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CN114272236A - 用于判断线粒体氧化磷酸化通路抑制剂抗癌效果的标志物 - Google Patents

用于判断线粒体氧化磷酸化通路抑制剂抗癌效果的标志物 Download PDF

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CN114272236A
CN114272236A CN202011034567.2A CN202011034567A CN114272236A CN 114272236 A CN114272236 A CN 114272236A CN 202011034567 A CN202011034567 A CN 202011034567A CN 114272236 A CN114272236 A CN 114272236A
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Abstract

本发明涉及用于判断线粒体氧化磷酸化通路抑制剂抗癌效果的标志物。具体地，本发明涉及一种线粒体氧化磷酸化通路抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肿瘤。本发明发现线粒体氧化磷酸化通路抑制剂对NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤具有显著优异的治疗效果。

Description

用于判断线粒体氧化磷酸化通路抑制剂抗癌效果的标志物
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地涉及用于判断线粒体氧化磷酸化通路抑制剂抗癌效果的标志物。
背景技术
线粒体在真核细胞中普遍存在，为细胞的生命活动提供能量和其他细胞生长必需的中间产物。线粒体作为细胞内的能量工厂和原料来源，也是肿瘤细胞成瘤不可或缺的细胞器，抑制线粒体功能能有效抑制肿瘤的发生发展，降低病人肿瘤的恶性程度，增加病人的生存期。
氧化磷酸化通路(Oxidative Phospholytion,OXPHOS)是线粒体最重要的通路之一，该通路利用三羧酸循环和脂肪氧化等通路来源的NADH和FADH等来合成ATP。线粒体氧化磷酸化通路有90余个蛋白组成，这些蛋白分别组成5个蛋白复合体，复合体I、II、III、IV和V。前4个蛋白复合体(复合体I、II、III和IV)又称为电子传递链，它们从电子供体NADH和FADH得到电子并将其传递给氧气。在传递电子的过程中，氢离子从线粒体内膜内侧泵到线粒体内膜和线粒体外膜间的膜间腔，从而在内膜内外形成氢离子梯度和电势差。储存于线粒体膜电势中的能量驱动氧化磷酸化通路中的复合体V，从而产生ATP。恶性程度较高的具有干细胞特性的癌细胞极为依赖该通路存活，抑制该通路可有效杀伤此类癌细胞，从而可解决相关恶性癌症复发问题，此类肿瘤能量代谢类药物是新一代抗癌药物研发的重要方向。
近年来人们发现一些可有效靶向线粒体氧化磷酸化通路的小分子，这些小分子在多种肿瘤模型和临床实验中取得明显抗癌效果，特别是对一些复发或转移的恶性癌症效果更好，能够为未满足的临床需求提供有效的解决方案。如发表在《Nature》的一项研究发现胰腺癌中引起其复发的肿瘤细胞对氧化磷酸化通路抑制剂Oligomycin非常敏感，此类抑制剂可有效杀伤肿瘤细胞，阻断肿瘤复发，参见Viale,A.,Pettazzoni,P.,Lyssiotis,C.etal.Oncogene ablation-resistant pancreatic cancer cells depend onmitochondrial function.Nature 514,628–632(2014)；同样发表在《Nature》的另一项研究发现线粒体氧化磷酸化通路抑制剂Gboxin对脑瘤等多种肿瘤有较好杀伤作用，可有效抑制肿瘤生长，参见Shi,Y.,Lim,S.K.,Liang,Q.et al.Gboxin is an oxidativephosphorylation inhibitor that targets glioblastoma.Nature 567,341–346(2019)；发表在《Nature Medicine》的一项研究发现线粒体氧化磷酸化通路抑制剂IACS-010759对脑瘤和急性骨髓性白血病等有很好抑制效果，参见Molina,J.R.,Sun,Y.,Protopopova,M.et al.An inhibitor of oxidative phosphorylation exploits cancervulnerability.Nat Med 24,1036–1046(2018)。
同时有各种研究及临床案例发现，各类型抗肿瘤药物并不会对所有肿瘤都有效，某些肿瘤细胞对特定抗肿瘤药物不敏感，特定抗肿瘤药物用在对其不敏感的肿瘤细胞或肿瘤病人上不但起不到较好治疗效果，反而会贻误治疗时机，对肿瘤病人有很大的负面影响。特别是截至目前，针对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂这类新颖抗癌药物的特定肿瘤标记物还知之甚少。相关肿瘤标记物的发现能够为线粒体氧化磷酸化通路抑制剂这类特定抗肿瘤药物提供精确的用药指引，显著提高其给药效果，实现对癌症患者的精准化治疗，从而显著提高相关癌症患者的临床治疗效果，并可避免对不适合使用此类特定抗癌药物的患者用药，贻误其病情。
因此，本领域亟需开发一种能够有效指引线粒体氧化磷酸化抑制剂这类抗肿瘤药物使用的生物标志物，从而精确指导该类药物用药，显著提升其治疗效果。
发明内容
本发明所述的目的在于提供一种NNMT基因和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗的标志物。线粒体氧化磷酸化通路抑制剂对NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤具有显著优异的治疗效果。
本发明第一方面，提供一种线粒体氧化磷酸化通路抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括NNMT基因低表达或未表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤。
在另一优选例中，所述NNMT基因低表达或未表达的肿瘤是指从该肿瘤中提取的1ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，更佳地是指从该肿瘤中提取的5ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，更佳地是指从该肿瘤中提取的10ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，更佳地是指从该肿瘤中提取的100ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，是指从该肿瘤中提取的1000ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白。
在另一优选例中，所述NNMT基因低表达或未表达是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
在另一优选例中，所述的同一细胞是指NNMT基因正常表达的细胞(如癌细胞)。
在另一优选例中，所述的正常细胞是指NNMT基因正常表达的正常组织细胞(如癌细胞起源细胞或邻近细胞)。
在另一优选例中，E0为NNMT基因正常表达细胞的NNMT基因的表达水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因正常表达的细胞包括对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂不敏感的细胞。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平(M％)≥3％且小于等于M％，其中，M为3-100之间的任一正整数。
在另一优选例中，M为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95或100。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平是指某基因区域甲基化的CpG核苷酸数量占该基因区域所有核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区CpG位点甲基化水平是指NNMT基因区的甲基化的CpG核苷酸数量占NNMT基因区所有核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平是指某基因区域甲基化的CpG核苷酸数量占该基因区域所有CpG核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区CpG位点甲基化水平是指NNMT基因区的甲基化的CpG核苷酸数量占NNMT基因区所有CpG核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的DNA CpG位点甲基化水平是指某区域DNA已甲基化的CpG位点数量占该区域DNA的全部CpG位点数量的比值。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因区DNA已甲基化的CpG位点数量占NNMT基因区DNA的全部CpG位点数量的比值。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、脑瘤、肝癌、前列腺癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肺癌选自下组：非小细胞肺癌、小细胞肺癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的结肠癌包括结肠腺癌。
在另一优选例中，所述的淋巴癌选自下组：B淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的淋巴癌包括弥漫大B淋巴瘤。
在另一优选例中，所述的脑瘤包括胶质母细胞瘤。
在另一优选例中，所述的肾癌包括肾透明细胞腺癌。
在另一优选例中，所述的肾癌的癌细胞包括肾癌Wilms细胞。
在另一优选例中，所述的白血病选自下组：T淋巴细胞白血病、髓细胞性白血病，或其组合。
在另一优选例中，所述的T淋巴细胞白血病包括急性T淋巴细胞白血病。
在另一优选例中，所述的髓细胞性白血病包括M4级AML急性髓细胞性白血病。
在另一优选例中，所述的髓细胞性白血病包括FAB M4级AML急性髓细胞性白血病
在另一优选例中，所述的表达包括蛋白表达和/或mRNA表达。
在另一优选例中，所述的线粒体氧化磷酸化通路抑制剂选自下组：
Figure BDA0002704737070000041
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的表达为mRNA或蛋白表达。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂
在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球或膜剂。
本发明第二方面，提供一种用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗的标志物，所述的标志物包括NNMT基因和/或NNMT基因区DNACpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，则该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNACpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
本发明第三方面，提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括：
(i)用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平的检测试剂。
在另一优选例中，所述检测试剂盒的检测样本包括肿瘤细胞。
在另一优选例中，NNMT基因表达是指该基因mRNA和该蛋白的表达；
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因启动子区DNACpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
本发明第四方面，提供一种如发明第三方面所述的检测试剂盒的用途，用于制备一伴随诊断试剂盒，所述伴随诊断试剂盒用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的伴随诊断试剂盒还包括说明书或标签
在另一优选例中，所述的说明书或标签记载：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，则该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的说明书或标签记载：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平高是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平低是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≤15％,较佳地≤10％,更佳地≤5％，更佳地≤3％，更佳地≤2％，更佳地≤1％。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
本发明第五方面，提供一种药盒，所述的药盒包括：
(i)用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平的检测试剂；和
(ii)线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
在另一优选例中，所述的药盒还包括说明书或标签。
在另一优选例中，所述的说明书或标签记载：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNACpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平高是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平低是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≤15％,较佳地≤10％,更佳地≤5％，更佳地≤3％，更佳地≤2％，更佳地≤1％。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
本发明第六方面，提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，给所需的对象施用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤如本发明第一方面所述。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤包括NNMT基因低表达或未表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤包括NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述对象为人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。
本发明第七方面，提供一种装置或系统，所述的装置或系统包括：
(i)检测模块，所述的检测模块用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平；
(ii)输出模块，所述的输出模块包括输出以下信息：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，则该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗；和/或
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平为NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括肿瘤细胞的NNMT基因表达和/或NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括肿瘤细胞的NNMT基因表达和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括肿瘤细胞的NNMT基因表达和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平高是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平低是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≤15％,较佳地≤10％,更佳地≤5％，更佳地≤3％，更佳地≤2％，更佳地≤1％。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
在另一优选例中，所述的装置包括基因检测仪或蛋白检测仪。
在另一优选例中，所述的装置或系统还包括进样模块。
在另一优选来了，所述的进样模块用于进肿瘤细胞提取物。
在另一优选例中，所述的装置或系统还包括数据处理模块。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高低。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平高低。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平高低。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平高低。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为不同癌细胞的NNMT基因表达情况。
图2为各肿瘤细胞NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平
图3为各肿瘤细胞NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp之间区域DNA CpG位点甲基化水平。
图4为各肿瘤细胞NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点前193bp之间区域DNA CpG位点甲基化水平。
图5为Gboxin抑制相关肿瘤细胞的IC50(μM)。
图6为相关肿瘤细胞的NNMT基因相对转录水平。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，首次意外地发现线粒体氧化磷酸化通路抑制剂对NNMT基因低表达(或未表达)和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤细胞具有显著的抑制作用。NNMT基因表达水平和/或NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平能够作为判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗的标志物。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“DNA CpG位点甲基化水平高”、“DNA CpG位点甲基化高水平”与“DNA CpG位点高甲基化”可互换使用。
如本文所用，术语“DNA CpG位点甲基化低水平”、“DNA CpG位点甲基化水平低”与“DNA CpG位点低甲基化”可互换使用。
如本文所用，术语“DNA CpG位点甲基化水平”是指某一DNA区域内已甲基化的CpG位点数量占该区域内所有CpG位点数量的比例。
如本文所用，术语“IC50”与“IC50”可互换使用，是指半抑制浓度(50％inhibitingconcentration)，即达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。
如本文所用，术语“CpG位点甲基化”、“CpG核苷酸甲基化”与“CpG甲基化”可互换使用。
如本文所用，“肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂”包括肿瘤患者的肿瘤对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂敏感。
如本文所用，“肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂”包括肿瘤患者的肿瘤对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂不敏感。
在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。
本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的线粒体氧化磷酸化通路抑制剂时观察到的水平相比，本发明所述线粒体氧化磷酸化通路抑制剂将相关疾病(如肿瘤)及其并发症减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
线粒体氧化磷酸化通路
氧化磷酸化通路(Oxidative Phosphorylation,OXPHOS)是线粒体最重要的通路之一，该通路利用三羧酸循环和脂肪氧化等通路来源的NADH和FADH等来合成ATP。线粒体氧化磷酸化通路有90余个蛋白组成，这些蛋白分别组成5个蛋白复合体，复合体I、II、III、IV和V。前4个蛋白复合体(复合体I、II、III和IV)又称为电子传递链，它们从电子供体NADH和FADH得到电子并将其传递给氧气。在传递电子的过程中，氢离子从线粒体内膜内侧泵到线粒体内膜和线粒体外膜间的膜间腔，从而在内膜内外形成氢离子梯度和电势差。储存于线粒体膜电势中的能量驱动氧化磷酸化通路中的复合体V，从而产生ATP。研究表明，线粒体氧化磷酸化通路对细胞生长非常重要，与许多疾病有关，例如癌症、免疫相关疾病、神经退行性疾病，抑制线粒体氧化磷酸化通路能够用于治疗癌症、免疫相关疾病、神经退行性疾病，尤其是恶性程度较高的具有干细胞特性的癌细胞极为依赖该通路存活，抑制该通路可有效杀伤此类癌细胞，从而可解决相关恶性癌症复发问题。
NNMT基因
NNMT基因英文名为Nicotinamide N-Methyltransferase,不同网站对该基因有不同的识别号：HGNC:7861；Entrez Gene:4837；Ensembl:ENSG00000166741；OMIM:600008；UniProtKB:P40261。
NNMT基因区位于人类11号染色体第114,255,831到114,313,285，总长为57455bp的DNA序列，包括NNMT基因启动子区、NNMT基因外显子区和NNMT基因内含子区。
NNMT基因启动子区：人11号染色体第114,255,831到114,258，331，也就是NNMT基因转录起始位点之前2000bp至转录起始位点之后500bp之间的区域为NNMT基因启动子区。
NNMT基因启动子区序列为NNMT基因转录起始位点之前2000bp(黑色加深无下划线部分)以及之后500bp之间的序列(非黑色加深下划线部分)，如SEQ ID NO:1所示：
Figure BDA0002704737070000111
Figure BDA0002704737070000121
DNA甲基化(DNA methylation)
DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。广义上的DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，以s-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位及鸟嘌呤的N-7位等位点。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5—甲基胞嘧啶(5-mC)，是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式。DNA甲基化作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。
DNA甲基化反应分为2种类型。一种是2条链均未甲基化的DNA被甲基化，称为从头甲基化(denovo methylation)；另一种是双链DNA的其中一条链已存在甲基化，另一条未甲基化的链被甲基化，这种类型称为保留甲基化(maintenance methylation)。
典型地，DNA甲基化为DNA CpG位点甲基化。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率。CpG位点富集区(又称CpG岛)主要位于基因的启动子(promotor)和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。这里CpG是胞嘧啶(C)—磷酸(p)—鸟嘌呤(G)的缩写。
细胞内基因表达受多种信号传导通路、转录因子和表观遗传修饰的调控。DNA甲基化修饰是表观遗传修饰调控基因表达的重要方式，特定基因区DNA甲基化水平往往影响该基因的表达水平。相对于信号传导通路和转录因子等对基因表达的调控，表观遗传修饰中的DNA甲基化修饰对基因表达的影响更加稳定，并不易被细胞外环境所影响，DNA甲基化修饰容易用现有技术精准检测，因此是较为理想的生物标志物。
线粒体氧化磷酸化通路抑制剂及其用途
本发明提供一种线粒体氧化磷酸化通路抑制剂，用于预防和/或治疗肿瘤(癌症)。
代表性地，所述的线粒体氧化磷酸化通路抑制剂选自下组：
Figure BDA0002704737070000131
Figure BDA0002704737070000141
癌症
本发明研究表明，本发明所述的线粒体氧化磷酸化通路抑制剂能够用于预防和/或治疗肿瘤。
在本发明中，术语“肿瘤”、“癌症”、“癌”和“瘤”可互换使用。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括NNMT基因低表达或未表达的肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述肿瘤包括NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤。
在一个优选例中，所述NNMT基因低表达或未表达的肿瘤是指从该肿瘤中提取的1ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，更佳地是指从该肿瘤中提取的5ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，更佳地是指从该肿瘤中提取的10ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，更佳地是指从该肿瘤中提取的100ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白，是指从该肿瘤中提取的1000ug蛋白中通过NNMT抗体检测不到NNMT蛋白。
在一个优选例中，所述NNMT基因低表达或未表达是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
在另一优选例中，所述的同一细胞是指NNMT基因正常表达的细胞(如癌细胞)。
在另一优选例中，所述的正常细胞是指NNMT基因正常表达的正常组织细胞(如癌细胞起源细胞或邻近细胞)。
在另一优选例中，E0为NNMT基因正常表达细胞的NNMT基因的表达水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因正常表达的细胞包括对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂不敏感的细胞。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平(M％)≥3％且小于等于M％，其中，M为3-100之间的任一正整数。
在另一优选例中，M为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95或100。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平是指某基因区域甲基化的CpG核苷酸数量占该基因区域所有核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区CpG位点甲基化水平是指NNMT基因区的甲基化的CpG核苷酸数量占NNMT基因区所有核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平是指某基因区域甲基化的CpG核苷酸数量占该基因区域所有CpG核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区CpG位点甲基化水平是指NNMT基因区的甲基化的CpG核苷酸数量占NNMT基因区所有CpG核苷酸数量的比值。
在另一优选例中，所述的DNA CpG位点甲基化水平是指某区域DNA已甲基化的CpG位点数量占该区域DNA的全部CpG位点数量的比值。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因区DNA已甲基化的CpG位点数量占NNMT基因区DNA的全部CpG位点数量的比值。
在本发明的一个优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
优选地，所述NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
优选地，所述NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
代表性地，所述的肿瘤包括(但不限于)：肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、脑瘤、肝癌、前列腺癌，或其组合。
典型地，所述的肺癌包括(但不限于)：非小细胞肺癌、小细胞肺癌，或其组合。
典型地，所述的结肠癌包括结肠腺癌。
典型地，所述的淋巴癌包括(但不限于)：B淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴癌，或其组合。
典型地，所述的淋巴癌包括弥漫大B淋巴瘤。
典型地，所述的脑瘤包括胶质母细胞瘤。
典型地，所述的肾癌包括肾透明细胞腺癌。
典型地，所述的肾癌的癌细胞包括肾癌Wilms细胞。
典型地，所述的白血病包括(但不限于)：T淋巴细胞白血病、髓细胞性白血病，或其组合。
典型地，所述的T淋巴细胞白血病包括急性T淋巴细胞白血病。
典型地，所述的髓细胞性白血病包括M4级AML急性髓细胞性白血病。
典型地，所述的髓细胞性白血病包括FAB M4级AML急性髓细胞性白血病典型地，所述的表达包括蛋白表达和/或mRNA表达。
标志物
本发明还提供一种用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗的标志物，所述的标志物包括NNMT基因和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平。
优选地，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNACpG位点甲基化水平。
在一个实施方式中，NNMT基因和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平作为判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗的标志物，其方法包括但不限于：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，则该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗；和/或
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
检测试剂盒及其用途
本发明提供一种用于检检测试剂盒，所述的所述的检测试剂盒包括：
(i)用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平的检测试剂。
本发明还提供一种本发明所述检测试剂盒的用途，用于制备一伴随诊断试剂盒，所述伴随诊断试剂盒用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的伴随诊断试剂盒还包括说明书或标签
在另一优选例中，所述的说明书或标签记载：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，则该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗；和/或
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平高是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平低是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≤15％,较佳地≤10％,更佳地≤5％，更佳地≤3％，更佳地≤2％，更佳地≤1％。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
药盒
本发明还提供一种药盒，所述的药盒包括：
(i)用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平的检测试剂；和
(ii)线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
在另一优选例中，所述的药盒还包括说明书或标签。
在另一优选例中，所述的说明书或标签记载：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗；和/或
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNACpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平是指NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平高是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平低是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≤15％,较佳地≤10％,更佳地≤5％，更佳地≤3％，更佳地≤2％，更佳地≤1％。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
预防和/或治疗肿瘤的方法，
本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，给所需的对象施用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤包括NNMT基因低表达或未表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述对象的肿瘤包括NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤。
在另一优选例中，所述对象为人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。
装置或系统
本发明还提供一种装置或系统，所述的装置或系统包括：
(i)检测模块，所述的检测模块用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平；
(ii)输出模块，所述的输出模块包括输出以下信息：
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因低表达或未表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高，则该肿瘤患者适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗；和/或
当肿瘤患者的肿瘤细胞中NNMT基因高表达或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低，则该肿瘤患者不适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
在另一优选例中，所述的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平为NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括肿瘤细胞的NNMT基因表达和/或NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括肿瘤细胞的NNMT基因表达和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括肿瘤细胞的NNMT基因表达和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平高是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≥3％，较佳地≥5％，较佳地≥10％，较佳地≥15％,较佳地≥20％,更佳地≥25％，更佳地≥30％，更佳地≥40％，更佳地≥50％。
在另一优选例中，所述的CpG位点甲基化水平低是指相关区域内DNA CpG位点甲基化水平≤15％,较佳地≤10％,更佳地≤5％，更佳地≤3％，更佳地≤2％，更佳地≤1％。
在另一优选例中，所述NNMT基因高表达或是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因的表达E1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因的表达E0的比值(E1/E0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2，更佳地≥3，更佳地≥5。
在另一优选例中，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平低是指某一细胞(如癌细胞)的NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A1与同一细胞或正常细胞(如癌旁组织细胞)中NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平A0的比值(A1/A0)≤0.7，更佳地≤0.6，更佳地≤0.5，更佳地≤0.4，更佳地≤0.3、更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，更佳地≤0.05，更佳地≤0.01，更佳地≤0.005，更佳地≤0.001，更佳地≤0.0001，更佳地≤0.00001，更佳地≤0.000001，更佳地≤0.0000001。
在另一优选例中，所述的装置包括基因检测仪或蛋白检测仪。
在另一优选例中，所述的装置或系统还包括进样模块。
在另一优选来了，所述的进样模块用于进肿瘤细胞提取物。
在另一优选例中，所述的装置或系统还包括数据处理模块。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高低。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平高低。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点后500bp区域内DNA CpG位点甲基化水平高低。
在另一优选例中，所述的数据处理模块处理得到NNMT基因表达高低和/或NNMT基因转录起始位点前1050bp到基因转录起始位点前193bp区域内DNA CpG位点甲基化水平高低。
组合物或制剂、活性成分的组合和药盒和施用方法
本发明所述的组合物优选为药物组合物，本发明所述的组合物可以包括药学上可接受的载体。
如本文所用“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料，它们适合于人体或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物组合物中的各组分和药物的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。
应理解，在本发明中，所述的药学上可接受的载体没有特别的限制，可选用本领域常用材料，或用常规方法制得，或从市场购买得到。药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂
代表性地，所述的组合物或制剂的剂型为片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球或膜剂。
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药剂还可与其他协同治疗剂一起使用(包括之前、之中或之后使用)。使用药物组合物或制剂时，是将安全有效量的药物施用于所需对象(如人或非人哺乳动物)，所述安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
线粒体氧化磷酸化通路抑制剂是一类新颖的抗肿瘤药物，特别是对一些复发或转移的恶性癌症治疗效果显著，能够为当前未满足的临床需求提供新的解决方案，相关生物标志物可有效识别出对此类新颖抗肿瘤药物敏感的肿瘤患者，提升其治疗效果，并可避免将该类药物施用于对其不敏感的肿瘤患者，从而可实现该类药物的精准化应用。本发明首次意外通过系统研究发现NNMT基因表达水平和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平能够作为判断特定肿瘤细胞是否适合应用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂治疗的标志物。NNMT基因低表达或未表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂药物敏感性高，即氧化磷酸化通路抑制剂药物对NNMT基因低表达或未表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的的肿瘤具有优异的治疗作用。而且，DNA CpG位点甲基化水平的检测手段成熟、稳定、可靠，适合分子标记物的开发。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
Oligomycin A、Gboxin、IACS-010759均是已知的线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
Oligomycin A化合物的结构式如下：
Figure BDA0002704737070000211
Gboxin化合物的结构式如下：
Figure BDA0002704737070000221
IACS-010759化合物的结构式如下：
Figure BDA0002704737070000222
NNMT基因启动子区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例1
使用细胞活性检测试剂检测对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂小分子OligomycinA和Gboxin敏感和不敏感的肿瘤细胞系。
实验背景：细胞活力检测采用Promega CellTiter-Glo试剂盒，该试剂盒通过直接检测细胞内ATP含量反应细胞活力。本实验检测线粒体氧化磷酸化通路抑制剂小分子Oligomycin A和Gboxin对不同肿瘤细胞系细胞活力抑制的IC50值。
实验方法和结果：各肿瘤细胞均培养于含有10％FBS的培养基中(加p/s)，细胞传代3小时后，加入梯度稀释的Oligomycin A和Gboxin小分子，培养3-4天后测定相关半抑制剂量IC50。
实验结果如表1所示：
表1 Oligomycin A和Gboxin对不同细胞株的抑制作用(IC50)
Figure BDA0002704737070000223
Figure BDA0002704737070000231
备注：IC50为半抑制浓度(50％inhibiting concentration)，即达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。
由表1可知，对不同肿瘤细胞进行Oligomycin A、Gboxin等线粒体氧化磷酸化通路抑制剂的敏感性检测发现NCI-H82(人小细胞肺癌细胞)、G-401(人肾癌Wilms细胞)、MDA-MB-453(乳腺癌细胞)、SW48(人结肠腺癌细胞)和WSU-DLCL2(人弥漫大B淋巴瘤细胞)对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂是敏感的(IC50值较低)。而786-O(肾透明细胞腺癌细胞系)、CFPAC-1(人胰腺癌细胞)、GB-1(人脑胶质母细胞瘤细胞)和SF126(人脑瘤细胞)对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂是不敏感的(IC50值较高)。
实施例2
对Oligomycin A、Gboxin等线粒体氧化磷酸化通路抑制剂敏感的5例肿瘤细胞系和不敏感的4例肿瘤细胞系使用RT-qPCR基因表达分析试验检测其NNMT基因的mRNA转录水平，分别测定这些肿瘤细胞系NNMT基因表达情况，结果如图1所示。
由图1可知，用RT-qPCR基因表达分析实验对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂敏感的5株细胞(NCI-H82、G-401、MDA-MB-453、SW48和WSU-DLCL2)和不敏感的4株细胞(786-O、CFPAC-1、GB-1和SF126)进行NNMT基因的mRNA转录水平检测发现：NNMT基因在敏感株细胞(NCI-H82、G-401、MDA-MB-453、SW48和WSU-DLCL2)中低表达而在不敏感株细胞(786-O、CFPAC-1、GB-1和SF126)中高表达。
因此，从图1中可以得出，与NNMT基因高表达的肿瘤细胞株相比，线粒体氧化磷酸化通路抑制剂对NNMT基因低表达的肿瘤细胞株的抑制作用显著增强，即肿瘤细胞中NNMT基因表达与其对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂的敏感性呈负相关。
实施例3
对Oligomycin A、Gboxin等线粒体氧化磷酸化通路抑制剂敏感的5例肿瘤细胞系和不敏感的4例肿瘤细胞系NNMT基因启动子区、NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp之间区域以及NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点前193bp之间区域进行重亚硫酸盐测序以检测相关区域内DNA CpG位点甲基化水平，首先利用重烟硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点，结果如图2、图3和图4所示。
如图2、图3及图4所示，线粒体氧化磷酸化通路抑制剂对NNMT基因启动子区或NNMT基因相关区域内DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤细胞株的抑制作用显著较强，对NNMT基因启动子区或NNMT基因相关区域内DNA CpG位点甲基化水平低的肿瘤细胞株的抑制作用显著较弱，表明肿瘤细胞NNMT基因启动子区或NNMT基因相关区域内DNA CpG位点甲基化水平高与其对线粒体氧化磷酸化通路抑制剂的敏感性呈正相关。
实施例4
对其他多例肿瘤细胞系考察发现其NNMT基因低表达即NNMT基因相对转录水平低和这些细胞对Gboxin线粒体氧化磷酸通路抑制剂的敏感性正相关，结果如图5和图6。在图5-6中，CCRF-CEM为急性T淋巴细胞白血病、ATN-1为T细胞白血病、OCI-LY-19为B细胞淋巴癌、OCI-AML5为M4级AML急性髓细胞性白血病、OCI-AML3为FAB M4级AML急性髓细胞性白血病、MIA PaCa-2为胰腺癌、HH为皮肤T细胞淋巴癌、PC-3前列腺癌、NCI-H1651为非小细胞肺癌、SNU-449为肝癌、769-P为肾癌。
实施例5
为了进一步验证线粒体氧化磷酸化通路抑制剂对NNMT基因低表达的肿瘤细胞株和/或NNMT基因启动子区或NNMT基因相关区域内DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤细胞株具有显著的优异抑制效果，本实施例进一步考察了另一种典型地氧化磷酸化通路抑制剂IACS-010759化合物对典型地的敏感或不敏感肿瘤细胞的抑制作用和IC50值，具体实验方法参考实施例1采用Promega CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力。IACS-010759化合物对不同肿瘤的细胞的抑制作用(IC50值)如表2所示：
表2 IACS-010759化合物对不同细胞株的抑制作用(IC50)
Figure BDA0002704737070000241
备注：IC50为半抑制浓度(50％inhibiting concentration)，即达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。其中，NCI-H82为人小细胞肺癌细胞、G-401为人肾癌Wilms细胞、CFPAC-1为人胰腺癌细胞、786-O为肾透明细胞腺癌细胞系。
从表2中可以看出，与NNMT基因高表达的肿瘤细胞株和/或NNMT基因启动子区或NNMT基因相关区域(如NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp之间区域或NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点前193bp之间区域)内DNA CpG位点甲基化水平低的肿瘤细胞株CFPAC-1和786-O相比，IACS-010759化合物对NNMT基因低表达的肿瘤细胞株和/或NNMT基因启动子区或NNMT基因相关区域(如NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点后500bp之间区域或NNMT基因转录起始位点前1050bp到转录起始位点前193bp之间区域)内DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤细胞株NCI-H82和G-401具有更显著的优异抑制效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南京施江医药科技有限公司
<120> 用于判断线粒体氧化磷酸化通路抑制剂抗癌效果的标志物
<130> P2020-1850
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 1
tttttacatc ctactaacag tagatttttt tgtagtgaac attttttgta tttttattta 60
taagtctcat aagaaaaata gcaatgttca gttgtatacc ttgaatctgc agttagaaga 120
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tggtgcttca gcacctctgc ctgaggccgt cctcactgcc tgtctctgac caaaataacc 1140
cctctcctcc tcaagaccca ggggacacag ccatgattgt cgtgctgggt cactccggta 1200
gggtaaaccc acaccgagca tcaggcctgg cctccagcat caccaggagt cgcagggagc 1260
catcacccca cgcgccaccg ccacccacct ggggagccaa acaaggcctg gcctgccagg 1320
ggtggcactg ggagggttac ctttcagccc tgttctcctg gggccaagac ccgggtctgt 1380
ctgaccctgg ggttgctgag cagaaaccgc ctggagctac ccctaccacc ggacaatctt 1440
cccaggagga ggaacaggtg cagcctgggg gcctccagcc cctagaagtt gcttctctgt 1500
ctttgctttc tcctctccct ctttgccgtc tgctgtgctt tcttgacccc tcctgcccct 1560
catctttttc ctctctccca atcttttttc tctcctttcc actcctcccc tctcttcctc 1620
atctgtggtc ttttctcctt tctttttgct tttgtttctc tgtcccacct tattttccct 1680
ctccacatat ttctcatctg ggaaaccagt ccttaaccaa attctgtgtt ttgattttga 1740
gcagttgcca ccattccccc aagccgtcct gatcctggct tttcttgggc ccctgcctat 1800
ttcctcaccc ccacactcta ctccaactcc ccgacacaca cacacagaca cacacacaca 1860
gcctcctcgc ccctccccca gctcccctcc cctccctcag gcctcagctt tctcttgaca 1920
gatgggaggg cagtgagcac tccctcttta aaacaacatt taatcgccgt tttctgttct 1980
tggacatcaa agctggggct ctggggaaca tgcaaaaacc ctgtctgtat taaaaataca 2040
aaaaaattag ctaggtgtgg cggcatatgc ctgtggtccc agctactcag gaggctgaag 2100
tgggaggatg gcttgagccc gggaggcgga ggttgcaatg aactgagatc gcaccactgt 2160
gttccagaca gagtgcgatg ctgtctcgaa aaaagtaaaa taataaataa ataataaata 2220
aaataaaata aagtgaattg ttacatgtaa aggacctaga atattgcatg gtgcttgata 2280
aacattcagt aaatgttagt tacaatcatt attattatac gcatcatcgt taatattagt 2340
tgccaaagca gctgagaaaa gatggcttat tctccaatca ggagagagga ttcctgttct 2400
cggctacagg cactggactc tttactggca ttgcctttga gagaggctgt gatacaactc 2460
agtttctata ccacatgctg ccaattcctt tttgatttaa 2500

Claims (10)

1.一种线粒体氧化磷酸化通路抑制剂的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肿瘤。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括NNMT基因低表达或未表达的肿瘤；和/或
所述肿瘤包括NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平高的肿瘤。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平包括NNMT基因启动子区DNA CpG位点甲基化水平。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、脑瘤、肝癌、前列腺癌，或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的线粒体氧化磷酸化通路抑制剂选自下组：
Figure FDA0002704737060000011
6.一种用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗的标志物，所述的标志物包括NNMT基因和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平。
7.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：
(i)用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平的检测试剂。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒的用途，其特征在于，用于制备一伴随诊断试剂盒，所述伴随诊断试剂盒用于判断肿瘤患者是否适合采用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂进行预防和/或治疗。
9.一种药盒，其特征在于，所述的药盒包括：
(i)用于检测NNMT基因表达和/或NNMT基因区DNA CpG位点甲基化水平的检测试剂；和
(ii)线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
10.一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其特征在于，给所需的对象施用线粒体氧化磷酸化通路抑制剂。
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