CN114026248A - 抗微生物剂敏感性试验及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的方法，包括以下步骤：a)将含有微生物的第一样品与第一生长培养基接触，以形成第一混合物，其中所选第一生长培养基使微生物能够增殖和/或促进微生物细胞周期开始增殖；b)将含有微生物的第二样品与第二生长培养基接触，以形成第二混合物，其中第二生长培养基与第一生长培养基基本上相同，但进一步包含可能抑制或减缓微生物增殖的第一抗微生物剂；c)在适合于实现或促进微生物增殖的条件下，将第一混合物和第二混合物孵育30分钟或更短时间；d)使第一混合物和第二混合物或它们的一部分通过流式细胞仪，以对两种混合物中微生物的一个或多个生物化学参数和/或生物物理参数进行评估；和e)孵育后，将第一混合物中微生物的参数与第二混合物中的参数进行比较，检测第一抗微生物剂是否抑制或减缓微生物的增殖，从而确定微生物对所述抗微生物剂的敏感性。该方法特别适用于确定哪些抗微生物剂适合治疗微生物感染，例如尿路感染(UTI)。在相应的试剂盒中提供了加富生长培养基，一种或多种抗微生物剂和羰花青染料。

Description

抗微生物剂敏感性试验及试剂盒

技术领域

本发明涉及用于在微生物感染患者样品中检测抗微生物剂敏感性的快速试验方法。本发明特别适用于在尿路感染(“UTI”)患者尿液中检测抗微生物剂敏感性。

背景技术

众所周知，现存在抗微生物剂耐药性的危机(Andersson and Hughes 2010；Bakeret al.2018；Gelband and Laxminarayan 2015；Laxminarayan et al.2016；Li etal.2016；Macedo et al.2013；Mendelson et al.2017；Roca et al.2015)，导致出现这种危机的部分原因在于用药错误。用药错误有两种形式：(i)在非细菌性感染时使用了可能有效的抗生素；或者(ii)在细菌性感染时使用了错误的(即无效的)抗生素。希望有一种非常快速的方法，甚至在患者离开医生手术室之前就可以知道某种特定的抗生素确实能够杀死目标生物体。虽然基因型(全基因组测序)方法在这方面有一定的前景(Buchan andLedeboer 2014；Didelot et al.2012；Dunne et al.2017；Kirkup et al.2013；

etal.2012；Kwong et al.2015；Roach et al.2015；Schmidt et al.2016；Tsai et al.2016；Tuite et al.2014；van Belkum and Dunne 2013)，但真正需要的是在样品本身中评估抗感染活性(Farha and Brown 2010)的表型分析(Kelley 2017；Murray et al.2015；Schmiemann et al.2010)。但是，由于几乎所有抗生素，无论是抑菌性还是杀菌1(Kohanskiet al.2007)，都仅在细胞试图复制时才显示出其功效(Coates et al.2011)，由于存在迟缓期(如下所述)，因此人们可能会认为这是一个无法实现的目标。

尿路感染(“UTI”)是世界性的患者问题(Schmiemann et al.2010)。除了医院获得性感染外(Cek et al.2014)，尿路感染在女性中尤为常见，每2名女性中就有1人在其生命中的某个时间点经历过UTI(Foxman 2010)。大肠杆菌是引起UTI最常见的病原体(

2011；Foxman 2010；Mehnert-Kay 2005；Wilson and Gaido 2004)。然而，还发现其他肠杆菌如奇异变形杆菌、克雷伯菌属和铜绿假单胞菌，甚至葡萄球菌和肠球菌等革兰氏阳性球菌也可能引起UTI(Kline and Lewis 2016；Tandogdu and Wagenlehner 2016)。在初级治疗中滥用和过度使用抗生素是产生抗微生物剂耐药性的主要原因(Bryce et al.2016；Ceket al.2014；Tandogdu and Wagenlehner 2016)，因此开具正确的抗生素处方非常重要(Kerremans et al.2008；Kirchhoff et al.2018)。对于无症状UTI，通常完全不用药是一个适当的策略(

et al.2017)。

但是，我们注意到，大肠杆菌(E.coli)细胞在所有条件下都是高度异质的(Kellet al.2015)，即使仅仅是因为它们处于细胞周期的不同阶段(Wallden et al.2016)，并且在“指数”期和“稳定”期都包含各种染色体数量(

et al.1995；Boye and

1991；Skarstad et al.1986；Skarstad et al.1985；Steen and Boye1980；Stokke et al.2012)。为了从生理学上对它们进行区分，特别是将它们与可培养性(个体的特性)相联系，必须对它们进行单独研究(Kell et al.1991；Taheri-Araghi etal.2015)，通常采用流式细胞术进行研究(Boye et al.1983；Davey 2011；Davey and Kell1996；Hewitt and Nebe-Von-Caron 2004；Kell et al.1991；Müller et al.1993；Nebe-von Caron and Badley 1995；Shapiro 2008,2001；Shapiro 2003；Steen 1990)。流式细胞术也可用于对微生物(实际上是白细胞)计数以评估UTI(Chien et al.2007；Koken etal.2002；Shang et al.2013；Shayanfar et al.2007；Wang et al.2010)，但在这些情况下不用于抗生素敏感性测试。还可以采用单细胞形态学成像，其中在有利的情况下，可以在15-30分钟或更短的时间内检测抗生素敏感性(Baltekin et al.2017；Choi et al.2014)。

许多工作人员已经认识到流式细胞术有可能用于检测细胞数量、形态(通过光散射)和生理学(通过添加特定的荧光染料报告生物化学或生理学的某些成分)的快速变化。Boye及其同事在将青霉素加入到敏感菌株后一小时内在流式细胞图中观察到青霉素的影响(Boye et al.1983)。同样，Gant及其同事(Gant et al.1993)使用前向和侧向散射，3小时后在谱图上注意到抗生素的依赖性影响，但没有测量绝对计数。后来的研究(Mason etal.1994；Mason et al.1995)使用了带负电荷的染料双-(1,3-二丁基-巴比妥酸)三次甲基氧杂菁(DiBAC4(3))，这种染料在失去膜电活动(membrane energisation)时会增强其结合，从而增强荧光(这会降低外排泵(如acrAB/tolC)的活性(Du et al.2018；Iyer etal.2015；Kessel et al.1991)，并且可以在2-5小时内检测对青霉素和庆大霉素的敏感性。Senyurek和他的同事(Senyurek et al.2009)采用类似的试验方法，可以在90分钟内检测到这种敏感性。其他工作人员使用了多种探针，但评估要在更长的时间(例如24小时)后进行(Boi et al.2015)。

和同事(

et al.2000)直至2000年的工作进行了极好的回顾，其中一些报告(例如(Walberg et al.1997))在暴露于抗生素30分钟后采用流式细胞术检测到形态学(光散射)的变化。流式细胞术还被用于检测菌尿，尽管发现的数量似乎与CFU的相关性不大(Pieretti et al.2010)。大多数所谓的“活/死”(live/dead)试剂盒依靠膜完整性的丧失来检测DNA染色的渗透性，但许多有效的抗生素短期内对这方面几乎没有发挥作用，并且这种试剂盒不能评估增殖(Kell et al.1998)。

普通微生物学和实验室微生物学的经典活动包括采用取自非生长状态的细胞接种液体营养肉汤，所述细胞无论是长期储存(通常在琼脂中)的细胞还是采用最近在另一液体分批培养中已经生长到(Navarro Llorens et al.2010)稳定期的细胞。这样做的结果是，随着时间的推移，细胞的数量和/或生物量通常会增加，通常呈指数增长，但在任何此类增加之前，都会经历“迟缓期”(可以被细分(Schultz and Kishony 2013))。迟缓期的长度取决于多种因素，包括接种前后营养培养基的性质、接种密度、pH、温度以及该细胞前一稳定期的时间(Bertrand 2014；Finkel 2006；Himeoka and Kaneko 2017；

and Tenson2016；Pin et al.2009；Roostalu et al.2008；Swinnen et al.2004)。通常通过将细胞数、cfu或生物量的对数对时间作图，从得到的一条线外推其起始纵坐标值来估计(实际上定义)迟缓期(例如(Baranyi and Pin 1999；Baty and Delignette-Muller 2004；Baty etal.2002；Pirt 1975；Prats et al.2008；Prats et al.2006；Swinnen et al.2004))。然而，由于采用生物量的块状光学(bulk optical)估计的敏感性不同(通常更低)(Dalgaardet al.1994；Madar et al.2013；Swinnen et al.2004)，因此，通常只有前两个才被认为估计到了“真正的”迟缓期。

除了一些重要的例外(例如(Link et al.2015；Madar et al.2013；Novotna etal.2003；Pin et al.2009；Rolfe et al.2012；Roostalu et al.2008))，迟缓期在分子水平上的研究相对较少。但是，从应用的角度来看，至少有两种影响被认为是可取的。因此，食品微生物学家可能希望最大限度地延长迟缓期(可能无限期)(例如(Baranyi and Roberts1994))。相比之下，在某些情况下(例如此处)，尤其是在临床微生物学中，希望能够在尽可能短的时间内测定微生物的生长/可培养性及其表型敏感性或对候选抗感染药物的敏感性。这必然涉及最大限度地缩短迟缓期，这也是目前研究的重点。

有证据表明，当接种到丰富培养基中时，在迟缓期发生可测量的生化变化之前的时间可能很短(Link et al.2015；Madar et al.2013；Rolfe et al.2012)。因此，Rolfe及其同事(Rolfe et al.2012)使用了溶原性肉汤(LB)(和肠道沙门菌)，其中通过转录组变化测定发现，迟缓期或再生长在4分钟内(测定的最早时间点)就开始。Madar及其同事(Madaret al.2013)所绘图中的时间尺度并不允许进行如此精确的去卷积，但M9对酪蛋白氨基酸的响应(称为“即时”)均一致，周期在10分钟以内。Hong和他的同事最近采用受激拉曼成像在30分钟内检测到了这种变化(Hong et al.2018)，Yu和他的同事通过视频显微镜也实现这一点(Yu et al.2018)，Schoepp等(Schoepp et al.2017)采用分子检测合适的转录物。

本发明的一个目的是提供用于在微生物感染患者样品中检测抗微生物剂敏感性的试验方法。希望该试验方法操作简单迅速，以便能够快速提供准确的结果，使医生能够提供成功治疗微生物感染的抗微生物治疗方案。理想情况下，这种试验方法应能够用于一系列体液，如血液、尿液、粘液或唾液。还希望提供一种用于在尿路感染患者尿液中检测抗微生物剂敏感性的试验方法。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的方法，包括以下步骤：

a)将含有微生物的第一样品与第一生长培养基接触，以形成第一混合物，其中所选第一生长培养基使微生物能够增殖和/或促进微生物细胞周期开始增殖；

b)将含有微生物的第二样品与第二生长培养基接触，以形成第二混合物，其中第二生长培养基与第一生长培养基基本上相同，但进一步包含可能抑制或减缓微生物增殖的第一抗微生物剂；

c)在适合于实现或促进微生物增殖的条件下，将第一混合物和第二混合物孵育30分钟或更短时间；

d)使第一混合物和第二混合物或它们的一部分通过流式细胞仪，以对两种混合物中微生物的一个或多个生物化学参数和/或生物物理参数进行评估；和

e)孵育后，将第一混合物中微生物的参数与第二混合物中微生物的参数进行比较，以检测第一抗微生物剂是否抑制或减缓微生物的增殖，从而确定微生物对所述抗微生物剂的敏感性。

在该方法中，步骤b)还可进一步包括将一种或多种含有微生物的其他样品与一种或多种其他生长培养基接触，以形成一种或多种其他混合物，其中所述一种或多种其他生长培养基与第一生长培养基相同，但进一步包含一种或多种可能抑制或减缓微生物增殖的其他抗微生物剂，其中所述一种或多种其他抗微生物剂彼此不同，并且与第一抗微生物剂也不同。因此，采用一种或多种其他抗微生物剂评估一种或多种其他样品，使该方法可以评估微生物对多种抗微生物剂的敏感性。在临床环境中，这将使医生能够快速确定哪种抗微生物剂在治疗感染方面最有效。

在该方法中，步骤d)可以另外在步骤c)之前和之后进行，从而可以在孵育之前评估样品的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数。

微生物的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数可以选自以下中的一种或多种：细胞大小、细胞数量、细胞膜电活动(membrane energisation)和/或核酸含量和/或核酸分布。微生物的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数可以通过评估一种或多种某些荧光染料或其他染料的摄取来测定。

本发明的方法具有许多优点。首先，该方法可以在30分钟或更短的时间段内确定微生物对抗微生物剂的敏感性。这种快速方法使医生或医疗专业人员(例如护士)可以从疑似感染或已知感染的患者身上采集样品，然后确定最合适和最有效的抗微生物剂来治疗感染。

当参数是细胞大小、细胞数量和/或细胞膜电活动时，优选地，培养基进一步包含羰花青染料，或者在步骤d)之前，将羰花青染料加入到混合物或混合物的一部分中。优选的羰花青染料包括3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物(di-S-C3(5))。羰花青染料可以添加到生长培养基或混合物中，使其浓度介于约1μM至约5μM，优选地介于约3μM。当参数是细胞大小、细胞数量和/或细胞膜电活动时，优选地，流式细胞仪依赖于特定波长下的激发以及特定波长范围内的评估。例如，流式细胞仪可能依赖于640nm处的激发，在675±15nm处评估参数。其他替代波长对于本领域技术人员来说也是显而易见的。例如，流式细胞仪可能依赖于633nm或638nm附近的激发。

当参数是核酸时，优选地，所述核酸包括DNA。在步骤d)之前，可以将光辉霉素和/或核酸染料添加到混合物或混合物的一部分中，并且任选地，用流式细胞仪在约572nm处评估DNA分布。当参数是DNA分析时，优选地，将细胞注射到乙醇中固定，在M-Tris/HCl缓冲液中离心洗涤两次，然后重悬在含有光辉霉素和/或核酸染料、MgCl₂和NaCl的相同缓冲液中。核酸染料可包括花青，例如SYBR绿(SYBR Green)或溴化乙锭。更优选地，将细胞注射到冰冷的乙醇中固定至终浓度为约70％，在pH约7.4的0.1M-Tris/HCl缓冲液中离心洗涤两次，然后重悬在含有光辉霉素(50μg/mL)和溴化乙锭(25μg/mL)、MgCl₂(25mM)和NaCl(100mM)的相同缓冲液中。

显然，采用的生长培养基将由待测试样品中微生物的类型和/或从哪种类型的环境中清除微生物来确定。例如，人们已经证明，当评估来自尿路感染个体尿液样品中的微生物时，超级肉汤培养基(Terrific Broth，TB培养基)是有效的生长培养基。

同样，步骤c)将在适于待测试样品中的微生物增殖和/或从其中清除微生物的环境类型中的微生物增殖的温度条件下进行。例如，当评估来自感染个体样品中的微生物时，步骤c)将在约35℃至约40℃范围内的温度下进行，优选地，在约37℃的温度下进行。

可以在多个时间点评估第一混合物和第二混合物的一部分，或者一种或多种其他混合物的一部分。优选地，所述多个时间点包括以下一个或多个时间点：0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和/或30分钟或任何额外或替代的中间时间点，或者选择这些时间点。优选地，步骤c)为约20分钟或更短。最优选地，步骤c)介于约15分钟至约20分钟。

理想的情况是在步骤c)之前和之后都对第一混合物和第二混合物的一部分，或者一种或多种其他混合物的一部分进行评估。这样就可以对处于生长停滞状态的微生物与处于增殖状态的微生物和/或处于细胞周期变化状态以开始增殖的微生物进行对照。

显然，微生物可以获取自被认为患有微生物感染的个体的生物样品。微生物可以获取自被认为患有细菌性或病毒性感染的个体的生物样品，在这种情况下，该方法可用于评估感染性质是细菌性感染还是病毒性感染，并有助于指导治疗剂或治疗过程。优选地，该方法将鉴定微生物对一种或多种抗菌剂的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数的变化，从而确定患者患有对该抗菌剂敏感的细菌感染。但是，如果该方法发现微生物对任何抗菌剂的一个或多个生物化学和/或生物物理参数未发生变化，那么这可能确定患者患有病毒性感染，并采取适当的方案(例如施用抗病毒药物)。

样品可以直接来自体液，例如尿液、血液、粘液或唾液。或者，样品在与生长培养基接触之前可以用试剂或缓冲液进行预处理或过滤。

微生物感染可以是尿路感染(UTI)。

在本发明的一个相关实施例中，提供了一种如上所述的用于确定用于治疗个体微生物感染的抗微生物剂的方法，其中该方法包括从个体采集生物样品，评估生物样品中微生物对两种或多种抗微生物剂的敏感性，并根据哪种抗微生物剂抑制或减缓微生物的增殖来确定向个体施用哪种抗微生物剂。

根据本发明另一个相关实施例，提供了一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的试剂盒，其包括：

a)加富生长培养基；

b)一种或多种抗微生物剂；和

c)羰花青染料。

该试剂盒还进一步包括：

d)流式细胞仪，任选地，具有至少一个红色激光器。

优选地，加富生长培养基包括超级肉汤(Terrific Broth)，尽管显然也可以使用其他加富生长培养基，并且可以根据样品中疑似存在的微生物来决定。

应当理解的是，本文所述的试剂盒可用于本文所述的方法中。

出乎意料并且有利的是，本发明人已经认识到尿路感染(UTI)中的细菌实际上可能正在生长(尽管缓慢)而不是处于“稳定”期，因此决定对定量流式细胞术在尽可能快的时间尺度内测定细菌细胞数量以及抗生素对细菌影响的能力进行评估。研究结果表明，在菌尿特征水平(10^4-5/mL)下，确实可以在30分钟内区分抗生素敏感菌株和耐药菌株(Detweiler et al.2015；Mody and Juthani-Mehta 2014)。有利的是，由于从取样到确定可以处方开出与/或分配正确的抗生素之间的时间很短，因此，开启了在患者仍在手术中时就确保向患者提供正确处方的可能性。

由于不同的探针和不同的抗生素对膜的完整性具有不同的影响(并且具有不同的动力学)，因此决定最好的策略是直接观察抗生素抑制增殖的能力，通过采用为活细胞聚集供能的带正电荷的染料来区分细菌和无生命的散射物质。罗丹明123(Rhodamine 123)是这类染料中非常受欢迎的染料，但仅对革兰氏阳性生物可以在无需额外化学处理的情况下有效抑制增殖(Kaprelyants and Kell 1993,1992)。但是，带正电荷的羰花青染料3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物(di-S-C3(5))(Waggoner 1976；Waggoner 1979)似乎与革兰氏阳性和阴性细菌都能结合和/或将它们聚集，提供了一种方便的手段对它们进行检测。

附图说明

下面仅通过示例的方式，并参考附图对本发明进行说明，其中附图如下：

图1：微生物再生长期间真实且明显的迟缓期。所示菌株在溶原性肉汤中生长，并在稳定期4小时后接种到超级肉汤中至约10⁵个细胞/mL。OD(光密度)在Omega酶标仪分光光度计(英国BMG Labtech)中准连续测量，而CFU在含有用1.5％琼脂固化的营养琼脂培养基的琼脂平板上进行常规测量。通过计数CFU观察到的迟缓期少于30分钟，而块状OD(bulkOD)测量显示迟缓期约230分钟(约4小时)。

图2：在含有3μM Di-S-C3(5)的0.2μm-过滤超级肉汤中培养时，浓度为10⁵个细胞/mL的大肠杆菌的细胞图。测量的样品体积3μL，测量时间超过2秒。A：RL1荧光的一维直方图显示了结果的重现性。B：RL1荧光和校准珠的一维直方图，表明细菌峰的宽度是“真实的”，而不仅仅是由于检测器的可变性。C和D：前向散射和侧向散射的信号高度分别相对RL1的原始点图。应注意，大肠杆菌细胞在RL1中的值高于10⁵，其余信号是由非常小的未过滤碎片造成的。E：只显示大肠杆菌单细胞的设门策略(I-V)。

图3：将细胞从稳定期接种到超级肉汤后的首个30分钟内细胞数量的变化。A：典型细胞图。B：大肠杆菌在10⁵个细胞/mL的初始浓度下生长的重现性和Z'统计量(Z'statistic)(见下文)。C：以5×10⁵个细胞/mL接种大肠杆菌的重现性和Z'统计量。

图4：氨苄西林(浓度100mg/L，敏感菌株3倍MIC)对从稳定期接种到超级肉汤中的大肠杆菌细胞图的影响。耐药菌株16(A，B)或敏感菌株7(C，D)中不存在氨苄西林(A，C)或存在氨苄西林(B，D)。E：表中示出了在存在和不存在氨苄西林的情况下生长时敏感菌株(菌株7)和耐药菌株(菌株16)细菌数量(带重复)的变化。采用其他八种宏观敏感菌株和耐药菌株也得到了类似的数据。

图5：图4实验的侧向散射直方图。耐药菌株16(A，B)或敏感菌株7(C，D)中不存在氨苄西林(A，C)或存在氨苄西林(B，D)。

图6：呋喃妥因在3倍标称MIC下对大肠杆菌敏感菌株的生长和流式细胞仪行为的影响。A、B为呋喃妥因，(A)侧向散射细胞图，(B)RL1荧光。如图3的图例所示精确开展实验。(C)流式细胞仪颗粒计数(如图2中的设门)在20分钟内测定大肠杆菌MG1655对四种不同抗生素的敏感性的能力。

图7：不同菌群的DNA分布。(A)稳定期细胞(红色)和指数生长细胞(蓝色)的DNA分布。叠加直方图示出了大肠杆菌样品的数据，这些样品用70％冰冷的乙醇固定，然后采用光辉霉素和溴化乙锭染色，如材料和方法中所述。BL2通道荧光(488nm激发，572±14nm发射)的相对强度表明细胞中染色体的数量。点I、II和III分别代表1个、2个和8个染色体等价物。这些点的BL2荧光峰值为I(2.03.10⁴)、II(3.90.10⁴)和III(1.53.10⁵)。取出处于稳定期(2-4h)的细胞并立即固定，而指数生长细胞在37℃下孵育90分钟再固定细胞。(B)从稳定期接种到超级肉汤中后每5分钟直到30分钟内，大肠杆菌细胞中DNA分布的变化。除了不存在羰花青(为了避免光谱干扰)外，实验完全按照图2图例中所述进行。

图8：用呋喃妥因处理的敏感UTI菌株的细胞图。UTI样品(在此情况下包含约10⁶个细胞/mL)直接从储存中取出，稀释10倍至37℃超级肉汤中，超级肉汤中包含3μM diS-C3(5)和标称3倍MIC的呋喃妥因，并通过流式细胞术测定，如图2的图例所述。(A)侧向散射，(B)红色荧光。

具体实施方式

材料和方法

微生物菌株

大肠杆菌MG1655和一系列敏感菌株和耐药菌株取自实验室保藏。

培养

将大肠杆菌菌株在锥形瓶中采用溶原性肉汤从适当浓度的接种物培养至光密度(600nm)1.5-2，这代表在该培养基中到达稳定期。将它们保持在稳定期2-4小时，然后以10⁵个细胞/mL的浓度(如注释)接种到超级肉汤中(Tartof and Hobbs 1987)。我们在这里不对于长时间(超过3天)处于稳定期(Finkel 2006；Navarro Llorens et al.2010)的细胞进行研究。

通过块状OD测定评估生长

块状OD测定在96孔板中进行，根据制造商的说明在Omega酶标仪分光光度计(英国BMG Labtech)在600nm处读取。未减去从板等处散射产生的“背景”。

流式细胞术

最初的研究采用Sony SH-800仪器，但本文报告的所有研究都采用

iQuescreener PLUS。该仪器很大程度上基于Sklar及其同事的研发成果(例如(Edwards etal.2009；Sklar et al.2007；Tegos et al.2014))，并在分析之前使用间断流(Skeggs1957)从96孔或384孔U型或V型底板取样。iQue Plus包含三个激发源(405nm、488nm、640nm)和7个固定滤光检测器(以nm为单位的中点/范围：445/45、530/30、572/28、585/40、615/24、675/30、780/60，提供13个荧光通道)，其输出采用FCS3.0数据文件标准，以“高度”和面积存储(Seamer et al.1997)。由488nm激发源获得前向和侧向散射。检测通道按所使用的激光(405nm紫色VL、488nm蓝色BL和640nm红色RL)和检测器编号(按可能的具有更长波长的检测器顺序编号)表示。因此，用于检测di-S-C3(5)的RL1指的是红色激光和675/30检测器。使用7log的动态范围从所有通道收集数据。许多参数可用于改变仪器的精确性能。我们发现可提供最佳重现性和最少残留的材料及其选定值如下：自动进样–60秒(在Qsol缓冲液中)；预-板振动–15s和1500rpm；取样(sip)时间–2s(实际样品摄取)；附加取样时间–0.5s(取样之间的间隔)；泵速–29rpm(样品摄取1.5μL/s)；板模式–U型底孔板(适用于96孔板)；中板清理–每孔后(用Qsol缓冲液洗涤4次；每次0.5s)；孔间振动–在Qsol缓冲液中1500rpm；6孔后，4秒；冲洗和清洁–用去离子和清洁缓冲液冲洗30秒，然后用去离子水冲洗60秒。随仪器提供的Forecyt^TM软件可用于设门和显示所有事后分析。它和FlowJo软件用于制作所示的细胞图。在使用时，di-S-C3(5)的终浓度为3μM；其分析使用640nm激发波长并在675±15nm处检测，荧光通道称为RL1。对于DNA分析，将细胞注射到冰冷的乙醇中固定(终浓度70％)，在pH7.4的0.1M-Tris/HCl缓冲液中离心洗涤两次，然后重悬在含有光辉霉素(50μg/mL)和溴化乙锭(25μg/mL)、MgCl₂(25mM)和NaCl(100mM)的相同缓冲液中(Boye et al.1983)。在这些条件下，光辉霉素吸收的激发能量(激发波长405nm或488nm)被转移到溴化乙锭，提供大的斯托克斯位移(在572nm、585nm或615nm处发射；我们选择572nm，因其提供了最好的信号)和对DNA的高选择性(因为光辉霉素不与RNA结合)。采用的所有溶液和培养基都经过0.2μm过滤器过滤。

UTI样品

在获得曼彻斯特大学的伦理批准并获得签署的同意书后，Firsway诊所疑似UTI的患者有机会通过我们的方法以及中心病理学实验室(centralised pathologylaboratory)使用的参考方法分析他们的尿液样品。在一天中的不同时间采集样品，保存在4℃，由出租车运送到曼彻斯特实验室，铺板(LB琼脂中含有适当的3倍标称MIC的规定抗生素)以评估微生物数量和抗生素敏感性，剩余样品再次保存在4℃，并在18小时内进行流式细胞术分析。为了开展流式细胞术评估，将细胞稀释到含有3μM diS-C3(5)和任何适当抗生素的37℃超级肉汤中，并按上述方法进行试验。对于其他实验(未示出)，将细胞过滤(0.45μm)并适当稀释到温热的超级肉汤中。两种方法之间没有明显差异。

试剂

如果可以提供的话，所有试剂均为分析纯。流式细胞术染料来自AAT Bioquest。

结果

通过96孔板中的块状光散射测定对再生长进行初步评估

图1示出了10⁵个细胞的接种物接种到超级肉汤(Tartof and Hobbs 1987)时，在稳定期保持4小时后的典型迟缓期，如通过块状OD测定所观察到的那样。对于菌株MG1655，它相当于大约230分钟，而对于更具毒性的临床分离株(未示出)会更短(2.5-3小时)。根据经验，对大肠杆菌来说，OD为1大约等于0.5mg/mL干重细菌或约10⁹个细胞/mL。因此，如果10⁵个细胞/mL将其数量增加50％，则OD的变化约为0.00015，该变化在此仪器中非常小，无法测定出来。考虑到系统中的噪声(可能主要是由于入射光强度的波动)，在该系统中，我们可以合理地检测到的OD变化为0.01(约10⁷个细胞/mL)，这需要细胞数量比接种物增加100倍(倍增约7次)。真正的迟缓期为10-15分钟，倍增时间为20分钟，这确实是大致可以观察到的(图1)(亦参见(Chandra and Singh 2018；Pin and Baranyi 2006,2008))。当样品取自同一菌株并铺板以通过CFU估计增殖时，结果确实与那些较长时间的结果一致(图1)。

细胞和细胞增殖的流式细胞术评估

图2A示出了一组来自Intellicyt iQue的多孔的典型轨迹，每个孔包含10⁵个细胞/mL的接种物。每次分析3μL(需时2s)，显然重现性很好，尤其是在插入叠加图中所示的。我们还展示了(后面的轨迹)微珠混合物的细胞图；图2B显示细胞特性的分布明显大于微珠分布，因此其明显的宽度不是由于检测器的任何不足造成的。现在广泛采用Z'统计量对“高通量”(或任何其他)检测的质量进行评估(Zhang et al.1999)。对于样品读数超过对照读数的检测，Z'统计量如下所示：

Z'＝1-3(SD样品+SD对照)/(样品平均值–对照平均值) 式1。

通常认为(Zhang et al.1999)Z'因子超过0.5可提供令人满意的检测。

图2C和2D分别示出了前向散射和侧向散射相对RL1的完整细胞图，表明了尽管经过广泛过滤，但仍留在超级肉汤中的小颗粒数量。因此，我们采用一系列门来单独评估我们样品中的细菌。这些在图2E中示出。

图3示出了将稳定期(LB-生长)细胞接种到超级肉汤中后不同时间的细胞图，以及目标区域内的细胞数量标记。这允许根据式1评估Z'值。从图3B中可以观察到，早在20分钟时Z'>0.5，表明这是我们可以稳健地检测到增殖的最早时间。然而，根据光散射判断，可以从最早的时间点(5分钟，图3A左上角)检测到细胞构成的变化。值得注意的是，至少最初的增殖(通过纵坐标上细胞数量的增加来衡量)与羰花青染料摄取的增加(横坐标)平行；随着细胞“苏醒”，它们变得越来越有活力，直到它们稳定下来(也通过侧向散射观察到)。如图3C所示，对于较低浓度的起始接种物(5×10⁴个细胞/mL)，从25分钟开始，Z'>0.5。

抗生素敏感性的流式细胞术评估

图4示出了在不存在(图4A、C)和存在(图4B、D)抗生素氨苄西林的情况下，施用3倍已知MIC(MIC＝32mg/L)时耐药菌株(图4A、B)和敏感菌株(图4C、D)的相似数据(http:// www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_8.1_ Break point_Tables.pdf)(The European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing.(欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会)Breakpoint tablesfor interpretation of MICs and zone diameters.Version 8.1,2018.(细菌MIC和抑菌圈直径的折点表8.1版，2018)http://www.eucast.org.)。显然，敏感菌株至少在三个方面与耐药菌株不同(由此可以区分)：(i)由RL1计数判断的细胞数量变化的动力学，(ii)由前向散射(未示出)或侧向散射判断的细胞数量变化的动力学，(iii)荧光强度的动力学变化。

由于我们在5分钟内看到了侧向散射的快速变化(图3)，因此将其作为检测抗生素敏感性的手段进行研究也很有意义。图5显示，尽管发生的增殖有限，但在5-10分钟内，敏感菌株和耐药菌株之间的侧向散射变化也明显不同。

当然，不同的抗生素有不同的作用模式，(Brochado et al.2018；Zampieri etal.2018)，最佳读数需要反映这一点。因此，呋喃妥因广泛用于UTI，其对我们标准实验室系统的影响如图6A、B(分别为侧向散射和RL1的细胞图)所示。图6C给出了呋喃妥因和其他几种抗生素对细胞增殖的影响。应注意，对于呋喃妥因，初始细胞数量和后期细胞数量似乎更低，因为这种抗生素会吸收激发波长的光(其峰位于620nm)。可以看到，抑菌性抗生素(甲氧苄啶)和杀菌性抗生素(氨苄西林、环丙沙星、呋喃妥因)对这种敏感菌株都有效。

DNA分布的流式细胞术评估

检测细菌的另一个重要策略是利用它们的DNA(例如(Hammes and Egli 2010；Jernaes and Steen 1994；Müller and Nebe-von-Caron 2010))。因此，对大肠杆菌细胞和培养物生理学进行检测的另一个高级向导是通过流式细胞术可观察其中DNA的分布，因为这种分布因生长基质、温度和细胞周期的不同而有很大差异(Boye and

1991；Skarstad et al.1986；Skarstad et al.1985；Steen and Boye 1980；Stokke etal.2012)。具体来说，解决DNA复制率固定而增长率可以变化并超过它们的问题的解决方案是在给定的细胞中允许多个复制叉(Cooper and Helmstetter 1968)。为此，我们比较了不同条件下我们培养物的DNA分布。图7A示出了根据材料和方法中给出的Skarstad及其同事的方案，采用光辉霉素-溴化乙锭混合物染色的稳定期细胞和指数生长的细胞。正如他们之前所观察到的那样(Boye et al.1983；Skarstad et al.1985)，(生长非常缓慢或)稳定期细胞显示出一个或两个染色体组(chromosome complement)，而那些在溶原性肉汤(LB培养基)中呈指数增长的细胞可能有多达八个或更多个染色体。这与基本的、经典的Cooper-Helmstetter模型(Cooper and Helmstetter 1968)和更现代的改进模型完全一致(Saulset al.2016；Si et al.2017；Willis and Huang 2017；Zheng et al.2016)。为此，图7B显示了从与图2类似的再生长实验中所采集细胞的DNA分布变化。显然，来自稳定期的含有一个和两个染色体的细胞在相同的时间尺度内开始增加它们的DNA含量，这可以从直接细胞计数(增殖)和羰花青荧光中观察到，最初双峰DNA分布转变为更多单峰的分布。这意味着细胞数量在15分钟左右的初始增加涉及即将分裂的细胞实际正在分裂，并提供了另一个有用的细胞(细胞周期)活动指标，尽管这需要采样，因为细胞必须被渗透化(permeabilise)，至少对于这个方案是这样。

UTI样品的流式细胞术分析

最后，我们希望确定这种在实验室培养中开发的方法是否可以应用于医生手术室中“收到”的候选UTI样本。为此，我们分析了23个样品，其中6个样品通过中心微生物实验室(central microbiology laboratory)的参考方法判断为阳性。采用我们的方法也发现每一个样品都呈阳性，抗生素敏感性在下表1中给出。这些结果再次与参考方法一致。

表1.Firsway诊所六个阳性样品(≥10⁵/mL)的抗生素敏感性概况。

敏感菌株和耐药菌株的典型细胞图如图8所示。阳性培养物集中分布，在每种情况下都发现微生物是大肠杆菌。

讨论和结论

人们通常认为细菌生长的“迟缓”期中细胞生长很少，而且细胞生长非常缓慢。这个观点可能源于这样一个事实，即实验室培养物(Kaprelyants and Kell 1993)中肉眼可观察到的OD变化确实非常缓慢。然而，对此详细研究的论文(Baltekin et al.2017；Madaret al.2013；Novotna et al.2003；Pin et al.2009；Rolfe et al.2012；Roostalu etal.2008；Schoepp et al.2017；Yu et al.2018)中很少有人发现在非常快速的时间尺度上，可能在重新接种到丰富生长培养基后4分钟内或更短的时间内，表达谱确实发生变化(尽管主要是在整体水平上测量)。为了可以观察到抗生素对细胞的影响，以及可以观察到细胞对抗生素的不同敏感性，细胞需要处于复制状态。这可能被认为排除了在迟缓期的任何此类观察，但从目前的观察中可以清楚地看到，细胞可以非常迅速地重新启动或继续其细胞周期，这样，在将饥饿的稳定期细胞重新接种到加富培养基中后，在短短的15-20分钟内可以发生可观察到的增殖。因此，没有必要等待完整的“迟缓期加上第一分裂时间”周期(Baltekin et al.2017)，这种周期可能超过一个小时(Pin and Baranyi 2006,2008)。我们描述的快速增殖可以通过光散射、细胞计数、羰花青荧光(膜电活动)以及菌群中DNA的强度和分布的变化来观察。这使我们能够采用任何或所有这些表型分析在创纪录的时间内确定表型水平上的抗生素敏感性。Pin和Baranyi(Pin and Baranyi 2006,2008)观察到的过程比我们在此处观察到的过程更随机且更慢，但在他们的情况下，他们仅测量CFU，并且接种到营养不太丰富的LB中，而我们采用了超级肉汤。事实上，当单独测量生物体时，从迟缓期的退出过程可能非常不一样(Aguirre et al.2013；Aguirre and Koutsoumanis 2016；Baltekin et al.2017；Stylianidou et al.2016)。

虽然在这里我们没有在转录组水平上研究这一点，但通过羰花青染料的摄取，在早期迟缓期和再生长期观察到的生理学变化动力学很有意义。典型地，羰花青的摄取被认为反映了跨膜电位差(内部为负)(例如(Bashford 1981；Ghazi et al.1981；Johnson etal.1981；Shapiro 2000；Waggoner 1976；Waggoner 1979)，但参见(Felle et al.1978))基于根据Nernst方程的双层介导的平衡(Rottenberg 1979)。然而，我们认识到，这类花青染料，与溴化乙锭(Jernaes and Steen 1994)和其他外源性物质一样(Kell et al.2013；Kell and Oliver 2014)，可能是各种转运蛋白的流入和流出底物(Wu et al.2015)，因此应谨慎对待这种解释。

类似的策略也适用于其他细胞(包括尿液等更难培养的基质中的病原体)、其他抗生素和其他染料。然而，本发明工作为这些提供了一个非常有用的跳板，表明人们可能确实希望能够在20分钟或更短的时间内在表型分析中确定抗生素敏感性。这可能是对抗微生物剂耐药性的一个非常有用的特性。

上述实施例并非旨在限制由权利要求提供的保护范围，而是描述如何将本发明付诸实践的示例。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的方法，包括以下步骤：

a)将含有微生物的第一样品与第一生长培养基接触，以形成第一混合物，其中所选第一生长培养基使微生物能够增殖和/或促进微生物细胞周期开始增殖；

b)将含有微生物的第二样品与第二生长培养基接触，以形成第二混合物，其中第二生长培养基与第一生长培养基基本上相同，但进一步包含可能抑制或减缓微生物增殖的第一抗微生物剂；

c)在适合于实现或促进微生物增殖的条件下，将第一混合物和第二混合物孵育少于20分钟；

d)通过细胞仪评估第一混合物和第二混合物或它们的一部分，以对这两种混合物中微生物的一个或多个生物化学参数和/或生物物理参数进行评估；和

e)孵育后，将第一混合物中微生物的参数与第二混合物中微生物的参数进行比较，以检测第一抗微生物剂是否抑制或减缓微生物的增殖，从而确定微生物对所述抗微生物剂的敏感性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)进一步包括将一种或多种含有微生物的其他样品与一种或多种其他生长培养基接触，以形成一种或多种其他混合物，其中所述一种或多种其他生长培养基与第一生长培养基相同，但进一步包含一种或多种可能抑制或减缓微生物增殖的其他抗微生物剂，其中所述一种或多种其他抗微生物剂彼此不同，并且与第一抗微生物剂不同。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数选自以下中的一种或多种：细胞大小、细胞数量、细胞膜电活动和/或核酸含量和/或核酸分布。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数通过评估一种或多种荧光染料或其他染料的摄取来测定。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞仪为流式细胞仪。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参数是细胞大小、细胞数量和/或细胞膜电活动，并且其中所述培养基进一步包含羰花青染料，或者在步骤d)之前，将羰花青染料加入到混合物或混合物的一部分中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述羰花青染料包括3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物(di-S-C3(5))。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述羰花青染料在所述混合物中的浓度介于约1μM至约5μM。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述羰花青染料在所述混合物中的浓度介于约3μM。

10.根据前述权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述流式细胞仪依赖于640nm处的激发，在675±15nm处评估参数。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参数是核酸，并且所述核酸包括DNA。

12.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤d)之前，将光辉霉素和/或核酸染料添加到混合物或混合物的一部分中，并且任选地，用流式细胞仪在约572nm处评估DNA分布。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸染料包括SYBR Green或溴化乙锭。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生长培养基包括超级肉汤。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)在约35℃至约40℃范围内的温度下进行。

16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤c)在约37℃的温度下进行。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在多个时间点评估第一混合物和第二混合物的一部分，或者从属权利要求2所述的一种或多种其他混合物的一部分。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述多个时间点包括以下一个或多个时间点：0分钟、5分钟、10分钟、15分钟和/或少于20分钟。

19.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述步骤c)介于约15分钟至少于约20分钟。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤d)在步骤c)之前和之后进行。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物获取自被认为患有微生物感染的个体的生物样品。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物样品是尿液。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述微生物感染是尿路感染(UTI)。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于确定用于治疗个体微生物感染的抗微生物剂，其中所述方法包括从个体采集生物样品，评估生物样品中微生物对两种或多种抗微生物剂的敏感性，并根据哪种抗微生物剂抑制或减缓微生物的增殖来确定向个体施用哪种抗微生物剂。

25.一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的试剂盒，包括：

a)加富生长培养基；

b)一种或多种抗微生物剂；和

c)羰花青染料。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括：

d)流式细胞仪。

27.根据权利要求25或26中任一项所述的试剂盒，其中所述加富生长培养基包括超级肉汤。

28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述流式细胞仪包括至少一个红色激光器。

29.根据权利要求25或28中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于权利要求1至24中任一项所述的方法。

Claims (29)

1.一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的方法，包括以下步骤：

a)将含有微生物的第一样品与第一生长培养基接触，以形成第一混合物，其中所选第一生长培养基使微生物能够增殖和/或促进微生物细胞周期开始增殖；

b)将含有微生物的第二样品与第二生长培养基接触，以形成第二混合物，其中第二生长培养基与第一生长培养基基本上相同，但进一步包含可能抑制或减缓微生物增殖的第一抗微生物剂；

c)在适合于实现或促进微生物增殖的条件下，将第一混合物和第二混合物孵育30分钟或更短时间；

d)使第一混合物和第二混合物或它们的一部分通过流式细胞仪，以对这两种混合物中微生物的一个或多个生物化学参数和/或生物物理参数进行评估；和

e)孵育后，将第一混合物中微生物的参数与第二混合物中微生物的参数进行比较，以检测第一抗微生物剂是否抑制或减缓微生物的增殖，从而确定微生物对所述抗微生物剂的敏感性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)进一步包括将一种或多种含有微生物的其他样品与一种或多种其他生长培养基接触，以形成一种或多种其他混合物，其中所述一种或多种其他生长培养基与第一生长培养基相同，但进一步包含一种或多种可能抑制或减缓微生物增殖的其他抗微生物剂，其中所述一种或多种其他抗微生物剂彼此不同，并且与第一抗微生物剂不同。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数选自以下中的一种或多种：细胞大小、细胞数量、细胞膜电活动和/或核酸含量和/或核酸分布。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物的一种或多种生物化学参数和/或生物物理参数通过评估一种或多种荧光染料或其他染料的摄取来测定。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参数是细胞大小、细胞数量和/或细胞膜电活动，并且其中所述培养基进一步包含羰花青染料，或者在步骤d)之前，将羰花青染料加入到混合物或混合物的一部分中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述羰花青染料包括3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物(di-S-C3(5))。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述羰花青染料在所述混合物中的浓度介于约1μM至约5μM。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述羰花青染料在所述混合物中的浓度介于约3μM。

9.根据前述权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述流式细胞仪依赖于640nm处的激发，在675±15nm处评估参数。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参数是核酸，并且所述核酸包括DNA。

11.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤d)之前，将光辉霉素和/或核酸染料添加到混合物或混合物的一部分中，并且任选地，用流式细胞仪在约572nm处评估DNA分布。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸染料包括SYBR Green或溴化乙锭。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生长培养基包括超级肉汤。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)在约35℃至约40℃范围内的温度下进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤c)在约37℃的温度下进行。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在多个时间点评估第一混合物和第二混合物的一部分，或者从属权利要求2所述的一种或多种其他混合物的一部分。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多个时间点包括以下一个或多个时间点：0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和/或30分钟。

18.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述步骤c)为约20分钟或更短。

19.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述步骤c)介于约15分钟至约20分钟。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤d)在步骤c)之前和之后进行。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物获取自被认为患有微生物感染的个体的生物样品。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物样品是尿液。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述微生物感染是尿路感染(UTI)。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于确定用于治疗个体微生物感染的抗微生物剂，其中所述方法包括从个体采集生物样品，评估生物样品中微生物对两种或多种抗微生物剂的敏感性，并根据哪种抗微生物剂抑制或减缓微生物的增殖来确定向个体施用哪种抗微生物剂。

25.一种快速测定微生物对抗微生物剂敏感性的试剂盒，包括：

a)加富生长培养基；

b)一种或多种抗微生物剂；和

c)羰花青染料。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括：

d)流式细胞仪。

27.根据权利要求25或26中任一项所述的试剂盒，其中所述加富生长培养基包括超级肉汤。

28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述流式细胞仪包括至少一个红色激光器。

29.根据权利要求25或28中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于权利要求1至24中任一项所述的方法。

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