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CN103958544A - 针对艰难梭菌的主要外毒素TcdA和TcdB的中和抗体 - Google Patents

针对艰难梭菌的主要外毒素TcdA和TcdB的中和抗体 Download PDF

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CN103958544A CN201280049537.6A CN201280049537A CN103958544A CN 103958544 A CN103958544 A CN 103958544A CN 201280049537 A CN201280049537 A CN 201280049537A CN 103958544 A CN103958544 A CN 103958544A
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Abstract

本发明描述了能够中和艰难梭菌的主要外毒素TcdA和TcdB的抗体的衍生和选择。本发明还描述了单个Mab及其混合物的新型中和和抗原结合性质。

Description

针对艰难梭菌的主要外毒素TcdA和TcdB的中和抗体
本发明涉及针对艰难梭菌(Clostridium difficile)的外毒素例如TcdA和TcdB的抗体、包含所述抗体的药物组合物、产生所述抗体和组合物的方法以及所述抗体和组合物用于治疗和/或预防，特别是治疗或预防艰难梭菌感染、假膜性结肠炎、暴发性结肠炎和/或中毒性巨结肠的用途。
两种主要外毒素TcdA和TcdB已在许多体外和体内研究中被确定为艰难梭菌的主要致病性决定子。非产毒株对动物和人是非致病性的(1,2)。迄今为止仍然需要确立对二元毒素的作用的明确理解(3)。
两种毒素都是肠毒性的和细胞毒性的，但综合各种证据显示TcdA是比TcdB更强的肠毒素，而通常观察到TcdB的细胞毒性为TcdA的约1000倍(4)。虽然两种毒素都能够诱发炎症反应，但TcdA似乎帮助更多炎症性TcdB迁移进入更深的肠黏膜(5)。
总体来说，30多年产生的一大批数据支持其中两种毒素都可能在人疾病过程中具有非常重要的意义的模型。TcdA可能通过紧密连接的丢失和绒毛尖的破坏和从而腹泻，可能地通过白蛋白驱动的液体流失来起始早期(即在TcdB之前)和快速(即1-3小时)肠损伤。对肠衬里的完整性的这种损害使得TcdB能够更快和更有效地(即深入更深的组织，或细胞靶并且全身性破坏可及的器官)施加其优良的摩尔效力(TcdB通常被引证为是TcdA的细胞毒性的1000倍)。任一毒素在体外对人或动物细胞和组织是单独有效的。取决于其它诱发因素例如机械损伤、屏障过载和宿主特异性敏感性，任一毒素单独地在动物的体内是有效的。现已清楚在仓鼠中，至少通过艰难梭菌肠感染递送的单独的TcdA或TcdB可引起死亡(1)。已证明A-B+菌株能够引起人的症状和死亡(6,7)。然而，绝大部分(～95%)临床菌株为A+B+，从而目标在于治疗艰难梭菌感染(CDI)的药物必须能够有效中和两种毒素的活性和清除所述毒素。
CDI是老年患者或具有并发合并症的那些患者的最常见的医院内感染。然而，社区获得性感染的增加已引起人们的注意。感染几乎总是与广谱抗生素的使用相关或由其诱发。仅在美国医疗保健相关花费据估计每年超过10亿美元。这些花费主要因具有更长的住院期的患者造成。目前的疗法包括使用杀死肠内的艰难梭菌细胞的抗生素，例如克林霉素、万古霉素或非达米星。目前的疗法解决了细菌感染但不能对付或直接防止由TcdA和TcdB引发的显著发病机制，所述TcdA和TcdB是CDI症状和死亡率的主要贡献者。
人的CDI症状包括轻度至严重的腹泻、假膜性结肠炎(PMC)和暴发性结肠炎或所谓的中毒性巨结肠。死亡导致5-15%的接受目前最好的照护的患者。因此，目前还没有患者可获得用于防止在感染后由艰难梭菌毒素引起的损害和损伤的特异性疗法。
已显示通过接种产生抗体反应和胃肠外施用多克隆和单克隆抗体能够保护动物免受腹泻的症状和死亡(8-15)。仓鼠中的早期研究表明单独的抗TcdA抗体是获得保护作用所需的所有物质。然而，功能上缺失TcdA或TcdB的菌株的使用证明了任一毒素都能够引起仓鼠的疾病，但两种毒素一起更有效(1)。
对于治疗性应用，单克隆抗体(Mab)可提供优于血清来源的多克隆抗体或血清来源的高免疫血清的效力、安全性、制造和监管有利方面。由于这些原因，Mab对于治疗产品通常是优选的选择。
已进行了许多努力来产生抗TcdA和TcdB保护性Mab。这些Mab中在临床上最先进的Mab是2种IgG1Mab的混合物，由MBL和Medarex开发的最初称为CDA1和MDX1388的各自抗TcdA和TcdB的Mab。已显示它们在急性或复发性感染的模型中不能完全保护仓鼠(15)。该Mab组合现由Merck Inc开发为MK3415A。在人II期临床试验中，MK3415A导致统计上显著的疾病复发的减少(p=0.006)(也参见Lowy等人,NEJM(2010)362:197-205)但不影响腹泻的持续时间/严重度或死亡率(16)。这可能意味着这些抗体仅对预防感染的复发有用。感染的复发导致约25%的患者。因此，可能存在这些抗体在其中无效的大量患者群体。
为了能够对腹泻(例如作为因TcdA引起的对肠紧密连接的急性损害的结果)和死亡(例如因下列情况而引起的：延长的不良营养状况、脱水应激和炎症级联的引发、对肠衬里的广泛解剖学上的损伤和可能地因全身性毒性TcdB(更甚于TcdA)引起的对远距离器官的损害)产生积极影响，需要具有优良亲和力、毒素中和、对TEER(跨上皮电阻)的丢失的优良防止、抗原修饰和抗原免疫清除的Mab。
发明概述
本发明提供了具有极高水平的体外和体内效力的Mab，其具有对患有艰难梭菌感染(CDI)的人的腹泻的持续和严重度以及死亡率产生影响的潜力。
在一个实施方案中，提供了特异于抗原TcdA或TcdB的单克隆抗体，其中所述抗体对靶抗原具有高亲和力，并且适合用于减少患有艰难梭菌感染或处于发生所述感染的风险中的患者的腹泻的持续时间和/或严重度以及发病率。
在一个实施方案中，提供了特异于的TcdA或TcdB的Mab，或至少两种Mab的群体，所述Mab的至少一种特异于TcdA并且所述Mab的至少一种特异于TcdB，其中所述抗体或每一种抗体或抗体的组合的EC50为200ng/ml或更少，例如150ng/ml或更小，例如100ng/ml。
本公开内容的抗体是有用的，因为它们可能提供治疗患者的原发感染例如腹泻的症状的严重度和持续时间或防止死亡而不仅仅是预防疾病症状的复发的手段。
在至少一些实施方案中，根据本公开内容的抗体在高浓度毒素存在的情况下不显示效力的减小。
发明详述
如本文中所用，特异性意指这样的抗体，所述抗体仅识别其所特异于的抗原，或这样的抗体，所述抗体对于其所特异性于的抗原的结合，相较于该抗体对于其所非特异性于的抗原的结合，具有显著更高的结合亲和力，例如为5、6、7、8、9、10倍的结合亲和力。
结合亲和力可通过标准测定例如表面等离子体共振技术例如BIAcore来测量。
在一个实施方案中，对于细胞培养测定和患者的艰难梭菌感染，EC50小于75、70、60、65、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.5ng/ml。这显著低于(效力更强)已知抗体，并且被认为是关于为什么本公开内容的抗体对接受治疗的受试者的存活具有显著的和积极影响的主要因素。
如本文中所用，效力是抗体在给定的剂量或浓度诱发适当的生物反应例如有害毒素作用的中和的能力。效力的实例包括毒素活性的最大中和百分比(保护的程度)、Mab对抗原的最低相对浓度(例如EC50)、中和活性的速度和耐久性。
在细胞培养测定中，中和可能被观察为下列方面的一个或多个方面：毒素结合至细胞的防止、毒素从溶液的免疫沉淀、细胞形式和形状丢失的防止、细胞骨架结构的丢失的防止、细胞单层紧密连接和跨上皮电阻的丢失的防止、细胞死亡、细胞凋亡的防止以及促炎细胞因子例如TNFα、IL-1β、IL-6和MIP1α的产生。
在组织切片和外植体测定中，中和可以例如被观察为坏死和/或水肿液积累的防止。
在体外测定中，中和可被观察为如下方面的一个或多个方面：液体在结扎的回肠袢中的积累的防止以及肠组织坏死、腹泻、动物死亡的假膜形成的防止，
因此，在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素A抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列1至3存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列4至6存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1为CDR L1，SEQ ID NO:2为CDR L2以及SEQ ID NO:3为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:4为CDR H1，SEQ ID NO:5为CDR H2以及SEQ ID NO:6为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1为CDR L1，SEQ ID NO:2为CDR L2，SEQ ID NO:3为CDR L3，SEQ ID NO:4为CDR H1，SEQ ID NO:5为CDR H2以及SEQ ID NO:6为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列的轻链可变区(抗体922抗-毒素A抗体；轻链可变区序列)SEQ ID NO:7:
DPVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISNALAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQYTHYSHTSKNPFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线并且构建体在本文中被称为922.g1VK(gL1)。
编码SEQ ID NO:7的多核苷酸序列示于图1中和SEQ ID NO:8。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:9的重链可变区(抗体922抗-毒素A抗体重链可变区序列):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISSYYMSWVRQAPGKGLEWIGIISSGGHFTWYANWAKGRFTISSDSTTVYLQMNSLRDEDTATYFCARAYVSGSSFNGYALWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线并且构建体在本文中被称为922.g1VH(gH1)
编码SEQ ID NO:9的多核苷酸序列示于图1中和SEQ ID NO:10。
在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:7和9中显示的可变区。
因此，在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素A抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列11至13存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列14至16存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:11为CDR L1，SEQ ID NO:12为CDR L2以及SEQ ID NO:13为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:14为CDR H1，SEQ ID NO:15为CDR H2以及SEQ ID NO:16为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:11为CDR L1，SEQ ID NO:12为CDR L2，SEQ ID NO:13为CDR L3，SEQ ID NO:14为CDR H1，SEQ ID NO:15为CDR H2以及SEQ ID NO:16为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:17的轻链可变区(抗体923抗-毒素A抗体;轻链可变区序列)：
DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISSLQPEDVATYYCQYSHYGTGVFGAFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线并且构建体在本文中被称为CA923.g1gL1
编码SEQ ID NO:17的多核苷酸序列示于图1中和SEQ ID NO:18。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:19的重链可变区(抗体923抗-毒素A抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASAFSLSNYYMSWVRQAPGKGLEWIGIISSGSNALKWYASWPKGRFTISKDSTTVYLQMNSLRAEDTATYFCARNYVGSGSYYGMDLWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线并且构建体在本文中被称为CA923.g1gH1
编码SEQ ID NO:19的多核苷酸序列示于图2中和SEQ ID NO:20。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19中所示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素A抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列21至23存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列24至26存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:21为CDR L1，SEQ ID NO:22为CDR L2以及SEQ ID NO:23为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:24为CDR H1，SEQ ID NO:25为CDR H2以及SEQ ID NO:26为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:21为CDR L1，SEQ ID NO:22为CDR L2，SEQ ID NO:23为CDR L3，SEQ ID NO:24为CDR H1，SEQ ID NO:25为CDR H2以及SEQ ID NO:26为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:27的轻链可变区(抗体993抗-毒素A抗体;轻链可变区序列)：
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYFSWYQQKPGKAPQLLIYGASTLASGVPSRFKGSGSGTELTLTISSLQPDDFATYYCQCTDYSGIYFGGFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线并且构建体在本文中被称为CA993.g1gL1
编码SEQ ID NO:27的多核苷酸序列示于图2中和SEQ ID NO:28。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:29的重链可变区(抗体993抗-毒素A抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWIGIISSGSSTTFTWYASWAKGRFTISKTSTTVYLQMNSLKTEDTATYFCARAYVGSSSYYGFDPWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线并且构建体在本文中被称为CA993.g1gH1
编码SEQ ID NO:29的多核苷酸序列示于图2中和SEQ ID NO:30。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素A抗体)，所述CD选自：
在一个实施方案中，序列31至33存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列34至36存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:31为CDR L1，SEQ ID NO:32为CDR L2以及SEQ ID NO:33为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:34为CDR H1，SEQ ID NO:35为CDR H2以及SEQ ID NO:36为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:31为CDR L1，SEQ ID NO:32为CDR L2，SEQ ID NO:33为CDR L3，SEQ ID NO:34为CDR H1，SEQ ID NO:35为CDR H2以及SEQ ID NO:36为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列的轻链可变区(抗体995抗-毒素A抗体;轻链可变区序列)SEQ ID NO:37:
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSINNYFSWYQQKPGKAPKLLIYGAANLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYSCQNNYGVHIYGAAFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:37的多核苷酸序列示于图3中和SEQ ID NO:38。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:39的重链可变区(抗体995抗-毒素A抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSNYDMIWVRQAPGKGLEYIGFINTGGITYYASWAKGRFTISRDSSTVYLQMNSLRAEDTATYFCARVDDYIGAWGAGLWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:39的多核苷酸序列示于图3中和SEQ ID NO:40。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素A抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列41至43存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列44至46存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:41为CDR L1，SEQ ID NO:42为CDR L2以及SEQ ID NO:43为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:44为CDR H1，SEQ ID NO:45为CDR H2以及SEQ ID NO:46为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:41为CDR L1，SEQ ID NO:42为CDR L2，SEQ ID NO:43为CDR L3，SEQ ID NO:44为CDR H1，SEQ ID NO:45为CDR H2以及SEQ ID NO:46为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:47的轻链可变区(抗体997抗-毒素A抗体;轻链可变区序列)：
ALVMTQSPSSFSASTGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISCLQSEDFATYYCLGVYGYSNDDGIAFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:的多核苷酸序列47示于图3中和SEQ ID NO:48。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:49的重链可变区(抗体997抗-毒素A抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSHHMCWVRQAPGKGLEYIGVIYHFGSTYYANWATGRFTISKDSTTVYLQMNSLRAEDTATYFCARASIAGYSAFDPWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:49的多核苷酸序列示于图4中和SEQ ID NO:50。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素A抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列51至53存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列54至56存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:51为CDR L1，SEQ ID NO:52为CDR L2以及SEQ ID NO:53为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:54为CDR H1，SEQ ID NO:55为CDR H2以及SEQ ID NO:56为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:51为CDR L1，SEQ ID NO:52为CDR L2，SEQ ID NO:53为CDR L3，SEQ ID NO:54为CDR H1，SEQ ID NO:55为CDR H2以及SEQ ID NO:56为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:57的轻链可变区(抗体1000抗-毒素A抗体;轻链可变区序列):
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNAYTSNSHDNAFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线。
编码SEQ ID NO:57的多核苷酸序列示于图4中和SEQ ID NO:58。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:59的重链可变区(抗体1000抗-毒素A抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCTVSGIDLSSDAVGWVRQAPGKGLEYIGIIATFDSTYYASWAKGRFTISKASSTTVYLQMNSLRAEDTATYFCARTGSWYYISGWGSYYYGMDLWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线。
编码SEQ ID NO:59的多核苷酸序列示于图4中和SEQ ID NO:60。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:59中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列61至63存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列64至66存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:61为CDR L1，SEQ ID NO:62为CDR L2以及SEQ ID NO:63为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:64为CDR H1，SEQ ID NO:65为CDR H2以及SEQ ID NO:66为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:61为CDR L1，SEQ ID NO:62为CDR L2，SEQ ID NO:63为CDR L3，SEQ ID NO:64为CDR H1，SEQ ID NO:65为CDR H2以及SEQ ID NO:66为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:67的轻链可变区(抗体926抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTLMHWFQQKPGQAPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTWNDPWTFGGGTKVEIK
其中将CDR加以下划线。
编码SEQ ID NO:67的多核苷酸序列示于图5中和SEQ ID NO:68。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:69的重链可变区(抗体926抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVELLESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSNYGMAWVRQAPTKGLEWVTSISSSGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTATYYCTTVIRGYVMDAWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:69的多核苷酸序列示于图5中和SEQ ID NO:70。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列71至73存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列74至76存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:71为CDR L1，SEQ ID NO:72为CDR L2以及SEQ ID NO:73为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:74为CDR H1，SEQ ID NO:75为CDR H2以及SEQ ID NO:76为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:71为CDR L1，SEQ ID NO:72为CDR L2，SEQ ID NO:73为CDR L3，SEQ ID NO:74为CDR H1，SEQ ID NO:75为CDR H2以及SEQ ID NO:76为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:77的轻链可变区(抗体927抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DTQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASGSVSTLMHWYQQKPGKAPKLLIYKASNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCHQSWNSDTFGQGTRLEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:77的多核苷酸序列示于图5中和SEQ ID NO:78。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:79的重链可变区(抗体927抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVATINYDGRTTHYRDSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSISRSHYFDCWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:79的多核苷酸序列示于图5中和SEQ ID NO:80。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列81至83存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列84至86存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:81为CDR L1，SEQ ID NO:82为CDR L2以及SEQ ID NO:83为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:84为CDR H1，SEQ ID NO:85为CDR H2以及SEQ ID NO:86为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:81为CDR L1，SEQ ID NO:82为CDR L2，SEQ ID NO:83为CDR L3，SEQ ID NO:84为CDR H1，SEQ ID NO:85为CDR H2以及SEQ ID NO:86为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列的轻链可变区(抗体1099抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)SEQ ID NO:87:
DVQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASKSISNHLAWYQEKPGKANKLLIHSGSTLQSGTPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDEYPYTFGQGTRLEIKRT
其中将CDR加以下划线
在一个实施方案中，SEQ ID NO:87的最后两个氨基酸(RT)被省略。
编码SEQ ID NO:87的多核苷酸序列示于图6中和SEQ ID NO:88。在一个实施方案中，编码最后两个氨基酸(RT)的密码子被省略。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列的重链可变区(抗体1099抗-毒素B抗体重链可变区序列)SEQ ID NO:89:
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLQSYTISWVRQPPGKGLEWIAAISGGGSTYYNLPLKSRVTISRDTSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCTRPRWYPRSYFDYWGRGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:89的多核苷酸序列示于图6中和SEQ ID NO:90。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89中所示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列91至93存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列94至96存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:91为CDR L1，SEQ ID NO:92为CDR L2以及SEQ ID NO:93为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:94为CDR H1，SEQ ID NO:95为CDR H2以及SEQ ID NO:96为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:91为CDR L1，SEQ ID NO:92为CDR L2，SEQ ID NO:93为CDR L3，SEQ ID NO:94为CDR H1，SEQ ID NO:95为CDR H2以及SEQ ID NO:96为CDR H3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:97的轻链可变区(抗体1102抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
NIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRISTSIHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSYSSLYTFGQGTKLEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:97的多核苷酸序列示于图6中和SEQ ID NO:98。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:99的重链可变区(抗体1102抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDSYMAWVRQAPGKGLEWIASISYGGTIIQYGDSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRQGTYARYLDFWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:99的多核苷酸序列示于图7中和SEQ ID NO:100。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:99中所示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列101至103存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列104至106存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:101为CDR L1，SEQ ID NO:102为CDR L2以及SEQ ID NO:103为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:104为CDR H1，SEQ ID NO:105为CDR H2以及SEQ ID NO:106为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:101为CDR L1，SEQ ID NO:102为CDR L2，SEQ ID NO:103为CDR L3，SEQ ID NO:104为CDR H1，SEQ ID NO:105为CDR H2以及SEQ ID NO:106为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:107的轻链可变区(抗体1114抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
ATQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLLHWYQQKPGKAPKLLIYKASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSWNSPPTFGQGTKLEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:107的多核苷酸序列示于图7中和SEQ IDNO:108。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:109的重链可变区(抗体1114抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVAIINYDASTTHYRDSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRYGRSHYFDYWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:109的多核苷酸序列示于图7中和SEQ ID NO:110。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:109中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列111至113存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列114至116存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:111为CDR L1，SEQ ID NO:112为CDR L2以及SEQ ID NO:113为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:114为CDR H1，SEQ ID NO:115为CDR H2以及SEQ ID NO:116为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:111为CDR L1，SEQ ID NO:112为CDR L2，SEQ ID NO:113为CDR L3，SEQ ID NO:114为CDR H1，SEQ ID NO:115为CDR H2以及SEQ ID NO:116为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:117的轻链可变区(抗体1114graft8抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DTVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLLHWYQQKPGKAPKLLIYKASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQSWNSPPTFGQGTKLEIK
其中将CDR加以下划线。
编码SEQ ID NO:117的多核苷酸序列示于图8中和SEQ ID NO:118。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:119的重链可变区(抗体1114graft8抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVAIINYDASTTHYRDSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRYGRSHYFDYWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:119的多核苷酸序列示于图8中和SEQ ID NO:120。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:119中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列121至123存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列124至126存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:121为CDR L1，SEQ ID NO:122为CDR L2以及SEQ ID NO:123为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:124为CDR H1，SEQ ID NO:125为CDR H2以及SEQ ID NO:126为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:121为CDR L1，SEQ ID NO:122为CDR L2，SEQ ID NO:123为CDR L3，SEQ ID NO:124为CDR H1，SEQ ID NO:125为CDR H2以及SEQ ID NO:126为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:127的轻链可变区(抗体1125抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYMYLNWYQQKPGKAPKRLIYNTNKLHTGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQHKSFPYTFGQGTKLEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:127的多核苷酸序列示于图8中和SEQ ID NO:128。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:129的重链可变区(抗体1125抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRDSFMAWVRQAPGKGLEWVASISYEGDKTYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTITTSGDSWGQGTMVTVSS
其中将CDR加以下划线
在一个实施方案中，SEQ ID NO:129的最后一个氨基酸(S)被省略。
编码SEQ ID NO:129的多核苷酸序列示于图9中和SEQ ID NO:130。在一个实施方案中，编码最后1个氨基酸S的密码子AGC被省略。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:129中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列131至133存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列134至136存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:131为CDR L1，SEQ ID NO:132为CDR L2以及SEQ ID NO:133为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:134为CDR H1，SEQ ID NO:135为CDR H2以及SEQ ID NO:136为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:131为CDR L1，SEQ ID NO:132为CDR L2，SEQ ID NO:133为CDR L3，SEQ ID NO:134为CDR H1，SEQ ID NO:135为CDR H2以及SEQ ID NO:136为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:137的轻链可变区(抗体1129抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DTQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVGTNVDWYQQKPGKVPKLLIYGASIRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYNYNPYTFGQGTKLEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:137的多核苷酸序列示于图8中和SEQ ID NO:138。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:139的重链可变区(抗体1129抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFIFSNFGMSWVRQAPGKGLEWVASISPSGGNAYYRDSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRAYSSPFAFWGQGTLVTVSS
其中将CDR加以下划线
在一个实施方案中，SEQ ID NO:139的最后一个氨基酸(S)被省略。
编码SEQ ID NO:139的多核苷酸序列示于图8中和SEQ ID NO:140。在一个实施方案中，编码最后一个氨基酸S的密码子AGC被省略。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:139中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列141至143存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列144至146存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:141为CDR L1，SEQ ID NO:142为CDR L2以及SEQ ID NO:143为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:144为CDR H1，SEQ ID NO:145为CDR H2以及SEQ ID NO:146为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:141为CDR L1，SEQ ID NO:142为CDR L2，SEQ ID NO:143为CDR L3，SEQ ID NO:144为CDR H1，SEQ ID NO:145为CDR H2以及SEQ ID NO:146为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:147的轻链可变区(抗体1134抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DVQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASKSISNHLAWYQEKPGKANKLLIHSGSTLQPGTPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDEYPYTFGQGTRLEIK
                                      SEQ ID NO:147
其中将CDR加以下划线。
编码SEQ ID NO:147的多核苷酸序列示于图9中和SEQ ID NO:148。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:149的重链可变区(抗体1134抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLNSYTITWVRQPPGKGLEWIAAISGGGSTYFNSALKSRVTISRDTSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCTRPRWYPRSYFDYWGRGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:149的多核苷酸序列示于图9中和SEQ ID NO:150。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:149中所示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列151至153存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列154至156存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:151为CDR L1，SEQ ID NO:152为CDR L2以及SEQ ID NO:153为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:154为CDR H1，SEQ ID NO:155为CDR H2以及SEQ ID NO:156为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:151为CDR L1，SEQ ID NO:152为CDR L2，SEQ ID NO:153为CDR L3，SEQ ID NO:154为CDR H1，SEQ ID NO:155为CDR H2以及SEQ ID NO:156为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:157的轻链可变区(抗体1151抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNVAWYQHKPGKAPKLLIYYASNRFTGVPSRFTGGGYGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQRVYQSTWTFGQGTKVEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:157的多核苷酸序列示于图9中和SEQ ID NO:158。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:159的重链可变区(抗体1151抗-毒素B抗体重链可变区序列):
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYYVHWVRQPPGKGLEWMGCIRTGGNTEYQSEFKSRVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGNYGFAYWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:159的多核苷酸序列示于图9中和SEQ ID NO:160。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:159中显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含CDR例如1,2,3,4,5或6个CDR的抗体(例如抗-毒素B抗体)，所述CDR选自：
在一个实施方案中，序列161至163存在于抗体的轻链中。
在一个实施方案中，序列164至166存在于抗体的重链中。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:161为CDR L1，SEQ ID NO:162为CDR L2以及SEQ ID NO:163为CDR L3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:164为CDR H1，SEQ ID NO:165为CDR H2以及SEQ ID NO:166为CDR H3。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:161为CDR L1，SEQ ID NO:162为CDR L2，SEQ ID NO:163为CDR L3，SEQ ID NO:164为CDR H1，SEQ ID NO:165为CDR H2以及SEQ ID NO:166为CDRH3。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:167的轻链可变区(抗体1153抗-毒素B抗体;轻链可变区序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKYLDWYQQKPGKVPKLLIYNIQSLHTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCFQHNSGWTFGQGTRLEIK
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:167的多核苷酸序列示于图10中和SEQ ID NO:168。
在一个实施方案中，提供了可变区，例如具有下列序列SEQ IDNO:169的重链可变区(抗体1153抗-毒素B抗体重链可变区序列)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFTQAAMFWVRQASGKGLEGIARISTKSNNFATYYPDSVKGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAPAYYYDGTVPFAYWGQGTLVTVS
其中将CDR加以下划线
编码SEQ ID NO:169的多核苷酸序列示于图10中和SEQ ID NO:170。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体包含中SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:169显示的可变区。
在一个实施方案中，提供了包含6个CDR的抗体，所述CDR独立地选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、21、22、23、24、25、26、31、32、33、34、35、36、41、42、43、44、45、46、51、52、53、54、55、56、61、62、63、64、65、66、71、72、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、91、92、93、94、95、96、101、102、103、104、105、106、111、112、113、114、115、116、121,122、123、124、125、126、131、132、133、134、135、136、141、142、143、144、145、146、151、152、153、154、155、156、161、162、163、164、165和166。
在一个实施方案中，提供了包含6个CDR的抗-TcdA抗体，所述CDR独立地选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、11、12、13、14、15、16、21、22、23、24、25、26、31、32、33、34、35、36、41、42、43、44、45、46、51、52、53、54、55和56。
在一个实施方案中，提供了包含6个CDR的抗-TcdB抗体，所述CDR独立地选自SEQ ID NO61、62、63、64、65、66、71、72、73、74、75、76、81、82、83、84、85、86、91、92、93、94、95、96、101、102、103、104、105、106、111、112、113、114、115、116、121,122、123、124、125、126、131、132、133、134、135、136、141、142、143、144、145、146、151、152、153、154、155、156、161、162、163、164、165和166。
在一个实施方案中，提供了包含两个可变区的抗体，所述可变区独立地选自SEQ ID NO:7、9、17、19、27、29、37、39、47、49、57、59、67、69、77、79、87、89、97、99、107、109、117、119、127、129、137、139、147、149、157和159。
在一个实施方案中，提供了包含两个可变区的抗体，所述可变区独立地选自SEQ ID NO:7、9、17、19、27、29、37、39、47、49、57和59。
在一个实施方案中，提供了包含两个可变区的抗体，所述可变区独立地选自SEQ ID NO:67、69、77、79、87、89、97、99、107、109、117、119、127、129、137、139、147、149、157和159。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体是人源化的。
在一个实施方案中，抗体是针对TcdA和/或TcdB毒素的C末端“细胞结合”部分的。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体适合用于中和毒素A或毒素B。
如本文中所用，中和意指消除或减小目标毒素的有害/有毒作用，例如至少50%的相关有害作用的减小。
本发明人通过使用本申请中发现的抗体之间的内部比较和通过与本领域中良好描述的抗体(Babcock等人2006;Lowy等人,2010)比较，已确定一些抗体即使在高毒素浓度下也具有期望的维持有效中和的特征(例如低EC50和高百分比保护作用)。包括本领域中描述的那些抗体的其它抗体在高毒素浓度下不维持有效毒素中和。
有效毒素浓度在滴定研究中可被定义为在中和抗体不存在的情况下的‘致死剂量’(LD)。中和测定通常在50%的完全细胞杀死的LD(即LD50)下进行，但也可在LD80下更严荷地进行。
测定还可在更具挑战性的条件例如LD90、LD95和/或LDmax(LDmax是可包括在测定中的受测定体积和最大毒素浓度/溶解度限制的最大毒素量)下进行。这样的测定目的在于模拟当肠中生长的艰难梭菌蔓延时并且腹泻和其它症状导致人们假设毒素浓度处于它们的最高值时人的感染的早期阶段。在高毒素浓度条件下有效地中和有害毒素活性的抗体被本发明人认为具有针对人感染的症状的控制的特殊临床值。在一个实施方案中，本公开内容的抗体具有有用的例如低EC50值和/或对于LD80、LD90、LD95和/或LDmax中的一个或多个使细胞免于死亡的高百分比保护作用。在一个实施方案中，后一种情况的一个或多个中的EC50为15ng/ml或更少，例如10ng/ml或更少，例如5ng/ml或更少，特别地1ng/ml或更少。在一个实施方案中，使细胞免于死亡的百分比保护作用大于90%，或大于75%或大于50%。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了即使在高水平毒素存在的情况下仍然维持毒素中和作用(例如如本文中提供的测定中测量的)的抗体或抗体组合。
可以例如在适当的体外测定中测量毒素的有害作用。在一个实施方案中，在下面实施例1中给出的测定中测量中和作用。还提供了在中和测定中鉴定的抗体，例如其中抗体的效力在高水平毒素存在的情况下得到维持。
毒素A可与TcdA互换使用。
毒素B可与TcdB互换使用。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体为单克隆抗体或其结合片段。
在一个实施方案中，根据本发明的单克隆抗体能够以极高的效力和亲和力中和TcdA。
在一个实施方案中，根据本发明的单克隆抗体能够以极高的效力和亲和力以及高亲合性(avidity)中和TcdA。
如本文中所用，亲合性是指多个结合亲和力的组合强度。
在一个实施方案中，根据本发明的单克隆抗体能够以极高的效力和亲和力以及高亲合性和高结合效价中和TcdA。
如本文中所用，结合效价是指单克隆抗体多次结合抗原的能力。高结合效价因而导致高水平的抗体对抗原的修饰和/或高水平的毒素分子的交联，这被认为是有利的。
根据本公开内容的抗-TcdA Mab可适合于中和TcdA的早期作用，例如细胞上的例如紧密连接的丢失。
如本文中所用，紧密连接意欲指单层或解剖组织结构内的细胞之间的不能渗透的连接区域。当紧密连接保持它们的结构和功能完整性时，液体丢失不发生。紧密连接的丢失是细胞已被毒素损害的指征，并且被良好地记录为TcdA和TcdB的毒性作用的早期步骤(25)，并且导致包含血清、免疫球蛋白和离子的流体的丢失(26,3)。紧密连接的丢失被认为是人的腹泻发作的第一步骤。
TEER测定系统可用于体外测量紧密连接的丢失。TEER为跨上皮电阻测定的首字母缩略词并且其通常用于测量代表肠内皮衬里的分化细胞层的通透性。然而，在抗体筛选的背景中，TEER丢失可用于鉴定减缓或防止对紧密连接的损害的抗体，从而为抗导致腹泻的组织损害的保护作用的替代者。
通常地使用Caco-2细胞，因为它们来源于人结肠细胞并且已知形成分化的单层，细胞通过紧密连接进行连接。试剂盒可从Becton-Dickinson命名的Caco-2BioCoat HTS平板系统(BDBiosciences/354802)商购获得。试剂盒中的说明书适合用于本说明书中的测试。当膜已受损后，膜的电阻改变。
通常地，在添加至TEER系统以确定抗体是否可防止或减缓对由毒素引起的对膜的损害之前，用毒素预温育抗体。可在一段适当的时间例如24小时内通过在某些时间点上进行测量来进行测定。本发明人已确定4小时的时间点特别适合鉴别治疗上有用的抗体。
TEER测定中使用的毒素的浓度通常在100-200ng/ml的范围内，最优选为125ng/ml。
TEER测定中使用的抗体(例如IgG1)的浓度通常在4至2000ng/ml，例如50至1000ng/ml，例如100至500ng/ml的范围内。
在一个实施方案中，在所述条件中使用的TEER测定中的抗体的EC50为至少200ng/ml，例如少于100ng/ml，例如约60-80ng/ml。
在一个实施方案中，提供了在艰难梭菌感染的治疗或预防中适合用作治疗剂的抗-TcdA抗体或抗-TcdB抗体，其中使用TEER测定筛选和选择所述抗体。
在一个方面，提供了就减缓或防止紧密连接丢失的能力在TEER测定中筛选抗体的方法。在一个实施方案中，筛选的抗体是抗-TcdA抗体。在一个实施方案中，筛选的抗体是抗-TcdB抗体。在一个实施方案中，筛选的抗体是抗-TcdA与抗-TcdB抗体的组合。在一个实施方案中，方法包括鉴定适当的抗体和表达适当量的所述抗体的步骤。在一个实施方案中，方法还包括在药物制剂中配制所述抗体的步骤。在一个实施方案中，方法还包括将所述抗体或所述制剂给有此需要的患者施用的步骤。
在一个实施方案中，本公开内容的多个抗体可以能够结合目标毒素(TcdA或TcdB)，所述抗体可帮助毒素的免疫清除。
如本文中所用，多个抗体意欲指多个拷贝的具有相同序列的抗体或具有相同氨基酸序列的抗体，或特异于相同靶抗原但具有不同氨基酸序列的抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体特异于靶抗原，例如特异于靶抗原中的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够在两个或更多个位置，例如两个或3个位置，例如4、5、6、7、8、9、10或更多个位置上结合靶抗原，例如毒素可包含重复结构域，从而抗体对于表位可以是特异性的并且事实上表位可数次存在于抗原中，即存在于超过一个位置中。因此，给定的抗体可在抗原的不同位置结合相同表位数次。
在一个实施方案中，抗体结合给定的抗原数次，例如2至20次例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16次。在一个实施方案中，抗体结合给定的抗原至少3次。该多次结合被认为在毒素的中和和/或清除中是非常重要的。不希望受理论束缚，认为多次结合例如3次或更多次结合，即被3个或更多个Fc片段修饰，在触发主要通过肝和脾(27,28)进行的毒素快速清除(24)中是非常重要的。
在一个实施方案中，抗-TcdA抗体结合3次或更多次，例如3至16次。
在一个实施方案中，抗-TcdA抗体结合12次。
在一个实施方案中，抗-TcdA抗体结合2次。
在一个实施方案中，抗-TcdA抗体在TcdA的催化末端细胞结合结构域中结合。
在一个实施方案中，抗-Tcd B抗体结合2次或更多次，例如2次。
在一个实施方案中，抗-TcdB抗体在TcdB的催化末端细胞结合结构域中结合。
在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体能够交联毒素分子，例如抗体分子的一个臂结合一个毒素分子，抗体的另一个臂结合不同毒素分子中的表位，从而形成一种免疫复合物。后者的形成还可促进免疫系统的活化，以清除相关毒素，从而使所述毒素的有害体内作用减小至最小。
在一个实施方案中，先天性免疫反应，例如补体被活化。
在一个实施方案中，本公开内容的抗体具有高的抗来源于不同核糖型例如003、027、078的菌株的毒素的效力。
在一个实施方案中，抗TcdA抗体，例如针对自核糖型003、027和078的菌株的毒素，可具有在0.1–100ng/ml，例如1至10ng/ml范围内的EC50以及在LD80-95的毒素浓度具有在50-100%的范围内的最大抑制。
在一个实施方案中，抗TcdA抗体，例如针对自核糖型003、027和078的菌株的毒素，可具有在0.1–100ng/ml，例如1至10ng/ml范围内的EC50以及在LD80-95的毒素浓度具有在60-100%、70-100%、80-100%或90-100%的范围内的最大抑制。
在一个实施方案中，抗TcdB抗体，例如针对自核糖型003的菌株的毒素，可具有在0.1–100ng/ml，例如1至10ng/ml范围内的EC50以及在LD80-95的毒素浓度具有在50-100%的范围内的最大抑制。
在一个实施方案中，抗TcdB抗体，例如针对自核糖型003的菌株的毒素，可具有在0.1–100ng/ml，例如1至10ng/ml范围内的EC50以及在LD80-95的毒素浓度具有在60-100%、70-100%、80-100%或90-100%的范围内的最大抑制。
在一个实施方案中，提供了根据本发明的抗体的组合，例如特异于TcdA的抗体的组合，特异于TcdB的抗体的组合或特异于TcdA的抗体与特异于TcdB的抗体的组合。
特异于TcdA的抗体的组合通常是指针对靶抗原TcdA上的不同表位的抗体的组合，或至少具有两个不同结合性质的抗体的组合。
特异于TcdB的抗体的组合通常是指针对靶抗原TcdB上的不同表位的抗体的组合，或至少具有两个不同结合性质的抗体的组合。
组合可包括2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15种不同抗体，例如2,3,4或5种抗体。
在一个实施方案中，提供了一种抗-TcdA抗体与两种抗-TcdB抗体的组合，例如其中抗-TcdA抗体为997并且其中抗-TcdB抗体为1125和1151。
具体地，提供了一种抗-TcdA抗体(其包含具有SEQ ID NO:49中显示的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:47中显示的序列的轻链可变区)与两种抗-TcdB抗体(第一种抗-TcdB抗体具有SEQ ID NO:129中显示的重链可变区和SEQ ID NO:127中显示的轻链可变区，第二种抗-TcdB抗体具有SEQ ID NO:159中显示的重链可变区和SEQ ID NO:157中显示的轻链可变区)的组合。
如本文中所用，不同的抗体意欲指具有不同的氨基酸序列的抗体，其可结合靶抗原上的相同表位或不同表位。
本发明还提供的是被本发明提供的抗体(特别是包含SEQ IDNO:49中显示的重链序列和SEQ ID NO:47中显示的轻链序列的抗体)结合的TcdA的特定区域或表位。
本发明还提供的是被本发明提供的抗体(特别地包含SEQ ID NO:129中显示的重链序列和SEQ ID NO:127中显示的轻链序列的抗体，或包含SEQ ID NO:159中显示的重链序列和SEQ ID NO:157中显示的轻链序列的抗体)结合的TcdB的特定区域或表位。
TcdA或TcdB毒素的该特定区域或表位可通过本领域内已知的任何适当的表位作图法与本发明提供的抗体的任一种相组合来鉴定。这样的方法的实例包括就与本发明的抗体的结合筛选来源于毒素的具有不同长度的肽，可特异性结合抗体的最小片段包含被抗体识别的表位的序列。可合成产生或通过毒素多肽的蛋白水解消化产生肽。结合抗体的肽可以通过例如质谱分析来鉴定。在另一个实例中，NMR光谱学或X射线晶体学可用于鉴定被本发明的抗体结合的表位。鉴定后，必要时，可将结合本发明的抗体的表位片段用作获得结合相同表位的其它拮抗性抗体的免疫原。
交叉阻断根据本发明的抗体的结合的抗体可类似地用于中和毒素活性。因此，本发明还提供了具有对于TcdA或TcdB的特异性的中和抗体，所述中和抗体交叉阻断上述抗体的任一种对TcdA或TcdB的结合和/或被那些抗体的任一种交叉阻断对这些毒素的结合。在一个实施方案中，这样的抗体结合与本文中上述抗体相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断中和抗体结合与被本文中上述抗体结合的表位相邻和/或重叠的表位。在另一个实施方案中，本发明的该方面的交叉阻断中和抗体不结合与本发明的抗体结合的表位相同的表位或与所述表位相邻和/或重叠的表位。
交叉阻断抗体可使用本领域中的任何适当方法来鉴定，例如通过使用竞争性的ELISA或BIAcore测定来进行，其中交叉阻断抗体对TcdA或TcdB的结合阻止本发明的抗体的结合或反之亦然。
在一个实施方案中，提供了产生抗-TcdA或抗-TcdB抗体，特别是交叉阻断本文中描述的抗体的结合的中和抗体的方法，所述方法包括步骤：用适当的抗原例如SEQ ID NO173至194的任一个所示的抗原或其组合免疫宿主。所述方法还包括一个或多个下列步骤，例如鉴定目标抗体(特别是使用功能测定例如TEER测定)，表达目标抗体，和任选地将抗体配制为药学上可接受的组合物。
因此在一个方面，本公开内容提供了利用SEQ ID NO173至194中所示的氨基酸序列或其组合免疫宿主的方法。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体具有10nM或更少，例如1nM或更少例如900pM，特别是800pM、700pM、600pM或500pM，例如60pM的对靶抗原的亲和力。
在一个实施方案中，亲和力是针对TcdA或TcdB或其片段的。在一个实例中，片段为对应于TcdA的S1827-D2249残基的TcdA123。在一个实例中，片段为对应于残基G2205-R2608的TcdA456。在一个实施方案中，片段为对应于TcdB的残基S1833-E2366的TcdB1234。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其组合具有200ng/ml或更少，例如150ng/ml或更少例如100ng/ml或更少，例如在0.1至10ng/ml的范围内的EC50。
混合物的单个组分抗体不必具有在所述范围内的EC50，只要当它们与一种或多种抗体组合使用时组合具有在所述范围内的EC50即可。
有利地，本发明的抗体是稳定的，例如在高于50℃例如60或70℃的温度是热稳定的。
根据本发明的抗体和组合还具有下列有利性质的一个或多个性质：慢的解离速率(off rate)、高亲和力、高效力、多次结合靶抗原的能力、利用减少可测量的TEER活性的损失的机制中和毒素、刺激或帮助宿主天然免疫反应、催化或帮助病原体(或毒素)的免疫清除和/或训练免疫系统对病原体(或毒素)作出适当反应的能力。
按照由Kabat等人设计的系统常规地给抗体可变结构域中的残基进行编号。该系统示于Kabat等人,1987,in Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Department of Health and HumanServices,NIH,USA(在下文中“Kabat等人(同上)”)中。除其中另有所指的地方外，该编码系统用于本说明书中。
Kabat残基命名不总是直接对应于氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸序列可包含比严格Kabat编号中的氨基酸更少或更多的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的结构组分(无论是构架区还是互补决定区(CDR))的缩短或插入。可通过将抗体序列中具有同源性的残基与“标准”Kabat编号的序列比对来确定给定的抗体的正确残基Kabat编号。
重链可变结构域的CDR位于根据Kabat编号系统的残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)上。然而根据Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等同于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此除非另外指出，否则如本文中所用，‘CDR-H1’意指残基26至35，如通过Kabat编号系统和Chothia’s拓扑学环定义的组合描述的。
轻链可变结构域的CDR位于根据Kabat编号系统的残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)上。
本发明中使用的抗体可使用本领域已知的任何适当的方法来获得。可使用毒素A和/或毒素B多肽/蛋白质，包括融合蛋白例如毒素-Fc融合蛋白或表达(重组地或天然)多肽的细胞(例如活化的T细胞)来产生特异性识别目标毒素的抗体。毒素多肽可以是全长多肽或其生物活性片段或衍生物。
多肽可通过本领域公知的方法从包含表达系统的遗传工程化宿主细胞制备，或可从天然生物来源回收它们。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外明确地指出，否则这些术语可互换使用。来自核糖型027的TcdA的序列示于SEQ ID NO:171(Uniprot登录号C9YJ37)，来自核糖型027的TcdB的序列示于SEQ ID NO:172(Uniprot登录号C9YJ35)。
抗原多肽可在一些情况下为更大的蛋白质例如融合蛋白(例如融合至亲和标记物)的一部分。
可通过使用公知的和常规方案给动物，优选非人动物施用多肽来获得针对抗原多肽产生的抗体，其中动物的免疫是必需的，参见，例如Handbook of Experimental Immunology,D.M.Weir(ed.),第4卷,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。可免疫许多温血动物例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最适当的。
单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,1983,Immunology Today,4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibody and CancerTherapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)来制备。
本发明中使用的抗体还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达从通过例如Babcook,J.等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15)：7843-78481;WO92/02551;WO2004/051268和国际专利申请号WO2004/106377中描述的方法选择的产生特定抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生。
人源化抗体(其包含CDR移植的抗体)是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见，例如US5,585,089;WO91/09967)。应理解，可能仅必需转移CDR的特异性决定残基而非整个CDR(参见例如,Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。人源化抗体可任选地还包含来源于CDR所源自的非人物种的一个或多个构架残基。
如本文中所用，术语‘人源化抗体分子’是这样的抗体分子，在所述抗体分子中，重链和/或轻链包含来自移植至受体抗体(例如，人抗体)的重链和/或轻链可变构架内的供体抗体(例如鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(包括，必要时，一个或多个修饰的CDR)。关于综述，参见Vaughan等人,Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是整个CDR被移植，而是将来自本文中上述CDR的任一个的特异性决定残基的仅一个或多个转移至人抗体构架(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将本文中上述CDR的一个或多个的特异性决定残基转移至人抗体构架。在另一个实施方案中，仅将本文中上述CDR的每一个的特异性决定残基转移至人抗体构架。
当移植CDR或特异性决定残基时，通过考虑CDR所源自的供体抗体的种类/类型，可使用任何适当的受体可变区构架序列，包括小鼠、灵长类动物和人构架区。适当地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体构架区以及本文中提供的CDR的一个或多个的可变结构域。
因此，在一个实施方案中提供的是结合毒素A或毒素B的人源化抗体，其中可变结构域包含人受体构架区和非人供体CDR。
可用于本发明的人构架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人,同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，EU、LAY和POM可用于重链和轻链。或者，可使用人种系序列；这些序列可在：http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/上获得。
在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链不必来源于相同抗体，并且必要时，可包含具有来源于不同链的构架区的混合链。
同样地，在本发明的人源化抗体中，构架区不必具有与受体抗体的构架区完全相同的序列。例如，可将罕见残基改变成对于该受体链种类或类型是更加频繁存在的残基。或者，可改变受体构架区中选择的残基，以便它们对应于在供体抗体中相同位置上发现的残基(参见Reichmann等人,1998,Nature,332,323-324)。应当使这样的变化保持至恢复供体抗体的亲和力所必需的最低程度。用于选择可能需要被改变的受体构架区中的残基的方案示于WO91/09967中。
一般而言，本说明书中公开的抗体序列被人源化。
本发明还提供了与本文中公开的序列或抗体具有80%、90%、91%、92%、93%94%、95%96%、97%、98%或99%的相似性的序列。
如本文中所用，"同一性"表示在对齐的序列中的任意特定位置上，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文中所用，"相似性"意指，在对齐的序列的任意特定位置上，氨基酸残基在序列之间具有相似类型。例如，亮氨酸可置换异亮氨酸或缬氨酸。通常可彼此置换的其它氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸);
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
同一性和相似性的程度可容易地计算(Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of SequenceData,Part1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991,可从NCBI获得的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410;Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402;Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656,)。
本发明的抗体分子包括具有全长重链和轻链或其片段的完全抗体分子，其可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双-scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体以及上述任一个的表位结合片段(参见例如，Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136;Adair和Lawson,2005,Drug DesignReviews-Online2(3),209-217)。用于产生和制造这类抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如Verma等人,1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181)。用于本发明的其它抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab’片段。多价抗体可包括多特异性，例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853和WO05/113605)。在本实例中特别考虑了双特异性和多特异性抗体变体，因为目的是中和两种独立的目标蛋白：TcdA和TcdB。来自本文中公开的抗体的可变区可以以这样的方式构造来产生能够结合并中和TcdA和TcdB的单一抗体变体。
在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体被提供为TcdA或TcdB结合抗体融合蛋白，其包含免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab’片段，和一个或两个直接或间接与其连接的单结构域抗体(dAb)，例如如WO2009/040562中描述的。
在一个实施方案中，融合蛋白包含两个结构域抗体，例如，任选地通过二硫键连接的可变重链(VH)和可变轻链(VL)配对，例如如WO2010/035012中描述的。
在一个实施方案中，融合蛋白的Fab或Fab’元件具有相同的或相似的对于单结构域抗体的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab’具有不同的对单结构域抗体的特异性，也就是说融合蛋白是多价的。在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如本文中的VH/VL对提供了白蛋白结合位点。
在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白结合TcdA和TcdB。
在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白在多个位置结合TcdB，例如具有特异于两个不同表位的不同的结合区域。
可以就预期的抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能，来选择本发明的抗体分子的恒定区结构域(如果存在的话)。例如，恒定区结构域可以是人IgA,IgD,IgE,IgG或IgM结构域。具体地，当意欲将抗体分子用于治疗用途并且需要抗体效应功能时，可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当意欲将抗体分子用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能(例如仅用于中和或激动抗原)时，可使用IgG2和IgG4同种型。应理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如可使用其中位置241上的丝氨酸已被改变成脯氨酸的IgG4分子(如Angal等人,MolecularImmunology,1993,30(1),105-108中描述的)。本领域技术人员还应理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺作用的变化。常见修饰是因羧肽酶的作用而导致的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris,RJ.Journal of Chromatography705:129-134,1995中描述的)。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域并且抗体轻链包含CL结构域(κ或λ)。
生物分子例如抗体或片段包含酸性和/或碱性官能团，从而赋予分子净正电荷或负电荷。总的“观察到的”电荷的量将取决于物质的绝对氨基酸序列，3D结构中的带电荷的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或其溶剂可及表面不携带净电荷时的pH。在一个实例中，本发明的抗体和片段可被工程化来具有适当的等电点。这可导致具有更加强劲的性质，特别是适当的溶解度和/或稳定性特征和/或改善的纯化特征的抗体和/或片段。
因此，在本发明的一个方面，提供了经工程化从而具有与其所源自的原始鉴定的抗体的等电点不同的等电点的人源化抗体。抗体可以例如通过替代氨基酸残基，例如用一个或多个碱性氨基酸残基替代酸性氨基酸残基来进行工程化。或者，可引入碱性氨基酸残或可除去酸性氨基酸残基。或者，如果分子具有不可接受的高pI值，则可视需要引入酸性残基来降低pI。重要的是当操纵pI时，必须小心以保持抗体或片段的期望的活性。因此，在一个实施方案中，工程化抗体或片段具有与“未修饰”抗体或片段相同或大体上相同的活性。
程序例如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html,and http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html，可用于预测抗体或片段的等电点。
应理解，可使用本领域已知的任何适当方法来改变本发明提供的抗体的亲和力。抗体或其变体的亲和力可使用本领域已知的任何适当方法，包括BIAcore，使用适当的分离的天然的或重组蛋白或适当的融合蛋白/多肽来测量。
本发明从而还涉及视情况而定具有改善的对于TcdA或TcdB的亲和力的本发明的抗体分子的变体。这样的变体可通过许多亲和力成熟方案来获得，包括突变CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992)、大肠杆菌的增变株的使用(Low等人,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)论述了这些亲和力成熟的方法。
本文中使用的改善的亲和力在本说明书中是指高于起始分子的改善。
必要时，可将本发明中使用的抗体缀合至一个或多个效应分子。应理解，效应分子可包括单个效应分子，或连接以形成可连接至本发明的抗体的单个部分的两个或更多个这样的分子。当期望获得连接至效应分子的抗体片段时，这可通过标准化学或重组DNA法来制备，其中将抗体片段直接地或通过偶联剂连接至效应分子。用于将这样的效应分子缀合至抗体的技术在本领域是公知的(参见，Hellstrom等人,Controlled Drug Delivery,第2版,Robinson等人,eds.,1987,pp.623-53;Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人,1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。特定的化学方法包括例如WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476和WO03031581中描述的方法。或者，当效应分子是蛋白质或多肽时，可使用重组DNA法，例如WO86/01533和EP0392745中描述的方法来实现连接。
如本文中所用，术语效应分子包括例如生物活性蛋白，例如酶、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段、放射性核素，特别是放射性碘、放射性同位素、螯合的金属、纳米颗粒和受体基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱学检测的化合物。
其它效应分子可包括螯合的放射性核素例如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物例如但不限于烷基磷酸胆碱、DNA拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和舒拉明。
其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。目标酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。目标蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织型纤溶酶原激活物、血栓形成剂或抗-血管生成剂例如血管他丁或内皮他丁，或生物应答调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。
其它效应分子可包括用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)和非放射性顺磁性金属离子。关于可被缀合至抗体以用作诊断剂的金属离子，通常参见美国专利号4,741,900。适当的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；适当的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；适当的发光材料包括鲁米诺；适当的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及适当的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一个实例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期和/或减小抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫系统的递送。该类型的适当的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物例如WO05/117984中描述的那些化合物。
当效应分子为聚合物时，其通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚链烯基或聚氧化烯基聚合物或分支或未分枝多糖例如同多糖或异多糖。
可存在于上述合成聚合物上的具体的任选的取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
如本文中所用，“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应性基团例如马来酰亚胺等。可将反应性基团直接或通过接头区段连接至聚合物。应理解，这样的基团的残基在一些情况下形成作为抗体片段与聚合物之间的连接基团的产物的部分。
聚合物的大小可按需变化，但通常在500Da至50000Da，例如5000至40000Da，例如20000至40000Da的平均分子量范围内。可以特别地基于产物的期望用途例如定位至某些组织例如肿瘤或延长循环半衰期的能力选择聚合物大小(关于综述，参见Chapman,2002,AdvancedDrug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当期望产物离开循环并渗入组织，例如用于治疗肿瘤时，可有利地使用小分子量例如具有约5000Da的分子量的聚合物。关于其中产物保留在循环中的应用，可有利地使用更高分子量例如具有在20000Da至40000Da的范围内的分子量的聚合物。
适当的聚合物包括聚烷基聚合物，例如聚(乙二醇)或，特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，特别是具有在约15000Da至约40000Da的范围内的分子量。
在一个实例中，可将用于本发明的抗体连接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体实例中，抗体是抗体片段，并且可通过位于抗体片段中的任何可获得的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基连接PEG分子。这样的氨基酸可天然地存在于抗体片段中，或可使用重组DNA法将其工程化入片段(参见例如，US5,219,996;US5,667,425;WO98/25971,WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是修饰的Fab片段，其中将修饰添加至其重链的C末端上的一个或多个氨基酸以允许效应分子的连接。适当地，另外的氨基酸形成包含一个或多个可将效应分子与其连接的半胱氨酸残基的修饰的铰链区。多个位点可用于连接两个或更多个PEG分子。
适当地可通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫基共价地连接PEG分子。可将连接至修饰的抗体片段的每一个聚合物分子共价地连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价连接通常是二硫键，或具体地，硫-碳键。当巯基用作适当地活化的效应分子的连接点时，可使用例如巯基选择性衍生物例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可在上述聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料。活化的聚合物可以是任意聚合物，所述聚合物包含巯基反应性基团例如α-卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物。这样的起始材料可商购获得(例如来自Nektar,以前称为Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可使用常规化学方法从商购可得的起始材料制备而来。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可从Nektar,formerly Shearwater;RappPolymere;和SunBio获得)和M-PEG-SPA(可从Nektar,以前称为Shearwater获得)。
在一个实施方案中，抗体是被PEG化的，即具有例如按照EP0948544或EP1090037中公开的方法共价地连接至其的PEG(聚(乙二醇))的修饰的Fab片段或diFab[也参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and BiomedicalApplications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds),American Chemical Society,Washington DC and"Bioconjugation Protein Coupling Techniquesfor the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam和A.Dent,GrovePublishers,New York;Chapman,A.2002,Advanced Drug DeliveryReviews2002,54:531-545]。在一个实例中，PEG被连接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价地连接至修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基。可将赖氨酸残基共价地连接至马来酰亚胺基和将赖氨酸残基上的每一个胺基连接至具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。连接至Fab片段的PEG的总分子量从而可以为约40,000Da。
具体的PEG分子包括N,N’-双(甲氧基丙基(乙二醇)MW20,000)的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙基酰胺修饰的赖氨酸，也称为PEG2MAL40K(可获自Nektar，先前称为Shearwater)。
PEG接头的可选择来源包括NOF，其提供GL2-400MA2(其中结构中的m小于5)和GL2-400MA(其中m是2)并且n为约450；
即每一个PEG为约20,000Da。
下列类型的其它可选择的PEG效应分子：
可获自Dr Reddy,NOF和Jenkem。
在一个实施方案中，提供了通过链中的氨基酸226(例如重链的氨基酸226(按照序列编号))上或其附近的半胱氨酸残基连接的被PEG化(例如利用本文中描述的PEG)的抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的一个特定抗体具有下列性质：
本发明还提供了组合物，例如本文中定义的抗体或抗体的组合的药物组合物。
本发明还提供了包含至少两种根据本发明的抗体的组合物，例如其中其中的至少一种抗体特异于TcdA并且其中的至少一种抗体特异于TcdB，或可选择地至少两种抗体特异于TcdA或至少两种抗体特异于TcdB。
在一个实施方案中，提供了包含多种特异于TcdA的抗体和任选地一种或多种特异于TcdB的抗体的组合物。
在一个实施方案中，提供了包含多种特异于TcdB的抗体和任选地一种或多种特异于TcdA的抗体的组合物。
因此，在一个实施方案中，提供了包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种根据本发明的抗体，即不同的抗体的组合物。
本发明描述了一种包含3种Mab的具体混合物，所述Mab的一种特异于TcdA并且所述Mab的两种特异于TcdB。该混合物显示极高水平的使仓鼠免受致死感染性口服剂量的艰难梭菌引起的死亡和肠炎症的保护作用。
具体地，提供了包含一种抗-TcdA抗体(包含具有SEQ ID NO:49中显示的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:47中显示的轻链可变区)和两种抗-TcdB(第一种具有SEQ ID NO:129显示的重链可变区和SEQ ID NO:127中显示的轻链可变区，第二种具有SEQ ID NO:159中显示的重链可变区和SEQ ID NO:157中显示的轻链可变区)的组合的组合物。
在一个实施方案中，其中组合物包含3种抗体，例如一种抗-TcdA和两种抗-TcdB抗体，所述抗体以分别为其总抗体含量的50%、25%和25%的比率存在。
在一个实施方案中，提供了包含特异于2、3、4或5个特异于TcdA的抗体和任选地1、2、3、4或5种特异于TcdB的抗体的组合物。
在一个实施方案中，根据本发明提供的组合物已被良好地定义，例如为单克隆抗体的混合物而不只是来源于免疫的的宿主或具有免疫活性的宿主的多克隆组合物。
在一个实施方案中，抗体的组合物具有200ng/ml或更少，例如150ng/ml或更少，例如100ng/ml或更少，例如0.1至10ng/ml的EC50。
有利地，本文中描述的抗体具有极高水平的生物物理稳定性，从而适合包含在抗体的混合物中。
在一个方面，根据本发明的药物制剂或组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可额外地包含液体例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质可存在于这样的组合物中。这样的载体使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂和栓剂，以被患者摄入。
用于施用的适当形式包括适合用于例如通过注射或输注(例如通过单次快速静脉注射或连续输注)胃肠外施用的形式。当产品用于注射或输注时，其可采用油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且其可包含配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可以以无水形式存在，以在使用前利用适当的无菌液体重建。
配制后，可将本发明的组合物直接施用至受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物可被改造来适合给人受试者施用。
适当地在根据本公开内容的制剂中，最终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值不相似，例如如果制剂的pH为7，则为8-9或更高的pI可以是适当的。虽然不希望受理论束缚，但认为这可最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保持在溶液中。
在一个实施方案中，本公开内容的组合物或制剂包含1-200mg/mL的抗体，这就是说组合的抗体含量，例如150mg/mL或更少，例如100mg/mL或更少，具体地90、80、70、60、50、40、30、20、10mg/mL或更少。
在一个实施方案中，本公开内容的组合物或制剂包含其中各20mg/mL的每一种抗体。
在一个实施方案中，提供了制剂，所述制剂包含：
33mg/mL或更少的一种包含具有SEQ ID NO:49中所示序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:47所示的序列的轻链可变区的抗-TcdA抗体，和
28mg/mL或更少的具有SEQ ID NO:129显示的重链可变区和SEQ ID NO:127显示的轻链可变区的第一抗-TcdB抗体，和
25mg/mL的具有SEQ ID NO:159显示的重链可变区和SEQ IDNO:157显示的轻链可变区的第二抗-TcdB抗体。
在一个实施方案中，pH在4.0至7.0的范围内的药物制剂包含：1至200mg/mL的根据本公开内容的抗体、1至100mM的缓冲剂、0.001至1%的表面活性剂，
a)10至500mM的稳定剂，
b)5至500mM的张度剂，或
c)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张度剂。
在一个实施方案中，根据本公开内容的组合物或制剂包含缓冲剂液磷酸盐缓冲盐水。
例如，具有约pH6的制剂可包含1至50mg/mL的抗体、20mM L-盐酸组氨酸、240mM海藻糖和0.02%的聚山梨醇20。或者，具有约pH5.5的制剂可包含1至50mg/mL的抗体、20mM柠檬酸盐缓冲液、240mM蔗糖、20mM精氨酸和0.02%的聚山梨醇20。
本发明的药物组合物可通过许多途径来施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心室内、经真皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。皮下注射器也可用于施用本发明的药物组合物。通常地，可将治疗性组合物配制为可注射液体溶液或悬浮液。还可制备在注射之前适合用于在液体媒介物中配制成溶液或悬浮液的固体形式。
组合物的直接递送通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来实现，或被递送至组织的细胞间隙。
还可通过例如用于吞咽的封装的口服剂量，通过鼻胃管至胃或回肠，通过直肠管或灌肠溶液或通过直肠胶囊将组合物施用至伤口或直接施用至胃肠道中。剂量处理可以是单剂量方案或多剂量方案。
应理解，组合物中的活性成分可为抗体分子。这样，其易于在胃肠道中降解。因此，如果将通过使用胃肠道的途径施用组合物，则组合物需要包含试剂，所述试剂保护抗体免受降解，但一旦其已从胃肠道吸收就释放抗体。
药学上可接受的载体的详尽论述可在《雷氏药学大全》(MackPublishing Company,N.J.1991)中获得。
本发明还提供了如本文中描述的抗体或抗体组合或包含所述抗体或抗体组合的组合物，其用于治疗，例如用于治疗或预防艰难梭菌感染或与所述感染相关的并发症例如腹泻、结肠炎特别是假膜性结肠炎、胃气胀、腹痛和中毒性巨结肠。
预防还可通过施用预形成的灭活的毒素抗原(类毒素)与抗体的复合物(以产生疫苗)来实现。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体、其组合和包含所述抗体的组合物适合用于治疗艰难梭菌的所谓超级菌株(即超毒力菌株例如核糖型027)的感染。
根据本发明的抗体和组合物适合用于治疗或预防相关艰难梭菌毒素在原发感染过程中的急性和/或慢性作用。
根据本发明的抗体和组合物适合用于治疗或预防相关艰难梭菌毒素在继发感染或再感染过程中的作用。国际指南(Internationalguidelines)确立原发感染后的时间间隔，这从而将继发(或回归)感染定义为与现有症状的持续不同(有时描述为复发)(29)。研究已显示继发感染可以是与原发感染相同的菌株或核糖型的结果。在这样的情况下，回归感染而非复发依赖于达成的时间约束。然而，研究还显示继发感染还可以是与原发感染的菌株或核糖型不同的菌株或核糖型的感染的结果。在一个研究中，48%的疾病回归是与已引起第一感染的菌株不同的第二菌株的结果(30)。在另一个研究中，超过56%的疾病回归是与引起第一感染的菌株不同的第二菌株的结果(31)。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体、其组合和包含所述抗体的组合物适合用于防止损伤，例如对结肠上皮的长期结构损伤。
在一个实施方案中，抗体、组合和组合物适合用于防止艰难梭菌感染，包括感染特别是医院内感染的回归。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体、其组合和包含所述抗体的组合物适合用于减小艰难梭菌感染回归的风险。
有利地，可预防性施用本公开内容的抗体以防止感染或再感染，因为在抗体所特异于毒素不存在的情况下，抗体只是被从身体清除而不引起不利的与受试者身体组织的相互作用。
有利地，本公开内容的抗体似乎在施用后引发快速反应，例如在1或2天的施用内，激起目标毒素的快速清除，这可阻止重要器官例如肺、心脏和肾被损伤。这是第一次可获得可用于在急性艰难梭菌感染期防止毒素A和/或B对患者的损害或损伤的试剂。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体、其组合和包含所述抗体的组合物适合用于防止对重要器官的损害。
在一个实施方案中，本文中描述的抗体、组合或制剂适合用于防止被感染的患者死亡，如果在毒素已产生不可挽回的损伤之前在适当的时间施用的话。
本公开内容的抗体具有快速的结合速率，其促进体内快速作用。
在一个实施方案中，患者群体超过60岁，例如超过65岁。
在一个实施方案中，患者群体为5岁或更小。
可将根据本发明的抗体与抗生素治疗例如甲硝唑、万古霉素或非达米星组合使用。
一系列体外数据证明了Mab和Mab混合物的性质。我们显示3种Mab的一种混合物(50%摩尔当量的抗-TcdA和50%摩尔当量的抗-TcdB组分)能够保护仓鼠免受致死性CDI。
在一个实施方案中，提供了通过例如在艰难梭菌感染或与所述感染相关的并发症例如腹泻、结肠炎特别是假膜性结肠炎、胃气胀、腹痛和中毒性巨结肠的治疗或预防中，施用治疗有效量的本文中描述的抗体或抗体组合或包含所述抗体的组合物来治疗有此需要的患者的方法。
在一个实施方案中，通过常规途径例如皮下、腹膜内、静脉内或肌内施用抗体、组合或制剂。仓鼠中产生的实施例的数据表明通过该途径施用的剂量到达肠，从而能够产生治疗作用。
在一个实施方案中，通过口服(例如肠溶衣制剂)施用抗体、组合或制剂。
在一个实施方案中，提供了本文中描述的抗体、组合或制剂用于制造用于治疗或预防艰难梭菌感染的药物的用途。
在一个实施方案中，施用的剂量在1至1000mg/Kg，例如10至75mg/Kg例如20至50mg/Kg的范围内。
在一个实施方案中，抗体在小鼠和仓鼠中的体内半衰期在健康(未感染的)动物中在6至8天的范围内，从而预期具有在14-28天的范围内的人中的半衰期。
在一个实施方案中，仅以一个剂量提供抗体。
在一个实施方案中，以每周一个剂量或每两周一个剂量提供抗体。
在一个实施方案中，以每天一次的剂量提供抗体。
在一个实施方案中，提供了包含与一种或多种本文中定义的抗-TcdA抗体复合的TcdA或其免疫原性片段的复合物。复合物可在疫苗制剂中用作抗原，例如适合用于在给人施用后体内产生针对毒素A的保护性抗体。
在一个实施方案中，提供了包含与一种或多种本文中定义的抗-TcdB抗体复合的TcdB或其免疫原性片段的复合物。复合物可在疫苗制剂中用作抗原，例如适合用于在给人施用后体内产生针对毒素B的保护性抗体。
可被配制来产生适合本发明中使用的佐剂的Th1型免疫刺激物包括并且不限于下列物质。
在一个实施方案中，提供了包含TcdA或其免疫原性片段和TcdB或其免疫原性片段的复合物，其中将每一种毒素或片段与一种或多种特异于其的抗体复合，其中复合物适合用于作为疫苗制剂施用。
已知抗体:抗原复合物在Fc受体介导的过程中被免疫系统吸收(27,28)，并且抗体:抗原复合物的预形成的复合物已在人临床试验中被成功地用作疫苗(22)。
在一个或多个实施方案中，疫苗制剂还包含佐剂作为免疫刺激物。
单磷酰脂质A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)是用于本发明的优选Th1型免疫刺激物。3D-MPL是由Ribi Immunochem,Montana生产的公知佐剂。在化学上，其通常以3-脱-O-酰化单磷酰脂质A与4,5或6个酰化链的混合物提供。可通过GB2122204B中教导的方法纯化和制备，所述参考资料还公开了二磷酰脂质A及其3-O-脱酰基变体的制备。已描述了其它纯化和合成的脂多糖(US6,005,099和EP0729473B1;Hilgers等人,1986,Int.Arch.Allergy.Immunol.,79(4)：392-6;Hilgers等人,1987,Immunology,60(1)：141-6;和EP0549 074 B1)。3D-MPL的优选形式以具有直径小于0.2mm的小的颗粒尺寸的颗粒制剂的形式存在，其制造方法公开于EP0 689 454中。
根据本发明，皂苷也是优选的Th1免疫刺激物。皂苷是公知的佐剂并且教导于：Lacaille-Dubois,M和Wagner H.(1996.A review of thebiological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine第2卷，第363-386页)中。例如Quil A(来源于南美的树石碱木(QuillajaSaponaria Molina)的树皮)及其级分描述于US5,057,540和“Saponinsas vaccine adjuvants”,Kensil,C.R.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2)：1-55;和EP0 362 279B1中。溶血性皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化的级分)已被描述为有效的系统性佐剂，其生产方法描述于美国专利号5,057,540和EP0 362 279B1。这些文献中还描述了QS7(Quil-A的非溶血性级分)的使用，其用作系统性疫苗的有效佐剂。QS21的使用进一步描述于Kensil等人(1991.J.Immunology第146卷,431-437)中。QS21与聚山梨酯或环糊精的组合也是已知的(WO99/10008)。包含QuilA级分、例如QS21和QS7的颗粒佐剂系统描述于WO96/33739和WO96/11711中。一个这样的系统称为Iscorn并且可包含一种或多种皂苷。
另一种优选免疫刺激物是包含未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞苷-鸟苷二核苷酸基序的缩写。当通过系统性和粘膜途径施用时，CpG在本领域已知为佐剂(WO96/02555,EP468520,Davis等人,J.Immunol,1998,160(2)：870-876;McCluskie和Davis,J.Immunol.,1998,161(9)：4463-6)。历史上，观察到BCG的DNA级分可产生抗肿瘤作用。在其它研究中，已显示来源于BCG基因序列的合成寡核苷酸能够诱导免疫刺激性作用(在体外和体内)。这些研究的研究人员得出某些回文序列（包括中央CG基序）具有该活性。CG基序在免疫刺激中的作用后来在Krieg的出版物,Nature374,p5461995中进行了阐明。详细分析已显示CG基序必须存在于某些序列背景中，并且这样的序列在细菌DNA中是常见的但在脊椎动物DNA中是稀有的。免疫刺激性序列通常是：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序未被甲基化，但已知其它未甲基化的CpG序列是免疫刺激性的并且可用于本发明。
在6个核苷酸的某些组合中，存在回文序列。这些基序中的几个，作为一个基序的重复或不同基序的组合，可存在于相同的寡核苷酸中。这些含免疫刺激性序列的寡核苷酸的一个或多个的存在可活化各种免疫亚组，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素g并且具有溶细胞活性)和巨噬细胞(Wooldrige等人第89卷(no.8),1977)。其它不具有该共有序列的含未甲基化CpG的序列现也显示是免疫刺激性的。
当配制成疫苗时，通常将CpG与游离抗原一起在自由溶液中施用(WO96/02555;McCluskie和Davis,同上)或共价地缀合至抗原(WO98/16247)，或利用载体例如氢氧化铝来配制((肝炎表面抗原)，Davis等人(同上);Brazolot-Millan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,1998,95(26),15553-8)。
可将上述这样的免疫刺激物与载体例如脂质体、水包油乳剂和/或金属性盐包括铝盐(例如氢氧化铝)一起配制。例如，3D-MPL可用氢氧化铝(EP0 689 454)或水包油乳剂(WO95/17210)来配制；QS21可以有利地利用含胆固醇脂质体(WO96/33739)、水包油乳剂(WO95/17210)或明矾(WO98/15287)来配制；CpG可以利用明矾(Davis等人(同上);Brazolot-Millan(同上))或利用其它阳离子载体来配制。
免疫刺激物的组合也是优选的，特别是单磷酰脂质A与皂苷衍生物的组合(WO94/00153;WO95/17210;WO96/33739;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)，更特别是WO94/00153中公开的QS21与3D-MPL的组合。或者，CpG+皂苷例如QS21的组合也形成用于本发明的有效佐剂。或者，可将皂苷配制在脂质体中或Iscorn中，以及与免疫刺激性寡核苷酸组合。
因此，适当的佐剂系统包括例如单磷酰脂质A，优选3D-MPL与铝盐的组合。
因此在一个实施方案中，佐剂是QS21与3D-MPL在水包油或脂质体制剂中的组合。
增强的系统包括单磷酰脂质A与皂苷衍生物的组合，特别是QS21和3D-MPL的组合(如WO94/00153中公开的)，或其中QS21在含胆固醇脂质体(DQ)中被淬灭的不太具有反应原性的组合物，如WO96/33739中公开的。该组合可额外地包含免疫刺激性寡核苷酸。
在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂描述于WO95/17210中，并且是用于本发明的另一种优选制剂。
另一种优选制剂单独地或与铝盐一起地包含CpG寡核苷酸。
在本发明的其它方面，提供了制造本文中描述的疫苗制剂的方法，其中所述方法包括将根据本发明的多肽与适当的佐剂混合。
用于根据本发明的制剂的特别适合的佐剂组合如下：
i)3D-MPL+QS21，在脂质体中
ii)铝+3D-MPL
iii)铝+脂质体中的QS21+3D-MPL
iv)铝+CpG
v)3D-MPL+QS21+水包油乳剂
vi)CpG
如本文中所用，本说明书的上下文中的术语“包含”应当被解释为“包括”。
当技术上恰当时，可组合实施方案与参数选择。
本文中的公开内容描述了包含某些整体的实施方案。本公开内容还扩展至由所述整体组成或基本上由所述整体组成的相同实施方案。
图
图1-10显示各种抗体和片段序列。
图11显示TcdA和TcdB的血清滴度。
图12显示单个Mab的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图13显示单一和成对Mab的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图14-15显示成对的Mab的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图16-18显示3种Mab的混合物的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图19-20显示4和5种Mab的混合物的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图21-22显示在不同TcdA浓度单一和成对Mab的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图23-24显示在不同TcdA浓度单一Mab和达到5种Mab的混合物的抗TcdA(核糖型003)体外中和数据。
图25-26显示单一Mab的抗TcdB(核糖型003)体外中和数据。
图27-30显示成对Mab的抗TcdB(核糖型003)体外中和数据。
图31-33显示3种Mab的混合物的抗TcdB(核糖型003)体外中和数据。
图34-40显示在不同毒素浓度两种Mab的混合物的抗TcdB(核糖型003)体外中和数据。
图41-45显示在不同毒素浓度不同相对Mab比率的两种Mab混合物的抗TcdB(核糖型003)体外中和数据。
图46-59显示单一抗体和成对抗体的TcdB中和数据。
图60显示TcdA的氨基酸序列。
图61显示TcdB的氨基酸序列。
图62显示以直方图形式表示的TcdA的TEER测定数据。
图62A显示以线图形式表示的TcdA的TEER测定数据。
图63显示抗体997、1125和1151的组合的meier-kaplan曲线，高浓度为50mg/Kg，低浓度为5mg/Kg。
50mg/kg的剂量至第11天产生100%的保护作用，至第28天产生～82%的保护作用。
5mg/kg的剂量导致非持久的且不完全保护作用。
图64显示万古霉素和媒介物处理的仓鼠的体重变化。
图65显示低剂量抗体5mg/Kg和高剂量抗体50mg/Kg的体重。
图66显示其中接受利用根据本公开内容的抗体的处理的动物相对于对照的结肠的照片。
图67-68显示涡旋对抗体稳定性的作用。
图69显示不同抗体的聚集稳定性的比较。
图70-73显示不同核糖型的TcdA的中和。
实施例
抗体的产生
一系列不同的免疫原和筛选试剂购自或产生自常规大肠杆菌表达技术，以提供多种多样的广泛的免疫反应和帮助单克隆抗体(表1中列出的)的鉴定和表征。在其中产生重组蛋白或肽的情况下，序列基于核糖型027。来自核糖型027的TcdA的序列示于SEQ ID NO:171(Uniprot登录号C9YJ37)中，给出的核糖型027的TcdB的序列为SEQ ID NO:172(Uniprot登录C9YJ35)。
利用定位至对于TcdA和TdcdB全长毒素是共同的区域的合成肽、甲醛灭活的类毒素A、毒素A的结合结构域片段(CROPs1、2、3或CROPs4、5、6)或毒素B的结合结构域(CROPs1、2、3、4)或在一些情况下上述毒素的组合来免疫斯普拉-道来大鼠和半垂耳兔。在2至6次免疫后，杀死动物，收集PBMC、脾和骨髓。通过ELISA监控血清对毒素A结构域、毒素B结构域、毒素或类毒素的结合。2个这样的免疫的血清滴度示于图11中。
UCB SLAM用作产生单克隆抗体的工具。直接从免疫的动物培养B细胞(Zubler等人,1985)。该步骤使得能够采集大百分比的B细胞库。通过整合选择的淋巴细胞抗体法(SLAM)(Babcook等人,1996)，可能使阳性培养孔讯号去卷积(deconvolute)并且鉴定抗原特异性抗体分泌性细胞。此处我们使用SLAM(UCB SLAM(Tickle等人2009))的改进形式，该形式利用基于荧光的方法来从培养孔鉴定抗原特异性B细胞。建立B细胞培养物，首先在基于珠粒的测定中，使用Applied Biosystem8200细胞检测系统筛选上清液的结合相关纯化的毒素结构域的能力(结合、转运或催化)。这是使用包含IgG的B细胞培养上清液、涂覆至链霉抗生物素珠粒上的生物素化毒素结构域和山羊抗大鼠/兔Fc-Cy5缀合物进行的均相测定。来自该测定的对于对TcdA或TcdB组分的结合是阳性的细胞培养物被选择用于基于细胞的功能测定来鉴定毒素诱导的细胞毒性的中和剂。在初步结合筛选中从总共40x50-板实验鉴定了约12,000个毒素特特异性阳性物。这等同于大约5亿个B细胞的筛选。在逆转录(RT)-PCR后，从通过显微操作从约100个毒素中和孔收获的单细胞分离重链和轻链可变区基因对。随后将这些V区基因克隆为用于大鼠可变区的小鼠IgG1/κ全长抗体和用于兔可变区的兔IgG/κ全长抗体。在HEK-293瞬时表达系统中再表达抗体。随后再测试这些重组抗体的在基于细胞的测定中中和毒素的能力。重组抗体也通过BIAcore筛选来测定对于给定的毒素结构域的亲和力，以及还测定抗体对毒素的特异性和结合事件的大致数目。基于细胞的测定中的体外活性，选择先导候选物(lead candidate)来进行人源化。除非另外声明，否则本文中的所有数据都使用人源化抗体来产生。
产生了一组重组大肠杆菌产生的毒素片段(TcdA)、艰难梭菌来源的毒素或类毒素(A)和合成肽(B)，或购自商业来源。
表1.用于筛选和免疫的毒素A(TcdA)序列相关试剂。
片段 残基编号 来源
TcdA催化 M1-E659 UCB大肠杆菌表达
TcdA迁移 K577-D1350 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROPS123(TcdA123) S1827-D2249 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROPS456(TcdA456) G2205-R2608 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP1 S1827-N1978 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP2 G1966-N2133 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP3 G2100-D2249 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP4 G2213-N2381 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP5 G2328-N2494 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP6 G2462-N2609 UCB大肠杆菌表达
TcdA CROP7 R2554-D2701 UCB大肠杆菌表达
TcdB催化 M1-A593 UCB大肠杆菌表达
TcdB迁移 R576-D1349 UCB大肠杆菌表达
TcdB结合(TcdB1234) S1833-E2366 UCB大肠杆菌表达
TcdB CROP1 S1833-S1981 UCB大肠杆菌表达
TcdB CROP2 G1968-D2113 UCB大肠杆菌表达
TcdB CROP3 G2100-E2247 UCB大肠杆菌表达
TcdB CROP4 G2234-E2366 UCB大肠杆菌表达
毒素A 全长 购买的
毒素B 全长 购买的
类毒素A 全长 购买的
表2.用于筛选和免疫的毒素B(TcdB)序列相关试剂。
毒素结构域 氨基酸序列
催化 SPVEKNLHFVWIGGEVSD              SEQ ID NO: 173
催化 NLAAASDIVRL                     SEQ ID NO: 174
催化 CGGVYLDVDMLPGIH                 SEQ ID NO: 175
催化 CGGVYLDVDMLPGIHSDLFK            SEQ ID NO: 176
催化 CWEMIKLEAIMKYK                  SEQ ID NO: 177
催化 CTNLVIEQVKNR                    SEQ ID NO: 178
催化 PEARSTISLSGP                    SEQ ID NO: 179
催化 CSNLIVKQIENR                    SEQ ID NO: 180
催化 TEQEINSLWSFDQA                  SEQ ID NO: 181
催化 TEQEINSLWSFDPEARSTISLSGPC       SEQ ID NO: 182
转运 NVEETYPGKLLLC                   SEQ ID NO: 183
转运 Acetyl-CANQYEVRINSEGR           SEQ ID NO: 184
转运 VNTLNAAFFIQSLIC                 SEQ ID NO: 185
转运 YAQLFSTGLNTIC                   SEQ ID NO: 186
转运 CAGISAGIPSLVNNEL                SEQ ID NO: 187
转运 DDLVISEIDFNNNSIC                SEQ ID NO: 188
转运 MEGGSGHTVT                      SEQ ID NO: 189
转运 AVNDTINVLPTITEGIPIVSTILDGI      SEQ ID NO: 190
NLGAAIKEL
结合 CGFEYFAPANTDANNIEGQA                  SEQ ID NO: 191
结合 CGYKYFAPANTVNDNIYGQA                  SEQ ID NO: 192
结合 CKYYFNTNTAEA                          SEQ ID NO: 193
结合 CKYYFDEDTAEA                          SEQ ID NO: 194
艰难梭菌抗-毒素Mab的表达和纯化
将单独的轻链和重链哺乳动物表达质粒以等摩尔组合，用于转染HEK-293或CHO-S细胞。对于小规模表达研究，使用lipofectamine和HEK-293细胞，而对于更大批的IgG的产生，至CHO-S内的电穿孔是优选的。
将培养上清液加载至MabSelect SuRe柱(于PBS pH7.4中)上。利用100%0.1M的柠檬酸钠pH3.4缓冲液洗脱抗体。利用Tris.ClpH8.0将样品中和至pH7.4。通过PBS pH7.4中的Superdex200凝胶过滤柱除去聚集体。
表3
实施例1.纯化的Mab对TcdA活性的体外中和
在96孔聚苯乙烯板中运行所有中和筛选测定。测定使用在MEM+20%FCS,2mM Q和NEAA中生长和筛选的CACO-2细胞。除非另外声明，否则任何抗体组合以等摩尔比率存在。第1天：将细胞以每孔3000个于50μl培养基中涂板，温育24hr；第2天：将人源化Mab的纯化样品添加至96孔圆底聚苯乙烯无菌板；将毒素A以足以产生适当的致死剂量的浓度(即LD80或以上)掺入PP板，在37℃温育1hr；将50μl的该混合物添加至细胞板，温育96hr；在第5天：添加亚甲蓝(0.5%亚甲蓝，50%乙醇)；在室温温育1hr；利用1%N-十二烷基肌氨酸裂解细胞，在BIOTEK Synergy2板读数器上于405nm进行读数。结果示于图12至24中。显示的EC50和TcdA活性的最大中和百分比确认选择的抗体具有作为单一试剂的极高效力。这些抗体的2至5种的组合不提高最佳EC50或最大中和百分比。当与MabCA922、923、995、997和1000组合时任何协同作用的不存在是非常重要的观察，并且可归因于每一种抗体单独地具有特别高水平的亲和力和效力的事实。实施例5中的支持数据也显示一些Mab(例如CA997)能够结合TcdA亚结构域许多次。因此，这5种Mab似乎可能代表当靶向TcdA的C末端细胞结合结构域时可获得的最大亲和力、效力和效价。抗体在中和范围从LD80变化至大于LD95(LDmax)的极高毒素浓度时是有效的，但对于高水平的[TcdA]观察到EC50的一些适度的增加(即效力的减小)。这些数据也是令人惊讶的，因为其它数据已显示当测试升高的TcdA浓度时效力显著下降(20)。
此处描述的Mab(例如对于CA997)的高效力和亲和力并不仅仅归因于它们的高结合效价。其它研究(20和WO06/071877)描述了能够结合达到14次的抗-TcdA Mab。这些Mab仅具有在0.3至100nM的范围内的亲和力，并且显示不完全的抗TcdA介导的细胞杀伤的保护作用：单独地(26-63%的保护作用)或成对地(31-73%的保护作用)。因此已显示对TcdA的结合的高效价不一定激起对TcdA的结合的高亲和力或中和。未描述Mab CDA-1的对TcdA的结合的亲和力和效价(18和US7625559)。因此，本文中描述的Mab具有令人惊讶的亲和力、效力和效价。
表4单一TcdA浓度(LD80)时的抗TcdA1、2和3Mab组合
表5.不同TcdA浓度时的抗TcdA单一、成对和三个一组的Mab组合，其中TcdA在其LD80,LD90,LD95和LDmax。
实施例2.纯化的Mab的抗TcdB体外中和作用
测定法描述：
在96孔聚苯乙烯板中进行所有中和筛选测定。
测定使用在MEM+20%FCS,2mM Q和NEAA中生长和筛选的CACO-2细胞。除非另外声明，否则所有Ab组合以等比率存在。
·第1天：以每孔3000将细胞于50μl培养基中涂板，温育24hr
·第2天：将人源化Mab的纯化样品添加至96孔圆底聚苯乙烯无菌板中
·将毒素B批次#031掺入PP板，在37℃温育1hr
·将50μl的该混合物添加至细胞板中
·温育96hr
·第5天：添加亚甲蓝(0.5%亚甲蓝，50%乙醇)
·在室温温育1hr
·用1%N-十二烷基肌氨酸裂解细胞
·在BIOTEK Synergy2板计数器上于405nm进行读数
图25至33中的数据显示：就百分比最大中和作用和活性(EC50)而言，单独的单一Mab在中和TcdB上是相对无效的。然而，当将2种和3种抗体组合时，在百分比最大中和作用和活性(EC50)上观察到相当大的改善。1125和1151被选择作为最佳配对，尽管观察到其它良好配对：1125+1153、1125+1134。
最有效的Mab配对凭经验地选择，并且当考虑每一种Mab的单个效力时，并回顾地发现产生预料之外的令人惊讶的组合。例如，在表6中，仅CA927具有可导致确定的EC50的TcdB中和效力，然而CA1125和CA1151的TcdB中和效力在这些测定条件下都不足以导致确定的EC50。然而，发现CA927不是组合内使用的最有效的Mab。最佳的含CA927的组合具有13.5ng/ml的EC50，然而其它两种Mab组合具有低至2.59和4.71ng/ml的EC50。在另一个实例中，在表8中，CA1099在使用的测定条件下具有最低TcdB中和EC50。然而，发现CA1099不是组合中使用的最有效Mab。最佳的含CA1099组合具有6ng/ml的EC50，然而其它两种Mab组合具有低至2和1ng/ml的EC50。我们可推测最有效的Mab配对通过它们的协同结合方式来确定，特别是如通过具有非重叠表位来确定。
表6.抗-TcdB Mab组合和在恒定毒素浓度时的相对Mab比率
样品 最终Mab浓度ng/ml EC50(ng/ml)
1125.g2 1000 >1000
1134.g5 1000 >1000
927.g2 1000 12.89
1153.g8 1000 >1000
1102.g4 1000 >1000
927+1099 1000 >1000
927+1102 1000 >1000
927+1114 1000 >111.111
927+1125 1000 13.55
927+1134 1000 51.58
1099+1114 1000 >1000
1102+1114 1000 >333.333
1102+1125 1000 15.51
1114+1134 1000 19.70
1114+1151 1000 25.69
1114+1153 1000 27.48
1125+1134 1000 2.59
1125+1151 1000 4.71
1125+1153 1000 21.23
1125+1134+1114 1000 3.77
1125+1134+927 1000 2.63
1125+1151+1114 1000 4.90
1125+1151+927 1000 5.69
1125.g2+1134.g5+927.g2 1000 5.83
1125.g2+1134.g5+1153.g8 1000 9.89
1125.g2+1134.g5+1102.g4 1000 2.72
实施例3.纯化的Mab的组合对TcdB的中和作用
在96孔聚苯乙烯板中进行所有中和筛选测定。
测定使用在MEM+20%FCS,2mM Q和NEAA中生长和筛选的CACO-2细胞。
·第1天：以每孔3000将细胞于50μl培养基中涂板，温育24hr
·第2天：将人源化Mab的纯化样品添加至96孔圆底聚苯乙烯无菌板中
·将毒素B(VPI10463)掺入PP板，在37℃温育1hr
·将50μl的该混合物添加至细胞板中
·温育72hr
·第5天：添加亚甲蓝(0.5%亚甲蓝，50%ETOH)
·在室温温育1hr
·用1%N-十二烷基肌氨酸裂解细胞
·在BIOTEK Synergy2板计数器上于405nm进行读数
结果示于图34至45。
这些数据显示在一系列毒素浓度时中和TcdB的最佳Mab配对是CA1125和CA1151。此外，1125+1151组合大体上不受相对摩尔比率的变化影响，这与1125+1153相反。
表7.抗-TcdB Mab组合和在3个不同的毒素浓度时的相对Mab比率
数据显示甚至最具有活性的特异性配对的组合具有令人惊讶地和不可预测地彼此相对不同的性质。等摩尔比率的CA1125与CA1151的优选组合的EC50大体上不受递增的[TcdB]影响。测试的Mab的3个相对摩尔比率(即25:75相对于50:50相对于75:25)具有彼此极其相似的EC50，从而表明CA1125和CA1151特别地具有互补作用模式。这与CA1125与CA1134的组合相反，在所述CA1125与CA1134的组合中，对于更高[TcdB]，EC50的增加(即效力的减少)更显著，并且其中3个Mab摩尔比率效力不同：25:75的CA1125:CA1134比率的效力明显低于50:50和75:25。这表明CA1125+CA1134的组合效力更加依赖于CA1125组分。CA1125与CA1153的所有3个摩尔组合的EC50基本上不受递增的[TcdB]影响，从而表明CA1153是不太适合的与CA1125的组合的伴侣。总体上，这些数据显示CA1125和CA1151是特别有利的组合，因为最高效力在一系列Mab与TcdB的摩尔比率上得到维持。
表8.TcdB中和–在恒定毒素剂量(LD80)时的1种或2种抗-TcdB
抗体 IC50(ng/ml)
1099 2
1102 N/A
1114 103
1125 N/A
1134 8
1151 182
1153 260
926 N/A
927 N/A
1099+1125 6
1114+1125 7
1151+1125 2
1134+1125 1
1102+1125 6
1125+1153 12
926+1125 42
927+1125 4
表9.TcdB中和–在不同TcdB剂量时的1种或2种抗-TcdB Mab
这些数据显示Mab的组合，特别是CA1125与CA1151的组合，改善了效力(如通过EC50测量的，还有如通过百分比最大保护作用测量的)。百分比最大保护作用在本测定法中具有特别的相关性，因为将Mab:TcdB混合物与细胞一起温育了很长时间(72h)。因为TcdB在2-4小时内在pg/ml的范围内对于Caco-2细胞是有毒的，该测量可被认为是非常难的Mab中和能力的测试，并且可在它们的结合动力学或模式方面反映Mab混合物的能力。继而，当大量TcdB可在组织内存在许多小时时，这可反映Mab混合物在建立的感染过程中保护免受TcdB的作用的能力。
在图46-59中进一步显示了来自表6-9的选择的数据。
实施例4.Mab对TcdB亚结构域的结合的效价
可在Biacore3000(GE Healthcare)上通过表面等离子体共振(SPR)来测定抗-艰难梭菌TcdB抗体对TcdB1234的结合事件的摩尔数。通过胺偶联将链霉抗生物素蛋白固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上至～4000RU的水平，生物素化的TcdB1234在500-600RU被结合。以10μl/min在该表面上方进行2次20μl的相同抗-TcdB抗体混合物(每一种抗体的终浓度为500nM)的注射，记录饱和结合反应。在每一轮后使用HCl再生表面。使用对仅有链霉抗生物素蛋白的参照流动池的反应来针对本底结合校正所有数据。
表10.TcdB1234上的IgG结合位点的数目的表面等离子体共振分析
相对于多个CA927平均反应来表达所有反应(表10的最后一列)，因为CA927似乎代表仅结合TcdB1234一次的Mab。
当结合至TcdB1234时，固定的CA1125不允许CA1125进一步结合，从而支持CA1125在TcdB1234上具有一个结合位点并且在该位点已被饱和后未能发现CA1125的其它结合位点的想法。然而，当TcdB1234已被CA1125饱和后，CA1151仍然可结合。这表明CA1151在作为被CA1125占据的位点的替代位点上结合。这些数据一起显示了CA1125是TcdB1234的单结合剂，然而1151IgG结合TcdB1234超过一次，最可能地2次。因此，CA1125与CA1151的混合物可结合TcdB1234大致3次。
所有抗体组合具有额外的结合反应，显示了在TcdB1234上存在2个或更多个被这些组合结合的非竞争性位点。
实施例5.Mab对TcdA亚结构域的结合的效价
在Biacore3000(GE Healthcare)上通过表面等离子体共振(SPR)测定抗-艰难梭菌TcdA抗体对TcdA123和A456的结合事件的摩尔数。通过胺偶联将链霉抗生物素蛋白固定在CM5传感器芯片(GEHealthcare)上至～4000RU的水平，以及将生物素化的TcdA123结合至一个流动池，将TcdA456结合至不同流动池至～500RU的反应。以10μl/min在两个流动池上方进行2次30μl的1μM的相同抗-TcdA抗体的注射，记录饱和结合反应。在每一轮后，使用HCl再生表面。使用对仅有链霉抗生物素蛋白的参照流动池的反应来针对本底结合校正所有数据。
表11.IgG对固定的TcdA123和TcdA456的结合反应的SPR分析
抗体CA997和CA1000以6个CA997对1个CA1000的比率结合TcdA123，然而它们以3个CA997对1个CA1000的比率结合TcdA456(表2)。
就分子量和固定的毒素水平进行了修正的CA997针对TcdA123与针对TcdA456的最大抗体反应相似。这表明CA997结合TcdA4566次并且CA1000结合TcdA4562次。因此抗体CA997可能结合完整TcdA毒素(TcdA)约12次。
总体上CA997结合A1236次或更多次，结合A4566次或更多次，然而CA1000结合A123至少1次，结合A4562次。
增加的对TcdA和TcdB结合的效价可具有两个重要的体内作用。第一个作用是能够结合TcdB超过一次的任何Mab或Mab混合物将具有增加的形成毒素间结合事件和从而免疫沉淀的潜能。免疫沉淀可通过降低毒素的溶解性和形成非常大的大分子复合物（这从而降低毒素的有效工作浓度）来提供效力。这样的大的蛋白质复合物可被驻留在组织中的巨噬细胞和单核细胞吸收并且可能促成增强的宿主免疫应答。具有Fc片段的抗原:抗体复合物已明确地显示能够引发抗肠病原体的宿主免疫反应(21)。同样地，可溶性抗原:抗体复合物已在人临床试验中被成功地用作抗病原体疫苗(22)。此外，利用具有Fc的IgG对毒素的免疫修饰可促成通过肝和脾使用正常机制进行的免疫清除。一般而言，更高水平的抗原的Fc修饰导致更快更完全水平的消除(23)。极其重要地，每毒素2个或更多个Mab Fc结构域的存在，特别是每毒素3个Fc结构域的存在，可能可以代表毒素的极快速的和大量清除所需的Fc的临界数目(24)。抗-TcdA Mab CA997可能能够结合TcdA多至12次，CA1125与CA1151的组合可能能够结合TcdB3次。因此3种Mab的混合物极可能能够在体内提供这些类型的额外的效力机制。
实施例6.由TcdA引起的TEER的丢失的Mab中和
使用Becton-Dickinson(BD)Caco-2BioCoat HTS平板系统进行艰难梭菌单层完整性测定。
第1天–将Caco-2细胞以每孔2x105/ml于500μl基础接种培养基(由BD提供)中接种在插入板中。将35ml的基础接种培养基添加至进料盘。将细胞在37℃温育24小时。第2天–从插入板除去基础接种培养基，替换为Entero-STIM分化培养基(由BD提供)。每孔添加500μl，向进料盘中添加35ml。将细胞在37℃再温育72小时。第5天–以相对于待用于聚丙烯板中的测定孔的浓度的2倍的浓度制备的抗体和毒素A。将毒素A以125ng/ml的浓度添加至抗体，将板在37℃温育1hr。将1ml的Caco-2生长培养基(MEM+20%FCS,2mMQ,NEAA)添加至标准24孔TC板的每一个孔。将BioCoat插入板转移至24孔TC板。从插入板除去Entero-STIM培养基，替换为400μl的毒素:Ab混合物。
肠细胞之间的紧密连接的丧失是TcdA对细胞单层和肠组织切片的重要早期作用，并且是腹泻的主要原因。白蛋白和其它血清蛋白质随同伴随的血清液一起流失至肠腔中。已形成单层的分化的培养细胞的跨上皮电阻的丢失是抗TcdA的急性作用的保护作用的有用替代。显示的3种抗体具有良好水平的抗TEER丢失的保护作用，图62。令人瞩目和惊讶的是这些Mab在TEER测定中的能力不反映在毒素中和中看到的能力，如在细胞增殖测定中测量的。CA922在细胞增殖测定中具有最佳性能(EC50=1.21ng/ml)，然而这被在细胞增殖测定中具有小于10倍的效力的抗体(CA1000)远远超过(EC50=19.73ng/ml)。CA997在TEER测定中具有最佳性能，因为其具有高水平的保护作用并且在更低的Mab浓度上维持该保护作用。CA997具有很大的可能在第4小时时以达到80%的最大抑制和约80ng/ml的EC50中和TEER丢失。这些观察是预料之外的，因为所述Mab全都具有对于TcdA结构域的高亲和力(CA922～4pM、CA997～132pM、CA1000～73pM)。这些数据表明CA997和CA1000识别在TEER丢失中是重要的表位或通过与对其它Mab不同的机制中和TcdA。此外，由于CA1000据估计结合完全毒素2次(一次在TcdA123中以及一次在TcdA456中)，因此CA1000可确定TcdA细胞结合区域内的‘TEER决定性’表位，这可能对确定疫苗免疫原具有特殊价值。结果示于图62中。
实施例7.抗-艰难梭菌毒素抗体对于TcdA和TcdB的亚结构域:TcdA123、TcdA456和TcdB1234的亲和力
通过在BIAcore3000上使用CM5传感器芯片进行的表面等离子体共振测定抗-艰难梭菌TcdA和TcdB抗体的相互作用的动力学常数。
所有实验在25oC进行。通过胺偶联化学将特异性AffinipureF(ab’)2片段山羊抗-人IgG、Fc片段(Jackson ImmunoResearch)固定在CM5传感器芯片(GE)上至～7000反应单位(RU)的捕获水平。以10μL/min的流速将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4,0.15MNaCl,3mM EDTA,0.005%表面活性剂P20,Biacore AB)用作运行缓冲液。将10μL的1ug/ml或更低的每一种抗体通过注射用于利用固定的抗-人IgG、Fc进行的捕获。以30μL/min的流速，从12.5nM开始以二倍稀释在捕获的纯化的抗体上滴定TcdA123、TcdA456或TcdB1234。对于存在于培养上清液中的抗体，以30ul/min在抗体上通过单个浓度的12.5nM的TcdA123或TcdA456和50nM的TcdB1234。在n=2时计算动力学。以10uL/min的流速通过两次10μL的40mM HCl的注射和5μL的5mM NaOH的注射再生表面。
按照标准方法使用BIAevaluation软件(3.2版)分析扣除两倍参照本底的结合曲线。根据拟合算法测定动力学参数。
表12.抗-TcdA Mab亲和力和结合动力学
表13.抗-TcdB Mab亲和力和结合动力学
抗-TcdA亲和力相较于公开的其它Mab的亲和力特别高。我们证明低至4pM的亲和力是可实现的。优选的CA997具有132pM的亲和力，CA1125具有122pM的亲和力，CA115具有551pM的亲和力。CA995明确地显示其不结合CROPs A123，从而以令人惊讶和意外的方式显示此处显示的Mab具有彼此不同的性质。CA922、923、997和1000结合CROPs A123和A456至少一次。因此这4种Mab确认了每一种必须结合完全毒素至少2次。我们因技术限制而不能得出这些Mab对完全毒素的结合的亲和力。然而，鉴于针对抗-TcdA Mab显示的高亲和力和效价，可能推测抗完全毒素的功能性亲和力可能甚至比针对对毒素亚结构域的结合证明的所述功能性亲和力更强。抗-TcdBMab还显示达到低至31pM的强亲和力。具体地，CA1125、1151、927、1099、1134和1153显示超过由其它抗体显示的亲和力的亲和力。
实施例8.艰难梭菌抗-毒素人源化IgG1分子的生物物理学表征
分析的分子
抗-TcdA IgG1:
CA164_00922.g1
CA164_0923.g1
CA164_0995.g1
CA164_0997.g1
CA164_01000.g1
抗-TcdB IgG1
CA164_01125.g1
CA164_01125.g2
CA164_01134.g4
CA164_01134.g5
CA164_01134.g6
CA164_01102.g1
CA164_01102.g4
CA164_01151.g4
抗体组合需要由具有高水平稳定性的Mab组成以在长期贮存中减小聚集的潜在风险。热稳定性(Tm)用作一个量度。对于Mab混合物特别有价值的是测量它们对因物理应激例如搅拌或摇动而聚集的倾向性。聚集体是药物组合物的不想要的组分，因为它们可减少贮存期限，并且可在某些水平上对患者产生安全性风险。Tm数据显示所有5种抗-TcdA Mab具有高Tm稳定性，而3种(CA922、923和997)具有在79-81℃的范围内的极高Tm。在测试的抗-TcdB Mab中，除两个外全都具有极高的Tm。注意在仓鼠感染研究(实施例9)中测试的CA997、CA1125和CA1151具有极高的Tm(分别地79.2℃、79.3℃和80.8℃)，这使得它们适合用于Mab混合物。
在摇动聚集测定中，CA997和922具有最低的对5种抗-TcdA Mab的聚集的倾向性。类似地，CA115和1151具有最低的抗-TcdB Mab的聚集倾向性。因此，CA997、1125和1151作为Mab混合物的用途可具有特别的价值，因为它们更可能在共配制后保持活性，以及以高蛋白质浓度贮存。
利用毛细管IEF估计等电点(pI)
通过混合下列组分来制备样品：30ul的2mg/ml的蛋白质样品、0.35%的甲基纤维素、4%的pH3-10两性电解质(Pharmalyte)、合成的pI标准产品(4.65和9.77)、各1ul的原液和加HPLC级水至200ul的终体积。随后使用iCE280IEF分析仪(在1500V预聚焦1min，随后在3000V聚焦6min)分析混合物。随后使用Empower软件(来自Waters)整合校准的电泳图。
通过Thermofluor测定法测量的热稳定性(Tm)
本方法使用Sypro橙荧光染料监控蛋白质结构域的解折叠过程。染料结合作为解折叠的结果而变得暴露的暴露的疏水区域，这导致发射光谱的改变。
将样品(5ul，1mg/ml)与5ul的Sypro橙的原液(30x)混合，利用pH7.40的PBS使体积达到50ul。
将10ul的该溶液的等份添加至384孔板的孔中(n=4)。
将板置于包含用于精确温度控制的加热装置的7900HT快速实时PCR系统中。使温度从20℃升高至99℃(1.1℃/min的升降温速度)。CCD装置同时监控孔中的荧光变化。将算法用于处理强度数据并且将多重转变(multiple transitions)加以考虑。
通过搅拌对样品进行应激
在制备过程中，将抗体样品经历通过方法例如抽吸和过滤产生的机械应激。这可引起由于蛋白质对气-液界面和剪切力的暴露而引起的变性和随后聚集，从而导致生物活性的最终丢失。通过涡旋产生的应激是筛选抗体样品鲁棒性以用于预测聚集稳定性的方法。
将抗-TcdA和抗-TcdB IgG1分子经历通过搅拌，通过涡旋(在25℃,以1400rpm使用Eppendorf Thermomixer Comfort)产生的应激。样品大小为250uL(x3/样品)，在1.5mL圆锥形Eppendorf-式加帽的管(塑料)中，于PBS pH7.4中进行。使每一种样品达到1mg/ml的浓度(使用从序列计算的消光系数)，通过使用Varian Cary50-Bio分光光度计，在一定间隔（总共达到24小时）测量的340nm和/或595nm处的吸光度监控聚集。
结果：表14提供了针对抗-TcdA和抗-TcdB IgG1分子测量的pI和Tm数据的总结
表14.pI和Tm数据的汇编
*表示不可能辨别Fab和CH2结构域。
测量的pI
分子的测量的pI是高的(除CA164_01000.g1_P3外)并且远离配制缓冲液例如PBS,pH7.4和50m醋酸钠/125mM氯化钠，pH5的pH。这可表示可选择具有适合于两种或更多种Mab的共配制的pH的缓冲液。
通过Thermofluor测定法测量的热稳定性(Tm)
由于所有分子是IgG1，因此Fc结构域的Tm(Tm(CH2))相同。分子之间热稳定性的差异可通过Fab’结构域的Tm(Tm(Fab))来测定。
对于抗-TcdA分子，等级次序(首先是最稳定的)为CA922≥997>923>995>1000，对于抗-TcdB分子(首先是最稳定的)是CA1151.g4>1125.g1,g4>1134.g4>1134.g5≥1134.g6>1102.g1=1102.g4。
通过搅拌进行的样品的应激反应
测定不同抗体之间的不同聚集稳定性是可能的，图67显示通过涡旋对PH7.4的PBS中的不同抗-TcdA IgG1分子的搅拌的作用。
确定等级次序(首先最稳定聚合的)是可能的:CA922≥997>923≥995>1000。
图68显示通过涡旋对不同抗-TcdB分子的搅拌的作用。
确定聚集稳定性的等级顺序是可能的，以便CA1125移植物表现比CA1134分子更稳定，所述CA1134分子比CA1102分子更稳定。
进行了进一步研究以直接比较抗-TcdB分子(CA1151.g4)与更稳定的分子CA1125.g2(参见图2)和更加聚集稳定的抗-TcdA分子(CA922.g1和CA997.g1)的聚集稳定性。结果可见于图69中。
这4种Mab的其它结果也示于图67和68中。
对于抗-TcdA分子CA922.g1和CA977.g1，基于上述分析，CA922是优选的，尽管除CA1000外，所有分子可被当作用作治疗性IgG1的适当候选者。
对于抗-TcdB分子，可基于聚集稳定性和Tm将生物物理学特征归类在移植物的家族内，以便CA1125移植物潜在地证明更加稳定。CA1102移植物显示最差的Tm数据并且还显示最大的对通过应激(通过搅拌产生的)产生的聚集的倾向性。
使用CA1151.g4的研究显示该分子相较于CA11125.g2显示略微增加的聚集稳定性并且似乎等于TcdA分子(CA922.g1和CA997.g1)。所有4种分子都显示相等的Tm值。CA997、CA1125和CA1151显示极高水平的热稳定性和在搅拌后极低水平的聚集体形成。
实施例9.抗-艰难梭菌毒素Mab仓鼠感染研究
仓鼠感染研究由Ricerca Biosciences LLC,Cleveland,Ohio,USA来进行。研究方案由Ricerca IACUC委员会批准。在完成计划的28天的研究期之前，活性组分和对照组分(组成和剂量)对于Ricerca员工来说是未知的。
将Golden Syrian雄性仓鼠(体重82-103g，54日龄)单个地圈养在HEPA过滤的一次性笼子中，并且随意地喂食Teklad Global Diet2016和水。适应后，利用Mab混合物或PBS(媒介物对照)给仓鼠预给药(i.p.)，每天一次，进行4天：第-3、-2、-1和0天。研究了两个剂量的Mab：高剂量=各50mg/kg的抗-TcdA和抗-TcdB组分；低剂量=各5mg/kg的抗-TcdA和抗-TcdB组分。
测试的药物组合由下列组成：一种构成50%的注射蛋白的抗-TcdA抗体(CA997.g1)和共同构成50%的注射蛋白(但单独地构成25%的注射蛋白)的两种抗-TcdB抗体(CA1125.g2和CA1151.g4)。在刺激之前，利用50mg/kg的PBS中的克林霉素磷酸酯使仓鼠致敏(s.c.)(第-1天)，1天后(第0天)用3.4x106c.f.u.的来自菌株ATCC43596的营养细胞进行刺激。在第1、2、3、4、5天每天两次以5mg/kg施用(p.o.)万古霉素即进行5天。
每两天一次对动物进行存活性检查，将被发现濒死的动物无痛致死，并将其计数为死亡。在给药的每一天测定体重，随后每周2次测定体重直至对存活者者实施无痛致死术。对所有动物进行肉眼尸检。利用Kaplan和Meier的方法产生存活曲线。使用相较于P=0.005的Bonferroni修正的阈值的来自时序检验的P值分析存活曲线。分析不包括万古霉素处理的组。利用Prism v5.04进行所有统计检验。所有组包含11只动物，除包含5只动物的万古霉素对照组外。
存活曲线可见于图63中。接受PBS(对照)的仓鼠在第+2和+3天都死亡，然而接受5天万古霉素处理的组在第+10和+11天都死亡。接受高剂量的UCB Mab混合物的仓鼠直至第+11天都存活，此后直至28天的研究结束仅两只动物死亡。接受低剂量的UCB Mab混合物的仓鼠直至第+3天都存活，此后动物相当稳定地失去，直至第+16天，此时所有动物都死亡。当与在仓鼠中使用抗-毒素Mab的公开的数据(18)相比较时，本数据显示异常水平和持续时间的保护作用。这些体内数据支持中和和稳定性的极高水平的性能的体外观察。
在感染的急性期(第1-5天)期间死亡与体重之间不存在明显的关联性，图64-65。因此，可猜测仓鼠死于TcdA和TcdB的压倒性直接和间接作用。因中和Mab的部分保护作用(UCB低剂量)而活过急性期的仓鼠重量减轻，假定归因于肠损伤和改变的营养状况。值得注意的是许多因UCB高剂量Mab的保护作用而持续活过28天的研究期的仓鼠从体重减轻恢复并且事实上甚至体重增加。这可被当作UCB Mab使得肠正常发挥作用的优良保护作用的证据
表15.总体病理学评分
很清楚，UCB Mab能够保护大肠和小肠免受由TcdA和TcdB引起的血液渗出。
结果示于图63至66。
图66中的照片显示了由TcdA和TcdB引起的盲肠的膨胀和血液渗出(左图，PBS对照，动物在第2天死亡)的典型肉眼检测病理学和在利用UCB高剂量Mab的保护后充满粪便的正常盲肠(右图，UCB高剂量，动物存活至第28天)。这些数据显示在利用高剂量的UCB Mab保护后，大肠可恢复至正常形态和功能。
实施例10.纯化的Mab对来自不同核糖体分型的菌株的TcdA的中和作用
临床感染由多种不同的菌株引起。使用许多方法（其中核糖体分型是至关重要的）表征菌株差异。观察到不同的核糖型菌株具有不同的致病性、感染和芽孢形成性质。所有上文中显示的TcdA中和使用从称为VPI10463的菌株纯化的TcdA。然而，与暴发相关的优势侵袭性致病性菌株称为核糖型027。其它重要的核糖型包括078、001、106。已在由不同核糖型产生的毒素之间观察到氨基酸序列差异，因此重要的是Mab能够中和来自不同组的临床分离株的毒素。测试CA922、997和1000中和来自菌株027和078的TcdA的能力，将其与它们抗来自VPI10463的TcdA的能力相比较。在4个[TcdA]测试Mab，发现其能够中和所有毒素而在LD80、LD90和LD95无显著差异。
表16
表17
表18
实施例11.PK数据
在健康仓鼠中进行的人IgG1(20mg/kg)的PK研究。发现仓鼠PK具有与小鼠或大鼠中的Mab相似的半衰期(t1/2 6-8天)。i.p.和s.c.给药基本上相同。
在‘正常’(非感染的)golden Syrian仓鼠中研究了hIgG1Mab的药代动力学和至肠的分配。通过CARE Research LLC,Fort Collins,Colorado,USA将纯化的Mab施用至雄性仓鼠(120-135g)，利用UCBPharma测定样品。研究获得CARE IACUC委员会批准。8只动物各自接受单一剂量的20mg/kg的IgG1，4只i.p.给药，4只s.c.给药。在给药后1、3、8、24、48、72、103和168小时收集血液，分离血清，随后在-80℃贮存。还从两只未处理的仓鼠采集血液以提供测定对照。在无痛致死后，从每一只仓鼠的盲肠联接处向前切取2cm长的结肠。用洗涤缓冲液(50%(v/v)含50%(v/v)Sigma蛋白酶抑制剂混合物(P2714)的PBS)冲洗结肠片段，随后打开、分离并从下面的肌肉取出粘膜。将粘膜样品置于0.5ml的洗涤缓冲液中进行匀浆，直至目视均匀，在于湿冰上立即装运之前将其在4℃贮存。对于抗-人IgG1，利用山羊F(ab’)2抗-人IgG-Fcγ片段(Jackson109-006-098)于0.1M NaHCO3pH8.3中涂覆ELISA Nunc maxisorp96孔板，过夜，用PBS-Tween(PBS/0.1%(v/v)Tween20)洗涤板，随后用1.0%(w/v)的PBS中的BSA&0.1%(v/v)Tween封闭板。将血清样品在样品-缀合物缓冲液(1%(w/v)的PBS中的BSA,0.2%Tween)中进行稀释，洗涤后，利用样品-缀合物缓冲液中的山羊抗-人κ-HRP(Cambridge Bioscience2060-05)和2.5M H2SO4终止溶液中的TMB显色。
肠、粘膜和血清水平：
此后取出从在第168小时时间点上采集的血液收集的血清样品和结肠样品。
第168小时的20mg/kg IP
样品 ng/mL/cm粘膜 血清μg/mL
1001 23.2 75.0
1002 13.7 90.8
1003 21.8 70.5
1004 53.8 119.4
第168小时的20mg/kg SC
样品 ng/mL/cm粘膜 血清μg/mL
2001 41.4 108.7
2002 62.1 76.6
2003 35.6 163.7
2004 37.3 153.3
血清数据
数据也示于图70和71中。
还显示hIgG1可见于肠的‘削刮的碎屑’，即hIgG1进入健康肠的血管系统–从而在‘预防性给药’中可具有保护性。该作用在人中甚至更重大，因为它们具有同源hFcRn。
实施例12.具有艰难梭菌感染的仓鼠的血清水平
本研究是测定i.p.施用(下面详述的不同剂量)后Golden Syrian仓鼠中的CA725.0、CA726.0、CA997.g1CA1125.g2和CA01151.g4的血清浓度。
在胰蛋白酶消化后使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析定量人源化Mab。通过将以已知浓度掺入空白基质的真正的标准材料与用作内部标准的掺入的马肌红蛋白相比较来实现定量。
选择对于所有研究的人源化Mab是共同的独特(“裂解蛋白质(proteotypic)”)肽(DTLMISR，CH2区肽)，如所概述的使用胰蛋白酶消化样品和校准样品。在利用乙腈/Tris(2-羧乙基)膦变性/还原和利用碘乙酰(Sigma-Aldrich,Poole,UK)进行胺氨甲酰-甲基化之后，使用测序级的修饰的胰蛋白酶对5μl血清样品进行胰蛋白酶消化过夜。
LC-MS/MS系统由CTC HTS-x自动采样器(CTC Analytics,Zwingen,Switzerland)、Agilent1290LC系统(Agilent Technologies,Stockport,UK)和配备有以电喷雾模式操作的Turbo V离子源的Sciex5500QTrap MS系统(AB Sciex,Warrington,UK)组成。使用OnyxMonolithic C18柱(100x4.6mm,Phenomenex,Macclesfield,UK)，通过以1.5mL/min递送的2至95%(v/v)的水/乙腈(0.1%的甲酸)的梯度分离分析物，进行6分钟。注射体积为10μL；将所有洗脱剂引入质谱仪源。将质谱仪的源温度维持在600℃，并且将其它源参数(例如碰撞能、去簇电压、帘式气压等)最优化以获得对目标肽的最大敏感性。监控每一个目标裂解蛋白质的选择跃迁(selective transition)。
对于所有目标分析物，选择独特的(“裂解蛋白质”)肽；在胰蛋白酶消化后分析样品。
基于监控的肽计算的血浆浓度概述于下文中。
对于CA164_00997和CA164_01151，在MRM描迹(MRM trace)中观察到干扰峰。为此，不能定量样品中的这两种分析物。
使用对于所有目标分析物来说是共同的肽来定量所有样品中的总h-IgG。这使用所有5种分析物的组合标准曲线来进行。该方法的有效性通过这样的事实来证明：对于CA164_00725和CA164_00726观察到的浓度之和与对于总的h-IgG观察到的浓度充分一致(在实验误差内)。
通过使用该方法，测定利用CA164_00997、CA164_01125和CA164_01151给药的动物的样品中的h-IgG的总浓度。
总体上，获得的数据表明全部5个目标分析物的暴露对于给定的剂量是相似的。
研究组
表19
nd–未检测到(对于所有分析LOQ=2.5μg/mL)
na–未分析：对于997和1151观察到样品中的干扰
表20.抗体CA725是现有技术抗体MDX1388。抗体CA726是如描述的现有技术抗体CDA1(15)。该数据的概述示于图72中。
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Claims (41)

1.一种特异于抗原TcdA或TcdB的单克隆抗体，其中所述抗体具有对于靶抗原的高亲和力，并且适合用于减少具有艰难梭菌(Clostridium difficile)感染或处于所述感染的风险中的患者的腹泻的持续时间和/或严重度、发病率和/或死亡率。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中当以等于或高于LD80使用毒素时，所述抗体具有高效力，例如200ng/ml或更少，例如150ng/ml或更少，特别是100ng/ml或更少的EC50。
3.权利要求2的单克隆抗体，其中当以等于或高于LD80使用毒素时，所述抗体的EC50为0.1至10ng/ml。
4.权利要求2或权利要求3的单克隆抗体，其中当以等于或高于LD80使用毒素时，毒素的最大抑制为50至100%。
5.权利要求1至4的任一项的单克隆抗体，其中所述抗体结合靶抗原多次。
6.权利要求5的单克隆抗体，其中所述抗体结合靶抗原2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次或更多次。
7.权利要求1至6的任一项的单克隆抗体，其中所述抗体特异于TcdA。
8.权利要求1至6的任一项的单克隆抗体，其中所述抗体特异于TcdB。
9.权利要求1至8的任一项的单克隆抗体，其中所述抗体具有1nM或更少，例如600pM，例如50至600pM的亲和力。
10.权利要求1至9的任一项的单克隆抗体，其中所述抗体是中和抗体，包括在高毒素浓度、特别是有效地抗核糖型003、012、027和078时是中和抗体。
11.权利要求1至10的任一项的单克隆抗体，其中当在测定开始后4小时测量时，所述抗体在TEER测定中具有在60至80ng/ml的范围内的EC50。
12.权利要求1的单克隆抗体，其特异性结合TcdA，其包含重链，其中重链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:44中所示的CDR-H1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:45中所示的CDR-H2的序列的CDR和具有SEQ ID NO:46中所示的CDR-H3的序列的CDR的至少一个。
13.权利要求12的单克隆抗体，其还包含轻链，其中轻链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:41中所示的CDR-L1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:42中所示的CDR-L2的序列的CDR和具有SEQ IDNO:43中所示的CDR-L3的序列的CDR的至少一个。
14.权利要求13的单克隆抗体，其具有重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:49所示的序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:47所示的序列。
15.权利要求1的单克隆抗体，其特异性结合TcdA，其包含重链，其中重链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:54中所示的CDR-H1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:55中所示的CDR-H2的序列的CDR和具有SEQ ID NO:56所示的CDR-H3的序列的CDR的至少一个。
16.权利要求15的单克隆抗体，其还包含轻链，其中轻链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:51中所示的CDR-L1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:52中所示的CDR-L2的序列的CDR和具有SEQ IDNO:53中所示的CDR-L3的序列的CDR的至少一个。
17.权利要求16的单克隆抗体，其具有重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:59中所示的序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:57中所示的序列。
18.权利要求1的单克隆抗体，其特异性结合TcdB，其包含重链，其中重链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:124中所示的CDR-H1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:125中所示的CDR-H2的序列的CDR和具有SEQ ID NO:126所示的CDR-H3的序列的CDR的至少一个。
19.权利要求18的单克隆抗体，其还包含轻链，其中轻链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:121中所示的CDR-L1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:122中所示的CDR-L2的序列的CDR和具有SEQ IDNO:123中所示的CDR-L3的序列的CDR的至少一个。
20.权利要求19的单克隆抗体，其具有重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:129中所示的序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:127中所示的序列。
21.权利要求1的单克隆抗体，其特异性结合TcdB，其包含重链，其中重链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:154中所示的CDR-H1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:155中所示的CDR-H2的序列的CDR和具有SEQ ID NO:156所示的CDR-H3的序列的CDR的至少一个。
22.权利要求21的单克隆抗体，其还包含轻链，其中轻链的可变结构域包含具有SEQ ID NO:151中所示的CDR-L1的序列的CDR、具有SEQ ID NO:152中所示的CDR-L2的序列的CDR和具有SEQ IDNO:153中所示的CDR-L3的序列的CDR的至少一个。
23.权利要求22的单克隆抗体，其具有包含SEQ ID NO:159中所示的序列的重链和包含SEQ ID NO:157中所示的序列的轻链。
24.权利要求1的单克隆抗体，其特异性结合TcdA，其具有重链和轻链，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:39的序列并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:37的序列。
25.权利要求1的单克隆抗体，其特异性结合TcdB，其具有重链和轻链，其中重链可变区包含选自的SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:119、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:159的序列，并且轻链可变区包含选自SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:77、SEQID NO:87、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:157的序列。
26.药物组合物，其包含一种或多种权利要求1至25的任一项中定义的抗体。
27.权利要求26的药物组合物，其包含两种或更多种特异于TcdB的抗体。
28.权利要求26的药物组合物，其包含两种或更多种特异于TcdA的抗体。
29.权利要求26的药物组合物，其中组合物中的至少一种抗体特异于TcdA并且组合物中的至少一种抗体特异于TcdB。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种特异于TcdB的第二抗体。
31.权利要求26至30的药物组合物，其中所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种不同的针对靶抗原的抗体，例如2、3、4或5种抗体。
32.包含权利要求14,20和23的抗体的药物组合物或混合物。
33.权利要求26至32的任一项的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
34.权利要求1至25的任一项的单克隆抗体或权利要求26至33任一项的药物组合物，其用于治疗例如治疗或预防艰难梭菌感染或源自其的并发症。
35.治疗具有艰难梭菌感染或处于源自其的风险中的患者的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1至25的任一项的单克隆抗体或权利要求26至33的任一项的药物组合物。
36.权利要求35的治疗方法，其中将所述治疗与用于艰难梭菌治疗的其它治疗、例如选自甲硝唑、万古霉素、克林霉素、非达米星及其组合组合使用。
37.权利要求1至25的任一项中定义的抗体或权利要求26至33的任一项中定义的组合物用于制造用于治疗或预防艰难梭菌感染或来自其的并发症的药剂的用途。
38.使用测量抵抗TEER(跨上皮电阻)的丢失的保护作用的测定来选择权利要求1至11的任一项中定义的抗体的方法。
39.使用测量热稳定性(Tm)和对摇动聚集的抗性的测定来选择权利要求1至11的任一项中定义的抗体的方法。
40.通过将毒素中和的测量、TEER测量、热稳定性测量(Tm)、摇动聚集测量和适合用于共配制的等电点(pI)组合来选择用于治疗艰难梭菌感染的抗体混合物的方法。
41.与类毒素或包含所述类毒素的药物组合物组合的权利要求1至26的任一项的单克隆抗体，其例如用于接种，例如治疗或预防艰难梭菌感染或来自其的并发症。
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