CN114438185B - 一种芯片表面双端扩增测序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芯片表面双端扩增测序的方法，在第一链测序完成后，重新向芯片表面提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，通过控制提供的扩增寡核苷酸的数量，可以控制第二链的生成数量，增加第二链的测序信号，从而提高测序准确度；本发明的方法还可与其他高通量测序技术兼容，兼容性更强。

Description

一种芯片表面双端扩增测序的方法

技术领域

本发明涉及一种芯片表面双端扩增测序的方法，属于基因测序领域。

背景技术

现阶段高通量测序技术发展迅速，已成为目前生命研究的常用的分析方法，它具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低的特点，这种技术需要通过扩增将目的DNA指数性的放大，从而实现同时检测几十万到几百万的DNA分子的目的，因此一种测序技术对应一种扩增方式。目前，在高通量测序领域中较为简单的是单端测序，即只需要一种测序引物，测序时从引物5’-3’的方向进行延伸测序，只能按照一种方向进行读取信号，使用的扩增也较为简单，将目的DNA通过PCR或其他扩增技术扩增一次就可以得到大量待测样品。但是单端测序的质量会随着测序的进行而下降，测序序列越往后越不准确，读长受到一定的限制。

双端测序技术是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一链测序完成后，用对读测序模块(Paired-End Module)引导第二链的再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二链的测序。对同一核酸分子进行双端测序时，例如常见的Illumina的双端测序方法(参见专利CN101663405B)，固相介质表面连接两种扩增引物，每种扩增引物上含有不同的剪切位点，通过剪切此剪切位点，将扩增形成的双链DNA分别进行线性化，再进行测序；在第一链测序结束后，此时介质表面留有经过剪切后的扩增引物，再以此扩增引物进行第二链的生成反应，以用于二链的测序。这种常规的技术路线有明显的不足之处：在对第一链测序的过程中，经过数十轮甚至上百轮的测序反应循环，介质表面残留的剪切后的扩增引物不可避免地损耗、与聚合酶等蛋白非特异性结合以及由于未被成功封端而发生非特异性延伸，上述因素均使得可用于第二链生成的扩增引物大大减少，严重影响第二链的生成效率，使第二链的测序信号降低，最终使得测序的准确度降低。

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的技术思路，即在第一链测序前的剪切反应，将扩增引物尽可能靠近其5’端彻底剪切掉，在第一链测序结束后，再重新提供新的扩增引物，用于第二链的生成，增加第二链的生成量，从而提高测序信号和测序准确度。

发明内容

本发明公开了一种芯片表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：

(1)提供固定在支持介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，所述第一扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，所述第二扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，且两种剪切位点互不相同；所述支持介质表面修饰有化学基团；

(2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与支持介质表面的第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；初始延伸所述第一扩增寡核苷酸，以生成与所述模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；

(3)扩增：提供扩增反应物，进行介质表面扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；

(4)剪切，封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；

(5)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；解旋；

(6)向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，所述扩增寡核苷酸至少包括所述第一扩增寡核苷酸或者不包含剪切位点的第一扩增寡核苷酸；

(7)生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链；

(8)剪切，封端：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；

(9)第二链测序：杂交第二测序引物，测序。

根据优选的实施方式，所述支持介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。

根据优选的实施方式，所述支持介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。

根据优选的实施方式，所述支持介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接所述扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。

根据优选的实施方式，支持介质表面修饰的所述化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在支持介质表面。

根据优选的实施方式，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。

根据优选的实施方式，其中所述剪切位点包括用切口内切核酸酶剪切的位点。

根据优选的实施方式，所述剪切包括使所述支持介质表面与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。

根据优选的实施方式，所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基或四氢呋喃修饰的碱基。

根据优选的实施方式，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶Ⅷ或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。

根据优选的实施方式，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8-氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次黄嘌呤碱基、四氢呋喃修饰的碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、一个或多个核糖核苷酸、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。

根据优选的实施方式，步骤(4)和步骤(8)中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3’末端，即：若剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，生成可延伸的3’末端。

根据优选的实施方式，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。

根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括聚合酶和dNTPs。

根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括重组酶和单链结合蛋白。

根据优选的实施方式，步骤(6)中所述重新提供的扩增寡核苷酸的5’端修饰有特定基团，通过与支持介质表面的化学基团发生反应从而固定在所述支持介质表面，生成完整的扩增寡核苷酸，再与所述第一链杂交；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。

根据优选的实施方式，所述重新提供的扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数，优选为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。

根据优选的实施方式，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

根据优选的实施方式，步骤(6)所述重新提供的扩增寡核苷酸包括液相的第一扩增寡核苷酸，可以与所述第一链杂交，所述第一扩增寡核苷酸5’端修饰有特定基团；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。

根据优选的实施方式，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，提供扩增反应物，延伸出第二链；通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第二链固定在支持介质表面。

根据优选的实施方式，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

根据优选的实施方式，步骤(7)包括，提供5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸，通过与支持介质表面化学基团发生反应，将所述液相的扩增寡核苷酸以及步骤(6)中与所述第一链杂交上的第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；再提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的第二链；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。

根据优选的实施方式，步骤(7)所述提供的5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，还可以包括第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数，优选为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点，所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点。

根据优选的实施方式，所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引，所述方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。

根据优选的实施方式，其特征在于，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。

本发明提供一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到模板多核苷酸，按照前面任一项所述的方法扩增测序。

本发明的有益之处

本发明公开的双端扩增测序方法，与现有技术相比，具有如下优势：

1.本发明的方法，在第一链测序完成后，通过向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，来实现第二链的再生，避免了使用现有技术中已损耗的、发生非特异性结合或者非特异性延伸的扩增寡核苷酸来进行第二链再生，通过控制提供的扩增寡核苷酸的数量，可以控制第二链的生成数量，增加第二链的测序信号，从而提高测序准确度。

2.本发明的方法还可以与其他高通量测序技术兼容，兼容性更强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施例，下面将对实施例中所需要使用的附图进行简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是符合本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他实施例对应的附图。

图1.芯片表面双端扩增测序流程示意图，其中101表示固定于介质表面的第一扩增寡核苷酸，102表示第二扩增寡核苷酸，引物带箭头的一端表示的是其3’端，103表示介质表面修饰的化学基团，104所示的黑点代表第一扩增寡核苷酸上的一个剪切位点，105所示的灰点表示第二扩增寡核苷酸上的一个剪切位点，两个剪切位点互不相同。

图2A-B.实施例1中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图2A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图2A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图2B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。

图3A-B.实施例2中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图3A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图3A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图3B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。

图4A-B.实施例3中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图4A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图4A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图4B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。

图5A-B.实施例4中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图5A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图5A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图5B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。附图中各部分的尺寸和形状不代表真实比例，只用以示意本发明内容。

除非另外定义，否则本文使用的所有科学和技术术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”的使用不是限制性的，应被解释为具有开放式含义，也就是说，其应与短语“至少包括”同义地解释。

1.定义和术语

本发明中，术语“支持介质”指的是核酸分子可以附接于其上的任何不可溶的惰性基底或基质，例如玻璃、硅(例如硅晶片)、陶瓷、树脂、二氧化硅、二氧化硅基材料、塑料、尼龙、硝化纤维素、金属、光纤或光纤束、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯、乳胶珠、葡聚糖珠和多孔板等。表面的形状是可选择的，包括，例如，适合用于特定应用的多孔的、平面的或球形的。优选的，将支持介质安装在流动池的内部，以允许其与多个试剂溶液的相互作用。

在一些优选的实施方式中，所述“支持介质”包括上述惰性基底或基质以及媒介材料，该惰性基底或基质通过媒介材料附接核酸分子，该媒介材料具有特定化学基团修饰，可以共价附接核酸分子，且该媒介材料可以通过共价作用力或非共价作用力固定在所述惰性基底或基质上，所述媒介材料包括但不限于，例如水凝胶层、水凝胶微球等，此时的惰性基底可以为玻璃。特殊的，所述媒介材料还可以包括磁性微球，通过外部作用力将其限制在所述惰性基底或基质表面。

本发明所述的“微反应室”指的是常见的测序芯片的微结构，也称作“微坑”“微阱”“微井”等。一般的，是离散分布的凹陷结构，形状是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。每个微反应室都是一个反应的反应室，反馈到测序数据的时候就对应一个数据点。这在测序反应中是常见的事实。

本发明中，“扩增”指的是本领域意义上的扩增。扩增指的是基因扩增，通过一定的技术，使得基因的拷贝数增加。本发明中所述的“模板多核苷酸”包括待测的核酸片段，也可以称为扩增模板。扩增模板是需要扩增的片段。所述的模板的序列可以是未知的。由上面的陈述可以知道，在测序的时候，将长片段的DNA打断以后，形成小的片段，然后连接上接头序列，就可以进行所述的扩增过程。待测分子的片段化可以使用本领域已知的多种技术的任一种进行，例如，超声处理、雾化、物理剪切、化学裂解或酶解等。整个过程中，对于待测的DNA片段或核酸序列片段是没有限制的，任意的序列都可以进行该操作。这也是完整测序的概念。

本发明中，所述“杂交”是分子生物学的常规操作，即两条单链DNA或RNA的碱基配对，具体的，例如，模板多核苷酸单链和介质表面的扩增引物杂交进而从液相转变为固相。

本发明中，术语“恒温扩增”或称“等温扩增”，是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。相比传统的PCR技术，恒温扩增具有显著的优势：检测线低、不需要变温、扩增速度快，且通常反应温度较低，降低了对芯片耐高温的要求。

本发明中，“引物”在扩增反应中经常用到。本发明中涉及到至少两种扩增引物。所述扩增引物的5’端固定在支持介质表面，也就是固相引物。所述两种引物的作用不仅仅在于和模板结合配对，在重组酶存在的情况下，还可将DNA链的另一端连接到介质表面。这样在扩增的过程中，就形成了在介质表面扩增的过程。引物的设计与合成并没有特殊的要求。不同的扩增反应对于引物的数量等的要求是不一样的。本发明中涉及到的扩增反应可以使用至少两种引物的形式。引物的具体设计是可以变化的。

术语“扩增寡核苷酸”指的是包括扩增引物在内的序列，可以全部由天然的核苷酸或经修饰的核苷酸(例如，8-氧代鸟嘌呤、甲基化核苷酸等)组成，还可以包括必要的非核苷酸化学间隔物，包括但不限于含有二硫基或双羟基或偶氮基团或叠氮基团的单元物等。

本发明中，术语“多核苷酸”可以与“核酸”等同使用，与“寡核苷酸”相比，组成“多核苷酸”的核苷酸数目较多，寡核苷酸通常由少于50个核苷酸组成。

本发明中，术语“聚合酶”与其在本领域中的常规意义基本一致，并且还包括，例如，使用核酸作为模板链产生互补的核酸分子的复制的酶。通常情况下，DNA聚合酶结合模板链，沿着模板链移动，顺序地将核苷酸添加到核酸的新生链的3’末端的自由羟基。RNA聚合酶则主要在转录过程中发挥功能，通常以DNA为模板合成RNA分子。聚合酶可以使用引物，起始链增长。此外，一些聚合酶具有链置换功能，具有从由被聚合酶读取的模板链去除互补链的活性。示例性的链置换聚合酶包括但不限于，Bst DNA聚合酶(大片段)、phi29 DNA聚合酶、Sau DNA聚合酶等，一些有用的聚合酶已被修饰，通过突变等方式，以降低或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。

本发明中，术语“重组酶”与其在本领域中的常规意义一致，重组酶装配在ssDNA(如引物)上，形成螺旋纤维.这个重组酶-ssDNA结构可以通过随机碰撞或某些因子的协助，捕获双链DNA。示例性的重组酶包括，例如，RecA蛋白质、T4 uvsX重组酶以及SC-recA、BS-recA、Rad51等同源蛋白质或蛋白质复合物，或其功能的变体。

本发明中，“第一链”是第一轮测序反应中被测序的单链多核苷酸；“第二链”是第二轮测序反应被测序的单链多核苷酸。对于同一双链核酸分子而言，所述第一链和第二链是基本互补配对的。

本发明中，术语“剪切位点”指代的含义较为广泛，任何剪切方法只要满足作用于此位点后使得双链核酸分子在此位点处被切断一条链，从而在支持介质表面只剩下一条多核苷酸链，则此位点就可以被称为“剪切位点”。所述剪切方法包括但不限于：光化学剪切、适合的化学剪切、适合的酶促剪切、核糖核苷酸的剪切、无碱基位点的剪切、具有切口内切核酸酶的酶消化、半甲基化DNA的剪切等方法。

本发明中，“光剪切”包括利用光能对待测核酸中的一条单链进行剪切的任何方法。前述剪切位点可以位于待测核酸中的非核苷酸化学间隔物单元中。所述化学间隔物单元包括可购于Glen Research公司(Sterling,VA,USA)的PC间隔物亚磷酰胺(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2--氰基乙基-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺，可以通过暴露于紫外光源来切割间隔物单元。

可以使用用于寡核苷酸的化学合成的标准技术将此间隔物单元与允许附着于固体表面的硫代磷酸基团一起附着于核苷酸单链的5’末端。

本发明中，“化学剪切”包括利用化学反应(包括但不限于氧化还原反应、水解反应、酶促反应等)以促进/实现对单链多核苷酸进行剪切的任何方法。通常，单链多核苷酸可以包括一个或多个非核苷酸化学部分和/或非天然核苷酸和/或非天然主链连接，以允许化学剪切反应的进行。

代表性的，所述化学剪切位点可以是二硫基，可以使用化学还原剂，例如使用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、巯基乙醇、DTT、半胱氨酸等物质对二硫键进行切割。代表性的，所述化学剪切位点可以是肽键，利用包括蛋白酶K等在内的可以促进肽键水解的酶进行酶促反应，完成剪切反应。

代表性的，所述化学剪切位点可以是氧化型化学连接基团，包括二醇连接单元，其数量可以是一个或多个；可以利用任何促进二醇切割的物质来进行剪切，优选的是高碘酸盐(例如高碘酸钠水溶液)或高锰酸钾；用切割剂(例如高碘酸盐)处理以切割二醇后，可以用“封端剂”处理切割产物，以中和切割反应中产生的反应性物质。为此目的合适的封端剂包括但不限于乙醇胺、三乙胺、三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、半胱胺等。在优选的实施方式中，可以将封端剂(例如乙醇胺)与切割剂(例如高碘酸盐)混合，使得反应性物质一经形成就被封端。可以使用用于自动化化学DNA合成的标准方法将一种或多种二醇连接单元掺入扩增寡核苷酸中。代表性的，所述化学剪切位点可以是还原剪切型连接基团，包括但不限于含有偶氮基团或叠氮基团的单元物。对于含有偶氮基团的化学连接单元，可以利用连二亚硫酸钠溶液处理完成剪切反应，剪切后的残端是惰性的，无需再进行封端反应，非常便捷；对于含有叠氮基团的化学连接单元，可以利用TCEP或者联氨进行处理，完成剪切反应。可以使用用于自动化化学DNA合成的标准方法将含有偶氮基团或叠氮基团的单元物掺入扩增寡核苷酸中。

代表性的，所述化学剪切位点还可以是酸敏感型连接基团，包括但不限于缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等连接方式。可以利用任何促进缩酮、缩醛、碳酸酯、氨基甲酸酯或者二苯基硅氧烷水解的反应物质或者反应体系来进行剪切，优选反应条件是在pH为2-3的酸性缓冲体系中，在室温或者37℃的条件下，反应5-30分钟，即可高效地完成切割。切割后的主产物为尾端各带羟基(或者氨基，对于氨基甲酸酯类来说)的连接单元，副产物为丙酮(或者其他酮类物质)，二苯基硅醇，二氧化碳等惰性物质，副产物不会参与后续的DNA合成反应，无需其他步骤加以去除。

本发明中，“无碱基位点”指的是核酸分子中已经除去碱基组分的位置。无碱基位点可以在生理条件下通过核苷残基的水解而天然存在于DNA中，同时，也可以在人工条件下(例如通过酶的作用)以化学方式形成。无碱基位点一旦形成，便可以利用合适的剪切方法剪切无碱基位点(例如，通过用内切核酸酶或其他单链切割酶、暴露于热或碱处理)，从而提供用于位点特异性剪切扩增寡核苷酸的手段。本领域普通技术人员应该认识到，使用热或碱有可能使核酸分子变性，因此，可能并不是优选的实施方式。

在优选的实施方式中，可以在扩增寡核苷酸的预定位置上产生无碱基位点，通过首先在预定的裂解位点掺入脱氧尿苷(U)来切割，然后可以使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)除去尿嘧啶碱基，从而在特定位置产生无碱基位点。然后可以通过用内切核酸酶(例如EndoIV内切核酸酶、AP裂合酶、FPG糖基化酶/AP裂合酶、Endo VIII糖基化酶/AP裂合酶)、热或碱处理，在无碱基位点处剪切包含无碱基位点的链。

除了脱氧尿苷，还可以在非天然/修饰的脱氧核糖核苷酸上产生无碱基位点，并通过用内切核酸酶、热或碱处理以类似的方式剪切。例如，可以通过暴露于FPG糖基化酶将8-氧代鸟嘌呤转化为无碱基位点；可以通过暴露于AlkA糖基化酶将脱氧肌苷转化为无碱基位点；然后通常可通过用合适的内切核酸酶(例如，Endo IV、AP裂合酶)处理来切割产生的无碱基位点。需要注意的是，由于非天然/修饰的核苷酸将被掺入扩增寡核苷酸中以用于扩增的用途，所以本发明中的非天然/修饰的核苷酸应该满足能够被用于扩增反应的聚合酶复制反应中。

在优选的实施方式中，可以将合适的糖基化酶和一种或多种合适的内切核酸酶混合在一起用于剪切反应。在此类混合物中，糖基化酶和内切核酸酶通常将以至少约2:1的活性比率存在。在一个具体的实施方案中，可购自New England Biolabs的USER试剂用于在扩增寡核苷酸中的尿嘧啶碱基处形成单核苷酸缺口，用内切核酸酶处理在切割位点处产生3’-磷酸部分，有需要时，此3’-磷酸可以被合适的磷酸酶(如碱性磷酸酶)除去。

在分子生物学领域中，使用切口内切核酸酶剪切双链核酸分子的一条链是常规使用的技术。切口内切核酸酶是选择性切割双链核酸的一条链的酶，并且在分子生物学领域是公知的。该方法基本上可以使用任何切口内切核酸酶，需要满足在扩增寡核苷酸上存在的剪切位点中包含合适的识别序列。

在扩增寡核苷酸中掺入一个或多个核糖核苷酸，再利用包括核糖核酸酶在内合适的剪切试剂选择性切割脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，从而实现在特定位点将待测核酸分子切割成单链测序模板。例如，待切割的核苷酸单链包含一个核糖核苷酸以提供用剪切位点。所述合适的剪切试剂包括但不限于：金属离子，例如稀土离子也很有效,特别是La3+,Tm3+,Yb3+,Lu3+离子的活性高，或者Fe(3)或Cu(3)或暴露于升高的pH，例如用碱如氢氧化钠处理。需要特别注意的是，所述合适的剪切试剂在相同条件下不能切割两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键。

核糖核苷酸的基本组成通常不是重要的，而是可以进行选择以优化化学(或酶促)切割。例如，如果要通过暴露于金属离子，特别是稀土金属离子进行切割，则通常优选rUMP或rCMP。为了用核糖核酸酶切割，优选包括两个或更多个连续的核糖核苷酸，例如2-10个或5-10个连续的核糖核苷酸。核糖核苷酸的精确序列通常并不重要，合适的RNA酶包括，例如RNase A，其在C和U残基之后切割。因此，当用RNase A切割时，剪切位点必须包含至少一个C或U核糖核苷酸。掺入一个或多个核糖核苷酸的扩增寡核苷酸可以使用用于寡核苷酸化学合成的标准技术与合适的核糖核苷酸前体容易地合成。

本发明中，所述“半甲基化DNA”是指寡核苷酸中包含一个或多个甲基化核苷酸，会与互补链上的非甲基化脱氧核糖核苷酸相对，使得两条链的退火产生半甲基化的双链体结构。对于该核酸的剪切，可以通过用内切核酸酶切割实现位点特异性切割；所述内切核酸酶对于包含甲基化核苷酸的识别序列是特异性的。可以使用适当的甲基化核苷酸前体，使用自动DNA合成的标准技术，制备掺入一个或多个甲基化核苷酸的扩增寡核苷酸。

本文中，“封端”是固相扩增中的常见步骤，常见的封端是指利用末端转移酶(TdT)等工具酶将带有不可延伸的3’基团的核苷转移到固相核酸(例如，未延伸的扩增寡核苷酸)3’端的步骤，此末端不可继续反应，从而降低副反应的发生。末端转移酶(TdT)是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物，加尾长度可达5-300nt。所述封端反应在测序反应之前进行。

2.发明概述

本发明公开了一种芯片表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：

(1)提供固定在支持介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，所述第一扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，所述第二扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，且两种剪切位点互不相同；所述支持介质表面修饰有化学基团；

(2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与支持介质表面的第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；初始延伸所述第一扩增寡核苷酸，以生成与所述模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；

(3)扩增：提供扩增反应物，进行介质表面扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；

(4)剪切，封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；

(5)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；解旋；

(6)向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，所述扩增寡核苷酸至少包括所述第一扩增寡核苷酸或者不包含剪切位点的第一扩增寡核苷酸；

(7)生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链；

(8)剪切，封端：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；

(9)第二链测序：杂交第二测序引物，测序。

本发明的方法首先将扩增寡核苷酸种植在所述支持介质表面，所述扩增寡核苷酸可以通过与支持介质表面修饰的化学基团发生反应固定在支持介质表面，所述化学基团包括：氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。

根据优选的实施方式，所述媒介材料为微球时，所述微球的直径应与所述微反应室的尺寸相匹配，即微球直径应小于微反应室的尺寸，且不小于该尺寸的一半，以使微球可进入微反应室，而且一个微反应室内不会进入多于一个微球，即所述微反应室的大小大于所述测序微球的直径，但小于微球直径的2倍。

根据优选的实施方式，所述微球的大小为0.2-5微米，优选0.3-3微米，更优选0.35-2.5微米。

在一些优选的实施方式中，可以将固载了至少两种扩增寡核苷酸、且含有特定化学基团修饰的微球加载到加工出微反应室并修饰好的芯片表面，达到芯片绝大多数的微反应室内都有微球而微反应室外不存在微球的状态。优选的，所述微反应室中至多加载一个微球。

在扩增的起始阶段，需要将扩增模板多核苷酸固定到介质表面，具体实现是通过模板两端的公共接头序列(即接头序列1和接头序列2)，该序列至少部分与介质表面的扩增寡核苷酸互补配对，因此可以按照碱基互补配对的原则杂交到支持介质表面。在杂交前，需将双链文库解旋为单链(若是单链文库，则可直接杂交)，再与固相引物互补配对。在杂交结束后，将多余的模板清洗掉并进入含有DNA聚合酶的反应液反应，这样固相扩增引物会根据杂交上的模板多核苷酸延伸出一条完整的互补配对的模板链。紧接着，加入解旋液反应并将解旋下的多核苷酸链清洗走。这样整个芯片内部就不再存在液相的游离DNA，所有模板DNA都复制到了支持介质表面。

本发明中，所述接头序列1和第一扩增寡核苷酸，至少部分序列是互补配对的。这样在扩增模板杂交的时候，可以通过互补配对的形式杂交。所述的接头序列2和第二扩增寡核苷酸的至少部分序列是重合的。杂交结束以后，解旋获得的是扩增模板的反向DNA链，或者说获得的是互补配对链，这个时候，其接头序列也是反向或者互补配对的。因此，在后续的扩增反应的时候，该反向接头序列是需要同第二扩增寡核苷酸结合的。也就是说，接头序列2和第二扩增寡核苷酸的至少部分序列是重合的。当然，扩增寡核苷酸一般来说，还需要满足连接到介质的其他要求，比如包含有连接到介质的基团等。部分匹配的要求属于常见的设计方式。

根据优选的实施方式，将所述模板多核苷酸杂交到介质表面时，通过控制条件使单链模板多核苷酸和种植有扩增寡核苷酸的微反应室或种植有扩增寡核苷酸的微球的数量比为1:1，使得大多数微反应室仅杂交上一种模板序列。

之后采用扩增技术进行扩增，核酸模板在介质表面进行扩增，根据优选的实施方式，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。

根据优选的实施方式，本发明中所述的扩增反应物可以包括聚合酶和dNTPs以及扩增缓冲液。可选的，扩增反应物还可包括重组酶和单链结合蛋白等。

扩增结束后，需要对扩增寡核苷酸进行剪切、封端等处理才能进行后续测序。在介质表面的至少两种扩增寡核苷酸中，第一扩增寡核苷酸包含一个剪切位点，第二扩增寡核苷酸包含一个剪切位点。通过作用于第一扩增寡核苷酸的剪切位点，第二链可以被特异性地剪切掉，未发生延伸反应的第一扩增寡核苷酸也被剪切掉。之后，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，再加入封端液，使得所有固相多核苷酸链或寡核苷酸的3’端都被封住，无法在DNA聚合酶的作用下延伸产生杂信号。在经过上述处理步骤后，只要杂交第一测序引物便可以进行第一链的测序反应了。

本发明中，所述第一扩增寡核苷酸包含一个剪切位点，所述剪切位点尽可能靠近所述寡核苷酸5’端，以便经过剪切反应最大程度地将第一扩增寡核苷酸彻底切除。此剪切反应结合后续的封端反应，可以进一步降低测序过程中副反应(非特异性延伸)的发生，减少干扰信号。由于第一扩增寡核苷酸还需用于第二链的生成，在此步骤将其彻底剪切干净，则需要在第二链生成之前重新向反应体系内提供扩增寡核苷酸，所述重新提供的扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，在一些实施方式中还可以提供第二扩增寡核苷酸。

根据优选的实施方式，所述两种扩增寡核苷酸含有剪切位点指的是，两种扩增寡核苷酸上的剪切位点是不一样的，并且剪切的条件也是不一样的。这样在进行剪切的时候，根据具体的需求，选择不同的剪切条件，可控制地进行有利的剪切。其中，所述的将扩增后的双链模板剪切为单链，指的是将第一扩增寡核苷酸或者第二扩增寡核苷酸通过剪切位点剪切为两段，使得第一扩增寡核苷酸或者第二扩增寡核苷酸与介质表面的连接断开。

本发明中，在进行剪切反应之后，需要使剪切反应的产物经历变性条件以去除未连接至介质表面的被切割的链的部分。例如可以通入甲酰胺溶液反应使核酸变性。

根据优选的实施方式，步骤(4)和步骤(8)中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3’末端，即：若剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，生成可延伸的3’末端。

剪切、封端后，介质表面存在第一链，将第一测序引物与第一链上的测序引物结合位点杂交，通过向测序引物的3’末端顺序添加核苷酸来进行第一链测序反应。DNA聚合酶使用测序引物来启动合成，并且单链多核苷酸作为第一个模板，第一链测序反应的结果是测定第一链的序列并产生第一链的互补链。

根据优选的实施方式，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。荧光发生测序的信号产生原理是DNA聚合酶按照碱基互补配对原则将5’磷酸上标记了荧光基团的反应底物结合到测序模板上，释放下来的基团会在碱性磷酸酶的作用下进一步分解出荧光发生基团，这样DNA模板发生延伸时就会释放出荧光基团并在特定波长激发光下发出荧光。由于测序时存在碱性磷酸酶，要在测序之前将剪切反应后DNA3’端残留的磷酸基团去除，以防止其在测序时产生杂信号。

在一些优选的实施方式中，在第一链测序完成后，解旋，去除测序引物延伸出的单链，向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，再通过反应将所述扩增寡核苷酸固定到介质表面，即重新生成固相扩增寡核苷酸，所述固相扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸，其包含剪切位点或不包含剪切位点；可选的，所述固相扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数，优选为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。之后，第一链与第一扩增寡核苷酸杂交，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的第二链，剪切第二扩增寡核苷酸以去除第一链保留第二链，再进行封端反应，杂交第二测序引物后便可以进行第二链的测序了。所述扩增可以采用恒温扩增或常规PCR。

在优选的实施方式中，步骤(6)中所述重新提供的扩增寡核苷酸的5’端修饰有特定基团，通过与支持介质表面的化学基团发生反应从而固定在所述支持介质表面，生成完整的扩增寡核苷酸，再与所述第一链杂交；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。所述扩增寡核苷酸上修饰的特定基团与支持介质表面的基团发生的反应可以包括，例如：可将氨基修饰的扩增寡核苷酸与羧基修饰的支持介质表面通过NHS/EDC连接；可将羧基修饰的扩增寡核苷酸与氨基修饰的支持介质表面通过NHS/EDC连接；可将炔基修饰的扩增寡核苷酸与叠氮基团修饰的支持介质表面进行click连接；可将叠氮基团修饰的扩增寡核苷酸与炔基修饰的支持介质表面进行click连接；以及其他常用的化学连接方法。EDC/NHS可以用来枝接氨基和羧基，因其没有在链上引入多余的碳链等而广为应用。EDC是可溶于水的碳二亚胺，常用于羧基的活化试剂，使用时pH范围为4.0-6.0，常和NHS连用，以提高偶联效率。

在一些优选的实施方式中，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链。当第一链的数量足够时，可以只进行延伸反应，即可生成足够量的第二链，当第一链的数量不足时，可以通过扩增进一步增加第二链的数量，以得到足够强度的测序信号为准。所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。

在一些优选的实施方式中，步骤(6)所述重新提供的扩增寡核苷酸包括液相的第一扩增寡核苷酸，可以与所述第一链杂交，所述第一扩增寡核苷酸5’端修饰有特定基团；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。

根据优选的实施方式，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，提供扩增反应物，延伸出第二链；通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第二链固定至支持介质表面。

根据优选的实施方式，步骤(7)还可以包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

根据优选的实施方式，步骤(7)还可以包括，提供5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸，通过与支持介质表面化学基团发生反应，将所述液相的扩增寡核苷酸以及步骤(6)中与所述第一链杂交上的第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；再提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的第二链；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等中的一种或多种。

根据优选的实施方式，步骤(7)所述提供的5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，还可以包括第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数，优选为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点，所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点。

本发明中，所述的重新提供的第一扩增寡核苷酸上可以包含剪切位点，也可以不包含剪切位点。由于后续的反应并不需要对第一扩增寡核苷酸进行剪切，不包含剪切位点可以降低引物合成的成本，也是优选的实施方式。可以理解的，当第一扩增寡核苷酸不包含剪切位点时，其核苷酸序列组成与被剪切的固相第一扩增寡核苷酸是一样的。所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点，且与介质表面的固相第二扩增寡核苷酸上的剪切位点相同。

本发明中，扩增反应中包括多条模板多核苷酸，例如，包括10⁵、10⁶、10⁷条或更多的模板多核苷酸，模板多核苷酸的数量可以在纳克至微克的范围内。

本发明的扩增方法，优选地对固相进行。例如，用于扩增的多种扩增寡核苷酸连接于固相支持介质表面。

本发明中，在扩增测序方法的各个步骤之间加入清洗液进行洗涤可能是有益的。

在一些优选的实施方式中，所述媒介材料为水凝胶层，例如聚丙烯酰胺水凝胶层，该水凝胶层作为中间层可以共价附接所述扩增寡核苷酸，该水凝胶层还可通过非共价作用附接在所述惰性基底或基质上，该惰性基底或基质包括但不限于玻璃、硅片等。

在一些优选的实施方式中，所述媒介材料为水凝胶微球。利用化学的合成手段，合成水凝胶微球，然后预留出来可以反应的基团，与扩增寡核苷酸上的化学基团进行反应，从而将扩增寡核苷酸固载到微球表面。作为公开的内容，申请人之前的专利例如CN202010087598.8，例如CN202010986795.3，例如CN202010063461.9，描述了合成水凝胶等种类微球的方法和步骤。

在一些实施方式中，磁性微球也是可以考虑的媒介材料。磁性微球可以通过外界的磁场施加作用力，在某些特殊的条件下，能够发挥作用。

芯片表面的双端扩增测序过程示意图参见图1。微球上带有的生物素可以与芯片表面的链霉亲和素结合，因此首先可以将微球通过离心的方式固载到芯片表面的微坑内。微球上固定了两种固相引物(即101和102)，两种引物上均带有剪切位点(即104和105)，用于后续的剪切步骤，微球表面还带有特定基团修饰103(图中步骤(1))。在扩增开始前，首先将单链模板多核苷酸杂交到微球上(图中步骤(2))，之后，进行初始延伸(图中步骤(3))、解旋和液相模板的取出(图中步骤(4))。然后，进行模板的扩增(图中步骤(5)(6))。在扩增结束后，依次进行固相引物的剪切反应(图中步骤(7))、解旋(图中步骤(8))和封端反应(图中步骤(9))。此时，微球上的模板为第一链，将第一测序引物杂交到第一链上即可进行第一链测序(图中步骤(10))。测序结束后，解旋，将测序引物延伸出的单链解旋掉，通过反应在微球表面重新生成第一扩增寡核苷酸(图中步骤(11))，之后采用恒温扩增或PCR进行再生延伸或扩增(图中步骤(12)(13))。扩增完成后，加入另一种剪切液，作用于第二扩增寡核苷酸上的剪切位点，将第一链剪切掉(图中步骤(14))，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，暴露出可以结合测序引物的单链(图中步骤(15))。同样向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住(图中步骤(16))。最后，在经过上述处理步骤后，杂交第二测序引物便可以进行第二链的测序了(图中步骤(17))。

需要说明的，一般的测序的时候，片段的DNA分子是双链的形式，在杂交之前，需要将双链分子解旋为单链分子。本发明中所述模板多核苷酸是双链核酸文库或单链核酸文库，在杂交前，需将双链DNA解旋为单链，即提供单链模板多核苷酸，再与固相扩增寡核苷酸互补配对。

优选的，所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引，以区分核酸序列的来源。本发明所述的双端扩增测序方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。示例性的，可以先测第一链、再测第一索引、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二索引、再测第二链；或者先测第一链、再测第一索引、再测第二索引、再测第二链；所述索引序列的测序顺序是可调的，可根据实际测序进行选择。

需要说明的，本发明中所述的模板多核苷酸指的是任意的核酸片段序列。高通量测序的过程中，每次有很多的，例如超过100M的核酸片段，任意一个都可以被称为一个模板多核苷酸。

本发明提供一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到模板多核苷酸，按照前面任一项所述的方法扩增测序。

对于基因测序方法，常规的，例如Illumina每轮测一个碱基。大部分测序方法每次都是测一个碱基的信号。对于本发明来说，每次反应几个碱基并不是本发明的重点。本发明所述的双端扩增测序方法，更加适用于申请人之前公开的2+2荧光切换类的测序；但是并不排除常规的类似于Illumina类型的测序方法，本发明的方法展现了很强的兼容性。特殊的，专利CN201510815685.X的内容可以以引用的形式加入本专利。

本发明所涉及的生物化学用的化合物或者修饰物，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

1.将微球固载至芯片表面，微球表面修饰了固载基团和两种扩增引物(即第一扩增引物和第二扩增引物)：

1)用含有0.01％Tween20的1xPBS溶液将微球载体稀释至约3M/μL，并振荡混匀。

2)在芯片进样口，通入稀释好的微球溶液300μL。

3)将芯片进行离心。

2.模板预杂交

1)根据扩增反应最终加入的模板浓度，对模板继续稀释并加入合适体积的0.1MNaOH进行解旋。模板稀释及解旋均取用1.5ml DNA Lobind EP管；若稀释后的模板不需要长期保存可用ultrapure water稀释，如需长期保存，可用TE稀释。下表为常用模板浓度及加入的0.1M NaOH的体积。

模板终浓度	加入的模板和0.1M NaOH体积
		1pM	4μL 100pM模板+4μL NaOH

2)加入0.1M NaOH后，震荡混匀，快速离心2s，放置室温5min。

3)解旋结束后，根据解旋液体积加入5x SSC溶液，使得溶液终体积为400μL，用移液枪缓慢吹打10次混匀立即放置在冰上待用，切记不能震荡混匀。

4)取待扩增芯片，用500μL seq buffer进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL seq buffer进行清洗。

5)取模板溶液加入芯片中，每张芯片加入200μL反应液，用kimtech将芯片出入口处的液体擦干净，用封口膜封口，放入平板PCR仪中，选择anneal程序：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。

6)反应完后取出，放置在冰上待用。

3.初始延伸反应

1)取400μL 2x phusion混合液放置在冰上，再加入400μL超纯水，稀释一倍，震荡混匀，放置在冰上。

2)将上述混合液加入芯片中，每张芯片加入400μL，将芯片放置在平板PCR仪上72℃加热2min。

3)反应结束后向芯片内加入400μL甲酰胺，常温反应5min后用清洗液清洗干净芯片。

4.重组酶聚合酶扩增反应

1)根据下表进行反应液的配制。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。

3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL异丙醇赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的扩增反应液加入芯片中，将芯片置于PCR仪上，拧紧盖子，选择加热程序：40℃，60min；4℃，forever。

5.剪切液(USER enzyme mix)反应，剪切第一扩增引物

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。

试剂	V/μL
		USER酶	4
Cutsmart	40
		ultrapure water	356
Total	400

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将扩增反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的剪切反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择剪切反应程序：37℃，30min；4℃，forever。

6.解旋

1)将剪切液反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

2)每张芯片加入200μL的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。

3)反应结束后，加入1ml 1xTE进行清洗，如果不立即测序，则用封口膜封口，放入4℃冰箱的存储盒中保存。

7.封端液(TdT enzyme mix)反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。

8.第一链测序

1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将封端反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。

4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。

5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第一轮测序。

9.重新杂交第一扩增引物

1)将溶解于1x TE内浓度为100uM的第一扩增引物在EP管内用杂交液稀释至1uM。

2)配制完成后，震荡混匀，2s快速离心。

3)将芯片用500ul清洗液进行清洗，如果芯片内有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡后，再用1ml清洗液进行清洗。

4)将500ul引物溶液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择引物杂交程序：60℃，7min,40℃，3min。

5)反应结束后，加入1ml清洗液清洗。

10.生成第二链

1)取1.5ml EP管按以下体系配制延伸反应液。

试剂	V/ul
		水化液	180
醋酸镁	15
		超纯水	105
总体积	300

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡。

3)将300ul延伸反应液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧

PCR仪盖子，选择延伸程序：40℃，20min，4℃，forever。

4)反应结束后，向芯片内加入1ml清洗液清洗芯片。

11.固相连接反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制固相连接反应液。

试剂	V/ul
		B3T	283
催化剂	17
		Total	300

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。

3)将反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的反应液加入芯片中，室温放置1h。

12.剪切液(Fpg enzyme mix)反应，剪切第二扩增引物

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。

试剂	V/μL
		Fpg酶	10
10x NEB buffer	40
		BSA	4
ultrapure water	346
		Total	400

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

3)将剪切反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

4)剪切结束后，用1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

5)向芯片中加入1ml解旋液，室温放置3min，解旋。

6)加入1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

13.切磷酸反应

1)取1.5ml EP管按以下体系配制切磷酸反应液。

试剂	V/ul
		T4PNK酶	16
10x NEB buffer	40
		Ultrapure water	344
Total	400

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

3)将切磷酸反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

14.封端反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。

试剂	V/μL
		TdT酶	4
10x buffer	40
		CoCl2	40
dTTP	4
		ultrapure water	312
Total	400

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。

15.第二链测序

1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。

4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。

5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二链测序。

16.数据分析

第二链生成效率：

图2A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图2A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图2B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的80％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。

实施例2

步骤1-8与实施例1相同，见上。

9.重新杂交第一扩增引物

1)将溶解于1x TE内浓度为100uM的第一扩增引物在EP管内用杂交液稀释至1uM。

2)配制完成后，震荡混匀，2s快速离心。

3)将芯片用500ul清洗液进行清洗，如果芯片内有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡后，再用1ml清洗液进行清洗。

4)将500ul引物溶液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择引物杂交程序：60℃，7min,40℃，3min。

5)反应结束后，加入1ml清洗液清洗。

10.固相连接反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制固相连接反应液。

试剂	V/ul
		B3T	283
催化剂	17
		Total	300

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。

3)将反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的反应液加入芯片中，室温放置1h。

11.生成第二链

1)取1.5ml EP管按以下体系配制延伸反应液。

试剂	V/ul
		水化液	180
醋酸镁	15
		超纯水	105
总体积	300

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡。

3)将300ul延伸反应液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧PCR仪盖子，选择延伸程序：40℃，20min，4℃，forever。

4)反应结束后，向芯片内加入1ml清洗液清洗芯片。

12.剪切液(Fpg enzyme mix)反应，剪切第二扩增引物

7)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。

试剂	V/μL
		Fpg酶	10
10x NEB buffer	40
		BSA	4
ultrapure water	346
		Total	400

8)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

9)将剪切反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

10)剪切结束后，用1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

11)向芯片中加入1ml解旋液，室温放置3min，解旋。

12)加入1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

13.切磷酸反应

4)取1.5ml EP管按以下体系配制切磷酸反应液。

试剂	V/ul
		T4PNK酶	16
10x NEB buffer	40
		Ultrapure water	344
Total	400

5)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

6)将切磷酸反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

14.封端反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。

试剂	V/μL
		TdT酶	4
10x buffer	40
		CoCl2	40
dTTP	4
		ultrapure water	312
Total	400

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。

15.第二链测序

1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。

4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。

5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二链测序。

16.数据分析

第二链生成效率：

图3A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图3A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图3B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的88％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。

实施例3

步骤1-8与实施例1相同，见上。

9.解旋

1)将测序后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

2)每张芯片加入200μL的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。

3)反应结束后，加入1ml 1xTE进行清洗。

10.固相连接第一扩增引物

1)将第一扩增引物溶解于1x TE内，使其终浓度为100uM。

2)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制固相连接反应液。

试剂	V/ul
		扩增引物	2
B3T	281
		催化剂	17
Total	300

3)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。

4)将反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。

5)将配制混合好的反应液加入芯片中，室温放置1h。

11.第二链生成反应

1)取1.5ml EP管按以下体系配制延伸反应液。

试剂	V/ul
		水化液	180
醋酸镁	15
		超纯水	105
总体积	300

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡。

3)将300ul延伸反应液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧PCR仪盖子，选择延伸程序：40℃，20min，4℃，forever。

4)反应结束后，向芯片内加入1ml清洗液清洗芯片。

12.剪切液(Fpg enzyme mix)反应，剪切第二扩增引物

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。

试剂	V/μL
		Fpg酶	10
10x NEB buffer	40
		BSA	4
ultrapure water	346
		Total	400

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

3)将剪切反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

4)剪切结束后，用1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

5)向芯片中加入1ml解旋液，室温放置3min，解旋。

6)加入1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

13.切磷酸反应

1)取1.5ml EP管按以下体系配制切磷酸反应液。

试剂	V/ul
		T4PNK酶	16
10x NEB buffer	40
		Ultrapure water	344
Total	400

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

3)将切磷酸反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

14.封端反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。

15.第二链测序

1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。

4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。

5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二链测序。

16.数据分析

第二链生成效率：

图4A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图4A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图4B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的79％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。

实施例4

步骤1-8与实施例1相同，见上。

9.重新杂交第一扩增引物

1)将溶解于1x TE内浓度为100uM的第一扩增引物在EP管内用杂交液稀释至1uM。

2)配制完成后，震荡混匀，2s快速离心。

3)将芯片用500ul清洗液进行清洗，如果芯片内有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡后，再用1ml清洗液进行清洗。

4)将500ul引物溶液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择引物杂交程序：60℃，7min,40℃，3min。

5)反应结束后，加入1ml清洗液清洗。

10.固相连接第一扩增引物

1)将第一扩增引物溶解于1x TE内，使其终浓度为100uM。

2)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制固相连接反应液。

试剂	V/ul
		扩增引物	1
B3T	282
		催化剂	17
Total	300

3)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。

4)将反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。

5)将配制混合好的反应液加入芯片中，室温放置1h。

11.第二链生成反应

1)取1.5ml EP管按以下体系配制延伸反应液。

试剂	V/ul
		水化液	180
醋酸镁	15
		超纯水	105
总体积	300

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可加入1ml IPA赶出气泡。

3)将300ul延伸反应液加入到芯片中，封口后，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧PCR仪盖子，选择延伸程序：40℃，20min，4℃，forever。

4)反应结束后，向芯片内加入1ml清洗液清洗芯片。

12.剪切液(Fpg enzyme mix)反应，剪切第二扩增引物

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。

试剂	V/μL
		Fpg酶	10
10x NEB buffer	40
		BSA	4
ultrapure water	346
		Total	400

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

3)将剪切反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

4)剪切结束后，用1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

5)向芯片中加入1ml解旋液，室温放置3min，解旋。

6)加入1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

13.切磷酸反应

1)取1.5ml EP管按以下体系配制切磷酸反应液。

试剂	V/ul
		T4PNK酶	16
10x NEB buffer	40
		Ultrapure water	344
Total	400

2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。

3)将切磷酸反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。

14.封端反应

1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。

试剂	V/μL
		TdT酶	4
10x buffer	40
		CoCl2	40
dTTP	4
		ultrapure water	312
Total	400

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。

4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。

15.第二链测序

1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。

2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。

3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。

4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。

5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二链测序。

16.数据分析

第二链生成效率：

图5A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图5A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图5B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的77％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。

以上内容公开了具体的实施例，详细列举了整个步骤。本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (53)

1.一种芯片表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：

(1)提供固定在支持介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，所述第一扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，所述第二扩增寡核苷酸包含一种剪切位点，且两种剪切位点互不相同；所述支持介质表面修饰有化学基团；

(2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与支持介质表面的第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；初始延伸所述第一扩增寡核苷酸，以生成与所述模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；

(3)扩增：提供扩增反应物，进行介质表面扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；

(4)剪切，封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；

(5)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；解旋；

(6)向芯片表面重新提供扩增寡核苷酸，用于第二链的生成，所述扩增寡核苷酸至少包括所述第一扩增寡核苷酸或者不包含剪切位点的第一扩增寡核苷酸；

(7)生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链；

(8)剪切，封端：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；加入封端试剂，将介质表面的核酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；

(9)第二链测序：杂交第二测序引物，测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支持介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支持介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、光纤、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯或聚氨酯。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支持介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接所述扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、光纤、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯或聚氨酯。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，支持介质表面修饰的所述化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或巯基；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在支持介质表面。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，支持介质表面修饰的所述化学基团包括环炔烃基，所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在支持介质表面。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述剪切位点包括用切口内切核酸酶剪切的位点。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述剪切包括使所述支持介质表面与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增寡核苷酸包含四氢呋喃修饰的碱基。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶Ⅷ或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8-氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次黄嘌呤碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫键、偶氮基、叠氮基、肽键、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯或氨基甲酸酯。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点是四氢呋喃修饰的碱基。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点是一个或多个核糖核苷酸。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)或桥式PCR中的一种。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述重新提供的扩增寡核苷酸的5’端修饰有特定基团，通过与支持介质表面的化学基团发生反应从而固定在所述支持介质表面，生成完整的扩增寡核苷酸，再与所述第一链杂交；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或巯基中的一种或多种。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述重新提供的扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述重新提供的扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

21.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述重新提供的扩增寡核苷酸的5’端修饰有特定基团，通过与支持介质表面的化学基团发生反应从而固定在所述支持介质表面，生成完整的扩增寡核苷酸，再与所述第一链杂交；所述特定基团是环炔烃基。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述重新提供的扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述重新提供的扩增寡核苷酸的5’端修饰有特定基团，通过与支持介质表面的化学基团发生反应从而固定在所述支持介质表面；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或巯基中的一种或多种。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述重新提供的扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。

28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

29.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

30.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述重新提供的扩增寡核苷酸的5’端修饰有特定基团，通过与支持介质表面的化学基团发生反应从而固定在所述支持介质表面；所述特定基团是环炔烃基。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述重新提供的扩增寡核苷酸包括第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸，第一扩增寡核苷酸与第二扩增寡核苷酸的数量比为1-10之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点；所述重新提供的第二扩增寡核苷酸包含剪切位点。

32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

33.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供扩增反应物，进行扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

34.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述重新提供的扩增寡核苷酸包括液相的第一扩增寡核苷酸，可以与所述第一链杂交，所述第一扩增寡核苷酸5’端修饰有特定基团；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或巯基中的一种或多种。

35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，提供扩增反应物，延伸出第二链；通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第二链固定在支持介质表面。

36.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述重新提供的扩增寡核苷酸包括液相的第一扩增寡核苷酸，可以与所述第一链杂交，所述第一扩增寡核苷酸5’端修饰有特定基团；所述特定基团是环炔烃基。

37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，提供扩增反应物，延伸出第二链；通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第二链固定在支持介质表面。

38.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

39.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，将所述液相的第一扩增寡核苷酸与所述第一链杂交，通过所述第一扩增寡核苷酸5’端的特定基团与支持介质表面化学基团发生反应，将所述第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。

40.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸，通过与支持介质表面化学基团发生反应，将所述的液相扩增寡核苷酸以及步骤(6)中与所述第一链杂交上的第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；再提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的第二链；所述特定基团是氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或巯基中的一种或多种。

41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，步骤(7)所述提供的5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，还可以包括第二扩增寡核苷酸，二者的数量比为1-10之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点，所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点。

42.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，步骤(7)所述提供的5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，还可以包括第二扩增寡核苷酸，二者的数量比为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点，所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点。

43.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，步骤(7)包括，提供5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸，通过与支持介质表面化学基团发生反应，将所述的液相扩增寡核苷酸以及步骤(6)中与所述第一链杂交上的第一扩增寡核苷酸固定在支持介质表面；再提供扩增反应物，进行介质表面扩增或延伸，生成固定在介质表面的第二链；所述特定基团是环炔烃基。

44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，步骤(7)所述提供的5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，还可以包括第二扩增寡核苷酸，二者的数量比为1-10之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点，所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点。

45.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，步骤(7)所述提供的5’端有特定基团修饰的液相扩增寡核苷酸至少包括第一扩增寡核苷酸，还可以包括第二扩增寡核苷酸，二者的数量比为1-5之间的任意数；所述重新提供的第一扩增寡核苷酸包含剪切位点或不包含剪切位点，所述重新提供的第二扩增寡核苷酸上包含剪切位点。

46.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引。

47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，还包括对所述第一索引和第二索引进行测序。

48.根据权利要求1-11或13-20或22-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述测序为边合成边测序或连接法测序。

49.根据权利要求1-11或13-20或22-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述测序为荧光发生测序。

50.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述测序为边合成边测序或连接法测序。

51.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述测序为荧光发生测序。

52.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述测序为边合成边测序或连接法测序。

53.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述测序为荧光发生测序。