CN114438101B

CN114438101B - 一种稻米外观透明的低直链淀粉含量的等位基因及其应用

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Publication number: CN114438101B
Application number: CN202210244057.0A
Authority: CN
Inventors: 杨杰; 许扬; 王芳权; 王军; 李霞; 李文奇; 范方军; 蒋彦婕; 陶亚军; 朱建平; 陈智慧
Original assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Current assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2024-07-19
Anticipated expiration: 2042-03-10
Also published as: CN114438101A

Abstract

本发明公开了一种水稻稻米外观透明的低直链淀粉含量的等位基因Du1 ^ΔA121，属于生物技术领域。该基因在水稻Du1基因编码区第1外显子的第361至363位核苷酸缺失，其含有如SEQ ID No.1所示的基因序列和如SEQ ID No.2所示的编码区序列。本发明还公开了一种Du1 ^ΔA121所编码的蛋白，其含有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。本发明的直链淀粉含量控制基因还可以应用于稻米外观透明的低直链淀粉含量水稻新品种选育。本发明携带纯合Du1 ^ΔA121基因的突变体tas1，AC为11.0%左右，下降了4.5个百分点左右，相比软米对照南粳9108（AC为8.7%），籽粒透明度明显较好。

Description

一种稻米外观透明的低直链淀粉含量的等位基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种稻米外观透明的低直链淀粉含量的等位基因Du1^ΔA121及其应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

水稻是世界范围内的重要粮食作物，对保障粮食安全具有举足轻重的作用。近30年来，中国水稻生产经过高产育种、超高产育种、超级稻育种和绿色超级稻育种等计划的实施，水稻产量不断提高，但稻米品质问题却越来越突出。近年来，随着我国人民生活水平的提高，稻米生产与消费的主要矛盾已然由总量不足转变为结构性过剩。在此新形势下，培育优质水稻新品种、发展优质稻米产业，满足人民日益增长的对美好生活的需要已成为服务三农、实现乡村振兴的重要任务。开展优质水稻研究符合当前市场要求。

稻米食味品质和淀粉含量的关系紧密。构成稻米的淀粉主要有两类，即直链淀粉和支链淀粉，其中直链淀粉被认为是稻米蒸煮食味品质最重要的决定因素(朱大伟等，2015)。水稻Wx基因编码颗粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS)，是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响水稻胚乳和花粉中直链淀粉的含量。此外，Du1(dullendosperm 1)基因编码一种前体mRNA剪切因子，这类剪切因子以复合体的形式直接参与调控等淀粉合成相关基因前体mRNA的剪接效率而影响成熟mRNA的转录数量。至今，己发现8个座位可导致暗胚乳突变，分别为如du-1、du-2、du-3、du-4、du5、du2035、du(2120)、du(EM47)(Isshiki et al 2000)。研究表明，暗胚乳突变只是使AC降低，对支链淀粉的性质没有影响，如支链的长短未发生变化。研究表明du-1，du-2无法形成正常的剪接蛋白因子，使得Wxb前体mRNA的剪接过程不能正常进行，进而降低突变体的直链淀粉含量(Isshiki et al.,2000)。

具有较低直链淀粉含量(AC)(7％～12％)的新型大米品种，俗称为“软米”，其米饭具有软而不烂、甜润爽口、膨化性好、富有弹性、冷后不易变硬和回生程度小等优点，是我国大部分地区优质稻米的典型特征。近年来云南、黑龙江、江苏、上海等地的低AC粳稻品种如云粳29、龙粳38、南粳46、沪软1212等，食味品质突出，深受广大消费者的喜爱而广泛种植。低AC粳稻的消费群体正在逐年扩大，相关产品的市场前景日趋广泛。

低AC粳稻品种虽然在口感上得到了市场的欢迎和追捧，但是存在的两大缺陷长期未得到很好的解决：1、多数现有低AC品种稻米外观品质较差。当前生产上多数低AC(9％左右)粳稻品种稻米外观呈云雾状，透明度差，俗称半糯或僵米，降低了稻米的商品价值，在外观品质上难以与东北和日本大米(透明、卖相好)竞争。通过提高稻米含水量至17％以上可提高其透明度，但是往往造成稻米不耐储藏，甚至霉变。AC在10％-13％时，稻米既能保有良好的食味品质，同时稻米外观品质会显著改善，呈现透明状。但是，当前水稻育种中缺乏此类种质和基因资源。2、可利用的稻米外观透明的低AC种质缺乏与可利用基因型单一。近20年以来，长三角地区选育的低AC品种主要是利用来源日本软米品种关东194的等位变异基因Wx-mp，AC为9％左右。近年来并没有新的软米基因资源被发现，缺乏具有育种利用价值的外观品质优良的低AC种质，难以满足市场的需求。因此，通过挖掘和利用外观品质优良软米的调控基因和材料，改变现有低AC外观不达标的现状已成为优质育种迫切需要。

目前尚未有Du1基因的等位变异的报道。

发明内容

技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供了一种水稻稻米外观透明的低直链淀粉含量相关的新的等位基因Du1^ΔA121。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的等位基因Du1^ΔA121所编码的蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述等位基因在控制水稻稻米外观透明度，和/或低直链淀粉含量方面的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了获得或鉴定外观透明的低直链淀粉含量的水稻的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种等位基因Du1^ΔA121，所述等位基因Du1^ΔA121为水稻稻米外观透明的低直链淀粉含量相关的基因，其在基因登录号是XM_015758339.2，水稻Du1基因编码区第1外显子的第361至363位核苷酸缺失，其含有如SEQ IDNo.1所示的基因序列和如SEQ ID No.2所示的编码区序列。

具体地，本发明利用江苏省水稻品种苏垦118为背景材料进行电离辐射，获得一万余份M₀突变体，自交繁种。以籽粒外观透明且AC为8％-12％为目标性状进行鉴定筛选。筛选得到一份稻谷含水量为12％的情况下，AC为11.0％，且稻米外观表现透明的突变体，命名为tas1(transparent-appearance and soft 1)，该突变体tas1已于2022年2月22日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24030，分类命名为水稻(Oryza sativa)保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院2号。

具体地，通过研究发现该突变体的Du1基因发生非移码弱突变，该突变体tas1在基因登录号是XM_015758339.2的水稻Du1基因编码区第1外显子的第361至363位核苷酸缺失(图5)，序列如SEQ ID NO.1所示。相较于野生型，该突变造成突变基因所编码的蛋白中缺失第121位丙氨酸(图5)，序列如SEQ ID NO.3所示，其他氨基酸未有突变。因此，突变体tas1的Du1基因是在野生型Du1基础上发生的新等位变异，命名为Du1^ΔA121。

本发明内容还包括所述的等位基因Du1^ΔA121所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID No.3所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的等位基因。

本发明内容还包括所述的等位基因Du1^ΔA121、所述的蛋白，所述的表达盒、重组载体或细胞在水稻杂交育种和品种改良中的应用。

其中，所述应用包括控制水稻稻米外观透明度，和/或低直链淀粉含量方面的应用。

本发明内容还包括获得外观透明的低直链淀粉含量的水稻的方法，包括如下步骤：

1)使水稻包含所述的等位基因Du1^ΔA121；或

2)使水稻表达所述的等位基因Du1^ΔA121所编码的蛋白。

其中，所述的方法包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

本发明内容还包括鉴定水稻的方法，其中水稻是包含所述的等位基因Du1^ΔA121的水稻、表达所述的蛋白的水稻或所述的方法获得的水稻，包括以下步骤：

1)鉴定所述水稻是否包含所述的等位基因；或，

2)鉴定所述水稻是否表达所述的蛋白。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：

1)本发明获得了一种水稻稻米外观透明的低AC相关的蛋白质及其编码该蛋白质的基因Du1^ΔA121。该基因编码一个前体mRNA剪切因子Du1^ΔA121，通过影响AC主效调控基因Wx的前体mRNA的剪接效率，进而减少Wx的表达和降低AC。相比于野生型植株AC15.5％左右，携带纯合Du1^ΔA121基因的突变体tas1，AC为11.0％左右，下降了4.5个百分点左右，相比软米对照南粳9108(AC为8.7％)，籽粒透明度明显较好。利用新的稻米外观透明的低AC资源，克隆新的稻米外观透明的低AC调控基因，对于丰富稻米外观透明的低AC调控基因库及解析相应友谊表型形成机制具有重要的理论和实践意义。AC降低数值适当，趋势明显，效果显著，能有效改良适口性和食味品质。

2)本发明得到的水稻突变体tas1材料的稻米崩解值(BDV)为1321.7±87.7cP，相比于野生型的989.7±111.8cP，BDV升高数值适当，差异显著；本发明发现的水稻突变体tas1材料的稻米回复值(CSV)为777.0±16.8cP，相比于野生型的1112.3±21.9cP，CSV降低数值适当，差异显著；本发明发现的水稻突变体tas1材料的稻米峰值时间(PeT)为5.7±0.1min，相比于野生型的5.9±0.1min，PeT减小数值适当，差异显著。突变体中上述3个指标为代表的稻米RVA谱粘滞性特征显著优于野生型对照，可利用于培育蒸煮食味品质改良植物。

3)本发明利用突变体tas1与常规粳稻品种南粳51的杂交种所结F₂群体，随机选取24个单株进行稻米透明度观察、AC检测及Du1基因测序，结果表明所有植株中稻米透明度都较好，所有AC大于14％的植株都为Du1Du1或Du1Du1^ΔA121基因型，所有AC小于14％的植株都为Du1^ΔA121Du1^ΔA121基因型，Du1^ΔA121基因与AC小于14％的表型完全共分离。利用杂交、回交等常规技术手段，将该基因转育到其它常规水稻品种中，可以培育新的稻米外观透明的低AC材料。

附图说明

图1表型分析；A：直链淀粉含量(AC)测定分析；B：精米外观透明度观察；SK188为苏垦118，tas1为突变体tas1，NG9108为南粳9108；

图2RVA各特征值的总体变化；NG46为南粳46；

图3遗传分析；

图4Wx基因编码区序列比对；SK188为苏垦118，tas1为突变体tas1；

图5Du1基因结构及Du1^ΔA121等位基因序列差异示意图；

图6Wx基因表达分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：突变体tas1的获得及表型鉴定

1、突变体tas1的获得

本发明选取的背景材料为苏垦118(购买于江苏苏垦种业有限公司)，该品种是由江苏省农业科学院粮食作物研究所选育的迟熟中粳新品种，全生育期155天左右，适宜江苏省苏中及宁镇扬丘陵地区种植，具有优良的综合农艺性状，已在生产上大面积推广应用，深受市场欢迎。苏垦118株型紧凑，分蘖力较强，叶片淡绿色，群体整齐度好，抗倒性好，成熟期转色好，直链淀粉含量为15.5％左右，稻米外观透明。利用该品种，通过物理化学诱变技术创制稻米外观透明且AC适当降低的突变体材料，利用其作为研究对象，从生化和分子层面进行解析，并最终应用于新品种选育，这一策略将是获得稻米外观品质较好的低AC产品的可行途径。

本发明利用江苏省水稻品种苏垦118为背景材料进行电离辐射，获得一万余份M₀突变体，自交繁种。以籽粒外观透明且AC为8％-12％为目标性状进行鉴定筛选。筛选得到一份稻谷含水量为12％的情况下，AC为11.0％，且稻米外观表现透明的突变体，命名为tas1(transparent-appearance and soft 1)，该生物材料已于2022年2月22日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24030，分类命名为水稻(Oryza sativa)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院2号。

2、AC测定及稻米外观观察

对野生型品种苏垦118(常规粳稻)，获得的突变体tas1和低AC对照品种南粳9108(Wx^mp基因型)进行AC测定，具体方法参照参照农业部颁发标准NY147-88进行，4个参比标准样品(AC：1.5％、10.6％、16.4％和25.6％)购自中国水稻研究所。结果如图1A所示，苏垦118的AC为15.5％±0.1，突变体tas1的AC为11.0％±0.2，显著低于其野生型，但是仍然高于南粳9108(AC为8.7％±0.1)。

透明度是衡量稻米外观品质的主要指标之一。本发明利用野生型苏垦118(透明)和南粳9108(呈云雾状)精米作为对照，观察突变体的精米外观。稻谷经砻谷机(SY88-TH，韩国双龙)去壳出糙，小型精米机(BLH-3120，台州伯利恒)出精后获得精米，并用水分分析仪(Metteler，瑞士)测定精米含水量以保证测试样品含水量一致。结果如图1B所示，在含水量为12％时，苏垦118精米仍表现为透明，但是南粳9108已表现为云雾状，透明度差，突变体tas1表现同苏垦118，仍呈现透明状态。表明该突变体虽然AC较野生型明显下降，但是外观上仍然能保持较好的透明度。

因此，tas1可以认为是一份全新的稻米外观透明的低AC材料。

3、稻米RVA谱粘滞性测定

蒸煮与食用品质(Eating and Cooking Quality,ECQ)是影响消费者选择的直接因素，因而是稻米品质构成中最为重要的评价指标。虽然我国出台了国家标准《大米蒸煮食用品质感官评价方法》(GB/T15682-2008)，但由于无法完全排除主观因素的影响，人工品尝的方式仍无法精确鉴定稻米品质。稻米的RVA谱特征值与稻米的蒸煮食味品质间存在着密切关系，采用快速粘度分析仪(RVASuper 4，NEWPORT SCIENTIFIC，澳大利亚)进行测定，参照美国谷物化学家协会AACC61-01和61-02操作规程进行参数设置。前人研究表明，食味品质好的稻米往往具有较大的崩解值(BDV)，冷饭相对不回生的稻米往往具有较小的回复值(CSV)，此外，峰值时间PeT是指样品达到峰值黏度所用的时间，一般PeT越小，淀粉粒的膨胀性和破损性越好。结果如表1所示，突变体tas1的BDV为1321.7±87.7cP，显著大于野生型的989.7±111.8cP；突变体tas1的CSV为777.0±16.8cP，显著小于野生型的1112.3±21.9cP；突变体tas1的PeT为5.7±0.1min，显著小于野生型的5.9±0.1min。此数据表明，相比于野生型，突变体tas1的食味品质较好，冷饭相对不回生，其淀粉粒在蒸煮过程中的膨胀性和破损性更好。RVA各特征值的总体变化如图2所示，突变体tas1的RVA曲线与野生型不同，野生型中由于FV大于PV，表现末端上翘，但突变体趋向低AC对照品种南粳46，即FV小于PV，表现末端不上翘。

表1RVA谱特征值

实施例2：遗传分析及目标基因克隆

1、遗传分析

以苏垦118为母本，突变体tas1为父本配制杂交组合，获得F₂群体(n＝140)进行遗传分析。如图3所示，低AC单株(AC<14％):高AC单株(AC>14％)分离比趋向1:3(χ²＝1.61<χ² _0.05,1)，表明突变体tas1中低AC表型由隐形单基因控制。

2、基因克隆

Wx基因是调控水稻淀粉含量的主效基因，首先利用靶基因重测序技术针对Wx基因进行鉴定。用CTAB法分别提取苏垦118和突变体tas1植株叶片的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增。扩增所用上游引物为5’-cggtgcccaacagaaaccaca-3’，下游引物为5’-cacccagaagagtacaacat-3’。PCR体系为DNA模板(20ngμL^-1)2μL，10×PCRbuffer2μL，MgCl₂(5mmol L^-1)2μL，dNTP(2mmol L^-1)2μL，上游引物(2μmol L^-1)2μL，下游引物(2μmol L^-1)2μL，Taq DNA聚合酶(5UμL^-1)0.2μL，ddH₂O 7.8μL。扩增条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4min，35个循环；72℃延伸10min，结束反应。在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行PCR。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的条带，送往南京擎科生物科技有限公司测序。利用BioXM2.6软件将苏垦118、突变体tas1及数据库中基因登录号是EU770319的日本晴的Wx基因进行序列比对。如图4，苏垦118中Wx序列同日本晴，为Wx^b等位类型，突变体tas1中Wx基因相比野生型苏垦118并无变异，表明该突变体表型由其他基因变异引起。

其次利用靶基因重测序技术针对已报道的Du1基因进行鉴定，扩增所用上游引物为5’-CGACTAATCACAAGCGTCTT-3’，下游引物为5’-CCATCCCAGTTCACTACCC-3’。PCR体系同上段所述。扩增条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃5min，35个循环；72℃延伸10min，结束反应。在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行PCR。切胶回收及测序如上段所述。利用BioXM2.6软件将苏垦118、突变体tas1及数据库中基因登录号是XM_015758339.2的水稻Du1基因进行序列比对。结果表明苏垦118中Du1序列同日本晴，如图5所示，突变体tas1中Du1基因相比野生型苏垦118，其编码区第1外显子的第361至363位核苷酸缺失，该突变造成所编码的蛋白中缺失第121位丙氨酸，其他氨基酸未有突变。目前尚未有Du1基因该等位变异的报道。因此，突变体tas1的Du1基因是在野生型Du1基础上发生的新等位变异，命名为Du1^ΔA121。

实施例3共分离及初步功能分析

1、共分离分析

为了验证突变体tas1中AC降低等表型是由于Du1基因突变导致的，在遗传上进行共分离分析。利用实施例2中的F₂群体(n＝140)单株进行AC测定及基因型鉴定。AC测定方法见实施例1。基因型鉴定利用PCR产物直接测序的方法进行，扩增所用上游引物为5’-CCTCCTCCCTGCTACTCCAC-3’，下游引物为5’-TAGTCCCCAATTTCAGGTATGCTT-3’。PCR体系见实施例2。扩增条件为94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃50s，34个循环；72℃延伸3min，结束反应。在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行PCR。切胶回收及测序方法见实施例2。

如表2所示，在上述F₂群体(n＝140)中鉴定得到野生型基因型的单株38个，全部表现为高AC(AC>14％)；获得杂合型单株74个，全部表现为高AC(AC>14％)；获得纯合的Du1^ΔA121突变基因型的单株28个，全部表现为低AC(AC<14％)，表明Du1^ΔA121和低AC表型共分离，即证明了突变体tas1中AC降低表型是由于Du1基因突变导致的。具体单株AC测定及基因鉴定情况见表3。

表2共分离分析

表3单株AC测定及基因鉴定情况

WT代表野生型；He代表杂合型；Ho代表纯合突变体

2、Wx基因表达量检测

前人研究表明Du1基因编码一个前体mRNA剪切因子，通过影响AC主效调控基因Wx的前体mRNA的剪接效率，进而减少Wx的表达和降低AC。本发明中进一步比较野生型苏垦118和突变体tas1中Wx基因的表达。分别提取苏垦118和突变体tas1开花后6天、9天和12天的胚乳RNA并反转录成cDNA，以获得的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR检测。以OsActin-1为内参基因(上游引物为5’-CCAAGGCCAATCGTGAGAAGA-3’，下游引物为5’-AATCAGTGAGATCACGCCCAG-3’)，利用荧光定量PCR的方法鉴定Wx基因(上游引物为5’-ATTCCTTCAGTTCTTTGTCTATCTCA-3’，下游引物为5’-ATGGTGGTTGTCTAGCTGTTGC-3’)的表达量。扩增体系为cDNA模板(1ng RNA反转录获得并稀释3倍)5μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞生物科技股份有限公司)10μL，上游引物(10μmol L^-1)0.4μL，下游引物(10μmol L^-1)0.4μL，ddH₂O 4.2μL。反应条件为95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s，结束反应。在荧光定量PCR仪(Roche Applied Science LightCycler 480)中进行PCR，利用自带导出功能进行数据导出并分析。结果如图6所示，相比于野生型苏垦118，突变体tas1中Wx基因在开花后6天、9天和12天的胚乳中的表达下降，分别只有野生型的58.4％、60.3％和64.8％。上述结果表明，突变体中Du1基因第361至363位核苷酸的缺失导致灌浆期胚乳中Wx基因表达量的降低，并最终导致AC的降低。

实施例4育种应用

为了在育种中利用稻米外观透明的低AC新材料tas1，本发明利用突变体tas1与常规粳稻品种南粳51(携带野生型Du1基因，外观透明，AC为16.0％±0.2)进行杂交。在得到的F₂群体中，随机选取24个单株进行稻米透明度观察、AC检测及Du1基因测序，结果表明，所有被检测植株稻米透明度都较好；此外如表4所示，所有表现为高AC(AC>14％)的植株都为野生型(Du1Du1)或杂合(Du1Du1^ΔA121)基因型，所有表现为低AC(AC<14％)的植株都为纯合突变基因型(Du1^ΔA121Du1^ΔA121)，Du1^ΔA121基因与AC小于14％的表型完全共分离，表明通过基因型筛选携带Du1^ΔA121Du1^ΔA121基因型的单株，即可实现在育种早世代材料中进行低AC表型的选择。具体单株AC测定及基因鉴定情况见表5。上述结果进一步表明，利用杂交、回交等常规技术手段，将该基因转育到其它常规水稻品种中，可以培育新的稻米外观透明的低AC材料。

表4基因型与AC检测分析

表5单株AC测定及基因鉴定情况

WT代表野生型；He代表杂合型；Ho代表纯合突变体

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种稻米外观透明的低直链淀粉含量的等位基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4592

<212> DNA

<213> tas1突变体(transparent-appearance and soft 1)

<400> 1

attcttcctc acgacctcaa aaacccaaac caatctactc cgccgccgcc gccgcgatgg 60

tgttcgtccg cgcgccggac gggaggaccc accacgtcga cctcgacccc tccaccgcca 120

cgctcgccga cctcacggcc tccgcctccc gcgtctgcgg cggcgtcccg ccggagcagc 180

tgcggctcta cctcgcccac cgccgcctcc tcccggccga gccgtccccg ctgctgtcct 240

ccctccgggt ctcggcctcc tcctccctgc tactccacct ccccctgctc ggagggatga 300

ccggcccgac gacgaccccc gcggcacccc cgcccccgcc gccgccgtcg gcgcagccgc 360

ccgcccgccc cgcgcgctac gacttcctca actccaagcc gcccccgaac tacgtgggtc 420

tggggcgtgg cgccaccggg ttcaccaccc gttcggatat cgggccggcc cgcgcggcgc 480

ccgatctgcc tgaccggtcc gccgccgccg ccgccgcccc cgccgtcggg cgcggccgtg 540

ggaagccacc cggggacgac gacggcgacg acgatggcgg cgacgaggag aaggggtacg 600

acgagaacca gaagttcgac gagttcgagg gcaacgacgc cgggctgttc tccaacgccg 660

actacgacga cgacgaccgc gaggcggatg cggtctggga gagcatcgac cagaggatgg 720

actctcgccg gaaggatcgg cgggaggcgc ggctgaagca ggagatcgag aagtaccgtg 780

cttccaaccc taagatcacc gagcaattcg ctgatttgaa gcgtaagttg gtcgatttgt 840

cggcgcagga gtgggaaagc atacctgaaa ttggggacta ctcgctgcgc aacaagaaga 900

agcgatttga gagcttcgtt cccgtgccgg acaccctgct cgagaaggct cggcaggagc 960

aggagcatgt cacggcactg gatcccaaga gccgtgcagc tggtggcacc gagacgccat 1020

gggcgcagac tccggttacc gatctgacgg ctgtgggcga aggtcgtggc accgtgctct 1080

ccttgaagct ggacaggttg tcggattcgg tatctggtct tactgttgtt gatccaaagg 1140

gttacttgac ggacctgaaa agtatgaaga ttactagtga tgctgagatt tctgacatta 1200

aaaaggcgcg attgttgctt aagtcagtga cacagacaaa cccgaagcat ccaccaggat 1260

ggattgctgc tgctaggctt gaagaggttg ctggcaagct tcaggttgct cggcagctta 1320

tccagcgtgg ctgtgaggag tgccccacaa atgaggatgt ttgggtcgag gcatgccggc 1380

tggccagccc agacgaggca aaggcagtga ttgctagggg cgtgaaggca attcccaatt 1440

ctgtgaagct gtggttgcag gcagcaaagt tggaaactag tgatttgaat aagagcaggg 1500

ttttgagaaa agggttggaa cacattcctg attcagtcag actgtggaaa gcagtagtag 1560

agcttgcaaa tgaggaggat gcaagactgt tgcttcacag ggctgtggag tgctgcccac 1620

tccatgtgga actgtggctt gccctagcaa ggctggagac atatgaccaa gcaaagaagg 1680

tacttaacaa ggcaagagaa aagcttccta aggaacctgc catctggatt acagctgcaa 1740

agctggagga agctaatgga aacacccagt cagtaatcaa ggtgattgag agaagtataa 1800

aaactttaca gagagaagga ttggatattg acagggaggc atggctaaag gaagcagaag 1860

ctgctgagcg tgctggatct gtattgactt gccaggctat tgttaagagc actattggca 1920

ttggtgttga tgaggaagac agaaaacgca catgggttgc cgatgctgag gaatgcaaga 1980

agcgtggttc aattgagaca gcccgtgcca tctatgcgca tgcactcagt gtcttcgttt 2040

ccaagaagag tatttggctg aaagcggctc agcttgagaa gagccatgga accaaggagt 2100

ctctttataa tctcctcaga aaggctgtta cctacaatcc acgtgcagaa gttttatggc 2160

ttatgagtgc aaaggagaaa tggctggctg gagatgtccc ggctgcccga gccattcttc 2220

aggaagctta tgcttctctc cccaattcag aggagatctg gctagctgcc ttcaagcttg 2280

agtttgagaa caatgaacca gagagagcaa gaattctttt gtcaaaggcc agggaaagag 2340

gaggcactga gagggtctgg atgaaatctg cgattgttga aagggagtta gggaatgtag 2400

acgaagaaag gaagctgttg gaggaaggtc tgaagttatt cccctcattc ttcaagctgt 2460

ggttaatgct tggacaaatg gaagaccggc ttggccatgg atccaaggca aaggaggttt 2520

acgagaatgc actgaagcac tgcccgagtt gcatccctct ttggctctct ctagctaatc 2580

tagaggagaa gataaatggc ttgagcaagt cacgtgctgt cctcaccatg gcaagaaaga 2640

agaacccagc tacacctgaa ctctggcttg cagcagttag ggctgaattg agacatggga 2700

acaagaagga agctgatgct ctactagcca aggcattaca ggaatgcccg acaagtggta 2760

ttttgtgggc tgcagctata gagatggtgc cacgtcccca gcgtaaagca aagagctcag 2820

atgctataaa acgatgtgac catgatcccc atgtcattgc agctgtggcc aaacttttct 2880

ggcatgatag gaaggttgat aaagctagaa gttggttgaa tagagctgtt actcttgctc 2940

cagacattgg agatttttgg gccttgtact acaaatttga actgcaacat ggaaatgctg 3000

atacacaaaa ggatgtccta caaagatgtg ttgcagcaga accaaagcat ggagagagat 3060

ggcaagcaat aacaaaggct gttgagaact cacatctgtc aattgaggcc cttctgaaga 3120

aagctgtgtt ggctcttggc caggaagaaa atccaaatgc tgcagatccc tagtttgtct 3180

cacttttaac ttttgataag gtattgcaat ctgttatcat tatactcttc tgataaagaa 3240

ctttgctatt gtgttcccgt atttccatgc tttatgatgt ctcatattga aatgcttttc 3300

agtgtctatt ctattggtca gctataagat cttaatattt gagtatcatg taataaatat 3360

tgcgaagagt tcttaatatt tgagttgcaa ttaatttgtt tgagacaagc agcattatca 3420

tttattttgt tggttatcat taagtaaacc ttagcttaaa tctactaggt gcatgggtag 3480

tctaaaaata tgagttctgt atgtaaacta tgcagaatct gttcatgctg tattaatctg 3540

ctgtgcacat atgcccagtt atctatgaca tataaattat aatcatgttg atgctgtcat 3600

ggccttaaga ttgaaagaat atacttgttg ccttcagctt gatttatgtt ttggttgaag 3660

aattggtgtt gttttactcc ttgattgact gtatcacctt gactgaagta tttggggaat 3720

gtggcaattc tatgttgaag tgtgtcaatg ctaacattga ttactgagtt gcaagctgac 3780

tttctgctcc aaccaactct tgtgaatgtg catttttttg ccacaatagc ggtcagacta 3840

tttaattctg ctaagcaacc ctattctatc ctctcctgat tccaactgta gagcaataga 3900

agatcgataa aatgtctatg cggatcaaaa caccaccttt ggaagcataa tttttctttt 3960

tcttaccagt aattttgtgt ttctgtaaca aaacaagtaa ataacatatg ttactgctcg 4020

tctactgatt cacgggtatc ttttttagtt tcctatgtgc ttggattata attgtcttct 4080

tggatatccc cagactaaag ttttctttca actcctcagt ctggtcacag gtctaattct 4140

tctgcgcatg ctggcaatgg aatatataga gaaagaaaca cagttgggta gtgaactggg 4200

atggactcga gctgcgacct cgtgattctg tgtaccaccg aactgattgc tgcactcctc 4260

caaccatgaa gccttacctg aagaagaatc aggcatgcga ttactacaat ttgtatcggc 4320

gatcaccagt taaaacctgt atcgtttgta tgccctaatt gccagcaata cttctgtact 4380

accatgagca tgtttattcc tccagatgca taccacaaat tcttagatgg gtgtatttgc 4440

tagccgcgac ttgggatgat gtaatttttc ttgggttcgg tttattctca gagcactggc 4500

gtctgtatct acgactgtaa gatctgcctg aatgtcggct taatatatga gataatgccc 4560

catttttcag cacaggctgt gagcatttct tc 4592

<210> 2

<211> 3117

<212> DNA

<213> tas1突变体(transparent-appearance and soft 1)

<400> 2

atggtgttcg tccgcgcgcc ggacgggagg acccaccacg tcgacctcga cccctccacc 60

gccacgctcg ccgacctcac ggcctccgcc tcccgcgtct gcggcggcgt cccgccggag 120

cagctgcggc tctacctcgc ccaccgccgc ctcctcccgg ccgagccgtc cccgctgctg 180

tcctccctcc gggtctcggc ctcctcctcc ctgctactcc acctccccct gctcggaggg 240

atgaccggcc cgacgacgac ccccgcggca cccccgcccc cgccgccgcc gtcggcgcag 300

ccgcccgccc gccccgcgcg ctacgacttc ctcaactcca agccgccccc gaactacgtg 360

ggtctggggc gtggcgccac cgggttcacc acccgttcgg atatcgggcc ggcccgcgcg 420

gcgcccgatc tgcctgaccg gtccgccgcc gccgccgccg cccccgccgt cgggcgcggc 480

cgtgggaagc cacccgggga cgacgacggc gacgacgatg gcggcgacga ggagaagggg 540

tacgacgaga accagaagtt cgacgagttc gagggcaacg acgccgggct gttctccaac 600

gccgactacg acgacgacga ccgcgaggcg gatgcggtct gggagagcat cgaccagagg 660

atggactctc gccggaagga tcggcgggag gcgcggctga agcaggagat cgagaagtac 720

cgtgcttcca accctaagat caccgagcaa ttcgctgatt tgaagcgtaa gttggtcgat 780

ttgtcggcgc aggagtggga aagcatacct gaaattgggg actactcgct gcgcaacaag 840

aagaagcgat ttgagagctt cgttcccgtg ccggacaccc tgctcgagaa ggctcggcag 900

gagcaggagc atgtcacggc actggatccc aagagccgtg cagctggtgg caccgagacg 960

ccatgggcgc agactccggt taccgatctg acggctgtgg gcgaaggtcg tggcaccgtg 1020

ctctccttga agctggacag gttgtcggat tcggtatctg gtcttactgt tgttgatcca 1080

aagggttact tgacggacct gaaaagtatg aagattacta gtgatgctga gatttctgac 1140

attaaaaagg cgcgattgtt gcttaagtca gtgacacaga caaacccgaa gcatccacca 1200

ggatggattg ctgctgctag gcttgaagag gttgctggca agcttcaggt tgctcggcag 1260

cttatccagc gtggctgtga ggagtgcccc acaaatgagg atgtttgggt cgaggcatgc 1320

cggctggcca gcccagacga ggcaaaggca gtgattgcta ggggcgtgaa ggcaattccc 1380

aattctgtga agctgtggtt gcaggcagca aagttggaaa ctagtgattt gaataagagc 1440

agggttttga gaaaagggtt ggaacacatt cctgattcag tcagactgtg gaaagcagta 1500

gtagagcttg caaatgagga ggatgcaaga ctgttgcttc acagggctgt ggagtgctgc 1560

ccactccatg tggaactgtg gcttgcccta gcaaggctgg agacatatga ccaagcaaag 1620

aaggtactta acaaggcaag agaaaagctt cctaaggaac ctgccatctg gattacagct 1680

gcaaagctgg aggaagctaa tggaaacacc cagtcagtaa tcaaggtgat tgagagaagt 1740

ataaaaactt tacagagaga aggattggat attgacaggg aggcatggct aaaggaagca 1800

gaagctgctg agcgtgctgg atctgtattg acttgccagg ctattgttaa gagcactatt 1860

ggcattggtg ttgatgagga agacagaaaa cgcacatggg ttgccgatgc tgaggaatgc 1920

aagaagcgtg gttcaattga gacagcccgt gccatctatg cgcatgcact cagtgtcttc 1980

gtttccaaga agagtatttg gctgaaagcg gctcagcttg agaagagcca tggaaccaag 2040

gagtctcttt ataatctcct cagaaaggct gttacctaca atccacgtgc agaagtttta 2100

tggcttatga gtgcaaagga gaaatggctg gctggagatg tcccggctgc ccgagccatt 2160

cttcaggaag cttatgcttc tctccccaat tcagaggaga tctggctagc tgccttcaag 2220

cttgagtttg agaacaatga accagagaga gcaagaattc ttttgtcaaa ggccagggaa 2280

agaggaggca ctgagagggt ctggatgaaa tctgcgattg ttgaaaggga gttagggaat 2340

gtagacgaag aaaggaagct gttggaggaa ggtctgaagt tattcccctc attcttcaag 2400

ctgtggttaa tgcttggaca aatggaagac cggcttggcc atggatccaa ggcaaaggag 2460

gtttacgaga atgcactgaa gcactgcccg agttgcatcc ctctttggct ctctctagct 2520

aatctagagg agaagataaa tggcttgagc aagtcacgtg ctgtcctcac catggcaaga 2580

aagaagaacc cagctacacc tgaactctgg cttgcagcag ttagggctga attgagacat 2640

gggaacaaga aggaagctga tgctctacta gccaaggcat tacaggaatg cccgacaagt 2700

ggtattttgt gggctgcagc tatagagatg gtgccacgtc cccagcgtaa agcaaagagc 2760

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ttctggcatg ataggaaggt tgataaagct agaagttggt tgaatagagc tgttactctt 2880

gctccagaca ttggagattt ttgggccttg tactacaaat ttgaactgca acatggaaat 2940

gctgatacac aaaaggatgt cctacaaaga tgtgttgcag cagaaccaaa gcatggagag 3000

agatggcaag caataacaaa ggctgttgag aactcacatc tgtcaattga ggcccttctg 3060

aagaaagctg tgttggctct tggccaggaa gaaaatccaa atgctgcaga tccctag 3117

<210> 3

<211> 1038

<212> PRT

<213> tas1突变体(transparent-appearance and soft 1)

<400> 3

Met Val Phe Val Arg Ala Pro Asp Gly Arg Thr His His Val Asp Leu

1 5 10 15

Asp Pro Ser Thr Ala Thr Leu Ala Asp Leu Thr Ala Ser Ala Ser Arg

20 25 30

Val Cys Gly Gly Val Pro Pro Glu Gln Leu Arg Leu Tyr Leu Ala His

35 40 45

Arg Arg Leu Leu Pro Ala Glu Pro Ser Pro Leu Leu Ser Ser Leu Arg

50 55 60

Val Ser Ala Ser Ser Ser Leu Leu Leu His Leu Pro Leu Leu Gly Gly

65 70 75 80

Met Thr Gly Pro Thr Thr Thr Pro Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro

85 90 95

Pro Ser Ala Gln Pro Pro Ala Arg Pro Ala Arg Tyr Asp Phe Leu Asn

100 105 110

Ser Lys Pro Pro Pro Asn Tyr Val Gly Leu Gly Arg Gly Ala Thr Gly

115 120 125

Phe Thr Thr Arg Ser Asp Ile Gly Pro Ala Arg Ala Ala Pro Asp Leu

130 135 140

Pro Asp Arg Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Gly Arg Gly

145 150 155 160

Arg Gly Lys Pro Pro Gly Asp Asp Asp Gly Asp Asp Asp Gly Gly Asp

165 170 175

Glu Glu Lys Gly Tyr Asp Glu Asn Gln Lys Phe Asp Glu Phe Glu Gly

180 185 190

Asn Asp Ala Gly Leu Phe Ser Asn Ala Asp Tyr Asp Asp Asp Asp Arg

195 200 205

Glu Ala Asp Ala Val Trp Glu Ser Ile Asp Gln Arg Met Asp Ser Arg

210 215 220

Arg Lys Asp Arg Arg Glu Ala Arg Leu Lys Gln Glu Ile Glu Lys Tyr

225 230 235 240

Arg Ala Ser Asn Pro Lys Ile Thr Glu Gln Phe Ala Asp Leu Lys Arg

245 250 255

Lys Leu Val Asp Leu Ser Ala Gln Glu Trp Glu Ser Ile Pro Glu Ile

260 265 270

Gly Asp Tyr Ser Leu Arg Asn Lys Lys Lys Arg Phe Glu Ser Phe Val

275 280 285

Pro Val Pro Asp Thr Leu Leu Glu Lys Ala Arg Gln Glu Gln Glu His

290 295 300

Val Thr Ala Leu Asp Pro Lys Ser Arg Ala Ala Gly Gly Thr Glu Thr

305 310 315 320

Pro Trp Ala Gln Thr Pro Val Thr Asp Leu Thr Ala Val Gly Glu Gly

325 330 335

Arg Gly Thr Val Leu Ser Leu Lys Leu Asp Arg Leu Ser Asp Ser Val

340 345 350

Ser Gly Leu Thr Val Val Asp Pro Lys Gly Tyr Leu Thr Asp Leu Lys

355 360 365

Ser Met Lys Ile Thr Ser Asp Ala Glu Ile Ser Asp Ile Lys Lys Ala

370 375 380

Arg Leu Leu Leu Lys Ser Val Thr Gln Thr Asn Pro Lys His Pro Pro

385 390 395 400

Gly Trp Ile Ala Ala Ala Arg Leu Glu Glu Val Ala Gly Lys Leu Gln

405 410 415

Val Ala Arg Gln Leu Ile Gln Arg Gly Cys Glu Glu Cys Pro Thr Asn

420 425 430

Glu Asp Val Trp Val Glu Ala Cys Arg Leu Ala Ser Pro Asp Glu Ala

435 440 445

Lys Ala Val Ile Ala Arg Gly Val Lys Ala Ile Pro Asn Ser Val Lys

450 455 460

Leu Trp Leu Gln Ala Ala Lys Leu Glu Thr Ser Asp Leu Asn Lys Ser

465 470 475 480

Arg Val Leu Arg Lys Gly Leu Glu His Ile Pro Asp Ser Val Arg Leu

485 490 495

Trp Lys Ala Val Val Glu Leu Ala Asn Glu Glu Asp Ala Arg Leu Leu

500 505 510

Leu His Arg Ala Val Glu Cys Cys Pro Leu His Val Glu Leu Trp Leu

515 520 525

Ala Leu Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Asp Gln Ala Lys Lys Val Leu Asn

530 535 540

Lys Ala Arg Glu Lys Leu Pro Lys Glu Pro Ala Ile Trp Ile Thr Ala

545 550 555 560

Ala Lys Leu Glu Glu Ala Asn Gly Asn Thr Gln Ser Val Ile Lys Val

565 570 575

Ile Glu Arg Ser Ile Lys Thr Leu Gln Arg Glu Gly Leu Asp Ile Asp

580 585 590

Arg Glu Ala Trp Leu Lys Glu Ala Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Ser

595 600 605

Val Leu Thr Cys Gln Ala Ile Val Lys Ser Thr Ile Gly Ile Gly Val

610 615 620

Asp Glu Glu Asp Arg Lys Arg Thr Trp Val Ala Asp Ala Glu Glu Cys

625 630 635 640

Lys Lys Arg Gly Ser Ile Glu Thr Ala Arg Ala Ile Tyr Ala His Ala

645 650 655

Leu Ser Val Phe Val Ser Lys Lys Ser Ile Trp Leu Lys Ala Ala Gln

660 665 670

Leu Glu Lys Ser His Gly Thr Lys Glu Ser Leu Tyr Asn Leu Leu Arg

675 680 685

Lys Ala Val Thr Tyr Asn Pro Arg Ala Glu Val Leu Trp Leu Met Ser

690 695 700

Ala Lys Glu Lys Trp Leu Ala Gly Asp Val Pro Ala Ala Arg Ala Ile

705 710 715 720

Leu Gln Glu Ala Tyr Ala Ser Leu Pro Asn Ser Glu Glu Ile Trp Leu

725 730 735

Ala Ala Phe Lys Leu Glu Phe Glu Asn Asn Glu Pro Glu Arg Ala Arg

740 745 750

Ile Leu Leu Ser Lys Ala Arg Glu Arg Gly Gly Thr Glu Arg Val Trp

755 760 765

Met Lys Ser Ala Ile Val Glu Arg Glu Leu Gly Asn Val Asp Glu Glu

770 775 780

Arg Lys Leu Leu Glu Glu Gly Leu Lys Leu Phe Pro Ser Phe Phe Lys

785 790 795 800

Leu Trp Leu Met Leu Gly Gln Met Glu Asp Arg Leu Gly His Gly Ser

805 810 815

Lys Ala Lys Glu Val Tyr Glu Asn Ala Leu Lys His Cys Pro Ser Cys

820 825 830

Ile Pro Leu Trp Leu Ser Leu Ala Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asn Gly

835 840 845

Leu Ser Lys Ser Arg Ala Val Leu Thr Met Ala Arg Lys Lys Asn Pro

850 855 860

Ala Thr Pro Glu Leu Trp Leu Ala Ala Val Arg Ala Glu Leu Arg His

865 870 875 880

Gly Asn Lys Lys Glu Ala Asp Ala Leu Leu Ala Lys Ala Leu Gln Glu

885 890 895

Cys Pro Thr Ser Gly Ile Leu Trp Ala Ala Ala Ile Glu Met Val Pro

900 905 910

Arg Pro Gln Arg Lys Ala Lys Ser Ser Asp Ala Ile Lys Arg Cys Asp

915 920 925

His Asp Pro His Val Ile Ala Ala Val Ala Lys Leu Phe Trp His Asp

930 935 940

Arg Lys Val Asp Lys Ala Arg Ser Trp Leu Asn Arg Ala Val Thr Leu

945 950 955 960

Ala Pro Asp Ile Gly Asp Phe Trp Ala Leu Tyr Tyr Lys Phe Glu Leu

965 970 975

Gln His Gly Asn Ala Asp Thr Gln Lys Asp Val Leu Gln Arg Cys Val

980 985 990

Ala Ala Glu Pro Lys His Gly Glu Arg Trp Gln Ala Ile Thr Lys Ala

995 1000 1005

Val Glu Asn Ser His Leu Ser Ile Glu Ala Leu Leu Lys Lys Ala Val

1010 1015 1020

Leu Ala Leu Gly Gln Glu Glu Asn Pro Asn Ala Ala Asp Pro

1025 1030 1035

Claims

1.一种等位基因Du1 ^ΔA121，其特征在于，所述等位基因Du1 ^ΔA121为野生型水稻Du1基因的编码区第1外显子的第361至363位核苷酸缺失，所述的等位基因Du1 ^ΔA121的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的等位基因Du1 ^ΔA121，其特征在于，所述等位基因Du1 ^ΔA121的编码区序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1~2任一项所述的等位基因Du1 ^ΔA121所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.表达盒或重组载体，其含有权利要求1~2任一项所述的等位基因。

5.权利要求1~2任一项所述的等位基因Du1 ^ΔA121、权利要求3所述的蛋白或权利要求4所述的表达盒或重组载体在水稻杂交育种和品种改良中的应用，

所述应用包括将等位基因Du1 ^ΔA121在水稻中表达获得外观透明的低直链淀粉含量的水稻。

6.获得外观透明的低直链淀粉含量的水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）使水稻包含权利要求1~2任一项所述的等位基因Du1 ^ΔA121；或

2）使水稻表达权利要求3所述的等位基因Du1 ^ΔA121所编码的蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

8.鉴定外观透明的低直链淀粉含量的水稻的方法，其中水稻是包含权利要求1~2任一项所述的等位基因Du1 ^ΔA121的水稻、表达权利要求3所述的蛋白的水稻或权利要求6或7所述的方法获得的水稻，其特征在于，包括以下步骤：

1）鉴定所述水稻是否包含权利要求1~2任一项所述的等位基因；或，

2）鉴定所述水稻是否表达权利要求3所述的蛋白。