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CN103768078B - 三萜衍生物及其抗流感用途 - Google Patents

三萜衍生物及其抗流感用途 Download PDF

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CN103768078B CN201210402726.9A CN201210402726A CN103768078B CN 103768078 B CN103768078 B CN 103768078B CN 201210402726 A CN201210402726 A CN 201210402726A CN 103768078 B CN103768078 B CN 103768078B
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Abstract

本发明涉及下式的三萜衍生物用于生产预防或治疗流感疾病的药物的用途，其中所述取代基定义见说明书。本发明中的三萜衍生物对流感病毒具有明显的抑制作用，并且能够明显抑制流感病毒进入细胞，可以用于预防或治疗流感。

Description

三萜衍生物及其抗流感用途
技术领域
本发明涉及了一种三萜衍生物的新用途，即其在预防或治疗流感尤其是甲型流感中的用途。
背景技术
流感是由流感病毒（influenza virus）引起的一种急性、传染性呼吸系统疾病。根据其内部核蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原性不同，流感病毒可分为A型、B型和C型。A型（又称甲型）流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(W.H.O.2003;Coleman 2007)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(Kilbourne 2006;Taubenberger,Hultin etal.2007)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood,Jain et al.2009;Zimmer and Burke 2009)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据统计，全世界平均每年有30-50万人死于流感(Fiore,Shay et al.2007)。
迄今，FDA批准的抗流感药物主要有两类。第一类，达菲(Oseltamivir)和乐感清(zanamivir)主要抑制流感病毒的神经氨酸酶（NA），阻断流感病毒从感染细胞中释放出来(Palese 2004;De Clercq 2006)。第二类，金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)主要破坏流感病毒M2蛋白离子通道活性，能够抑制流感病毒的脱衣壳过程(Jing,Ma et al.2008)。然而，美国疾病预防控制中心抽样调查发现，2008/2009年的H3N2毒株和2009年大流行H1N1病毒中，100%的毒株对金刚烷类药物都具有耐药性；99.6%的季节性H1N1流感病毒对达菲具有耐药性（http://www.cdc.gov/flu/weekly/ weeklyarchives2008-2009/weekly35.htm）。
三萜类化合物是自然界中广泛存在的一类天然化合物，其结构包括A、B、C、D、E五个环，30个碳原子（Hostettmann,K et al.1995;Waller,G.R.et al.1996）。三萜类化合物由于其多种多样的生物及药理活性而引起越来越广泛的关注，如白桦脂酸及其衍生物已在临床试验中用作抗肿瘤和抗HIV的药物（U.S.Pat.Nos.5,679,828；6,689,767；6,369,109；U.S.App.Pub.No.2004/0204389）；齐墩果酸是保护肝脏防止化学试剂损伤和防治HIV感染的有效成份（Liu,J.et al.2005）；此外，最近欧洲研究人员报道山楂酸能够抑制HIV在体内的传播，抑制率高达80%以上。本专利申请人的尚未公开在先申请201110373224.3公开了一类三萜衍生物及其在预防和治疗病毒性肝炎中的用途，但是没有公开预防或治疗流感的用途。三萜类化合物对流感病毒的抑制作用则未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供三萜类化合物、其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可接受的盐或它们的水合物，它们能够抑制流感病毒尤其是甲型流感病毒的感染。
本发明的另一个目的是提供制备所述三萜及其衍生物或其药学上可接受的盐或它们的水合物的方法。
本发明的另一个目的是提供所述的三萜衍生物或其药学上可接受的盐或它们的水合物用于预防或治疗流感优选甲型流感的用途。
本发明的目的是通过具有下面的实施方案实现的。
本发明一方面提供了下式结构的化合物、其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可接受的盐或它们的水合物以及它们在制备用于预防或治疗需要的患者（包括人和动物）流感尤其是甲型流感的药物中的用途：
其中，虚线部分表示可有可无，即单键或双键；
R1是XR1’，其中X为O或NH，R1’为氢，单糖，寡糖，多糖或者它们的衍生物，或维生素C、唾液酸、氨基糖（一、二、三等糖）、达菲及其前药；所述“单糖，寡糖，多糖的衍生物”是指它们的一个羟基或多个羟基例如2个、3个或4个羟基可以被取代基例如C1-C6烷酰氧基、C1-C6烷氧基、苯甲酰氧基和/或苄氧基及其类似物（例如其苯环可被一个或多个卤素、硝基、氨基和/或C1-C6烷基取代）取代；它们的一个羟基可以被氢、氨基或乙酰氨基取代；
R2和R7各自独立选自H，卤素，羟基，氰基，硝基，巯基，羰基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基，氨基，NR11’R12’,其中R11’和R12’各自独立选自未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基；
R3，R4，R5，R6和R8各自独立选自H，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基；
R9选自H，卤素，羟基，氰基，硝基，巯基，C1-C6硫烷基，羰基，肟基，未取代的C1-C6烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C6烷基；
R10，R11，R12，R13，和R14各自独立选自H，OH，NHR9’（其中R9’是H、未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基）巯基，C1-C6硫烷基，未取代的C1-C3烷基或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基，
条件是：当R7是羟基时，R2和R1’不都是氢。
按照本发明的一个实施方案，其中R10，R11，R12，R13，和R14各自独立选自H，羟基，氨基，未取代的C1-C3烷基“优选甲基”或被羟基、氨基或羧基取代的C1-C3烷基优选甲基。
按照本发明的另一个实施方案，其中R10，R11，R12，R13和R14各自独立选自H、羟基、氨基或甲基；优选R11和R12各自独立选自H或甲基，R10是H，和/或R13和R14各自独立选自H，OH或NH2。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述药物通过口服、直肠、鼻、气雾或颗粒吸入、局部包括含化和舌下、经皮、阴道、膀胱内、伤口内和胃肠外途径给药；优选为喷雾剂，用于口腔或鼻内喷雾给药或者室内或局部环境灭菌和消毒。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述单糖独立选自葡萄糖,甘露糖,果糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，核糖或脱氧核糖，其中所述寡糖是麦芽糖,蔗糖或乳糖，或者其中所述衍生物是“单糖，寡糖，多糖”的1个、2个、3个或4个羟基被C1-C4烷酰氧基、C1-C4烷氧基、苯甲酰氧基和/或苄氧基取代；或者它们的一个羟基被氢、氨基或乙酰氨基取代；优选“单糖，寡糖，多糖”的一个羟基或2个、3个或4个羟基被乙酰氧基、苄氧基、甲氧基和/或苯甲酰氧基取代；或者“单糖，寡糖，多糖”的一个羟基被氢、氨基或乙酰氨基取代。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述糖是氨基糖，例如新霉胺、新霉素、卡纳霉素或庆大霉素。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述X为O或NH，所述糖是单糖或二糖，或者单糖或二糖的羟基被乙酰氧基取代的乙酰化衍生物。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述R2独立选自H，OH，羰基，SH或NH2，优选H、OH或羰基。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述R3,R4,R5,R6和R8各自独立选自甲基。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述R7独立选自H，OH,羰基，NH2或SH，优选OH或羰基。
按照本发明的另一个实施方案，其中所述化合物为
刺囊酸，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-葡萄糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-木糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-半乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(七-O-乙酰基-β-D-麦芽糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-甘露糖苷)或
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)。
当上述化合物含有手性原子时，均包括R和S两种构型以及它们的混合物。
上述衍生物中的糖残基部分也包括所述糖的差向异构体。
本发明另一方面也提供了上述三萜衍生物，但是不包括现有技术已知的化合物，例如刺囊酸。
本发明另一方面也提供了制备所述三萜衍生物的方法，如下文本发明的化合物制备方法部分所述。
同时，本发明提供了本发明所述三萜衍生物预防或治疗流感尤其是甲型流感的用途。
此外，本发明提供了一种抑制流感病毒感染，尤其是流感病毒进入宿主细胞的抑制剂，其中所述抑制剂含有所述三萜衍生物。
此外，本发明还提供了一种预防或治疗流感的药物，其含有所述的三萜衍生物。
此外，本发明还提供了预防或治疗流感尤其是甲型流感的方法，该方法包括向人或其它哺乳动物使用所述的三萜衍生物。
附图说明
图1：噬斑抑制实验验证Q9对流感病毒的抑制作用图。纵坐标显示形成噬斑的数量；横坐标显示的是化合物的浓度。
图2.加药时间点实验检测Q9作用于病毒复制的哪个阶段。（A）加药时间点实验的设计模式图。用MOI=1.5的WSN病毒感染MDCK细胞，然后在感染后0-10、0–2、2–5、5–8或8–10h加入50μM的Q9。感染后10h收获细胞裂解液，用Western检测病毒的复制情况。（B）加药时间点Western检测结果。GAPDH作为细胞内参，NP作为检测流感病毒的标志物。
图3.血凝抑制验证Q9是否影响流感病毒与细胞受体之间的结合。流感病毒（WSN毒株）的血凝素蛋白（HA）可以凝集红细胞，即无红点。HA可以介导流感病毒进入细胞。Anti-HA：HA的抗体，作为本实验的阳性对照。DMSO为阴性对照。病毒用量（25稀释），每孔加入50ul1%鸡红细胞。
图4.假病毒实验检测Q9对H1N1和H5N1流感病毒假病毒的抑制效果。假病毒是由HIV的核心蛋白和流感病毒的囊膜蛋白HA/NA组成。流感病毒的两种亚型H1N1和H5N1假病毒都被Q9抑制；Q9浓度为50μM。DMSO作为阴性对照，抑制率设为零。
图5.在50μM浓度下，各化合物对MDCK细胞的毒性检测。以DMSO作为阴性对照。犬肾上皮细胞（MDCK）传代24h后，将药物加入到DMEM中，充分混匀后加入到MDCK细胞中，48h后用Celltiter-Glo检测试剂盒检测细胞活力。
图6.在50μM浓度下，各化合物抗流感病毒活性。以DMSO作为阴性对照。犬肾上皮细胞（MDCK）传代24h后，将WSN病毒（MOI=1）与待检化合物加入到DMEM中，充分混匀后加入到MDCK细胞中，48h后用Celltiter-Glo检测试剂盒检测细胞活力。感染率（Infectivity）=100%-化合物对细胞病变的保护率。化合物对细胞病变的保护率=100%×(1-(Testcompound–Median Virus 1)/(Median Cells-Median Virus2)).其中Test compound表示只加待检化合物不加病毒组的细胞活力；Median Virus1表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力；Median Cells表示只加入1%DMSO组的细胞活力；Median Virus2表示加入1%DMSO和病毒组的细胞活力。
图7.在50μM浓度下，各化合物对MDCK细胞的毒性检测。方法同图5。
图8.在50μM浓度下，各化合物抗流感病毒活性。方法同图6。
具体实施方式
定义
术语“C1-C4烷基”是指含有一到四个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
术语“C1-C6烷基”是指含有一到六个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基等。
术语“单糖”是指不能水解成更简单的多羟基醛或多羟基酮的糖类。单糖的通式是CnH2nOn。根据分子中所含的碳原子数，单糖分为丙糖、丁糖、戊糖和己糖等。如果结构是多羟基醛的单糖叫醛糖（如核糖是戊醛糖；葡萄糖、半乳糖是己醛糖），如果结构是多羟基酮的单糖叫酮糖（如果糖、山梨糖是己酮糖）。单糖中最重要的是葡萄糖和果糖。单糖主要以环状半缩糖结构（氧环式结构）的形式存在，例如核糖、阿拉伯糖、木糖、核酮糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等。
术语“寡糖”是指由二个以上九个以下相同或不同的单糖分子缩合、失水而组成的糖，例如麦芽糖、蔗糖或乳糖。
术语“多糖”是指由十个以上相同或不同的单糖分子缩合、失水而组成的糖，例如淀粉、环糊精等。
术语“单糖，寡糖，多糖的衍生物”是指它们的一个羟基或多个羟基例如2个、3个或4个羟基可以被取代基例如C1-C6烷酰氧基、C1-C6烷氧基、苯甲酰氧基和/或苄氧基及其类似物（例如其苯环可被一个或多个卤素、硝基、氨基和/或C1-C6烷基取代）取代；它们的一个羟基可以被氢、氨基或乙酰氨基取代。
术语“氨基糖”是指糖的一个或多个羟基为氨基所取代的单糖，寡糖或多糖，例如新霉胺、链霉素、卡那霉素、新霉素或庆大霉素等。
术语“三萜”是指有数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质，大部分为30个碳原子，少部分含27个碳原子的萜类化合物，例如齐顿果酸、刺囊酸等。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“C1-C6硫烷基”是指其中一个氢原子被硫原子取代的C1-C6烷基。
术语“C1-C6烷氧基”是指其中C1-C6烷基与氧原子连接后生成的基团，例如甲氧基、乙氧基、己氧基。
术语“C1-C6烷酰氧基”是指其中C1-C6烷基与酰氧基连接后生成的基团，例如乙酰氧基。
本发明化合物的制备方法
本发明另一方面提供了一种制备上述化合物的方法。
本发明中的所涉及的三萜化合物及衍生物可以通过天然植物提取，和/或化学合成或半合成或结构化学修饰完成。在发明的一个实施方案中，某些三萜化合物可以通过从植物中提取或者从市场购买获得，其它一些三萜化合物可以通过上述的三萜化合物经过结构改造或化学合成或半合成获得。
提取方法包括将含有丰富三萜的植物浸泡于极性溶剂中回流，过滤去除不溶物然后浓缩，再经过酸处理，最后通过硅胶柱层析（例如二氯甲烷/甲醇梯度洗脱）分离出三萜苷元。本领域技术人员采用常规方法提取了一系列天然存在的三萜皂苷元，例如：齐墩果酸、白桦脂酸、刺囊酸（EA）等，它们可以从市场上购得，并可用于合成本发明衍生物的原料。
某些衍生物的半合成方法包括将三萜苷元的羟基通过保护基保护，然后活化其羧基（例如生成酰氯、酯或酐），与糖或氨基糖偶合，最后脱保护生成三萜皂苷。
本领域技术人员采用本领域常规技术可以制备三萜化合物的药学上可接受的盐或其的水合物。
本领域技术人员可以参考中国专利申请号201110373224.3说明书中的方法制备本发明的化合物，上述申请的全部内容这里通过引用全部并入本文。例如，可以采用下面所述的一般合成方法和实施例以及类似方法制备本发明的化合物。
一般合成方法
可以采用不同的反应来制备本发明各种三萜化合物。
EA与糖的连接
下面以α-D-吡喃葡萄糖为例，合成路线如下：
刺囊酸-葡萄糖缀合物的合成路线
采用类似的方法可得到一系列刺囊酸-糖缀合物和齐墩果酸-糖缀合物.以下为具体反应操作步骤：
（1）糖上羟基的全乙酰化保护反应
采用经典的吡啶/乙酸酐（1.2eq）=2/1的反应比例，加入2g单糖或二糖原料和适量催化剂DMAP，室温反应，12h后薄层检测，展开剂比例石油醚：乙酸乙酯=2:1。
后处理：旋干吡啶，二氯甲烷溶解后1N HCl溶液洗涤，MgSO4干燥后蒸除溶剂，收率95-98%，待用。
粗产物可直接用于下步反应，无需纯化，但要保证薄层上产物点单一，若产物点不单一，则需经柱层析纯化。
（2）溴代糖供体的制备
取1mmol全乙酰化保护糖，二氯甲烷溶解，冰浴条件下滴加2eq的HBr-HOAc溶液，1h后温度升至室温，反应13h。
后处理：适量水洗涤后，饱和NaHCO3溶液洗涤，无需干燥直接进行下一步反应。
（3）刺囊酸糖基化反应
此步反应采用近年来兴起的相转移催化反应，取上一步反应得到的未干燥分离的糖供体，加入20mL二氯甲烷溶解后，依次加入188.8mg刺囊酸（EA），138mg K2CO3，51.52mg四正丁基溴化铵，2mL水，50°C条件下回流反应，并用N2保护。12h后停止反应。
后处理：反应液10mL水洗一次，MgSO4干燥后柱分离。
此步反应条件温和，后处理简便，收率较高。在这步反应中尽管糖供体不同，该反应均会产生一个极性小于EA的副产物，其可通过常规分离方法除去。
（4）中间产物高选择性的脱乙酰化反应
将反应物溶于适量MeOH中，加入适量MeONa，室温下反应，TLC检测反应的进程，一般的该反应在一个小时完成。
后处理：加入阳离子交换树脂，调pH至中性，将树脂过滤掉，滤液旋干溶剂后柱分离。
12位酮/羟基的衍生物的合成：
刺囊酸甲酯328mg溶解在10ml的二氯甲烷中，加入m-CPBA(间氯过氧苯甲酸)92mg，常温反应，过夜，然后进行柱分离，得到白色固体260mg，收率77%。
12-羟基-刺囊酸的合成：
上述化合物150mg溶解在5ml的甲醇中，冰浴，加入硼氢化钠36mg，反应过夜，处理方式：蒸干大部分溶剂，加水萃取，加入1M的HCL 3ml，用乙酸乙酯萃取三次，收集，蒸干，用石油醚/乙酸乙酯=2：1进行柱分离，得到白色固体122mg，收率75%。
3位羟基的修饰：
3,16-二酮的合成
在25mL圆底瓶中加入120mg EA甲酯，200mg无水碳酸氢钠及410mgDess-martin氧化剂，以二氯甲烷为溶剂常温反应48小时，反应体系为乳白色悬浊液。过滤，减压去除溶剂，得到的固体通过色谱柱分离纯化；展开剂：石油醚：乙酸乙酯=3：1，得到白色固体EA甲酯二酮62mg；收率52%。
3位氨基的合成
刺囊酸甲酯通过一系列合成3-酮-刺囊酸甲酯，取240mg溶解在3ml的二氯甲烷中，而后加入甲醇4ml，油浴60摄氏度加入乙酸胺150mg，反应1h，冷却后加入NaBH3CN(氰基硼氢化钠)20mg，反应24h，后处理，蒸干大部分溶剂，加入10ml的水和10ml的乙酸乙酯萃取，三次，收集酯层，柱分离。先用石油醚/乙酸乙酯=1：1冲洗柱子，而后用二氯甲烷/甲醇=8.5：1洗脱，得到白色固体168mg，收率70%。
本领域技术人员可以制备其他三萜化合物衍生物。
本发明化合物的活性
本发明的化合物具有抗流感病毒活性，能够用于预防或治疗人或动物流感，尤其是甲型流感。本发明化合物可阻断流感病毒进入细胞，但不仅局限于此机制。
本发明化合物可以以纯净化合物或化合物的混合物的形式给药，或者优选在药物赋形剂、稀释剂或载体中给药。
可以通过任何适当的途径来施用活性剂进行治疗。适当的施用途径可以包括口服、直肠、鼻、气雾或颗粒吸入剂、局部（包括含化和舌下）、经皮、阴道、膀胱内、伤口内和胃肠外（包括皮下、肌内、静脉内、胸骨内、膜内、硬膜外和真皮内）。本发明化合物特别适合制成喷雾剂，用于口腔或鼻内喷雾给药或者室内或局部环境灭菌和消毒。
本发明也涉及组合物，包含本发明化合物，与一种或多种药学可接受的添加剂和任选的其他药物一起。药学可接受的添加剂可以是载体、稀释剂、佐剂和（或）赋形剂的形式，可以包括所有常规的溶剂、分散剂、填充剂、固体载体、包衣剂、抗真菌或抗菌剂、皮渗透剂、表面活性剂、等张剂和吸收剂，和缓释或控释基质。活性剂可以以适合同时、分开或连续施用活性剂的组分的试剂盒的形式。在与组合物的其他成分相容和患者生理耐受的意义上，每种载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂必须是“药学可接受的”。该组合物可以方便地以单元剂型的形式存在，可以通过制药领域公知的方法来制备。这些方法包括将活性成分与载体相混合的步骤，其中载体是由一种或多种助剂组成的。一般地，制备该组合物，包括将活性成分与液体载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂或精细分离的固体载体或两者均匀和直接地混合，然后如果必要使产物成型。
适合口服的本发明的组合物可以是以每个都包含预定量的活性成分的分离单元例如胶囊、囊剂或片剂的形式存在；作为粉末或颗粒；作为水相或非水液体中的溶液或混悬液；或者作为水包油性液体乳剂或油包水性乳剂。活性成分也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂的形式存在。
可以通过任选与一种或多种助剂压片或成模来制备片剂。可以通过在适当的机器中压制自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分来制备压制片，任选与粘合剂(例如惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在适当的机器中将用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物成型来制备模印片。任选可以将片剂包衣或刻痕，可以通过配制来缓释或控释活性成分，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素来产生所需的释放性质。片剂任选可以具有肠溶衣，以在肠部分而不是胃中释放。
适合胃肠外施用的组合物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与所预期的患者的血液等张的溶质；和水性和非水性无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和管中，可以贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前加入无菌液体载体例如注射用水。可以由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备无准备的注射溶液和混悬液。
适合局部施用于皮肤，即经皮施用的组合物可以包含溶解或悬浮在任何适当的载体或基质中的活性剂，可以是洗剂、凝胶、乳膏、糊剂、软膏等等的形式。适当的载体可以包括液状石蜡、丙二醇、蜡、聚氧乙烯和长链醇。也可以使用经皮装置例如贴剂，可以包含适当材料例如硝酸/乙酸纤维素、丙烯和聚碳酸酯制成的微孔膜。贴剂也可以包含适当的皮肤粘附性和基底材料。
本发明的活性化合物也可以以植入物的形式存在，其可以包含药物的聚合性装置，其中聚合物是生物相容性的和无毒性的。适当的聚合物可以包括水凝胶、硅酮、聚乙烯和生物可降解的聚合物。
本发明的化合物可以以持续（即控释）或缓释的形式施用。持续释放制剂是其中施用后活性成分在患者体内缓慢释放并在最小的时间里维持所需的药物浓度的制剂。持续释放制剂的制备是本领域技术人员公知的。剂型可以包括口服形式、植入物和经皮形式。对于缓释施用，活性成分可以作为例如，缓释颗粒悬浮或在脂质体内。
依据选择的化合物的特定活性、患者状况以及要处理的病症选择本发明化合物适合的剂量范围。本领域技术人员可以根据其普通知识和在本领域的经验适合的剂量范围。例如对于流感，人类适合的剂量范围可以为每人每天1-500mg，例如10-300mg，通常为30-150mg。
本发明化合物抑制流感病毒进入细胞的生物活性评价方法
1.细胞病变（CPE）抑制试验。流感病毒感染细胞后会导致细胞病变，使得细胞活力降低。如果药物能够抑制流感病毒复制，则会降低细胞病变数量，提高细胞活力。具体来说：
1）将犬肾上皮细胞（MDCK）以1:3的比例传代到白色的96孔板中，在37°C细胞培养箱中用含10%FBS的DMEM培养基培养24h。
2）将流感病毒【A/WSN/33(H1N1)，感染复数（MOI）=1】与一定浓度的待检化合物加入到100μl含有2μg/mL TPCK处理的胰酶、1%FBS的DMEM中，充分混匀。化合物的阴性对照为1%DMSO（稀释化合物所用的溶剂）。同时设立一组只加各化合物不加病毒实验组，用来检测化合物对细胞活力的影响。
3）将96孔板中的MDCK细胞的培养基吸出，将混合有病毒和化合物的培养基加入到MDCK细胞中，37°C细胞培养箱中培养48h。每个样品三个复孔。
4）用CellTiter-Glo荧光细胞活性检测试剂盒（Cat.G7571,Promega）检测细胞活力。首先将细胞和CellTiter-Glo检测试剂放于室温环境，待其温度平衡至室温，将100μl/孔的CellTiter-Glo检测试剂加入到细胞的培养上清中，震动2min后，避光静置10min。用仪器Tecan Infinite M2000PROTM检测细胞活力。5）EC50的计算方法：首先对化合物进行浓度系列稀释，然后利用上述方法测定出细胞活力。化合物对细胞病变的保护率=100×(1-(Test compound–Median Virus1)/(Median Cells-Median Virus2)).其中Test compound表示只加待检化合物不加病毒组的细胞活力；Median Virus1表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力；Median Cells表示只加入1%DMSO组的细胞活力；Median Virus2表示加入1%DMSO和病毒组的细胞活力。将化合物浓度和相应的保护率输入到软件Prism，即可计算EC50。此方法已被广泛应用于抗病毒药物筛选领域(Noah,Severson et al.2007)。
6）CC50的计算方法:CellTiter-Glo也可以用来检测化合物对细胞的毒性。首先对化合物进行浓度系列稀释，然后将其加入到细胞中，方法同2）--4），但不加入病毒。培养48h后，测定细胞活力。然后将对照组细胞活力（1%DMSO）定义为100%，将其他各化合物组细胞活力标准化，除以对照组1%DMSO的细胞活力，再乘以100%。将化合物的浓度和相应的标准化的细胞活力输入到软件Prism，即可计算出CC50。
2.噬斑抑制实验。利用噬斑抑制实验进一步印证化合物的抗病毒效果。具体方法如下：
1）将MDCK细胞传代到12孔板中，在37°C细胞培养箱中用含10%FBS的DMEM培养基培养24h。使细胞密度达到0.4×106细胞/孔。用PBS清洗细胞一次。
2）将A/WSN/33（H1N1）病毒（100PFU/孔）与系列稀释的化合物混合，稀释液为2μg/mL TPCK处理胰酶的DMEM。将混合液加入MDCK细胞中，置于37°C细胞培养箱中吸附1h。
3）将病毒液吸出，用PBS清洗细胞三次，除去未吸附的病毒。
4）用1mL含有1.5%低熔点琼脂糖、待检化合物、2μg/mL TPCK处理胰酶的无酚红DMEM覆盖细胞。注意温度不能过高，以免将细胞烫死。
5）待4°C琼脂糖凝固后（10-15min）倒置放于在37°C培养箱培养。3-4天后对噬斑进行计数，计算病毒滴度。如果化合物对病毒有抑制作用，则噬斑数量会减少。
3.加药时间点实验。用以分析化合物作用于病毒感染细胞的哪一阶段。具体步骤：
1）将MDCK细胞传代到六孔板中，在37°C细胞培养箱中用含10%FBS的DMEM培养基培养24h。
2）将A/WSN/33(H1N1)病毒（MOI=1）稀释到不含血清的DMEM中，感染MDCK细胞。
3）流感病毒从吸附到子代病毒粒子释放，其复制周期约为6-8h。故在以下时间段将药物加入到细胞培养基中：0–10、0–2、2–5、5–8或8–10h。
4）感染10h后，用冰预冷的PBS清洗细胞一次，用200μl/孔的PIPA裂解液裂解细胞。用细胞刮将细胞刮下，吸入1.5mL EP管中，置于冰上15min。以12,000rpm4°C离心10min，将上清液转移到另一个1.5mL EP管中。
5）吸取30μl样品与等体积的2×蛋白上样缓冲液混合，100°C煮样10min。
6）将煮好的样品各20μl加入到12%的蛋白质凝胶加样孔中，进行SDS-PAGE电泳。
7）用免疫印迹法（Western blotting）检测流感病毒的NP蛋白的表达水平（以此来检测病毒在细胞内的复制情况）；同时以细胞蛋白GAPDH作为细胞内参（也可用于验证药物对细胞的毒性）。
4.假病毒实验。流感病毒假病毒实验用来验证化合物是否作用于病毒进入细胞阶段，以及化合物是否作用于其它高致病流感毒株，具有高度的安全性和可操作性。流感假病毒是一种重组的病毒颗粒，它的核心是来源于反转录病毒的基因组（除去包装基因的HIV基因组），而外层是流感病毒的囊膜蛋白血凝素蛋白（HA）和神经氨酸酶（NA）。这种重组病毒能够像流感病毒一样感染细胞，但只能复制一次，不能够进行子代病毒包装。
假病毒的制备及化合物抑制假病毒感染实验的具体方法：
1）将流感病毒的HA和NA基因克隆到真核表达载体pcDNA4/TO中，进行测序鉴定。
2）利用质粒中提试剂盒（Promega）对质粒进行提取，利用分光光度计测定质粒浓度和纯度，用于下一步转染。
3）将293T细胞传代到10cm细胞培养皿中，37°C细胞培养箱中培养24h。在质粒转染前1-2h对细胞进行换液。
4）利用转染试剂lipofectamine2000（Invitrogen）将pcDNA4/TO-HA、pcDNA4/TO-NA与pNL4-3.Luc.E-R-载体各6μg共转染到293T细胞中，转染后4-6h换液。转染具体步骤见lipofectamine2000（Invitrogen）产品说明书。将转染后的细胞在37°C细胞培养箱中培养72h。
5）流感假病毒粒子会被分泌到培养上清中。用0.45μM的滤器过滤含有假病毒的细胞培养上清，以除去培养基中的细胞和细胞碎片。
6）将假病毒储存在-80°C低温冰箱中备用。VSV假病毒制备方法同上，唯一的区别是用表达VSVG的质粒取代流感病毒的pcDNA4/TO-HA和pcDNA4/TO-NA。
7）将MDCK细胞传代到黑色透明底的96孔板中，在37°C细胞培养箱中培养24h。
8）将待检化合物与稀释过的假病毒进行充分混合，稀释液为含有2μg/mL TPCK处理的胰酶、1%FBS的DMEM。
9）吸去96孔板中的细胞培养基，然后将100μl/孔的混合液加入到细胞中，在37°C细胞培养箱中培养48h。每个化合物三个复孔，每种化合物都包含一组VSV假病毒实验组，用来检测化合物对流感假病毒作用的特异性。
10）利用Bright-glo萤光素酶检测系统（Promega）检测感染细胞中的萤光素酶（luciferase）的活性。首先将细胞培养板和检测试剂置于室温环境，将其温度平衡到室温。然后将100μl/孔检测试剂加入到96孔板中，震荡10s，避光静置2min。然后利用分光光度计测定luciferase活性。
所制备的假病毒基因组中缺失病毒复制所需的必要基因，所以假病毒丧失了复制能力，安全性高。除了A/WSN/33(H1N1)毒株外，我们还将选用的流感病毒毒株有A/VietNam/1203/2004(H5N1)，因为此毒株为高致病性流感病毒毒株。这些毒株的HA和NA基因均可从北京义翘神州生物技术有限公司购买到，无需操作活病毒，所以实验是安全的。假病毒粒子中含有Luciferase报告基因，一旦进入细胞便可表达Luciferase基因，裂解细胞后加入酶的底物，酶标仪读数。
5.血凝抑制试验。此方法用来检测药物是否影响病毒与细胞受体之间的结合。具体方法：
1）制备1%（v/v）的鸡红细胞悬液。选1-2只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中混匀，置4℃冰箱保存。以800-1000rpm离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4-5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液。放入4℃冰箱中可保存2-3天。使用时用1mL吸管吸取0.1mL红细胞，然后加入9.9mL的生理盐水，此即1%红细胞悬液。
2）确定病毒的血凝效价。将WSN流感病毒以2倍梯度做倍比稀释，稀释液为PBS。
3）将病毒液与1%红细胞悬液等体积（各50μl）混合加入到V底的96孔板中。置于微量振荡器上振荡1min，室温静置孵育30min。
4）将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，表明红细胞被病毒所凝集。在确定流感病毒的血凝效价后，确定合适的病毒使用量。
5）将药物、DMSO（阴性对照）或抗HA的特异性单克隆抗体（阳性对照）与病毒液混合后加入到细胞混悬液中。观察化合物对红细胞凝集有没有抑制效果。
本发明是用以下给出的实施例详细描述，所述实施例是用作举例说明的，因此，不应当解释为对本发明保护范围的限制。
齐墩果酸和刺囊酸的提取与分离
齐墩果酸和刺囊酸是植物中广泛存在的三萜类天然物，它们从植物中的分离方法如下，将含有丰富齐墩果酸和刺囊酸的植物如皂荚等浸泡于乙醇中回流，提取极性大的部分，再经过浓盐酸处理去除所含的糖，最后通过硅胶柱层析和二氯甲烷/甲醇梯度洗脱就分离出大量的纯品齐墩果酸和刺囊酸（《天然有机化合物提取与分离》1994年，科技出版社）。齐墩果酸和刺囊酸也可以通过市场上购买获得。
实施例13β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷)和3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-葡萄糖苷)的合成
取D-葡萄糖3g于50mL反应瓶中，加入吡啶24mL溶解，依次加入醋酸酐12mL，催化量DMAP，室温反应过夜后停止反应。TLC监测，展开剂PE：AcOEt=1：1。旋干溶剂后展开剂（PE：AcOEt=1：1）20mL溶解，闪式柱分离，待用。
取上述产物390mg于25mL反应瓶中，3mL DCM溶解，冰浴下缓慢滴加HBr-AcOH溶液0.21mL，反应1h后，置于室温反应，TLC监测，展开剂PE：AcOEt=2：1。反应12h后停止反应。加入20mL DCM稀释后，依次用20mL蒸馏水、20mL饱和NaHCO3溶液洗涤，合并有机层，MgSO4干燥后，柱分离纯化，展开条件PE：EA=1:1，得到黄色粘稠状物质194mg。
向装有20mL溴代糖（194mg,0.47mmol）DCM溶液的50mL反应瓶中加入EA 189mg（0.4mmol），K2CO3 138mg，四正丁基溴化铵52mg，水2mL，50°C条件下回流反应，并用N2保护。12h后停止反应。TLC监测，展开剂PE：AcOEt=1：1。柱分离纯化，洗脱条件PE：AcOEt=2:1，得到252mg白色固体化合物3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷)，收率80%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.54(d,1H,J=8.2Hz,Glc-1-H),5.39(t,1H,J=3.2Hz,H12),5.08-5.24(m,3H),4.39(brt,1H,H16),4.25(dd,1H,J=4.4,12.4Hz),4.02(dd,1H,J=2.1,12.4Hz),3.74-3.78(m,1H),3.19(dd,1H,J=4.2,10.6Hz,H3),2.97(dd,1H,J=4.0,14.3Hz,H18),2.05,2.00,2.00,1.99(s,each 3H,CH3CO),1.32,0.96,0.92,0.89,0.88,0.75,0.70(s,each 3H,H27,H23,H30,H25,H29,H26,H24).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ174.72(C=O,C28),170.53,170.03,169.38,169.07,141.88(C13),123.22(C12),91.56(Glc-1-C),78.84,74.22,72.68,72.41,69.91,67.90,61.44,55.19,48.79,46.61,46.03,41.31,40.40,39.49,38.68,38.48,36.93,35.46,35.14,33.02,32.62,30.23,30.17,28.01,27.12,26.76,24.45,23.24,20.62(CH3CO),20.50(3C,3×CH3CO),18.22,17.01,15.55,15.43.ESI-HRMS(m/z)calcd for C44H66O13Na(M+Na+):825.4396.Found 825.4387;C44H70O13N(M+NH4 +):820.4842.Found 820.48400.即为如下所示的Q1化合物。
取50mg上述化合物，用5mL甲醇溶解于25mL反应瓶中，加入适量MeONa,室温搅拌反应1h，TLC监测，展开剂DCM：MeOH=7:1。反应结束后，加入阳离子交换树脂，调pH至中性。柱分离纯化，展开剂DCM：MeOH=5:1，得到白色固体12.4mg 3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-葡萄糖苷)，收率31%.1H NMR(400MHz,MeOD):δ5.35(d,1H,J=8.1Hz,Glc-1-H),5.32(t,1H,J=3.4Hz,H12),4.53(br t,1H,H16),3.82(d,1H,J=11.1Hz),3.67(dd,1H,J=4.3,12.0Hz),3.27-3.34(m,4H),3.15(dd,1H,J=5.0,11.4Hz),2.99(dd,1H,J=4.0,14.2Hz),2.29(t,1H,J=13.3Hz),1.37,0.97,0.96,0.89,0.79,0.77(s,7×CH3).13CNMR(100MHz,MeOD):δ177.21(C=O,C28),144.63(C13),123.63(C12),95.72(Glc-1-C),79.72,78.73,78.33,74.93,74.01,71.08,62.42,56.88,50.03,48.20,47.78,42.65,42.12,40.82,39.97,39.84,38.16,36.44,36.27,31.70,31.28,28.74,27.27,25.01,24.49,19.50,17.78,16.33,16.10.ESI-HRMS(m/z)calcd for C36H58O9Na(M+Na+):657.3973.
实施例2 3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)和3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-半乳糖苷)的合成
取D-半乳糖2g于50mL反应瓶中，加入16mL吡啶溶解，依次加入醋酸酐8mL，催化量DMAP，室温反应10h后停止反应。TLC监测反应完全，展开剂PE：AcOEt=1：1。旋干溶剂后DCM20mL溶解，用20mL水洗，有机层MgSO4干燥。旋蒸除去溶剂，得全乙酰半乳糖固体产物。
取上述产物390mg于25mL反应瓶中，3mL DCM溶解，冰浴下缓慢滴加HBr-AcOH溶液0.35mL，反应1h后，置于室温反应，反应12h后停止反应。TLC监测，展开剂PE：AcOEt=2：1。加入20mL DCM稀释后，依次用20mL蒸馏水、20mL饱和NaHCO3溶液洗涤，合并有机层，旋干溶剂至20mL。
向装有20mL溴代糖(上步反应未分离的混合物)DCM溶液的50mL反应瓶中加入EA188.8mg（0.4mmol），138mg K2CO3，51.52mg四正丁基溴化铵，2mL水，50°C条件下回流反应，并用N2保护。12h后停止反应。TLC监测、展开剂PE：AcOEt=1：1。柱分离纯化，展开条件PE：AcOEt=1:1，得到98.5mg白色固体产物3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，收率31%。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.54(d,1H,J=8.4Hz,Gal-1-H),5.40-5.44(m,2H),5.31(t,1H,J=10.3Hz),5.07(dd,1H,J=3.4,10.4Hz),4.39(br t,1H,H16),4.10-4.15(m,2H),4.00(t,1H,J=6.7Hz),3.22(dd,1H,J=4.1,10.4Hz,H3),3.00(d,1H,J=10.6Hz,H18),2.17,2.04,2.02,1.99(s,each 3H,CH3CO),1.34,0.99,0.95,0.92,0.91,0.78,0.75(s,each 3H,CH3,H27,H23,H30,H25,H29,H26,H24).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ174.64(C=O,C28),170.22,170.07,169.84,169.25,141.87(C13),123.13(C12),92.03(Gal-1-C),78.82,74.06,71.39,70.70,67.56,66.69,60.65,55.22,48.97,46.64,46.07,41.36,40.48,39.53,38.69,38.49,36.95,35.50,35.06,33.04,32.58,30.19,29.82,28.01,27.13,26.76,24.65,23.26,20.64,20.55,20.44,18.22,17.07,15.55,15.47.ESI-HRMS(m/z)calcd forC44H66O13Na(M+Na+):825.4396.Found 825.4387;C44H70O13N(M+NH4 +):820.4842.Found820.4839.
取50mg上述化合物,用5mL甲醇溶解于25mL反应瓶中，加入适量MeONa,室温反应1h，TLC监测，展开剂DCM：MeOH=7:1，加入阳离子交换树脂，调pH至中性，过滤，滤液旋干。柱分离纯化，展开剂DCM：MeOH=5:1，得到白色固体产物35.6mg 3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-半乳糖苷)，收率90%。
1H NMR(400MHz,MeOD):δ5.31-5.33(m,2H,Gal-1-H,H12),4.55(brt,1H,H16),3.88(d,1H,J=3.0Hz),3.69-3.71(m,2H),3.58-3.65(m,2H),3.50(dd,1H,J=3.2,9.7Hz),3.15(dd,1H,J=4.9,11.4Hz,H3),3.00(dd,1H,J=3.8,14.2Hz,H18),2.29(t,1H,J=13.3Hz),1.37,0.97,0.96,0.89,0.78,0.77(s,7×CH3).13C NMR(100MHz,MeOD):δ177.29(C=O,C28),144.64(C13),123.63(C12),96.22(Gal-1-C),79.72,77.38,75.17,74.94,71.30,70.00,62.02,56.88,49.98,42.63,42.08,40.81,39.96,39.83,38.16,36.44,36.26,34.23,33.36,31.80,31.29,28.74,27.90,27.28,24.99,24.48,19.50,17.79,16.33,16.09.ESI-HRMS(m/z)calcd for C36H62O9N(M+NH4 +):652.4419.Found 652.4415.
按照类似于上述实施例的方法可以合成其他衍生物，例如下列的化合物：
Q1：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷)
Q2：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-葡萄糖苷)
Q3：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-木糖苷)
Q4：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-木糖苷)
Q5：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-阿拉伯糖苷)
Q6：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-阿拉伯糖苷)
Q8：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)
Q9：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-半乳糖苷)
Q10：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(七-O-乙酰基-β-D-乳糖苷)
Q11：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-乳糖苷)
Q12：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(七-O-乙酰基-β-D-麦芽糖苷)
Q13：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-麦芽糖苷)
Q14：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-纤维二糖苷)
实施例3：3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)和3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)的合成
1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-β-D-半乳糖的制备：
取D-半乳糖3g于50mL反应瓶中，加入吡啶24mL溶解，依次加入醋酸酐12mL，催化量DMAP，室温反应过夜后停止反应。TLC监测反应完全。旋蒸除去溶剂，50mL AcOEt混悬，依次用蒸馏水50mL×3及饱和食盐水50mL洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥后硅胶柱分离得产物。
1α-溴-2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖的制备
取上述产物2.0g于25mL反应瓶中，15mL DCM溶解，冰浴下缓慢滴加HBr-AcOH溶液1.2mL，反应1h后，置于室温反应过夜，TLC监测至反应完全，展开剂PE：AcOEt=2：1。加入20mLDCM稀释后，依次用40mL蒸馏水、40mL×3饱和NaHCO3溶液洗涤，有机相用Na2SO4干燥后，旋蒸除去溶剂，不做进一步分离纯化，直接进行下步反应。
1β-叠氮基-2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖的制备
将上述产物用10mL DMF溶解，搅拌下加入NaN3，室温反应过夜，TLC监测至反应完全，展开剂PE:AcOEt=2:1。旋蒸除去溶剂，50mL AcOEt混悬，依次用蒸馏水50mL×3及饱和食盐水50mL洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥后硅胶柱分离得白色固体产物约0.97g，两步总产率50%。
取上述产物100mg，5mL THF溶解，Pd/C催化氢化，室温反应过夜，TLC监测至反应完全，展开剂PE:AcOEt=1:1。滤除Pd/C后滤液旋干，产物不做进一步纯化处理，直接进行下步反应。
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)
150mg EA用5mL THF溶解，加入65mg EDC，室温搅拌反应0.5h，加入上述产物，室温反应1d，TLC监测至反应完全，展开剂PE:AcOEt=1:1。旋蒸除去溶剂，30mL AcOEt混悬，依次用蒸馏水30mL×3及饱和食盐水30mL洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥后硅胶柱分离得白色固体产物约114.3mg，两步总产率53%。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.79,0.80,0.90,0.91,0.92,0.99,1.16,2.00,2.02,2.05,2.14(11×CH3),0.72-2.17(m,other aliphatic ring protons),2.55(brd,1H,J=9.9Hz),3.21(dd,1H,J=3.6,10.4Hz),3.97-4.13(m,3H),5.03-5.18(m,3H),5.41-5.43(m,1H),5.50(brs,1H),6.68(d,1H,J=9.0Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ15.3,15.5,17.0,18.2,20.4,20.5,20.5,20.7,23.1,23.4,23.9,25.4,27.0,27.1,28.0,30.5,32.4(2C),32.8,34.0,36.8,38.4,38.6,39.2,41.2,41.9,46.3,46.5,47.4,55.0,60.6,67.0,68.2,70.7,71.6,78.5,78.7,123.4,143.6,169.7,169.9,170.2,171.0,178.9.
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)
取上述产物50mg溶于3mL CH3OH中，搅拌下加入适量CH3ONa,室温搅拌反应1h，TLC监测至反应完全，展开剂DCM：MeOH=7:1。反应结束后，加入阳离子交换树脂，调pH至中性。柱分离纯化，展开剂DCM：MeOH=10:1，得到白色固体产物35.1mg，产率89%。
1H NMR(400MHz,MeOD):δ0.75,0.80,0.90,0.91,0.92,0.96,1.15(s,7×CH3),0.71-2.10(m,other aliphatic ring protons),2.83(brd,1H,J=12.9Hz),3.14(dd,1H,J=5.0,11.3Hz),3.48-3.55(m,3H),3.62-3.71(m,2H),3.89(brd,1H),4.80(d,1H,8.0Hz),5.31(brs,1H).13C NMR(100MHz,MeOD):δ15.8,16.1,17.7,19.2,23.9(2C),24.0,24.3,26.3,27.5,28.1,28.6,31.3,33.4,33.6(2C),34.9,37.8,39.5,40.3,42.0,42.7,47.3,47.3,48.7,56.3,62.2,70.0,71.0,75.4,77.7,79.4,81.5,123.6,144.9,181.1.
按照类似于上述实施例的方法可以合成其他衍生物，例如下列的化合物：
得到的其他各化合物的核磁数据如下：
Y1：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.74,0.79,0.84,0.91,0.93,1.00,1.34,1.99,2.02,2.03,2.13(s,11×CH3),0.74-2.37(m,other aliphatic ring protons),2.97(brd,1H,J=10.7Hz),3.19(dd,1H,J=4.2,10.6Hz),3.74-3.78(m,1H),4.02(dd,1H,J=2.1,12.4Hz),4.25(dd,1H,J=4.4,12.4Hz),4.39(brs,1H),5.08-5.24(m,3H),5.39(t,1H,J=3.2Hz,H12),5.54(d,1H,J=8.2Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ15.4,15.6,17.0,18.2,20.5(3C),20.6,23.2,24.5,26.8,27.1,28.0,30.2,30.2,32.6,33.0,35.1,35.5,36.9,38.5,38.7,39.5,40.4,41.3,46.0,46.6,48.8,55.2,61.4,67.9,69.9,72.4,72.7,74.2,78.8,91.6,123.2,141.9,169.1,169.4,170.0,170.5,174.7.
Y2：3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)
1H NMR(400MHz,MeOD):δ0.78,0.86,0.90,0.95,0.96,0.98,1.33(s,7×CH3),0.74-1.94(m,other aliphatic ring protons),2.20(t,1H,J=13.4Hz),3.04(dd,1H,J=3.6,14.0Hz),3.15(dd,1H,J=4.9,11.2Hz),3.49-3.56(m,3H),3.65-3.67(m,2H),3.88(brd,1H,J=1.4Hz),4.26(dd,1H,J=3.6,5.5Hz),4.79(d,1H,J=8.8Hz),5.45(brs,1H).13CNMR(100MHz,MeOD):δ16.3,16.3,18.2,19.5,24.5,26.3,27.5,27.9,28.7,29.6,30.9,33.1,34.0,35.8,36.3,38.1,39.8,40.0,41.0,42.2,43.0,47.8,48.4,50.8,56.9,62.4,70.4,71.6,75.0,75.8,78.1,79.7,81.9,123.9,144.6,181.1.
Y3：3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.82,0.90,0.93,1.05,1.06,1.09,1.22,2.00,2.03,2.04,2.16(11×CH3),1.25-2.65(m,other aliphatic ring protons),3.22(dd,1H,J=3.8,13.7Hz),3.97-4.00(m,1H),4.06-4.08(m,2H),5.09-5.10(m,3H),5.42(brs,1H),5.68(brt,1H),6.76(d,1H,J=7.8Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ14.9,17.0,19.3,20.4,20.5(2C),20.7,21.3,23.0,23.4,26.3,27.1,28.6,30.3,31.9,32.6,33.9,34.9,36.6,38.9,39.6,44.4,45.6,45.9,46.0,46.5,47.3,55.2,59.9,60.7,67.0,67.9,70.7,71.9,78.7,124.5,140.1,169.6,169.9,170.2,170.7,172.3,210.3,216.9.
Y4：3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)
1H NMR(400MHz,MeOD):δ0.87,0.95,0.97,1.05,1.08,1.09,1.20(s,7×CH3),1.15-2.27(m,other aliphatic ring protons),2.36-2.42(m,1H),2.54-2.63(m,1H),2.98(d,1H,J=14.7Hz),3.43(dd,1H,J=3.9,14.1Hz),3.47-3.58(m,3H),3.66-3.67(d,2H,J=6.2Hz),3.89(brd,1H,J=2.7Hz),4.82(d,1H,J=8.8Hz),5.56(t,1H,J=3.5Hz).13C NMR(100MHz,MeOD):δ15.5,17.8,20.6,21.9,23.7,24.6,27.0,27.7,28.6,31.4,33.2,33.3,35.0,36.1,37.9,40.1,41.1,46.7(2C),47.1,48.0,48.5,48.9,56.4,61.1,62.2,70.3,71.1,75.9,78.2,81.8,125.2,142.0,175.1,212.7,220.2
Y7：3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-甘露糖苷)
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.78,0.79,0.87,0.90,0.92,0.99,1.16,1.98,2.04,2.07,2.23(11×CH3),0.71-2.13(m,other aliphatic ring protons),2.45(dd,1H,J=3.7,13.2Hz),3.21(dd,1H,J=4.1,10.4Hz),3.71-3.75(m,1H),4.05(dd,1H,J=2.4,12.2Hz),4.22(dd,1H,J=4.9,12.3Hz),5.10(dd,1H,J=3.3,10.1Hz),5.19-5.24(m,1H),5.31-5.34(m,2H),5.51(d,1H,J=9.3Hz),6.54(d,1H,J=9.3Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ15.3,15.5,16.9,18.2,20.4,20.6(3C),23.2,23.5,24.0,25.4,27.0(2C),28.0,30.5,32.3,32.3,32.8,33.9,36.8,38.4,38.6,39.2,41.9,42.1,46.5,46.6,47.4,55.0,62.4,65.5,70.1,71.4,73.6,76.0,78.7,122.8,144.6,169.7,169.7,169.9,170.5,178.0.
Y8：3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)
1H NMR(400MHz,MeOD):δ0.78,0.85,0.92,0.94,0.95,0.98,1.19(s,7×CH3),0.74-2.17(m,other aliphatic ring protons),2.83(dd,1H,J=3.6,13.4Hz),3.15(dd,1H,J=5.0,11.4Hz),3.25-3.28(m,1H),3.50-3.57(m,2H),3.64(dd,1H,J=5.6,11.7Hz),3.74(brd,1H,J=1.4Hz),3.81(dd,1H,J=2.2,11.7Hz),5.11-5.13(m,1H),5.39(brs,1H),7.40(d,1H,J=8.8Hz).13C NMR(100MHz,MeOD):δ16.0,16.3,18.1,19.5,23.9,24.6(2C),26.3,27.9,28.5,28.8,31.6,33.5,33.9,34.0,35.1,38.1,39.8,39.9,40.8,43.0,43.1,47.6,47.9,49.1,56.7,63.1,68.1,72.3,75.6,79.2,79.7,79.7,124.7,144.7,180.7.
实验例
下面为本发明部分化合物的抗流感病毒的实验结果。
1．Q9能够有效抑制流感病毒的复制。通过CPE抑制试验和噬斑抑制实验证明化合物Q9对流感病毒有着明显的抑制作用，强于阳性药物利巴韦林。CPE抑制试验表明Q9的对流感病毒的EC50为48.7μM，而阳性药物达菲（磷酸奥司他韦，OSV-P）的EC50为45.6μM，利巴韦林（RBV）的EC50为42.7μμM（见表1）。噬斑抑制实验表明Q9对流感病毒的IC50<5μM（见图1）。而Q9在A549、MDCK以及293T细胞中的CC50均大于100μM，说明Q9的细胞毒性很小。
表1：Q9抑制流感病毒（WSN）的活性及其细胞毒性分析。
a：CC50，半数细胞毒性浓度
b：EC50，半数有效浓度，即抑制一半细胞病变的化合物浓度。利用细胞病变（CPE）抑制实验计算Q9的EC50与利巴韦林和磷酸奥司他韦抗病毒活性相当，说明Q9抗流感病毒效果类似于利巴韦林和磷酸奥司他韦。
表2：噬斑抑制实验证明Q9对于流感病毒有明显的抑制作用
Q9浓度 100μM 50μM 25μM 10μM 5μM 0μM
噬斑数量 0 7.6±2.5 14.1±1.7 21.8±2.5 42.9±5.8 100
结果显示：流感病毒在MDCK细胞上可形成病毒噬斑，Q9在5μM浓度下可以抑制一半以上的噬斑数量，即IC50<5μM。
2．Q9能够抑制流感病毒进入细胞
通过上述加药时间点实验和上述血凝素实验可以初步断定，Q9作用于病毒进入细胞过程，且干扰了病毒与细胞受体之间的结合。（见表3和附图1）
表3.加药时间点实验表明Q9作用于病毒复制的早期（0-2h）
加药时间点 0-10h 0-2h 2-5h 5-8h 8-10h DMSO
病毒NP水平 0.25 0.38 1.0 1.0 0.96 1.0
结果显示，在全程给药（0-10h）以及0-2h加药均能够有效地抑制流感病毒的复制。说明药物在病毒感染后0-2h内发挥抑制作用，而在感染2h之后加药则无抑制效果。
实验表明Q9对HA有抑制作用，说明Q9作用于病毒与细胞结合阶段。
3．假病毒实验表明Q9能够抑制H1N1和H5N1流感毒株进入细胞。
由于H5N1为高致病性流感病毒，所以本发明制备了H5N1和H1N1的假病毒，用来衡量Q9抗病毒活性的广谱性。此种假病毒具有高度的安全性，可以在P2实验室进行操作。在Q9浓度为50μM时，表现出对流感病毒H1N1和H5N1明显的抗病毒活性，抑制率分别为61.9%和16.8%。抑制率越高，检测到的相对萤光素酶活性就越弱。
表4.假病毒实验表明Q9能够抑制H1N1和H5N1流感病毒假病毒。
假病毒是由HIV的核心蛋白和流感病毒的囊膜蛋白HA/NA组成。流感病毒的两种亚型H1N1和H5N1假病毒都被Q9抑制；Q9浓度为50μM。DMSO作为阴性对照，抑制率设为零。
4．部分糖修饰三萜类化合物衍生物抗流感病毒活性
将化合物与病毒混合后加入到细胞中，观察化合物对病毒诱发细胞病变的抑制效果。只加化合物不加病毒组可以用来衡量化合物的细胞毒性。以DMSO作为阴性对照。犬肾上皮细胞（MDCK）传代24h后，将待检化合物加入到DMEM中，充分混匀后加入到MDCK细胞中，48h后用Celltiter-Glo检测试剂盒检测细胞活力。结果表明Q9有非常好的抑制流感病毒活性，可以显著削弱病毒的感染性；EA、Q1、Q2、Q3、Q11和Q12也表现出一定的抗流感病毒活性；其它化合物则没有明显的抗流感病毒活性。而被检测的化合物中EA、Q4和Q6有很强的细胞毒性，Q1、Q2、Q3、Q11和Q12虽然在抗流感病毒活性没有Q9明显，但与EA相比，细胞毒性有了显著的降低。其它化合物毒性都非常弱。（见表5、6）
表5.在50μM浓度下，各化合物对MDCK细胞的毒性检测。
化合物 EA Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q8
细胞活力(%) 73.5 110.2 101.1 100.4 0.1 100.9 38.4 102.6
化合物 Q9 Q10 Q11 Q12 Q13 Q14 DMSO
细胞活力(%) 89 98.1 92.8 93.3 91.7 98.3 100
表6.在50μM浓度下，各化合物抗流感病毒活性，病毒感染力越低则说明药物的抑制效果越好，检测方法同表5。
化合物 EA Q1 Q2 Q3 Q5 Q8 Q9
病毒感染力(%) 67.9 78.7 76.2 71.1 107.5 109.7 21.1
化合物 Q10 Q11 Q12 Q13 Q14 DMSO
病毒感染力(%) 100.6 82.6 80.1 115.5 154.4 100.0
以DMSO作为阴性对照。犬肾上皮细胞（MDCK）传代24h后，将WSN病毒（MOI=1）与待检化合物加入到DMEM中，充分混匀后加入到MDCK细胞中，48h后用Celltiter-Glo检测试剂盒检测细胞活力。感染率（Infectivity）=100%-化合物对细胞病变的保护率。化合物对细胞病变的保护率=100%×(1-(Test compound–Median Virus 1)/(Median Cells-MedianVirus2)).其中Test compound表示只加待检化合物不加病毒组的细胞活力；MedianVirus1表示加了待检化合物和病毒组的细胞活力；Median Cells表示只加入1%DMSO组的细胞活力；Median Virus2表示加入1%DMSO和病毒组的细胞活力。
对Q9进行进一步的结构修改发现，Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y7及Y8都具有非常明显的抗流感病毒活性，并且细胞毒性也很弱。其中Y5的抗流感病毒活性最为明显。（见表7和表8）
表7.在50μM浓度下，各化合物对MDCK细胞的毒性检测。
化合物 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
细胞活力(%) 84.8 105.0 80.8 98.5 81.7
化合物 Y6 Y7 Y8 Q9 DMSO
细胞活力(%) 98.7 82.3 85.0 100.3 100.0
表8.在50μM浓度下，各化合物抗流感病毒活性，病毒感染力越低则说明药物的抑制效果越好，检测方法同表6。
化合物 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
病毒感染力(%) 16.4 17.5 16.3 31.1 9.0
化合物 Y6 Y7 Y8 Q9 DMSO
病毒感染力(%) 16.0 17.4 19.5 21.1 100
本发明并不局限于上述的具体实施例，上述的具体实施例仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明保护范围之内。

Claims (4)

1.下面的化合物、其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗需要的患者甲型流感的药物中的用途：
刺囊酸，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-葡萄糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-木糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(七-O-乙酰基-β-D-麦芽糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-甘露糖苷)，或
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)。
2.权利要求1中所述的下面化合物、其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可接受的盐，其中所述的化合物为：
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-木糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(β-D-乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-O-(七-O-乙酰基-β-D-麦芽糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3β,16α-二羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3,16-二酮-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)，
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-甘露糖苷)，或
3β-羟基-齐墩果烷-12-烯-28-酸-28-N-(β-D-半乳糖苷)。
3.权利要求2中所述的化合物、其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：
4.按照权利要求3所述的制备方法，包括：
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