CN114058713B - 乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水产养殖中性染色体分析技术领域，公开了一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，包括如下步骤：步骤一，构建种间杂交群体，步骤一中所述杂交群体由雄性乌苏里拟鲿和雌性圆尾拟鲿通过人工授精获得；步骤二，雄性杂交个体鉴定，步骤二中所述雄性杂交个体通过性腺特征观察和分子标记两种方法鉴定；步骤三，雄性杂交个体三代基因组测序与组装，步骤三中所述三代基因组测序与组装采用HiFi与Hi‑C技术实施；步骤四，与雌性基因组染色体比对获得Y染色体序列。本发明中乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，能大幅缩短现有技术条件下获得Y染色体序列所需时间，有效降低劳动强度、提高工作效率，有力促进乌苏里拟鲿性别控制育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖中性染色体分析技术领域，具体的涉及一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法。
背景技术
鱼类普遍存在性别二态性，有些鱼类雄性生长速度明显大于雌性，而有些则是雌性生长速度大于雄性。在鱼类育种中，如果能充分利用这种性别生长差异，育成全雄或全雌品系，将为相应鱼类养殖产量的提高产生极大的推动作用。为了实现性别控制育种的目标，首先需要了解目标鱼类的性别决定机制，而获得性染色体序列是揭示其性别决定机制的重要突破口。
目前，对于XX-XY性别决定类型的鱼类而言，获得Y染色体序列的主要方法是：1.利用雌激素处理XY遗传雄性的性腺未分化幼体，使之性逆转为生理雌性的伪雌性个体；2.将XY伪雌性个体饲养至性成熟后，与XY正常雄性个体交配产生后代；3.开发雄性特异分子标记，并利用分子标记从后代中鉴定出YY超雄性个体；4.利用三代基因组测序技术对YY超雄性个体测序，通过与已有的雌性基因组比对，获得Y染色体序列。
乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）是分布于我国黑龙江至珠江水系的鲿科鱼类。由于味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，同时其养殖技术难度不大、养殖病害少，养殖范围也在不断扩大，目前已在全国多省开展养殖。乌苏里拟鲿为XX-XY性别决定型鱼类，性别二态性特征非常明显，在二龄时，雄性个体大小可达雌性的3倍以上，因此，具有极大的全雄育种潜力。然而，目前对乌苏里拟鲿性别决定机制的认识非常有限，无法满足全雄育种的需要。
发明内容
发明目的
本发明要解决的技术问题在于提供一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，能大幅缩短现有技术条件下获得Y染色体序列所需时间，有力促进乌苏里拟鲿性别控制育种进程。
技术方案
本发明提供了一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，包括如下步骤：步骤一，构建种间杂交群体：挑选雌性圆尾拟鲿和雄性乌苏里拟鲿亲本通过人工催产与授精，构建杂交群体；步骤二，雄性杂交个体鉴定：取20尾饲养至3月龄的杂交个体，解剖取出性腺，利用体视显微镜观察性腺进行生理性别鉴定，并将每尾个体通过乌苏里拟鲿雄性特异分子标记进行遗传性别鉴定，将两种方法均鉴定为雄性的个体作为待检测样本；步骤三，雄性杂交个体三代基因组测序与组装：从待检测样本提取基因组DNA后构建HiFi测序文库，利用肌肉组织构建Hi-C交联文库，进行三代基因组测序与染色体水平基因组组装；步骤四，与雌性基因组染色体比对获得Y染色体序列：将组装获得的雄性乌苏里拟鲿的染色体序列与现有雌性乌苏里拟鲿染色体序列进行比对，获得与X染色体同源的染色体，即Y染色体序列。
优选地，步骤一中，所述雌性圆尾拟鲿的挑选标准为：腹部膨大、松软且富有弹性、仰腹可见卵巢轮廓、无伤病、体重在80克以上；所述雄性乌苏里拟鲿的挑选标准为：生殖突尖而长且末端泛红、体质强壮、无伤病、体重在200克以上。
优选地，在步骤一中，人工催产采用人工注射催产剂的方式进行。
优选地，所述催产剂采用10~15微克/千克的促黄体生成素释放激素类似物A2（LRH-A2）、1000~2000 IU/千克的人绒毛膜促性腺激素（HCG）与3~6毫克/千克的地欧酮（DOM）三种药物配制得到。
优选地，雌性圆尾拟鲿共注射两针所述催产剂，第一针只注射LRH-A2，注射量为总注射剂量的20%～30%，间隔11~14小时后第二针注射余量；雄性乌苏里拟鲿注射一针所述催产剂，注射剂量为雌性圆尾拟鲿的60%。
优选地，步骤二中，所述通过性腺观察鉴定生理性别的标准为：性腺呈肉色或半透明白色，为两条短细线状结构，在体视显微镜下不可见颗粒状细胞，为雄性；性腺呈淡黄色，为两条长带状结构，在体视显微镜下可见颗粒状细胞，为雌性。
优选地，所述利用乌苏里拟鲿雄性特异标记鉴定遗传性别的标准为：在雄性特异位点能扩增出条带的为雄性；在雄性特异位点不能扩增出条带的为雌性。
优选地，步骤三中，所述HiFi测序文库构建所用DNA为利用大片段DNA提取试剂盒抽提的高质量大片段DNA。
优选地，在步骤三中，所述Hi-C交联库构建所用肌肉组织样本为不少于1克的新鲜肌肉组织，且在建库前均用液氮保存。
优选地，步骤四中，所用雌性乌苏里拟鲿染色体序列采用Nanopore三代测序技术获得。
有益效果
（1）本发明采用圆尾拟鲿和乌苏里拟鲿的雄性杂交个体为测序样本，其Y性染色体来自乌苏里拟鲿，X染色体来自圆尾拟鲿，利用这种远缘杂交个体可有效避免直接对乌苏里拟鲿XY雄性个体测序造成的X和Y染色体序列相互干扰而无法正确组装，确保组装出的Y染色体序列准确可靠；
（2）本发明中待检测样本采用了生理性别和遗传性别同时鉴定的方法，使待检测样本的生理性别和遗传性别一致，从而确保能通过测序和组装获得乌苏里拟鲿Y染色体序列；
（3）本发明无需按照现有技术方法来构建YY超雄性个体，避免了人工性转、饲养至性成熟后再次人工繁殖、YY个体鉴定等繁琐操作，大大缩短了获得Y染色体序列所需时间，有效降低了劳动强度，提高了工作效率。
综上，本发明所提供的一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，能准确、高效地获取乌苏里拟鲿Y染色体序列，大幅度缩短现有技术条件下获得Y染色体序列所需时间，有效降低了获取Y染色体序列信息的劳动强度，可有力促进乌苏里拟鲿性别控制育种进程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，包括如下步骤：
步骤一，构建种间杂交群体：于2021年5月挑选腹部膨大、松软且富有弹性、仰腹可见卵巢轮廓、无伤病的雌性圆尾拟鲿6尾，平均体重95克；挑选生殖突尖而长且末端泛红、体质强壮、无伤病雄性乌苏里拟鲿3尾，平均体重268克；亲本挑选后于直径1.7米的圆形产卵池中暂养3天。于2021年5月20日7:00注射第一针催产剂，每尾雌性圆尾拟鲿注射5微克/千克的LRH-A2，雄性乌苏里拟鲿不注射。5月20日19:00注射第二针催产剂，每尾雌性圆尾拟鲿按照LRH-A2 10微克+HCG 1500单位+DOM 5毫克/千克注射，每尾雄性乌苏里拟鲿按照LRH-A26微克+HCG 900单位+DOM 3毫克/千克的剂量注射，之后将雌雄亲鱼放回产卵池。于5月21日6:00达到效应时间，挤出雌性圆尾拟鲿卵子于干燥的塑料盆中，将雄性乌苏里拟鲿精巢取出，在研钵中剪碎并研磨，并用0.65%生理盐水稀释，然后与雌性圆尾拟鲿的卵子混合进行人工授精。受精卵粘附在煮沸消毒过的棕榈片上，在21 °C水温条件下于5月24日5:00孵化出苗，共获得杂交个体约2000尾。
步骤二，雄性杂交个体鉴定：饲养至8月24日时，随机选取20尾杂交个体，利用解剖剪剪开每尾个体的腹部，取出性腺后，利用体视显微镜进行生理性别鉴定，发现有12尾个体的性腺呈肉色或半透明的白色，为两条短细线状结构，在体视显微镜下不可见颗粒状细胞，为雄性；8尾个体的性腺呈淡黄色，为两条长带状结构，在体视显微镜下可见颗粒状细胞，为雌性。提取上述20尾个体的DNA，利用已研发的乌苏里拟鲿雄性特异分子标记（专利公开号：CN106811540B）进行PCR扩增和电泳分析，结果表明有12尾个体在雄性特异位点能扩增出清晰条带，为雄性；8尾个体在雄性特异位点不能扩增出条带，为雌性。对比结果表明20尾个体的生理性别和遗传性别均一致。
步骤三，雄性杂交个体三代基因组测序与组装：选取鉴定出的1尾雄性杂交个体，利用大片段DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司产品）抽提其基因组DNA，按照HiFi文库构建试剂盒（美国PacBio公司产品）的操作说明构建HiFi测序文库，利用PacBio平台进行三代基因组测序。取1.5克新鲜肌肉组织于液氮中保存，取0.1克组织利用Hi-C建库试剂盒（北京百迈客生物公司产品）按照操作说明构建Hi-C交联文库，并利用Illumina Hiseq X Ten平台进行高通量测序。测序序列利用软件分别组装出了含26条染色体的雌性圆尾拟鲿和含26条染色体的雄性乌苏里拟鲿的染色体水平基因组序列。
步骤四，与雌性基因组染色体比对获得Y染色体序列：将组装获得的雄性乌苏里拟鲿的染色体序列与本团队利用Nanopore三代测序技术获得的雌性染色体序列进行比对，从而发现雄性乌苏里拟鲿的7号染色体与雌性X染色体同源，即雄性的7号染色体为Y染色体，序列长度为33.3 Mb。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，构建种间杂交群体：挑选雌性圆尾拟鲿和雄性乌苏里拟鲿亲本通过人工催产与授精，构建杂交群体；
步骤二，雄性杂交个体鉴定：取20尾饲养至3月龄的杂交个体，解剖取出性腺，利用体视显微镜观察性腺进行生理性别鉴定，并将每尾个体通过乌苏里拟鲿雄性特异分子标记进行遗传性别鉴定，将两种方法均鉴定为雄性的个体作为待检测样本；
步骤三，雄性杂交个体三代基因组测序与组装：从待检测样本提取基因组DNA后构建HiFi测序文库，利用肌肉组织构建Hi-C交联文库，进行三代基因组测序与染色体水平基因组组装；
步骤四，与雌性基因组染色体比对获得Y染色体序列：将组装获得的雄性乌苏里拟鲿的染色体序列与现有雌性乌苏里拟鲿染色体序列进行比对，获得与X染色体同源的染色体，即Y染色体序列。
2.如权利要求1所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤一中，所述雌性圆尾拟鲿的挑选标准为：腹部膨大、松软且富有弹性、仰腹可见卵巢轮廓、无伤病、体重在80克以上；
所述雄性乌苏里拟鲿的挑选标准为：生殖突尖而长且末端泛红、体质强壮、无伤病、体重在200克以上。
3.如权利要求1所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤一中，所述人工催产采用人工注射催产剂的方式进行。
4. 如权利要求3所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，所述催产剂采用10~15微克/千克的促黄体生成素释放激素类似物A2（LRH-A2）、1000~2000 IU/千克的人绒毛膜促性腺激素（HCG）与3~6毫克/千克的地欧酮（DOM）三种药物配制得到。
5.如权利要求4所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，雌性圆尾拟鲿共注射两针所述催产剂，第一针只注射LRH-A2，注射量为总注射剂量的20%～30%，间隔11~14小时后第二针注射余量；
雄性乌苏里拟鲿注射一针所述催产剂，注射剂量为雌性圆尾拟鲿的60%。
6.如权利要求1所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤二中，所述通过性腺观察鉴定生理性别的标准为：性腺呈肉色或半透明白色，为两条短细线状结构，在体视显微镜下不可见颗粒状细胞，为雄性；性腺呈淡黄色，为两条长带状结构，在体视显微镜下可见颗粒状细胞，为雌性。
7.如权利要求1所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤二中，所述利用乌苏里拟鲿雄性特异标记鉴定遗传性别的标准为：在雄性特异位点能扩增出条带的为雄性；在雄性特异位点不能扩增出条带的为雌性。
8.如权利要求1所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤三中，所述HiFi测序文库构建所用DNA为利用大片段DNA提取试剂盒抽提的高质量大片段DNA。
9.如权利要求1所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤三中，所述Hi-C交联文库构建所用肌肉组织样本为不少于1克的新鲜样本，且在建库前均用液氮保存。
10.如权利要求1至9中任一项所述的乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法，其特征在于，在步骤四中，所用雌性乌苏里拟鲿染色体序列采用Nanopore三代测序技术获得。
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