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CN103561765B - 补体因子b类似物及其用途 - Google Patents

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CN103561765B CN201280021957.3A CN201280021957A CN103561765B CN 103561765 B CN103561765 B CN 103561765B CN 201280021957 A CN201280021957 A CN 201280021957A CN 103561765 B CN103561765 B CN 103561765B
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李蓓蓓
罗天赐
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Abstract

本发明提供包含补体因子B类似物的多肽。本发明还提供各种补体因子B类似物和相关方法、核酸和载体，所述各种补体因子B类似物包括包含游离半胱氨酸的突变的补体因子B类似物。这些补体因子B类似物和相关方法、核酸和载体可用于调节补体途径或用于研究和/或治疗与补体途径相关的各种状况或疾病。

Description

补体因子B类似物及其用途
背景技术
补体系统是先天免疫和适应性免疫系统的组件(Volanakis,J.E.的综述,1998.第2章.In The Human Complement System in Health and Disease.由J.E.Volanakis和M.M.Frank主编.Marcel Dekker,Inc.,New York9-32页)。补体在微生物杀灭和免疫复合物的转运和清除方面起重要作用。补体系统的许多激活产物还与促炎症或免疫调节功能相关。所述补体系统由血浆和膜相关蛋白组成，所述膜相关蛋白以三种酶促激活级联来组织：经典途径、凝集素途径和替代途径(图1)。所有三种途径都可以导致终末补体复合物(TCC)和生物活性产物阵列的形成。
在某些情况下，补体激活通过特定的抗体识别以及与各种病原体和外源分子结合而启动，和/或通过补体蛋白与外源物质的直接相互作用而启动。一旦激活，这些途径引起蛋白酶复合物，C3-转化酶的形成。经典途径C3-转化酶(C4b2a)和替代途径C3-转化酶(C3bBb)都能够切割C3的α链，产生C3b。C3b具有与生物表面共价结合的潜力。C3b结合导致被多形核细胞和巨噬细胞吞噬的调理素作用。当可以获得另外的C3b时，C3-转化酶可以起C5-转化酶作用，切割C5，启动TCC的组装，或膜攻击复合物(MAC)的组装，所述膜攻击复合物通过将孔形成蛋白复合物插入靶细胞膜来介导细胞裂解。
在如图1A所示的经典途径中，C1q，第一组分(C1)的胶原亚成分，与在免疫复合物内的免疫球蛋白结合，其相关的丝氨酸蛋白酶，C1r和C1s，被激活。该补体级联通过之后对C4和C2的切割、随后C3激活来启动。产生的C3b片段不仅充当调理素还以裂解途径导致膜攻击复合物(MAC)的形成。在先天性免疫中，被命名为甘露糖-结合凝集素(MBL)相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)的由识别分子(凝集素)和丝氨酸蛋白酶组成的复合物，在与微生物表面上的糖类结合时通过凝集素途径激活C4和C2。该结合在不存在免疫球蛋白时发生。在有颌脊椎动物中发现的凝集素途径的识别分子是MBL和纤维胶凝蛋白(ficolin)，它们的特征在于存在胶原样结构域(例如C1q)和对GlcNAc具有共同结合特异性的糖类结合结构域。MASPs和C1r/C1s共有相同的结构域组织，并形成丝氨酸蛋白酶的亚家族。
先天性免疫中的凝集素补体途径与适应性免疫中的经典补体例如在它们的组分的结构和功能方面密切相关。两种途径通常通过由甘露糖-结合凝集素(MBL)相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)/C1r/C1s家族的胶原性蛋白和丝氨酸蛋白酶组成的复合物启动。据推测在进化上经典途径在凝集素途径之后出现。
如图1B中所示，替代补体途径的激活，通常在C3b蛋白(或C3i)与细胞和例如微生物表面等其它表面的组分结合时开始。C3b还能够与免疫球蛋白G(IgG)抗体结合。然后替代途径因子B蛋白与C3b蛋白结合，从而形成C3bB。之后因子D蛋白将结合的因子B蛋白分割成Bb和Ba片段，形成C3bBb。然后备解素与Bb结合从而形成C3bBbP，所述C3bBbP起能够将通常数以百计的C3分子酶促分割成C3a和C3b的C3转化酶的作用。一些C3b然后与一些C3bBb结合从而形成C3bBbC3b，该C3bBbC3b是能够将C5分子分割成C5a和C5b的C5转化酶。
由于C3b在血浆中是游离的，其能够与宿主细胞或病原体表面结合。为了防止补体激活在宿主细胞上进行，存在破坏补体激活过程的数种不同的调节性蛋白。补体受体1(CR1或CD35)和DAF(也称为CD55)与因子B竞争与细胞表面上C3b的结合，并且甚至能够从已形成的C3bBb复合物中除去Bb。当被称为因子I的血浆蛋白酶将C3b切割成其失活形式iC3b时，还可以防止C3转化酶的形成。因子I与诸如CR1和蛋白水解的膜辅因子(MCP或CD46)等C3b结合蛋白辅因子一起作用。另一补体调节性蛋白是因子H，其与因子B进行竞争，从蛋白酶中替换Bb，充当因子I的辅因子，或者优先与结合至脊椎动物细胞的C3b结合。
补体系统的精密功能依赖于其调节，因为补体级联的激活导致许多促成炎症的蛋白的产生。当有助于宿主防御时这是有益的，但是如果在自身组织上激活则是有害的。通常，血液中C3的激活保持在低水平，并且C3b沉积限制在病原体的表面。
人野生型补体因子B蛋白是由5个蛋白结构域组成的764个氨基酸的单链糖蛋白(约93-kDa)(Mole等,1984The J.Biol Chem,259:6,3407-3412)。人野生型补体因子B蛋白(fB)通常与N-末端25个氨基酸的信号肽一起表达，例如参见SEQ ID NO:1。人野生型补体因子B蛋白的氨基末端区(Ba)主要由三个短共有重复组成。中间区域是与冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor)中发现的结构域相似的A型结构域(Colombatti等,Blood(1991)77(11):2305-15)。羧基末端是丝氨酸蛋白酶(SP)结构域(Perkins和Smith,Biochem J.(1993)295(Pt1):109-14;Hourcade等,JBC(1998)273(40):25996-6000;Hourcade等，J Immunol.(1999)162(5):2906-11;Xu等,J BiolChem.2000275(1):378-85;Milder等.Nat Struct Mol Biol(2007)14(3):224-8)。
补体因子B类似物及其用于抑制补体和治疗补体介导的疾病的用途描述于PCT第WO08/106644号公开和美国专利US20100120665号公开中。例如，人补体因子B蛋白类似物，hfB3(描述于美国专利20100120665号公开)，是有效地抑制替代补体(AP)活性的显性负向人因子B蛋白变体。hfB3蛋白(SEQ ID NO:4)与人野生型因子B蛋白(SEQ ID NO:1)相比具有5个氨基酸改变。所述5个氨基酸改变使hfB3蛋白与野生型因子B蛋白相比能够(i)与C3b蛋白更紧密地结合，(ii)抵抗因子D蛋白的C3b依赖性切割，和(iii)与因子D蛋白更紧密地结合。hfB3蛋白与C3b蛋白和因子D蛋白的更紧密结合，封合在失活C3转化酶(hfB3)中的替代补体途径(ACP)的两个必需组分，阻断AP活性。由于C3b-结合的hfB3蛋白不能被因子D蛋白切割，不发生hfB3蛋白的构象变化，并且不激活hfB3蛋白的C末端处的丝氨酸蛋白酶。
人野生型补体因子B蛋白和hfB3都含有23个半胱氨酸。它们的“活性”形式使所有的半胱氨酸与其它半胱氨酸中的一个形成二硫键，例外是对应于SEQ ID NO:1的C292的半胱氨酸。hfB3和野生型因子B的“活性形式”的C292是游离半胱氨酸(Parkes等，1983Biochem J.213,201-209)，并且在各种哺乳动物物种中高度保守，例如参见以下表1。
本文参考文献的引用或讨论不应解释为承认它们是本发明的现有技术。
发明内容
本发明提供包含补体因子B类似物的多肽。本发明还提供各种补体因子B类似物。在某些实施方式中，补体因子B类似物包含游离半胱氨酸的突变。本发明还提供包含编码本发明的多肽和补体因子B蛋白类似物的核苷酸序列的核酸和病毒载体。本发明的某些实施方式提供细胞，其中所述细胞包含编码本发明的补体因子B蛋白类似物的核酸，并且其中所述细胞表达补体因子B蛋白类似物。
另外，本发明提供药物制品，所述药物制品包含本发明的多肽或补体因子B蛋白类似物、本发明的核酸、本发明的病毒载体或者它们的任意组合。
本发明还提供的是治疗补体介导的疾病的方法，所述方法包含对患者施用本发明的药物制品，本发明的多肽、本发明的补体因子B蛋白类似物、本发明的核酸、本发明的病毒载体或者它们的任意组合。
本发明还提供生产包含补体因子B蛋白类似物的多肽的方法，所述方法包括：在细胞中表达本发明的补体因子B蛋白类似物，和纯化所述补体因子B蛋白类似物。
本发明的多肽、本发明的补体因子B类似物、编码它们的核酸和载体能够用于调节补体途径，并且用于研究和/或治疗各种与补体途径相关的状况或疾病。
本发明基于以下发现：游离半胱氨酸的突变或去除(i)提高了活性和/或正确折叠的补体因子B蛋白类似物的产量(例如参见实施例9和10)；(ii)增强了补体因子B蛋白类似物的热稳定性(例如参见实施例13和14)；和/或(iii)减少了补体因子B蛋白类似物的聚集(例如参见实施例6)。
该发明内容不必描述本发明的所有特征或必需特征。本发明还可以在于所述特征的亚组合。
附图说明
为了说明本发明的目的，在附图中描述了本发明的一些实施方式。但是，本发明不限于附图中所述实施方式的精确排列和手段。
图1A描述了经典补体途径和凝集素补体途径。经典途径是通过C1启动，而凝集素途径通过甘露糖结合凝集素(MBL)启动。C4bC2a是将C3切割成C3a和C3b的蛋白酶，被称为C3转化酶。类似地，C4bC2aC3b将C5切割成C5a和C5b，被称为C5转化酶。C3a、C4a和C5a具有炎症性质，并且吸引吞噬细胞。C5b6-9形成膜攻击复合物(MAC)，其创造了不仅杀死感染源而且能够损害宿主细胞的膜孔。MASP是甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶。
图1B描述了替代补体途径。该途径通过C3的自发性切割而具有低水平的组成性活性。在存在适当表面时，C3b与补体因子B(fB)结合。该复合物然后被补体因子D(fD)切割，从而产生C3bBb。数分钟内该复合物的自发性解离(“衰变”)导致其失活，而备解素发挥的稳定化作用产生了切割C3的复合物，即，C3转化酶。数种减弱补体途径的因子通过促进C3和C5转化酶的衰变而减弱补体途径。C3b参与C3转化酶，以产生另外的C3b，由此如大箭头所示形成正反馈环。C3bBb是C3转化酶。C3bBbC3b是C5转化酶。
图2是hfB3-292S表达构建体。CMV-巨细胞病毒即早期启动子；IRES-内部核糖体进入位点；Neo-新霉素磷酸转移酶基因；SynPolyA-合成polyA；Amp-氨苄青霉素-抗性基因。SEQ ID NO:8是图2中所示的hfB3-292S表达构建体的核苷酸序列。
图3显示在细胞培养温育72小时(2x106细胞/mL)后含有hfB3或hfB3-292S蛋白的粗细胞培养物上清液的蛋白质印迹分析。泳道1，充当阴性对照的、来自初始未转染的293FreeStyle细胞的1μl细胞培养基；泳道2，充当阳性对照的、由血浆纯化的100ng人野生型因子B(Quidel,Santa Clara,CA)；泳道3，来自hfB3产生细胞的1μl细胞培养基；泳道4，来自hfB3-292S产生细胞的1μl细胞培养基。右侧示出以KDa为单位的分子量标记。
图4显示溶血性检测的结果。该结果证明了人替代补体途径溶血活性被粗hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白生产细胞培养基抑制。相对溶血活性通过因人替代补体途径活性而在rRBC溶血后释放出的血红蛋白进行评分。从左到右的X轴：补充有0μg纯化人因子B蛋白的因子B-耗尽的人血清(对照，没有rRBC的裂解)；在每个反应中补充有0.5μg纯化人因子B蛋白和1.0μg、0.5μg、0.25μg或0.125μg的hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的混合物的因子B-耗尽的人血清，如上所述，所述hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白来自产生hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的细胞的培养基。注意：100%抑制表示没有rRBC的裂解。Y轴表示平均OD405和标准偏差(SD)。
图5A显示从三步色谱过程纯化、进行SDS-PAGE和银染色分析的hfB3蛋白(200ng)。图5B显示了人替代补体途径溶血活性被纯化hfB3蛋白抑制。从左到右的X轴：补充有0μg纯化野生型人因子B蛋白(wt hfB)的因子B蛋白-耗尽的人血清(对照，没有rRBC的裂解)；在每个反应中补充有0.5μg纯化野生型人因子B蛋白和1.0μg、0.5μg、0.3μg、0.2μg、0.1μg或0.05μg的如上所述的hfB3的混合物的因子B蛋白-耗尽的人血清。100%抑制表示没有rRBC的裂解。Y轴表示平均OD405和SD。
图6显示两种hfB3蛋白群体的生物活性。所显示的是来自峰I和峰II的疏水相互作用色谱(HIC)纯化的hfB3蛋白抑制人替代补体途径溶血活性的结果。从左到右的X轴：补充有0μg纯化人因子B蛋白的因子B蛋白-耗尽的人血清(对照，没有rRBC的裂解)；在每个反应中补充有0.5μg纯化野生型人因子B蛋白和范围为1.0～0.05μg的各种量的hfB3蛋白的混合物的因子B蛋白-耗尽的人血清。100%抑制表示没有rRBC的裂解。Y轴表示平均OD405和SD。
图7显示在组织培养温育72小时(2x106细胞/mL)后，含有hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的粗细胞培养上清液的反相高压液相色谱(HPLC)。A)将来自hfB3产生细胞(………)，hfB3-292S蛋白产生细胞(______)和初始293细胞(_____)的上清液施加到Agilent HP1100HPLC系统，所述系统使用使用窄孔JupiterTMC4柱(Phenomenex)，并用50分钟的含有0.1%TFA的水/乙腈(25%～70%乙腈)梯度液洗脱。用PDA检测器在215nm监视洗脱。还示出在所有三种样品中存在的热休克70蛋白(HSP70)的位置。B)图7A中显示的色谱的放大区，聚焦于含有hfB3蛋白的峰I和II以及含有包含hfB3-292S蛋白的峰的区域(25分钟～29分钟)。
图8显示hfB3-Fc蛋白表达的分析，该分析通过使含有hfB3-Fc蛋白的2μl的细胞培养上清液进行非还原SDS-PAGE和蛋白印迹分析而进行(参见实施例12)。用左侧所示的以KDa为单位的分子量检测hfB3-Fc蛋白的两条带。
图9显示了小鼠的右前爪关节的石蜡切片的代表性H&E染色，所述小鼠来自如实施例16中所述的、就类风湿性关节炎在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)小鼠模型中测试hfB3-292S的研究。第1组是不接受胶原抗体鸡尾酒的载剂对照组。第2组是接受胶原抗体鸡尾酒的未处理组。第3组是接受胶原抗体鸡尾酒并用hfB3-292S处理的处理组。
图10显示来自如实施例16中所述的、就类风湿性关节炎在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)小鼠模型中测试hfB3-292S的研究中的关节肿胀测定。如该段落所述，这些组与图8中的组相同。与未处理组(第2组)相比，hfB3-292S引起具有统计学显著性(p＜0.0003)的关节肿胀的减少。
图11显示来自转染有hfB3-292SN480表达构建体的细胞的细胞培养基的蛋白印迹分析。该蛋白印迹分析使用对hfB3-292S具有特异性的单克隆抗体进行。左泳道含有hfB3-292S，右泳道是来自转染有hfB3-292SN480表达构建体的细胞的细胞培养基。该分析检测了来自hfB3-292SN480细胞系的细胞培养基的约55KDa的条带(右泳道)。
图12显示来自转染如以下实施例19所述的有hfB3-292S/Fc-mono表达构建体的细胞的细胞培养基的蛋白印迹分析。通过来自该非还原SDS-PAGE的纯化的山羊抗人因子B抗体来检测约115KDa的条带。
图13显示来自表达hfB3-292SN480的细胞的细胞培养上清液以剂量依赖性方式抑制了人替代补体途径溶血活性。
图14显示来自表达hfB3-292S/Fc-mono的细胞的细胞培养上清液以剂量依赖性方式抑制了人替代补体途径溶血活性。
序列说明
SEQ ID NO:1–野生型人补体因子B的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2–人补体因子B蛋白类似物hfB3-292S的氨基酸序列，其包含以下突变：K258A、R259A、K260A、D279G、N285D和C292S。
SEQ ID NO:3–人补体因子B类似物hfB3-292S-740N的氨基酸序列，相对于SEQID NO:1其包含以下突变：K258A、R259A、K260A、D279G、N285D、D740N和C292S。
SEQ ID NO:4–人补体因子B类似物hfB3的氨基酸序列，相对于SEQ ID NO:1其包含以下突变：K258A、R259A、K260A、D279G和N285D。
SEQ ID NO:5–hfB3表达构建体的核苷酸序列，其构建如实施例1所述。
SEQ ID NO:6-7–定点诱变的引物。
SEQ ID NO:8–hfB3-292S表达构建体的核苷酸序列，其构建如实施例2所述。
SEQ ID NO:9-14–分别来自人、小鼠、大鼠、猪、猴和绵羊的补体因子B蛋白的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO:15-16–定点诱变的引物。
SEQ ID NO:17–人补体因子B蛋白类似物hfB4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18–hfB3-Fc表达构建体的核苷酸序列，其构建如实施例12所述。
SEQ ID NO:19-20–定点诱变的引物。
SEQ ID NO:21–人补体因子B蛋白类似物hfB3-Fc的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22–人补体因子B蛋白类似物hfB3-292S-Fc的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23–人补体因子B蛋白类似物hfB3-292S-740N-Fc的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24–用于表达hfB3-292SN480的表达构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25–用于hfB3-292S/Fc-mono的核苷酸序列基因表达构建体。
SEQ ID NO:26–hfB3-292S/Fc-mono的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27-Fc结构域的氨基酸序列。
具体实施方式
除非另外指出，本发明的实施会使用作为本领域技术人员技能的细胞生物学、分子生物学、细胞培养和病毒学等的常规技术。这些技术在本文和/或现有文献中完全公开，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis eds.,"Molecular Cloning,A LaboratoryManual",第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Celis J.E."Cell Biology,A Laboratory Handbook"Academic Press,Inc.(1994)和Bahnson等,J.of Virol.Methods,54:131-143(1995)。
设想本文所述的任何方法、制品或组合物可以相对于本文所述的任何其它方法、制品或组合物执行。当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，单词“一种(a)”或“一个(an)”等的使用可以表示一种(个)，但其可以与“一种或多种”、“至少一种”和“一个或多于一个”的意思一致。在与列表一起使用时术语/词组“和/或”表示可以使用所列举项目中的一种或多种，例如，其不限于所述要素中的一个或全部。
在称为hfB3的补体因子B蛋白类似物(SEQ ID NO:4)的生产和纯化过程中，检测了两种补体因子B蛋白类似物的群体。例如参见图6和图7，一个群体具有补体因子B蛋白类似物的所需活性(峰I)，而另一群体具有实质上较低的所需活性(峰II)。来自两个群体的表征的结果表明，两个群体在其二硫键模式上是不同的。当将游离半胱氨酸(SEQ ID NO:4的292位)突变成丝氨酸时，未检测到峰II。图6显示：峰II级分展示了抑制补体/溶血活性的一定能力，但是与峰I级分相比每ug蛋白的所述能力低得多。可能通过峰II表现出的补体/溶血抑制活性主要或仅是峰II包含一些具有在292位的游离半胱氨酸的hfB3的结果，这可能是未完全相互分离的峰I和峰II的结果。
对应于SEQ ID NO:1的292位的半胱氨酸在不同哺乳动物物种的补体因子B蛋白中是高度保守的(例如参见表1)。高度保守序列通常对于蛋白的功能是重要的。“分子进化的中性学说论述了氨基酸的突变以随机恒定方式发生，只要所述突变对基因产物的功能没有影响即可[Kimura M:The neutral theory of molecular evolution.Sci Am1979,241(5):98-100,102,108各章节]。另一方面，对于蛋白质功能和结构重要的氨基酸在不对蛋白活性造成有害影响的情况下不能突变。因此，在给定蛋白家族中这些氨基酸在进化过程中会非常缓慢地变化。“(Liu等.BMC Bioinformatics2006,7:37)
表1.补体因子B蛋白中的保守性半胱氨酸
*C对应于人因子B(SEQ ID NO:1)的292位。
将补体因子B蛋白类似物的292位氨基酸处的半胱氨酸改变为丝氨酸(例如如SEQ ID NO:2(hfB3-292)中所示)，极大地减少(如果不消除的话)了峰II(实质上较低的活性)群体的量，并且hfB3-292S补体因子B蛋白类似物保持了其活性，所述活性在该情况下为抑制或减少补体活性的能力。(例如参见以下实施例10。)
不希望受理论束缚，hfB3蛋白的较低的活性群体(峰II级分)可能是hfB3蛋白错折叠的结果。可能峰II群体中大多数的产生归因于游离半胱氨酸和引入至hfB3蛋白的突变的组合，这是因为当将细胞工程化从而以与用于hfB3蛋白相似的方式表达野生型人补体因子B蛋白(SEQ ID NO:1)时，检测到仅野生型人因子B蛋白的一个群体。
该游离半胱氨酸的突变允许更高产率的活性补体因子B类似物，因为大多数(即使不是全部)所产生的补体因子B蛋白类似物为活性形式。另外，游离半胱氨酸的突变导致更稳定的蛋白，因为所有残余的未突变半胱氨酸是二硫键的一部分，并且没有剩下能够参与可能的未期望的有害反应的游离半胱氨酸。另外，使游离半胱氨酸突变似乎出人意料地减少或消除的补体因子B蛋白类似物的聚集，例如参见实施例6和图3。
描述于PCT公开号WO08/106644或美国专利公开号US20100120665(通过参考将它们的全文并入本文)中的补体因子B蛋白类似物可以使它们的游离半胱氨酸发生突变，并且仍然保留它们所需的功能，同时受益于突变的前述优点。因此，本发明包括描述于PCT公开号WO08/106644或美国专利公开号US20100120665中的具有游离半胱氨酸的突变的任何补体因子B蛋白类似物。
术语“游离半胱氨酸”是指作为蛋白或肽的一部分的半胱氨酸，其中所述游离半胱氨酸不与同一蛋白或肽中的另一半胱氨酸形成二硫键。在一些情况下，当蛋白类似物具有所需活性时，蛋白类似物的“游离半胱氨酸”不与(同一蛋白或肽中的)另一半胱氨酸形成二硫键，但是可以在较低活性或失活形式的蛋白类似物中与(同一蛋白或肽中的)另一半胱氨酸形成二硫键。
术语“补体介导的”是指涉及补体的过程或疾病。通常而言，“补体介导的”疾病或状况是指这样的疾病或状况：其中补体活性是所述疾病或状况的潜在原因之一并且其中补体活性的抑制或阻断减轻了所述疾病或状况的程度。许多补体介导的疾病或状况的实例在本文中有所描述。
可与“天然”交换使用的术语“野生型”(或野生类型)是指由哺乳动物基因组、天然存在的核酸等编码的天然存在的蛋白。在一些情况下，例如由于物种的不同个体中的等位基因差异、不同的同工型和/或遗传变异所致，可能实际上存在对应于野生型版本的多余1种的蛋白。
术语“类似物”是指蛋白(亲本蛋白)的结构衍生物。类似物不必保留亲本蛋白的所有性质，并且在一些情况下，与对应的天然亲本蛋白相比具有至少一种改变的性质。在一些实施方式中，亲本蛋白是天然(天然存在的)蛋白。通过对于所述蛋白的相应天然氨基酸序列替换、取代、缺失和/或添加氨基酸而产生类似物或变体蛋白。取代或插入通常涉及天然存在的氨基酸，但是还可以也包括合成或非常规氨基酸。在一些实施方式中，类似物或变体通过使蛋白突变(例如使编码蛋白的核酸突变)而生产。类似物通常会保留相应的天然亲本蛋白的氨基酸序列中的至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%(例如相对于规定的所述天然亲本蛋白在整个亲本蛋白的长度上或在特定实施方式中，在所述亲本蛋白的特定结构域或部分上具有该百分比氨基酸序列同一性)。类似物还包括全长类似物的片段，其包含所述氨基酸序列的一部分，并且保留亲本蛋白或全长类似物的一种或多种生物活性，或者抑制这些生物活性中的一种或多种。
当指特定蛋白中的氨基酸时，术语“对应于”、“与…对应”或“相应的”是指在该特定蛋白中的特定氨基酸，还指相关或类似蛋白中的氨基酸，并且可以提供与所述蛋白相似的功能。例如，可以发现人补体因子B中的氨基酸与鼠类补体因子B中或因子B的人等位基因变体中的氨基酸对应，这通常通过将两个氨基酸序列进行比对来确定。例如，本领域技术人员可以例如使用BLAST程序，将诸如SEQ ID NO:9-14等两个以上相关序列进行比对，以确定相应的氨基酸(例如，参见以上表1)。另外，可以通过将相关或不相关蛋白内的基序(例如蛋白酶切割基序)进行比对来确定相应的氨基酸。此类比对还可用于推导靶蛋白或其结构域的共有序列。
如本文所用，术语“基因”通常是指蛋白的编码区。但是，在本文的一些情况下显而易见的是术语“基因”还指与编码区可操作地连接的元件(例如调节性元件)，例如启动子、增强子、剪接位点(受体和/或供体)、多腺苷酸化信号、内含子、5’非翻译区、3’非翻译区等。
术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或用于人类的其它公认的药典中列出。
“治疗益处‘不必是特定疾病或状况(包括本文所述的任何疾病或状况)的治愈，而是包含通常包括疾病或状况的缓解、疾病或状况的消除、与疾病或状况相关的一种或多种症状的减少、由原发性疾病或状况的发作导致的第二疾病或状况的预防或缓解、降低发展疾病或状况的可能性、降低疾病或状况的严重性、改变疾病或状况的的特征、缩短疾病或状况的过程、减慢或预防疾病或状况的进程或恶化和/或预防疾病或状况。
补体因子B类似物
本发明包括补体因子B蛋白类似物和包含补体因子类似物的多肽以及它们的用途。本发明的一些实施方式包括补体因子B蛋白类似物，其中游离半胱氨酸已经突变。在一些实施方式中，游离半胱氨酸的该突变可以包括所述游离半胱氨酸的缺失或所述游离半胱氨酸被另一氨基酸取代。游离半胱氨酸可以被实质上任何氨基酸取代，其仍允许该补体因子B蛋白类似物保留至少一些所需特性，例如下游调节、减少或除去补体活性的能力。取代可以使用一种或多种氨基酸进行。在一些实施方式中，游离半胱氨酸被丝氨酸取代。在一些实施方式中，游离半胱氨酸被选自由丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组中的一种或多种氨基酸取代。在一些实施方式中，游离半胱氨酸对应于SEQ IDNO:1的292位氨基酸。
在一些实施方式中，本发明提供不包含游离半胱氨酸的补体因子B蛋白类似物。本发明还提供制造或生产补体因子B蛋白类似物的方法，所述方法包括使游离半胱氨酸突变。
游离半胱氨酸的突变可以与补体因子B蛋白的其它突变(例如如本文所述的其它突变)组合。
本发明还提供补体因子B蛋白类似物，其中与SEQ ID NO:1的292位氨基酸对应的半胱氨酸发生突变。该突变可以是缺失、插入或取代(例如被丝氨酸取代)，或者本文所述的其它突变。
类似物可以包括各种除天然存在的氨基酸序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸取代(例如保守性或非保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代通常不实质上改变亲本序列的结构特性(例如，取代的氨基酸不倾向于破坏亲本序列中存在的螺旋，或干扰表征亲本序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级结构和三级结构的实例描述于Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984));Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton等，Nature354:105(1991)。保守性取代包括但不限于来自以下组中的取代：酸性残基Asp(D)和Glu(E)；碱性残基Lys(K)、Arg(R)和His(H)；亲水性不带电残基Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)；脂肪族不带电残基Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)；非极性不带电残基Cys(C)、Met(M)和Pro(P)；芳香族残基Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)；含醇基团残基S和T；脂肪族残基I、L、V和M；环烯烃相关残基F、H、W和Y；疏水性残基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y；带负电残基D和E；极性残基C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T；带正电残基H、K和R；小残基A、C、D、G、N、P、S、T和V；非常小的残基A、G和S；参与转角形成的残基A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T；和柔性残基Q、T、K、S、G、P、D、E和R。
在一些实施方式中，使用非保守性取代。
在一些实施方式中，突变包括但不限于一个或多个氨基酸的取代、一个或多个氨基酸的缺失或者一个或多个氨基酸的插入。突变包括但不限于以下那些，它们：(1)减少补体因子B类似物对蛋白水解的易感性，(2)减少补体因子B类似物对氧化的易感性，(3)改变补体因子B类似物形成蛋白复合物的结合亲和性，(4)改变(例如增加或降低)补体因子B类似物的结合亲和性，(5)减少补体因子B类似物的免疫原性；(6)增加补体因子B类似物的稳定性(例如热稳定性)；(7)减少补体因子B蛋白类似物的聚集；或1-7的任意组合。
在一些实施方式中，本发明的人补体因子B类似物与天然补体因子B竞争结合。例如，天然补体因子B可以与补体因子C3b结合从而形成C3bB，例如参见图1B。作为C3bB复合物一部分的因子B可以结合因子D。因此，在一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物可以与天然因子B就(i)与C3b结合、(ii)与因子D结合或(iii)与C3b和因子D结合进行竞争结合。
在一些实施方式中，本发明补体因子B蛋白类似物是具有形成二硫键的半胱氨酸的SEQ ID NO:4的类似物，游离半胱氨酸被另一氨基酸、多于一个氨基酸取代，或没有被取代而是缺失。
在本发明的一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物与相应的天然补体因子B蛋白相比具有增加的C3b结合亲和性，并且所述补体因子B蛋白类似物包含(i)与相应的天然补体因子B蛋白相比减少的蛋白酶活性；(ii)与相应的天然补体因子B蛋白相比减少的被因子D蛋白切割的能力；或(iii)与相应的天然补体因子B蛋白相比减少的蛋白酶活性和与相应的天然补体因子B蛋白相比减少的被因子D蛋白切割的能力。
在一些实施方式中，补体因子B类似物包含在所述C3b结合域中的突变，并且所述补体因子B蛋白类似物与相应的天然补体因子B蛋白对C3b的结合亲和性相比展示了增加的对C3b的结合亲和性。在一些实施方式中，在所述C3b结合域中的突变包括：(i)与SEQ ID NO:1的279位氨基酸对应的天冬氨酸的取代或缺失，和/或与SEQ ID NO:1的285位氨基酸对应的天冬酰胺的取代或缺失；或(ii)紧邻所述天冬氨酸或所述天冬酰胺的至少一个氨基酸的插入。在一些实施方式中，该天冬氨酸和/或天冬酰胺被一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1的279位氨基酸对应的天冬氨酸被甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺取代。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1的285位氨基酸对应的天冬酰胺被甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸取代。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1的279位氨基酸对应的天冬氨酸被甘氨酸取代，与SEQ ID NO:1的285位氨基酸对应的天冬酰胺被天冬氨酸取代。
在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物是基于人补体因子蛋白的人补体因子B蛋白类似物。
本发明包括补体因子B蛋白类似物，例如该补体因子B蛋白类似物可以作为蛋白和/或通过基因转移被递送以削弱补体激活的替代途径。这些类似物可以克服阻碍一些补体抑制剂的发展的障碍，例如包括：1)避免长期全身免疫抑制；2)实现面对血液中补体因子的惊人高水平时的功效；3)为了功效实现治疗性补体因子B蛋白类似物在视网膜和玻璃膜中的足够水平和分布；4)实现治疗性补体因子B蛋白类似物在玻璃疣内的活性；5)实现治疗递送的足够持续时间以治疗慢性疾病；6)在眼后部中实现功效而不会有害地妨碍经典补体途径活性；和/或7)避免或减少对治疗剂的免疫反应(例如，局部免疫反应)。
削弱替代途径中的正反馈环是下调整个替代途径的手段。用于削弱替代途径反馈环的一个合适的手段是干扰补体因子B(fB)蛋白功能或水平。本发明的一些实施方式使用补体因子B类似物以削弱补体活性。
本发明的补体因子B蛋白类似物可以包含对应于SEQ ID NO:1的选自由K258A、R259A、K260A、D279G、N285D和D740N突变组成的组中的至少一个突变。在一些实施方式中，其包含对应于SEQ ID NO:1的K258A、R259A、K260A、D279G和N285D的突变。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的D740N的突变。
出于说明性目的，本文描述补体因子B蛋白的具体类似物。因子B蛋白可以以许多方式进行操作，以便例如抑制或减少替代途径的激活。在一些实施方式中，可以例如通过定点诱变改变因子B的特定位点，从而使分子不再完全正确地起作用。在一些实施方式中，所述分子的酶部分或结构域(例如蛋白酶结构域，其是丝氨酸蛋白酶)可以改变为使得该分子不再具有酶促活性或具有减少的酶促活性(例如减少至少2倍、5倍、10倍、50倍或100倍)。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含丝氨酸蛋白酶结构域的活性位点处的突变，其中与相应的天然补体因子B蛋白相比，所述突变减少或消除了所述补体因子B蛋白类似物切割补体因子C3的能力。
在一些实施方式中，这可以通过改变对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸而实现。在一些实施方式中，该突变包含对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的天冬氨酸的缺失或取代。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的天冬氨酸(D)被诸如天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)等另一氨基酸取代。本文的特定因子B氨基酸的编号涉及包括信号肽的整个多肽，并且反映在SEQ ID NO:1中。Hourcade等(JBC(1998)273(40):25996-6000)注意到SEQID NO:1的739-746位氨基酸(在Hourcade等中称为714-721位氨基酸，因为Hourcade等的编号不包括25个氨基酸的信号序列/肽)在因子B蛋白的丝氨酸蛋白酶功能中起作用。另外，N693、T694和D740可以组成底物结合位点或作为底物结合位点的一部分，H526、D576和S699可以组成催化中心或作为催化中心的一部分，例如参见Xu等,J Biol Chem.2000275(1):378-85。在一些实施方式中，因子B蛋白类似物包含选自SEQ ID NO:1的739-746位氨基酸的至少一个氨基酸的突变。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的739位氨基酸的氨基酸被丙氨酸取代。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的氨基酸被选自由天冬酰胺、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成的组中的氨基酸取代。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的741位氨基酸的氨基酸被选自由色氨酸和丙氨酸组成的组中的氨基酸取代。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的742位氨基酸的氨基酸被谷氨酰胺取代。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ IDNO:1的743位氨基酸的氨基酸被苯丙氨酸取代。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的745位氨基酸的氨基酸被苯丙氨酸取代。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包含对应于SEQ ID NO:1的746位氨基酸的氨基酸被色氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方式中，因子B蛋白类似物包含SEQ IDNO:1的693和694位氨基酸中的一个或两个的突变，例如取代或缺失。在一些实施方式中，因子B蛋白类似物包含SEQ ID NO:1的526、576和699位氨基酸中的一个或两个的突变，例如取代或缺失。
因子B中可以发生改变的其它位点包括：1)用于备解素的结合位点(备解素结合域)，以使结合以较低亲和性(例如，与野生型因子B蛋白相比亲和性减少例如至少2倍、5倍、10倍、50倍或100倍)或以较高亲和性(例如，与野生型因子B相比亲和性增加例如至少为2倍、5倍、10倍、50倍或100倍)发生；2)用于C3b蛋白的结合位点(C3b结合域)，以使结合以较低亲和性(例如，与野生型因子B蛋白相比亲和性减少例如2倍、5倍、10倍、50倍或100倍)或以较高亲和性(例如，与野生型因子B相比亲和性增加至少为例如2倍、5倍、10倍、50倍或100倍)发生；例如，这可以通过将对应于SEQ ID NO:1的279位和/或285位的氨基酸用其它氨基酸取代来实现，例如，其中在对应于279位的位置处的氨基酸被天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代，和/或在对应于285位的位置处的氨基酸被天冬氨酸(D)或丙氨酸(A)取代)；3)因子D作用的位点以使因子D具有减少的切割因子B形成Bb的活性，或不再切割因子B形成Bb(例如，在因子D切割位点，对应于SEQ ID NO:1的258、259或260位的位置处的至少一个氨基酸例如可以改变为丙氨酸(A)，或；以上1、2和/或3的组合。
在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物包括补体因子D切割位点的改变，其中所述改变减少或消除了因子D蛋白度所述补体因子B蛋白类似物的切割。在一些实施方式中，因子D切割位点的改变包括(i)：对应于SEQ ID NO:1的259位氨基酸的精氨酸的取代或缺失，对应于SEQ ID NO:1的258位或260位氨基酸的一个或两个赖氨酸的取代或缺失，或者说是所述精氨酸和两个赖氨酸的取代或缺失；或(ii)紧邻所述精氨酸、紧邻所述一个或两个赖氨酸或者紧邻所述精氨酸和一个或两个所述赖氨酸的插入。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物的对应于SEQ ID NO:1的258-260位氨基酸的氨基酸各自被丙氨酸替换。
本发明包括：(i)与因子C3b和D都结合的补体因子B蛋白类似物；(ii)与因子C3b和D的结合都增加的补体因子B蛋白类似物(与其天然形式相比)；(iii)与因子D蛋白的结合增加的补体因子B蛋白类似物(与其天然形式相比)；和(iv)与C3bB复合物的结合增加的补体因子B蛋白类似物(与其天然形式相比)。本发明还包括使用诸如以上i至iv等本发明的补体因子B蛋白类似物抑制补体途径的方法。
在一些实施方式中，增加的结合是增加约1.5倍～10,000倍、约10倍～10,000倍、约100倍～10,000倍、约1,000倍～10,000倍、约1.5倍～1,000倍、约1.5倍～100倍、约1.5倍～10倍、约2倍～5倍、约2倍～10倍、约5倍～10倍、约5倍～20倍、约10倍～20倍、约10倍～30倍、约20倍～30倍、约30倍～50倍、约50倍～100倍、约100倍～500倍、约500倍～1,000倍、约1,000倍～5,000、或约5,000倍～10,000倍。在一些实施方式中，增加的结合是增加大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000或10,000倍。在一些实施方式中，例如与野生型蛋白相比增加的结合可以通过免疫沉淀或使用Biacore(GEHealthcare,Piscataway,NJ)测定。作为以上(i)的实例，可以通过以下方式测定结合：使所述蛋白与C3b蛋白的结合分子免疫沉淀，然后例如使用诸如ELISA或蛋白质印迹等免疫测定检测免疫沉淀物中的因子D蛋白，例如在免疫测定检测中增加的结合表现为强度增加的带。
与野生型因子B与C3b和/或因子D的结合相比，本发明的一些因子B蛋白类似物与C3b蛋白和/或因子D蛋白的结合增加2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍。在一些实施方式中，增加的结合可以用过免疫沉淀或使用Biacore(GE Healthcare,Piscataway,NJ)来测定。
本发明的一些修饰因子B蛋白类似物包含一个或多个本文所讨论的氨基酸改变，并且另外具有一个或多个另外的氨基酸取代、插入或改变(例如，至少或不多于1、2、5、8、10、15、20、50、100或200个改变)，所述类似物保留了本文讨论的因子B蛋白类似物的对C3b和/或因子D的增加的结合或其它生物活性，其介导补体途径的抑制。此类类似物可以与野生型因子B蛋白(例如SEQ ID NO:1的氨基酸序列)具有至少99.9%、99%、98%、95%、90%、85%、80%、75%或70%的氨基酸序列同一性，并且保留了与C3b和/或因子D的增加的结合。
在补体因子B蛋白类似物的基因治疗和表达的情况下，改变/突变会反映在编码核酸的水平上。因此，还可以对所述核酸进行修饰，以增强表达。例如，具体的宿主细胞可以偏爱特定的密码子。因此，在偏爱特定密码子的情况中，例如在具体的哺乳动物表达系统或细胞中，可以重编码。
本发明的一些实施方式涉及用于生产补体因子B蛋白类似物的多核苷酸和宿主细胞(或宿主多细胞有机体)，和涉及所述类似物，例如hfB3-292S(SEQ ID NO:2)、hfB3-292S-740N(SEQ ID NO:3)、hfB3-292S-Fc(SEQ ID NO:22)、hfB3-292S-740N-Fc(SEQ ID NO:23)或hfB3-292S/Fc-mono(SEQ ID NO:26)。还提供分离这些补体因子B蛋白类似物和测试这些补体因子B蛋白类似物的补体介导的活性的方法。本发明的一些方面涉及药物组合物/制品，其中补体因子B蛋白类似物在治疗和/或预防背景下是活性成分。本发明的一些实施方式还涉及使用治疗有效量的补体因子B蛋白类似物治疗补体介导的疾病的方法。
在本发明的一些实施方式中，补体因子B类似物可以包含与在天然存在的补体因子B上的糖基化模式不同的糖基化模式，或可以完全缺乏糖基化模式。可以例如使用犬胰微粒体系统(例如，参见Mueckler和Lodish(1986)Cell44:629以及Walter,P.(1983)Meth.Enzymol.96:84)等，向因子B类似物添加糖类和/或从因子B类似物除去糖类，所述因子B类似物包含用于体外N-和/或O-连接的糖基化的糖基化位点序列。可以生产本发明的补体因子B类似物，例如包括添加对应于糖基化位点的氨基酸序列或使对应于糖基化位点的氨基酸序列缺失/突变，例如改变蛋白的糖基化模式/状况可以改变蛋白的功能特性。例如，与野生型因子B(SEQ ID NO:1)相比，hfB2,hfB3(SEQ ID NO:4)、hfB3-292S(SEQ ID NO:2)、hfB3-292S-740N(SEQ ID NO:3)、hfB3-292S-Fc(SEQ ID NO:22)、hfB3-292S-740N-Fc(SEQ ID NO:23)和hfB3-292S/Fc-mono(SEQ ID NO:26)包含N285D取代，这导致除去N-糖基化位点。(所述hfB2和hfB3补体因子B蛋白类似物都详细地描述于美国专利公开号US20100120665)。N-糖基化位点的失去改变了所述蛋白的特性。可以通过在具有改变的糖基化模式或不将该N285糖基化的细胞中生产所述蛋白而实现相同的效果。例如，可以在不将该N285糖基化的大肠杆菌细胞中生产因子B蛋白或类似物。在一些实施方式中，在不将对应于野生型因子B蛋白的通常被糖基化的氨基酸(其例如对应于SEQ ID NO:1的N285氨基酸)糖基化的细胞(例如，大肠杆菌)中生产补体因子B蛋白类似物。
如PCT公开号WO08/106644和美国专利公开号US20100120665中所证明的，在一些情况下来自一个物种的天然因子B蛋白可以在来自另一物种的补体反应/途径中具有活性。因此，本发明还包括来自一个物种的补体因子B蛋白类似物，所述补体因子B蛋白类似物用于抑制另一物种中的补体活性。
在一些实施方式中，将本发明的补体因子B蛋白类似物聚乙二醇化，例如参见Roberts等,Advanced Drug Delivery Reviews54(4):459-476(2002)；Veronese,Biomaterials22(5):405-417(2001)；Fee和Alstine,Chemical Engineering Science61(3):924-939(2006)；Kodera等,Progress in Polymer Science23(7):1233-1271(1998);Morar,Biopharm International19(4):34(2006)；以及Veronese和Pasut,Drug DiscoveryToday10(21):1451-1458(2005)。可以将聚乙二醇(PEG)连接到本发明的补体因子B蛋白类似物。在一些实施方式中，PEG通过PEG的位点特异性缀合(例如缀合至补体因子B类似物的N末端或C末端)或通过赖氨酸残基上存在的ε氨基连接(可带有多功能连接物或不带有多功能连接物)。在一些实施方式中，可以使用引起生物活性最小损失的直链或支链聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱密切监视缀合程度，以确保PEG分子正确缀合至补体因子B类似物。在一些实施方式中，通过尺寸排阻色谱和/或通过离子交换色谱将未反应的PEG与PEG缀合物分离。
在特定实施方式中，对补体因子B类似物的羧基末端和/或氨基末端进行化学修饰。可以将诸如酰化(例如乙酰化)或烷基化(例如甲基化)等氨基末端修饰和诸如酰胺化等羧基末端修饰以及其它末端修饰(包括环化)引入本发明的各种实施方式中。对核心序列进行特定的氨基末端和/或羧基末端修饰和/或肽延伸(例如融合至异源多肽，例如白蛋白、免疫球蛋白或其一部分，例如免疫球蛋白Fc结构域)，可以提供有利的物理、化学、生化和药学性质，例如：增强的稳定性、增加的效力和/或功效、对血清蛋白酶的抗性和期望的药代动力学性质等。
在一些实施方式中，本发明的补体因子B蛋白类似物包括免疫球蛋白Fc结构域，例如人免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域是相应的补体因子B类似物氨基酸序列的C末端。在一些实施方式中，Fc结构域包含SEQ ID NO:21的766-990位氨基酸或者SEQ ID NO:26的766-1003或786-1003位氨基酸，或者由SEQID NO:21的766-990位氨基酸或者SEQ ID NO:26的766-1003或786-1003位氨基酸组成。在一些实施方式中，Fc结构域是SEQ ID NO:27的1-239或2-239位氨基酸。在一些实施方式中，Fc结构域是人Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域来自免疫球蛋白，例如诸如IgG4等IgG。在一些实施方式中，Fc结构域能够与另一Fc结构域形成二聚体。在一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物能够通过例如但不限于Fc结构域的相互作用形成二聚物(例如同源二聚体)。在一些实施方式中，补体因子B类似物不形成二聚体，或大多数补体因子B类似物群体/制品为单体形式。在一些实施方式中，包含Fc结构域的补体因子B类似物不形成二聚体，或大多数该补体因子B类似物群体/制品为单体形式。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含在Fc结构域序列中具有半胱氨酸(例如参与Fc结构域的二聚体化的半胱氨酸)的一个或多个突变的Fc结构域。在一些实施方式中，Fc结构域包含对应于SEQ ID NO:27的17和/或20位氨基酸的一个或多个半胱氨酸的突变。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含在Fc结构域序列中具有游离半胱氨酸的一个或多个突变的Fc结构域。在一些实施方式中，半胱氨酸被选自由组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组中的氨基酸取代。在一些实施方式中，使半胱氨酸缺失。在一些实施方式中，在补体因子B类似物和Fc区的氨基酸序列之间使用氨基酸序列连接物。在一些实施方式中，该连接物是一个氨基酸，例如精氨酸。
在一些实施方式中，多肽包含截短的补体因子B类似物和Fc区，例如包含对应于SEQ ID NO:2的26-480位氨基酸的氨基酸和Fc区。
本发明还提供作为补体因子B蛋白或类似物的片段的类似物，该类似物包含所述补体因子B蛋白或类似物的至少20、30、50、70、100、150、200、300、400、480、500、600或700个氨基酸的部分，和/或包含所述蛋白的1、2或3个结构域，并且具有或保留野生型补体因子B蛋白或类似物的一种或多种生物活性，和/或充当补体系统(经典途径和/或替代途径)方面的抑制剂。可以通过与另一蛋白或诸如Fc等片段连接或融合而进一步对这些片段进行修饰，以增加类似物的稳定性和/或半衰期。在一些实施方式中，类似物是补体因子B蛋白或类似物的片段，并且所述片段与野生型补体因子B的相应氨基酸序列具有至少99.5%、99%、98%、95%、90%、85%或62%的同一性。
本发明提供包含补体因子B蛋白或类似物的片段的蛋白，其中所述片段具有N末端和/或C末端截短。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含C末端截短，其中所述类似物在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的407、427、457、477、480、484、487、507或527位氨基酸的氨基酸处或在这些氨基酸之后(C末端)截短。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含C末端截短，其中所述类似物在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的407-487、470-495或477-487位氨基酸的氨基酸之间的氨基酸处截短。在一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物不包含对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的408-764、428-764、458-764、478-764、481-764、485-764、488-764、507-764、527-764位氨基酸的氨基酸。在一些实施方式中，因子B蛋白或类似物的截短或片段化可以形成游离半胱氨酸。例如，截短可以产生天然补体因子B蛋白中形成二硫键的半胱氨酸对中的一个半胱氨酸的缺失，由此形成含有半胱氨酸，但不含有其天然半胱氨酸“配对物(partner)”的多肽。在某些这些实施方式中，使半胱氨酸对的残留半胱氨酸缺失，例如被诸如丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸等另一氨基酸取代，或者可以使所述半胱氨酸缺失，例如以消除可能的不期望的二硫键合。
本发明的类似物可以通过各种技术制备，包括但不限于化学合成或通过重组类似物的表达。
编码人因子B的基因和编码区的核苷酸序列，以及氨基酸序列是本领域已知的。例如，在NCBI数据库登录号NG_000013中发现编码人因子B的基因。在NCBI数据库登录号NM_001710中发现人因子B的编码序列，在NCBI数据库登录号NP_001701或P00751中发现人补体因子B前蛋白原的氨基酸序列。其它动物物种的序列也是本领域已知的。通过比较，在小鼠因子B蛋白序列(例如参见NCBI数据库登录号P04186)中，第三SCR结构域位于该761个氨基酸前蛋白原的160-217位，成熟鼠类因子B蛋白横跨23-761位。小鼠因子B蛋白的前22个氨基酸包含信号序列。
通常，人因子B前蛋白原是具有信号肽的764个氨基酸的蛋白(例如参见SEQ IDNO:1)，所述信号肽横跨1-25位氨基酸。因子B的成熟链对应于26-764位(例如参见SEQ ID NO:1)。人因子B的三个SCR区是SCR1(也称为Sushi1，横跨约35位～约100位)、SCR2(也称为Sushi2，横跨约101位～约160位)和SCR3(也称为Sushi3，横跨约163位～约220位)。
PCT公开号WO08/106644和美国专利公开号US20100120665特别描述了命名为hfB1、hfB2和hfB3的三个具体的显性负向人因子B蛋白类似物。这三个类似物中的第一个称为fB1，含有在因子B(fB)蛋白酶位点处的突变氨基酸。该fB部分以正常的亲和性和动力学结合C3b，但是在被因子D(fD)作用且被备解素稳定化时，不充当蛋白酶并且不形成C3转化酶。fB1在对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的氨基酸处含有被N取代(例如D740N)。这些补体因子B类似物中的第二个称为fB2，改变了与fB1相同的氨基酸，但是此外，还改变了C3b结合域中的两个另外的氨基酸(在对应于SEQ ID NO:1的279和285位氨基酸的氨基酸处的取代)，这增加了fB2与C3b的结合亲和性，例如D279G,N285D和D740N变化。N285D取代除去推定的N糖基化位点。这些补体因子B蛋白类似物中的第三个称为hfB3，组合了增加C3b与fB2结合的突变和敲除被因子D切割的位点的突变，特别是在对应于SEQ ID NO:1的258、259和260位残基的氨基酸处的取代以及在对应于279和285位的氨基酸处的取代组合，例如K258A,R259A,K260A,D279G和N285D变化。野生型fB被因子D切割激活了fB蛋白酶。因此，具有其5个氨基酸变化的hfB3，有效地结合C3b，但是具有最小的蛋白酶活性。
hfB1、hfB2和hfB3是人因子B类似物的实例，其可以通过使对应于SEQ ID NO:1的292位氨基酸的游离半胱氨酸突变(例如通过用丝氨酸取代所述半胱氨酸)而修饰为本发明的补体因子B类似物，但是本发明不限于这些具体的类似物。本发明的一些实施方式包括调节补体途径并且不包含游离半胱氨酸的任何补体因子B类似物。在一些实施方式中，除了游离半胱氨酸之外，突变的补体因子B类似物包含对应于SEQID NO:1中一个或多个以下氨基酸的氨基酸的一个或多个突变：258、259、260、279、285、739、740、741、742、743、744、745和746位氨基酸。这些一个或多个突变可以是所述氨基酸的取代或缺失，或者紧邻相应氨基酸或在相应氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内的至少一个氨基酸的添加。在一些实施方式中，该添加干扰、改变、增强或抑制了所列氨基酸的功能，例如干扰以下作用(i)在另一蛋白质的切割中的作用(例如740)，(ii)作为被另一蛋白质切割的位点(例如，对应于SEQID NO:1的258、259和/或260位残基的氨基酸)，或(iii)其在结合另一蛋白质中的作用(例如对应于SEQ ID NO:1的279或285位残基的氨基酸)。
本发明的一些实施方式包含与对应于SEQ ID NO:1的258、259和/或260位的一个或多个氨基酸相应的氨基酸例如被选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含与对应于SEQ ID NO:1的258、259和/或260位的一个、两个或三个氨基酸相应的氨基酸的缺失。本发明的一些实施方式包含紧邻对应于SEQ ID NO:1的258、259和/或260位氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸中至少一个的添加。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的739位氨基酸的氨基酸的取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的739位氨基酸的氨基酸例如被选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的739位氨基酸的氨基酸的缺失。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的氨基酸例如被选自由谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸和酪氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的氨基酸例如被选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸和酪氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的740位氨基酸的氨基酸的缺失。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的741位氨基酸的氨基酸例如被选自由色氨酸和丙氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的741位氨基酸的氨基酸例如被选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQID NO:1的741位氨基酸的氨基酸被选自由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的741位氨基酸的氨基酸的缺失。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的742位氨基酸的氨基酸的例如被谷氨酰胺取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的742位氨基酸的氨基酸例如被选自由谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的742位氨基酸的氨基酸的缺失。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的743和/或745位氨基酸的氨基酸的例如被苯丙氨酸取代。本发明的一些实施方式包括对应于SEQ ID NO:1的743和/或745位氨基酸的氨基酸被选自由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的743、744和/或745位氨基酸的一个或多个氨基酸的缺失。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的746位氨基酸的氨基酸例如被选自由色氨酸和丙氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的746位氨基酸的氨基酸例如被选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQID NO:1的746位氨基酸的氨基酸被选自由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的746位氨基酸的氨基酸的缺失。
本发明的一些实施方式包含与对应于SEQ ID NO:1的739、740、741、742、743、744、745和/或746位氨基酸的氨基酸紧邻的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的插入，或者对应于SEQ ID NO:1的739、740、741、742、743、744、745和/或746位氨基酸的氨基酸中的任何一个或多个被1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸取代。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的279位氨基酸的氨基酸例如被选自由甘氨酸、丙氨酸和天冬酰胺组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的279位氨基酸的氨基酸被选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的279位氨基酸的氨基酸被选自由天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的279位氨基酸的氨基酸的缺失。本发明的一些实施方式包含与对应于SEQ ID NO:1的279位氨基酸的氨基酸紧邻的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的插入，或者对应于SEQ ID NO:1的279位氨基酸的氨基酸被1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸取代。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的285位氨基酸的氨基酸例如被选自由丙氨酸和天冬氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的285位氨基酸的氨基酸被选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQID NO:1的285位氨基酸的氨基酸被选自由天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺组成的组中的氨基酸取代。本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的285位氨基酸的氨基酸的缺失。本发明的一些实施方式包含与对应于SEQ ID NO:1的285位氨基酸的氨基酸紧邻的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的添加，或者对应于SEQ ID NO:1的285位氨基酸的氨基酸被1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸取代。
本发明的一些实施方式包含对应于SEQ ID NO:1的279、282、283、284和285位氨基酸的一个或多个氨基酸的取代。在一些实施方式中，这些氨基酸分别被甘氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、组氨酸和天冬氨酸替换。
如本文所述，本发明的一些实施方式包含SEQ ID NO:1的258、259、260、279和285位的氨基酸的突变。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供因子B蛋白类似物，其包含SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列(可选的是，不具有任何信号序列，例如包含于其中的1-25位氨基酸)。这些因子B蛋白类似物可用于本发明的方法中。
本发明包括补体因子B蛋白类似物，其包含本文所述的突变(取代、缺失和添加)的组合。在一些实施方式中，这些补体因子B类似物保留hfB1、hfB2、hfB3、hfB3-292S或hfB3-292S-740N类似物或本文讨论的任何其它补体因子B类似物的一种或多种属性。本发明还提供作为具有本文讨论的类似物(例如hfB3-292SN480)的一种或多种属性的这些类似物的片段(例如包含具有本文提出的一个或多个氨基酸突变的补体因子B蛋白的一个或多个结构域)的类似物。此外，所述类似物还包含另外的氨基酸取代、缺失或插入(例如，保守性氨基酸取代、N末端或C末端的截短等)，从而使所述类似物与相应的野生型补体因子B具有至少99.5%、99%、98%、95%、90%、85%、80%、75%或75%的同一性，或在包含补体因子B的片段的类似物的情况下，在该类似物的相应部分和野生型补体因子B之间，所述类似物具有知识99.5%、99%、98%、95%、90%、85%、80%、75%或70%的同一性。
hfB3-292S和hfB3-292SN480蛋白从N末端至C末端具有以下关键特征：1)用于有效分泌出诸如人293细胞、CHO细胞、BHK细胞等哺乳动物表达细胞的因子B蛋白天然信号序列；2)突变的C3b-依赖性因子D蛋白切割位点(将氨基酸从K258R259K260改变为A258A259A260)；3)突变的C3b蛋白结合位点(将氨基酸从D279改变为G279，和将氨基酸从N285改变为D285)，以使其与C3b蛋白紧密结合并被其捕获；和4)突变的游离半胱氨酸(将C292氨基酸改变为S292)，以增加“活性”或正确折叠的蛋白的量。
在本发明的一些实施方式中，人补体因子B蛋白类似物与以下序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的同一性：(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23；(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的26-764位氨基酸；(iii)SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的1-990或26-990位氨基酸；SEQ ID NO:2的26-480位氨基酸；和(iv)SEQ ID NO:26的1-1003或26-1003位氨基酸。在一些实施方式中，本发明的人补体因子B蛋白类似物包含：(i)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26；(ii)SEQ ID NO:2的1-480位氨基酸；(iii)SEQ ID NO:2的26-480位氨基酸；(iv)SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的26-764位氨基酸；(v)SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的26-990位氨基酸；或(vi)SEQ ID NO:26的26-1003位氨基酸。在一些实施方式中，补体因子B蛋白类似物基本上由以下序列组成：(i)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的26-764位氨基酸；(ii)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的26-480位氨基酸；(iii)SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23的26-990位氨基酸；或(iv)SEQ ID NO:26的26-1003位氨基酸。
图1描述了经典和凝集素补体途径(图1a)和替代补体途径(图1b)。两种途径都利用C3b。C3bBb补体是将C3转化成C3b的C3转化酶。数分钟内C3bBb的自发性解离("衰变")导致其失活，而备解素稳定C3bBb复合物。C3b参与C3转化酶，以产生另外的C3b，由此如大箭头所示形成正反馈环。诸如衰变加速因子(DAF)等数种减弱补体途径的因子通过促进C3转化酶C3bBb的衰变而减弱补体途径。不希望受理论限制，一些本文所述的补体因子B类似物代替天然补体因子B结合C3b，由此与天然补体因子B竞争对C3b结合。一些本发明的补体因子B类似物结合C3b，以形成失活复合物或与天然C3bBb复合物相比具有显著减少的C3转化酶活性的复合物。
本发明还提供补体因子B类似物，该补体因子B类似物包含对应于补体因子B中与加速C3bBb复合物的衰变的因子/分子相互作用的氨基酸的氨基酸的突变。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含与DAF相互作用的氨基酸的突变。这些突变包括但不限于，对应于SEQ ID NO:1的290、291、323、363、364或407位氨基酸的氨基酸的一个或多个突变。在一些实施方式中，这些突变是与SEQ ID NO:1的290、291、323、363、364或407位氨基酸对应的一个或多个氨基酸的取代或缺失。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含一个或多个以下突变，所述突变对应于SEQ IDNO:1的K323E、K290A、K291A、Y363A、S364A或D407N的突变。在一些实施方式中，补体因子B类似物包含以下突变组合中的一个，所述突变组合对应于SEQ IDNO:1的K290A/K291A、Y363A/S364A或K290A/K291A/Y363A/S364A。不希望受理论限制，补体因子B类似物中与加速C3bBb复合物的衰变的因子/分子相互作用的氨基酸的突变，可以抑制C3b与本发明的补体因子B类似物的复合物的衰变，由此允许补体因子B类似物更好地抑制补体活性。
用于生成cDNA(例如，人野生型fB和三个补体因子B类似物以及四个类似的鼠类序列)并将它们引入载体中的示例性步骤，详细描述于PCT公开号WO08/106644的实施例8或美国专利申请号US20100120665中。
核酸
本发明包括核酸，所述核酸包含编码本发明的补体因子B蛋白类似物的核苷酸序列，本发明还包括包含这些核酸的载体。
为了确保局部长期表达目的核酸，本发明的一些实施方式计划用编码本发明的补体因子B类似物的核酸或载体对细胞进行转导。本发明不应解释为限于任何具体核酸递送方法，并且体内或体外核酸递送策略的任何可利用的核酸递送载剂、或操纵细胞的使用(例如the technology of Neurotech,Lincoln,RI,例如参见美国专利号6,231,879、6,262,034、6,264,941、6,303,136、6,322,804、6,436,427、6,878,544)以及编码补体因子B类似物的本发明的核酸本身(例如“裸DNA”)，都可用于本发明的实施。可以与本发明一起使用各种递送载剂，例如载体。例如，病毒载体、两性脂质、诸如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸等阳离子聚合物、诸如梳状分子和星芒状分子等树状高分子、非离子脂质、阴离子脂质、囊泡、脂质体和基因递送的其它合成核酸手段(例如参见美国专利号6,958,325和7,098,030;Langer,Science249:1527-1533(1990);Treat等,in“Liposomes”in“The Therapy of Infectious Disease and Cancer”;和Lopez-Berestein&Fidler(eds.),Liss,New York,pp.317-327and353-365(1989);“裸”核酸等可以用于本发明的实施。
载体是通过其将目的核酸(例如治疗性核酸，例如能够编码治疗性蛋白的核酸)引入目的靶细胞的手段。载体通常从原料构建或获得，所述原料例如为能够携带外源基因或转基因的核酸，并且能够进入靶细胞中并在靶细胞中表达。由其可以获得载体的合适的原料，包括本领域已知的转座子、质粒、病毒、PCR产物、cDNA和mRNA等。用于获得或构建目的载体的方法包括，但不限于，本领域已知的标准基因操纵技术、测序反应、限制性酶消化、聚合酶反应、PCR、PCR SOE、连接、重组酶反应(例如Invitrogen’s技术)、作用在核酸上的其它酶活性剂、细菌和病毒增殖材料和方法、化学品和试剂和定点诱变策略等，参见例如Maniatis等教科书“Molecular Cloning”。
本发明的核酸通常会包含与补体因子B蛋白类似物编码序列可操作地连接的启动子。启动子可以例如是组织特异性启动子、细胞特异性启动子、诱导性启动子、阻抑启动子、组成性启动子、合成启动子或杂交启动子。用于本发明的构建体的启动子的实例包括，但不限于，噬菌体λ(PL)启动子；SV40早期启动子；单纯疱疹病毒(HSV)启动子；诸如人CMV即早期启动子等巨细胞病毒(CMV)启动子；四环素控制的反式作用子响应性启动子(tet)系统；诸如MoMLV LTR、BIV LTR或HIV LTR等长末端重复(LTR)启动子；莫洛尼氏小鼠肉瘤病毒的U3区启动子；颗粒酶A启动子；金属硫蛋白基因的调节序列；CD34启动子；CD8启动子；胸腺嘧啶激酶(TK)启动子；B19细小病毒启动子；PGK启动子；糖皮质激素启动子；诸如HSP65和HSP70启动子等热休克蛋白(HSP)启动子；免疫球蛋白启动子；MMTV启动子；劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子；lac启动子；CaMV35S启动子；和胭脂碱合成酶启动子。在一些实施方式中，启动子是MND启动子(Robbins等,1997,J.Virol.71:9466-9474)，或MNC启动子，其是其中LTR增强子与最小CMV启动子组合的MND启动子的衍生物(Haberman等,J.Virol.74(18):8732-8739,2000)。
在一些实施方式中，本发明的载体包含内含子，其例如作为编码补体因子B蛋白类似物的基因的一部分。异源内含子是已知的，并且非限制性实例包括人β-珠蛋白基因内含子。内含子可以来自补体因子B基因或异源内含子。
信号序列或前导序列是已知的，并且可用于补体因子B类似物表达构建体中。将信号序列框内翻译成连接至所选择多肽的氨基末端的肽，分泌性信号序列会通过与宿主细胞的机制相互作用而引起所述多肽的分泌。作为分泌过程的一部分，该分泌性信号序列会被切割下。人胎盘碱性磷酸酶分泌信号序列是可用的信号序列的实例。本发明不限于具体的分泌性信号序列，其它序列对本领域技术人员而言是已知的。术语“信号序列”也称为编码分泌肽的核酸序列。如果包含信号序列，其可以是野生型补体因子B序列、同源序列或异源序列。
病毒载体
本发明包含编码本发明的补体因子B类似物的病毒载体。用于本发明的病毒载体的实例描述于PCT公开号WO08/106644和美国专利公开号US20100120665中。本发明不限于具体的病毒载体。病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体(参见例如美国专利号7,045,344)、AAV载体(例如参见美国专利号7,105,345)、疱疹病毒载体(例如参见美国专利号5,830,727和6,040,172)、肝炎(例如丁型肝炎)病毒载体(例如参见美国专利号5,225,347)、SV40载体、EBV载体(例如参见美国专利号6,521,449)和新城疫病毒载体(例如参见美国专利号6,146,642、7,442,379、7,332,169和6,719,979)。在一些实施方式中，慢病毒载体是HIV、EIAV、SIV、FIV或BIV载体。本发明还提供产生本发明的病毒载体的细胞。
BIV系统的实例例如描述于Matukonis等,2002Hum.Gene Ther.13,1293-1303;Molina等,2002Virology.304,10-23;Molina等,2004Hum.Gene Ther.,15,65-877;美国专利号6,864,085,7,125,712,7,153,512;PCT公开号WO08/106644和美国专利公开号US20100120665。
本发明的载体病毒颗粒(virion)可以体内或体外施用至细胞(例如哺乳动物细胞)。可将载体(病毒性或非病毒性的)用于转导或转化细胞，所述细胞包括但不限于，未分化细胞、分化细胞、体细胞、粗细胞和/或干细胞。在一些实施方式中，旨在将干细胞施用至人类，而不是植入合适的假妊娠妇女中以在婴儿中分化和发育。
在一些实施方式中，本发明的病毒载体包含衰变加速因子(DAF).。例如，包膜病毒载体包括在病毒膜上的DAF。在一些实施方式中，DAF是野生型DAF。在一些实施方式中，DAF是具有包膜蛋白的融合蛋白的一部分，例如参见Guibinga等Mol Ther.200511(4):645-51。在一些实施方式中，BIV产生细胞表达DAF。
本发明的补体因子B类似物的生产
本发明的补体因子B蛋白类似物可以由细胞生产。在一些实施方式中，然后由细胞和/或由细胞培养基纯化补体因子B蛋白类似物。
本发明包括(i)包含核酸的细胞，所述核酸含有编码本发明的补体因子B类似物的核苷酸序列，和/或(ii)表达本发明的补体因子B蛋白类似物的细胞。在一些实施方式中，利用哺乳动物细胞。在一些实施方式中，利用原核细胞。
通常使用用于蛋白生产的表达载体或克隆载体转染或转导宿主细胞，并将其在适当改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体、扩增编码所需序列的基因，或进行下游纯化和/或浓缩步骤。
用于克隆或表达载体中的编码区的合适的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。用于该目的的合适的原核生物包括，但不限于：诸如革兰氏阴性有机体或革兰氏阳性有机体等真细菌，例如肠杆菌科，例如诸如大肠杆菌等埃希氏菌属，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷伯氏杆菌属，变形杆菌属，诸如鼠伤寒沙门氏菌等沙门氏菌属，诸如粘质沙雷氏菌等沙雷氏菌属，和志贺氏菌属，以及诸如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌41P)等芽孢杆菌属(Bacilli)，诸如铜绿假单胞菌等假单胞菌属，和链霉菌属。在一些实施方式中，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(例如ATCC31,446)，虽然例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(例如ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(例如ATCC27,325)等其它菌株可以是合适的。
除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物是合适的克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中通常使用酿酒酵母或普通的面包酵母。但是，本文通常可获得和使用许多其它的属、种和菌株，例如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(例如ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(例如ATCC16,045)、魏氏克鲁维酵母(例如ATCC24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(例如ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(例如ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母和马氏克鲁维酵母(K.marxiamis)；亚罗酵母属(例如EP402,226)；毕赤酵母(例如EP183,070)；念珠菌属；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(例如EP244,234)；粗糙链孢霉；许旺酵母属，例如西方许旺酵母；和丝状真菌，例如，如脉孢菌属、青霉属、弯颈霉属和曲霉属宿主，例如构巢曲霉和黑曲霉。
例如用于表达糖基化蛋白的合适的宿主细胞，可以衍生自多细胞有机体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒菌株和变种及相应的来自宿主的许可昆虫宿主细胞(permissive insect host cells)，例如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕，并且将其用于表达蛋白。用于转染的各种病毒菌株可用于蛋白表达，并且是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变种和家蚕NPV的Bm-5菌株，根据本发明可将此类病毒例如用于草地贪夜蛾细胞的转染。棉花、谷类、马铃薯、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草也可用作宿主。
本发明的一些实施方式利用脊椎动物或哺乳动物细胞，并且培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的增殖可以是常规步骤。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为由SV40转化的猴肾CVI细胞系(例如COS-7、ATCC CRL1651)；人胚胎肾系(例如293或293T细胞，包括经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的细胞系Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)。例如293Freestyle(Invitrogen,Carlsbad,CA)或293FT)；幼地鼠肾细胞(例如BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(例如CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(例如TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(例如CVI ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(例如VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(例如HELA,ATCC CCL2)；犬肾细胞(例如MOCK,ATCC CCL34)；CF2TH细胞；大鼠肝细胞(例如BRL3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(例如W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(例如Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺瘤细胞(例如MMT060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1983))；MRC5细胞；和FS4细胞。
在一些情况下，可以对宿主细胞进行修饰以减少或消除内源性蛋白的表达。例如，如果在具体的宿主细胞(例如CHO细胞)中生产补体因子B蛋白类似物，则可以对宿主细胞进行修饰，从而减少或消除宿主细胞的天然因子B蛋白(例如仓鼠因子B)的表达。这对于补体因子B蛋白类似物的下游纯化而言可以是有利的。因此，本发明提供生产本发明的补体蛋白类似物的方法，所述方法包括减少或消除宿主细胞中相应的天然补体蛋白的表达。用于降低、消除或敲除宿主细胞蛋白的表达的方法是本领域已知的。例如，可以通过对宿主细胞工程化来表达对编码所述蛋白的RNA具有特异性的抑制性RNA(例如RNAi)，而降低或消除蛋白的表达水平。例如，Clontech(MountainView,CA)销售各种载体和试剂盒，例如用于敲弱宿主细胞中蛋白表达的称为KNOCKOUTTMRNAi系统的一部分的那些载体和试剂盒。其它方法包括通过同源重复的基因靶向，其允许将特定突变引入任何克隆基因中，例如参见Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,1994-1998,Sections9.16and9.17。这可用于敲除表达宿主细胞蛋白的基因。
可用于降低内源性蛋白的表达的另一方法包括使用抑制内源性蛋白的表达的靶向转录因子。例如，来自转录因子的阻遏结构域可以连接或融合至DNA结合域，例如锌指多肽。本领域技术人员可以设计结合特定DNA序列的锌指多肽，例如参见美国专利号6,140,081和7,067,617；以及美国公开专利申请20060078880；20040224385和20070213269。本领域技术人员可以将所设计的锌指多肽与转录阻遏结构域(例如KRAB(Krüppel相关盒)结构域)连接。此类分子和技术的实例描述于Beerli等(ProcNatl Acad Sci U S A.200097(4):1495–1500)和美国公开专利申请20070020627。在本发明的一些实施方式中，用表达转录阻遏子的载体转导宿主细胞。该方法具有使用同源重组敲除目的基因的优点，因为在大多数情况下，宿主细胞是二倍体，理想的是敲除两个基因拷贝。而转录阻遏子的表达应该阻遏两个基因拷贝的表达。
还可以使用直接或间接减少具体内源性蛋白的表达的化合物来减少具体内源性蛋白的表达。以fB为例，可以使用各种化合物来减少内源性fB的表达。例如，已经显示fB答辩受以下物质抑制：组胺(Falus&Meretey,Immunology198760:547-551，和Falus&Meretey,Mol Immunol198825(11):1093-97)、丁酸钠(Andoh等Clin ExpImmuno1999118:23-29)、诸如地塞米松等糖皮质激素(Dauchel等Eur J Immunol199020(8):1669-75)、血小板衍生生长因子(Circolo等1990The Journal of Biol Chem265(9):5066-5071)、表皮生长因子(Circolo等1990)和成纤维细胞生长因子(Circolo等1990)。还可以在这些分子中任一种或组合的存在下培养本发明的宿主细胞，以减少补体因子B蛋白的内源性表达。因此，在本发明的一些实施方式中，在选自由组胺、丁酸钠、糖皮质激素(例如地塞米松)、血小板衍生生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子组成的组中的任一种或多种化合物的存在下培养表达补体因子B蛋白类似物的宿主细胞。
已经显示多种化合物和蛋白上调或维持补体因子B蛋白的表达。例如，已经显示肿瘤坏死因子(TNF)(Andoh等Clin Exp Immuno1999118:23-29)、雌激素(Sheng-Hsiang等Biology of Reproduction200266:322-332)、白介素-1(Dauchel等EurJ Immunol199020(8):1669-75)、地塞米松(Lappin&Whaley,Biochem J1991280:117-123)、泼尼松龙(Lappin&Whaley1991)、皮质类(cortical)(Lappin&Whaley1991)和干扰素γ(Huang等2001Eur J Immunol31:3676-3686)上调或维持补体因子B蛋白的表达。可以在不存在这些分子中任一种或组合时培养本发明的宿主细胞，以减少补体因子B蛋白的内源性表达。另外，可以在任一种或多种这些化合物的抑制剂的存在性培养宿主细胞。因此，在本发明的一些实施方式中，在抑制选自由TNF、雌激素、白介素-1、地塞米松、泼尼松龙(Lappin&Whaley1991)、皮质类(cortical)和干扰素γ组成的组中的化合物的一种或多种化合物的存在下，培养表达补体因子B蛋白类似物的宿主细胞。在一些实施方式中，例如使用本文所述的方法减少宿主细胞表达这些化合物中的一种或多种。雌激素的抑制剂的实例包括，但不限于他莫西芬。抑制剂还包括结合并减少所述化合物的活性的抗体。例如，本领域已知结合TNF并使TNF失活的各种抗体。
由细胞制备的含有补体因子B蛋白类似物的组分可以使用例如以下方法进行纯化：羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、尺寸排阻色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、切向流纯化、渗滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、反相色谱、肝素琼脂糖亲和色谱以及其它已知形式的分离和浓缩。在任何初步纯化步骤后，可以对包含补体因子B蛋白类似物和污染物(如果存在的话)的混合物进行低pH疏水相互作用色谱(例如使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，在某些情况下在低盐浓度(例如约0-0.25M的盐)进行)或其它用于进一步纯化的步骤。
在一些实施方式中，本发明的补体因子B蛋白类似物相对于总蛋白的纯度为至少90%、至少93%、至少95%、至少98%、至少99.5%或至少99.9%。
本发明还提供生产补体因子B蛋白类似物的方法，所述方法包括在细胞中表达本发明的补体因子B蛋白类似物，并对补体因子B蛋白类似物进行纯化。
补体介导的状况/疾病
存在三条补体激活途径，经典途径、替代途径和凝集素途径(图1)。本文所述的是本发明的补体因子B蛋白类似物的实例。在一些实施方式中，这些补体因子B蛋白类似物能够削弱补体激活的替代途径。但是，基于所有三条途径交叉的方式，这些类似物可以减少由这三条补体途径中任一条引起的炎症，由此提供对其病因至少部分涉及补体激活的任何疾病的治疗。这些疾病包括但不限于，早期AMD、湿性AMD和地图状萎缩。图1A和1B概述补体途径。请注意它们在C3b处交叉。
本发明提供治疗补体介导的疾病的方法，所述方法包括对患者施用本发明的药物制品、本发明的补体因子B类似物或者本发明的编码补体因子B类似物的核酸或载体。本发明还包括抑制补体活性的方法，其中所述方法包括对人类受试对象施用突变人补体因子B类似物，其量足以通过与所述受试对象中的天然补体因子B竞争结合而抑制补体途径，其中所述突变人补体因子B类似物是具有形成SEQ ID NO:4的活性补体因子B类似物，所述活性补体因子B类似物具有形成二硫键的半胱氨酸和已经被选自由组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组中的氨基酸取代的游离半胱氨酸。在一些实施方式中，突变补体因子B类似物包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23。
本发明还提供抑制补体活性的方法，其中所述方法包括将本发明的补体因子B类似物、本发明的核酸、本发明的病毒载体、本发明的药物组合物/制品或它们的任意组合以足以抑制补体活性的量引入补体活性的位点。在一些实施方式中，本发明的方法利用SEQ ID NO:4的补体因子B类似物，该补体因子B类似物具有形成二硫键的半胱氨酸和已经被另一氨基酸取代的游离半胱氨酸。
本发明提供抑制补体活性的方法，其中所述方法包括将突变人补体因子B类似物以足以通过所述将突变人补体因子B类似物与天然补体因子B竞争结合而抑制所述补体活性的量引入补体活性的位点，其中所述突变人补体因子B类似物是SEQ IDNO:4的活性补体因子B类似物，所述活性补体因子B类似物具有形成二硫键的半胱氨酸和已经被另一氨基酸取代的游离半胱氨酸。在一些实施方式中，该方法利用包含SEQ ID NO:2的26-764位氨基酸、SEQ ID NO:3的26-764位氨基酸、SEQ ID NO:22的26-990位氨基酸、或SEQ ID NO:23的26-990位氨基酸的补体因子B类似物。
补体途径是称为先天免疫系统的免疫系统的一部分，所述先天免疫系统在免疫系统的体液和细胞介导的分支激活前提供对感染的即时保护。它们通过展示高阶动力学但被良好调节的级联反应来激活或失活。特别是替代补体途径，已经进化到通过正反馈环高速地循环。
本发明的补体因子B蛋白类似物和/或表达其的载体可以有利地用于对哺乳动物进行局部和/或全身施用，和/或治疗慢性疾病。在本发明的一些实施方式中，补体因子B类似物通过与天然补体因子B竞争例如与C3b蛋白和/或因子D蛋白的结合而抑制补体途径。与实现该途径的阻断相反，这能够允许削弱补体活性。因此，可以将补体活性下调至不完全阻断补体活性的治疗性(例如，缓解一些症状或它们的严重性)水平。因此，避免或降低了与补体活性阻断相关的风险，例如增加的感染风险。因此，本发明提供通过局部或全身施用(例如静脉内、腹膜内或口服)本发明的补体因子B蛋白类似物而治疗补体介导的疾病(例如慢性疾病)的方法。
在一些实施方式中，本发明提供用于调控、调节、抑制和/或增强补体活性的组合物和方法。补体相关途径包括但不限于，经典补体途径、凝集素补体途径和替代补体途径。在一些情况下，补体相关途径在具体的状况或一种或多种疾病中起作用。因此，本发明的一些实施方式提供通过施用本发明的补体因子B类似物或者本发明的编码补体因子B类似物的核酸或载体而调节、调控、治愈、抑制、预防、减轻、减慢由一种或多种补体相关途径介导的疾病状态的发展和/或治疗由一种或多种补体相关途径介导的疾病状态的方法。此类疾病状态或状况包括但不限于：玻璃疣形成、黄斑变性、AMD、干眼症、角膜溃疡、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、玻璃体视网膜病变(Grisanti等Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.32:2711-2717)、角膜炎症、气道高反应、免疫相关疾病、自体免疫相关疾病、狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、关节炎(例如类风湿性关节炎)、风湿性疾病、抗磷脂抗体综合征、肠和肾I/R损伤、哮喘、非典型溶血尿毒综合征、II型膜性增生性肾小球肾炎、非增生性肾小球肾炎、胎儿丢失(fetal loss)(例如自发性胎儿丢失)、青光眼、葡萄膜炎、高眼压症、脑损伤(例如外伤性脑损伤)、中风(例如参见Arumugam等PNAS93(12):5872-6(1996))、创伤后器官损伤、热伤(例如烧伤)、心肌梗死后器官损伤(例如心脏、神经学上)、血管炎、川崎病、遗传性血管性水肿(HAE)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH，有时称为马米二氏综合征)、结肠炎、炎性肠病、肿瘤转移、缺血再灌注损伤、脑血管意外、阿尔茨海默氏病、移植排斥(例如异源(xeno)和异基因(allo))、感染、败血症、败血性休克、干燥综合症、重症肌无力、抗体介导的皮肤病、所有抗体介导的器官特异性疾病(包括I型和II型糖尿病、甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血和神经病变)、胰岛素抵抗综合征(例如参见Weyer等(2000)Diabetes Care、23(6):779-785)、妊娠糖尿病、多发性硬化、银屑癣、心肺旁路损伤(cardiopulmonary bypass injury)、结节性多动脉炎、过敏性紫癜、血清病、古德帕斯彻病、系统性坏死性血管炎、链球菌感染后肾小球肾炎、特发性肺纤维化(常见型间质肺炎)、膜性肾小球肾炎、心肌炎(例如自体免疫心肌炎)(Kaya等Nat Immunol.2001;2(8):739-45)、心肌梗死、肌肉萎缩症(例如与抗肌萎缩蛋白缺乏症相关)、急性休克肺综合征、成人型呼吸窘迫综合征、再灌注和/或补体介导的疾病。
在一些实施方式中，补体介导的疾病是眼的疾病。在一些实施方式中，通过玻璃体内注射、视网膜下注射、注射至眼的前房内、注射或局部施用至角膜、结膜下注射(subconjunctival injection)、眼球囊下注射(subtenon injection)进行施用或通过滴眼剂对眼施用补体因子B类似物或药物组合物。在一些实施方式中，对眼施用药物组合物，其中所述药物组合物包含例如选自hfB3-292S(SEQ ID NO:2)、hfB3-292S-740N(SEQID NO:3)、hfB3-292S-Fc(SEQ ID NO:22)和hfB3-292S-740N-Fc(SEQ ID NO:23)组中的至少一种补体因子B类似物。
年龄相关的黄斑变性(AMD)是发达国家中65岁以上个体中视力下降的最常见的起因。干性AMD的特征在于引起中央视力损失的斑的进行性变性。更急性的衰弱AMD包括视网膜中菜花状新血管形成(florid neovascularization)和溢出，称为湿性AMD。对于AMD目前没有有效的疗法。
AMD的特征是位于视网膜色素上皮(RPE)的基板和玻璃膜的内层之间玻璃疣的累积(Pauleikhoff等,1990Am.J.Ophthalmol.109,38-43;Bressler等,1990Arch.Ophthalmol.108,1442-1447)。认为玻璃疣以及发生在玻璃膜附近的其它年龄相关的改变，通过引起缺血和限制视网膜和脉络膜之间营养物和废物的交换，而导致RPE和视网膜的机能障碍和变性(Bird的综述,1992Pathophysiology of AMD.InAge-Related Macular Degeneration:Principles and Practice(Hampton,G.,and Nelsen,P.T.,eds.)，第3章,Raven Press,纽约)。数个研究已经指出了AMD发展中的免疫介导的过程。重要的是，如免疫和炎症介导的过程涉及玻璃疣的发展和/或去除的假设所预测的，在AMD患者的血清中检测到自身抗体(Penfold等,1990Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.228,270-274)。
眼中玻璃疣的形成与诸如黄斑变性等各种疾病相关。在一些情况下，已经暗示玻璃疣形成和/或其与疾病的关联涉及补体活性。本发明的一些实施方式提供用于调控、调节、抑制、减少、阻滞和/或逆转诸如人类等动物中玻璃疣的形成或生长的组合物和方法。例如，可以将本发明的组合物组合物或方法递送至玻璃疣(例如通过直接注射入玻璃疣中(玻璃疣内注射)、邻近玻璃疣或玻璃体内注射)。本发明的一些实施方式能够用于减慢黄斑变性的进展，这可能通过抑制玻璃疣形成实现。玻连蛋白，是玻璃疣的丰富组分，也是与动脉粥样硬化(Niculescu等,1989Atherosclerosis,78,197-203)、淀粉样变性(Dahlback等,1993J.Invest.Dermatol.100,166-170)、弹性组织变性(Dahlback等,1988Acta Derm.Venereol.68,107-115)和II型MPGN(Jansen等,1993Am.J.Pathol.143,1356-1365)相关的胞外沉积物的组分。玻连蛋白是在细胞粘着、止血维持和补体诱导的细胞裂解的抑制方面起作用的多功能蛋白(Preissner,1991Ann.Rev.Cell Biol.7,275-310)。此外，粥样硬化斑块与玻璃疣共有许多其它成分，例如补体组分和载脂蛋白E。在流行病学研究中报道了晚期AMD和颈动脉的动脉粥样硬化之间的关联(Vingerling等,1995Am.J.Epidemiol.142,404-409)，另一研究鉴定了AMD患者中不暴露至阳光的真皮的弹力组织变性和脉络膜新生血管形成之间的显著相关性(Blumenkranz等,1986Ophthalmology,93,552-558)。最后，淀粉样β肽是阿耳茨海默氏病中神经斑的主要成分，也在玻璃疣中发现(Johnson等,2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,11830-11835)。已经暗示淀粉样β肽是补体的主要激活剂(Bradt等,1998J.Exp.Med.188,431-438)。
对人玻璃疣的分子组合物、以及侧接玻璃疣或在玻璃疣上的RPE细胞的广泛分析，证明了对免疫球蛋白和与免疫复合物沉积相关的补体系统的组分的免疫反应性(Johnson等,2000Exp.Eye Res.70,441-449)。玻璃疣也含有在免疫系统调控中起作用的诸如玻连蛋白(Hageman等,1999FASEB J.13,477-484)和载脂蛋白E(Anderson等,2001Am.J.Ophthalmol.131,767-781)等多功能蛋白。此外，也已经在玻璃疣中鉴定出诸如淀粉样P组分和α1-抗胰蛋白酶等涉及对炎症的急性期反应的分子(Mullins等,2000The FASEB Journal,14,835-846)，以及涉及凝固和纤维蛋白溶解的蛋白(因子X、凝血酶和纤维蛋白原)(Mullins等,2000The FASEB Journal,14,835-846)。暗示玻璃疣形成和相关的RPE病理学导致激活补体级联的慢性炎性响应(Hageman等,2001Prog.Retin,Eye Res.20,705-732;Johnson等,2001Exp.Eye Res.73,887-896)。
由AMD引起并导致视网膜扰乱的视觉障碍的一种其它形式是地图状萎缩，这导致视杆细胞和视锥细胞细胞的斑点以及RPE的死亡。
已经显示动脉粥样硬化通常涉及补体相关的途径，例如参见Niculescu等Immunologic Research,30(1):73-80(8)(2004)以及Niculescu和Horea,ImmunologicResearch30(1):73-80(2004)。补体激活和C5b-9沉积通常发生在人类和实验动脉粥样硬化中。C5b-9负责细胞裂解，C5b-9的低度裂解(sublytic)组装诱导平滑肌细胞(SMC)和内皮细胞(EC)激活和增殖。补体C6缺陷对饮食诱导的动脉粥样硬化具有保护作用，表明在动脉粥样硬化损伤的进展中需要C5b-9组装或在动脉粥样硬化损伤的进展中C5b-9组装至少起显著作用，例如参见Niculescu和Horea,Immunologic Research30(1):73-80(2004)。本发明的一些实施方式可用于抑制C5b-9的形成和/或抑制动脉粥样硬化。在一些实施方式中，将本发明的补体因子B蛋白类似物施用至动脉粥样硬化的位点或潜在位点。该补体因子B蛋白类似物抑制途径(例如，经典补体途径和/或替代补体途径)，这转而抑制C5b-9或参与动脉粥样硬化的另一补体途径相关的化合物的形成或激活。可以存在参与动脉粥样硬化的其它补体相关蛋白，可以以类似方式抑制或阻断其形成和/或激活。
气道高反应(AHR)是包含但不限于哮喘(例如过敏性哮喘)在内的各种疾病的特征。已经显示AHR通常涉及补体相关的途径，例如参见Taube等，2006PNAS103(21):8084-8089；Park等，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine169:726-732,(2004)；Thurman和Holers,J Immunology176:1305-1310(2006)以及美国专利公开号20050260198。Park等指出通过腹膜内注射施用的Crry–Ig对AHR具有作用。本发明的一些实施方式提供用于调控、调节、抑制和/或减少诸如人类等动物中AHR的组合物和方法。可以被治疗、缓解、抑制和/或改善的具体AHR相关疾病包括但不限于，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、变应性支气管肺曲菌病、过敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、气肿、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、囊性纤维化、结核病、超敏性肺炎、职业性哮喘、肉样瘤、反应性气道病综合征、间质性肺病、嗜酸细胞增多综合征、鼻炎、鼻窦炎、运动诱导的哮喘、污染诱导的哮喘、咳嗽变异性哮喘、肺寄生虫病、呼吸道合胞体病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、鼻病毒(RV)感染、汉坦病毒(例如四角菌株(our-corners strain))和腺病毒感染。
已经显示诸如自体免疫相关疾病、HLA-B27相关炎性疾病、狼疮肾炎和系统性红斑狼疮(SLE)等免疫相关疾病通常涉及补体相关途径，例如参见Thurman andHolers,J Immunology176:1305-1310(2006)。狼疮肾炎是SLE的一种并发症。其涉及狼疮的自体免疫过程，其中免疫系统产生针对身体组分的抗体(抗核抗体和其它抗体)。这些抗体与补体组分的复合物通常在肾中累积，并导致炎性响应。本发明的一些实施方式提供用于调节、调控、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗免疫相关疾病的方法和组合物，所述免疫相关疾病例如参与或涉及补体途径，例如SLE。
已经显示关节炎通常涉及补体相关途径，例如参见Thurman和Holers,JImmunology176:1305-1310(2006)，以及Banda等J Immunol.177(3):1904-12(2006)。替代补体途径在关节炎的诱导中起显著作用，甚至可以要求替代补体途径。本发明的一些实施方式提供用于调节、调控、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗哮喘(例如类风湿性关节炎或炎性关节炎)的方法和组合物。
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是潜在威胁生命的血液疾病，特征在于红细胞(RBC)被补体血管内破坏导致的补体诱导的血管内溶血性贫血和血栓症，导致引起RBC膜的破坏的补体系统的不受控扩增。患有该疾病的人通常具有丢失被称为PIG-A的基因的血细胞。该基因使被称为糖基-磷脂酰肌醇(GPI)的物质帮助特定蛋白粘附至细胞。没有PIG-A，补体调节蛋白不能连接至细胞表面，并保护细胞免受补体影响。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症的方法和组合物。
遗传性血管性水肿(HAE)是潜在威胁生命的遗传病况，该遗传病况通常由C1抑制子(补体系统的一种蛋白)的缺陷引起。症状包括在各种身体部分(包括手、足、脸和气道)中水肿(肿胀)的事件。遗传性血管性水肿(HAE)以三种形式存在，它们都由遗传突变引起，所述遗传突变以常染色体显性形式遗传。I型和II型由SERPING1基因的突变引起，这导致C1-抑制蛋白的水平减少或功能障碍形式(I型HAE)。III型HAE与F12基因的突变相关，F12基因编码凝固蛋白因子XII。HAE的所有形式导致补体系统的异常激活。一些目前治疗包括Ecallantide(激肽释放酶的肽抑制剂)(例如参见美国专利公开号US20070213275)、艾替班特(Firazyr,Jerini)(其是选择性缓激肽受体拮抗剂)和Cinryze(Viropharma,Inc.)(C1酯酶抑制剂)。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症的方法和组合物。
青光眼是一组视神经的疾病，在视神经病变的特征模式中涉及视网膜神经节细胞的损失。约25%的具有视网膜神经节细胞的损失的青光眼患者具有正常眼压。高眼压(OHT)是发展青光眼的显著风险因子，通过药物或手术降低高眼压是目前青光眼治疗的主流。已经显示高眼压和青光眼通常涉及补体相关途径，例如参见Khalyfa等,Molecular Vision,13:293-308(2007);Stasi等IOVS47(3):1024-1029(2007)；和Kuehn等,Experimental Eye Research83:620-628(2006)。已经显示C1q和C3的表达和/或存在在视网膜受试对象中比OHT高。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗青光眼的方法和组合物。
已经显示葡萄膜炎通常与补体途径相关，例如参见Mondino和Rao,InvestigativeOphthalmology&Visual Science24:380-384(1983)，以及Jha等Molecular Immunology44:3901-3908(2007)。Mondino和Rao发现用于血清测定的水状液中所有测试的补体组分的平均值，在具有之前眼手术历史的患者中增加，并且在患有前葡萄膜炎的患者中最高。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗青光眼的方法和组合物。
糖尿病性视网膜病是中年患者中视力丧失的主要原因之一。认为补体系统的激活在糖尿病性视网膜病的发病机理中起重要作用(例如参见Jha等Molecular Immunology44:3901-3908(2007))。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗糖尿病性视网膜病的方法和组合物。
增生性玻璃体视网膜病变(PV)是视网膜脱离的最常见并发症之一。PV与补体活性相关，例如参见Grisante等Invest Ophthalmol Vis Sci.1991;32(10):2711-7，和Grisante等Ophthalmologe.1992;89(1):50-4。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗PV的方法和组合物。
已经显示抗磷脂抗体综合征、肠和肾缺血再灌注I/R损伤、非典型溶血尿毒综合征、II型膜性增生性肾小球肾炎和胎儿丢失(例如自发性胎儿丢失)通常涉及补体相关途径，例如参见Thurman和Holers,J Immunology176:1305-1310(2006)。
已经显示脑损伤(例如外伤性脑损伤)通常涉及补体相关途径，例如参见Leinhase等,J Neuroinflammation4:13(2007)，和BMC Neurosci.7:55(2006)。Leinhase2006指出在野生型(fB+/+)小鼠中实验性外伤性脑损伤之后，存在时间依赖性全身补体激活。与之相反，全身补体激活的程度在fB-/-小鼠中显著削弱。本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗神经细胞死亡、外伤性神经损伤(例如脑)、补体介导的神经炎症和/或神经病理学的方法和组合物。
缺血再灌注损伤能够引起由细胞和组织产生的各种潜在的有害化合物的产生或氧化，这能够导致细胞和组织的氧化性损伤或死亡。例如，肾缺血再灌注损伤能够导致对肾的组织损伤，包括肾小管损伤和急性肾小管坏死的改变特性。所导致的肾功能障碍使通常由肾分泌的含氮废物的累积，例如血清尿素氮(SUN)。缺血再灌注也可以引起远端器官损伤，例如肺。例如当对患有缺血再灌注或有风险经历或发展缺血再灌注的动物施用时，本发明的一些实施方式利用补体途径的调节剂，例如抑制剂(例如因子B活性的抑制剂)。在一些实施方式中，这些调节剂预防、减少或抑制由缺血再灌注导致的损伤的至少一种症状。可以使用本发明的方法和组合物预防或减少的缺血再灌注损伤的其它类型包括但不限于，诸如心肌梗死或冠状动脉旁路手术等心脏缺血再灌注损伤、中枢神经系统缺血再灌注损伤、四肢或手指或足趾缺血再灌注损伤、诸如肺、肝或肠等内脏器官的缺血再灌注损伤，或任何移植器官或组织的缺血再灌注损伤。参见例如讨论心肌梗死和补体途径的PCT公开号WO03/061765。
炎症是心肌梗死的主要病因决定因素(Ridker,2007Nutr.Rev.65(12Pt2):S253-9)。还已经显示骨髓(干)细胞的递送(例如冠状动脉内递送)在急性心肌梗死后引起收缩功能的改善(Wollert,2008,Curr.Opin.Pharmacol.Jan31[Epub])。另外，骨髓干细胞还使梗死的心肌再生(Orlic等2003Pediatr.Transplant.7Suppl3:86-88)。已经显示间充质干细胞提供对缺血性心脏病的心脏保护作用(Guo等2007Inflammation30(3-4):97-104)。本发明中，可以通过任何方式，例如冠状动脉内注射、直接注入心肌(例如诸如发病和/或健康的心肌(例如损伤区附近))来进行干细胞的递送。在一些实施方式中，用细胞因子治疗哺乳动物，以使它们的骨髓干细胞移动至血液循环，使所述干细胞运输至心肌梗死。
已经在体内施用各种干细胞以用于各种应用。与体内干细胞使用的一个问题是例如在目的区域中干细胞的所需存活和/或接种较低。干细胞的接种和存活较低的一个显著原因可以是在所述位点处发炎。因此，本发明体提供治疗方法，和/或改善干细胞存活和/或接种的方法。在一些实施方式中，这些方法包括在施用或固定干细胞之前、过程中和/或之后施用本发明的组合物。在一些实施方式中，本发明的补体抑制剂充当消炎剂，所述消炎剂会形成使干细胞在所需接种区域(例如，受损心脏或骨髓)定殖和存活的有利环境，因此修复或替换受损组织。可以以还含有本发明的补体因子B蛋白类似物的溶液施用干细胞。干细胞可以是，但不限于：造血干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、乳腺干细胞、嗅觉干细胞、胰岛干细胞、全能干细胞、多能干细胞(multipotent stem cell)或多潜能干细胞(pluripotent stem cell)。所述干细胞可以是自体同源的、同种异体的或同基因的(syngeneic)。
补体活性似乎涉及肌肉萎缩症(例如与抗肌萎缩蛋白缺乏症相关)。例如，参见PCT公开号WO2007130031,Spuler&Engel1998Neurology50:41-46，和Selcen等2001Neurology56:1472-1481。因此，本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗肌肉萎缩症的方法和组合物。
补体活性可以导致角膜炎症。因此，本发明的一些实施方式提供用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗角膜炎症的方法和组合物。在一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物经由滴眼剂或以本文描述的其它方式施用。
在一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物用于调节、缓和、治愈、抑制、预防、改善和/或治疗角膜新生血管形成。
本发明的一些实施方式提供用于增强后冠状动脉(post-coronary)或外周动脉旁路移植术或血管成形术的功效。在一些实施方式中，将编码本发明的补体因子B蛋白类似物的本发明的载体(例如hfB3-292S或hfB3-292S-740N)用于转导血管细胞(例如内皮细胞)。在一些实施方式中，在植入动物之前对血管细胞进行转导。在一些实施方式中，对血管细胞进行体内转导。
缓解术后患者中的疼痛、痛苦和炎症是临床医学中特别关注的领域，特别是随着每年进行的门诊患者手术的数量不断增多。本发明的补体因子B类似物例如通过抑制补体活性而用于抑制炎症。因此，可将补体因子B类似物用于减少例如术后患者中的炎症。在一些实施方式中，将补体因子B类似物局部施用(例如围手术期递送)至手术位点，以抑制炎症，这在某些情况下会减少疼痛和痛苦。在一些实施方式中，以溶液(例如生理电解质载体流体)施用补体因子B类似物。在一些实施方式中，经由直接围手术期递送至含有所述组合物的灌洗液的手术位点而递送补体因子B类似物。在一些实施方式中，由于本发明的局部围手术期递送方法，可以以比使用其它递送方法(例如静脉内、肌肉内、皮下和口服)所需更低的剂量实现所需的治疗效果。在一些实施方式中，当围手术期使用时，所述溶液会导致手术位点疼痛和/或炎症的临床上显著的降低，由此降低患者的术后镇痛(例如阿片剂)要求，并且其中在适当情况下，允许患者的手术位点较早可动。在一些实施方式中，使用相对于常规灌洗液的本发明溶液不需要部分外科医生和手术室人员的额外努力。在一些实施方式中，本发明的组合物用于关节镜检查、心血管和常规血管治疗和诊断过程、泌尿过程、常规手术伤口和普通伤口。本发明的组合物可以通过但不限于注射(例如经由注射器)、经由灌洗液，作为伤口上绷带的一部分递送，或者以诸如溶液、膏剂或凝胶等局部施用而递送。
在本发明的一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物和/或载体可以在施用所述补体因子B类似物和/或载体之前，同时或之后与补体抑制因子组合施用。补体抑制因子包括但不限于：因子H、因子H-样1、MCP、DAF或MCP的可溶形式。
在本发明的一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物和/或载体与抗血管生成因子组合施用。抗血管生成因子包括但不限于：内皮抑素、VEGF结合分子、PEDF、T2-TrpRS(例如参见美国专利号273,844)、sFLT(例如参见Kong等Hum Gene Ther(1998)9:823–833)、阿柏西普(aflibercept)(VEGF Trap)、VEGF Trap-eye、激肽原汀(kininostatin)、兰尼单抗和贝伐单抗。
在本发明的一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物和/或载体与(兰尼单抗)、(贝伐单抗)、VEGF Trap-eye、阿柏西普或者结合VEGF和/或抑制血管生成的分子。用于治疗湿性AMD。本发明的一些实施方式还可用于治疗湿性AMD。因此，本发明提供用于治疗湿性AMD的方法和组合物，所述方法包括单独或一起组合使用本发明的组合物以及(兰尼单抗)、(贝伐单抗)、VEGF Trap-eye、阿柏西普或者结合VEGF和/或抑制血管生成的分子。另外，眼内炎症是在施用后最常见的副作用之一，例如参见的“Full Prescribing Information”for本发明提供用于抑制或减少眼内炎症(例如由施用导致)的方法，所述方法包括在施用VEGF Trap-eye或阿柏西普之前、同时和/或之后施用本发明的分子或组合物。
在本发明的一些实施方式中，本发明的补体因子B类似物或载体与另一化合物组合施用，例如抑制T细胞激活、B细胞、TNF、白介素-1(例如白介素-1b)、白介素-6和/或干扰素γ的化合物。本发明的补体因子B类似物或载体还可以与抑制诸如替代补体活性等补体活性的化合物组合施用。可以使用的抑制TNF的化合物包括但不限于，结合TNF的化合物，例如抗体(例如英夫利昔单抗戈利木单抗和阿达木单抗)或结合诸如依那西普等TNF的可溶性受体。可以使用的抑制T细胞激活的其它化合物包括但不限于结合B7的化合物，例如阿巴西普还可以使用下调B细胞的化合物，包括但不限于，结合CD20的化合物，例如利妥昔单抗和
可以使用作为本发明一部分的各种方法和/或补体因子B蛋白类似物调控、调节、抑制和/或激活导致和/或引起疾病的补体途径。
组合物、制剂和制品
本发明的一些手术费提供含有本发明的补体因子B类似物的组合物，例如药物组合物，以例如用于治疗用途。在一些实施方式中，药物组合物包含补体因子B类似物，所述补体因子B类似物包含SEQ ID NO:2的26-764位氨基酸、SEQ ID NO:3的26-764位氨基酸、SEQ ID NO:22的26-990位氨基酸或SEQ ID NO:23的26-990位氨基酸，例如hfB3-292S(SEQ ID NO:2)、hfB3-292S-740N(SEQ ID NO:3)、hfB3-292S-Fc(SEQ ID NO:22)或hfB3-292S-740N-Fc(SEQ ID NO:23)。在一些实施方式中，药物组合物包含补体因子B类似物，所述补体因子B类似物由SEQ ID NO:2的26-764位氨基酸、SEQ ID NO:3的26-764位氨基酸、SEQ ID NO:22的26-990位氨基酸或SEQ ID NO:23的26-990位氨基酸组成。可以与本发明的补体因子B类似物一起使用的药物组合物和制剂的实例描述于PCT公开号WO08/106644和美国专利公开号US20100120665。
本发明的一些实施方式包括药物制品，所述药物制品包含本发明的补体因子B蛋白类似物、本发明的核酸、本发明的病毒载体或者它们的任意组合。
制剂(例如用于注射)通常，但不必然是活性成分的生物相容性溶液，例如包含汉克氏溶液(Hank's solution)和林格氏溶液(Ringer's solutio)。用于透皮或透粘膜施用的制剂通常包括但不限于，与清洁剂或表面活性剂组合的诸如梭链孢酸或胆汁盐等渗透剂。在一些实施方式中，可以将制剂制造成气溶胶、栓剂或贴片剂。在一些实施方式中，对于蛋白或肽活性成分而言口服施用可能是不利的，但是，这种形式的组合物可以例如以肠溶形式、储库(depot)和胶囊形式等合适地配制，以保护免遭消化酶影响，因此也可以使用口服施用。本发明的一些制剂包含平衡盐溶液(Alcon Laboratories,Inc.,Fort Worth,Texas)或平衡盐溶液+(Alcon Laboratories,Inc.)。在一些实施方式中，制剂包含以下成分中的一种或多种：柠檬酸盐、NaCl(例如0.64%)、氯化钾(KCl)(例如0.075%)、二水氯化钙(CaCl2·2H2O)(例如0.048%)、六水氯化镁(MgCl2·6H2O)(例如0.03%)、三水乙酸钠(CH3CO2Na·3H2O)(例如0.39%)、二水柠檬酸钠(C6H5O7Na3·2H2O)(例如0.17%)、蔗糖和氢氧化钠和/或盐酸(以调整pH)和水。之前的列表包括作为特定水合物(例如二水合物、三水合物、六水合物等)列出的一些方法。应该理解的是，这些化合物的各种水合物可用于本发明，并且本发明不限于所列出分子的这些具体水合物形式。在一些实施方式中，制剂包含以下成分中的一种或多种：NaCl、一水合磷酸二氢盐、七水合磷酸氢二钠和调整pH的盐酸和/或氢氧化钠和水。在一些实施方式中，药物组合物包含选自由组氨酸、MgCl2、海藻糖、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20、NaCl、蔗糖、精氨酸和脯氨酸组成的组中的至少一种成分。在一些实施方式中，制剂包含以下成分中的一种或多种：组氨酸(例如约10mM)、α,α-脱水海藻糖(例如约10%或约50mM)、MgCl2(例如约10mM)、诸如聚山梨醇酯20等聚山梨醇酯(例如约0.01%)和NaCl(例如约0.1%)。在一些实施方式中，制剂包含以下成分中的一种或多种：蔗糖、精氨酸或脯氨酸。在一些实施方式中，制剂包含本发明的下述分子或由本发明的下述分子组成：10mM组氨酸、10mM MgCl2、50mM海藻糖和0.01%聚山梨醇酯20。在一些实施方式中，制剂包含本发明的下述分子或由本发明的下述分子组成：1.0%NaCl和10mM MgCl2。在一些实施方式中，制剂包含本发明的分子和平衡盐溶液或由本发明的分子和平衡盐溶液组成，所述平衡盐溶液富含碳酸氢盐、右旋糖和谷胱甘肽，例如在一些实施方式中，制剂不包含海藻糖。在一些实施方式中，制剂或组合物的pH为约5.5。在一些实施方式中，制剂或组合物的pH为约5.0～9.0、约5.0～5.5、约5.3～5.7、约5.5～6.0、约5.8～6.2、约6.0～6.5、约6.3～6.7、约6.5～7.0、约6.8～7.2、约7.0～7.5、约7.3～7.7、约7.5～8.0、约7.8～8.2、约8.0～8.5、约8.3～8.7和约8.5～9.0，任何一个都适合保持活性成分的生物活性和稳定性。
本发明的一些制剂可以制造成气溶胶、栓剂、滴眼液或贴片剂。
用于所期望施用模式的合适的制剂和配制方法的实例可以在Remington'sPharmaceutical Sciences，最新版，Mack Publishing Co.,Easton,PA和美国专利号7,208,577中发现。
在一些实施方式中，体内使用的组合物含有“载体”或“药学上可接受的载体”。术语“载体”是指与其一起施用目的载体的稀释剂、佐剂、赋性剂或载剂。术语“载体”包括但不限于，固体材料或液体材料，其可以是合成或天然来源的无机物或有机物，所述组合物的活性成分与其一起混合或配制，以促进对受试对象的施用。
通常，合适的油、盐水、水性右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液以及诸如丙二醇或乙二醇等二醇通常是合适的胃肠外溶液用载体。在一些实施方式中，胃肠外施用用溶液含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定化剂和如果需要或必须的话，缓冲物质。可以单独或组合使用诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸等抗氧化剂作为稳定化剂。另外使用的是柠檬酸和其盐以及乙二胺四乙酸钠。此外，胃肠外溶液可以含有防腐剂，例如苯扎氯铵、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯以及氯丁醇。
载体可以包括糖类，例如海藻糖、甘露糖、谷胱甘肽、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制剂的其它成分可以包括，例如DPPC(1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。可以使用天然或合成的表面活性剂。可以使用聚乙二醇(即使除其在将蛋白衍生化的用途之外)。可以使用右旋糖苷，例如环糊精。在一些实施方式中，可以使用环糊精、叔胺和/或β-环糊精。可以使用胆汁盐和其它相关增强剂。可以使用纤维素和纤维素衍生物。可以使用氨基酸，例如将其在缓冲制剂中使用。另外，考虑使用脂质体、微囊剂或微球体、包涵体复合物或其它类型的载体。
合适的药物赋性剂包括但不限于：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、抗生素、防腐剂、麦芽、小鼠、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水和乙醇等。如果需要，组合物还可以含有湿润剂和/或润滑剂，和/或pH缓冲剂。如果需要，组合物还可以包括增溶剂和/或局部麻醉剂(例如利诺卡因)，以缓解注射位点的疼痛。
本文还设想的是肺部递送本发明的制剂或蛋白质(或其衍生物)。在一些实施方式中，将补体因子B类似物在吸入的同时递送至哺乳动物的肺，并且最大程度地保留在肺中，或在一些实施方式中，穿过肺上皮内衬进入血流。(例如参见Adjei等,Pharmaceutical Research7:565-569(1990);Adjei等，International Journal ofPharmaceutics63:135-144(1990);Braquet等,Journal of Cardiovascular Pharmacology13(suppl.5):s.143-146(1989);Hubbard等,Annals of Internal Medicine3:206-212(1989);Smith等,J.Clin.Invest.84:1145-1146(1989);Oswein等,Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II,Keystone,Colo.,March,1990;Debs等,The Journal ofImmunology140:3482-3488(1988)and Platz等,U.S.Pat.No.5,284,656)。用于实施本发明所设想的是为肺部递送治疗产品而设计的机械装置，包括但不限于，喷雾器、定量吸入器和粉末吸入器。适于实施本发明的一些实施方式的商业可获得的装置的一些具体实例是由Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Mo.制造的ULTRAVENTTM喷雾器；由Marquest Medical Products,Englewood,Colo.制造的喷雾器；由Glaxo Inc.,Research Triangle Park,N.C.制造的VENTOLIN定量吸入器；和由Fisons Corp.,Bedford,Mass制造的SPINHALER粉末吸入器。
在一些实施方式中，以微粒形式制备蛋白。在一些实施方式中，该微粒形式具有小于10μm(或微米)，最优选0.5～5μm的平均粒径，以递送至远端肺。
与喷雾器(例如喷射式或超声式)一起使用的合适制剂通常会包含溶于水中的补体因子B类似物，在一些实施方式中，浓度为每mL溶液约0.1mg～约25mg的生物活性蛋白。制剂还可以包括缓冲剂和/或单糖(例如，用于蛋白稳定化和渗透压的调节)。喷雾器制剂还可以含有表面活性剂以减少或预防由在形成气溶胶时所述溶液的雾化引起的蛋白的表面诱导的聚集。
与定量吸入器装置一起使用的制剂通常会包含微细粉末，所述微细粉末含有例如在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中的本发明的补体因子B类似物。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇(dichlorotetrafluoroethanol)和1,1,1,2-四氟乙烷，或者它们的组合。合适的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。在一些实施方式中，用于从粉末吸入器装置分配的制剂会包含含有本发明的补体因子B类似物的微细干粉末，并且还可以包括填充剂，例如乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，其量促进所述粉末从所述装置的分散，例如为所述制剂的50重量%～90重量%。
施用和递送
应该理解的是，当讨论引入或施用编码补体因子B蛋白类似物的核酸时，本发明还设想引入或施用补体因子B蛋白类似物自身。应该理解的是，当讨论引入补体因子B类似物时，本发明还设想编码补体因子B蛋白类似物的核酸的引入。
在一些实施方式中，可以局部或全身施用本发明的补体因子B类似物或组合物。施用的有用途径描述于本发明，并且是本领域已知的。引入或施用的方法包括但不限于：真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、气管内、局部、吸入、透皮、直肠、胃肠外途径、硬脑膜外、颅内、入脑、脑室、硬膜下、关节内、鞘内、心内、冠状动脉内、玻璃体内、视网膜下、眼的前房内、特别是局部至角膜、结膜下(subconjunctival)、眼球囊下注射(subtenon injection)、通过应用滴眼液、口服途径、经由气囊导管、经由血管内支架(stent)，或者它们的任何组合。在一些实施方式中，将本发明的组合物或补体因子B类似物通过直接注射入玻璃疣而施用至玻璃疣。全身施用可以但不限于通过静脉内或动脉内注射或通过透粘膜、皮下和/或透皮递送。在一些实施方式中，本发明的组合物可以最初针对除发病位点之外的位点。例如，关于发生在动物肺中的AHR，本发明的蛋白、载体或核酸的腹膜内注射可以导致肺中AHR的变化，例如参见Park等,American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine169:726-732,(2004)。在一些实施方式中，组合物的施用的剂量水平和/或模式可以依赖于组合物的性质、待治疗的状况的性质和/或个体患者的历史。在一些实施方式中，施用表达本发明的补体因子B类似物的细胞。这些细胞是细胞系，所述细胞系是异源的(xenogeneic)、同种异体的或自体同源的。
在一些实施方式中,例如包括施用至眼，每隔一个周、每隔一个月、每隔2个月、每隔3个月、每隔6个月、每隔9个月、每隔1年、每隔18个月、每隔2年、每隔30个月、每隔3年、每隔5年或每隔10年施用本发明的补体因子B蛋白类似物或载体。在一些实施方式中,例如包括施用至眼，约每1～4周、约每4～8周、约每1～4月、约每3～6月、约每4～8月、约每6～12月、约每9～15月、约每12～18月、约每15～21月、约每18～24月、约每1～2年、约每1.5～3年、约每2～4年、约每3～5年、约每5～7年、约每7～10年或约每10～20年施用本发明的分子或载体。预期编码补体因子B蛋白类似物的载体的施用的频率小于补体因子B蛋白类似物的施用。在本发明的一些实施方式中，药物制品包含编码本发明的补体因子B类似物的载体，将所述药物制品施用至患者仅一次。
在一些实施方式中，例如包括施用至眼，对患者在其生命中施用编码补体因子B类似物的载体1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方式中，例如包括施用至眼，对患者在其生命中施用本发明的慢病毒载体1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。
在一些实施方式中，通过玻璃体内注射对人类眼施用本发明的补体因子B蛋白类似物。在一些实施方式中，通过玻璃体内注射对人类眼施用约15μg～约5mg、约15μg～约500μg、约100μg～约900μg、约300μg～约700μg、约500μg～约1mg、约1mg～约5mg、约1mg或约500μg的补体因子B蛋白类似物。
在一些实施方式中，通过视网膜下注射或玻璃体内注射施用慢病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体施用本发明的补体因子B蛋白类似物。在一些实施方式中，通过视网膜下注射来施用约5x106～约5x108、约5x106～约5x107、约5x107～约5x108、约1x107～约1x108、约3x107～约5x107、约2.5x107、约5x107、约7.5x107或约1x108转导单元的慢病毒载体。在一些实施方式中，通过视网膜下注射来施用约5x108～约1x109、约5x108～约7.5x108、约7.5x108～约1x109、约6x108～约9x108、约7x108～约8x108、约5x108、约6x108、约7x108、约8x108、约9x108或约1x109转导单元的AAV载体。
在一些实施方式中，通过玻璃体内注射来施用约5x108～约1x1010、约5x108～约5x109、约5x108～约2x109、约2x109～约5x109、约5x109～约1x1010、约5x108～约1x109、约1x109～约3x109、约3x109～约6x109、约6x109～约1x1010或约1x109～约1x1010转导单元的AAV载体。
在一些实施方式中，视网膜下注射约50μl～约100μl、约50μl～约75μl、约75μl～约100μl、约60μl～约90μl、约70μl～约80μl、约50μl、约60μl、约70μl、约80μl、约90μl或约100μl的补体因子B蛋白类似物或编码补体因子B蛋白类似物的载体。在一些实施方式中，玻璃体内注射约50μl～约1ml、约50μl～约500μl、约500μl～约1ml、约250μl～约750μl、约250μl～约500μl、约500μl～约750μl、约400μl～约600μl或约750μl～约1ml的补体因子B蛋白类似物或编码补体因子B蛋白类似物的载体。
在一些实施方式中，消炎剂可以与本发明的补体因子B蛋白类似物(例如hfB3-292S或hfB3-292S-740N)、载体或核酸组合递送。可以在施用本发明的分子或载体之前、同时和/或之后递送消炎剂。在一些实施方式中，可以在同一溶液和/或同一注射器中与本发明的补体因子B蛋白类似物、核酸或载体一起施用消炎剂。在一些实施方式中，例如如本文所述，本发明的补体因子B蛋白类似物或载体和消炎剂可以共施用至眼。
许多消炎药是本领域已知的，并且包括但不限于：地塞米松、地塞米松间磺基苯甲酸钠、地塞米松磷酸钠、氟米龙、溴芬酸、普拉洛芬、RESTASISTM、环孢菌素眼用乳剂、萘普生、糖皮质激素、酮咯酸、布洛芬、托美汀、非甾体消炎药、甾体消炎药、双氯芬酸、氟比洛芬、吲哚美辛和舒洛芬。
本发明的一些实施方式包括同时施用补体因子B蛋白类似物和编码其的载体。可以在施用本发明的载体之前、同时和/或之后递送本发明的补体因子B蛋白类似物。在一些实施方式中，可以在同一溶液和/或同一注射器中与本发明的载体一起施用本发明的补体因子B蛋白类似物。在一些实施方式中，例如如本文所述，本发明的补体因子B蛋白类似物和本发明的载体可以共施用至眼。
另外，补体因子B类似物或编码其的核酸可以经由细胞(例如作为细胞治疗)递送或施用至动物。例如，这可以通过施用或递送表达补体因子B类似物的细胞实现。在一些实施方式中，经由可调节、可诱导和/或阻遏性启动子从细胞表达补体因子B类似物。在一些实施方式中，将表达补体因子B类似物的包封细胞递送至动物，例如参见涉及包封细胞的PCT公开号WO07078922。在一些实施方式中，局部(例如关节、玻璃体内、视网膜内、颅内等)或全身(例如静脉内)施用细胞。
待施用至动物的细胞可以是自体同源的、同种异体的或异源的。在一些实施方式中，离体操作自体同源细胞，以使它们产生本发明的补体因子B蛋白类似物，并且在一些实施方式中，将所述细胞导回至动物。将由编码区组成的核酸离体转移至细胞可以通过任何方法进行，例如电穿孔、显微注射、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合、脂质体转染、微粒轰击、磷酸钙介导的转染和病毒感染等。可选的是，也可以将选择标记引入细胞中。如果利用选择标记，可以对所述细胞进行选择，以例如增强表达和/或分离表达所转移的编码区的那些细胞(参见例如Loeffler&Behr,Meth.Enzymol.217:599-618(1993);Cohen等,Meth.Enzymol.217:618-644(1993)；和Cline,Pharmac.Ther.29:69-92(1985))。
可以通过本领域已知的各种方法将重组细胞(例如体外转导的自体同源细胞或同种异体细胞)递送至患者。例如，如本领域已知，可以在施用之前将细胞包封。在一些实施方式中，当包封时，所述细胞不是自体同源的。在一些实施方式中，可以静脉内施用重组血细胞(例如造血干细胞和/或祖细胞)。在一些实施方式中，可以将眼细胞和/或多潜能细胞直接注射入眼中。所需的细胞的量依赖于所需效果、动物状态等。
在本发明的一些实施方式中，基因递送系统可以导致将补体因子B类似物的基因或编码区转导到和/或稳定整合到靶细胞中。在一些实施方式中，靶细胞是哺乳动物细胞，例如灵长类细胞和人类细胞。在一些实施方式中，靶细胞是眼细胞，例如视网膜色素上皮细胞、视网膜细胞或多潜能细胞。靶细胞可以体外的、离体的或体内的。在一些实施方式中，靶细胞是干细胞。干细胞包括但不限于多潜能干细胞、全能干细胞、造血干细胞、癌干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方式中，本文设想的多潜能干细胞不是从受精卵或卵裂球繁殖生物体的那些细胞。本发明还设想将部分未分化的细胞部分植入需要治疗的患者的眼中，以例如使眼的细胞再生。
转基因动物
本发明的一些实施方式提供表达本发明的补体因子B类似物的转基因动物(例如非人类)。用于制造转基因动物的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，转基因动物(例如小鼠)会包含Fas基因中的突变、缺失或破坏，例如参见Macmicking等Cell.81:641-650(1995)。
实施例
现在参考以下实施例描述本发明。仅出于说明目的提供这些实施例，本发明决不应该解释为限于这些实施例，而是应该解释为包含与本文提供的教导结果等价的任何变化形式和所有变化形式。
然而，本文已经出于说明目的描述本发明的具体实施方式，本领域技术人员会意识到的是，无需背离如所附权利要求所述的发明即可进行细节的许多变化。
实施例1.hfB3表达构建体的生成
将质粒设计成包括具有IRES-Neo选择标记的人hfB3(hfB3-IRES-Neo)的编码序列。该质粒通过GENEART AG(雷根斯堡，德国，质粒)(一个收费服务合同组织)合成。将Nhe I限制位点同时整合到编码序列的5’端和3’端。对hfB3核酸编码序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中优化表达。
对基因表达质粒pCI(Promega,Madison,WI)进行修饰。首先，将BGH(BovineGrowth Hormone)多聚A从pCI除去，并且用合成多聚A替换。接下来，将具有选择标记的hfB3编码序列(hfB3-IRES-Neo)通过Nhe I从质粒切割下，并将其作为平末端连接克隆到经修饰pCI的Sal I位点中，以创建hfB3表达构建体。对质粒整个进行测序，以确认构建体(SEQ ID NO:5)的序列完整性。
实施例2.hfB3-292S表达构建体的生成
在hfB3蛋白中引入进一步的修饰。人野生型因子B蛋白和hfB3蛋白具有23个半胱氨酸(C)，表明在所述蛋白中存在至少一个未配对游离半胱氨酸。二硫键作图表明生物活性hfB3中的游离C位于第292位氨基酸。在不同物种之间因子B蛋白中292位处的C是高度保守的(上表1)。该实施例中，将292位处的C改变为丝氨酸(S)，生成hfB3-292S。
为了创建hfB3-292S表达构建体，将定点突变引入hfB3表达构建体(SEQ ID NO:5)中。
将hfB3表达构建体用作模板，以使用Stratagene’s Site-Directed Mutagenesis Kit根据制造商说明书制造将292位的C改变成S的位点突变，创建hfB3-292S表达构建体。使用两个引物：正向引物5’-CACCGGCGCCAAGAAGAGCCTGGTCAACCTGATC-3’(SEQ ID NO:6)和反向引物5’-GATCAGGTTGACCAGGCTCTTCTTGGCGCCGGTG-3’(SEQ ID NO:7)。下划线的核苷酸表示C至S的突变氨基酸。hfB3-292S表达盒从5’至3’包括：CMV启动子、嵌合内含子、经密码子优化的hfB3-292S的编码序列、IRES-Neo选择标记和合成多聚A(图2)。对整个构建体进行测序，以确认所述构建体的突变和完整性(SEQ ID NO:8)。hfB3-292S的预测氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中。
实施例3.稳定的hfB3和hfB3-292S表达细胞系的生成
通过用hfB3或hfB3-292S表达构建体转染293FreeStyle细胞(Invitrogen,Cat.No.R79007)，而生成表达hfB3或hfB3-292S蛋白的稳定细胞系。通过基于PEI(聚乙烯亚胺，Sigma,Cat.No.23966)的转染介导质粒DNA至293FreeStyle细胞的转染。在无菌水中制备终浓度为1mg/mL的PEI溶液。用5N HCl将pH调整至7.0。使用0.22μm过滤器对所述溶液除菌。在-80℃储存PEI的等分试样，直到使用。
转染程序如下：
在转染前一天，以1x106个细胞/mL将细胞接种在无血清293F ExpressionMedium(Invitrogen,Cat.No.12338-018)中。
第二天，将细胞用仅补充有HT Supplement(Cat.No.11067-030,Invitrogen)的基础RPMI1640培养基(Invitrogen,Cat.No.22400-089)洗涤，以2x106个细胞/mL再悬浮在相同的培养基中，并分配至新的6孔板中，每孔1mL。
如下在无菌150mM NaCl中制备DNA和PEI的原液：将2.5μg hfB3或hfB3-292S表达构建体DNA(以2.5μL)稀释到47.5μL的150mM NaCl中，并通过移液管抽吸混合(DNA溶液)。将10微升(10μL)PEI溶液稀释到40μL的150mM NaCl中，然后温和旋转(PEI溶液)。在室温将DNA和PEI溶液温育5分钟。然后将PEI溶液添加至所述DNA溶液中，使混合物在室温再温育10分钟，然后将DNA/PEI混合物添加至所述6孔板的细胞中，在具有8%CO2和85%湿度的温育器中在37℃于振荡(200RPM)下温育细胞5小时。5小时后，在各个孔中添加1.1mL完全293F表达培养基(无添加剂)，继续温育72小时。
然后收获细胞，将其用293F表达培养基洗涤1次，并放置在含有300μg/mL G418(Teknova)的新鲜293F表达培养基中。作为阴性对照，在相同的含G418培养基中培养等量的未转染293F初始细胞。对所述细胞进行G418选择约3个周。在这段时间内，含G418培养基中的未转染细胞死亡。使转染细胞通过FICOL梯度液(Sigma)以从G418-抗性活种群中除去死亡或正在死亡的细胞。将G418-抗性活种群进一步扩增约2周，在此期间每2-3天使细胞旋转沉降并再悬浮于含300μg/mL G418的新鲜293F表达培养基中。
实施例4.hfB3和hfB3-292S的生产
将产生hfB3或hfB3-292S的G418-抗性细胞以2x106个细胞/mL的密度接种在每孔具有2mL培养基的6孔板中的293F表达培养基中、每烧瓶具有100mL培养基的500mL转瓶中的293F表达培养基中、或每烧瓶具有1,000mL培养基的3,000转瓶中的293F表达培养基中。在100rpm的振荡下在轨道摇床上于具有8%CO2和80%湿度的37℃温育器中将细胞温育72小时。
然后收获含有hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的细胞培养基上清液，将其以2,000rpm离心10分钟，以清除细胞碎片，之后使培养基过滤通过0.22μm过滤器。
实施例5.hfB3和hfB3-292S蛋白的定量
对于hfB3和hfB3-292S的定量开发了电化学发光检验(ECL)，使用人野生型因子B作为标准品。所述检验是基于BioVeris’s ECL技术的夹心免疫检验。简言之，ECL检验格式化为96孔板夹心、一步且无洗涤的检验。将质量控制样品(来自人血浆的纯化因子B，Quidel,Cat.No.A408)和测试样品与主混合试剂一起温育，所述主混合试剂含有生物素化的抗hfB单克隆抗体(抗人因子B单克隆抗体，R&D Systems,Cat.No.MAB2739)、BV-TAG plus-标记的抗hfB多克隆抗体(抗人因子B多克隆抗体,R&DSystems,Cat.No.AF2739)和链霉亲和素包被的顺磁性珠。将混合物温育150分钟。温育后，添加停止液(硼酸盐缓冲液，250mM,pH9.2，含有500mM氯化钠和1.6mg/mLBSA)，然后在M1MR Analyzer上对上述板读数。该检验的估计动态范围为9.0ng/mL～950ng/mL。
实施例6.hfB3和hfB3-292S的蛋白质印迹分析
通过将hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白与非还原性蛋白样品缓冲液(Pierce)混合而进行在变性且非还原条件下hfB3蛋白和hfB3-292S蛋白的聚丙烯酰胺电泳(Pierce)。将从血浆中纯化的人因子B蛋白(每份样品100ng，Quidel)用作阳性对照。每个凝胶还包括具有预染色蛋白分子量标记(15μL/泳道)(Invitrogen)的孔。在非还原性蛋白样品缓冲液中在95℃对样品和标记加热5分钟。将样品加载到7.5%Tris-HCL Precast minigel(Bio-Rad)上。使凝胶在75V泳动(10X SDS/Tris/Glycine Running Buffer,Bio-Rad)15分钟，或直到染料前端通过堆积凝胶进入分离凝胶中。一旦染料前端进入分离凝胶中，将电压增加至100V，继续进行电泳直到染料前端跑离所述凝胶。
通过在温和摇晃的同时在转移缓冲液中对凝胶进行洗涤和平衡20分钟而进行蛋白质印迹分析。也在转移缓冲液中对硝酸纤维素膜(Bio-Rad)和印迹纸进行平衡。使用Trans Blot Semi-Dry Transfer Cell(Bio-Rad)将通过SDS-PAGE分离的蛋白电泳转移至硝酸纤维素上(20V，45分钟)。一旦完成转移，在摇床上通过温和摇动于室温下用1X酪蛋白溶液(Vector Laboratories)封闭所述膜至少1小时。在温和摇动下用在1X酪蛋白溶液中稀释成1:10,000的一抗(针对人因子B的单克隆抗体，R&D Systems,Cat.No.MAB2739)探测所述膜1小时，并且在摇床上于温和摇动下在10mL的1X酪蛋白溶液中洗涤3次，每次5分钟。在摇床上在温和摇动下于室温使所述膜与用在1X酪蛋白溶液中稀释成1:20,000的生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗，R&D Systems,Cat.No.BAF007)一起温育1小时，并且在室温于温和摇动下在10mL的1X酪蛋白溶液中洗涤3次，每次5分钟。使所述膜在20mL的1X酪蛋白溶液中的VectastainABC-AmP试剂(Vector Laboratories)中温育45分钟，所述试剂含有40μL的试剂A和40μL的试剂B。在室温于温和摇动下将所述膜在10mL的1X酪蛋白溶液中洗涤3次，每次5分钟。
为了从蛋白质印迹获得化学发光信号，在20mL的0.1M Tris pH9.5中在不摇动下将所述膜平衡5分钟。通过垂直拿持所述膜并使所述膜的边缘接触擦拭纸Kimwipe而从所述膜上除去过量的缓冲液。所述膜的目标侧在新容器中面朝上放置。将DuoloxSubstrate(7mL,Vector Laboratories)直接放置到所述膜的目标侧，所述膜在黑暗中温育5分钟。通过垂直拿持所述膜并使所述膜的边缘接触擦拭纸Kimwipe而从所述膜上除去过量的Duolox。通过在黑暗中于摇动下将所述膜浸入pH9.5的20mL的0.1MTris中5分钟，而对所述膜进行洗涤。通过垂直拿持所述膜并使所述膜的边缘接触擦拭纸Kimwipe而从所述膜上除去过量的缓冲液。将所述膜放置在折叠的塑料包装纸中，暴露至胶片暗盒中的Kodak BioMax MS X射线胶片1～5分钟。将所述膜放置在柯达显影液(将26mL显影液稀释在92mL的ddH2O中)中1分钟。将所述膜从显影液中取出，并放置在柯达定影液(将26mL定影液稀释在92mL的ddH2O中)中1分钟。最后，用自来水冲洗胶片，使其在室温下干燥。
如图3中所示，G418抗性的hfB3和hfB3-292S生产细胞在细胞培养基中产生恰当尺寸(约100KDa)的hfB3蛋白(泳道3)和hfB3-292S蛋白(泳道4)。这些蛋白以约与纯化自人血浆的野生型人因子B(泳道2)相同的速率迁移。在未转染的细胞培养基(阴性对照)中没有检测到可见带，表明单克隆抗人因子B抗体(泳道1)的特异性。令人感兴趣的是，在hfB3样品中容易地检测到约200KDa～260KDa的推测聚集体(泳道3)，而在相同的实验条件下产生的hfB3-292S样品中没有检测到聚集体(泳道4)。聚集体可以由细胞培养基中hfB3的错折叠群体引起。当蛋白错折叠时，它们暴露疏水区，所述疏水区倾向于通过疏水-疏水相互作用形成聚集体。这些数据表明在hfB3-292S蛋白制品中，与hfB3蛋白比较错折叠消除或显著减少。
实施例7.替代补体途径溶血活性检验
可以使用如该实施例中所述的溶血检验测定人替代补体途径活性。
用新制备的冷Mg2+-EGTA缓冲液洗涤1毫升(1mL)的兔红细胞(rRBC)(LampireBiological Laboratory,Cat.No.7246408)悬浮液。将红细胞转移至50mL锥形离心管，添加30mL的Mg2+-EGTA缓冲液，并温和地混合细胞。在4℃以1,200rpm在BeckmanAllegra6KR离心机中不间断地离心5分钟，使rRBC成球团，并使其再悬浮于Mg2+-EGTA缓冲液中。该洗涤步骤重复2次。使rRBC再悬浮于2mL的冰冷Mg2+-EGTA缓冲液中，使用血球计获得细胞计数。
在放置在冰上的V型底的96孔板中建立溶血活性反应混合物。为了确定hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白是否能够与野生型人因子B蛋白竞争并且抑制其溶血活性，在包含500ng的野生型人因子B、增加量的hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白和GVB++缓冲液(Sigma,Cat.No.G6415)的40μL总体积中建立竞争检验。将50微升(50μL)的用Mg2+-EGTA缓冲液稀释25倍的因子B耗尽的人血清添加至各孔，然后用10μL的Mg2+-EGTA洗涤5x107rRBC。添加rRBC后，使用多道移液管在96孔板中将各个样品温和地混合。
将96孔板放置在玻璃托盘中，所述玻璃托盘具有浸没所述板的底部的37℃的水层。然后将托盘放置在具有以110rpm摇晃的轨道的37℃水浴中40分钟。温育后，将所述板放置在冰上，向各孔添加150μL的冰冷0.9%盐水，使各反应通过移液管抽吸温和混合，以停止所述反应。在4℃在Eppendorf5810R离心机中将96孔板以2,000rpm不间断地离心5分钟(min)，以使rRBC在所述板的底部成球团。从各孔除去上清液(180μL)而不扰动所述球团，并将上清液转移至新96孔板的相应孔。在微板阅读器中于405nm测定各样品的吸光度。
实施例8.hfB3和hfB3-292S的生物活性
通过测定替代补体途径介导的rRBC溶血来检查hfB3蛋白和hfB3-292S蛋白的生物活性。使用实施例7中描述的检验来测试hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白抑制人替代补体途径的效力。各反应一式三份进行。如图4中所示，来自产生hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的细胞的粗细胞培养基以剂量依赖性方式有效地抑制/减少替代补体途径活性。虽然不希望受理论限制，hfB3和hfB3-292S蛋白可以通过与野生型因子B蛋白竞争和/或通过阻隔C3b和/或补体因子D而抑制替代补体途径活性。
实施例9.hfB3和hfB3-292S蛋白的纯化
将来自经转染并稳定表达和分泌hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的人293FreeStyle细胞系的细胞培养基用作用于纯化hfB3蛋白或hfB3-292S蛋白的初始材料。使用GEAKTA Purifier，通过分别用于捕获、中间纯化和精提步骤的阴离子交换(AEX)、疏水相互反应(HIC)和尺寸排阻色谱(SEC)的组合，而从细胞培养上清液中纯化可溶性分泌的hfB3或hfB3-292S蛋白。以下描述两种纯化方案。这两种方案的不同之处在于，一种使用一步HIC色谱，另一种使用两步HIC色谱。
用蒸馏水以培养上清液/水为4:1的体积比稀释含有hfB3蛋白的细胞培养上清液，以将电导率降低至～8毫西门子/厘米(mS/cm)，并且用50mM磷酸盐缓冲液调整至pH7.5。使用P-960泵以30mL/分钟的流速将该材料直接加载到位于AKTA净化器上的预包装的离子交换柱(POROS HQ50,ABI)上。事先用缓冲液A(50mM磷酸盐缓冲液(PB),pH7.5,电导率～8mS/cm)以600mL/hr的线性流速(～1柱体积/min,CV/min)对所述柱进行平衡。通过UV检测在280nm处监视洗脱液。洗去未结合材料后，用缓冲液A和缓冲液B(50mM PB和1M NaCl,pH7.5)的非线性梯度液洗脱停留材料，以逐步地将流动相的电导率从8mS/cm(0%缓冲液B，2CV)逐步上升至33mS/cm(25%缓冲液B，8CV)，并最后上升至105mS/cm(100%缓冲液B，5CV)。
为了进一步促进宿主蛋白污染物的去除，引入中间的疏水相互作用(HIC)色谱步骤，这基于它们的表面疏水性的差异纯化和分离蛋白。收集含有hfB3蛋白的主要级分(来自AEX色谱步骤)，以硫酸铵/磷酸盐缓冲液相对于样品的约30:1的体积比向样品中添加缓冲液C(1.5M的硫酸铵和50mM磷酸盐缓冲液,pH7.5)，将其调整至含有约1.4M的硫酸铵和47mM的磷酸盐缓冲液,pH7.5(电导率216mS/cm)(1.0M的硫酸铵和33.7mM的磷酸盐缓冲液,pH7.5，对于hfB3-292S为电导率169mS/cm)。使收集的样品过滤通过0.2μm的过滤器，并且以300mL/hr(1CV/min)的流速将其应用至用pH7.5的1.5M的硫酸铵和50mM磷酸盐缓冲液(缓冲液C)(对于hfB3-292S为1.0M的硫酸铵和33.7mM磷酸盐缓冲液)预平衡的疏水相互作用柱(HiTrap PhenylHP,GE Healthcare)。以非线性方式通过减少硫酸铵浓度而洗脱停留材料。
作为选择，中间HIC色谱步骤可以用两步HIC色谱替换，例如以使纯化过程更易于扩大化。在该两步HIC色谱过程中，大多数宿主细胞蛋白通过第一步HIC色谱、HIC阴性选择、通过结合至HIC柱(HiTrap Phenyl HP,GE Healthcare)在低盐条件(对于fB3为0.75M硫酸铵和25mM磷酸盐缓冲液,pH7.5；以及对于hfB3-292S为0.6M硫酸铵和20mM磷酸盐缓冲液,pH7.5，电导率100mS/cm)下与fB3或fB3-292S分离。然后将来自HIC阴性选择步骤的含有fB3或fB3-292S蛋白的流过级分再调整成对于fB3含有约1.5M硫酸铵和50mM磷酸盐缓冲液,pH7.5(电导率216mS/cm)，或者对于hfB3-292S含有1.0M硫酸铵和33.7mM磷酸盐缓冲液,pH7.5(电导率169mS/cm)。对于第二步HIC色谱，使样品过滤通过0.2μm的过滤器，并且以300mL/hr(1CV/min)的流速将其应用至用pH7.5的1.5M的硫酸铵和50mM磷酸盐缓冲液(对于fB3)以及1.0M的硫酸铵和33.7mM磷酸盐缓冲液(对于hfB3-292S)预平衡的疏水相互作用柱(HiTrap Phenyl HP,GE Healthcare)。以非线性方式通过减少硫酸铵浓度而洗脱停留材料，以进一步从残留宿主细胞蛋白中分离fB3或fB3-292S蛋白。
收集含有来自HIC色谱步骤的生物活性hfB3蛋白的级分，并用离心过滤装置浓缩(Millipore,Amicon Ultra,Cat.No.901024,10,000MW Cut-off)。使浓缩的样品在于PBS缓冲液(4mM磷酸盐，150mM NaCl,pH7.4，(GIBCO))中平衡的Sephacryl S30026/60HR柱(最大加载体积：3%CV,～10mL)上进行尺寸排阻色谱。使用PBS以60cm/hr的恒定线性流速进行hfB3蛋白的洗脱，通过280nm处的UV检测监视洗脱液。以等分试样将纯化的hfB3蛋白贮存在-80℃。
该步骤使hfB3蛋白与其它污染物基本完全分离。如对0.2μg纯化hfB3蛋白进行的SDS-PAGE银染色分析仅产生单个尖锐的带(图5，左图)的事实所表明的，三步色谱过程后hfB3蛋白的纯度相当高。当在溶血检验中使通过以上三步色谱过程纯化的hfB3蛋白相对于人野生型因子B进行竞争检验时，其抑制了人替代补体途径的溶血活性，证明所纯化的hfB3蛋白具有生物活性(图5，右图)。令人惊奇的是，通过HIC检测两群hfB3，一群是生物活性的(称为峰I或活性群体)，另一群具有低得多的生物活性(称为峰II或活性较低的群体)(图6)。在稳定产生hfB3蛋白的细胞的未加工细胞培养基中通过反相HPLC(RP-HPLC)容易地检测出这两种形式。
实施例10.产生hfB3-292S蛋白的细胞系不产生峰II群体
使含有补体因子B类似物(在292位游离半胱氨酸被丝氨酸取代)的粗hfB3-292S蛋白细胞培养基进行RP-HPLC分析，使用初始293FreeStyle细胞培养基作为阴性对照，粗hfB3蛋白细胞培养基作为阳性对照(图7)。hfB3-292S蛋白细胞培养基不产生任何可检测的峰II群体，而hfB3蛋白细胞培养基的分析显示35%的hfB3为低活性的峰II群体(图7A&B)。
实施例11.hfB4表达构建体和hfB4蛋白的生成和表征
将hfB4蛋白设计成将位于hfB3的740位氨基酸处的天冬氨酸改变为天冬酰胺。认为该改变削弱或抑制该补体因子B蛋白类似物的丝氨酸蛋白酶的功能。
为了创建hfB4表达构建体，将定点诱变引入hfB3表达构建体中。
实施例1中所述的hfB3表达构建体(SEQ ID NO:5)用作模板，以使用Stratagene的Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Santa Clara,CA)根据制造商说明书进行将SEQ ID NO:4的740位处的天冬氨酸(D)改变为天冬酰胺(N)的突变，创建hfB4表达构建体。使用两个引物：正向引物5’-GTCCCCGCCCACGCCCGGAACTTCCACATCAACCTGTTCC-3’(SEQ ID NO:15)和反向引物5’-GGAACAGGTTGATGTGGAAGTTCCGGGCGTGGGCGGGGAC-3’(SEQ ID NO:16)。下划线的核苷酸表明导致D至N的氨基酸改变的核苷酸改变。该hfB4表达构建体从5’至3’包括：CMV启动子、嵌合内含子、经密码子优化的hfB4的编码序列、IRES-Neo选择标记和合成多聚A。对整个构建体进行测序，以确认所述构建体的突变和完整性。hfB4的预测氨基酸序列示于SEQ ID NO:17中。hfB3和hfB4的氨基酸序列之间的唯一差异是D740N改变。
通过如实施例3所述对293细胞进行PEI-介导的转染和药物选择而生成表达hfB4蛋白的稳定细胞系。通过如实施例5所述的ECL测定hfB4蛋白在所选择细胞群体的细胞培养基中的浓度。
对于使用一步HIC色谱方法如实施例9所述进行纯化的hfB4蛋白的生物活性，通过如实施例7所述的溶血活性检验进行检查。表2显示人替代补体途径溶血活性被含有hfB4蛋白的细胞培养基抑制。相对溶血活性通过在rRBC被人替代补体途径途径溶血后释放的血红蛋白进行评分。如表2所示，hfB4蛋白有效地抑制替代补体途径活性。
表2.人替代补体途径溶血活性的hfB4抑制
实施例12.hfB3-Fc表达构建体和hfB3-Fc蛋白的生成和表征
hfB3-Fc是hfB3和IgG Fc的融合蛋白。具体而言，将全长hfB3蛋白与人IgG4Fc融合。
为了创建hfB3-Fc表达构建体，使用两种引物如实施例1所述从hfB3表达构建体(SEQ ID NO:5)扩增PCR产物：正向引物5’-GCGCACCGGTGCTAGCGAATTCGGCGACAAGAAGGGCAGCTGCGA-3’(SEQID NO:19)；和反向引物5’-GCGCAGATCTCAGGAAGCCCAGGTCCTCAT-3’(SEQ IDNO:20)。然后将含有hfB3-Fc的C末端的编码区的377bp PCR产物用Age I和Bgl II消化，并且连接至之前用Age I和Bgl II消化的pFUSE-hIgG4Fc(Invivogen,Cat.Code:pfuse-hg4fc1)，创建质粒phfB3Cterm-Fc。将hfB3表达构建体(SEQ ID NO:5，描述于实施例1中)用EcoR I和EcoR V消化。将含有hfB3的N末端的EcoR I/EcoR V片段连接至之前用EcoR I和EcoR V消化的phfB3Cterm-Fc，创建EcoR I and EcoR V。用Nhe I消化phfB3-Fc质粒，将含有hfB3和Fc编码序列的片段连接到具有实施例1所述的IRES-Neo的经修饰pCI构建体中，创建hfB3-Fc表达构建体(SEQ ID NO:18)。该hfB3-Fc表达构建体从5’至3’包括：CMV启动子、嵌合内含子、hfB3-Fc的编码序列、IRES-Neo选择标记和合成多聚A。对整个构建体进行测序，以确认所述构建体(SEQ ID NO:18)的完整性。SEQ ID NO:21是hfB3-Fc蛋白的氨基酸序列。
通过如实施例3所述对293细胞进行PEI-介导的转染和药物选择而生成表达hfB3-Fc蛋白的稳定细胞系。将经药物选择的细胞以2x106个细胞/mL培养72小时。然后通过使2μl的细胞培养上清液进行非还原SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，而检测hfB3-Fc蛋白的表达。如图8中所示，通过山羊抗因子B特异性抗体(R&D Systems,Cat.No.AF2739)来检测hfB3-Fc蛋白的两条带。在左侧示出以KDa为单位的分子量标记。不希望受理论限制，hfB3-Fc蛋白的这两条带可能表示所述蛋白的单体和二聚体。通过如实施例7所述的溶血活性检验来检测(在细胞培养上清液中的)hfB3-Fc蛋白生物活性。如表3所示，hfB3-Fc蛋白抑制替代补体途径活性。
Table3.人替代补体途径溶血活性的hfB3-Fc抑制
实施例13.重复冷冻/解冻对hfB3-292S补体抑制的影响
如实施例9所述使用一步HIC色谱法纯化hfB3-292S蛋白。将在PBS中的经纯化的hfB3-292S蛋白从-80℃冷冻中取出并在室温解冻，其计为第一次冷冻和解冻循环。该次解冻后，用PBS将hfB3-292S蛋白浓度调整至2mg/mL，取样一等分试样的hfB3-292S，将其保存在冰上作为第一次冷冻和解冻样品。然后通过将hfB3-292S蛋白的试管浸入甲醇/干冰浴中20分钟而将hfB3-292S蛋白的试管冷冻，然后在室温解冻，直到完全解冻(第二次冷冻和解冻循环)。在重复下一次冷冻和解冻循环之前取样一等分试样的样品，将其留出。如实施例7所述在替代补体途径介导的溶血检验中通过测定样品与野生型人因子B的能力，来分析来自每一次冷冻和解冻循环(总共7次)的样品的生物活性。各反应含有固定量的野生型人因子B(0.5μg)与增加量的hfB3-292S。表4中的结果表示溶血检验中的抑制百分比。
这些结果证明，即使在7次冷冻和解冻循环后，hfB3-292S蛋白仍然能够有效地抑制替代途径介导的溶血(表4)。所有样品中都观察到溶血抑制的类似水平，这表明重复的冷冻和解冻(多达7次)不影响hfB3-292S蛋白抑制补体介导的溶血的能力。
表4.冷冻/解冻循环后的hfB3-292S
实施例14.hfB3-292S蛋白比hfB3蛋白的热稳定性高
如实施例9所述使用一步HIC色谱法纯化hfB3和hfB3-292S蛋白。将在PBS中的经纯化hfB3和hfB3-292S蛋白从-80℃取出。将蛋白质浓度重新调整为在PBS(pH7.4)中2mg/mL。将hfB3和hfB3-292S蛋白等分成三个0.6mL eppendorf管(每管40μL)，然后在4℃、-80℃和37℃条件下贮存7天。通过如实施例7所述测定它们抑制替代补体途径介导的溶血的能力来测定每个所贮存样品的生物活性(抑制补体介导的溶血的能力)。该溶血检验的结果显示，在4℃或-80℃贮存7天没有影响hfB3或hfB3-292S抑制替代补体途径介导的溶血的能力。但是，在所有四个测试样品中贮存在37℃下7天的hfB3基本上丧失其所有生物活性。引人注目的是，贮存在37℃下7天的hfB3-292S良好地保留了其生物活性，并且仍然能够有效地与野生型人因子B竞争。表5中的结果代表人替代补体活性(具有标准偏差)被hfB3或hfB3-292S抑制的百分比。这些结果表明在37℃下hfB3-292S蛋白具有比hfB3蛋白更高的热稳定性。
实施例5.hfB3和hfB3-292S的热稳定性
实施例15.人因子B、fB3和fB3-292S蛋白的蛋白解折叠温度(Protein melting point)确定
蛋白熔融温度(Protein melting temprature,Tm)是蛋白的热稳定性的量度，包括蛋白的氨基酸序列的改变在内的因素可能影响蛋白的热稳定性。人因子B蛋白(hfB)含有23个半胱氨酸残基，其中22个以双硫键对(胱氨酸)存在，其中的一个，C292，以未配对的游离巯基(sulfhydrile)形式存在。
通过将每种蛋白在1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)的存在下温育并测定ANS在460nm的荧光的增加，将hfB3蛋白(K258A、R259A、K260A、D279G、N285D)和hfB3-292S蛋白(将hfB3蛋白的单个未配对半胱氨酸残基修饰为丝氨酸)的熔融温度特性与hfB蛋白比较。ANS与蛋白疏水区结合(Stryer,J.Molecular Biology(1965)13:482-495)，并且已经用于调查温度对hfB蛋白的表面疏水性的影响(Takada等,Complement(1985)2:193-203)。在100μL含有10mM ANS(Invitrogen,Catalog#A-47)的PBS(137mMNaCl,2.7mM KCl，10mM磷酸盐,pH7.4)缓冲液中制备含有hfB蛋白(35μg)、hfB3蛋白(50μg)和hfB3-292S蛋白(39μg)的样品。将每种蛋白(一式三份)的样品在封闭的聚丙烯管中在21℃、30℃、37℃、44℃、47℃、50℃、55℃、60℃和65℃温育30分。将样品转移至清晰的96孔微孔板(Costar,Catalog#3635)，并在PerceptiveBiosystems Cytofluor4000微孔板分光光度计中测定荧光(激发=60/40nm，发射=460/40nm)。使用非线性4PL曲线拟合对结果进行分析。野生型hfB蛋白、hfB3蛋白和hfB3-292S蛋白的Tm值(来自两个实验的结果的平均值)分别确定为46.4℃、45.1℃和47.0℃。在hfB3蛋白中相对于野生型hfB蛋白进行的5个氨基酸改变(K258A、R259A、K260A、D279G、N285D)导致ΔTm=-1.3℃，表明hfB3蛋白与相应的野生型hfB蛋白相比热稳定性低。但是，hfB3-292S蛋白的Tm(47.0℃)导致相对于hfB3蛋白的ΔTm=+1.9℃，表明hfB3-292S蛋白至少与野生型hfB蛋白(46.4℃)的热稳定性相同。
因此，与指出在人成纤维生长因子(FGF-1)蛋白(C83S或C117S)中半胱氨酸残基被丝氨酸取代分别将Tm减少13℃和2℃的Culajay等(Biochemistry(2000)39:7153-7158)的结果相反，hfB3在C292位氨基酸的取代导致hfB3-292S比hfB3更具热稳定性。
实施例16.hfB3-292S蛋白在小鼠类风湿性关节炎模型中预防关节炎症和损伤
胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)是类风湿性关节炎的侵袭性小鼠模型(Terato K等,J.Immunol.(1992)148(7):2103-8；Terato K等,Autoimmunity(1995)22(3):137-47)。在该模型中，用LPS增强的含有4种针对胶原的单克隆抗体的胶原抗体鸡尾酒(Chondrex,Inc.,Catalogue Number:10010)用于在6周龄的DBA/1J雄性野生型小鼠(JacksonLaboratory)中诱导关节炎。
将40只小鼠分成三组。第1组具有充当载剂对照组的10只小鼠，其中在第0天将100μL PBS(磷酸盐缓冲盐水,pH7.4)注射入尾静脉中，在第3天每只小鼠腹膜内施用25μg LPS(List Biological Lab,Campbell,California,目录号：421)的增强注射(LPS以500g/mL的浓度存在于PBS中)，在第3、5、7和9天再次经由尾静脉增强注射100μL的PBS。第2组具有15只小鼠，所述小鼠在第0天经由尾静脉用胶原抗体鸡尾酒(每只小鼠在100μL PBS中的0.25mg)注射，在第3天接受25μg LPS的增强注射，并在第3、5、7和9天经由尾静脉施用100μL PBS。第3组具有15只小鼠，所述小鼠在第0天经由尾静脉每只小鼠注射0.25mg的胶原抗体鸡尾酒和1mg的hfB3-292S蛋白(所述抗体鸡尾酒和hfB3-292S蛋白都在100μL PBS中)，在第3天接受25μg LPS的增强注射，并在第3、5、7和9天经由尾静脉施用在100μL PBS中的1mg的hfB3-292S蛋白。
每天检查小鼠。当进行关节测定时记录每只小鼠体重。在第1、4、6、9和11天就宽度和厚度使用卡尺测定前爪和后肢关节。测定顺序为左前肢、左后肢、右后肢和右前肢。在第11天，杀死所有动物，收集所有肢体(左前肢、右前肢、左后肢和右后肢)并将其贮存在带有个体标签的塑料盒中。将每个盒放置在含有10%中性缓冲福尔马林溶液的组织学容器中。
对这些小鼠肢体进行石蜡切片和H&E染色，以检查关节中的发病机理。具体而言，固定后，将来自每只小鼠的每个肢体分别转移至塑料盒中。在室温(RT)下在烧杯中用流水冲洗肢体30分钟，以除去固定液。然后通过将所述盒浸入所述溶液中，将每个盒转移至含有脱钙液(Thermo Scientific,目录号8340)的烧杯。将前肢脱钙8小时，将后肢脱钙9小时。8小时或9小时后，再次在室温用流水冲洗所述肢体30分钟，以除去脱钙液。脱钙后，将肢体贮存在70%乙醇中过夜(O/N)，以用于下一脱水步骤。通过依次浸入以下溶剂对肢体进行脱水：75%乙醇(由100%乙醇制造)2次；85%乙醇2次；95%乙醇2次；和100%乙醇2次；每次在摇晃下于室温进行15分钟。接下来，在摇晃下于室温将肢体浸入100%乙醇和柏木油(Fisher,Catalogue Number:040-1)的1:1混合物15分钟，并且再重复2次，所以一共3次。然后将肢体浸入100%柏木油中并且在40℃温育5小时。5小时温育后，在室温下将肢体浸入柏木油和水杨酸甲酯(ACROS,目录号119-36-8)的1:1混合物中60分钟。然后在室温下将肢体浸入柏木油和水杨酸甲酯的另一1:1混合物中过夜。温育过夜后，在室温下将肢体浸入100%水杨酸甲酯中40分钟，再重复1次(总共2次)。最后，将肢体包埋在石蜡中，这通过在60℃温育7小时而制备。
使用切片机制备小鼠肢体的石蜡切片，并将其切成7μm的厚度。将切片在40℃水浴中温育，并转移至Superfrost Plus显微镜载玻片。在室温将载玻片O/N干燥，并通过在载玻片加热器上通过温育过夜进一步干燥。将载玻片保持在室温直到染色。
对小鼠肢体的固定石蜡切片进行H&E染色。通过浸入二甲苯中3分钟重复2次总共3次，来使切片脱石蜡和复水。然后吸掉过量的二甲苯，将切片浸入100%乙醇中3分钟，总共3次，然后95%乙醇3分钟1次，80%乙醇3分钟1次，和去离子水5分钟1次。所有温育均在室温。对于苏木精染色，将载玻片浸入苏木精中4分钟1次，并用去离子水冲洗。将载玻片浸入自来水5分钟1次，以使染色显影。快速将载玻片浸入乙醇酸(200ml70%ethanol plus150μL concentrated HCL)中8-12次，以使切片脱色。然后将载玻片在自来水中冲洗1分钟2次，然后在去离子水中2分钟1次。在曙红染色之前从载玻片吸去过量的水。
对于曙红染色，将载玻片浸入曙红中20秒1次。然后通过浸入95%乙醇中5分钟3次来使载玻片脱水。在100%乙醇中将载玻片温育5分钟3次。吸去过量的乙醇，并将载玻片在二甲苯中温育15分钟3次。使用基于二甲苯的Permount(EMS,目录号17986-01)通过使用玻璃棒小心不形成气泡将Permount液滴放置在载玻片上，而将盖玻片附着在载玻片上。然后将盖玻片成角度地放在载玻片上，并温柔地滴在载玻片上。使Permount在盖玻片下铺展，覆盖整个切片。在化学通风橱中于室温对载玻片进行干燥过夜。
如图10所示，在不存在hfB3-292S的情况下用胶原抗体鸡尾酒注射的组(第2组)诱导了严重的前爪肿胀。用抗体鸡尾酒注射但用hfB3-292S蛋白处理的小鼠(第3组)显示爪尺寸减少65%(图10)。这些结果证明在该模型中hfB3-292S显著抑制关节炎的效果。在每只小鼠250μg胶原抗体鸡尾酒给药以诱导CAIA时，小鼠的后肢不显示明显的肿胀。观察到hfB3-292S蛋白治疗对小鼠体重没有明显的副作用。所有小鼠的平均体重保持稳定。在该研究最后，在所有三个组中所有小鼠的平均体重为20.4±1.1克。
如图9所示，第1组中的小鼠表现具有正常的关节，关节中没有可检测的炎性细胞浸润，并且软骨和骨表现正常(图9，上部图)。第2组中的小鼠具有严重的关节内炎症、炎性细胞浸润、关节翳形成、软骨损伤和骨质侵蚀(图9，中间图)。用hfB3-292S治疗的第3组中的小鼠具有正常的关节结构、没有炎性细胞浸润、没有软骨或骨质侵蚀或损伤(图9，底部图)。
这些数据证明，在该CAIA小鼠模型中hfB3-292S显著有效地预防关节炎症和损伤，证明了hfB3-292S蛋白对于类风湿性关节炎的治疗用途。
实施例17.hfB3-292S-Fc表达构建体和hfB3-292S-Fc蛋白的生成和表征
通过如实施例3所述对293细胞进行PEI-介导的转染和药物选择而生成表达hfB3-292S-Fc蛋白(SEQ ID NO:22)的稳定细胞系。将经药物选择的细胞以2x106个细胞/mL培养72小时。然后通过使2μL的细胞培养上清液进行非还原SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，而检测hfB3-292S-Fc蛋白的表达。通过山羊抗因子B特异性抗体检测hfB3-292S-Fc蛋白的两条带(数据未显示)。不希望受理论限制，hfB3-292S-Fc蛋白的这两条带可能表示所述蛋白的单体和二聚体。
用蛋白A柱纯化hfB3-292S-Fc。通过如实施例7所述的溶血活性检验来检测纯化hfB3-292S-Fc蛋白的生物活性。如表6所示，hfB3-292S-Fc蛋白以剂量依赖性方式抑制替代补体途径活性。
表6.hfB3-292S-Fc抑制人替代补体途径溶血活性
实施例18.C末端截短的hfB3-292S
制造表达C末端284个氨基酸(丝氨酸蛋白酶结构域)缺失的hfB3-292S的截短形式的基因表达构建体。将该分子命名为hfB3-292SN480，其由hfB3-292S的N末端480个氨基酸(SEQ ID NO:2的1-480位氨基酸或切除分泌肽后的SEQ ID NO:2的26-480位氨基酸)组成。用于hfB3-292SN480的表达构建体的DNA序列示于SEQ IDNO:24，其中核苷酸1064-2509是hfB3-292SN480的编码序列。如之前实施例3中所述将表达构建体转染到293FreeStyle细胞中，并且用G418进行选择。使用全长hfB3-292S作为对照(左泳道)，就hfB3-292SN480的表达对G418抗性非克隆细胞培养基进行蛋白质印迹分析。如图11所示，使用对hfB3-292S具有特异性的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析，检测到来自hfB3-292SN480细胞系的细胞培养基的约55KDa的带(右泳道)，表明即使使hfB3-292S的C末端缺失280个氨基酸，N末端氨基酸仍然以合适的尺寸表达。
如之前所述进行替代补体活性检验，以确定hfB3-292SN480是否能够抑制替代补体活性。如图13所示，来自表达hfB3-292SN480的细胞的细胞培养上清液以剂量依赖性方式抑制替代补体活性。这证明hfB3-292S的片段仍然能够保留抑制补体活性的能力，因此可以与本文对hfB3-292S(SEQ ID NO:2)所述进行相同的利用。
实施例19.单体hfB3-292S/Fc融合蛋白hfB3-292S/Fc-mono
工程化设计“融合”至人IgG4Fc的编码全长hfB3-292S的基因表达构建体。当在诸如之前所述的人细胞等哺乳动物细胞中生产时，hfB3-292S是单体，例如参见实施例6中描述的图3，实施例6显示在非还原条件下hfB3-292S被检测为约MW100KDa的一条带，表明hfB3-292S是单体。使人IgG4Fc的铰链区中的两个半胱氨酸突变，以确保融合蛋白会是单体，并保留抑制补体活性的hfB3-292S生物性质。通过所述两个半胱氨酸各自用丝氨酸取代使所述两个半胱氨酸突变。将hfB3-292S和突变IgG4Fc的该融合蛋白命名为hfB3-292S/Fc-mono。该融合蛋白表达构建体的DNA序列示于SEQ ID NO:26。hfB3292S/Fc mono的相应氨基酸序列示于SEQ ID NO:25，其中1-764位氨基酸是hfB3-292S区，765-1003位氨基酸是人IgG4Fc区，782和785位氨基酸是丝氨酸，该丝氨酸取代在天然人IgG4Fc中可见的半胱氨酸残基。
将hfB3-292S/Fc-mono基因表达构建体(SEQ ID NO:26)转染到人293FreeStyle细胞中。然后对细胞进行G418选择。对来自药物抗性细胞的培养基就所述融合蛋白进行蛋白质印迹分析。如图12所示，通过以该非还原性SDS-PAGE和蛋白质印迹分析纯化山羊抗因子B抗体，而检测到约115KDa的带。两条更高的带最有可能是单体融合蛋白的聚集体。该数据表明，hfB3-292S和人IgG4Fc的单体融合蛋白(hfB3-292S/Fc-mono)在哺乳动物细胞中成功地表达，并且大多数融合蛋白似乎是单体。
为了检查hfB3-292S/Fc-mono是否保留hfB3-292S的阻断替代补体活性的性质，如之前所述进行替代补体活性检验。如图14所示，来自生产hfB3-292S/Fc-mono的细胞的细胞培养上清液以剂量依赖性方式抑制替代补体活性，表明hfB3-292S的补体抑制活性在该单体hfB3-292S/Fc-mono融合蛋白中未丢失。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用将其全部内容并入说明书中，其程度如同每一篇出版物、专利或专利申请被特别或单独地通过引用并入本文中一样。

Claims (20)

1.一种多肽，所述多肽选自由hfB3-292S、hfB3-292SN480和hfB3-292S-Fc组成的组，所述hfB3-292S为SEQ ID NO:2的1-764或26-764位氨基酸，所述hfB3-292SN480为SEQ ID NO:2的1-480或26-480位氨基酸，所述hfB3-292S-Fc为SEQ ID NO:22的1-990或26-990位氨基酸。
2.一种核酸，所述核酸包含编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。
3.一种病毒载体，所述病毒载体包含权利要求2所述的核酸。
4.如权利要求3所述的病毒载体，其中，所述病毒载体选自由逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、肝炎病毒载体、SV40病毒载体、AAV载体、EBV载体和NDV载体组成的组。
5.如权利要求4所述的病毒载体，其中，所述慢病毒载体是BIV、HIV、EIAV、SIV或FIV载体。
6.如权利要求5所述的病毒载体，其中，所述病毒载体包含衰变加速因子。
7.一种药物制品，所述药物制品包含权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸、权利要求3～6中任一项所述的病毒载体或它们的任何组合。
8.如权利要求7所述的药物制品，所述药物制品包含选自由组氨酸、MgCl2、海藻糖、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20、蔗糖、精氨酸和脯氨酸组成的组中的至少一种成分。
9.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸、权利要求3～6中任一项所述的病毒载体、权利要求7～8中任一项所述的药物制品或它们的任何组合在制备用于抑制补体活性的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述药物用于治疗患者中补体介导的疾病。
11.如权利要求10所述的应用，其中，所述补体介导的疾病是眼的疾病。
12.如权利要求11所述的应用，其中，所述药物制品配制成对所述眼施用。
13.如权利要求12所述的应用，其中，所述药物制品配制成通过玻璃体内注射、视网膜下注射、注射至眼的前房内、注射或局部施用至角膜、结膜下注射、眼球囊下注射进行施用，或通过滴眼剂进行施用。
14.如权利要求10～13中任一项所述的应用，其中，所述补体介导的疾病是黄斑变性、年龄相关的黄斑变性(AMD)、地图状萎缩、湿性AMD、心肌梗死、干性AMD、玻璃疣形成、关节炎、中风、缺血再灌注损伤、糖尿病性视网膜病、玻璃体视网膜病变、外伤性器官损伤、角膜炎症、角膜新生血管形成、葡萄膜炎、高眼压症或青光眼。
15.如权利要求10～13中任一项所述的应用，其中，所述补体介导的疾病选自由以下疾病组成的组：动脉粥样硬化、气道高反应、免疫相关疾病、自体免疫相关疾病、狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、关节炎、风湿性疾病、抗磷脂抗体综合征、肠和肾I/R损伤、哮喘、非典型溶血尿毒综合征、II型膜性增生性肾小球肾炎、非增生性肾小球肾炎、胎儿丢失、脑损伤、创伤后器官损伤、心肌梗死后器官损伤、血管炎、遗传性血管性水肿、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、脑血管意外、阿尔茨海默氏病、移植排斥、感染、败血症、败血性休克、干燥综合症、重症肌无力、抗体介导的皮肤病、I型和II型糖尿病、胰岛素抵抗综合征、妊娠糖尿病、甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜和溶血性贫血、神经病变、多发性硬化、心肺旁路损伤、结节性多动脉炎、过敏性紫癜、血清病、古德帕斯彻病、系统性坏死性血管炎、链球菌感染后肾小球肾炎、特发性肺纤维化、膜性肾小球肾炎、急性休克肺综合征、成人型呼吸窘迫综合征和再灌注。
16.一种细胞，所述细胞包含权利要求2所述的核酸，其中所述细胞表达所述多肽。
17.如权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
18.如权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞选自由293细胞、CHO细胞、PerC6细胞、或Vero细胞组成的组。
19.如权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞是原核细胞。
20.如权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞是大肠杆菌细胞。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012250614B2 (en) 2011-05-05 2016-02-11 Pharma Cinq, Llc Complement factor B analogs and their uses
KR20180066242A (ko) * 2015-10-30 2018-06-18 제넨테크, 인크. 인자 d 활성 및 인자 d 억제제의 효력을 측정하는 방법
BR112018012174A2 (pt) * 2015-12-16 2018-12-04 Ra Pharmaceuticals, Inc moduladores da atividade de complemento
CN108476055B (zh) * 2015-12-31 2020-09-04 华为技术有限公司 一种波束赋形方法、接收机、发射机及系统
IL261246B2 (en) * 2016-02-24 2023-03-01 Biomarin Pharm Inc Therapeutic fusion proteins targeting lysosomal enzymes, their formulations and their uses
SG11201811491YA (en) 2016-06-27 2019-01-30 Achillion Pharmaceuticals Inc Quinazoline and indole compounds to treat medical disorders
ES2987333T3 (es) * 2016-10-26 2024-11-14 Univ Leland Stanford Junior Regiones bisagra de inmunoglobulina modificadas para reducir la hemaglutinación
US11274141B2 (en) 2017-05-10 2022-03-15 Wellstat Immunotherapeutics, Llc Enveloped virus resistant to complement inactivation for the treatment of cancer
PL237868B1 (pl) 2018-04-04 2021-06-14 Gdanski Univ Medyczny Mutanty punktowe czynnika B oraz białka C2 do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej przeciwciał w leczeniu chorób nowotworowych
CN111893090B (zh) * 2020-08-17 2023-10-27 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州医科大学天然产物化学重点实验室) 一种动脉粥样硬化防治药物筛选细胞模型及其构建和应用
JP2025530222A (ja) 2022-09-10 2025-09-11 江▲蘇▼豪森▲薬▼▲業▼集▲団▼有限公司 ２－置換ピペリジン誘導体、その製造方法及び医薬的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010066418A1 (de) * 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von flt3-ligand zur verstärkung von immunreaktionen bei rna-immunisierung
WO2010085682A3 (en) * 2009-01-23 2010-09-30 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized fc polypeptides with reduced effector function and methods of use

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CA2408851C (en) 2000-05-16 2011-07-12 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
WO2006031994A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP2500030B2 (en) 2005-11-04 2018-08-08 Genentech, Inc. Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases
WO2008106644A2 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Advanced Vision Therapies, Inc. Treatment of diseases characterized by inflammation
PL2489731T3 (pl) 2007-07-26 2015-01-30 Amgen Inc Zmodyfikowane enzymy acylotransferaza lecytyna-cholesterol
AU2008293487A1 (en) * 2007-08-27 2009-03-05 Novelmed Therapeutics, Inc. Method of inhibiting complement activation with factor Bb specific antibodies
AU2010281385B2 (en) 2009-07-28 2017-06-01 Ligacept, Llc Broad spectrum ErbB ligand binding molecules and methods for preparing and using them
AU2012250614B2 (en) 2011-05-05 2016-02-11 Pharma Cinq, Llc Complement factor B analogs and their uses

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010066418A1 (de) * 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von flt3-ligand zur verstärkung von immunreaktionen bei rna-immunisierung
WO2010085682A3 (en) * 2009-01-23 2010-09-30 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized fc polypeptides with reduced effector function and methods of use

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