CN114306715A

CN114306715A - 包含凝血酶和果胶的干燥垫

Info

Publication number: CN114306715A
Application number: CN202210007184.9A
Authority: CN
Inventors: E·伊兰; Y·古曼; R·埃维里; E·德克
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2022-04-12
Also published as: US11484623B2; JP6461957B2; CA2931481A1; IL245424A0; JP2016539694A; AU2014356002A1; EP3074055B1; CN105764537A; IL229645A0; AU2014356002B2; ES2741015T3; US20150147312A1; EP3074055A1; IL245424B; WO2015079433A1

Abstract

本发明涉及一种包含果胶、二价阳离子和凝血酶的干燥垫及其制备。优选地，本发明的干燥垫中的果胶的密度在约等于或大于1％至小于7％(w/v)的范围内。根据本发明的垫包含具有低甲氧基含量的果胶。

Description

包含凝血酶和果胶的干燥垫

技术领域

本发明涉及凝血酶-果胶垫及其制备。

背景技术

果胶是从植物物质提取的天然多糖。果胶主要由D-半乳糖醛酸(GalA)单体通过α-(1-4)糖苷键连接的直链组成。这些GalA单体具有酯化羧基(COOCH₃)侧链，该酯化羧基侧链可被三种不同的侧链取代：羧基(COOH)、羟基(OH)和氨基(NH₃)，得到具有不同特性的果胶[Prade RA等人，Pectins,pectinases and plant-microbe interactions BiotechnolGenet Eng Rev.1999]。侧链的类型通过由特定的酶(根据侧链)促进的化学反应；以及通过溶液条件(例如，pH水平、不同的糖类的存在、离子组成等)来确定。

果胶有两种主要类型：高甲氧基(HM)果胶和低甲氧基(LM)果胶。这两类之间的区别在于酯化GalA单体与总GalA单体之间的比率(称为“酯化度”-DE)。通常，商用HM果胶的DE值在60％至75％的范围内，LM果胶的DE值为20％至40％。

果胶用于食品行业例如作为增稠剂，以及医疗行业例如作为丸剂包衣材料。

两种果胶类型的凝胶形成性质：

在以下条件下将水加入HM果胶粉末中将形成凝胶：pH为约3、热(75-80℃的温度)以及可溶性固体例如多糖以等于或大于65％的浓度存在。多糖的加入减少了果胶-水相互作用，并替代地产生了果胶-糖类相互作用，从而有助于提高胶凝活性。与HM果胶相比，LM果胶在更宽的pH范围(2.5-6.5)内形成凝胶，并且凝胶形成与多糖含量和温度水平无关。LM果胶需要存在二价阳离子(例如钙；约30-40mg钙/1克果胶)，以用于适当地形成凝胶。LM果胶胶凝机制涉及羟基与羧基侧链基团之间的分子内化学键的形成。该结构称为“蛋盒”模型，其中钙被捕获在结构中并形成牢固凝胶。

由于凝胶形成需要酸性pH(氢在酸性pH下不释放)，HM果胶类型具有低含量的羧基侧链基团且缺乏带负电的羧基侧链基团，因此加入带正电的钙离子既不会导致凝胶形成，也不会导致在空间上形成“蛋盒”结构。

一些出版物涉及包含含有或不含有凝血酶的果胶的组合物：

US 2012/0282320涉及可用作阻止出血的伤口敷料的止血粉末的组合物。该止血粉末包含果胶酸银部分。根据该说明书，所用的果胶还应修正为与可溶性钙盐反应，生成不溶性果胶酸钙。示例是包含2.3％果胶酸银的止血粉末的组合物。该公开明确指出止血粉末的使用优于冻干敷料。

US 7019191公开了包含织物基底和设置于基底上并透过基底的多孔、水溶性或水溶胀性聚合物基体的冻干止血伤口敷料，以及制备此类止血伤口敷料的方法。多糖被列为水溶性或水溶胀性聚合物的一种可能选择(共有17种可能选择)；果胶被列为35种可能的多糖中的一种可能的多糖。还提到，敷料可带有例如凝血酶、纤维蛋白原和纤维蛋白。

GB 708148涉及止血制剂及其制造工艺。发明人发现，将碱性吖啶衍生物加入凝血酶制剂提高了凝血酶的活性。该专利公开了果胶和果胶衍生物作为一种可能选择被包含于凝血酶制剂中。示例是冷冻干燥的果胶-凝血酶溶液的止血制剂。该止血制剂包含10％果胶。

US 4265233公开了其上固定有凝血因子XIII的伤口愈合材料。该材料有助于在伤口部位形成稳定的纤维蛋白。根据该说明书，优选地凝血酶与因子XIII一起固定到材料上。该材料呈单丝、纤维集合体、膜或海绵的形式。还提到，果胶作为可构成结构的一种选择(在大列表之外)。该专利涉及因子XIII和凝血酶粘结到各种结构，例如果胶结构。

US 4292972涉及具有由水状胶体、明胶、果胶和羧甲基纤维素钠形成的医疗可用的止血和粘合性质，并且密度为约0.01至约0.10克/cc的冻干泡沫海绵产品。明胶以最终产品的约20重量％至约80重量％存在，果胶和羧甲基纤维素钠各自以最终产品的约10重量％至约50重量％存在。该产品通过形成水状胶体的水性胶态分散体、充气或发泡、冷冻以及冻干制备。

US 2008/0260810涉及包含可吸收泡沫、可吸收机织或针织织物、凝血酶和纤维蛋白原的止血剂。根据该说明书，可吸收泡沫可以是生物相容性、水溶性或水溶胀性聚合物。用于制造该泡沫的优选的生物相容性、水溶性或水溶胀性聚合物包括多糖。还提到，果胶作为可能多糖海量列表中的一种可能多糖。该专利申请举例说明了一种包含羧甲基纤维素(作为水溶性或水溶胀性聚合物)和连接到氧化再生纤维素织物的白蛋白(作为发泡剂/表面活性剂)以及掺入到泡沫中或喷洒到泡沫上的凝血酶和纤维蛋白原的泡沫。

US 5688923涉及多价阳离子交联的果胶纤维组合物，该组合物由可用于制备局部施用的伤口敷料的钙敏感性低甲氧基(LM)果胶构成。

凝血酶是催化可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白的丝氨酸蛋白酶。在手术中，通常，液体凝血酶作为独立的产品通过在活动性出血部位将内源纤维蛋白原转化为纤维蛋白来遏止出血。然而，液体凝血酶可被渗出的血液从出血部位冲掉，因此独立的凝血酶的使用效果不佳。为了克服此问题并使凝血酶物理保持在活动性出血部位上，可有利地使用包括凝血酶的垫、海绵或补片。

一些出版物描述了由动物来源蛋白质(例如胶原或明胶)与止血用途的凝血酶组合形成的干燥泡沫海绵的使用。然而，来自动物来源的海绵的制备工序花费高昂，而来自植物物质的海绵的制备可节省成本。

此外，动物来源物质可能存在传播感染原诸如病毒的风险。

本发明涉及一种克服现有技术垫的上述和其他缺陷的垫。

发明内容

本发明涉及包含果胶、二价阳离子例如钙、和凝血酶的干燥垫及其制备。优选地，本发明的干燥垫中果胶的密度在约1％至小于7％(w/v)的范围内。根据本发明的垫包含具有低甲氧基含量的果胶(本文中称为“LM果胶”)。

有利地，根据本发明制备的垫是均匀的，具有高液体/血液吸收能力，由于其在不损坏的情况下可易于操作以适形于身体器官的形状，因此具有延展性，表现出对目标组织的粘附力增加，并且在操作和处理期间可保持完整。由于垫的延展性或适应性，可将其施用于具有不同结构和形状的多种器官。

值得注意的是，根据本发明制备的垫具有改善的粘合性质。它可用于促进在出血部位形成纤维蛋白，从而提高止血能力(例如通过垫中存在的凝血酶对来源于患者血液的纤维蛋白原的作用)。

在本发明的一个实施方案中，干燥垫中的果胶密度为大于1％至小于7％(w/v)。

在本发明的另一个实施方案中，干燥垫中的果胶密度为约1％至约5％(w/v)。

在另一个实施方案中，干燥垫中的果胶密度为约1％至小于5％(w/v)。

在本发明的又一个实施方案中，干燥垫中的果胶密度为约3％至小于5％(w/v)。

在本发明的又一个实施方案中，干燥垫中的果胶密度为约3％(w/v)。

在本发明的一个实施方案中，垫通过以下步骤制备：

a-提供LM-果胶、二价阳离子和凝血酶；

b-在允许形成均匀凝胶的条件下混合果胶、二价阳离子和凝血酶，使果胶浓度达到约1％至小于7％(w/v)；以及

c-干燥该凝胶。

在本发明的一个实施方案中，步骤b通过首先使凝血酶与二价阳离子混合然后加入果胶来进行。

在本发明的另一个实施方案中，二价阳离子是钙。

本发明还涉及减少患者的伤口出血的方法，该方法包括将根据本发明的垫施用于伤口，从而减少伤口出血。

具体实施方式

在一个方面，本发明提供包含果胶、二价阳离子和凝血酶的改进干燥垫。

根据本发明发现，包含特定浓度的特定类型果胶与凝血酶组合的干燥垫能够形成改进的干燥垫，该改进的干燥垫能够将血液和其他流体吸收和保持在其空隙内，并且通过在受伤部位形成纤维蛋白来遏止出血。

根据本发明的垫包含密度在约1至小于7％(w/v)、大于1％至小于7％(w/v)、约1％至约5％(w/v)、约1％至小于5％(w/v)、大于1％至小于5％(w/v)、约3％至小于5％(w/v)或约3％(w/v)的范围内的低甲氧基(LM)果胶。

整个专利申请中所用的术语果胶百分比意指果胶重量/体积(w/v)。

例如，干燥垫包含密度在约1％至小于7％(w/v)的范围内的果胶，意指果胶密度在约10mg/cm³至小于70mg/cm³的范围内。

如本文所用，术语“约”是指±2％。

术语“改进的干燥垫”是指例如能够有效遏止出血如轻度、中度、重度或活跃出血的垫；具有在不损坏的情况下易于适形于身体表面的形状的能力；表现出对目标组织的粘附力增加；具有高液体/血液吸收能力。术语“遏止出血”和“止血”可互换使用。

所谓“高液体/血液吸收能力”是指例如垫可将其自身重量多倍的血液和其他流体吸收和保持在其空隙内，和/或可迅速吸收血液和其他流体，例如在30秒内吸收其自身重量的30倍。

术语“止血”是指药剂遏止受伤的血管出血和/或促进血液保持包含于血管内的能力。

据发现，根据本发明的垫具有在保持其结构且不损坏的情况下易于适形于身体表面的形状的能力；具有粘性并且表现出对目标组织的粘附力增加；具有能够将液体/血液有效吸收到垫中的增加的孔隙度；并且在操作和处理期间保持完整。

有利地，根据本发明的干燥垫是均匀的，具有高液体/血液吸收能力，在不损坏的情况下可易于操作且适形于身体器官的形状；表现出对目标组织的粘附力增加；并且在操作和处理期间可保持完整。垫的适应性允许其施用于具有不同结构和形状的各种器官。

在垫的语境中，术语“均匀的”意指凝血酶和果胶基本上均匀地分散于整个干燥垫中。有利地，垫的不同区域具有大致相同的生物活性。

术语“干燥”是指垫包含基于干燥组合物的总重量计等于或小于3重量％的液体含量(w/w)。

有利地，果胶是植物来源的多糖，因此由果胶形成的垫可使病毒和/或未知病原体传播的风险最小化。

另外，将从植物提取的果胶用于药剂是有利的，因为它是非免疫原性物质，并且也是具有长期安全记录的高性价比材料。

在本发明的一个实施方案中，干燥垫中的二价阳离子是钙，例如密度范围为0.1-100mg/cm³，诸如密度为4.5-7.5mg/cm³。在本发明的一个实施方案中，垫中的钙密度为4.5mg/cm³。在本发明的另一个实施方案中，垫中的钙密度为7.5mg/cm³。

垫中的凝血酶密度可在10-1000IU/cm³的范围内，例如密度可以是约340IU/cm³或680IU/cm³。

通常，本发明的垫可在非冷冻温度储存条件下(例如在2-8℃至室温的温度下或在低于37℃的温度下)储存相对较长的时间段，仍保持其生物活性。“室温”是指包括约20℃至约28℃，或者22℃至约26℃的温度。

在本发明的一个实施方案中，垫可在室温下储存2年。

在另一个方面，本发明涉及制备根据本发明的干燥垫的方法。

在本发明的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

a-提供LM-果胶、二价阳离子和凝血酶；

b-在允许形成均匀凝胶的条件下混合果胶、二价阳离子和凝血酶，使果胶浓度达到约等于或大于1％至小于7％(w/v)；以及

c-干燥该凝胶。

果胶的浓度可在约1％至小于7％(w/v)、大于1％至小于7％(w/v)、约1％至约5％(w/v)、约1％至小于5％(w/v)、大于1％至小于5％(w/v)、约3％至小于5％(w/v)或约3％(w/v)的范围内。

在一些实施方案中，垫通常如下文所述进行制备。在第一步中，按照下述方式制备具有约1.5％至15％(w/v)(15-150g/L)的浓度的不同果胶储液：将LM果胶粉末在40-70℃下溶解于重蒸馏水(DDW)中，同时以1300RPM搅拌3-6小时，直到目测确定溶液均匀。获得pH为3.5-5.5的溶液。然后，加入0.5M NaOH，形成约7.0的pH。在下一步中，将果胶储液在4℃下储存过夜(14-18小时)，以稳定果胶溶液。在下一步中，将1.7ml凝血酶(得自

纤维蛋白密封剂)和25μl 10.8M氯化钙(CaCl₂)混合在一起，然后将所形成的混合物与3.3ml的各果胶储液(1.5％、4.5％、7.5％、10.5％和15％)混合，形成最终果胶浓度分别为约1％、3％、5％、7％和10％(w/v)(10-100g/L)的果胶凝胶。凝血酶与CaCl₂的混合，以及随后与果胶储液的混合在室温(20-25℃)下进行。凝血酶-CaCl₂溶液与果胶溶液的混合使用两支注射器进行(参见下文详细阐述)，溶液在两支注射器之间转移10-15次。获得最终体积5ml，将最终混合物倾注到具有以下尺寸的冻干玻璃杯中：25mm深和25mm直径。将冻干玻璃杯置于冻干机中，并冻干形成水含量≤3％的干燥垫。不同的干燥垫(在冻干步骤后)包含密度为约1％、3％、5％、7％或10％(w/v)(10-100mg/cm³)的果胶、340IU/cm³的凝血酶和7.5mg/cm³的钙。干燥垫的高度在10-14mm的范围内，直径为25mm。

在另一个实施方案中，包含密度为3％(w/v)的果胶(30mg/cm³)的干燥垫如下所述进行制备：

将2.25克LM果胶粉末溶解于48.5ml DDW中，从而获得浓度为4.5％(w/v)的果胶储液。在40℃-70℃下进行溶解，同时以1300RPM搅拌3-6小时(直到目测确定溶液均匀)。获得pH为3.5-5.5的溶液。溶解后，用0.5M NaOH(约2ml)将果胶储液滴定至约7.0的pH。

在下一步中，将果胶储液在4℃下储存过夜(14-18小时)，以稳定果胶溶液。

在下一步中，将包含40mM CaCl₂的1.7ml凝血酶与25μl 10.8M CaCl₂混合(获得最终CaCl₂浓度为67.5mM的凝血酶溶液)。然后将凝血酶-钙混合溶液(约1.7ml)与3.3ml果胶储液(浓度为4.5％w/v)混合形成凝胶。凝血酶与CaCl₂的混合，以及随后与果胶储液的混合在室温(20-25℃)下进行。

通过使用两支经由三通活塞彼此连接的5ml注射器进行混合，其中一支注射器装有凝血酶-钙溶液，另一支装有果胶储液。溶液在两支注射器之间转移10-15次。混合后，将混合溶液(体积5ml)倾注到冻干杯(尺寸同上)中，用针刺破形成于凝胶的上表面上的可触及气泡，然后将杯转移到冻干机中并冻干。

所形成的垫中的果胶、凝血酶和钙的最终密度分别为3％(w/v)(30mg/cm³)、340IU/cm³和7.5mg/cm³。

在冻干工序后，将垫储存于室温(20-25℃)下具有干燥剂的密闭隔室中。

在一些实施方案中，果胶、凝血酶和/或钙的溶液体积增加约1至20倍以获得更大的垫和/或更多的垫。

对于液体和凝胶物质，约1％至小于7％(w/v)的果胶浓度意指果胶浓度在约10g/L至小于70g/L的范围内。

术语“混合”是指将组分(例如果胶、二价阳离子和凝血酶)共混或搅拌在一起。

术语“在允许形成均匀凝胶的条件下混合”是指在一个或多个特定条件下例如以能够形成均匀凝胶的方式(例如组分的特定混合顺序)和/或在能够形成均匀凝胶的环境中(例如具有特定的pH、具有特定的温度和/或避免气泡形成)共混或搅拌组分。在一个实施方案中，此类条件包括首先使凝血酶与二价阳离子混合，然后加入果胶。

在凝胶的语境中，术语“均匀的”意指凝血酶和果胶基本上均匀地分散于整个凝胶物质中(在干燥垫之前)。例如，凝胶的不同区域具有大致相等的凝血酶和果胶浓度。均匀的凝胶可以例如通过将果胶溶液与包含二价阳离子的凝血酶溶液充分且轻轻地混合而获得。在一个实施方案中，混合通过使用两支彼此连接的注射器来进行，其中一支装有果胶溶液，另一支装有凝血酶溶液。

均匀的凝胶可以例如通过，例如通过使用针除去凝胶中存在的大量气泡和/或大气泡；和/或通过避免混合不当而使所形成的凝胶上存在液体来获得。混合也可通过使用充分混合溶液的搅拌器来进行。

术语“凝胶”是指半刚性胶冻样材料，其中液体分子分散在固体中，并且其中固体为连续相，液体为不连续相。通常，凝胶是不流动的基本上稀的交联体系。凝胶大部分为液体，但由于液体中存在三维交联网络而具有固体的特性。

LM-果胶、二价阳离子和凝血酶可以溶液形式提供。凝血酶溶液中的总固体可为约1-45mg/ml。

在本发明的一个实施方案中，二价阳离子在凝血酶溶液中提供。在本发明的另一个实施方案中，二价阳离子作为单独的溶液提供。

干燥步骤可通过本领域已知的任何工序进行，该工序不会降解对热工序敏感的活性成分(例如凝血酶)或使其变性，该热工序包括但不限于真空干燥、冻干和空气干燥诸如室温干燥。

在一个实施方案中，干燥可通过冻干进行。术语“冻干”通常是指冷冻混合物然后降低水浓度(例如通过升华到不维持生物反应或化学反应的水平)的过程。

通常，在冻干后，获得“固体块”。术语“块”、“固体块”、“干燥组合物”是指由冻干过程得到的多孔、海绵结构样组合物。

已证实，在冻干过程后，所形成的块维持其自身的结构，即凝胶物质和固体组合物的结构和体积基本上相同。此参数可通过轻轻按压垫并评估留在手套上的垫部分来评估。垫应有利地保持其结构，并且在操作和处理期间保持完整。使垫在可易于适形于身体的形状但仍可保持其结构不损坏之间保持平衡是重要的。

如本文所用，术语“干燥组合物”和“干燥垫”可互换使用，是指水含量等于或小于约3％(w/w)的组合物。

根据本发明所用的果胶可来源于(例如提取或分离)任何植物或其部分(例如种子、叶、茎、花、根和/或柄)。果胶可具有可变的纯度水平，除果胶之外，还可包含从植物或其部分提取或分离的其他组分。

果胶可具有在约20％至75％的范围内的酯化度以及在约15％至30％的范围内的酰胺化度。

在本发明的一个实施方案中，酯化度在约26％至27％的范围内。在本发明的另一个实施方案中，酰胺化度在约20％至22％的范围内。

术语“酯化度”是指酯化GalA单体与总GalA单体之间的比率。

术语“酰胺化度”是指酰胺化GalA单体与总GalA单体之间的比率。

在本发明的一个实施方案中，垫包含另外的止血剂。如本文所用，术语“止血剂”是指试剂在有效时间内控制、减少或遏止毛细血管、静脉血管或微动脉血管出血，包括轻度、中度、重度或活跃出血的能力，如本领域的技术人员所认识的那样。止血剂的示例包括但不限于凝血酶原、纤维蛋白、纤连蛋白、因子X/Xa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、因子XIII、因子VIII、玻连蛋白、组织因子、von Willebrand因子、血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂、血小板活化剂、具有止血活性的合成肽、上述的衍生物以及它们的任意组合。

术语“轻度”是指其中发生出血量较小、出血速率较低的出血情况。在轻度出血中，出血可自发停止或通过压力遏止，出血可在约10-20分钟的压力后停止或者减缓为渗流或滴流，和/或其可渗流或滴流最多40分钟。

轻度出血的示例包括但不限于由于身体器官诸如皮肤上的小面积损伤而导致的出血，其中不需要使用抗凝血药物，大静脉或动脉未受到损伤。通常，在轻度出血中，止血将通过天然凝血机制自发实现。

术语“中度”是指其中在长时间内以较低出血速率丧失大量血液或在短时间内以中等出血速率失血的出血情况。通常，在中度出血中，在施加约15分钟的压力后，出血减缓或停止，但当移除压力时出血再次开始，和/或可通过少量绷带吸收血液，但血液流速不快或失去控制。

中度出血的示例包括但不限于由于身体器官诸如皮肤上的大面积损伤而导致的出血，或其中接受大量血液补给的器官受到小面积损伤的情况。通常，在中度出血中，止血实施失败将导致在数分钟至数小时内死亡。术语“重度或活跃出血”是指其中发生出血量较大、出血速率较高的出血情况。通常，在严重出血中，血液从伤口泵出，施加压力不能遏止或减缓出血，和/或在用绷带包扎后血液迅速通过绷带吸收。

重度和活跃出血的示例包括但不限于由于动脉刺穿、肝脏切除、肾脏切除、血友病和接受抗凝血药物的患者等等而导致的出血。通常，在重度或活跃出血中，止血实施失败将导致在数秒钟至数分钟内死亡。

垫止血的有效性可通过使用活体动物模型实验来评估。例如，如下面的实施例中所述的大鼠肾脏出血模型(重度出血模型)和猪脾脏出血模型(轻度至中度出血模型)。

根据本发明发现，包含凝血酶和等于或大于1％至小于5％(w/v)的LM果胶的干燥垫有效遏止了重度出血，并且包含凝血酶和等于或大于1％至小于7％(w/v)的LM果胶的干燥垫有效遏止了轻度至中度出血。

在本发明的一个实施方案中，干燥垫包含凝血酶和密度为约1％至小于5％(w/v)的LM果胶，并且可用于轻度至重度出血。

在本发明的一个实施方案中，干燥垫用于轻度至中度出血，并且包含凝血酶和密度为约1％至小于7％(w/v)的LM果胶。

在本发明的一个实施方案中，干燥垫用于重度出血，并且包含凝血酶和密度为约1％至小于5％(w/v)的LM果胶。

根据本发明还发现，果胶垫的止血性能可通过增加凝血酶密度而增强，例如当垫中的果胶密度增加到680IU/cm³凝血酶时，包含3％(w/v)果胶和340IU/cm³凝血酶的垫的性能得以增强。

在本发明的一个实施方案中，凝血酶的密度可增加至少两倍，以增强果胶垫的性能。

本发明的垫可根据预期用途以多种尺寸和形状诸如正方形、多边形、球形、圆锥形、立方形、椭圆形、矩形或圆柱形制备和提供。例如，本发明的垫可制备为尺寸为(宽×长)5×10cm、10×10cm、高度均为1cm的矩形。又如，本发明的垫可制备为直径为2cm、4cm或6cm、高度均为1cm的圆形。

根据本发明的垫可按原样施用于出血部位，并且通过在活动性出血部位将内源纤维蛋白原转化为纤维蛋白而遏止出血。

垫可施用于所需部位上并且在压力下保持一定时间段，例如在30秒至4分钟范围内的时间段，以足以使垫与施用部位之间的交界处出现凝血并且基本上遏止出血。

技术人员能容易地理解在本发明描述中公开的范围。这表示公开了限定范围之间的连续值和数字，并包括限定数字和值。例如，如果范围给定为约1％至小于7％(w/v)，意指至少1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％和/或小于7％(w/v)，以及中间子范围的所有组合诸如1％至6.75％(w/v)。例如，如果范围给定为大于1％至小于7％(w/v)，意指至少1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％和/或小于7％(w/v)，以及中间子范围的所有组合诸如1％至6.75％(w/v)。

在另一个方面，本发明涉及减少患者的伤口出血的方法，该方法包括将根据本发明的垫施用于伤口，从而减少伤口出血。

所谓“减少伤口出血”意指例如受伤的组织和/或器官的失血量减少、减轻或消除。

术语“伤口”包括但不限于动脉刺穿、肝脏切除、肾脏切除、皮肤伤口、静脉和/或动脉损伤、手术期间产生的切口等。上文或下文引用的专利申请、专利和公布的公开内容据此以引用方式并入。

以下实施例为示例性而非限制性的。

实施例

材料和方法

凝血酶：在以下实验中，使用

纤维蛋白密封剂(由OmrixBiopharmaceuticals Ltd.,Israel制造)中的凝血酶组分。

活性成分：人凝血酶(800-1200IU/ml)。

其他成分：40mM氯化钙(CaCl₂)、6mg/ml人白蛋白、20gr/L D-甘露糖醇、20mM乙酸钠、130mM氯化钠(NaCl)、注射用水(WFI)。

果胶：在以下实验中，使用低甲氧基(LM；两种不同类型)和高甲氧基(HM)果胶来制备包含凝血酶的垫：

1.LM果胶(目录号104AS，CPkelco,Atlanta,Georgia)，酯化度27％，酰胺化度20％(本文中称为“第1类”)。从柑橘皮中提取。

2.LM果胶(目录号104AS FS，CPkelco,Atlanta,Georgia)，酯化度26％，酰胺化度22％(本文中称为“第2类”)。从柑橘皮中提取。

3.HM果胶(目录号76282，Sigma Aldrich,Rehovot,Israel)，酯化度70-75％。从苹果中提取。

所有果胶类型由供应商以粉末形式提供。

表1列出了HM果胶和LM果胶的性质。

表1：果胶性质。

*酯化度–酯化GalA单体与总GalA单体之间的比率。

**酰胺化度–酰胺化GalA单体与总GalA单体之间的比率。

冻干：凝胶物质的冻干根据下表2所示的循环使用Christ Epsilon 2-8D冻干机来进行。在冻干后，获得“固体块”。术语“块”、“固体块”和“干燥组合物”是指由冻干过程得到的多孔、海绵结构样组合物。

通常，在冻干过程后，块维持其自身结构，即冻干后获得的凝胶物质和固体物质的结构和体积基本上相同。

表2：冻干循环。

干燥垫中的水含量的定量：水含量测定使用容量Karl Fischer滴定法(KFT)来进行，该方法基于US Pharmacopoeia(美国药典)测定法(USP 27,<921>,P.2398-2399)。在滴定之前，按照以下方式从冻干组合物中提取水分：将4ml干燥甲醇加入装有冻干组合物的小瓶中，使小瓶在室温下滚动30分钟。然后，取3ml上清液进行滴定。

使用活体模型来评估垫的止血功效。

大鼠肾脏出血模型-重度或活跃出血模型：

使用活体急性大鼠肾脏出血模型来测定功效。

该模型使用约3月龄、体重约350克的Sprague dawley大鼠。通过IP(腹膜内)注射，以50mg三甲基乙烯/kg施用量来诱导麻醉。在此步骤期间监测麻醉的效果，如有需要，施用另外注射的三甲基乙烯。

为保持动物处于38℃和40℃之间的恒定温度(最佳38.4℃)，将动物置于厚的塑料工作台上，并将连接到热探针的加热灯和电加热垫均置于工作台(热调节器)下。

剃去动物左侧的毛发，以进行腰旁剖腹术。用70％乙醇擦拭刮剃部位。将热探针插入动物的直肠中以监测温度。将动物转到右背侧位置。静脉内注入一剂肝素(RotexMedicaGermany#ET3L184-10-200IU/kg)以抑制动物血液中存在的内源性凝血酶的活性(所施用的肝素浓度不影响垫中存在的凝血酶)。通过使用该模型可保持可重复性，因为动物不能经由内源性凝血酶来活化其内部凝血机制。

从左髋至第十二肋骨作一大小约1-2cm的左腰旁切口，暴露出左肾。将肾脏与肾周脂肪分离。使大鼠重新置于曲膝背卧位。用软血管夹封闭肾血管。进行矢状半肾切除术，移除与肾血管垂直的整个远侧半部肾脏。吸干留下的肾脏的切口表面。将测试垫施加到肾脏的切口表面上。放置三分钟以进行聚合，然后释放肾脏夹。在释放肾脏夹后，观察肾脏出血情况。如果出现出血，经一小时的时间段使血液被吸收在垫内。

如果动物在整个一小时测试期内存活，则移除垫，通过用施用前垫的重量减去施用到切口上之后垫的重量来评估肾脏的出血。在移除垫后，立即使用CO₂来处死存活的动物(仍在麻醉下)。

猪脾脏出血模型-轻度至中度出血模型：

步骤基本上如Cole DJ等人“A pilot study evaluating the efficacy of afully acetylated poly-N-acetyl glucosamine membrane formulation as a topicalhemostatic agent”.Surgery.1999年9月；126(3):510-7所述进行，但以下步骤除外：

1-使用4mm活检针作出伤口，在脾脏内形成圆形伤口(而不是如Cole DJ等人所述在脾脏中作一切口)；以及

2-垫施用步骤如下所述进行：使伤口自由出血5秒钟，然后通过用手术海绵轻轻按压来移除积聚的血液。施用待测试的止血剂(果胶-凝血酶垫或对照处理：浸入凝血酶溶液中的

可吸收明胶海绵；准确配方参见以下实施例4)，用手指对准按压30秒，然后不施加压力观察60秒。如果伤口继续出血或再次出血，已施用的试剂保留在原位，不加入另外的试剂，再次重复上述压力循环(30秒后观察60秒)。从伤口形成起重复该循环总共5分钟。如果在5分钟内未实现止血，则宣告测试失败。在该实验中，在将垫/海绵施用到出血部位上之后测定并记录每次试验的止血时间(最多5min)。

整个施用过程中所用的果胶百分比浓度以重量/体积(w/v)表示。

对于液体和凝胶物质，1％w/v果胶意指果胶浓度为10g/L。

对于干燥垫，1％w/v果胶意指果胶密度为10mg/cm³。

实施例1：使用不同的LM果胶浓度来制备干燥凝血酶-果胶垫。

包含约1％-10％(w/v)(10-100mg/cm³)LM果胶和凝血酶的垫通常如下所述制备；包含3％(w/v)(30mg/cm³)LM果胶的垫的制备在下文更详细地描述。

在第一步中，按照下述方式制备具有约1.5％至15％(w/v)(15-150g/L)的浓度的不同果胶储液：将LM果胶粉末(上文定义为第1类；含量列于下表3中)在40-70℃下溶解于48.5ml DDW中，同时以1300RPM搅拌3-6小时，直到目测确定溶液均匀。获得pH为3.5-5.5的溶液。然后，加入0.5M NaOH，形成约7.0的pH(具体的滴定体积列于下表3中)。

用于制备不同的果胶储液的具体果胶粉末重量和NaOH滴定体积列于下表3中。

表3：果胶储液的制备。

在下一步中，将1.7ml凝血酶(得自上述

纤维蛋白密封剂)和25μl 10.8M氯化钙(CaCl₂)混合在一起，然后将所形成的混合物与3.3ml的各果胶储液(1.5％、4.5％、7.5％、10.5％和15％)混合，形成最终果胶浓度分别为约1％、3％、5％、7％和10％(w/v)(10-100g/L)的果胶凝胶。凝血酶与CaCl₂的混合，以及随后与果胶储液的混合在室温(20-25℃)下进行。凝血酶-CaCl₂溶液与果胶溶液的混合使用两支注射器进行(参见下文详细阐述)，溶液在两支注射器之间转移10-15次。获得最终体积5ml，将最终混合物倾注到具有以下尺寸的冻干玻璃杯中：25mm深和25mm直径。将冻干玻璃杯置于冻干机中，根据上表2冻干形成如Karl Fischer滴定法所测得水含量≤3％的干燥垫。

不同的干燥垫(在冻干步骤后)包含密度为约1％、3％、5％、7％或10％(w/v)(10-100mg/cm³)的果胶、340IU/cm³的凝血酶和7.5mg/cm³的钙。干燥垫的高度在10-14mm的范围内，直径为25mm。

包含密度为3％(w/v)的果胶(30mg/cm³)的干燥垫的制备方法的详细描述：

将2.25克LM果胶粉末(上文定义为第1类)溶解于48.5ml DDW中，从而获得浓度为4.5％(w/v)的果胶储液。在40℃-70℃下进行溶解，同时以1300RPM搅拌3-6小时(直到目测确定溶液均匀)。获得pH为3.5-5.5的溶液。溶解后，用0.5M NaOH(约2ml)将果胶储液滴定至约7.0的pH。

通过使用两支经由三通活塞彼此连接的5ml注射器(目录号1097Ilif,Haryana,India)进行混合，其中一支注射器装有凝血酶-钙溶液，另一支装有果胶储液。溶液在两支注射器之间转移10-15次。混合后，将混合溶液(体积5ml)倾注到冻干杯(尺寸参见上文)中，用针刺破形成于凝胶的上表面上的可触及气泡，然后将杯转移到冻干机中并根据上表2所示冻干。

所形成的垫中果胶、凝血酶和钙的最终密度分别为3％(w/v)(30mg/cm³)、340IU/cm³和7.5mg/cm³。

制备包含3％(w/v)(30mg/cm³)LM果胶第1类和7.5mg/cm³钙(无凝血酶)的垫作为以下实验/测定的对照。对照垫的制备方式与包含3％(w/v)LM果胶、340IU/cm³凝血酶和7.5mg/cm³钙的垫相同，不同的是仅使用凝血酶缓冲液组分(1.7ml注射用水中包含6mg/ml人白蛋白、20mM乙酸钠、20g/L D-甘露糖醇、130mM NaCl和40mM CaCl₂)代替1.7ml凝血酶溶液。

在冻干工序后，将垫储存于室温(20-25℃)下具有干燥剂的密闭隔室(Sorb-It#4243Süd-Chemie,Munich,Germany)中，直到它们进行止血功效评估和特定参数的目测检查。

对上述制备的凝胶进行以下参数的目测检查(在混合两支注射器的内容物并将内容物倾注到冻干杯中之后，以及冻干本身进行之前)：

所有参数按照1至5的标度(1为最低，5为最高)进行排序；对所有评估进行定性，并确定相对于其他凝胶制剂的排序；每个参数的最佳值以括号示出。

-气泡度(1)–在评估此参数时，考虑所形成的凝胶中气泡的量和大小这两者。凝胶制剂中存在大量气泡或大气泡是不期望的，因为它可导致干燥垫具有不均匀分布于凝胶中的大气孔，对止血和干燥垫的紧实度造成不利影响。

-凝胶上方的液体(1)–此参数通过倾斜装有凝胶的杯子并目测评估凝胶上方的液体体积来评估。所形成的凝胶上方存在液体是不期望的，因为它表示凝胶的均匀度低，从而垫在其冻干后的均匀度低。

-粘度(4-5)–此参数通过用丁腈手套触摸凝胶并定性评估凝胶与手套的粘附性来评估。粘度值高是所期望的，因为它表示干燥后获得的干燥垫与表面的粘附性高。

-刚度(3-4)–此参数通过轻轻用手按压凝胶来评估：。3-4的值是所期望的，因为它表示干燥后获得的干燥垫具有足够的刚度来维持其结构，但刚度不是太大，所以其能够被操作或能够适形于身体器官的形状。

不同凝胶的目测检查的结果示于下表4中。

表4：所制备凝胶的表征。

*每个参数的最佳值。

还对干燥垫(冻干后)进行目测检查。在冻干后，获得“固体块”/“块”。“固体块”是指冻干过程得到的多孔、海绵结构样组合物。评估以下参数；所有参数按照1(最低)至5(最高)的标度进行排序；对所有评估进行定性，并确定相对于其他凝胶制剂的排序；每个参数的最佳值以括号表示：

-易碎性(1)–此参数通过轻轻按压每个垫并评估留在手套上的垫部分来评估。垫应有利地维持其结构，并且在操作和处理期间保持完整。

-发泡度(3)–此参数涉及垫的泡沫样结构，并且通过以下步骤评估：向垫轻轻施加压力并评估垫中的空穴(根据按压垫的能力/阻力)。值为3表示垫具有在血液不逸出到整个块(参见上文“块”的描述)的情况下可吸收液体/血液的孔隙度。

-粘度(4-5)–如上所述评估凝胶制剂的粘度。具有粘性的垫更好地粘附到目标组织。

-刚度/硬度(3)–此参数通过轻轻用手按压垫并评估耐压性来评估。值为3表示垫可易于适形于身体的形状但仍可维持其结构不损坏之间的平衡。

另外，每个干燥垫的密度通过干燥垫组合物中的总固体量除以垫的体积(用于制备干燥垫的凝胶物质体积，其基本上等于垫的体积；约5ml)的数学计算获得。

凝血酶组分溶液中的总固体量为约40mg/ml。

目测检查的结果和不同干燥垫的计算密度示于下表5中。

表5：用LM果胶制备的干燥垫的表征。

*每个参数的最佳值。

**数学计算值。

结果显示，根据凝胶的物理特性(表4)，LM果胶浓度为7％(w/v)的凝胶优于其他凝胶。

出乎意料的是，干燥垫的物理特性(表5)显示，LM果胶密度为7％和10％(w/v)的果胶垫劣于具有较低果胶密度的垫。果胶密度为3％和5％(w/v)LM果胶的凝胶/垫具有最佳特性。

在上述制备方法中，凝血酶-果胶凝胶根据以下工序顺序形成：凝血酶首先与CaCl₂混合，然后与果胶溶液组合和混合。

当混合顺序改变，CaCl₂首先与果胶溶液(然后与凝血酶溶液)混合时，立即出现胶凝。这引起早期胶凝，产生凝胶滴，因此果胶凝胶内缺乏均匀度，这导致下一步与凝血酶溶液的混合不充分。

结果显示，为了形成均匀垫，首先使钙与凝血酶溶液混合，然后在下一步加入果胶溶液是有利的。

垫还由LM果胶第2类(如上文所定义)以与LM果胶第1类类似的方式制备。对凝胶和垫的上述指定参数进行目测检查。所得的结果和结论类似于LM果胶第1类的那些。

实施例2：使用不同的HM果胶浓度来制备干燥凝血酶-果胶垫。

包含0.66％-5.33％(w/v)(6.6-53.3mg/cm³)HM果胶和凝血酶的垫如下所述制备：

在第一步中，浓度为8％(w/v)(80g/L)HM果胶的果胶储液如下所述制备：将100ml50mM碳酸氢钠缓冲液(目录号31437,Sigma Aldrich,Rehovot,Israel)加入搅拌器辊筒中，在通过使用搅拌器(目录号K5SSWH325瓦，KitchenAid,St.Joseph,MI)混合期间逐渐加入8克HM果胶(如上文材料和方法部分所述)，该混合在室温(20-25℃)下以280RPM的速度进行约30分钟，直到果胶完全溶解；目测检查；形成无团块的均匀糊料样溶液。糊料样溶液具有约3.0的pH。

在下一步中，糊料样溶液用于形成不同的果胶浓度(1％、2％、4％、6％和7％(w/v)(10-70g/L))：按下表6所示的体积(总体积为30ml)用50mM碳酸氢钠稀释8％HM果胶储液。

表6：具有不同HM果胶浓度的溶液的形成。

在下一步中，将凝血酶溶液(如材料和方法部分所述)以1:2的比率[15ml凝血酶溶液和30ml果胶溶液]加入不同的果胶溶液(包括8％果胶储液)。由于HM果胶需要糖类进行胶凝(凝血酶组分中的甘露糖醇浓度不足以形成凝胶物质)，所形成的溶液为液体状态，而不是凝胶形式。据观察，所形成的溶液是粘稠的，仅部分均匀。

将5ml所获得的混合物倾注到冻干玻璃杯(深度为25mm，直径为25mm)中，并根据表2所述的冻干循环冻干。不同干燥垫中的最终果胶密度为：0.66％、1.33％、2.66％、4％、4.66％、5.33％(w/v)(6.6-53.3mg/cm³)；凝血酶密度为333IU/cm³；钙密度为1.48mg/cm³。干燥垫的高度在9-10mm的范围内，直径为25mm。

在冻干工序后，将垫储存于室温(20-25℃)下具有干燥剂的密闭隔室(Sorb-It#4243Süd-Chemie,Munich,Germany)中，直到使用上述实施例1的排序进行其止血功效和以下特性评估：易碎性、发泡度、粘度和刚度。在这些垫中，仅对干燥垫进行目测检查。

另外，每个干燥垫的密度如LM果胶垫所述通过数学计算获得(凝胶物质体积为5ml)。

密度和每个检查参数的值示于下表7中。

表7：使用HM果胶制备的干燥垫的特性。

*每个参数的最佳值。

**数学计算值。

结果显示，垫中的HM果胶密度对上述测试特性无影响(所有垫接受相同的排序)。

还显示，这些垫是不均匀的，且包含固体晶体(目测观察)。

这些结果表明，包含HM果胶并且在上述条件下制备的垫具有的吸收性质差，不易于操作和适形于身体器官的形状，不能有效粘附到目标组织，从而不能有效止血。

实施例3：急性大鼠肾脏出血模型中HM和LM果胶-凝血酶垫的活体止血功效。

以下实施例旨在测定根据实施例1和实施例2制备的凝血酶-果胶垫在重度出血模型中的止血功效。该评估使用上述活体急性大鼠肾脏出血模型来进行。

测试包含以下LM果胶密度的干燥垫：1％、3％、5％、7％和10％(w/v)，并且测试包含以下HM果胶密度的垫：0.66％、1.33％、2.66％和4.66％(w/v)。

LM果胶垫中的钙和凝血酶密度分别为：7.5mg/cm³和340IU/cm³。

HM果胶垫中的钙和凝血酶密度分别为：1.48mg/cm³和333IU/cm³。

在该实验中，还测试如实施例1详细阐述制备的包含3％(w/v)LM果胶和7.5mg/cm³钙(无凝血酶)的垫的性能。

实现约4克或更少的失血量的垫被视为止血有效的垫。

使用不同果胶垫时的失血量结果和平均值示于下表8(包含LM果胶的垫)和表9(包含HM果胶的垫)中。

表8：在使用包含不同LM果胶密度的垫时大鼠肾脏模型中的平均失血量。

*使用第1类LM果胶(如上文所定义)。

**使用第2类LM果胶(如上文所定义)。

***括号表示每次处理的个体失血量结果。

****所测试动物的数量＝2-3。

表9：在使用包含不同HM果胶密度的垫时大鼠肾脏模型中的平均失血量。

*所测试动物的数量＝1-2。

**括号表示每次处理的个体失血量结果。

结果显示，包含1％和3％(w/v)LM果胶(第1类和第2类两者)的垫具有小于4克的合格的平均失血量(参见表8)。

结果还显示，包含3％(w/v)LM果胶、无凝血酶的垫具有不合格的高失血量(参见表8)。

HM果胶垫不能实现合格的止血效果，均显示出不合格的高失血量(参见表9)。

这些结果显示，果胶垫应有利地包含凝血酶和等于或大于1％至小于5％(w/v)LM果胶，以获得能够有效遏止重度出血的垫。

实施例4：猪脾脏出血模型中LM果胶-凝血酶垫的活体止血功效。

前述实施例显示，包含凝血酶和密度为1％和3％(w/v)的LM果胶的垫有效遏止了重度出血。以下实施例旨在评估不同的凝血酶-LM果胶垫在遏止轻度至中度出血中的功效。

在此实施例中，猪脾脏出血模型如上所述使用。如上所述，记录每次试验的止血时间(最多5min)。成功的合格标准是300秒或更少的止血时间。

所测试垫包含密度在1％-5％(w/v)的范围内的果胶；密度为340IU/cm³和680IU/cm³的凝血酶；以及密度为4.5mg/cm³和7.5mg/cm³的钙。

垫如下所述制备：

10％(w/v)果胶溶液通过将5克LM果胶粉末(上文定义为第1类)溶解于40ml DDW中来制备。将果胶粉末逐渐加入DDW中，溶解步骤在40℃-70℃的温度下进行，同时在1300RPM下搅拌3-6小时。在溶解后，所获得的溶液的pH为5.0，使用约2ml 0.5M NaOH进行滴定，获得约7.0的pH。在下一步中，向溶液加入DDW直到最终体积为50ml。果胶储液在4℃下储存过夜(14-18小时)以达到稳定。

然后，将包含40mM CaCl₂的凝血酶溶液与25μl 2.7M CaCl₂混合(获得最终钙浓度为27mM的凝血酶溶液)。然后，将凝血酶-钙溶液与DDW混合(参见下表10中每个垫的凝血酶溶液和DDW体积)。

然后，将上述溶液与果胶储液混合，形成果胶-凝血酶凝胶(参见下表10中每个垫的10％w/v果胶储液体积)。混合如实施例1所述在室温下进行。

表10：用于制备LM果胶-凝血酶凝胶的体积。

*使用第1类LM果胶。

在两支注射器中混合后，将溶液(约5ml)转移到冻干杯(尺寸参见上文)中，置于冻干机中，根据表2中详细阐述的循环冻干。

最终果胶、凝血酶和钙密度列于表11中。干燥垫具有以下尺寸：高度在8-12mm的范围内、直径为25mm。

表11：干燥垫中的果胶、凝血酶和钙密度。

可吸收明胶海绵与凝血酶一起使用，作为阳性对照(如下所述制备)。

海绵是无菌、水不溶性、延展性的猪明胶可吸收海绵，旨在通过施用到出血表面而用于止血用途。海绵的外观是灰白色和多孔的。在该实验中，使用前将

(高度为10mm)切成20×30mm的尺寸，在2ml凝血酶溶液(

纤维蛋白密封剂中的凝血酶组分如下所述稀释：1ml凝血酶组分:4ml盐水溶液)中饱和。在其施用前，用戴手套的手指按压饱和的海绵，排出气泡，并根据上述模型中详细阐述的工序施用。

在使用不同的果胶垫时实现的平均止血时间和对照处理(含凝血酶的

)示于下表12中。如上所述，合格的止血时间是300秒或更短。

表12：在使用包含不同的LM果胶、钙和凝血酶密度的垫时猪脾脏出血模型的平均止血时间。

*括号表示每次处理的个体止血时间结果。

**所测试动物的数量＝1-3。

结果显示，在该模型中，所有测试垫均有效地遏止出血，即止血时间为300秒或更短。

结果还显示，包含3％(w/v)果胶和680IU/cm³凝血酶的垫实现了最佳结果，止血时间为30秒，类似于对照处理(含凝血酶的

)的结果，该对照处理是目前临床环境的标准操作步骤。

这些结果显示，果胶垫的性能可通过增加凝血酶密度而增强，例如参见包含3％(w/v)果胶和340IU/cm³凝血酶的垫的性能相比于包含3％(w/v)果胶和680IU/cm³凝血酶的垫的性能。