CN103459407B - 用于电化学检定的新二茂铁标记物及其在分析方法中的用途 - Google Patents
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Abstract
通式I的化合物用作电化学检定中的标记物：（I）其中Fc和Fc’是取代的或未取代的二茂铁基部分，X是任选地被-O-或-NH-间隔的C1～C6亚烷基链；Y是任选地被-O-或-NH-间隔的C1～C6亚烷基链；Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且R是连接基团。使用化合物I来制备被标记底物，以及用于制备被标记底物的官能化化合物。
Description
技术领域
本发明涉及电化学检测方法。更具体地，本发明涉及电化学检定、用于电化学检测方法中的电化学活性标记物、及其用途。
背景技术
某些生物分子的检测在很多生命领域发挥重要作用。例如，在医学领域，始终需要检测细菌或病毒病原体或生物分子。需要灵敏检定的其它领域包括食品和饮料工业。
WO03/074731公开一种探测核酸的方法。使核酸溶液与具有电化学活性标记物的寡核苷酸探针接触。使探针至少部分地与可能存在于核酸溶液中的任何互补靶标序列杂交。在核酸探针的酶促降解之后，在电化学方面确定与标记物相关的信息。还公开了用于该方法的化合物。
WO2005/05657公开一种检测蛋白酶活性的方法，其中，样品溶液与具有电化学活性标记物的蛋白酶底物接触，提供如下条件，即可能存在于样品中的任何蛋白酶可使蛋白酶底物降解，并在电化学方面确定与电化学活性标记物相关的信息。还公开了某些用于该方法的新化合物。
对能够检测生物底物或指示物的小浓度存在的标记物的开发存在持续的需求，生物底物或指示物例如核酸（以分离的形式或以更大分子的形式，例如，天然的或合成的寡核苷酸）、或氨基酸（以分离的形式或以更大分子的形式，例如，天然的或合成的肽）。特别地，对具有不同氧化电位的新标记物存在持续的需求，从而拓宽可能的检定范围并增加对于多重反应开发的范围。
发明内容
本发明提供通式I的化合物在电化学检定中作为标记物的用途：
其中，Fc是取代的或未取代的二茂铁基部分，
Fc’是取代的或未取代的二茂铁基部分，且可以与Fc相同或不同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是连接基团。
发现根据本发明使用的化合物是用于电化学检定的有效标记物。具体而言，可以使用化合物来形成被标记的底物。作为可被标记的底物的感兴趣分子包括但不限于，氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、及任意这些分子的衍生物。可以使用本发明的化合物进行标记的其它底物包括胶乳/顺磁微粒和纳米颗粒。通式I的标记化合物和包括从标记化合物衍生的标记物的被标记分子，都可以用在电化学技术中，其中它们的电化学特性可以用于得到关于标记物或它们环境的信息。例如，本发明的化合物可以用于WO03/074731记载的方法或WO2005/05657记载的方法。
在根据本发明使用的化合物中，优选X表示任选地被氧间隔的C1～C6亚烷基；Y表示任选地被氧间隔的C1～C6亚烷基；并且Z表示任选地被氧间隔的C1～C8亚烷基。X优选是x为1～6、优选为1～4、特别是1或2的-(CH2)x-；或被氧间隔的C1～C6亚烷基，例如-(CH2)3-O-CH2-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、或-CH2-O-(CH2)3-。Y优选是y为1～6、优选为1～4、特别是1或2的-(CH2)y-；或被氧间隔的C1～C6亚烷基，例如-(CH2)3-O-CH2-、-(CH2)2-O-(CH2)2-或-CH2-O-(CH2)3-。优选X与Y相同。优选Fc和Fc’相同，且X和Y相同。优选Z是z为1～8、优选表示1～6、特别是2～6的-(CH2)z-；或被氧间隔的C1～C8亚烷基，例如-(CH2)2-O-(CH2)3-或-(CH2)2-O-(CH2)3-。在一个优选实施方式中，X是x为1或2的-(CH2)x-；Y是y为1或2的-(CH2)y-；且Z是z为1～8的-(CH2)z-。其中X和Y表示被-NR5-间隔的亚烷基链，R5优选地表示氢或C1～C4烷基，更优选为氢。
在一个优选实施方式中，本发明提供通式II的化合物作为电化学标记物的用途：
其中，
Fc是取代的或未取代的二茂铁基部分，
Fc’是取代的或未取代的二茂铁基部分，且可以与Fc相同或不同；
x为1或2；
y为1或2；
z为1～8；
且R是连接基团。
优选地，x和y各自等于1。
通式I或通式II的化合物中的二茂铁基部分可以是未取代的二茂铁基，或者一个或两个可以如下进一步记载地被取代。优选二茂铁基部分相同，因此优选，当Fc被一个或更多个取代基取代时，Fc’在相同位置携带相同的取代基。
除非上下文中明显相反，贯穿本文件的剩余部分，使用术语“底物”来包括天然出现的底物和合成的底物。合成的底物包括天然出现底物的合成类似物。底物包括单个核苷酸和单个氨基酸。在基于经由例如酶的底物裂解的检定情况下，单个氨基酸可以被认为是底物，因为，尽管其缺乏能够被蛋白酶裂解的内部键，但这样的键可以经由标记物的连接而形成。
本发明提供使用本发明化合物来检测化学实体的方法。根据本发明的在电化学检定中的用途可以是在例如对被电化学标记的底物进行检测的检定中。电化学检定可以是例如用于确定被电化学标记的底物的量的检定。检定可以有利地用于检测或确定被标记底物的量，其中，被标记底物选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、微粒和纳米颗粒。在某些优选实施方式中，检定用于检测或确定被标记底物的量，其中，被标记底物选自核苷酸、核苷、寡核苷酸和多核苷酸。在另一个有利实施方式中，检定用于检测或确定被标记底物的量，其中被标记底物选自氨基酸、肽和蛋白。
出于连接至底物的目的，标记物可以通过添加官能化基团而被官能化。因此，本发明还提供官能化衍生物，其包括从连接到官能化基团的本发明化合物衍生出的部分，其中官能化基团适用于增强与底物的连接。
本发明还提供制备包括用于电化学检定的标记物部分的官能化标记化合物的方法，包括使通式I的化合物与官能化化合物反应：
其中，
Fc是取代的或未取代的二茂铁基部分，
Fc’是取代的或未取代的二茂铁基部分，且可以与Fc相同或不同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是包括氧原子的连接基团，
从而得到通式III的官能化标记化合物：
A-L-FIII
其中，A表示
其中Fc、Fc’、X、Y和Z的限定如上，参考通式I；F表示官能化部分，特别是用于与底物反应以将标记部分连接至底物的官能化部分；
并且L表示连接部分。
连接部分L通常为从连接基团R衍生出的连接部分。例如，当R是OH基或包含OH基时，L通常表示-O-或包括-O-。
此外，本发明提供用于制备底物的方法，包括使通式III的化合物与底物反应，从而形成被标记的底物：
A-L-FIII
其中A、F和L的限定如上。
本发明还提供用于制备底物的官能化标记化合物，官能化标记化合物具有通式III：
A-L-FIII
其中A、L和F的限定如上。
本发明还提供用于电化学检定中的被标记底物，被标记底物具有通式IIIa：
A-L-F'-[S]IIIa
其中A表示
其中，
Fc是取代的或未取代的二茂铁基部分，
Fc’是取代的或未取代的二茂铁基部分，且可以与Fc相同或不同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，
其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L-F’表示连接部分；并且
[S]表示底物。
连接部分-L-F’-通常是从通式III的-L-F-部分衍生而来的部分。
本发明还提供包括本发明底物的检定。
附图说明
图1是用于本文所述微分脉冲伏安法测量中的电化学电池的示意图；
图2是在以下实施例1中制备的标记物A的微分脉冲伏安图；
图3是在以下实施例2中制备的标记物B的微分脉冲伏安图；
图4是在以下实施例3中制备的标记物C的微分脉冲伏安图；
图5示出根据以下实施例5（a）的对于衣原体（Chlamydia）阳性和阴性样品的伏安扫描；
图6是以下实施例5（a）记载的合成有标记物A电化学标记物的单核苷酸和二核苷酸的质谱分析；
图7是实施例5（a）的检定产物的质谱分析；
图8是示出以下实施例5（b）记载的当衣原体靶标以一定浓度范围直接添加到PCR反应并使用寡核苷酸探针检测时的电流测量的条形图；
图9是示出以下实施例5（c）记载的当衣原体靶标添加到DNA提取工序中且使用PCR扩增来自提取工序的输出，之后使用标记有标记物A的寡核苷酸探针进行检测时，在一定浓度范围内的峰电流的条形图；
图10示出用于诺瓦克病毒（Norovirus）的使用标记物A探针的电化学检测与基于SYBR绿的qPCR检定之间的比较；
图11示出用于马链球菌（Streptococcusequi）的使用标记物A探针的电化学检测与基于SYBR绿的qPCR检定之间的比较；
图12a是使用与市售抗山羊IgG结合的标记物A的伏安扫描；
图12b示出使用与市售抗山羊IgG结合的标记物A以一定时间间隔执行的伏安扫描；
图13a示出根据实施例8的多种浓度的微粒的伏安扫描；
图14是在以下实施例9中制备的标记物D的微分脉冲伏安图。
具体实施方式
相比荧光检测，电化学检测的应用具有很多好处。电化学检测具有非常高水平灵敏性的潜能，并表现出比荧光更宽的线性动态范围。不需要样品是光学透明的。从背景污染物而来的干扰也更少（很多生物样品自发荧光）。
电化学检测基于以下观察，即根据是否连接至底物以及底物的性质，电化学活性标记物表现出不同的电化学特性。例如，在连接至氨基酸的电化学标记物的情况中，所表现的特性不仅取决于氨基酸的特性（identity），还取决于氨基酸残基是否引入到肽或蛋白中，以及任何这些肽或蛋白的长度。在合适的环境下，连接到氨基酸残基的标记物的电化学活性可以在失去单个或非常少氨基酸残基的连接之后变化可检测的程度。
电化学活性标记物所连接的分子的尺寸和特性影响电化学标记物的可观察特性。这可能例如通过影响经由扩散的标记物迁移速率或响应于电场的迁移速率而出现。
由其所连接的分子的存在而引起的空间效应可影响标记物的电化学活性。例如，空间位阻可以防止标记物接近电极以及接收或提供电子。
如果标记物连接到肽，则肽的二级结构（主要由一级序列决定）可以影响标记物的物理特性。例如，如果标记物连接到肽中的氨基酸残基，使得肽的结构从空间上阻碍电化学活性标记物，则可减少通过伏安法可观测到的信号。肽的消化可以破坏或释放二级结构元素，因而减少或消除肽结构对标记物的影响。因此，肽的消化引起由标记物部分所生成的电化学信号的变化，通常引起增加。在微分脉冲伏安法实验中，在特定施加电压下的法拉第电流响应可以在肽消化时增加。
近似地，如果标记物连接至核苷酸，核苷酸是否引入到寡核苷酸中、该寡核苷酸的长度以及特别是在连接点附近的寡核苷酸的序列会影响电化学特性。
与电化学活性标记物相关的信息可以通过伏安法或通过安培法来获得。微分脉冲伏安法特别适合。如果需要的话，电化学检测步骤可以使用一个或更多个电极来执行，该电极由能够基于一个或更多个特性例如尺寸、电荷或疏水性而选择性地排除分子的膜覆盖。这可以帮助消除由例如溶液中的带电物种引起的背景噪音电流。
在本发明的一个实施方式中，用于电化学检定中的通式I的化合物是N,N-二-(二茂铁基烷基)氨基醇，氨基醇部分有利地具有2～10个碳原子，优选为2～8个碳原子，特别是3～6个碳原子。优选地，醇部分是未取代的或取代的并且任选地被一个或更多个杂原子和/或一个或更多个基团间隔的直链醇部分。杂原子的例子是，例如，氧、硫或氮。可能存在的基团包括但不限于-O-、-S-、环烷基（包括杂环烷基）、-CO-、-CONH、-NHCO-和-NH-和-NR1-，其中R1是C1～C4烷基。当存在取代基时，其可以是例如可以任选地被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团所取代的C1～C4烷基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基。
优选地，双二茂铁基烷基的亚烷基部分具有1～4个碳原子，优选一个或两个碳原子。优选地，亚烷基部分在两个二茂铁基烷基中是相同的。因此，优选地，双二茂铁基烷基是双二茂铁基甲基或双二茂铁基乙基，其中二茂铁基部分在各个情况下可以独立地为未取代的或被一个或更多个取代基所取代。
在根据本发明使用的化合物（包括标记化合物、官能化标记化合物和被标记底物）中，其包括通式I、II和III的化合物以及通式Ia的标记物部分，优选两个二茂铁基Fc和Fc’各自独立地选自未取代的和取代的二茂铁基。在一个实施方式中，通式I、II和III的化合物以及通式Ia的标记部分中的两个二茂铁基各自为未取代的二茂铁基。在其它实施方式中，一个或各个二茂铁基部分的一个或两个戊二烯基环可以被一个或更多个取代基取代，其性质和位置选择为，以期望的方式影响二茂铁部分的氧化还原特性。二茂铁基部分的戊二烯基环可以另外地或代替地被不会在很大程度上降低标记物的电化学灵敏性的任何环取代基所取代。在一个实施方式中，至少一个二茂铁基，优选两个二茂铁基是具有选自以下的一个或更多个取代基的被取代二茂铁基部分：卤素；可以任选地被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基。优选的取代基包括C1～C4烷基，例如甲基或乙基；被NH2、NHR2、NR3R4取代的C1～C4烷基，其中R2、R3和R4各自独立地选自直链或支链的C1～C4烷基；卤素，例如溴或氟；或C1～C4烯基，例如乙烯基。
例如，在本发明的一个实施方式中，各个二茂铁基在与二茂铁基连接至分子剩余部分的位置相邻的环位置处包括单个取代基。该实施方式的例子是化合物双((2-(二甲基氨基)二茂铁基)甲基)-6-氨基己醇。在另一个实施方式中，两个二茂铁基均是未取代的。该实施方式的例子是化合物N,N-二(二茂铁基甲基)-6-氨基己醇。其它示例性的二茂铁基包括1’-甲基二茂铁基；2-甲基二茂铁基；1’-乙烯基二茂铁基；1’-溴二茂铁基；以及2,3,4,5-四甲基-1’,2’,3’,4’,5’-五甲基二茂铁基。
优选二茂铁基部分相同。认为这会给出更强的信号。
Z部分可以是未取代的或取代的。当存在取代基时，其可以是例如选自羟基、卤素、氰基、氨基、和未取代或取代的C1～C4烷基、C1～C4烯基或芳基的一个或更多个取代基；其中在各个情况中，任选的取代基包括但不限于羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基。如果需要的话，Z部分被一个、或任选地多于一个选自-O-、-S-、环烷基（包括杂环烷基）、-CO-、-CONH、-NHCO-和-NH-和R1为C1～C4烷基的-NR1-的原子或部分所取代。可以在Z部分内包括为间隔的环烷基部分的例子是5～7个环原子、特别是6个环原子的环烷基环，例如环己基、哌啶基、吗啉基。
X和Y部分优选相同，其有利地具有1～6个碳原子的链长度，优选为1～4个碳原子，特别是一个或两个碳原子，且更特别地为一个碳原子。X和Y部分可以各自表示亚烷基链，任选地被-O-、-S-、或-NR5-例如-NH-间隔。优选的X和Y部分包括，例如-CH2-、-CH2-CH2-、-(CH2)3-O-CH2-、-CH2-O-(CH2)3-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、和-(CH2)2-O-(CH2)3-。
与底物的连接可以通过任何合适的连接，通常通过与底物侧链的连接。通式I的化合物中的连接基团R可以是适用于直接地或经由本文所述官能化基团实现与底物的连接的任何基团。R优选为羟基或受保护的羟基或含有羟基或受保护的羟基的基团。然而，应理解，可以根据使用中化合物将要连接的底物来选择任何其它合适的连接基团R。已经开发出多种合成方法，以用于蛋白、肽或氨基酸侧链，或者蛋白、肽或氨基酸端部的衍生。例如，蛋白中的赖氨酸残基可以通过与琥珀酰亚胺酯的反应而进行衍生。对于在其它氨基酸残基处的衍生，可以使用其它已知的合成法。例如，可以使用马来酰亚胺试剂来使半胱氨酸残基衍生。可以使用N-羟基琥珀酰亚胺酯来使蛋白或肽的氨基端或侧链氨基、或氨基酸的氨基部分衍生。
用于核苷酸的合适衍生法也是熟知的，例如，使用亚磷酰胺部分。
上述衍生法是可以用来将本发明化合物与底物连接的方法的例子，尽管可以使用其它方法。
根据本发明的被标记底物可以通过根据本发明的化合物与底物（例如选自氨基酸、核苷酸（例如寡聚脱氧核糖核苷酸或寡聚核糖核苷酸）、核苷、糖、肽、蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物及任意这些分子的衍生物）的反应来制备，任选地在官能化获得官能化标记化合物之后。
在优选实施方式中，底物是核苷酸或寡核苷酸。核苷酸可以选自腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷或尿苷。优选地，核苷酸、或寡核苷酸的核苷酸经由例如在2’、3’、或5’位连接到核苷酸的核糖或脱氧核糖的基团，例如经由氧或氮原子而连接至标记物。最优选地，核苷酸在3’或5’位，例如在5’位连接。在其它位置的连接也是可行的。
在核苷酸的情况下，连接本发明的标记物的一个有利方式是用亚磷酰胺进行官能化。亚磷酰胺基团与寡核苷酸的连接广泛地在寡核苷酸合成中实施，因此，用亚磷酰胺官能化的标记物与寡核苷酸连接的方法和条件会是熟知的，且对于本领域技术人员是常规方式。此外，有利地允许使用标准寡聚制备法。
根据本发明用于检定中的寡核苷酸有利地为核苷酸为2～50个的核苷酸，更优选核苷酸为2～40个，特别地核苷酸为15～35个，特别优选核苷酸为18～30个。对于一些应用，更短的寡核苷酸可以是有用的，例如，核苷酸为2～14个的寡核苷酸，更优选核苷酸为2～10个。
例如经由半胱氨酸、赖氨酸而与蛋白的连接，在一些情况中可通过将蛋白和二茂铁基标记物一起在室温下孵育在合适的缓冲溶液中来完成。当标记物有利地连接至半胱氨酸或赖氨酸但是底物序列在合适的位置不包含半胱氨酸或赖氨酸时，如果需要的话，可以使序列突变，以添加一个或更多个半胱氨酸或赖氨酸残基，作为额外的残基或作为对另一个残基的取代。用于与蛋白连接的可选方法可以包括标记物的生物素化以及商用链霉亲和素化蛋白的使用（或反之亦然）。通过示例的方式，底物可以经任何标准技术而生物素化，例如通过使用市售的生物素化试剂盒。生物素化底物会与链霉亲和素或亲和素结合蛋白例如抗体（其为商用且广泛可得）相结合。
然而，对于本领域技术人员清晰的是，可以通过使用合适的标记官能团，将相似的标记物在多个位置中所选的一个位置处与底物连接。
在通式III的官能化标记化合物中：
A-L-FIII
A-L优选为从通式I的化合物衍生而来的部分，且F是官能化基团。优选的通式III的官能化标记化合物包括通式IIIb的化合物：
A-O-FIIIb
其中A-O是从通式I的化合物衍生而来的部分，当通式I的连接基团R是羟基或含羟基基团或是受保护的羟基时，优选通过羟基氢原子或保护基团的失去，且F是官能化基团。
可以与本发明的标记物一起使用的适当官能化基团，包括为通式III和通式IIIb中的官能化基团F，其可以包括但不限于，琥珀酰亚胺酯基、亚磷酰胺基、马来酰亚胺基、生物素和叠氮基。然而，将意识到，可以使用促进标记化合物与将要被标记的底物的连接的任何官能化基团。
本发明还提供检测样品中核酸（例如RNA或DNA）的方法，包括扩增核酸的任选步骤（例如通过PCR或另一核酸扩增技术），之后是在允许探针与扩增子之间的杂交的条件下使扩增子与互补核酸探针接触的步骤，之后是选择性地降解杂交的或未杂交的探针的步骤（例如，通过使用单链或双链特定核酸酶），其中所述探针用本发明的电化学活性化合物进行标记，并且其中该方法提供对标记探针的化合物的电化学活性进行测量的步骤，其中所述电化学活性定量或定性地取决于探针降解的程度。
本发明还提供使用本发明的电化学活性化合物来检测抗体或衍生物的方法（例如其可以与检定中的靶标抗原结合），包括测量化合物的电化学活性的步骤。
本发明还提供在受试者中对疾病进行诊断或监测的方法，包括将本发明的方法用于检测受试者组织或体液中与所述疾病相关的蛋白酶或蛋白酶抑制剂。
本发明还提供在受试者中对疾病进行诊断或维护的方法，包括使用本发明的方法来检测受试者组织或体液中与所述疾病相关的肽或蛋白。
本发明还提供在受试者中对疾病进行诊断或监测的方法，包括将本发明的方法用于检测受试者组织或体液中与所述疾病相关的核酸酶或核酸酶抑制剂。
此外，本发明提供本发明方法在检测受试者的疾病中的用途。
本发明还提供检测病原体或其它不期望有机体例如食物腐败有机体的方法，包括使用本发明的方法。
此外，本发明提供N,N-二(二茂铁基烷基)甘氨酸衍生物，例如N,N-二(二茂铁基烷基)甘氨酰氨基衍生物作为电化学测量法中的电化学标记物的用途。
本发明还提供一种检定，包括本发明的被标记底物，任选地与其它检定组分例如样品容器、含有电化学检测用电极的容器、用于检定的酶或标准品和对照组合在一起。所述检定可以包括多于一种的本发明的不同被标记底物。如果是那种情况的话，不同被标记底物的存在可以通过用具有不同电化学特性（例如，不同的氧化电位）的本发明电化学标记物对其标记而进行区别检测，从而使得检定是多重（例如双重）检定，其中，当不同的底物存在于同一样品容器中时，可以对其进行区分。
本发明在另一个实施方式中提供通式I的化合物
其中，
Fc是取代的二茂铁基部分，
Fc’是取代的二茂铁基部分，且可以与Fc相同或不同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是连接基团。
在该实施方式中，优选各个二茂铁基部分被选自卤素、C1～C4烷基、卤代烷基、芳基、C1～C4烯基、和氰基的至少一个取代基所取代。
在又一个实施方式中，本发明提供通式I的化合物
其中，
Fc和Fc’各自为未取代的二茂铁基部分；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是C6～C12亚烷基链，或是被一个或更多个取代基取代的和/或被选自-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONH-、-NHCO-、或-NR1-的基团间隔的C1～C12亚烷基，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是连接基团。
在该又一个实施方式中，优选X表示-(CH2)x-，其中x为1～6；且Y表示-(CH2)y-，其中y为1～6。
在所述另一个和又一个实施方式中，Z优选地表示任选地被氧间隔的C6～C8亚烷基。优选地，连接基团R包括能够与官能化部分或底物的相容基团反应的基团，以将化合物连接到所述官能化部分或所述底物，例如，R可以是羟基、受保护的羟基或含有羟基或受保护的羟基的部分。
以下表1列出通式IVa、Va、VIa、VIIa和VIIIa中的根据本发明的某些优选化合物，其可以用作本发明电化学检定中的标记物，且其可以用于制备本发明的官能化标记化合物和被标记底物。表1还列出通式IVb、Vb、VIb、VIIb和VIIIb中的根据本发明的示例性相应官能化标记化合物。在表1的式中，除考虑针对其减少空间位阻外，各个二茂铁基可以具有多于一个的取代基R，其可以相同或不同，并在任意环位置中。当在一个二茂铁基中有一个或多个取代基时，另一二茂铁基应理解为在相同位置具有相同取代基。
表1：示例性的化合物和官能化标记化合物
在表1的通式IVa、Va、VIa、VIIa和VIIIa及其官能化对应物中，当一个或更多个环取代基R11或R13存在于各个二茂铁基的邻近戊二烯基环（即直接与分子的剩余部分键合的环）时，优选在该键的邻近环位置处存在所述环取代基。当多于一个的环取代基R11、R13存在于各个邻近戊二烯基环上时，这些取代基可以相对于彼此在任意位置上。当多于一个的环取代基R10、R12或R14存在于各个二茂铁基的各个较远戊二烯基环（即远离将二茂铁基连接到分子剩余部分的键的环）上时，这些取代基可以相对于彼此在任意位置上。当在表1的通式IVa、Va、VIa、VIIa和VIIIa及其官能化对应物中在邻近或较远环上显示出环取代基时，也可以使各个二茂铁基的两个戊二烯基环携带一个或更多个取代基。
在特别优选的实施方式中，化合物是N,N-二(二茂铁基甲基)-6-氨基己醇（在以下的实施例中称为标记物A）。可以根据本发明使用的其它优选标记物包括：
2-((双二茂铁基甲基)氨基)-1-(4-(羟甲基)哌啶-1-基)乙酮；以及
N,N-二-(二茂铁基甲基)-2-氨基乙氧基乙醇
其中，该二茂铁基部分或各个二茂铁基部分可以是未取代的或被一个或更多个取代基所取代。二茂铁基均为未取代的化合物N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇已经被发现具有良好的电化学特性。如在本文实施例中示例说明的，一个或更多个取代基引入到化合物的各个二茂铁基中（在各个二茂铁基中的取代基是相同的）可以用来获得具有改性的电化学特性的化合物，从而经适当的取代基选择，提供一系列化合物，其中两种或更多种可以选择用于多重反应的目的。
在表2中列出已经被发现具有良好电化学特性的本发明的某些示例性化合物：
表2：根据本发明的示例性标记化合物
对于某些优选实施方式的具体说明
参考图1，示意性地示出适用于本文所述循环伏安法实验的电化学电池1。电池包括容器2，含有背景电解质溶液3，其为氯化钠的100mM水溶液。浸在溶液3中的是印刷碳工作电极5、印刷碳对电极6和银/氯化银参考电极7，均具有银连接器。样品分散在工作电极的表面，并且通过将银连接器与电位计的适当引线连接来执行伏安法。通过示例的方式，可以如下制备样品：将二茂铁基标记物前体（2ng）溶解在DMSO（1mL）中。从该溶液中取出10μL的等分试样，之后在缓冲液中（500μL）进一步稀释。之后将等分试样（20μL）施加到丝网印刷电极，以进行电化学扫描。
以下实施例示例说明本发明：
材料和方法-标记物合成和检定
从Sigma-Aldrich得到二茂铁羧酸。从Sigma-Aldrich得到二茂铁甲醛。
从Sigma-Aldrich获得6-氨基己醇。
从Sigma-Aldrich得到甘氨酸。
从Sigma-Aldrich得到N,N-二异丙基乙胺。
从Sigma-Aldrich得到2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺。从Sigma-Aldrich得到浓度为1mg/mL的木瓜蛋白酶溶液。
从Sigma得到抗山羊IgG和生物素化的山羊IgG。
使用PTC-100或PTC-200编程性控温器（MJResearchInc.）或PeqLab平板（flatbed）热循环器，执行PCR法。
经链霉亲和素涂覆的微滴定孔是SigmaScreenTM高密度孔。
材料和方法-电化学检测
电极是油墨类的且丝网印刷到聚合物基质（例如Mylar）上，之后进行热固化-由GMNameplate（Seattle，WA）制造。
实施例1：N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇[标记物A]的合成
标记物A
将二茂铁甲醛（2.1g，9.81mmol）和6-氨基己-1-醇（0.5g，4.27mmol）于干THF（25mL）中的溶液添加到烘箱干燥的烧瓶中。将三乙酰氧基硼氢化钠（2.3g，10.90mmol）分批添加到溶液中。反应过夜。将反应吸收在乙酸乙酯（40mL）中，用NaCO3（饱和，20mL）、盐水（20mL）和MilliQ水（20mL）洗涤有机层。之后在硫酸镁上干燥有机部分，且在真空下除去溶剂。然后使用9:1溶液B:溶液A（溶液A：乙酸乙酯95%TEA5%，溶液B：石油醚40-6095%，TEA5%）使粗产物过柱，以得到纯产物（深橙色固体）。85%收率。1HNMR（300MHz，CDCl3）δ4.18（2H，s，Cp），4.17（2H，s，Cp），4.13（15H，s，Cp），3.66（4H，t，J=6.25Hz，CH2），3.48（2H，s，CH2），2.20（2H，t，J=6，CH2），1.59-1.31（6H，m，CH2)。13CNMR（75.5Hz，CDCl3）δ77.83，77.40，76.98，70.58，68.88，63.36，53.02，52.17，33.10，27.43，25.88。针对C28H33N1O1Fe2m/z519.1430计算的HRMS（ESI）得到519.1438。
化合物标记物A的电化学示于图2的伏安图中。
发现产物标记物具有0.275V的氧化还原电势。
实施例2：二-((二甲基氨基)甲基二茂铁基甲基)-6-氨基己醇（标记物B）的合成
（a）二甲基氨基)甲基二茂铁甲醛的合成
将(二氨基甲基)甲基二茂铁（1g，5mmol）溶解在Et2O中，缓慢添加正丁基锂（2.51mL，6.25mmol），且将反应混合物在室温下搅拌16小时。
在16小时后，用DMF（0.4mL，6.25mmol）淬灭反应混合物，并再次在室温下搅拌4小时。之后，向反应中加入水（15mL）。之后用乙醚（2×25mL）萃取有机相。使用硫酸镁干燥合并的有机相，过滤，在真空下除去溶剂，以得到收率为72%的产物（深红/棕色油）。1HNMR（300MHz，CDCl3）δ9.81（1H，s，CHO），4.21（2H，s，Cp），4.14（5H，s，Cp），3.64（2H，s，CH2），2.08（6H，s，NMe2）13CNMR（75.5Hz，CDCl3）δ193.2，86.7，83.4，77.8，77.5，77.0，76.62，75.8，71.8，70.3，70.2，70.0，68.4，68.0，59.2，56.6，44.8，44.7。针对C14H18N1O1Fe1m/z272.0737计算的HRMS（ESI）得到272.0731。
参考：Biot,C.,Glorian,G.,Maciejewski,L.A.,Brocard,J.S.,Domarle,O.,Blampain,G.,Millet,P.,Georges,A.J.,Abessolo,H.,Dive,D.,Lebibi,J.J.Med.Chem.1997,40,3715-3718。
（b）标记物B的合成
标记物B
将(二甲基氨基)甲基二茂铁甲醛（1.1g，4.04mmol）溶解在干THF（30mL）中。添加6-氨基己-1-醇（0.25g，2.13mmol）。之后，向反应混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠（1.3g，6.16mmol）。将溶液在氮下于室温搅拌过夜。之后加入乙酸乙酯（20mL）和1N的NaOH（饱和，20mL），并且之后用NaCO3（25mL）、盐水（25mL）和MilliQ过滤水（25mL）萃取有机层，之后将其在MgSO4上干燥，并在真空下除去溶剂，以得到橙色油（0.95，75%）。1HNMR（300MHz，CDCl3）δ4.18（2H，s，Cp），4.17（2H，s，Cp），4.13（15H，s，Cp），3.66（4H，t，J=6.25Hz，CH2），3.48（2H，s，CH2），2.20（2H，t，J=6，CH2），2.17（12H，s，CH3）1.59-1.31（6H，m，CH2）。针对C34H49N3O1Fe2m/z627.3012计算的HRMS（ESI）得到627.3126。
产物化合物的电化学显示在图3的伏安图中。发现产物标记物B具有0.38V的氧化还原电势。
实施例3：2-((双二茂铁基甲基)氨基)-1-(4-(羟甲基)哌啶-1-基)乙酮（标记物C）
（a）N,N-(双二茂铁基甲基)甘氨酸的合成
将二茂铁甲醛（2.1g）添加到含有干THF（20mL）的圆底烧瓶中。向溶液中加入甘氨酸（0.5g），并在N2下搅拌反应。将三乙酰氧基硼氢化钠（2.3g）分批添加到搅拌溶液中。反应搅拌过夜。之后，将溶液在乙酸乙酯（40mL）和1M氢氧化钠水溶液（40mL）之间分隔。用饱和NaHCO3水溶液（饱和，20mL）、盐水（40mL）和水（40mL）洗涤有机部分。使用MgSO4干燥有机部分，并除去溶剂。之后，使粗产物过柱（溶液A：石油醚40-60：TEA95:5，溶液B：乙酸乙酯：TEA95:5）。产物为深橙色固体（80%）。1HNMR（250MHz，CDCl3）δ4.099（1H，s，CpH），4.052（1H，s，CpH），4.022（7H，s，FcCpH），3.549（4H，t，J=6.75，2xCH2），3.348（2H，s，CH2），1.979（1H，s，OH）。13CNMR（75.5Hz，CDCl3）δ171.5，78.0，77.5，77.1，68.9，67.4，61.1。针对C24H25N1O2Fe2m/z：477.3974计算的HRMS（ESI）得到477.4213。
（b）由双二茂铁基甘氨酸合成标记物C
标记物C
在N2下，于0℃，将草酰氯（0.87mL）于干DCM（2mL）中的溶液经等压滴液漏斗逐滴添加到以上3（a）得到的二-二茂铁基甘氨酸衍生物于干DCM（100mL）的搅拌溶液中。将反应温热至室温并搅拌2小时。之后，除去溶剂，且将酰基氯产物吸收于干DCM（75mL）中。在N2下，于0℃，经由滴液漏斗逐滴添加6-氨基己-1-醇（0.56g）于干DCM（75mL）中的溶液。之后，反应在温热至室温的同时搅拌2小时。之后用NaHCO3（饱和，100mL）和1.0MHCl（100mL）洗涤溶液。在MgSO4上干燥有机部分，之后除去溶剂，以得到产物（85%）。橙色/黄色固体。1HNMR（250MHz，CDCl3）δ4.11（12H，s，FcCp），3.65（4H，t，J=6.0Hz，CH2），3.55（2H，s，CH2），1.48-1.18（5h，m，CH2）。13CNMR（75.5Hz，CDCl3）δ173.32，77.80，77.39，76.90，62.10，38.85，35.45，32.02，30.67，26.75，25.54，25.44。m/z：576。
产物化合物标记物C的电化学示于以下表3中以及图4的伏安图中。
表3：标记物C的电化学活性
| 峰位（mV） | 峰值高度 |
| 410 | 6.79e-6 |
| 425 | 8.47e-6 |
| 415 | 8.56e-6 |
实施例4：用于连接亚磷酰胺官能团的一般合成过程
作为以上反应方案的起始材料的二茂铁基衍生物是示例说明性的，并可以替换为摩尔当量的任何在以上实施例1～3或以下实施例9～13中制备的化合物。
在氮氛下，将N,N-二异丙基乙胺（0.4mL，8.4mmol）添加到二茂铁衍生物（2.1mmol）于干THF（25mL）的搅拌溶液中。逐滴加入2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺（0.2ml，3.15mmol），并搅拌所得混合物15分钟。加入MilliQ过滤水（200mL），并再搅拌溶液30分钟。加入乙酸乙酯-三乙胺（1:1，25mL），形成沉淀物。用饱和NaCHCO3（25mL）和MilliQ过滤水（25mL）洗涤混合物。在MgSO4上干燥有机部分，并在真空下除去溶剂。之后，通过硅胶色谱（石油醚:乙酸乙酯9:1）来纯化粗产物。
使用标记物C作为二茂铁基起始材料的上述方法，得到式IX的亚磷酰胺官能化化合物，具有以下列出的特征数据。
1HNMR（500MHZ，CDCl3）δ4.23（2H，s，Cp），4.18（2H，s，Cp），4.13（15H，s，Cp），3.90-3.82（2H，m，CH2），3.71-3.54（4H，m，CH2），3.44（4H，s，CH2），2.64（2H，t，J=6，CH2），2.35（2H，t，J=6.5，CH2），1.69-1.35（85H，m，CH2，CH），1.23（12H，t，J=7，CH3）。31PNMR（DEC）（202.5Hz，CDCl3）δ147.23。针对C39H53N4O3Fe2P1m/z：768.0973计算的HRMS（ESI）得到768.1254。
实施例5：与寡核苷酸探针结合的标记物A的使用
使用标准的寡核苷酸固相合成技术来执行寡核苷酸的合成，其中核苷酸逐步添加到寡核苷酸链的5’端。对寡核苷酸链的各次增加涉及四种反应，即去封闭、连接、帽化和氧化步骤。在完成所需长度的寡核苷酸序列时，经亚磷酰胺连接添加电化学标记物。
方法
通过使用5’和3’靶标特异引物的标准PCR法和尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）步骤，从沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）扩增出靶标序列。PCR条件汇总在下表1中。当完成PCR反应时，将与靶标上5’与3’引物之间位置的序列中间体互补的寡核苷酸探针（在5’端标记有电化学标记物A）添加到PCR反应产物中并使其与扩增子上的靶标退火。将T7核酸外切酶（特定用于双链核酸）添加到管中，并孵育，以使其消化dsRNA。通过T7核酸外切酶将探针消化到使其与PCR扩增子退火的程度。之后，执行电化学检测，对于标记有标记物A的消化产物核苷酸，显示出在0.2V的特征氧化还原电势处的峰值。
表4
| 组分 | 浓度 |
| PCR缓冲液 | 1× |
| MgCl2 | 5mM |
| dUTP mix（混合物） | 1× |
| 正向引物 | 0.04μM |
| 反向引物 | 0.3μM |
| Taq | 2.5U |
| UNG | 0.5U |
UNG方案：
37℃×10分钟
94℃×10分钟
PCR方案：
94℃×30秒
58℃×45秒
72℃×60秒
重复步骤×39个循环（总共40个循环）
72℃×7分钟
结果
图5示出沙眼衣原体阳性样品（强峰）和阴性样品（没有峰）在已知（标记物特异性）氧化还原电势处的电流峰值高度。
图6示出合成有标记物A电化学标记物的单核苷酸和二核苷酸的质谱分析。图7是检定产物的质谱分析，其示出与结合至标记物A电化学标记物（检定中检测的电化学部分）的单核苷酸的确切相关性。
图8示出将衣原体靶标以一定浓度范围直接添加到PCR反应的实验结果。使用PCR扩增，之后使用标记物A寡核苷酸探针进行检测。
图9示出将一定浓度范围的衣原体靶标添加到DNA提取工序（即，不直接添加到PCR）中，且使用PCR扩增来自提取工序的输出，之后使用标记有标记物A的寡核苷酸探针进行检测的实验结果。
实施例6：与qPCR性能的比较
a）图10示出用于诺瓦克病毒的使用标记物A探针的电化学检测与基于SYBR绿的qPCR检定之间的比较。材料和方案如下：
BiolineSensiMixdU
Bioline1×SYBR绿
0.3μM正向引物
0.3μM反向引物
0.5UUNG
UNG方案：
37℃×10分钟
60℃×2分钟
qPCR方案：
95℃×10分钟（taq活化步骤）
95℃×15秒
45℃×10秒
72℃×10秒（SYBR获取）
重复最后3个步骤×39个循环（总共40个循环）
47℃～95℃，1℃增量（端点熔化，以检查非特异性扩增）
Ct值的小数化倒数被用于qPCR结果，以提供与电化学结果的直接比较。
数据示出电化学检定的检测限是200ag。qPCR检定的检测限示出为在2～20fg之间。在该水平之下，Ct值大于40循环的界值（cut-off），由水平线显示为40的Ct值的倒数。qPCR阴性组没有上升到阈值之上。这表明了使用标记物A的电化学检定的有利灵敏度。
b）图11示出用于马链球菌（Streptococcusequi）的使用标记物A探针的电化学检测与基于SYBR绿的qPCR检定之间的比较。
数据示出，电化学检定和qPCR检定均能够向下检测到在该实验中测试的最低DNA浓度（20fg）。在20fg的电化学检测的信号:噪音比在该实验中为4:1。20fg等于马链球菌DNA的8个基因组拷贝。
实施例7：直接与蛋白结合的标记物A
a）图12a是使用与市售抗山羊IgG的伯胺直接结合的标记物A的伏安扫描，使用活性NHS酯（N-羟基琥珀酰亚胺酯）。
以下概括的反应方案示出标记物与例如抗山羊IgG中赖氨酸残基的游离胺的连接。
将市售的生物素化山羊IgG固定到经链霉亲和素涂覆的微滴定孔上。之后，将标记物A抗山羊IgG孵育在含有被固定的山羊IgG的孔中，之后通过洗涤除去。将木瓜蛋白酶溶液添加到孔中，并孵育，以使二抗消化，电化学地读取所得溶液。该实验中的对照组遵照相同的步骤，但是最终的孵育仅在缓冲液中执行而没有木瓜蛋白酶。
图12a示出，当存在木瓜蛋白酶而非缺少木瓜蛋白酶时，释放出标记物A的在已知氧化电位下的电化学信号。这示出，标记物A在该检定中与抗体直接结合，且仅在抗体被消化从而释放出电化学标记物时观察到信号。
b）图12b中的数据使用与以上实施例7a）相同的模式检定，不同之处在于示出木瓜蛋白酶消化时程实验。在该实验中，对照是标记物A二抗（抗山羊IgG），其被添加到没有被固定的山羊IgG抗体的孔中。
实施例8：与微粒结合的标记物A
将生物素分子结合到标记物A。可以在自动寡核苷酸合成器中或使用标准的实验室条件，通过二茂铁基亚磷酰胺标记物与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯的反应来执行生物素化。将顺磁性链霉亲和素颗粒洗涤×3（磷酸盐缓冲液）并与生物素化标记物混合，之后在室温下，伴随着混合而孵育1小时。将颗粒洗涤×2（磷酸盐缓冲液）并洗涤×1（PCR缓冲液）。将其重悬在最终缓冲液中（PCR缓冲液）。
在各个洗涤步骤之后，测试上清液的电化学信号，并且如果需要的话，重复洗涤直至上清液显示出没有游离电化学标记物的迹象。
在一定浓度范围检定这些颗粒，以证实所观察到的电化学信号归因于与磁颗粒结合的标记物A。这涉及颗粒的磁性捕获和在一系列缓冲液体积中的重悬。结果显示在图13中。
实施例9：(N,N-双二茂铁基甲基-2-氨基乙氧基)乙醇（标记物D）的合成
将二茂铁甲醛（2.1g，9.81mmol）和(氨基乙氧基)乙醇（0.5g，4.27mmol）于干THF（25ml）中的溶液添加到烘箱干燥的烧瓶中。将三乙酰氧基硼氢化钠（2.3g，10.90mmol）分批添加到溶液中。反应过夜。将反应吸收在乙酸乙酯（40mL）中，用NaCO3（饱和，20ml）、盐水（20mL）和MilliQ水（20mL）洗涤有机层。之后，在硫酸镁上干燥有机部分，且在真空下除去溶剂。之后使用9:1溶液B:溶液A（溶液A：乙酸乙酯95%TEA5%，溶液B：石油醚40-6095%，TEA5%）使粗产物过柱，以得到纯产物标记物D（深橙色固体）。85%收率。1HNMR（300MHz，CDCl3）δ4.18（2H，s，Cp），4.17（2H，s，Cp），4.13（15H，s，Cp），3.66（4H，t，J=6.25Hz，CH2），3.48（2H，s，CH2），2.20（2H，t，J=6，CH2）。13CNMR（75.5Hz，CDCl3）δ77.83，77.40，76.98，70.58，68.88，63.36，53.02，52.17，33.10，27.43，25.88。针对C26H33N1O2Fe2m/z501.1430计算的HRMS（ESI）得到501.1438。
标记物D的电化学显示在以下表格以及图14的伏安图中。
表5：标记物D的电化学活性
| 峰位（mV） | 峰值高度 |
| 242 | 9.31e-6 |
| 245 | 9.38e-6 |
| 239 | 9.76e-6 |
实施例10：二-二茂铁基甘氨酸氨基醇N,N-2-(双二茂铁基甲基氨基)乙酰基-6-氨
基己醇，也称为N-(6-羟基己基)-2-((双二茂铁基甲基)氨基)-乙酰胺（标记物E）的合成
在N2下，于0℃，经等压滴液漏斗，将草酰氯（0.87mL）于干DCM（2mL）中的溶液逐滴添加到二-二茂铁基甘氨酸（如实施例3a所述地得到）于干DCM（100mL）的搅拌溶液中。将反应温热至室温并搅拌2小时。之后，除去溶剂，并将酰基氯产物吸收在干DCM（75mL）中。在N2下，于0℃，经滴液漏斗逐滴添加6-氨基己-1-醇（0.56g）于干DCM（75mL）中的溶液。之后将反应在温热至室温的同时搅拌2小时。之后，用NaHCO3（饱和，100mL）和1.0MHCl（100mL）来洗涤溶液。在MgSO4上干燥有机部分，之后除去溶剂，以得到产物标记物E（85%）。橙色/黄色固体。lHNMR（250MHz，CDCl3）δ4.11（12H，s，FcCp），3.55（4H，t，J=6.0Hz，CH2），3.31（2H，s，CH2），1.48-1.18（12h，m，CH2）。13CNMR（75.5Hz，CDCl3）δ173.32，77.80，77.39，76.90，62.10，38.85，35.45，32.02，30.67，26.75，25.54，25.44。针对C24H25N1O2Fe2m/z：576.0988计算的HRMS（ESI）得到576.1264。
标记物E的电化学显示在以下表格的数据中。
表6：标记物E的电化学活性
| 峰位（mV） | 峰值高度 |
| 504 | 6.61e-6 |
| 506 | 5.51e-6 |
| 507 | 3.28e-6 |
实施例11：6-(双((1’-乙烯基二茂铁基)1-甲基二茂铁基)氨基)己-1-醇
将1’-乙烯基二茂铁甲醛（122mg，0.5mmol）溶解在干THF（5cm3）中，并相继用6-氨基己-1-醇（29mg，0.25mmol）和三乙酰氧基硼氢化钠（205mg，1.25mmol）处理。使溶液在室温下搅拌过夜。之后，通过添加10cm3饱和NaHCO3来淬灭反应。分离有机层，之后用乙酸乙酯（3×10cm3）萃取回水层。在硫酸镁上干燥合并的有机萃取物，过滤之后在真空下浓缩，以得到红色固体。通过用1:1（乙酸乙酯:己烷）+1%氢氧化铵洗脱的二氧化硅色谱来纯化产物，从而以50%收率得到所需产物，其为72mg橙色油。
1HNMR（500Mhz；CDCl3）δΗ6.38（2H，dd，J17.6，10.7=CH），5.30（2H，dd，J10.7，1.5，=CH2），5.03（2H，dd，J10.7，1.5，=CH2），4.25（4H，t，J1.8，CpH），4.15（4H，t，J1.8，CpH），4.07（8H，s，CpH），3.59（2Η，t，J6.6，OCH2），3.32（4Η，s，2xFcCH2），2.23，（2Η，appt，J7.4，NCH2），1.49-1.55（2Η，m，CH2），1.33-1.39（2Η，m，CH2），1.22-1.33（4Η，m，CH2)；13CNMR（125Mhz；CDCl3）δC134.3，111.3，83.7，83.6，71.4，69.2，69.0，67.2，62.8，52.1，32.7，27.1，25.5；HRMS，m/z（ESI）566.1825（1.8%，[M+H]，C32H39Fe2NO需要566.1808）；电极电势：298mV。
实施例12：6-(双((1’-溴二茂铁基)1-甲基二茂铁基)氨基)己-1-醇
将1’-溴二茂铁甲醛（85mg，0.29mmol）溶于干THF（3cm3）中，并相继用6-氨基己-1-醇（25mg，0.144mmol）和三乙酰氧基硼氢化钠（59.3mg，0.36mmol）处理。使溶液在室温下搅拌过夜。之后，通过添加5cm3饱和NaHCO3来淬灭反应。分离有机层，之后用乙酸乙酯（3×10cm3）萃取回水层。在硫酸镁上干燥合并的有机萃取物，过滤之后在真空下浓缩，以得到红色固体。通过用1:1（乙酸乙酯:己烷）+1%氢氧化铵洗脱的二氧化硅色谱来纯化产物，从而以17%收率的得到所需产物，其为17mg黄色油。
1HNMR（500Mhz；CDCl3）δΗ4.32,（4H，t，J1.8，FcH），4.21（8H，s，FcH），4.05（4H，t，J1.8，FcH），3.63（2Η，t，J6.5，OCH2），3.46（4Η，s，FcCH2N），2.31（2Η，t，J7.1，NCH2），1.45-1.58（4Η，m，CH2），1.27-1.36（4Η，m，CH2)；13CNMR（125Mhz；CDCl3）δC78.4，72.9，70.8，70.5，68.6，67.9，63.1，62.8，52.1，33.0，27.3，26.0；HRMS，m/z（ESI）669.7929（2.7%，[M+H]，C28H34Fe2Br2NO需要669.9705）；电极电势：437mV。
实施例13：6-(双((2-甲基二茂铁基)甲基)氨基)己-1-醇
将甲基二茂铁甲醛（1g，5mmol）溶解在干THF（30cm3）中。加入6-氨基己-1-醇（0.25g，2.13mmol）。之后，向反应混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠（1.3g，6.16mmol）。将溶液在氮下于室温搅拌过夜。之后，加入乙酸乙酯（20cm3）和1MNaOH（20cm3），之后用饱和NaHCO3（25cm3）、盐水（25cm3）和MilliQ过滤水（25cm3）萃取有机层，之后在硫酸镁上干燥，且在真空下除去溶剂，以得到黄色油。之后使用9:1溶液B:溶液A（溶液A：乙酸乙酯95%TEA5%，溶液B：石油醚40-6095%，TEA5%）使粗产物过柱，以得到纯产物（橙色油）。（0.95，65%）。1HNMR（300MHz；CDCl3）δΗ4.18（2H，s，CpH），4.17（2H，s，CpH），4.13（15H，s，CpH），3.66（4H，t，J6.25，CH2），3.48（2H，s，CH2），2.36（3H，s，CH3），2.20（2H，t，J6.1，CH2），1.59-1.31（6H，m，CH2）。13CNMR（75.5Hz；CDCl3）δC77.8，77.4，76.9，70.5，68.9，63.3，53.0，52.1，33.1，27.4，25.8，12.4；HRMS，m/z（ESI）539.8156（10%，[M+H]，C30H47N1O1Fe2需要539.8232）；电极电势：330mV。
表7：对标记物A的二茂铁基部分上取代基的电极电势的作用
| 实施例 | Fc取代基 | 电极电势 |
| 1 | 无 | 275mV |
| 2 | 二甲基氨基甲基 | 380mV |
| 11 | 1’-乙烯基 | 298mV |
| 12 | 1’-溴 | 437mV |
| 13 | 2-甲基 | 330mV |
以上表格中的数据显示出，在二茂铁基部分包括取代基以及该取代基的选择可用来如何影响电极电势。这使得化合物的电化学检测能够在多种不同条件下执行，例如选择最佳测量电势或避免测量灵敏性可能因可能存在的杂质的干扰而降低的条件。此外，具有不同电极电势的标记物的使用允许用于开发多重反应，其中在同一样品中可以进行多于一种的测定。
Claims (45)
1.通式I的化合物在电化学检定中作为标记物的用途：
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是连接基团，其选自羟基或受保护的羟基或含有羟基或受保护的羟基的基团。
2.根据权利要求1所述的用途，其中：
X表示任选地被氧间隔的C1～C6亚烷基；
Y表示任选地被氧间隔的C1～C6亚烷基；
Z表示任选地被氧间隔的C1～C8亚烷基。
3.根据权利要求1所述的用途，其中：
X是-(CH2)x-，其中x为1或2；
Y是-(CH2)y-，其中y为1或2；
Z是-(CH2)z-，其中z为1～8。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中X和Y相同。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中所述检定用于检测被电化学标记的底物，并且其中所述底物选自碳水化合物。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中所述检定用于检测被电化学标记的底物，并且其中所述底物选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、微粒和纳米颗粒。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中所述检定用于检测被电化学标记的底物，并且其中所述底物选自寡核苷酸和多核苷酸。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中所述检定用于检测选自核苷酸和核苷的生物底物。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中所述检定用于检测选自寡核苷酸和多核苷酸的生物底物。
10.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中所述检定用于检测选自氨基酸、肽和蛋白的生物底物。
11.一种制备包括用于电化学检定的标记物部分的官能化标记化合物的方法，包括使通式I的化合物与官能化化合物反应：
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是包括氧原子的连接基团，
从而得到通式III的官能化标记化合物：
A-L-FIII
其中A表示
其中，Fc、Fc’、X、Y和Z的限定如上，
F表示官能化部分；并且
L表示连接部分。
12.一种用于制备被标记底物的方法，包括使通式III的化合物与底物反应以形成被标记底物：
A-L-FIII
其中A、F和L的限定如权利要求11，
其中所述底物选自碳水化合物。
13.一种用于制备被标记底物的方法，包括使通式III的化合物与底物反应以形成被标记底物：
A-L-FIII
其中A、F和L的限定如权利要求11，
其中所述底物选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、微粒和纳米颗粒。
14.一种用于制备被标记底物的方法，包括使通式III的化合物与底物反应以形成被标记底物：
A-L-FIII
其中A、F和L的限定如权利要求11，
其中所述底物选自寡核苷酸和多核苷酸。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述底物是选自核苷酸和核苷的生物底物。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述底物是选自氨基酸、肽和蛋白的生物底物。
17.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中官能化基团F选自琥珀酰亚胺酯基、亚磷酰胺基、马来酰亚胺基、生物素和叠氮基。
18.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述官能化部分是亚磷酰胺部分或从其衍生而来。
19.一种用于权利要求12～18中任一项所述的方法中的官能化标记化合物，所述官能化标记化合物具有通式III：
A-L-FIII
其中，
A表示通式Ia的标记部分：
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L表示连接基团；
并且其中F表示用于与底物反应以将所述标记部分连接到所述底物的官能化部分，所述底物选自碳水化合物。
20.一种用于权利要求12～18中任一项所述的方法中的官能化标记化合物，所述官能化标记化合物具有通式III：
A-L-FIII
其中，
A表示通式Ia的标记部分：
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L表示连接基团；
并且其中F表示用于与底物反应以将所述标记部分连接到所述底物的官能化部分，所述底物选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、微粒和纳米颗粒。
21.一种用于权利要求12～18中任一项所述的方法中的官能化标记化合物，所述官能化标记化合物具有通式III：
A-L-FIII
其中，
A表示通式Ia的标记部分：
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L表示连接基团；
并且其中F表示用于与底物反应以将所述标记部分连接到所述底物的官能化部分，所述底物选自寡核苷酸和多核苷酸。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的官能化标记化合物，其中所述官能化基团F选自琥珀酰亚胺酯基、亚磷酰胺基、马来酰亚胺基、生物素和叠氮基。
23.根据权利要求19-21中任一项所述的官能化标记化合物，其中所述官能化部分是亚磷酰胺部分或从其衍生而来。
24.一种用于电化学检定的被标记底物，所述被标记底物具有通式IIIa：
A-L-F’-[S]IIIa
其中A表示
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L-F’表示连接部分；并且
[S]表示底物，其选自碳水化合物。
25.一种用于电化学检定的被标记底物，所述被标记底物具有通式IIIa：
A-L-F’-[S]IIIa
其中A表示
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L-F’表示连接部分；并且
[S]表示底物，其选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、微粒和纳米颗粒。
26.一种用于电化学检定的被标记底物，所述被标记底物具有通式IIIa：
A-L-F’-[S]IIIa
其中A表示
其中，
Fc是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是未取代的二茂铁基部分或被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；
L-F’表示连接部分；并且
[S]表示底物，其选自寡核苷酸和多核苷酸。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的被标记底物，其中所述底物选自生物分子、微粒和纳米颗粒。
28.根据权利要求24所述的被标记底物，其中所述底物是选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、和蛋白的生物分子。
29.根据权利要求24所述的被标记底物，其中所述底物选自核苷酸、和核苷。
30.根据权利要求26所述的被标记底物，其中所述底物是寡核苷酸或包括寡核苷酸。
31.根据权利要求24所述的被标记底物，其中所述底物选自氨基酸、糖、肽和蛋白。
32.一种用于确定检定靶标的存在的检定试剂盒，其中所述检定试剂盒包括权利要求24～31中任一项所述的被标记底物。
33.一种通式I的化合物
其中，
Fc是被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
Fc’是被一个或多个选自以下的取代基取代的二茂铁基部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，且与Fc相同；
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是可以任选地被取代和/或可以任选地被-O-、-S-、环烷基、-CO-、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-间隔的C1～C12亚烷基链，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是连接基团，其选自羟基或受保护的羟基或含有羟基或受保护的羟基的基团。
34.根据权利要求33所述的化合物，其中各个二茂铁基部分被选自卤素、C1～C4烷基、卤代烷基、芳基、C1～C4烯基和氰基中的至少一个取代基所取代。
35.一种通式I的化合物
其中，
Fc和Fc’各自是未取代的二茂铁基部分，
X是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Y是任选地被-O-、-S-或-NR5-间隔的C1～C6亚烷基链，其中R5表示氢或C1～C6烷基；
Z是C6～C12亚烷基链，或是被一个或更多个取代基取代的和/或被选自-O-、-S-、环烷基、-CONR1-、-NR1CO-、或-NR1-的部分间隔的C1～C12亚烷基，其中R1表示氢或C1～C4烷基；并且
R是连接基团，其选自羟基或受保护的羟基或含有羟基或受保护的羟基的基团。
36.根据权利要求33～35中任一项所述的化合物，其中：
X表示-(CH2)x-，其中x为1～6；且
Y表示-(CH2)y-，其中y为1～6。
37.根据权利要求33～35中任一项所述的化合物，其中Z表示任选地被氧间隔的C6～C8亚烷基。
38.根据权利要求33～35中任一项所述的化合物，其中所述连接基团R包括能够与官能化部分或底物的相容基团反应以将所述化合物连接到所述官能化部分或所述底物的基团。
39.一种化合物，选自
40.N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇、或N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇的两个二茂铁基均被一个或更多个选自以下的取代基取代的化合物：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基。
41.一种被标记底物，包括从N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇或N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇的两个二茂铁基均被一个或更多个选自以下的取代基取代的化合物衍生而来的标记部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
其中所述底物选自碳水化合物。
42.一种被标记底物，包括从N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇或N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇的两个二茂铁基均被一个或更多个选自以下的取代基取代的化合物衍生而来的标记部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
其中所述底物选自氨基酸、核苷酸、核苷、糖、肽、蛋白、微粒和纳米颗粒。
43.一种被标记底物，包括从N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇或N,N-双二茂铁基甲基-6-氨基己醇的两个二茂铁基均被一个或更多个选自以下的取代基取代的化合物衍生而来的标记部分：卤素；C1～C4烷基；被选自羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基的一个或更多个基团取代的C1～C4烷基；氰基；C1～C4烯基；被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的C1～C4烯基；芳基；或被羟基、卤素、氰基、氧、氨基、酯基或酰氨基取代的芳基，
其中所述底物选自寡核苷酸、和多核苷酸。
44.一种检测核酸的方法，包括在允许探针与扩增子之间的杂交的条件下，使所述核酸与互补核酸探针接触，之后是选择性地使杂交的或未杂交的探针降解的步骤，其中所述探针标记有权利要求33～43中任一项所述的化合物，并且其中所述方法提供对标记所述探针的化合物的电化学活性进行测量的步骤，其中所述电化学活性定量地或定性地取决于所述探针的降解程度。
45.一种对标记有权利要求33～43中任一项所述的化合物的氨基酸、肽或蛋白进行检测的方法，包括测量所述化合物的电化学活性的步骤。
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