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CN114112595B - 一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法 - Google Patents

一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法 Download PDF

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CN114112595B CN202111474352.7A CN202111474352A CN114112595B CN 114112595 B CN114112595 B CN 114112595B CN 202111474352 A CN202111474352 A CN 202111474352A CN 114112595 B CN114112595 B CN 114112595B
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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域,尤其是一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法。该方法包括如下步骤:(1)糖化:取动物血清白蛋白溶于0.05‑2mol/L的磷酸盐缓冲液中,至动物血清白蛋白的浓度达到10‑60g/L,加入葡萄糖至葡萄糖浓度达到1.25‑7.5g/L,40‑70℃水浴条件下800‑2000r/min搅拌6‑10h,置入冰箱,放置5‑24h,得试剂液A;(2)去除葡萄糖;(3)分装。本发明安全性高,原料用量少、产率高、耗时低,使用生物学方法去除剩余的葡萄糖,无需冻干、透析,2‑8℃保存长期稳定性良好。

Description

一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,尤其是一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法。
背景技术
血清果糖胺是葡萄糖与血清蛋白进行非酶促糖化反应形成的高分子酮胺结构,又称糖化血清蛋白,它的浓度与血糖水平成正相关,并相对保持稳定。由于血清蛋白的半衰期为17-20天,故果糖胺可以反映检测前2-3周内的平均血糖水平,果糖胺的测定可以辅助糖尿病的诊断、病情监测、疗效观察。
果糖胺测定试剂盒(四氮唑蓝法)用于体外定量检测人血清样本中果糖胺(FMN)的含量。目前报导的作为测定果糖胺的校准物有:糖化人血清蛋白、1-脱氧-1-吗啉-D-果糖(DMF)、五乙酸葡萄糖脂(GPA)和1-脱氧-1-哌啶-D-果糖。上述测定果糖胺的校准物存在如下不足:(1)糖化人血清蛋白需要人血清蛋白作为反应底物,存在生物安全隐患;(2)1-脱氧-1-吗啉-D-果糖和1-脱氧-1-哌啶-D-果糖价格昂贵,增加了生产成本;(3)五乙酸葡萄糖脂不易溶于水,溶解时需要添加丙酮,但丙酮易挥发,影响浓度。
现有的果糖胺测定试剂盒的制备方法大多采用以下两种工艺路线:
方法一:生理盐水+40g/L人血清白蛋白→D-葡萄糖1.5kg/L→50℃水浴搅拌8h→4℃过夜→冻干;
方法二:Dulbecco磷酸盐缓冲液→饱和葡萄糖→人血清白蛋白100g/L→37℃四天→→透析48h。
上述方法中,方法一的不足为:使用了人血清白蛋白,潜在生物安全风险;原料使用量高、产率低,过程消耗时长;需透析、大量原料被浪费;需冻干、冻干品使用时需复溶,增加使用不方便,且复溶后易不稳定,能量消耗大,成本高。方法二的不足为:原料使用量高、产率低,耗时长,使用了人血清白蛋白,潜在生物安全风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,克服前述现有技术的不足,使用牛血清白蛋白,安全性高,原料用量少、产率高、耗时低,使用生物学方法去除剩余的葡萄糖,无需冻干、透析,2-8℃保存长期稳定性良好。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是:
一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)糖化:取动物血清白蛋白溶于0.05-2mol/L的磷酸盐缓冲液中,至动物血清白蛋白的浓度达到10-60g/L,加入葡萄糖至葡萄糖浓度达到1.25-7.5g/L,40-70℃水浴条件下800-2000r/min搅拌6-10h,置入冰箱,放置5-24h,得试剂液A;
(2)去除葡萄糖:从冰箱中取出试剂液A加入葡萄糖氧化酶,至葡萄糖氧化酶浓度达到0.1-10KU/L,20-60℃水浴,水浴过程中50-2000r/min搅拌0.5-6h,用0.05-2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至2.20±0.5mmol/L;
(3)分装:步骤(2)反应结束后加入防腐剂至防腐剂的浓度达到0.5-5g/L,分装,2-8℃保存。
优选的,所述动物血清白蛋白选用牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、兔血清白蛋白中的任一种。
优选的,所述磷酸盐缓冲液的pH为4-9。
优选的,所述步骤(1)中冰箱的温度设置为2-8℃。
优选的,所述步骤(3)中的防腐剂选用叠氮钠、Proclin系列防腐剂、甲基异噻唑啉酮、山梨酸钾、苯甲酸钠中的一种或多种。
优选的,所述步骤(3)的分装过程分装为0.5mL/支,或1mL/支,或2mL/支。
优选的,所述步骤(1)中,取牛血清白蛋白溶于0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中,至动物血清白蛋白的浓度达到40g/L,磷酸盐缓冲液的pH为7.5,加入葡萄糖至葡萄糖浓度达到5g/L,60℃水浴条件下1000r/min搅拌8h,置入冰箱,放置12h,得试剂液A。
优选的,所述步骤(2)中,从冰箱中取出试剂液A加入葡萄糖氧化酶至葡萄糖氧化酶的浓度达1KU/L,25℃水浴,水浴过程中200r/min搅拌2h,用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至2.2mmol/L。
优选的,所述步骤(3)中,加入叠氮钠至叠氮钠的浓度达1g/L。
本发明的有益效果是:与现有技术相比,本发明的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法具有以下优点:(1)使用动物血清白蛋白,例如牛血清白蛋白,相对来源广泛,价格低廉,并降低了生物安全风险;(2)无需冻干、透析,降低了生产时长,减少了能耗及成本;(3)大大减少了葡萄糖的使用量,降低成本;(4)长期稳定性良好;(5)能够直接使用,无需复溶。
具体实施方式
实施例1
一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)糖化过程:取牛血清白蛋白40g溶于1L0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中,磷酸盐缓冲液的pH为7.5,加入5g葡萄糖完全溶解后,60℃水浴条件下1000r/min搅拌8h,置入冰箱。2℃下放置12h;
(2)去除葡萄糖过程:加入葡萄糖氧化酶1KU,25℃水浴200r/min搅拌2h,用0.2L0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释。
(3)分装:反应结束后加入1g叠氮钠,分装为1mL/支,2-8℃保存。
实施例2
一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)糖化:取羊血清白蛋白20g溶于1L0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中,磷酸盐缓冲液的pH为7.5,加入2.5g葡萄糖完全溶解后,60℃水浴条件下1200r/min搅拌10h,置入冰箱,4℃下放置20h,得试剂液A;
(2)去除葡萄糖:从冰箱中取出试剂液A加入葡萄糖氧化酶0.5KU,35℃水浴,水浴过程中500r/min搅拌0.5h,用0.1L0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释;
(3)分装:步骤(2)反应结束后加入0.6g山梨酸钾,分装为1mL/支,2-8℃保存。
实施例3
一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,包括如下步骤:
(1)糖化:取兔血清白蛋白55g溶于1L0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中,磷酸盐缓冲液的pH为7.5,加入7g葡萄糖完全溶解后,60℃水浴条件下1500r/min搅拌8h,置入冰箱,3℃下放置8h,得试剂液A;
(2)去除葡萄糖:从冰箱中取出试剂液A加入葡萄糖氧化酶2KU,30℃水浴,水浴过程中500r/min搅拌3h,用0.35L0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释;
(3)分装:步骤(2)反应结束后加入1.5g甲基异噻唑啉酮,分装为1mL/支,2-8℃保存。
试验例1
对实施例1中制得的果糖胺测定试剂盒液体校准品进行长期稳定性试验,并对长期稳定性数据进行处理,得到如表1和表2的结果:
表1
表2
由表1和表2能够看出,P≥0.05,14个月内变化趋势不显著。表明实施例1制得的果糖胺测定试剂盒液体校准品长期稳定性良好。
试验例2
对实施例2中制得的果糖胺测定试剂盒液体校准品进行长期稳定性试验,并对长期稳定性数据进行处理,得到如表3和表4的结果:
表3
表4
由表3和表4能够看出,P≥0.05,14个月内变化趋势不显著。表明实施例2制得的果糖胺测定试剂盒液体校准品长期稳定性良好。
试验例3
对实施例3中制得的果糖胺测定试剂盒液体校准品进行长期稳定性试验,并对长期稳定性数据进行处理,得到如表5和表6的结果:
表5
表6
由表5和表6能够看出,P≥0.05,14个月内变化趋势不显著。表明实施例3制得的果糖胺测定试剂盒液体校准品长期稳定性良好。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案,本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样,任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰,皆应落入本发明的专利保护范围。

Claims (8)

1.一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)糖化:取动物血清白蛋白溶于0.05-2mol/L的磷酸盐缓冲液中,至动物血清白蛋白的浓度达到10-60g/L,加入葡萄糖至葡萄糖浓度达到1.25-7.5g/L,60℃水浴条件下800-2000r/min搅拌6-10h,置入冰箱,冰箱的温度设置为2-8℃,放置5-24h,得试剂液A;
(2)去除葡萄糖:从冰箱中取出试剂液A加入葡萄糖氧化酶,至葡萄糖氧化酶浓度达到0.1-10KU/L,20-60℃水浴,水浴过程中50-2000r/min搅拌0.5-6h,用0.05-2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至2.20±0.5mmol/L;
(3)分装:步骤(2)反应结束后加入防腐剂至防腐剂的浓度达到0.5-5g/L,分装,2-8℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述动物血清白蛋白选用牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、兔血清白蛋白中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述磷酸盐缓冲液的pH为4-9。
4.根据权利要求1所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中的防腐剂选用叠氮钠、Proclin系列防腐剂、甲基异噻唑啉酮、山梨酸钾、苯甲酸钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)的分装过程分装为0.5mL/支,或1mL/支,或2mL/支。
6.根据权利要求4所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,取牛血清白蛋白溶于0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中,至动物血清白蛋白的浓度达到40g/L,磷酸盐缓冲液的pH为7.5,加入葡萄糖至葡萄糖浓度达到5g/L,60℃水浴条件下1000r/min搅拌8h,置入冰箱,放置12h,得试剂液A。
7.根据权利要求6所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,从冰箱中取出试剂液A加入葡萄糖氧化酶至葡萄糖氧化酶的浓度达1KU/L,25℃水浴,水浴过程中200r/min搅拌2h,用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至2.2mmol/L。
8.根据权利要求7所述的一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中,加入叠氮钠至叠氮钠的浓度达1g/L。
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