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CN114480375A - 事件ctc79005-2，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的方法 - Google Patents

事件ctc79005-2，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的方法 Download PDF

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CN114480375A CN202011272914.5A CN202011272914A CN114480375A CN 114480375 A CN114480375 A CN 114480375A CN 202011272914 A CN202011272914 A CN 202011272914A CN 114480375 A CN114480375 A CN 114480375A
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L·库特里
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Abstract

本发明涉及生物技术领域。更确切地说，一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，其抵抗害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis)的侵染，后者作为害虫被广泛知晓，描述为普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫。本发明描述了该事件、事件鉴定的方法，以及插入检测方法，以在插入部分和宿主基因组之间交叉的独特区域和特征性的侧翼区域为基础。

Description

事件CTC79005-2，抗虫甘蔗植株，生产和检测抗虫甘蔗植株的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，描述了一种用于生产转基因植物事件，特别是甘蔗(Saccharum spp.)事件的基因构建体和方法，该事件表达了赋予对害虫小蔗螟(Diatraea saccharalis，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫，或仅称为螟虫)侵染抗性的Cry1Ac毒素。本发明描述了一种检测抗甘蔗螟虫侵染的事件和来自该事件的材料，以及识别这种事件的多核苷酸、引物、探针和侧翼区的方法。本发明具体地涉及用于检测转基因事件、基因构建体的多核苷酸、引物和方法，从植物样本中检测材料的试剂盒，事件CTC79005-2，抗虫甘蔗植株，以及生产抗虫甘蔗的植株、植物细胞、植物部分或种子的方法。
背景技术
甘蔗(Saccharum spp.)是一种属于植物禾本科的草本植物，原产于东南亚，更精确地说，是产于新几内亚和印度尼西亚的广大中部地区。它是热带和亚热带地区生长的最重要的植物品种之一，其面积超过2,300万公顷，分布在121个国家(粮农组织2012年统计年鉴第233页)。
甘蔗是生产糖、酒、糖蜜、朗姆酒、卡莎萨(巴西的国家蒸馏酒)和燃料乙醇的原材料来源。甘蔗碾磨后产生的甘蔗渣可用于打捆、提供热能、在工厂加工、生产电力(通常卖给用户电网)，或作为生产甘蔗第二代乙醇的原料(BR 11 2014 02385-1)。因此，甘蔗农业产业通过由糖和乙醇的商业化以及植物生物质的可持续优化利用为该地区创造了数百万个工作岗位，并促进了外汇的增长，具有巨大的经济和社会意义。
最近，随着全球变暖的出现，以及随之而来的对化石燃料(生物燃料)替代品的渴望，全世界对甘蔗的兴趣大大增加。以甘蔗为基础的乙醇作为一种可再生能源，被认为对减少温室气体和对化石燃料的依赖极为重要，从而使其成为控制全球气候变化的一个关键因素(Savage，2011年)。
由于甘蔗的经济和社会意义，越来越多的研究被用于确定甘蔗种植的最佳农业实践和提高种植品种的质量。改善甘蔗农艺特性的努力集中在提高糖的产量和积累、提高对生物和非生物胁迫的耐受性、对病虫害和病原体的抗性和耐受性，以及开发利用木质纤维素生物质生产甘蔗乙醇的替代技术(PI 0802153-8；PI 0904538-4；PI 1101295-1)。
现代甘蔗品种的多倍体和非整倍体基因组的复杂性，连同其相对有限的遗传基础和低生育率，给利用常规育种选择具有合乎需求的农艺特性的植株带来了很大的困难和许多限制(Souza等人，2011年；D′Hont和Glaszmann，2005年，Basel，第109卷，第1-3期，第27-33页；Cheavegatti-Gianotto等人，2011年)。因此，生产成本高、必须使用手工劳动、产品上市时间线长，可能会阻碍甘蔗产业满足全球市场日益增长的需求。
在过去的20年里，甘蔗产量的增加不仅是种植园生产力提高的结果，也是种植品种多样性增加的结果，使得种植面积扩大到其他地理区域。这种地理扩张要求开发对不同气候条件的适应品种，使甘蔗市场的可持续性得到不断向市场提供新的和当地适应性种质的支持，同时得到控制病虫害的能力的支持。
传统的育种方法对于不断提供新品种是很重要的，但不足以满足现代市场的需求，因为部分特征不是建立在品种的遗传背景上的，最根本的是开发有效的方法以引入外源基因。由于传统育种方法的局限性，以及对快速有效纳入合乎需求的性状的日渐增长的需求，基因工程(生物技术)在甘蔗育种计划中的应用已经变得越来越突出，特别是由于通过基因工程整合合乎需求的农艺性状在其他植物品种(例如大豆、玉米、油菜籽、甜菜和棉花)获得了商业成功。
植物基因工程涉及将目的基因转移到植物细胞中(基因转化)，以这样的方式：使可育性和农艺上优越的后代保持并稳定地表达负责所需性状的基因。
尽管甘蔗具有通过基因工程进行遗传改变(整合入合乎需求特性)的潜力[病毒抗性(Guo等，2015；Zhu等，2011)、昆虫(Kalunke，Kolge，Babu，&Prasad，2009；Weng等,2011)、除草剂(Enríquez-Obregon，Vazquez-Padron，Prieto-Samsonov，De la Riva，&Selman-Housein，1998；van der Vyver，Conradie，Kossmann，&Lloyd，2013)、耐旱性(Molinari等人,2007；Reis等，2014)、盐度(Kumar，Uzma，Khan，Abbas，&Ali，2014)和铝毒性(Ribeiro，2016)、糖分的产量和积累提升(Bewg，Poovaiah，Lan，Ralph，&Coleman，2016；Mudge等，2013)]，这种方法受到甘蔗内在特性的限制。与玉米、水稻、小麦和其他商业谷物不同，甘蔗在组织培养繁殖方面表现出困难，胚性愈伤组织的诱导和再生率低，并且不可能将合子胚作为基因转化的靶组织[(Anderson&Birch，2012；Basnayake，Moyle，&Birch，2011；Molinari等，2007)]。经常观察到甘蔗基因型之间转化效率低和变异性高，为了成功地利用基因工程将合乎需求的农艺性状引入甘蔗中，仍有许多挑战需要克服。
甘蔗被认为是对遗传转化顽抗的物种，尽管已经对该物种的几种遗传工程方法进行了评估，但仍然没有标准的方案以确保转基因事件的产生(Smith等人，1992；Rathius&Birch.1992；Rathius&Birch 1992.；Chen等人，1987；Arencibia 1998；Manickavasagam等人。2004；Elliott等人，1998).
除了该物种的固有限制阻止了现有基因工程技术的应用外，甘蔗基因组的复杂性(高倍性水平和非整倍性)阻止了通过回交(特定基因型的重组)将性状的基因掺入到特定栽培品种中，如同通常在其他商业利益作物中进行的那样。因此，为了在一个以上的种质中"插入"相同的性状而使不同地理区域的生产力得到提高，有必要实行新的遗传转化，承担与为该性状而获得的第一次事件相关的相同的成本和风险。即使在今天，在不同品种的甘蔗中插入相同的特性，成功的可预测性也很低，是一个极度依赖基因型的过程，这使得该物种的转基因产品组合的构建具有挑战性。
该物种的基因型复杂性也极大地影响了对所产生事件的表征(为确保其商业化所必需的特征的存在)。转基因事件的明确识别是确保其可追溯性和监测的根本，这是其商业化的监管要求。甘蔗基因组的高度多倍性和大量的重复区域，连同关于其组织和结构的信息的缺乏，使得对所产生的转基因事件的表征更加困难。
在甘蔗育种领域，即使应用广为人知的常规和/或分子/遗传技术，要提高结果的可预测性，还有一些技术挑战需要克服。尽管在获得更高产的甘蔗品种方面存在着各种技术挑战，但毫无疑问，获得具有显著影响作物产量从而影响其市场的特性的改良品种是非常迫切的。
历史上，农业害虫是造成农业损失的主要因素之一。在巴西，主要的甘蔗害虫是物种小蔗螟Diatraea saccharalis(1794年由Fabricius首次描述)，俗称普通螟虫、甘蔗螟虫或仅称为螟虫。它是草螟科和鳞翅目的成员。该螟虫几乎在所有该作物的地方都有发现，这个面积在2019/20作物季约为1000万公顷(CONAB，2019)。
雌性甘蔗螟虫交配后，产卵200～400粒，分布在叶片两侧以及叶鞘上。孵化后，新生幼虫以叶实质为食，迁移到叶鞘区躲避。它们在此区域停留7至10天，通过刮取叶鞘或年轻节间的树皮取食。蜕皮后，毛虫刺穿茎秆，钻入内部。该虫在茎内制造隧道，通常在取食时向上钻。在秆内，毛虫在成为有翅成虫之前，大约要经历六次蜕皮(DINARDO-MIRANDA，2014)。这是该虫的发育阶段，其对作物造成经济损失(图1)。
甘蔗螟虫的攻击还对用于制糖、制酒的原料的质量造成严重的二次损害，因为螟虫对甘蔗茎的钻蛀，为真菌进入和条件致病菌，特别是造成赤腐病(图2)的镰形刺盘孢菌(Colletotrichum falcatum)和串珠镰孢菌(Fusarium moniliform)，创造了有利条件。与赤腐病原材料相关的细菌会产生不良的发酵作用，带来工业酒精发酵的异物产物。此外，这些细菌还从麦芽汁中含有的糖类中产生有机酸和胶质(葡聚糖)，对酵母细胞的活力产生负面影响，需要在发酵反应器中替换它们(Prececti和Terán，1983；Prececti等，1988；BOTELHO和MACEDO，2002)。细菌在发酵反应器中存在的另一个问题是发生酵母絮凝的可能性。在这种情况下，污染的细菌形成粘液，聚集酵母细胞，导致它们絮凝。最后，被螟虫/赤腐复合病攻击的植物也有高水平的酚类化合物(METCALF和LUCKMANN，1994；PRICE，1997)。
假设有4％的螟虫感染指数(巴西甘蔗田的典型情况)、平均农业损失和害虫控制成本，估计螟虫每年给糖和乙醇生产行业造成的经济损失超过50亿雷亚尔。
甘蔗螟虫由于幼虫在茎秆中的取食行为阻止了杀虫剂有效接触该虫，因此化学杀虫剂难以控制。作为化学杀虫剂的替代品，主要从苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)中鉴定的杀虫蛋白已被用于防治包括Diatraea sp在内的农业害虫，在从Bt菌株中提取的杀虫蛋白中，Cry结晶蛋白因其对常见的鳞翅目、双翅目和鞘翅目幼虫的特定毒性而脱颖而出。这些蛋白质以原毒素(65-149KDa)形式产生，在易感昆虫的肠道中通过蛋白水解而溶解和活化，并与肠细胞膜结合，诱导上皮细胞渗透性溶解，这导致昆虫死亡。
Cry蛋白根据序列同源性分为若干组，其中，被归为Cry1的蛋白组对鳞翅目昆虫表现出高特异性，使其成为引入甘蔗种质中培育甘蔗螟虫抗性品种的优良候选者。在甘蔗品种中异源表达Cry1蛋白，虽然具有一定的挑战性，但对甘蔗螟虫的防治，减少甘蔗产业的经济损失，以及在环境中免除化学杀虫剂，具有很大的潜力。
因此，仍然需要制定策略来减轻害虫侵染特别是甘蔗螟虫的侵染对甘蔗作物造成的损害。通过向甘蔗种植者提供具有高产潜能和抗螟虫性状的品种，农业生物技术为甘蔗产业和巴西的甘蔗种植者作出重要贡献。
本发明中公开的转基因甘蔗事件CTC79005-2的产生是为了向甘蔗种植者提供一个新品种，其抗甘蔗螟虫害，遗传背景为RB92579(植物品种保护/PVP-协议号-21806.000439/2000-45；PVP Certificate№480，于23/07/2003授权)。RB92579品种在2003年推出，在2017/18具有约61000ha的种植面积，已经用于甘蔗田的更新，尤其是在东北地区，其在那里比其他品种多生产了30-40％的甘蔗。RB92579适应于东北地区(更干燥地区)的风土条件，因为它对于灌溉和水的利用具有高度响应性。
实施方案
在第一实施方案中，本发明提供了能够明确识别事件CTC79005-2的多核苷酸。
本发明还确定了能够识别表征事件CTC79005-2的多核苷酸的引物对和探针。
在第三个实施方案中，本发明提供了检测源自CTC79005-2事件的植物材料的方法。
本发明的其它实施方案定义了一种用于检测植物材料样品中存在事件CTC79005-2的试剂盒。
本发明的第五个实施方案是一种能够赋予甘蔗(Saccharum spp.)植物对昆虫侵染，特别是被Diatraea saccharalis害虫侵染的抗性的基因构建体。
另外，本发明还提供了一种转基因甘蔗、植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其包含定位于转化的甘蔗植物基因组中定义的位点的目的基因构建体，其特征在于特定的侧翼序列。
本发明的第七个实施方案是提供一种商品产品。
本发明的第八个实施方案是生产一种抗虫植物的方法。
最后，本发明的第九和第十个实施方案是提供一种制作和培育抗虫甘蔗植物和/或植物细胞、植物部分或种子的方法。
发明简述
第一实施方案是通过提供包含选自由以下组成的组的序列的至少14至26个连续的核苷酸的多核苷酸来实现的：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22。
本发明的第二实施方案通过提供引物对来实现，其中正向引物由SEQ ID NO:6组成且反向引物由SEQ ID NO:7组成和/或正向引物由SEQ ID NO:8组成且反向引物由SEQ IDNO:9组成。
第三实施方案是通过检测源自事件CTC79005-2的植物材料的方法实现的，包括以下步骤：
a)获得用于分析的样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；并且检测扩增产物的存在。
同样为了实现第三实施方案，步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。
仍然为了实现第三种实施方案，本发明描述了一种检测源自事件CTC79005-2的植物材料的方法，包括以下步骤。
a)获得分析用的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA或RNA；
c)提供一种探针，该探针设计成与多核苷酸的互补物结合，所述多核苷酸包含选自SEQID NO:18，SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少14个连续的核苷酸；
d)将所述探针与样品杂交；以及
e)检测探针的实际杂交情况。
本发明的第四个实施方案由检测植物样品中事件CTC79005-2的存在的试剂盒证明，该试剂盒包含用于检测多核苷酸的存在的工具，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸，和/或杀虫晶体蛋白(Cry)。
第五个实施方案是通过提供包含SEQ ID NO:1或2的基因构建体实现的。
第六个实施方案是通过包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物、植物部分、植物细胞、植物组织或种子来实现的。
第七个实施方案是通过提供由本发明的转基因甘蔗生产的商品产品来实现的。
第八个实施方案是通过产生包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的抗虫植物的方法实现的。
本发明的第九个实施方案提供了一种制作抗虫甘蔗植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以生产事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。
最后，本发明的第十个实施方案描述了一种培育事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括在包括昆虫侵染的条件下种植包含SEQ ID NO:5或SEQID NO:22的CTC79005-2的转基因甘蔗植物。
附图简要说明
图1体现了由D.saccharalis(甘蔗螟虫)引起的对甘蔗茎秆的损害。
图2说明了由于D.saccharalis(甘蔗螟虫)的攻击而造成的赤腐-螟害复合病。
图3表示本发明事件中引入的T-DNA的图谱。
图4表示作为构建本发明中使用的质粒的基础使用的质粒。
图5表示所得到的质粒，用于获得目的事件。
图6是经由
Figure BDA0002778249600000071
(相对荧光强度x循环)对目的事件进行qPCR扩增的曲线图。
图7是经由SYBR GREENTM(相对荧光强度x温度)对于目的事件的qPCR熔解曲线。箭头指示了目的事件的特定扩增峰，而且基线指示了其他阴性事件和对照的无扩增。
图8是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(新鲜组织)中Cry1Ac蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha、Piracicaba、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002778249600000072
(PR)和Juazeiro(BA)的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。条形图表示了SE。
图9是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(干燥组织)中Cry1Ac蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha(SP)、Piracicaba(SP)、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002778249600000074
(PR)和Juazeiro(BA)的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。条形图表示了SE。
图10是CTC79005-2事件的Cry1Ac蛋白在茎、叶和根组织的新鲜(A)和干基(B)中的表达均值。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。条形代表平均值±标准误差。
图11是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(新鲜组织)中NptII蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha(SP)、Piracicaba(SP)、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002778249600000075
(PR)和Juazeiro(BA)地点的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。
图12是比较本发明的事件在甘蔗栽培周期期间叶片(干燥组织)中NptII蛋白表达的平均水平的结果。对于Barrinha(SP)、Piracicaba(SP)、Valparaiso(SP)、Quirinópolis(GO)、
Figure BDA0002778249600000073
(PR)和Juazeiro(BA)地点的合并分析。在5％的概率水平下，相同字母下的条形图通过T检验没有差异。
图13是CTC79005-2事件的NptII蛋白在茎、叶和根组织的新鲜(A)和干基(B)中的表达平均值。同一字母下的条形图在5％的概率水平下通过T检验没有差异。条形代表平均值±标准误差。
图14是Western blot方法鉴定Cry1Ac蛋白的结果。M：分子量标记(kDa)。R1至R4：事件CTC79005-2的生物重复；WT1至WT4(阴性对照)：从亲本栽培品种，未转化的RB92579中提取的总蛋白。CP(阳性对照):1ng纯化的Cry1Ac蛋白；WT+CP:1ng纯化的Cry1Ac蛋白稀释在从WT提取的总蛋白中；
Figure BDA0002778249600000081
空孔。
图15是Western blot方法鉴定NptII的结果。蛋白M：分子量标记(kDa)。R1和R2：事件CTC79005-2的生物重复。CP:5ng NptII蛋白；以及WT+CP：5ng NptII蛋白稀释在从亲本栽培品种RB 92579提取的总蛋白中。WT：从亲本栽培品种未转化的RB 92579中提取的总蛋白。
图16表示：A)侵染指数(I.I.％)，B)来自事件CTC79005-2和来自对照(第一次收获的植物)的损害相对长度。字母代表通过T检验进行方差分析的结果，条形指标准误差。
图17表示来自4个地点的事件CTC79005-2的螟虫控制效果(I.I％＝侵染指数)。条形指出分析的标准误差。
图18在A中显示：与亲本非转基因CTC79-TC(RB92579)相比，抗虫(甘蔗螟虫)的CTC79005-2事件的植物材料在叶盘测定中的幼虫死亡率；B。事件CTC79005-2的螟虫防治效果(Borer Control Effectiveness)；C：在叶盘测定中幼虫在喂食七天后大小和发育的示范性结果。左边是用抗虫CTC79005-2事件的植物材料喂养的示范性幼虫，右边(B)是用亲本非遗传修饰的CTC79-TC(RB92579)的植物材料喂养的示范性幼虫。
图19展示了通过基因编辑方式生成事件CTC79005-2的盒(cassette)的例子。盒A包含由pZmUbi启动子和T-35s终止子驱动的甘蔗密码子优化的Cas9；盒B包含由小麦U3启动子驱动的Cas9的crRNA，盒C包含HR模板，HR模板包含CTC79005-2 T-DNA区域(SEQ ID NO 2)的，具有同源臂，用于位点定向整合。
图20表示包含Cas 9和crRNA盒的基因编辑结构的一个例子。
图21表示了一个基因编辑构建的实例，其包含HR模板，HR模板包含CTC79005-2 T-DNA区域(SEQ ID NO 2)，具有同源臂进行位点定向整合。
图22表示基因编辑构建，包含用于产生事件CTC79005-2的所有盒：由pZmUbi启动子和T-35s终止子驱动的密码子优化的Cas9；由小麦U3启动子驱动的Cas9的crRNA和HR模板，包含CTC79005-2 T-DNA区域(SEQ ID NO 2)，具有同源臂用于位点定向整合。
图23A)是使用EcoRV、HindIII和BsrGI限制性酶鉴定事件CTC79005-2中插入的T-DNA的Southern印迹策略的示意图。T-DNA方案下面的灰色箭头表示从CTC79005-2事件产生的T-DNA片段的预测大小。B)是使用限制性酶SphI检测载体(骨干)片段的Southern印迹策略的示意图。
图24表示使用限制性酶EcoRV(左)、HindIII(中)和BsrGI(右)的Southern印迹。识别cry1Ac基因的cry探针的结果。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份。T0：来自第1次收获的植株。T1：来自第2次收获的植株；T2：来自第3次收获的植株；T3：来自第4次收获的植株。
图25表示使用限制性酶BsrGI(左)、HindIII(中)和EcoRV(右)进行Southern印迹。识别UBI启动子的UBI-1探针的结果。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份。T0：来自第1次收获的植株。T1：来自第2次收获的植物；T2：来自第3次收获的植物；T3：来自第4次收获的植物。
图26表示使用限制性酶EcoRV(左)、HindIII(中)和BsrGI(右)的Southern印迹。识别nptII基因的nptII探针的结果。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1份；T0：来自第1次收获的植物。T1：来自第2次收获的植株；T2：来自第3次收获的植株；T3：来自第4次收获的植株。
图27A)表示使用限制性酶SphI和骨干(backbone)探针BB1和BB3的Southern印迹。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1拷贝，用pCTC302。BB1：探针骨干1的阳性对照；BB2：探针骨干2的阳性对照；BB3：探针骨干3的阳性对照。红色箭头表示CTC79005-2事件的两次重复。道1：其他事件。B)代表使用SphI限制性酶和BB2骨干探针的Southern印迹。M：分子量标记；WT：阴性对照；1C：阳性对照1拷贝，用pCTC302。BB1：探针骨干1的阳性对照；BB2：探针骨干2的阳性对照；BB3：探针骨干3的阳性对照。红色箭头表示CTC79005-2事件的两次重复。道1为其他事件。
图28表示在CTC79005-2事件中插入的T-DNA的侧翼区域的完整性的确认。(A)确认左侧边界(5')的完整性。(B)确认右侧边界(3')的完整性。事件：来自事件CTC79005-2的DNA；WT：RB 92579品种的DNA；C-：阴性对照。
发明详述
首先，术语"事件"是指通过遗传转化产生的转基因植物(即经基因修饰植物，经遗传修饰植物)，该转基因植物稳定地表达由引入的转基因赋予的所需性状。更具体地，在本例中，术语"事件"被认为是转基因植物，优选是甘蔗转基因植物(Saccharum spp.)，该植物在经过遗传改造后，表达了抗害虫的特性，特别是对害虫Diatraea saccharalis(甘蔗螟虫)的抗性。在一个优选的实施方案中，通过遗传转化产生的转基因甘蔗被指定为'CTC79005-2'，并且可以交替地称为"CTC79005-2事件"。
另外，为参考目的，除非另有明确提及，"LB区域"是指转移的T-DNA(5')的左边界(边缘)，而"RB区域"是指转移的T-DNA(3')的右边界(边缘)。
此外，除另有明确说明外，本文描述的所有生物序列都涵盖与所描述序列具有至少80％、优选85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性的序列。
最后，"植物材料"是指任何和所有植物组织或其衍生物，诸如但不限于种子、茎、茎秆、叶、秸秆、树皮、根、细胞、植物来源的分子，等等。此外，"植物材料"可以包括植物的任何产品或其衍生物，例如但不限于汁液、糖、乙醇，等等。
重组DNA技术已使基因的分离及其稳定插入宿主基因组成为可能。这种技术也称为基因转化，可以定义为将核酸("DNA"或DNA)受控制地引入到受体基因组中，不包括通过受精引入。这是一个受控的过程，在这个过程中，确定的DNA片段被引入宿主(或受体)基因组，并且必须整合到其中。将这些分子稳定地插入到宿主基因组中，就会产生一个基因组与重组分子的受体(宿主)相等或实质上相等，但具有新的特殊特征的个体。"实质上相等"是指基因组相对于受体具有80％以上，最好是85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。
有几种植物基因转化技术可归纳为两大类：间接和直接基因转移。间接转移是指通过生物载体的作用将外源DNA插入基因组，而直接转移则是基于物理生化过程。
根据基因转化技术和根据要转化的物种或基因型，可以使用不同的组织和/或细胞。一般来说，这些组织或细胞包括但不限于胚胎愈伤组织、愈伤组织、原生质体、胚胎、体细胞胚胎、分生组织、和具有再生能力的植物的任何其它部分、组织或细胞。
间接转化是以农杆菌(Agrobacterium)属的细菌介导系统为基础，一直是获得转基因植物最广泛使用的方法。这种方法的优点包括能够转移相对较长的DNA片段而不发生重排，同时保持转基因的低拷贝数整合，从而保证生成事件的基因型更加稳定。一些农杆菌的种和株、质粒和程序方案已经被开发并适应于几种植物物种的基因转化。这些方法的优点包括对于单拷贝事件更高的概率，稳定的整合，和引入的遗传性状的遗传继承，以及，世世代代的一致的基因表达和更低的基因沉默率。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是属于根瘤菌科的革兰氏阴性土壤植物病原菌，分别引起双子叶植物的病害，即所谓的冠瘤和毛状根球。在这种植物与病原体的相互作用中，农杆菌与植物细胞之间有一个自然基因转移的过程，其中细菌DNA的片段被转移到植物细胞中(T-DNA)，与核基因组整合。在其自然形式下，细菌转移T-DNA("转移的DNA")，它是称为Ti("诱导肿瘤的")的细菌质粒的一部分，并整合到感染的植物细胞的基因组中。转移到植物细胞中的T-DNA片段由参与植物激素(茁长素和细胞分裂素)组成性生物合成的基因组成，这些基因改变了感染组织的正常发育程序，并导致肿瘤的形成。此外，它还包含用于合成糖和可作为细菌的碳和氮源的称为冠瘿碱的氨基酸的癌基因(Oger等人,1997)。左右边界25个碱基对(bp)的重复末端划定了T-DNA的界限，对其转移至关重要。受伤植物组织释放的酚类化合物激活特定区域(vir区域)，启动T-DNA向植物细胞转移的过程。农杆菌还具有染色体(chv)基因，促进细菌与宿主细胞之间的结合，使含T-DNA复合物的孔道形成(Sheng&Citovsky.1996).
由于要转移的片段是由其边界确定的，任何由该边界侧翼的序列都可以通过农杆菌转移到植物上，使得操纵这些序列以转移目的编码序列成为可能。替换或删除野生型T-DNA的编码区(致癌基因)，就可以产生非致癌(缴械)的农杆菌菌株，这些菌株可以携带目的序列。修饰后的T-DNA能够将目的序列转移到植物上，因为毒力基因(vir区域)保持完整。
此外，只要构建体包含这种T-DNA边界，农杆菌间接转化系统就允许将人工质粒构建体转移到植物上，这实现了使用为其它细菌菌株开发的分子工具和材料的灵活性。
这些人工质粒构建体除了具有赋予抗生素抗性、除草剂抗性或耐受性或酶活性(磷酸甘露糖异构酶(PMI)/甘露糖(Man))的基因外，还具有来自不同来源的启动子，例如植物启动子、病毒启动子、细菌启动子和或嵌合启动子，因此这些标记可用于转化细胞或植物的选择。
这些构建还可以包含辅助基因，其干扰相关的形态发生信号通路，提高遗传转化过程的效率和植物组织的再生。包括但不限于LEAFY COTYLEDON1(Lotan等，1998)、Lec1(Lowe等，2002)、LEAFY COTYLEDON2(Stone等，2001)、WUSCHEL(WUS；Zuo等，2002)、e BABYBOOM(BBM；Boutilier等，2002)，等等。
在本发明的第一方面，要引入植物的外来或外源DNA被克隆到二元质粒中，左、右边界共有序列(T-DNA)之间。将二元质粒转移到农杆菌细胞中，随后用于感染植物组织。将包含外源DNA的载体的T-DNA区域插入到植物基因组中。标记基因表达盒和特征基因表达盒可以存在于T-DNA的同一区域，也可以存在于同一质粒上T-DNA的不同区域，或者存在于不同质粒上T-DNA的不同区域。在本发明的一个实施方案中，盒体存在于与T-DNA相同的区域。本领域的技术人员熟悉通过农杆菌间接转化的方法。
另外，可以使用直接DNA转移来直接将DNA引入植物细胞中。直接DNA转移的一种方法是用粒子枪将包含DNA的载体轰击植物细胞进行插入(粒子介导的基因枪转化)。转化植物细胞的其它方法包括原生质体转化(可选地在聚乙二醇的存在下)；在包含多核苷酸或载体的培养基中对植物组织、细胞或原生质体进行超声处理；将多核苷酸或载体显微注射到植物材料中；显微注射、真空渗透、超声处理、使用碳化硅、用PEG进行化学转化、植物细胞电穿孔等。介于直接转化的缺点之间的是与植物组织的再生和转基因表达量低有关的挑战。
此外，还可以通过核酸酶介导的同源重组进行位点直接插入进行基因转化(基因组编辑)。近年来，基于使用工程核酸酶或嵌合核酸酶的基因组编辑技术使转基因生物的生成更加精确和特异。外源基因或外来基因的引入由同源重组实现，通过引入具有与与受体生物基因组同源的DNA片段连接的外源DNA的同源重组模板(HR)。现有的工具之间有嵌合酶系统CRISPR-(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats成簇的规律间隔的短回文重复序列)-Cas，锌指(ZFN)核酸酶和TAL效应核酸酶(TALENs)。Crispr-Cas系统是由两个主要成分组成的酶系统：内切酶(Cas)和引导RNA(单引导RNA-sgRNA；朝向Cas内切酶的特定切割位点的向导)。引导RNA也可以包含两个成分：Crispr RNA(crRNA)--与特定DNA基因组序列互补的17-20mer的序列，以及任选的tracr RNA。由sgRNA引导和内切酶所进行的特异性切割将被同源重组进行修复，特别是将侧翼是同源序列的外源DNA插入到切割位点。将该酶系统引入细胞可以通过几种方式进行，使用质粒，通过直接或间接转化，或使用载体如蛋白质和其他化学试剂。该系统组分的表达将以瞬时或稳定的方式发生，使用受体生物体的细胞机制或以外源方式实现，在体外，将所有准备好使用的组分(内切酶+sgRNA，在细胞递送前体外转录和组合)递送到靶细胞或组织。本文所列出的描述并非详尽无遗，不应限制使用本发明范围内已知的、甚至尚未发现的基因组编辑的不同变体、系统和方法。
转化之后，从转化的植物组织中再生转基因植物，并且可以使用适当的标记如卡那霉素、遗传霉素或草铵膦抗性来选择具有外源DNA的后代。本领域的技术人员熟悉合适的再生培养基的组成。
另外，可以应用其它选择方法，而不需要如前所述在宿主基因组(受体生物体)中插入任何基因标记。
在一个优选的实施方案中，遗传转化是通过农杆菌属的细菌来介导的。
在一个更优选的实施方案中，遗传转化是通过根癌农杆菌介导的。
CTC79005-2事件表现出包含两个表达盒的新基因型。第一表达盒包含适合植物表达的启动子，该启动子与编码在控制鳞翅目昆虫害虫中有用的Cry1Ac杀虫毒素的基因和合适的多腺苷酸化信号可操作地连接。第二表达盒包含适合植物表达的启动子，该启动子可操作地连接到编码用于获得本发明事件的选择性标记的蛋白质的基因。
适合植物表达的启动子可以从植物或其他生物体中分离出来。已经分离或开发了几种启动子，包括组成型启动子、"开和关"启动子和对组织特异性非生物胁迫有反应的启动子等。这些启动子中的许多具有被描述为与适当基因表达相关的内含子序列。在本发明的一个优选方面，启动子是组成型启动子，可以选自CaMV 35s、CoYMV(鸭跖草黄斑驳病毒，Commelina yellow mottle virus)、FMV 35s、泛素(Ubiquitin)、Actin Rice Promoter(Act-1)、Act-2、胭脂碱合成酶启动子(NOS)、章鱼碱合成酶启动子(OCS)、玉米乙醇脱氢酶启动子(Adh-1)、PvUbi1等等组成的非限制性组。
在本发明的一个实施方案中，启动子是玉米泛素基因(pUBI)启动子。在一个甚至更优选的实施方案中，玉米泛素启动子在前导RNA的5'序列中包含一个内含子。
本发明的启动子区域(UBI-1)有1992个碱基对，这些碱基对被细分为：启动子片段(899个碱基)、多泛素-1(polyubiquitin-1)基因的第一外显子(83个碱基)和第一内含子(1,010个碱基)。
为了增强基因表达水平，还可以将额外的元件如内含子、增强子序列和转运子(转运蛋白)加入到表达盒中，例如转录或翻译增强子，如CaMV35s增强子、FMV 35s、Nos、supP、来自小麦主要叶绿素a/b-结合多肽(L-Cab)的非翻译前导序列、翻译起始位点上游5'的kozak序列等等。
在表达盒上还考虑了终止子序列。合适的和功能性的植物多聚腺苷酸化信号的实例包括那些来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nopaline synthase,nos)基因、蛋白酶抑制剂II基因rbcS(豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基,pea ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase small subunit)、Lhcb1(烟草叶绿素a/b结合蛋白)、CaMV 35s、章鱼碱(octopine)合成酶、α-微管蛋白基因，等等的。
在本发明的一个实施方案中，多腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(nos)基因的信号。
优选地，cry1Ac和nptII基因的表达受玉米泛素基因启动子–UBI-1(其有一个内源性内含子)的调节。两种表达盒都使用根癌农杆菌的胭脂碱合成酶合成酶终止子-NOS。
cry1Ac基因编码一种615个氨基酸的毒素，估计分子量为68KDa，来源于苏云金芽孢杆菌serovar kustaki(菌株HD73)，它赋予了对Diatraea saccharalis(甘蔗螟虫)的抗性。本发明考虑了对仅表达原生Cry1Ac蛋白的活性胰蛋白酶核心(active trypticnucleus)进行基因修饰。因此，在本发明的一个优选实施方案中，编码Cry1Ac蛋白的多核苷酸是截断的，编码52KDa的胰蛋白酶杀虫核(tryptic insecticide nucleus)。在一个更优选的实施方案中，Cry1Ac蛋白是SEQ ID NO 34。本发明还考虑了与SEQ ID NO:34的序列具有至少80％，优选85％，90％，95％，98％，99％或100％的同一性的序列。胰核负责蛋白质的杀虫活性，与昆虫肠道的特定蛋白质结合，导致该器官的功能和解剖学完整性的破坏。目标昆虫摄取Cry1Ac蛋白后，会引起营养吸收的改变，从而导致昆虫迅速中毒并随后死亡。
根据本发明，编码Cry1Ac蛋白的多核苷酸可以具有优化(或以其他方式改变)的密码子，以改善在植物材料中的表达。这种密码子优化可用于改变在任何转化细胞中产生的RNA转录产物的预测的二级结构，或破坏存在于未改变的转录产物中的隐性RNA不稳定元件，从而提高转录产物在转化细胞中的稳定性和/或可用性。
优选地，在本发明事件中存在的cry1Ac基因对应于经优选甘蔗密码子优化的截断合成DNA序列。在本发明的更优选方面，cry1Ac基因具有序列SEQ ID NO:20。本发明还考虑了与SEQ ID NO:20的序列具有至少80％，优选85％，90％，95％，98％，99％或100％的同一性的序列。
已经表征了几种用于植物事件选择的标记基因，包括一些赋予抗生素耐受性的基因和其他赋予除草剂抗性的基因。在本发明中可以选择使用的标记基因的例子包括赋予对潮霉素(hygromycin)、卡那霉素、庆大霉素、遗传霉素(geneticin)、草甘膦、草铵膦的抗性或耐受性或对毒素如eutypine的抗性的那些基因。还可以采用其它形式的选择，如基于激素的选择系统、通过表达荧光蛋白的视觉选择、甘露糖异构酶、木糖异构酶等等。在本发明的一个实施方案中，事件选择标记基因是赋予卡那霉素和遗传霉素耐受性的基因。
在本发明的一个优选实施方案中，第二表达盒中使用的标记基因是nptII基因，该基因编码265个氨基酸的新霉素磷酸转移酶II(NptII)酶，估计分子量为29.2KDa。在本发明的更优选方面，nptII基因具有SEQ ID NO21的序列。新霉素磷酸转移酶II赋予对氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素和遗传霉素的抗性。在获得转化事件中用作选择标记的nptII基因来自大肠杆菌Tn5转座子，如BECK等人(1982)所述。NptII蛋白由几种广泛存在于环境中的原核生物产生，水生和陆生栖息地中均存在，以及人和动物肠道微生物群。NptII蛋白利用三磷酸腺苷(ATP)使氨基糖苷类抗生素如新霉素、庆大霉素、巴龙霉素和卡那霉素A、B、C等磷酸化，使其失去活性，从而防止它们在接触上述抗生素时对细胞造成伤害。这种机制使其可以作为选择转化植物的标记物。在本发明的一个优选方面，NptII蛋白具有SEQ ID NO 35的序列。
使用选择标记基因，如nptII基因，对于选择在遗传修饰过程中转化的细胞很重要(HORSCH等，1985)。因此，在本发明的事件中插入nptII基因的目的是选择用cry1Ac基因转化的细胞。
除所述表达盒外，还可在事件CTC79005-2中使用另外的表达盒。
事件CTC79005-2中包含的第一和第二表达盒可以在相同或不同质粒上引入植物。如果第一和第二表达盒位于同一质粒上并通过农杆菌介导的转化方法引入植物，它们可以存在于T-DNA的相同或不同区域内。在本发明的一个实施方案中，第一和第二表达盒存在于T-DNA的同一区域内。
更具体地，本发明的事件是通过根癌农杆菌介导的转化，用包含含有cry1Ac和nptII基因表达盒的DNA片段(T-DNA)的遗传构建体获得的。优选地，本发明的遗传构建体包含序列SEQ ID NO:1的核苷酸。
本发明的事件是通过含有上述定义的T-DNA片段(SEQ ID NO:1)的根癌农杆菌介导的转化获得的。
该T-DNA片段插入到二元质粒中，该质粒的宿主谱中含有大肠杆菌和根癌农杆菌。本发明原始二元质粒的具体遗传元件和成分来源如图4所示。图5中描述了包含本发明构建体的二元质粒。
在一个优选的实施方案中，本发明的基因构建体包含SEQ ID NO:14的序列。
所述构建体是通过本领域普通技术人员已知的技术，如电穿孔或热休克(thermalshock)等，转移到根癌农杆菌(载体)菌株上。
在一个更优选的实施方案中，载体是根癌农杆菌肿菌株EHA105。
进一步描述了一种产生目的事件的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤。
a)将基因构建体引入农杆菌菌株中；
b)从甘蔗(Saccharum spp.)的未成熟叶卷或顶部茎秆中获得胚性愈伤组织；
c)将胚性愈伤组织与农杆菌培养物共培养；
d)在含有氨基糖苷类抗生素的培养基中选择含有功能片段的转化细胞；以及
e)再生转化的甘蔗植物。
在一个实施方案中，生产事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法的步骤a)包括将包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的基因构建体引入农杆菌菌株中。此外，所述方法的步骤e)包括再生转化甘蔗植物，其中转基因甘蔗植物包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。本发明还考虑了，由本文所述方法产生的转基因甘蔗植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
本领域的技术人员熟悉用于生成胚胎愈伤组织(b阶段)的合适的培养基的组成，以及共培养阶段(c阶段：共培养+静息)、选择(d阶段)和再生(e阶段；再生+延伸)的手段。优选地，所使用的培养基是基于包含诸如MS盐(Murashige和Skoog，1962)、蔗糖和维生素B5等成分的组合物。可选地，还可以加入以下：选自脯氨酸和天冬酰胺的氨基酸；酪蛋白水解物；柠檬酸；甘露醇；硫酸铜；甘氨酸；胶凝剂；茁长素；抗生素；乙酰丁香酮；和选择剂。茁长素的使用，在胚胎愈伤组织的生成、共培养和选择中尤为重要，在选择培养基中使用氨基糖苷类抗生素，优选是遗传霉素，也很重要。
"共培养"步骤是指对已经感染或接触过农杆菌(使农杆菌T-DNA转移到植物细胞中)的植物组织进行孵化。该阶段对应于从接种(农杆菌与植物组织接触)后立即一直到菌体被去除或失活的时刻。
接种的组织可以共培养约1至30天，优选1至20天，更优选1至10天。
在共培养步骤中，温度可以是本技术中已知的任何适合目标植物的温度。示例性地，对于甘蔗，温度可以在约15℃至约30℃和约16℃至约29℃范围之间。在一些实施方案中，共栽培步骤在没有光照的情况下进行。
在与农杆菌共培养之后，除去培养基，并将细胞转移到没有农杆菌的培养基中。然后将细胞在约20℃和约26℃之间的温度下在黑暗中培养1至20天。
本文提供的方法还包括选择包含至少一个拷贝的目的遗传序列的细胞。本文使用的"选择"是指其中对转化体使用选择剂的情况，其中所述选择剂将允许含有至少一个定位在T-DNA内的标记基因拷贝的植物细胞优先生长。而那些未转化的细胞将不含有允许在选择剂中生存的标记基因。如上所述，可以使用任何合适的选择标记物。优选地，使用的选择标记基因是nptII基因，该基因编码一种赋予对氨基糖苷类抗生素如遗传霉素的抗性的酶。
在一些实施方案中，还加入抑制农杆菌生长的药剂。
选择可以在光照或黑暗条件下进行，例如，这取决于被转化的植物种类和基因型等。在某些情况下，进行转化的胚胎愈伤组织或其它组织可在同一培养基中定期或不定期地进行传代培养。在愈伤组织转化的情况下，可以将各个愈伤组织分开，以确保每个愈伤组织只再生一株植物(从而确保所有再生的植物来自独立的转化事件)。在一个优选的实施方案中，使用遗传霉素作为选择剂，选择步骤在黑暗中进行约1至10周。更优选地，选择步骤进行约2至5周。
在选择期结束后，可将在选择剂存在下继续生长并因此是已被遗传修饰的植物组织，通过置于合适的培养基和生长条件中进行操作和再生。这样得到的转基因植物可以检测是否存在目的DNA。出于本发明的目的，术语"再生"是指形成包含地上部分和根的植物。再生的植物可以种植在合适的基质(如土壤)上并转移到温室中。如本文所使用的，"遗传修饰(genetically modified)"或"转基因(transgenic)"或"稳定转化(stablytransformed)"是指包含通过转化引入其基因组的目的DNA序列的植物细胞、植物部分、植物组织或植物。
在一个实施方案中，该细菌是农杆菌属的。
在一个更优选的实施方案中，该细菌是根癌农杆菌。
在一个更优选的实施方案中，该细菌是根癌农杆菌菌株EHA105。
本发明还涉及选定事件(CTC79005-2)的表征和检测由其衍生的植物材料的方法。用于检测和表征转基因植物的分析方法包括间接方法(基于蛋白质的检测方法)或直接方法(基于DNA的检测方法)。
宿主细胞基因组中T-DNA稳定整合位点的定义及其侧翼序列的表征对于开发和验证明确识别和表征的方法是必要的。
为了鉴定事件CTC79005-2中T-DNA插入物两端的侧翼区域，进行了多项DNA扩增和测序实验。在T-DNA的两端进行反向PCR(iPCR)检测，以分离和克隆插入物的侧翼区域。随后，利用Sanger法对得到和分离的片段进行测序，以验证iPCR得到的结果。由这些实验产生的数据所得到的存在于事件CTC79005-2中的基因插入图如图3和SEQ ID NO:2所示，事件CTC79005-2的侧翼序列显示在SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24.
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:18的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的至少17个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18。在本发明的另一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:13.
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的多核苷酸。在本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:12的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:5的序列的多核苷酸。在本发明的另一个方面，提供了一种包含序列SEQ ID NO:22的多核苷酸。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的植物。根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ IDNO:18的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的植物。在另外一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:13的植物。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少14个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少15个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少16个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少17个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少18个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少19个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少20个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少21个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少22个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少23个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQID NO:19的26-核苷酸的序列的至少24个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:19的26-核苷酸的序列的至少25个连续核苷酸的植物。在一个实施方案中，提供了一种包含SEQ ID NO:18的植物。在另外一个实施方案中，提供了一种包含SEQ IDNO:13的植物。
在本发明的一个实施方案中，所述植物是转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。此外，所述植物是抗昆虫的，并且包含SEQ ID NO:5。还是在另一个方面，本发明的抗虫植物包含SEQ ID NO:22。在另一个方面，所述植物是事件CTC79005-2的抗虫甘蔗植物或由其衍生的植物。
在本发明的一个方面，事件CTC79005-2是甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQID NO:5。在另一个方面，事件CTC79005-2包含SEQ ID NO:22。
在其他方面，提供了一种检测和鉴定CTC79005-2事件的具体方法。
根据本发明，提供了一种检测来自事件CTC79005-2的转基因甘蔗的植物材料的方法，包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向引物和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；以及
e)检测扩增产物的存在。
在一个实施方案中，根据所描述的检测方法的引物对(步骤c)是设计为与包含SEQID NO 2的连续的核苷酸的多核苷酸结合。
在另一个实施方案中，步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的连续的核苷酸序列。
在一个实施方案中，上述(步骤c)引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少3个连续核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少7个连续核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续核苷酸，其中至少一个引物对包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少14个连续核苷酸。
此外，根据描述的检测方法的引物对被设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31的序列的连续的核苷酸以及第二引物包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计成结合到包含选自SEQID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少3个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ IDNO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少3个连续的核苷酸。在另一个实施方案中，引物对被设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少7个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对被设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的至少14个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少14个连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的至少3个连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39的序列的至少14个连续的核苷酸。
在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQID NO:39的序列的连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸。在一个实施方案中，根据描述的检测方法的引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少3个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少3个连续的核苷酸。在一个实施方案中，引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少7个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少7个连续的核苷酸。此外，引物对被设计为结合到包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸，其中至少一个引物对由第一引物和第二引物组成，第一引物包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的至少14个连续的核苷酸，以及第二引物包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的至少14个连续的核苷酸。
众所周知，特别是对于本技术领域的技术人员来说，DNA分子(或DNA)是由两股(核苷酸的)组成，它们通过核苷酸碱基之间的氢桥固定在一起。根据碱基的互补性进行配对，遵循的一般规则是：腺嘌呤与胸腺嘧啶和胞嘧啶与鸟嘌呤。因此，虽然核苷酸序列的表示只针对其中一条链进行，但它们的互补链或互补序列被包括在本发明的范围内，并被考虑用于本文所述引物和探针的定义。
获得用于DNA提取的样品的方法对于本领域普通技术人员来说是广为人知的，包括收集来自CTC79005-2转基因事件的任何植物材料，如茎、根和叶。优选地，样品从完整的叶子中获得。植物DNA提取方法包括但不限于基于使用CTAB洗涤剂的方法(Alianabi等，1999)，(任选地)随后用氯化铯或乙酸铵进一步净化样品，以及其它市售方法。
既然SEQ ID No:2、3、4、5、22、23、24、29、30、31、36、37、38和39已经可用，适用于本检测方法的引物对可以使用分子生物学技术领域的技术人员熟知的参数进行设计。例如，该对引物中的一个或两个引物可以被设计成构建体特异性、性状基因特异性、启动子特异性、插入DNA和基因组DNA之间连接处的序列特异性和/或侧翼序列特异性。
与本发明的这一方面相应地，有许多扩增方法可以使用。本领域技术人员已知的最常见的扩增技术之一，是聚合酶链反应(PCR)。PCR反应的扩增产物可以通过用荧光标记如溴化乙锭染色核苷酸链，然后用紫外光激发它(通常是在使用琼脂糖凝胶电泳进行大小分离后)来可视化。
本发明的一个实施例采用了PCR原理的变化，如定量实时PCR、巢式PCR、反向PCR(iPCR)、数字PCR、长(Long)PCR、降落(Touchdown)PCR、热起动(Hot Start)PCR、多重PCR等。扩增产物也可以通过不同的方法进行检测，这些方法是本发明所考虑的，例如SYBR GreenTM系统，当该试剂与双链DNA结合时就会发出荧光，以及
Figure BDA0002778249600000233
系统，其检测是基于荧光探针的相互作用。
Figure BDA0002778249600000231
方法使用与位于反应引物之间的目标PCR产物段互补的探针。在PCR循环的杂交阶段，探针与目标DNA结合，在Taq聚合酶延伸过程中，通过其5'-外切酶的活性，去除探针，释放出荧光色素并发出荧光。本发明这方面的其他实施例包括但不限于：环介导等温扩增(LAMP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、微阵列技术Luminex、"DNA行走(DNAwalking)"和下一代测序(NGS)、Sanger法、Illumina等。
本发明描述了一种基于定量实时PCR(qPCR)技术的具体检测方法，称为"Plus-Minus"或"Presence-Absence"，呈现出了该方法的两种变化：SYBR GREENTM和
Figure BDA0002778249600000232
技术。
在本发明的一个实施方案中，提供了引物对，其中正向引物由SEQ ID NO:6和反向引物由SEQ ID NO:7组成和/或正向引物为SEQ ID.NO:8和反向引物为SEQ ID NO:9.
在另一个实施方案中，事件CTC79005-2的转基因甘蔗植物材料检测方法的步骤c)中使用的引物对包含由SEQ ID NO:6组成的正向引物和由SEQ ID NO:7组成反向引物的和/或正向引物是SEQ ID NO:8和反向引物是SEQ ID NO:9。此外，由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物产生的扩增子(扩增后的产物)通过SEQ ID NO:10的标记探针观察。另外，通过SEQID NO:8和SEQ ID NO:9引物产生的扩增子，通过SEQ ID NO:11的标记探针观察。因此，本发明的一个方面是，检测通过使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8和SEQID NO:9获得的扩增产物，是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
在本发明的一个实施方案中，通过所述方法扩增的区域(扩增的扩增子或产物)长度在80至1000个碱基对之间。在另外一个实施方案中，扩增子的长度在100到300个碱基对之间。在一个优选的实施方案中，使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7获得的扩增子的长度为126个碱基对，如SEQ ID NO:12所定义的。在另一个优选的实施方案中，通过使用引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9获得的扩增子长度为104个碱基对，如SEQ ID NO:13所定义的。
图6(本发明经由
Figure BDA0002778249600000241
的事件特异性检测反应)和7(SYBR GREENTM测定)代表两种方法的验证。
本发明中所述的引物和探针可组合使用以检测CTC79005-2事件。因此，本发明的另一个实施方案涉及使用多路PCR来鉴定CTC79005-2事件的植物材料。
本发明中包含用于检测和表征CTC79005-2事件的替代引物和探针。这些和其它变体可与但不限于上述任何一种直接检测方法一起使用。
此外，通过将DNA样品与探针杂交，可以从植物材料中检测CTC79005-2事件。具体而言，本发明描述了一种检测转基因甘蔗事件CTC79005-2的材料的方法，其包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品。
b)从样品中提取DNA或RNA。
c)提供探针或探针组合，该探针设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ IDNO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO 22，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO 31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO38和SEQ ID NO 39的序列的连续的核苷酸。其中多核苷酸是单链的。
d)将所述探针或探针的组合与样品杂交，并且
e)检测探针或探针组合的实际杂交。
在优选的实施方案中，本发明描述了一种检测来自转基因甘蔗事件CTC79005-2的材料的方法，它包括以下步骤。
a)获得用于分析的植物材料样品。
b)从样品中提取DNA或RNA。
c)提供一种探针，该探针设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的14个或更多个连续的核苷酸，同时该多核苷酸为单链。
d)将所述探针与样品杂交，并且
e)检测探针的实际杂交。
根据本发明的一个方面，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少15个连续的核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少16个连续的核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种探针，其设计为结合到包含选自SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少17个连续的核苷酸的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33的序列的至少18个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ IDNO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少19个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少19个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少20个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少21个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少22个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少23个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少24个连续的核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含选自SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少25个连续的核苷酸的多核苷酸。根据本发明的一个方面，提供了一种包含选自SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的序列的至少26个连续的核苷酸的多核苷酸。
该探针可以是例如PCR产物或限制性消化片段。在另一个实施方案中，本文所述的探针可以用适合于使杂交得以检测的荧光、放射性、酶或其它标签标记。鉴于本公开的优点，本领域的技术人员现在将知道如何设计合适的探针。
在另一个实施例中，提供了一种在严格条件下(高特异性)对样品进行探针杂交的方法。严格的杂交条件对于本领域的技术人员来说是众所周知的。严格条件的例子包括：在大约65℃的温度下，在含有6x SSC、0.01％SDS和0.25％脱脂奶粉的溶液中进行杂交，然后在相同的温度下，在含有0.2倍SSC和0.1％SDS的溶液中进行洗涤。
基于杂交原理检测来自事件CTC79005-2的植物材料的合适技术包括但不限于Southern Blots和原位杂交。本领域的技术人员熟悉此类技术。
典型地，这些技术涉及将探针与样品孵育，洗涤以去除未结合的探针，并检测探针是否已杂交。所述检测方法取决于附着在探针上的标签类型。例如，放射性标记的探针可以通过暴露在X射线胶片上和显影来检测。另外，酶标记的探针可以通过转换底物以影响颜色变化来检测。
此外，本发明的另一个方面设想了一种检测源自事件CTC79005-2的植物材料的方法，该方法包括：获得用于分析的样品；提供一种抗体，该抗体设计为与植物内包含的Cry或NptII蛋白结合，该蛋白包含在SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO.19的至少14个连续的核苷酸之内；将所述抗体与样品孵育；以及检测抗体是否结合。在本发明的一个实施方案中，所述Cry蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:20编码，所述NptII蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:21编码。在另外一个实施例中，所述Cry蛋白包含SEQ ID NO:34，所述NptII蛋白包含SEQ ID NO:35。
基于所述抗体结合检测来源于CTC79005-2事件的植物材料的合适方法包括(但不限于)：western blot、ELISA(酶联免疫吸附测定)和质谱法(例如表面增强激光解吸/电离(SELDI))。本领域的技术人员熟悉这些免疫学技术。典型的步骤包括用与Cry或NptII蛋白结合的抗体孵育样品，洗涤以去除未结合的抗体，并检测抗体是否已结合。许多这样的检测方法是基于酶反应的：例如，抗体可以与酶如过氧化物酶连接，在应用合适的底物后，检测颜色变化。这种抗体可以是单克隆或多克隆的。
本发明的另一个方面考虑了一种检测源自事件CTC79005-2的植物材料的方法，该方法包括：获得用于分析的样品；提供来自样品的蛋白质提取物；提供设计用于检测包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸的植物中Cry或NptII蛋白存在的试纸条；将试纸条与样品一起孵育；并检测。在本发明的一个实施方案中，所述Cry蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:20编码，NptII蛋白由核苷酸序列SEQ ID NO:21编码。在另外一个实施例中，所述Cry蛋白包含SEQ ID NO:34，所述NptII蛋白包含SEQ ID NO:35。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种检测来源于CTC79005-2事件的植物材料的方法，所述方法包括：获得用于分析的来源于CTC79005-2事件的样品和来源于非转基因甘蔗品种的样品(对照)；将一种或多种Diatraea saccharallis种的昆虫(对Cry1Ac易感)置于样品中；检测对昆虫的杀虫作用。在本发明的这一方面，"杀虫剂"指的是对昆虫的任何抑制作用(包括但不限于)：减少进食、生长迟缓、降低繁殖力、麻痹和死亡。
检测来自事件CTC79005-2的植物材料的方法包括但不限于生物叶饲检测，其中事件CTC79005-2的植物的叶子或其他合适的部分，或来自事件CTC79005-2的任何植物材料被一种或多种昆虫害虫侵染。所述检测的测量可以包括在调整的时间段后评估叶子或植物损害，评估死亡率或评估其他杀虫效果。这种生物测定可以在田间或温室中进行，并且可以需要自然或人工昆虫侵染。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于检测植物样品中是否存在事件CTC79005-2的试剂盒，所述试剂盒包含：检测包含SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19和/或杀虫晶体蛋白(Cry)的序列的至少14个连续的核苷酸的多核苷酸存在的工具。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒可包含DNA扩增检测技术，如PCR、qPCR或
Figure BDA0002778249600000271
在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可以包含探针杂交检测技术，如Southern Blots或原位(in situ)杂交。在一个方面，检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC79005-2)的转基因甘蔗的材料的工具包含设计成结合到包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸的引物对，其中至少一对引物包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的组的连续的核苷酸序列。此外，该工具包含引物对，其中正向引物包含SEQ ID NO:6和反向引物包含SEQ ID NO:7，或者正向引物包含SEQ ID NO:8和反向引物包含SEQ ID NO:9。在另一个实施方案中，检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC79005-2)的转基因甘蔗的材料的工具包含含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒可包含抗体结合检测技术，如western blots、ELISA、质谱(SELDI)或试纸条。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒可以包含生物昆虫检测技术，如叶片取食生物测定或生物死亡检测。在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒可以包含上述检测技术的任意组合。
本发明所述的转基因事件会影响由鳞翅目昆虫组成的群体中的一个或多个物种的昆虫。因此，与相同品种的非转基因甘蔗植株相比，在所述植株的栽培过程中需要减少杀虫喷雾的次数。
本发明本身并不拘泥于事件CTC79005-2；相反，它被进一步扩展到包括由其衍生的任何植物材料，包括种子，只要它们含有至少一种本发明的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明包括来自转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物组织或种子包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19.在其它实施方案中，本发明考虑了包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。此外，本发明还包括包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。本发明还包括但不限于通过常规或其它杂交方法从具有CTC79005-2事件或其衍生物的杂交系中衍生的植物；因此，本发明的一个实施方案涉及使用来自本文所述转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物、植物细胞、植物部分或种子，该植物、植物细胞、植物部分或种子用于再生植物、种植、栽培植物田或生产植物产品。本发明还考虑了包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。在其它实施方案中，本发明包括包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。在本发明中还考虑了一种包含SEQ ID NO.5或SEQ IDNO:22的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养。此外，本发明还包括从上述组织培养物再生的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中再生的植物包含SEQ ID NO:18或SEQID NO:19。植物细胞和植物部分的实例包括但不限于：悬浮细胞、愈伤组织、体胚、分生组织、顶茎、茎、叶、叶盘、分蘖、芽。另一个方面考虑了一种生产抗虫甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括将第一甘蔗植物与第二甘蔗植物杂交，其中第二甘蔗植物是包含事件CTC79005-2的植物，并由此生产子代甘蔗植物。含有事件CTC79005-2的植物是包含SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物。本发明还考虑了由上述生产抗虫甘蔗的方法生产的甘蔗(Saccharum spp.)植物和植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种商品产品，由包含事件CTC79005-2的甘蔗植物生产。因此，本发明包括一种商品产品，由包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。在一个实施方案中，本发明考虑了一种商品产品，其由包含SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。此外，本发明还包括一种商品产品，由包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的转基因甘蔗(Saccharumspp.)植物生产。商品产品的例子包括但不限于：甘蔗渣、甘蔗汁、糖浆、第一代乙醇(由甘蔗汁生产)、第二代乙醇(纤维素乙醇；由生物质生产)、生物质、糖、原糖、精制糖、糖蜜、酒糟和纤维。
本发明还提供了一种来自CTC79005-2事件的植物材料，其包含额外的多核苷酸序列，经过修饰或比CTC79005-2更小，或表现出其它表型特征。例如，植物材料CTC79005-2事件可以被转化以产生包含额外特征的新事件，例如，第二抗虫基因。这个过程被称为基因叠加。这样的第二昆虫抗性基因编码，例如，来自苏云金杆菌的杀虫凝集素(insecticidallectin)、杀虫蛋白酶抑制剂和其它杀虫蛋白。
本发明还提供了一种昆虫防治方法，包括在所述昆虫进食的地点提供来源于CTC79005-2事件的植物材料。本发明还提供了一种昆虫防治方法，包括在所述昆虫进食的地点提供CTC79005-2衍生的植物材料，并对所述植物材料施用其它农业化学试剂(例如除草剂、杀真菌剂等)。
在其它实施方案中，本发明描述了，一种制造事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括引入基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，以产生事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物与未进行转基因的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比具有更好的抗虫性。在另外一个实施方案中，本发明提供了一种培育CTC79005-2事件的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括种植包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，在包含昆虫侵染的条件下，其中，与在相同条件下种植的未进行遗传修饰的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比，该转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的抗虫性增加。本发明还提供了，一种事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22。
转基因甘蔗'CTC79005-2'的描述
转基因杂交甘蔗'CTC79005-2'植株在遗传学角度实质等同于重组分子的接受者(宿主)(即亲本植株品种'RB92579，一种商业化的巴西甘蔗品种(植物品种保护/PVP-协议号-21806.000439/2000-45；PVP证书№480，授权于23/07/2003))，表型上与其相似，但具有新的和特定的特征(Cry1Ac的表达)，其保证了对甘蔗螟虫D.saccharalis(鳞翅目)的抗虫性。如同其亲本品种'RB92579'，'CTC79005-2'是一个现代甘蔗杂交种，它具有几个合乎需求的农艺特性，诸如高产能，高截根蔗萌发活力的遗传潜力，高甘蔗产量，优良的截根苗生长性，优异的从干旱期中恢复的能力，对灌溉的高度响应性和良好的蔗糖含量。'CTC79005-2'事件，除了昆虫抗性之外，也耐受白条病，棕锈病和橙锈病，以及有对黑穗病的适中的抗性。
在6个不同的地点，与亲本品种‘RB92579’相比，评估了平均成熟的茎秆高度(在种植后330收获日(Harvest Day after Planting)-DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量；从冠部到叶子插入点测量+1)，茎秆直径(在种植后330收获日-DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量)，分蘖数(在30、60、90、120、150、180、210、240、270、300和330DAP；在Juazeiro-BA未测量)，重量(在330DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量)，糖分含量(BRIX％；在330DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量；榨汁)、开花情况(在整个发展周期期间观察，直到330DAP，除了在Juazeiro，数据收集直到210DAP)和每公顷pol％(甘蔗汁中蔗糖的％)吨数(TPH；在种植后330收获日-DAP测量，除了Juazeiro在210DAP测量)。计算TPH根据的公式：
TPH＝(Pol％CanaxTCH)/100
对于每个数据集，将所有地点的数据合并进行统计分析。合并的地点分析采用以下统计模型：
yijk＝μ+Gk+(S)i+B(S)ij+(SG)ik+εijk，
其中，yijk为在地点i上经处理k的第j重复的测量值；μ为总体平均值；Si为地点i(i＝1～6)的效应；Bj为第j重复(j＝1～4)的效应；B(S)ij为在地点i的第j重复(j＝1 to 4)的效应；Gk为处理k(k＝1～7)的效应；(SG)ik为地点i和处理k之间的交互作用；εijk为实验残留误差。
主效应分析和模型交互作用按Kuznetsova等人(2017)的描述进行。所有数据均采用通过lme4包装的混合线性模型(Bates等，2015)进行分析。
农艺和表型特征分析的结果如下方表格所示，并证实了'CTC79005-2'与其亲本品种('RB92579')相似的结论。
表01.'CTC79005-2'和其亲本品种'RB92579'的表型和农艺特征的均值的比较。对Barrinha-SP、Piracicaba-SP、Valparaíso-SP、Quirinópolis-GO、
Figure BDA0002778249600000312
-PR和Juazeiro-BA的合并分析。从Juazeiro-BA收集的数据是在210DAP，其他地点的数据是在330DAP。
Figure BDA0002778249600000311
*转基因事件与亲本品种之间的显著性差异通过按5％水平的t检验(p≤0.05)。SE:标准误差；**范围：在3个商业化参考品种中观察到的最小和最大平均值。
Figure BDA0002778249600000313
未在Juazeiro(BA)进行评估。
实施例
实施例1.CTC79005-2事件的产生--农杆菌转化。
事件CTC79005-2是通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefasciens)介导的RB92579栽培品种的基因转化获得的。
RB 92579是一个商业杂交品种，是CTC79005-2事件的供体基因型(遗传背景)；也就是说，它代表了CTC79005-2事件的未转化对应物。该品种为中晚熟品种，专门在巴西东北地区种植。与其他商业化甘蔗杂交种一样，它是高倍性材料，具有来自其两个亲本品种(S.officinarum和甘蔗细茎野生种S.spontaneum)的大量染色体(DANIELS和ROACH，1987；SREENIVASAN等人，1987)。
CTC79005-2事件具有cry1Ac基因，其表达一种毒素以控制D.saccharalis，以及nptII基因，在基因修饰过程中用作选择标记。cry1Ac和nptII基因的表达由玉米泛素基因启动子UBI-1调控，其具有一个内源性内含子。两种表达盒都使用根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子。
1.1使用cry1Ac和nptII基因开发构建体(图5；SEQ ID NO 14)。
使用商业细菌质粒、限制性酶消化和片段连接(用连接酶)的常规基因克隆技术来开发本发明的构建体(图5)。
通过连接UBI-cry1Ac-NOS和UBI-nptII-NOS盒来开发本发明的构建体。使用限制性酶将含有这两种盒的T-DNA从克隆质粒转移到基础质粒(图4:二元质粒载体，其宿主谱中含有大肠杆菌(Escherichia coli)和根癌农杆菌)，生成本发明的构建体(图5；SEQ ID NO:14).
在最后的克隆步骤之后，将构建体(SEQ ID NO:14)利用热休克插入到大肠杆菌菌株DH5α中。将含有构建体的分离菌落接种到补充有150μg/ml大观霉素的液体LB培养基中，并在37℃下且以250rpm摇动孵育16小时。然后制备含有细菌悬浮液和10％(v/v)甘油的贮存品，将其储存在-80℃的超低温冰箱中。
然后，通过分离和纯化质粒DNA，并通过电穿孔转化农杆菌，将本发明的构建体从大肠杆菌转移到根癌农杆菌菌株EHA105。与大肠杆菌菌株一样，将含有农杆菌的细菌悬浮液和10％(v/v)甘油的存货存放在-80℃的超低温冰箱中。
1.2农杆菌介导的植物转化方法
为了获得胚性愈伤组织，收集在田间或温室中生长长达12个月的幼RB 92579甘蔗叶卷，进行初始外植体的分离。
表面消毒后，在无菌条件下从分生组织上方切取约0.05-5mm厚的横切面。将切片置于愈伤组织诱导培养基[MS–Murashige和Skoog，1962；蔗糖、维生素B5、选自包含脯氨酸的组的氨基酸、酪蛋白水解物、柠檬酸、甘露醇、硫酸铜、甘氨酸、胶凝剂、2，4D]的表面。培养物保持在26±2℃的黑暗中，每隔15天传代培养一次，共3～5个周期，每次7～28天。转化前一周，再次选择愈伤组织的胚胎发生特征(结节、紧凑、不透明、略带黄色)。
由用本发明构建体转化的EHA105菌株组成的农杆菌培养物，从甘油贮藏液开始，在28℃黑暗中保持2～3天。通过在MS液体培养基加乙酰丁香酮中重新悬浮培养制备农杆菌悬浮液用于感染植物材料，调整至最终OD600为0.1-1.0(MS盐、蔗糖和维生素B5)。
目测选出具有胚胎特征的愈伤组织，直接转移到农杆菌悬浮液中，在黑暗中以50转/分的恒定速度持续搅拌，保持30分钟。
在此之后，将愈伤组织从农杆菌悬浮液中分离出来，并去除多余的悬浮液。下一步，愈伤组织在半固体培养基(MS盐、蔗糖、维生素B5、柠檬酸、胶凝剂、2,4D和乙酰丁香酮)中，以22℃避光培养1-5天。
共培养后，将愈伤组织转移到DT静息培养基(MS盐；蔗糖、维生素B5、选自包含脯氨酸和天冬酰胺的组的氨基酸、酪蛋白水解物、柠檬酸、硫酸铜、甘氨酸、胶凝剂、2，4D、特美汀)中，以26℃避光保持14天。
通过在含有植物调节素和选择剂氨基糖苷类抗生素的选择培养基中进行连续传代培养，选择转化的细胞。(含有遗传霉素的选择培养基：MS盐，蔗糖，维生素B5，选自包含脯氨酸和天冬酰胺的组的氨基酸，酪蛋白水解物，硫酸铜，甘氨酸，胶凝剂，2,4D，特美汀)。在这种条件下，愈伤组织在26℃避光保持21天，然后将愈伤组织转移到再生培养基(相当于不含2,4D的选择培养基)，然后转移到延伸培养基(MS盐、蔗糖、维生素B5、酪蛋白水解物、胶凝剂、特美汀)。在选择剂存在的情况下，将愈伤组织暴露在4,000勒克斯的16小时光周期下，然后在将它们转移到温室之前进行繁殖、生根和适应。这个过程被用来生成最终创造事件CTC79005-2的克隆。
实施例2.事件CTC79005-2的分子特征
2.1 DNA提取。
使用来自事件CTC79005-2的约10mg叶片组织。根据制造商的说明，在BioSprint96Nucleic Acid Extractor(Quiagen，GER)上用BioSprint 96 DNA DNA Plant KitExtraction Kit(Quiagen，GER)进行基因组DNA提取。在Multiskan GO光谱仪(ThermoScientific，USA)中，将DNA归一化为10ng/μL的浓度。
2.2插入宿主植物种质的转基因拷贝数的测定。
通过定量
Figure BDA0002778249600000331
PCR(qPCR/
Figure BDA0002778249600000332
)对插入CTC79005-2事件中的cry1Ac和nptII基因的拷贝数进行初步评估，并经由Southern blot和/或测序确认结果。
Figure BDA0002778249600000333
实时PCR反应是通过7500实时PCR系统(Applied Biosystems，美国)在Fast模式下实现的。所用引物对和探针见表02。作为cry1Ac和nptII反应的内对照，以确认所用DNA的存在和质量，以及，反应的有效性，在多重模式中使用甘蔗多泛素基因(正向引物：5'ACCATTACCCTGGAGGTTGAGA 3'(SEQ ID No:15)；反向引物。5'GTCCTGGATCTTCGCCTTCA3'(SEQ ID No:16)；探针：VIC-5'CTCTGACACCATCGAC 3'-MGB(SEQ ID No:17)。
表02:来自
Figure BDA0002778249600000334
测定的用于确定CTC79005-2事件中存在的cry1Ac和nptII基因拷贝数以及载体结构(骨干)的引物和探针。
Figure BDA0002778249600000341
qPCR反应使用1X
Figure BDA0002778249600000342
Fast PCR Master Mix II(Applied Biosystems，USA)，每种引物300nM，相应探针200nM。使用的循环是：50℃循环2分钟用于尿嘧啶N-糖基酶活化，95℃循环20秒用于DNA聚合酶活化，95℃3秒(变性)和60℃30秒(退火和延伸)循环40轮。
通过手动输入扩增曲线指数阶段的阈值进行数据分析。对于cry1Ac和nptII基因，拷贝数由DeltaCt(dCt)分析推断，其中内源基因的Ct(扩增产物发出的荧光信号达到阈值的周期)从靶基因的Ct中减去。在这类分析中，在每一个Ct值，拷贝数都被认为加倍，并且数值已知的同一物种的对照拷贝的参考数量作为参照。
因此，这两种检测都指出CTC79005-2事件基因组中cry1Ac基因存在1个拷贝。nptII基因也检测到相同的拷贝数(即1个拷贝)，该基因的检测是基于基因启动子的检测。
对于Southern印迹，按照冷探针标记步骤(Digoxigenin-DIG)，分别用不同的限制性酶(EcoRV、HindIII、BsrGI和SphI)消化来自CTC79005-2事件及其亲本品种RB 92579的10μg基因组DNA。简而言之，按照制造商(Macherey-Nagel GmbH&Co.KG,德国)的推荐，用
Figure BDA0002778249600000343
Plant II试剂盒在试管中提取CTC79005-2事件和亲本品种RB 92579的基因组DNA。在TAE 1X缓冲液(Tris-乙酸EDTA)中的1％琼脂糖凝胶上检查提取的DNA的质量，以及每个样品使用100单位的限制性酶(10U/μg gDNA)消化10μg的DNA，最终反应体积为400μl。
酶解反应按照制造商的建议(Thermo Fisher，美国)进行。消化产物用2体积的乙醇和10％的7.5M醋酸铵沉淀，并在-20℃下孵育48小时，沉淀的DNA在14,000×g离心30分钟，形成的沉淀重悬在35μl的milli-Q水中，直到完全溶解。用1X TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)在1％琼脂糖凝胶上目测消化质量。用EcoRV、HindIII和BsrGI酶检测含有cry1Ac和nptII基因的盒(图23A)。SphI酶用于检测载体骨干(图23B)。
设计了探针以检测存在于CTC79005-2事件中的cry1Ac基因(探针Cry1Ac-1,079bp)、nptII基因(nptII探针679bp)、UBI启动子区域(1029bp)。用于检测载体片段(骨干)的探针设计在整个载体上，覆盖了约98％的骨干(BB1探针-1,875bp；BB2探针-2,305bp；BB3探针-2,282bp；图23B)。制备探针并用于检测靶标(使用PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂(罗氏，货号#11636090910，瑞士)。将约100pg的线性化载体作为模板，以通过PCR扩增目的区域和引入地高辛分子(DIG)。用于制作探针的引物、杂交温度(Thyb)和每个扩增子的预期大小列于表03中。
来自RB 92579品种的DNA被用作阴性对照。作为阳性对照，将含有用于获得事件CTC79005-2的构建的质粒DNA加入到RB 92579基因组DNA样品中。质粒DNA先前用每个测定中使用的限制性酶线性化。
表03.用于合成用DIG标记的探针的引物清单。
Figure BDA0002778249600000351
将消化的DNA转移到尼龙膜上是根据确立完善的程序进行的。简而言之，将消化的DNA在1％琼脂糖凝胶中用TAE 1X缓冲液在40V下进行电泳约20小时，使用SYBR Safe DNA凝胶染色剂(Invitrogen#S33102，美国)作为嵌合剂(intercalant agent)。然后，将琼脂糖凝胶按以下顺序用四种不同的溶液处理。
·去嘌呤化溶液(1.1％HCL)；10-15分钟。
·变性溶液(0.5N NaOH；1.5M NaCl)；30-40分钟。
·中和液(1.5M NaCl；0.5M Tris)；30-40分钟。
·SSC 20x(盐水柠檬酸钠(Saline Sodium Citrate))；20分钟
根据制造商的说明，使用TurboBlotter Transfer System 20x 25(Sigma#WHA10416324，美国)实施DNA向尼龙膜上的转移。将带有转移的DNA样品的膜置于UV交联设备(UVP-Analytik-Jena，德国)中进行DNA固定(700×100μJ/cm2 2个循环)。然后进行预杂交和杂交。
预杂交处理包括将膜与DIG Easy Hyb溶液(Roche#11603558001，瑞士)在40℃下孵育3小时，与终浓度为100μg.mL-1变性的鲑鱼精子DNA一同，并不断旋转(0.5x g)。之后，用同样的预杂交溶液(DIG Easy Hyb与鲑鱼精子DNA)加入到标有DIG的探针中并变性，进行杂交。所用探针的浓度为65μg.mL-1。杂交温度为50℃。
杂交在杂交炉中进行约16小时，并不断旋转(0.5×g)。杂交后的膜被清洗和封闭。弃去封闭液后，用含有以1∶20000比例稀释的抗地高辛AP片段抗体(Roche#11093274910，瑞士)的新阻断液覆盖膜。然后将膜在室温下孵育30分钟，并轻微摇动。丢弃抗体溶液，并根据制造商的说明，用最终浓度为1X的检测缓冲液(Roche#11585762001，瑞士)加CDP-Star即用型(Roche#12041677001，瑞士)洗涤并孵育膜。为检测化学发光，加入感光胶片(Roche#11666657001,瑞士)，在与膜接触至少16小时后浸入1x显影液(Kodak#1900943，美国)以显现出条带。用1x定影液(Kodak#1901875，USA)固定检测到的带状图像。
在与Cry1Ac的杂交中，对于用EcoRV、HindIII和BsrGI消化的材料，从CTC79005-2事件的所有样品中观察到了一个大于8.5kb的单带(图24)。在与pUBI探针的杂交中，对于用HindIII和EcoRV消化的材料，从CTC79005-2事件的所有样品中观察到了一个大于8.5kb的单带(图25)。用BsrGI消化的样品有两条带，一条涉及包含cry1Ac元件的片段，大于8.5kb，另一条具有包含nptII的片段，其大小近似约4.9kb(图25)。对于与nptII探针的杂交，对于用HindIII和EcoRV消化的材料，观察到大小大于8.5kb的独特的片段。对于BsrGI的消化，与nptII探针的杂交表现出一条大小约为4.9kb的单独片段(图26)。
使用EcoRV、HindIII和BsrGI酶与识别cry1Ac、nptII基因和UBI-1启动子的探针相结合的Southern印迹结果证实了使用qPCR发现的结果，这表明CTC79005-2事件在基因组中只有一个携带一个拷贝cry1Ac基因和一个拷贝nptII基因的整合的T-DNA。此外，来自连续营养繁殖世代收集的样本的所有世代的CTC79005-2事件中都存在相同的片段(T0-T3；图24、25和26)，证实了该事件中插入的基因在4代营养繁殖中的遗传稳定性。在CTC79005-2事件中没有检测到载体骨干的序列(图27)。
2.3侧翼序列的定义。
为了分离事件CTC79005-2中存在的T-DNA插入物两端的侧翼区域，进行了多次DNA测序实验。由这些实验数据生成的事件CTC79005-2的基因插入图如图3所示。
对T-DNA的右边界(3’)末端进行反向PCR(iPCR)检测，以分离和克隆插入物的侧翼区域。左侧边界通过如下描述的捕获测序方法鉴定。iPCR方法是基于基因组DNA消化，使用酶切割T-DNA序列和随机事件基因组序列。切割产物被环化，并使用已知T-DNA区域的引物进行多重巢式PCR循环(表04)。然后将分离出的片段进行分离、克隆并通过Sanger方法进行测序。最后，组装了侧翼区域的共有(consensus)序列(SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24).
表04.用于进行iPCR(反向PCR)以识别CTC79005-2事件的侧翼区域的限制性酶和引物核苷酸序列，以及扩增反应条件。
Figure BDA0002778249600000371
Figure BDA0002778249600000372
同时，由于目前没有完全测序的基因组可以用作RB92579种质的参考，因此采用了捕获测序方法，作为分离插入到事件CTC79005-2的T-DNA及其侧翼区域的额外努力。在该策略中，开发了小的重叠多核苷酸片段(探针)以覆盖整个T-DNA序列。将这些探针与RB92579和CTC79005-2两个栽培品种的部分分级的基因组DNA杂交，并分离出杂交序列。然后根据标准程序使用
Figure BDA0002778249600000382
技术对分离的片段进行测序。将得到的数据与存在于转化载体中的T-DNA序列进行比对，并与上述iPCR数据一起，得到CTC79005-2事件及其侧翼序列(SEQID NO:22、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24)的完整T-DNA共有序列(SEQ ID No:2)。
2.4CTC79005-2事件的检测和表征方法(事件特异性测定)
为了验证该方法，将非转基因对照(WT)植物和具有相同构建体的其他转基因事件作为实验对照。如上所述进行DNA提取。
基于T-DNA插入基因组侧翼序列的分子特征，设计并验证了用于识别CTC79005-2事件的实时PCR检测。为了开发特定的检测方法，选择了被称为"加-减(Plus-Minus)"或"存在-不存在(Presence–Absence)"的实时PCR(qPCR)技术，验证了该方法的两种变化：通过SYBR GREENTM和通过
Figure BDA0002778249600000383
技术。特定的引物对已被设计成在两种方法中产生有关T-DNA插入的信息，这样的一个引物结合到构建体中，第二个引物结合到宿主基因组中。对于
Figure BDA0002778249600000384
技术的使用，在引物之间设计了特定的探针。
在一个优选的实施方案中，设计的引物是为SEQ ID No:6至9定义的引物，其中SEQID NO:6的引物为右边界(RB)的正向引物，SEQ ID NO:7的引物是右边界的反向引物，SEQID NO:8的引物是左边界(LB)的正向引物，SEQ ID NO.9的引物是左边界的反向引物(表05)。
在一个优选的实施方案中，
Figure BDA0002778249600000385
PCR技术中采用的探针由在RB区域(右边界)中的SEQ ID NO:10和/或在左边界中LB区域(左边界)的SEQ ID NO:11组成。
表05.用在实时PCR测定中的引物和探针清单
Figure BDA0002778249600000381
Figure BDA0002778249600000391
Figure BDA0002778249600000392
实时PCR反应使用来自Applied Biosystems的QuantStudio 6Flex。
甘蔗多泛素基因(内源基因)被用作内部反应对照，以确认所使用DNA的存在和质量。以下试剂可与用于事件的测定方法多重地进行：正向引物(SEQ ID NO:15)；反向引物(SEQ ID NO:16)；探针(SEQ ID NO:17)。
qPCR反应使用1X
Figure BDA0002778249600000393
Fast PCR Master Mix II(Applied Biosystems，USA)，每个事件特异性引物为150nM和相应探针为100nM，内源性多泛素基因的引物为200nM，其探针为200nM，DNA 100-200ng，以及足够的水加至20μL的体积。使用以下PCR程序：50℃循环2分钟以活化尿嘧啶N-糖基化酶，95℃循环20秒以活化DNA聚合酶，95℃3秒(变性)和60℃30秒(退火和延伸)35个循环。也可以进行单点(Singleplex)反应。对于单点反应，使用150nM每种事件特异性引物或内源性引物，以及100nM相应的探针。反应条件与对于多重(multiplex)反应的相同。
因此，如图6中所示，通过高精度
Figure BDA0002778249600000394
验证CTC79005-2的事件特异性检测反应是可能的。
Figure BDA0002778249600000395
技术探针特异性地结合到DNA，并在DNA扩增期间被释放，从而在这个过程期间产生可以被设备捕获的荧光信号。
使用SYBR GREENTM的qPCR反应使用Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA)以及来自Applied Biosystems的QuantStudio 6 Flex在其标准模式下进行这种类型的检测。反应使用1X QuantiFast SYBR GreenTM PCR试剂盒(QIAGENTM)、100nM正向引物和反向引物、20ng DNA和足够的水加至最终体积为25μL。使用本发明事件、与本发明事件相同构建体转化的其它事件(阴性对照)、野生型甘蔗(WT，未转化)样品和实验对照(提取和反应空白对照)进行反应。
使用以下PCR程序：95℃下5分钟的一个DNA变性循环，35个循环的引物退火和95℃下15秒及60℃下1分钟的扩增，以及生成熔解峰的一个解离循环(95℃下15秒，60℃下1分钟，95℃下15秒)。使用SYBR safe的反应不允许使用多重扩增，因此，有必要准备一个单独的内源基因扩增反应，使用相同的DNA以消除假阴性。
对应于本发明事件的样品显示出特异性扩增：具有定义良好的扩增曲线形成和特征性的S形形状；而其他事件、WT以及提取和反应空白的样品没有显示出事件特异性扩增。正如预期的那样，除了提取和反应空白对照外，内源性对照对所有样品都呈现了扩增，这既表明了反应中使用的DNA的质量，也表明了反应和循环的质量。
SYBR GREENTM检测结果显示了事件样品在预期的熔解温度下的特异性扩增。其他事件的样品，以及WT和空白的样品在这个温度下不具有峰值(图7)。
实施例3.事件CTC79005-2的产生--基因组编辑(GE)
本发明的事件CTC79005-2是使用基因组编辑(GE)方式产生的，从而重现了使用本文所述的优选的农杆菌介导的转化方法产生的事件。
以这种方式，通过将cry1Ac基因插入到与CTC79005-2事件相同的基因组位置来重现CTC79005-2事件，cry1Ac基因的表达由能够以足以控制目标害虫侵染的水平驱动Cry1Ac蛋白表达的启动子或启动子区域和终止子调节。此外，还插入(瞬时或稳定地)标记基因或选择系统以实现事件选择。优选地，将所要求的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)被插入到与CTC79005-2事件相同的基因组位置。因此，通过插入表达控制D.saccharalis的毒素的cry1Ac基因和nptII基因，重现CTC79005-2事件。cry1Ac和nptII基因的表达受玉米泛素基因启动子UBI-1调控，UBI-1有一个内源性内含子。两种表达盒都使用根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子。
如果上述生成事件CTC79005-2的基因组编辑方法导致T-DNA在靶位点的整合效率低下，可以将发育基因或其他调控元件与GE试剂一起传递，以提高整合效率。
3.1构建体的开发。
使用商业化质粒、限制性酶消化、片段连接(用连接酶)和其它已知方法的常规基因克隆技术来开发本发明的构建体(质粒)。
GE试剂可以在多个质粒上递送，每个质粒包含酶复合体的一个元件(内切酶、crRNA或引导RNA，以及同源重组(HR)模板；图19)。
在一个实施方案中，HR模板构建体包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC79005-2的侧翼序列同源的大约1kb的DNA(SEQ ID Nos:23和24)，位于T-DNA的两侧。在一个优选的实施方案中，HR模板构建体包含SEQ ID NO:26(图21)。本发明还包括包含内切酶表达盒的第二构建体。在一个优选的实施方案中，内切酶表达盒包含Cas9内切酶序列。在更优选的实施方案中，Cas9序列是针对甘蔗表达优化的密码子。在一个实施方案中，Cas 9构建体另外包含引导/crRNA序列。优选地，Cas 9构建体包含crRNA序列SEQ ID NO:28.在一个更具体的实施方案中，Cas 9构建体包含SEQ ID NO:27(图20)。本发明中还计划了单独包含引导RNA表达盒的第三构建体，其包含SEQ ID NO:28.
在另外一个实施方案中，基因组编辑构建体包含HR模板、核酸酶和引导RNA表达盒，在单个构建体中递送所有GE试剂。在一个实施方案中，单一构建体包含所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC79005-2的侧翼序列同源的大约1kb的DNA(SEQ ID Nos:23和24)，位于T-DNA的两侧。在一个优选的实施方案中，该构建体包含SEQ IDNO:25(图22)。
可选地，构建体还包含荧光/选择标记和/或其他基因工程系统，以去除标记基因和/或核酸酶盒，例如来自噬菌体P1的Cre/loxP重组系统。在这种情况下，应被删除的标记基因/核酸酶基因盒侧翼是loxP区域，而Cre重组酶在瞬时表达过程中删除该片段。
3.2直接递送
在一个实施方案中，本发明的事件是使用直接递送蛋白质、RNA或质粒的方法产生的。直接递送的方法选自由粒子轰击、电穿孔、脂质体转染和原生质体转染组成的组；然而，本领域技术人员已知的其它递送方法也可以利用。_
3.2.1直接递送-RNP方法
在一个实施方案中，本发明的事件是使用核糖核蛋白(RNP)递送产生的。RNP递送的优选方法选自甘蔗愈伤组织的粒子轰击和原生质体转染组成的组。此外，其他甘蔗细胞类型也可用于转化，包括(但不限于):叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
使用RNP方式进行基因组编辑，内切酶和crRNA或引导RNA以RNP形式递送，与HR模板分开，后者通过质粒递送。
导向RNA可以通过体外转录初步产生，或如同核糖寡核苷酸以化学方式合成，而相应的核酸酶可以通过进一步纯化(细菌表达)在体内产生，或从任何此类产品的制造商购买。在一个优选的实施方案中，该引导RNA包含SEQ ID NO:28.在另一个实施方案中，核酸酶是Cas9核酸酶。
由相应的核酸酶和引导RNA以及HR模板质粒组成的即用核糖核蛋白(RNP)复合物被吸附在金色颗粒上，并直接递送到细胞或组织中。
3.2.2直接递送--质粒法
在本发明的另一个实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂将以瞬时方式表达，从而实现CTC79005-2的位点定向整合，而无需整合与GE方式相关的额外转基因。
质粒递送的方法选自由甘蔗愈伤组织的粒子轰击(基因枪)或原生质体的聚乙二醇转化组成的组；然而，本领域技术人员已知的其它方法也可以利用。此外，其它甘蔗细胞类型也可用于转化，包括(但不限于)：原生质体、叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
仍然在本发明的另一个实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂是稳定表达的，因此需要使用例如Cre/Lox系统切除整合的GE试剂和可选择的标记。使用这种方式，LoxP位点将保留在事件CTC79005-2植物的基因组中。本领域技术人员已知的其它DNA切除方式也可用于从事件CTC79005-2植物的基因组中去除GE试剂DNA。
3.3间接递送
在一个实施方案中，本发明的事件是使用间接递送质粒的方法产生的，如农杆菌转化。可以使用根癌农杆菌和发根农杆菌。植物病毒也可用于将质粒间接递送至植物细胞和组织。例如，转基因植物双生病毒使得实现更高的转化效率成为可能，特别是在没有稳定插入基因组的情况下。此外，不同的组织和细胞类型也可用于转化，包括(但不限于)：愈伤组织、原生质体、叶盘、分生组织和愈伤组织衍生的悬浮细胞。
在一个优选的实施例中，农杆菌转化如实施例1所述进行。
在另一个优选的实施方案中，本发明的事件是通过农杆菌转化使用质粒递送产生的，其中GE试剂将以瞬时方式表达，从而实现CTC79005-2的位点定向整合，而无需整合与GE方法相关的额外转基因。
GE试剂可以在多个质粒上递送，但优选在单个质粒上递送。在一个优选的实施方案中，构建体是SEQ ID NO:25，包含一个可选择的标记、一个核酸酶、crRNA或引导RNA和同源重组(HR)模板(图22)。HR模板包含含有所要求保护的发明的T-DNA(SEQ ID NO:2)，其两侧是与所述CTC79005-2的侧翼序列同源的DNA(SEQ ID Nos:23和24)，位于表达盒的两侧。
在一个优选的实施方案中，使用质粒递送产生本发明的事件，其中GE试剂稳定表达，因此需要使用例如Cre/Lox系统切除整合的GE试剂和可选择的标记。使用这种方法，LoxP位点将保留在事件CTC79005-2植物的基因组中。本领域技术人员已知的其它DNA切除方式也可用于从事件CTC79005-2植物的基因组中去除GE试剂DNA。
通过上述所有转化过程，所得转化细胞将再生形成含有本发明事件的植物。
3.4分子表征。
使用基因组编辑生成的事件CTC79005-2，对于其T-DNA在基因组的目标位点准确插入情况，使用本发明的引物和探针(SEQ ID NO:6-9)进行评估，如本文说明书中所述。
此外，设计用于扩增事件CTC79005-2侧翼序列中最外侧序列的一对引物得到验证，并可用于评价重组位点的完整性(表06，图28)。
表06.为CTC79005-2侧翼序列设计的引物对。
Figure BDA0002778249600000431
Figure BDA0002778249600000441
PCR反应使用0.2μM引物(表06)，20ngDNA，1X Dream Taq-Thermo Fisher buffer(Thermo Fisher Scientific Inc–美国)，Taq聚合酶(终体积20μL)。反应条件为：在94℃下1分钟一个循环，94℃下30秒、65℃下45秒和72℃下3分钟，35个循环，以及在72℃下7分钟的延伸一个循环。大于2kb的扩增子，反应用1个单位的Takara LA Taq酶–Takara(Takara BioInc-美国)，1X LA PCR缓冲液(Takara Bio Inc-USA),2.5mM MgCl2,2.5mM dNTP,0.5μM引物和200ng的DNA(终体积50μL)进行。
通过表06中的"T-DNA"和"侧翼区域"引物组合进行PCR反应产生的扩增子，可以用Sanger进一步测序，使用表07中所描述的引物对(引物对设计为退火到CTC79005-2事件的T-DNA序列)来确认插入物的完整性。
表07.定位于T-DNA内部的引物对，用于扩增事件CTC79005-2的插入物。
Figure BDA0002778249600000442
Figure BDA0002778249600000451
实施例4.对本发明事件中插入的基因表达产物的评价。
使用ELISA和Western印迹法对本发明事件中的基因表达产物进行了详细的表征，以确定Cry1Ac和NptII蛋白的浓度，并确认这些异源蛋白的身份。
(ELISA)酶联免疫吸附测定。
为了经由ELISA评价cry1Ac和nptII基因的表达，在作物发育的不同阶段研究不同的甘蔗组织。为了生产本发明事件和亲本对照的组织样品，进行的实验测试是AGRO/PHENO。
"AGRO/PHENO"试验在亲本对照种植区的6个代表性地点进行，其中3个在圣保罗州(Barrinha、Piracicaba和Valparaíso)，1个在戈亚斯州(Quirinópolis)，1个在巴伊亚州(Juazeiro)，1个在巴拉那州
Figure BDA0002778249600000453
实验采用随机完全分块设计，4组重复。实验地块由4个8米长的行组成，行间距为1.5米。
表08.用于分析本发明事件产生的cry1Ac和nptII基因表达的样品采集的测定信息。(种植后的天数(DAP)表示用于分析的样品采集的时间)
Figure BDA0002778249600000452
Figure BDA0002778249600000461
在甘蔗植物发育的不同时期，研究了本发明的事件产生的Cry1Ac和NptII蛋白的表达分析。评价的条件是：
·叶片中异源蛋白在本发明的事件的一个栽培周期内的表达(100、200和300DAP)；
·在甘蔗周期的330DAP时的叶子、茎和根中异源蛋白的表达。在Juazeiro是在200DAP时。
在AGRO/PHENO测定中在100、200、300和330DAP时，在实验处理地块(CTC79005-2和亲本对照-RB 92579)上收集叶子样品。在AGRO/PHENO测定中，茎和根样品仅在330DAP时收集。除了Juazeiro之外，那里在200DAP收集叶片、茎秆和根。采集后，样品被送往ELISA分析，以确定Cry1Ac和NptII蛋白的表达水平。
叶子样品：从5到10片"诊断"叶的顶端收集30厘米的组织，在曲折线2和3上，避免病叶。去除中央肋后，将叶子切成碎片，均质化并包装在先前确定的封口袋中。
茎秆样品。收集了10根整根甘蔗。去掉干叶和尖后，将甘蔗切成小尾状，均质化，装入贴有标签的包装中。
根部样品。从实验地块的第2行和第3行采集有代表性的一丛。将土壤粉碎，用清水洗净根部，去除多余的土壤。然后将干净的根切成碎块，均质化，装入有标签的塑料袋中。
所有样品(来自叶、茎和根组织)在取样15分钟内转移到泡沫塑料箱中的干冰中。如上所述，通过事件特异性检测确认所有团块样品的遗传学身份。
为了分析Cry1Ac蛋白，使用TissueLyser设备浸渍30±1mg叶、200±1mg茎和20±1mg根组织。向浸渍的叶组织中加入750μL补充有Tween 20的生理盐水磷酸盐提取缓冲液(PBS)(0.138M NaCl；0.027mM KCl；0.05％Tween 20，pH 7.4)，按照制造商的说明(EnvirologixTM，美国)稀释。对于茎秆，使用375μL相同的缓冲液，对于根部样品，加入1,500μL。
对于叶子中NptII蛋白的分析，称重40±1mg并浸渍，对于茎和根样品，称重200±1mg并浸渍。在浸渍后的叶组织样品中，加入750μL提取缓冲液；而在茎和根样品中，加入1500μL同样的缓冲液。本例使用的提取缓冲液为PEB1 1x(pH 7.0)，按厂家说明书(
Figure BDA0002778249600000471
Kit for NPT II,Agdia,USA)进行稀释。
缓冲液加入后，进行旋涡震荡均质化，然后以最大速度离心20分钟。收集所得上清液，用Bradford测定法(Cry1Ac)和BCA(NptII)对总蛋白进行定量。
用于获得校准曲线的标准是与上述试剂盒一起提供的已经稀释的商业BSA(牛血清白蛋白)标准。使用2000、1000、500、250、125和0μg/mL的校准物(在PBST缓冲液中配置)。每种标准校准物10μL，一式三份加入板孔中。独立稀释生成总共6条曲线。对于样品，3个单独的蛋白质提取液在每个孔中使用10μL。然后将200μL的Coomassie Plus ReagentSolution加入到每个含有校准剂和样品的孔中。盖上板子，在室温下孵育5分钟。使用SoftmaxPro 7.0软件(Molecular Device,美国)在595纳米(nm)处读取吸光度。
对每个研究的样品获得一式三份的总蛋白。对每个重复的总蛋白定量后，选择中位定量值变异最小的样品进行ELISA分析。总蛋白定量后，叶片和茎秆样品稀释700x；而用于Cry1Ac分析的根样品稀释70x。对于NptII分析，叶片和茎秆样品稀释5x；而根样品直接使用，不经稀释。
通过96孔板光谱仪在两种不同波长下读取结果：在SpectraMax Plate reader(Molecular Devices,美国)上对于Cry1Ac以450nm和630nm的波长以及对于NptII以450nm的波长读取。对于Cry1Ac，使用Envirologix AP003 CRBS试剂盒进行蛋白质检测和定量。对于NptII使用
Figure BDA0002778249600000472
Kit for NPT II(Agdia，美国)试剂盒。在所有情况下，都遵循制造商的建议。
分析是基于测试样品的吸光度值与通过测量标准曲线的吸光度估计的方程中的预测值的关联。将合成蛋白在PBST缓冲液中稀释至所需浓度。对每个样品进行一式两份的实验分析。Cry1Ac和NptII蛋白的浓度是根据总蛋白(μg/mg)、新鲜组织(μg/g)和干燥组织(μg/g)计算的。
蛋白Cry1Ac和NptII的表达的统计分析结果分别示于表9和表10。蛋白质的表达数据来自于一式两份的四组生物重复的平均值(实验田块)。表9列出了收集的一年栽培(100、200、300和330DAP)的甘蔗叶片中的Cry1Ac蛋白表达数据，按不同地点进行的个体和合并分析的结果。表10显示了在相同条件下，对NptII蛋白的分析结果。
表09.经过一年的栽培(100、200和300DAP；DAP＝种植后的天数)和在330DAP时，Cry1Ac在CTC79005-2事件的叶子中平均表达水平的比较。对于6个测试地点的个体和联合的统计分析。在个体和合并分析中，在Juazeiro-BA的300和330DAP时的数据不可用。经过5％水平的t检验，后跟相同字母的均值没有差异(p≤0.05)。(SE：标准误差)。
Figure BDA0002778249600000481
表10:经过一年的栽培(100、200和300DAP)和在330DAP时，NptII在CTC79005-2事件的叶子中平均表达水平的比较，对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。在个体和合并分析中，在Juazeiro-BA的300和330DAP时的数据不可用。经过5％水平的t检验，后跟相同字母的均值没有差异(p≤0.05)。(SE：标准误差)。
Figure BDA0002778249600000491
来自对本发明的事件在6个地点进行一年的甘蔗栽培的合并分析(表09)的Cry1Ac的表达数据(叶片；μg/g新鲜组织和干燥组织)如图8(单位为μg蛋白/g新鲜组织)和图9(单位为μg蛋白/g干燥组织)所示。来自本发明的事件在6个地点进行一年的甘蔗栽培中的合并分析(表10)的NptII表达数据(叶片；μg/g新鲜组织和干燥组织)显示在图11(单位为μg蛋白/g新鲜组织)和图12(单位为μg蛋白/g干燥组织)。
在一个甘蔗周期内，所有地点(Juazeiro在300和330DAP时除外——无数据)的CTC79005-2事件的叶子中Cry1Ac蛋白的平均表达量为新鲜组织60.34μg/g和干燥组织185.37μg/g。对于NptII，在一个甘蔗周期内，所有地点(Juazeiro在300和330DAP时除外——无数据)的CTC79005-2事件的叶子中的平均表达量为新鲜组织0.22μg/g和干燥组织0.68μg/g。
表09和图10显示了来自在330DAP(Juazeiro为200DAP)时收获的CTC79005-2事件的叶子中Cry1Ac蛋白的表达数据(单位为μg蛋白/g新鲜和干燥组织)。表10和图13中显示了来自在330DAP(Juazeiro为200DAP)时收获的事件CTC79005-2的叶子中的NptII蛋白表达数据(单位为μg蛋白/g新鲜和干燥组织)。
330DAP时收获的来自本发明的事件的成熟茎秆中的Cry1Ac蛋白表达数据见表11和图10(μg/g新鲜和干燥组织)。
表11.本发明事件的成熟茎秆中Cry1Ac的平均表达量的比较(330DAP)。对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。在Juazeiro-BA的样品收集在220DAP实施。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差)。
Figure BDA0002778249600000501
在330DAP时收集的来自本发明的事件的成熟茎秆的NptII蛋白表达数据显示在表12和图13中(μg/g新鲜和干燥组织)。
表12:本发明事件的成熟茎秆中NptII的平均表达量的比较，对于330DAP。在Juazeiro-BA的样品收集在220DAP实施。对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差)。
Figure BDA0002778249600000502
Figure BDA0002778249600000511
在330DAP时收获的来自事件CTC79005-2的根中Cry1Ac蛋白表达数据显示在表13和图10中(μg/g新鲜组织和干燥组织)。
表13.Cry1Ac蛋白在CTC79005-2事件的根中的平均表达量的比较。对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。在Juazeiro-BA的样品收集在220DAP实施。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差)。
Figure BDA0002778249600000512
在330DAP时收集的本发明事件的根中的NptII蛋白表达数据如表14和和图13所示(μg/g新鲜和干燥组织)。
表14.NptII蛋白在CTC79005-2事件的根中的表达量平均值的比较，对于330DAP。在Juazeiro-BA的样品收集在220DAP实施。对于6个测试地点的个体和合并的统计分析。后随相同字母的均值通过在5％水平(p≤0.05)的t检验没有差异。(SE:标准误差)。
Figure BDA0002778249600000513
所有地点的CTC79005-2事件的茎秆中Cry1Ac蛋白的平均表达量在新鲜组织中为6.35μg/g，在干燥组织中为29.90μg/g。对于NptII，所有地点的CTC79005-2事件中茎秆的平均表达量为新鲜组织的0.01μg/g和干燥组织的0.06μg/g。
所有地点的CTC79005-2事件的根中Cry1Ac蛋白的平均表达量为新鲜组织的2.38μg/g和干燥组织的9.23μg/g。对于NptII，所有地点CTC79005-2事件的根中的平均表达量为新鲜组织的0.01μg/g和干燥组织的0.04μg/g。
叶、茎和根所得到的结果表明，本发明事件的Cry1Ac蛋白表达水平远高于NptII的表达。
在200DAP时，来自本发明事件的叶子的Cry1Ac的平均浓度低于100DAP时的平均浓度(干燥组织)。另外，对于NptII，在200DAP时叶片中平均表达水平低于在分析的其他DAP(100和300DAP)时的平均浓度。
来自CTC79005-2事件的Cry1Ac和NptII蛋白表达水平在330DAP时在叶中的表达水平远高于在茎和根中。Cry1Ac和NptII蛋白的表达数据在茎和根部之间差别并不显著。
因此得出结论，来自本发明的事件的Cry1Ac和NptII蛋白的表达水平在不同的时间、组织和种植地点是特征性的，都有其在巴西种植的代表性。Cry1Ac蛋白的表达水平，特别是在本发明事件的叶片中，在整个栽培周期内保持较高的水平，保证了抗Diatraeasaccharalis的预期效果。
Western blot
为了鉴定本发明事件所表达的异源蛋白，CryAc使用50mg(±0,5mg)在液氮中冷冻的叶片，NptII使用300(±0,5mg)。在TissueLyser设备中，在25Hz下浸渍10分钟，加入3个钢珠(3mm–Qiagen，德国)。对浸渍后的组织，加入500μl补充Tween 20的生理盐水磷酸提取缓冲液(PBS)(0.138M NaCl；0.027mM KCl；0.05％Tween 20,pH 7.4)，按照制造商的说明(EnvirologixTM,美国)稀释。缓冲液加入后，进行旋涡震荡匀浆，并将混合物在4℃下以4,000RPM离心20分钟。收集所得的上清液，并对总蛋白进行定量。对于NptII，蛋白质提取物在继续进行之前被浓缩(
Figure BDA0002778249600000521
Ultra-0.5离心过滤装置(3000NMWL)。
对Cry1Ac和NptII蛋白质的分析所采用的定量根据ThermoScientificTMCoomassiePlus(Bradford)蛋白质检测试剂盒(23236)-微孔板程序和BCA的建议来进行。因此，用于获得校准曲线的标准是上述试剂盒提供的已经稀释的商业BSA(牛血清白蛋白)标准。使用在PBST缓冲液中制备的2000、1000、500、250、125和0μg/ml校准物。将每个标准校准物10μL加入板孔中，一式三份。盖上板子，在室温下孵育5分钟。使用SoftmaxPro 7.0软件(MolecularDevice，美国)在595纳米(nm)处读取吸光度。一旦进行了总蛋白提取，3μg蛋白提取物与2XLaemmli Sample Buffer(Bio-Rad,美国)混合，通过在100℃加热5分钟变性，以鉴定样品中存在Cry1Ac蛋白。在nptII检测和鉴定的情况下，40μg总蛋白提取物与样品缓冲液(2XLaemmli Sample Buffer)混合并变性。
作为异源蛋白存在的阴性对照，从常规亲本品种(WT-RB 92579)中提取3μg蛋白提取物用于CryAc实验，并取40μg用于NptII测定。此外，还准备了阳性对照来检测Cry1Ac和NptII蛋白。第一个阳性对照是用1ng的Cry1Ac(约69kDa，内部生产)或5ng的NptII(约29kDa，Bon Opus Biosciences，美国)，稀释在从常规亲本品种(WT-RB 92579)叶片中提取的总蛋白溶液中制备的。第二种阳性对照是通过在PBST提取缓冲液中稀释1ng纯化的Cry1Ac蛋白或5ng的NptII蛋白。
将样品变性后应用在4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Mini-
Figure BDA0002778249600000531
TGXTMPrecast Gel)上，浸入Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液(Bio-Rad，美国)中，并通过在50V下电泳5分钟，然后在120V下电泳约90分钟而分离。接着，将聚丙烯酰胺凝胶在Tris/甘氨酸转移缓冲液(Bio-Rad，USA)中平衡，加入20％甲醇10-15分钟。PVDF膜用无水甲醇处理。将转移系统安装在装有冷的转移缓冲液的容器中，以在50V的恒定电压下浸泡转移("湿转移")3小时。转移完成后，将膜在4℃下，在不断搅拌下，在封闭液[5％脱脂奶粉(Bio-Rad，美国)和TBS/T(20mM Tris，150mM NaCl，1％Tween20)中封闭16小时，以防止可能的非特异性膜结合。
下一步，用主抗体孵育膜90分钟，以检测和确认Cry1Ac和NptII蛋白的存在和完整性。本测定中使用的多克隆抗体为兔抗-Cry1Ab(Fitzgerald，美国)，可同时结合Cry1Ac和Cry1Ab蛋白；以及兔抗-NptII(#N6537-Sigma Aldrich美国)，可与NptII蛋白反应，在TBS/T以1:1000稀释(v/v)。
在TBS/T中以3次每次5分钟(3x5)循环洗涤膜，并与山羊生产的HRP结合的二级抗兔抗体(Sigma Aldrich,美国)孵育，以1:20,000的浓度或以1:5,000的浓度-v/v(Fitzgerald，美国)孵育60分钟。孵育后，再次用TBS/T洗涤膜(3x5分钟)，根据制造商的说明，在Amersham Hyperfilm ECL X射线胶片(GE Healthcare，USA)上通过Clarit WesternECL Substrate Kit底物反应(Biorad，USA)验证酶联免疫法。X射线胶片对膜的暴露时间从15秒到3分钟不等。
Western blot测定检测到Cry1Ac和NptII蛋白在CTC79005-2事件中的表达(图14)。Cry1Ac蛋白的表达谱表现为两个免疫反应条带，来自近似约66kDa和约69kDa，其通常被称为成对物(doublet)，并被接受为植物叶片中Cry蛋白的细胞内蛋白分解断裂的产物，通常是通过被植物组织处理期间释放的蛋白酶移除末端氨基酸残基而产生的。观察到两条其他的更小的条带，具有约45Kda和32Kda的近似重量，其也被认为是在植物叶片中蛋白水解切割的产物。所有样品(R1-R4)都是从Piracicaba地点的四个实验地块获得的本发明的事件的生物重复。正如预期的那样，阴性对照(WT)没有显示免疫反应性。在亲本品种提取的总蛋白中加入Cry1Ac蛋白的阳性对照(WT+CP)，呈现出同样的两条免疫反应带，来自大约69和66kDa。
nptII选择基因的蛋白质也用Western blot法检测，获得预期大小为29kDa的免疫反应带的存在，在用于本测定的CTC79005-2事件的两个生物重复中(图15)。对应于NptII蛋白的诊断带在稀释于来自亲本品种(RB92579)的蛋白提取物中的阳性对照中也存在。
分子量约150、75和50kDa的免疫反应条带，在包含源自RB92579的蛋白质的所有的样本(事件特异的、阳性对照和阴性对照)中都被观察到，并被认为是用于本测定的抗体溶液与存在于RB 92579品种蛋白谱中的某种蛋白质的非特异免疫反应(图14)。
Western blot测定的结果证实了本发明的事件CT79005-2所表达的蛋白Cry1Ac和NptII的存在与完整性。本发明事件表达的蛋白质具有预期的大小，并且没有发现所述事件表达这些蛋白质的非预期的替代形式的证据。
实施例5.生物学试验：对甘蔗螟虫(D.saccharalis)的敏感性。
使用目标害虫D.saccharalis(甘蔗螟虫)的生物测定(bioassays)也可用于检测和表征事件CTC79005-2，证明表达的杀虫蛋白Cry1Ac提供的对害虫的防治效果。在本发明的范围内可以考虑不同的生物测定法：例如，叶盘测定法、网室生物测定法、组织稀释法，等等。
对于叶盘测定，收集事件CTC79005-2植物的叶子，切成16mm2的圆盘，并分布在含有凝胶琼脂的生物测定板中。从培养板的每个孔中侵染了D.saccharalis(0-24h龄)新生体，并在27±1℃、相对湿度60±10％、光周期12:12h(明：暗)下培养7天。孵化结束后，评价存活个体的幼虫死亡率和对幼虫发育的抑制作用，计算相对功效：
Figure BDA0002778249600000541
将存活的幼虫用Digimizer软件(v 4.6.1)进行图像分析，基于头囊(cephaliccapsule)的宽度评估幼虫阶段。未达到第一龄的幼虫被视为死亡。与评估的转基因事件在遗传上非常相似的非转基因甘蔗品种可以用作测定对照。
为了表征事件在实验室中控制目标害虫D.saccharalis的功效，用CTC79005-2事件(30DAP)的植物组织进行叶盘测定。以非转基因甘蔗RB92579作为对照(CTC79-TC)。实验设计是完全随机的，每个处理有四个重复。当比较常规品种(CT79-TC)和CTC79005-2事件在用叶盘喂养7天后，平均观察到92％的死亡率。这些数据，当通过从常规品种获取的结果均一化(ABBOTT,1925)后，表现出92％的相对有效性(图18)。另外，基于头囊宽度的测量，观察到100％的存活个体没有发育到第1龄期以后，证明在用转基因事件喂养后，D.saccharalis的发育受到高度抑制(图18)。
对于组织稀释测定，在Piracicaba、Valparaíso、Barrinha(SP)和Quirinópolis(GO)的Agro/pheno田中对CTC79005-2事件的叶子取样，取样点在100、200和300DAP时。这些样品被切碎，在冷冻干燥器中脱水，然后浸渍以获得一致的绿色粉末。为了准备生物测定板，每个象限的16个小室接收稀释25X的样品与MS饮食(多物种)，填充每个小室约1毫升。对于侵染，在每个小室中转移入2新生幼虫(0-24h龄)(32毛虫每象限)。在温度27±1℃、相对湿度60±10％和12:12的光周期(光：暗)下鉴定并孵化10天。孵化结束后，评估每个象限的有效死亡率和幼虫的平均质量。有效死亡率按以下公式计算：
Figure BDA0002778249600000551
稀释试验的相对效力使用公式计算:
Figure BDA0002778249600000552
通过对Agropheno田地的组织稀释分析，可以验证事件CTC79005-2的有效性，关于有效死亡率和关于幼虫的质量减少，分别为23％和93％。
对于网室生物测定，将转基因事件的幼苗种植在网室苗圃中，其中将植物种植在与自然环境条件相似的土壤中，但为受控的环境，防止自然侵染的发生。至少进行5次侵染，每分蘖含有20-35个D.saccharalis卵。将所有被感染的茎秆采收并纵向切开，以量化损害，进行评估。侵染强度的计算方法是将有损伤的节间数除以节间总数，结果乘以100(侵染强度)。计算有效损害百分比，考虑昆虫造成损害的节间总数除以地块中评价的总茎数。
进行网室试验，以表征CTC79005-2事件与其亲本品种RB92579(WT；非转基因)相比，在随机块设计中控制螟虫攻击的功效，有4组重复。每个实验地块由8丛甘蔗植株组成，每15天接受10次约30个D.saccharalis卵的人工侵染。8个月后，计算两个品种的侵染强度(II)和有效损害量。相对功效按以下公式计算。
Figure BDA0002778249600000561
在人工侵染下，相比于其非转基因亲本品种RB 92579(对照)，CTC79005-2在控制D.saccharalis侵染方面的相对效力为99.2％，在控制茎秆损伤(长度)方面的相对效力几乎为100％。D.saccharalis对CTC79005-2茎秆造成的损害明显可见地低于常规甘蔗RB92579。在CTC79005-2和非转基因品种RB 92579之间，在所评价的两个参数中都存在统计学差异(t检验，P＜0.05)(df＝16；P＜0.0001)，表明在D.saccharalis大规模侵染下，该事件抑制了害虫造成的损害(图16)。
在甘蔗常规生产上，当侵染强度低于3％时，D.saccharalis被认为是受控制的(Gallo等人，2002)。对于CTC79005-2，侵染强度低于0.2％，加强了事件对其主要目标害虫的控制效果。
除了采用使用人工侵染的生物测定来观察D.saccharalis的侵染程度和造成的损害外，还可以基于直接从种植CTC79005-2的田间收集的信息来观察侵染和损害百分比。例如，可以通过定义实验区域进行茎秆取样切割，并计量节间有损害和无损害的数量来计算侵染强度(II)，而得到自然侵染评价。
在为本发明事件而进行的试验中，计算了四个实验区的侵染强度(II)：Piracicaba、Barrinha和Valparaiso(SP)和Quirinópolis(GO)。常规品种RB 92579(亲本；非转基因)被用作对照。该测定说明了事件CTC79005-2与亲本品种(RB 92579)相比对D.saccharalis侵染的抗性：在所有四个实验区中，与亲本品种(RB 92579)相比，观察到CTC79005-2植物的侵染强度更低(合并分析；图17)。在控制D.saccharalis侵染方面，事件CTC79005-2在所有地点都显示出几乎100％的相对效力，除了Barrinha之外，它显示出99.4％的效力。因此，似乎事件CTC79005-2在控制Diatraea saccharalis上，在4个地点中平均比常规材料更加有效99.8
％(图17)。
在描述了优选实施例之后，应该理解，本发明的范围包括其他可能的变化，并且仅受所附权利要求的内容限制，包括其可能的等同物。
SEQUENCE LISTING
<110> 巴西甘蔗技术中心
<120> 用于检测转基因事件、基因构建体的多核苷酸、引物和方法，从植物样本中检测材料的试剂盒，事件CTC79005-2，抗虫甘蔗植株，以及生产抗虫甘蔗的植株、植物细胞、植物部分或种子的方法
<130> P249050-CN
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含Cry1Ac和nptII基因的转基因构建体
<400> 1
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttagtactga tatcggtacc cggggcggcc gcgagctcga 120
tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt ggcgcgccga tctagtaaca 180
tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg 240
cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca 300
tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca 360
tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat 420
ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga 480
taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac 540
gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga 600
atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca 660
cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg 720
cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag 780
tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa 840
gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt 900
gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt 960
cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc 1020
gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa 1080
ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt 1140
gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc 1200
catcttgttc aatccacatt ctagagtcga cctgcagaag taacaccaaa caacagggtg 1260
agcatcgaca aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg tatgaaggca gggctaaaaa 1320
aatccacata tagctgctgc atatgccatc atccaagtat atcaagatca aaataattat 1380
aaaacatact tgtttattat aatagatagg tactcaaggt tagagcatat gaatagatgc 1440
tgcatatgcc atcatgtata tgcatcagta aaacccacat caacatgtat acctatccta 1500
gatcgatatt tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag atgtatgaca cacacataca 1560
gttccaaaat taataaatac accaggtagt ttgaaacagt attctactcc gatctagaac 1620
gaatgaacga ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca agcgaacaaa aagcatctct 1680
gtatatgcat cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta tcctagatcg atatttccat 1740
ccatcatctt caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca cacatacaga tccaaaatta 1800
ataaatccac caggtagttt gaaacagaat tctactccga tctagaacga ccgcccaacc 1860
agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa agatgacccg acaaacaagt 1920
gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa ccctatgcaa cgaaacaaaa 1980
aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc catcccagga ttccccaaag 2040
agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt acaggtcgca tccgtgtacg 2100
aacgctagca gcacggatct aacacaaaca cggatctaac acaaacatga acagaagtag 2160
aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag agaaggtaga gagggggggg 2220
gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga cgggtggatt tgggggagat 2280
ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg ggaaagaggg tgtggagggg 2340
gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc 2400
cccgtagctg ccgtgccgtg agaggaggag gaggccgcct gccgtgccgg ctcacgtctg 2460
ccgctccgcc acgcaatttc tggatgccga cagcggagca agtccaacgg tggagcggaa 2520
ctctcgagag gggtccagag gcagcgacag agatgccgtg ccgtctgctt cgcttggccc 2580
gacgcgacgc tgctggttcg ctggttggtg tccgttagac tcgtcgacgg cgtttaacag 2640
gctggcatta tctactcgaa acaagaaaaa tgtttcctta gtttttttaa tttcttaaag 2700
ggtatttgtt taatttttag tcactttatt ttattctatt ttatatctaa attattaaat 2760
aaaaaaacta aaatagagtt ttagttttct taatttagag gctaaaatag aataaaatag 2820
atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta aaccctaaat ggatgtacta 2880
ataaaatgga tgaagtatta tataggtgaa gctatttgca aaaaaaaagg agaacacatg 2940
cacactaaaa agataaaact gtagagtcct gttgtcaaaa tactcaattg tcctttagac 3000
catgtctaac tgttcattta tatgattctc taaaacactg atattattgt agtactatag 3060
attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa agatagataa actgcacttc 3120
aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata acttagacat gcaatgctca 3180
ttatctctag agaggggcac gaccgggtca cgctgcactg caggcatacg cgtgatccac 3240
tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattcg cccttggcgc gccgatctag taacatagat 3300
gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat 3360
taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat 3420
tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca 3480
agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatctcac 3540
tcagcctcga gggtggcggt cactgggatg aactcgaacc tgtcgatgat cacgccggcg 3600
gtgccgctga agttcctcac gcccacgatg ttaccgaggg aggaggtgaa agcgttggcg 3660
ctctcgaagt aaccgaagtc gctggattgg aggttgtcca gggaggtagc ggtagctggc 3720
acggtgttgg agaagatgga ggagttaccc cagttcacgt tgaggtggat cggggtcacg 3780
gaagcgtacc tcacgcgcac cctgtacctg gtggaggtgg atgggaagtg gattggcacc 3840
tcgatgtagc ccctgttctg gatgttgttg ccgctgctgt tgagcctcac gaggtcgcca 3900
ccggtgaagc ctgggccgga aatgacggaa ccgttgaaga ggaagttgcc cttcacggcc 3960
gggatttggg tgatgctgtc ggaggcgatg atgttgttga actcagcgct gcggtggatc 4020
caggagaaca tcggagccct gatgatgctc acggagctgt tgctgaagcc ggagcggaac 4080
atggacacgt ggctcagcct gtgggagaag ccttgcctgg gtggcacgtt gttgttctgt 4140
ggtgggatct cgtccaggga gtccacggtg ccgctcttcc tgtagacagc ggatggcagg 4200
ttggaggagg tgccgtaggc gaactcggtg ccgtcgagca cggacagttg ctggttgttg 4260
ataccgatgt tgaagggcct cctgtacagg gtggaggaca gggtcctgta gacaccctga 4320
cccagttgag ccacgatgcg ttgctgtgga gcggcgttgc ccatggtgcc gtagagcggg 4380
aaggtgaact cggggccgct gaagcccact ggggaggcca tgatctggtg gccggaccag 4440
tagtactcgc ccctgtgagc gtcggtgtag atggtgatgc tgttcaggat gtccatcagg 4500
tgtgggctcc tgatggagcc ctcgataccc tgggcggaac cgcggaagct accgtcgaag 4560
ttctccagca ctgggttggt gtagatctcc ctggtgagtt gggacacggt gcggatcggg 4620
taggtcctgg agtcgtagtt cgggaagagg gacacaatgt ccagcacggt gagggtcaac 4680
tccctcctga actggttgta cctgatccag tccctggagt ccggacccca gacgcgctcc 4740
aggccggtgt tgtaccagcg cacagcgtgg tcggtgtagt tgccaatcag cctggtcagg 4800
tcgttgtagc ggctgttgat ggtggcagca tcgaagcccc acctttggcc gaacacgctc 4860
acgtcgcgca gcacgctgag gtgcaggtta gcggcttgca cgtacacgga caggagcggc 4920
acttggtagt tctggacggc gaacagtggg atagcggtgg tcagggcgct gttcatgtcg 4980
ttgaattgaa tgcgcatttc ctcgcggaga gctgggttgg tcgggtcggc ctcccactcc 5040
ctgaagctct cggcgtagat ttggtagagg ttgctcaggc cctccagcct ggagatggcc 5100
tggttcctgg cgaactcttc gatcctctgg ttgatcagct gctcgatttg caccaggaag 5160
gcgtcccatt gggatggacc gaagataccc cagatgatgt ccaccaggcc gagcacgaag 5220
ccagcacctg gcacgaactc gctgagcagg aactgggtca aggacaggga gatgtcgatg 5280
ggggtgtaac cggtctcgat gcgctcgcca cccagcacct ccacctctgg gttgctcagg 5340
cagttgtatg ggatgcactc gttgatgttt gggttgttgt ccattctaga gtcgacctgc 5400
agaagtaaca ccaaacaaca gggtgagcat cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa 5460
tagcgtatga aggcagggct aaaaaaatcc acatatagct gctgcatatg ccatcatcca 5520
agtatatcaa gatcaaaata attataaaac atacttgttt attataatag ataggtactc 5580
aaggttagag catatgaata gatgctgcat atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc 5640
cacatcaaca tgtataccta tcctagatcg atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta 5700
tgaagatgta tgacacacac atacagttcc aaaattaata aatacaccag gtagtttgaa 5760
acagtattct actccgatct agaacgaatg aacgaccgcc caaccacacc acatcatcac 5820
aaccaagcga acaaaaagca tctctgtata tgcatcagta aaacccgcat caacatgtat 5880
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gcacacacat acagatccaa aattaataaa tccaccaggt agtttgaaac agaattctac 6000
tccgatctag aacgaccgcc caaccagacc acatcatcac aaccaagaca aaaaaaagca 6060
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ccaaacccta tgcaacgaaa caaaaaaaat catgaaatcg atcccgtctg cggaacggct 6180
agagccatcc caggattccc caaagagaaa cactggcaag ttagcaatca gaacgtgtct 6240
gacgtacagg tcgcatccgt gtacgaacgc tagcagcacg gatctaacac aaacacggat 6300
ctaacacaaa catgaacaga agtagaacta ccgggcccta accatggacc ggaacgccga 6360
tctagagaag gtagagaggg gggggggggg aggacgagcg gcgtaccttg aagcggaggt 6420
gccgacgggt ggatttgggg gagatctggt tgtgtgtgtg tgcgctccga acaacacgag 6480
gttggggaaa gagggtgtgg agggggtgtc tatttattac ggcgggcgag gaagggaaag 6540
cgaaggagcg gtgggaaagg aatcccccgt agctgccgtg ccgtgagagg aggaggaggc 6600
cgcctgccgt gccggctcac gtctgccgct ccgccacgca atttctggat gccgacagcg 6660
gagcaagtcc aacggtggag cggaactctc gagaggggtc cagaggcagc gacagagatg 6720
ccgtgccgtc tgcttcgctt ggcccgacgc gacgctgctg gttcgctggt tggtgtccgt 6780
tagactcgtc gacggcgttt aacaggctgg cattatctac tcgaaacaag aaaaatgttt 6840
ccttagtttt tttaatttct taaagggtat ttgtttaatt tttagtcact ttattttatt 6900
ctattttata tctaaattat taaataaaaa aactaaaata gagttttagt tttcttaatt 6960
tagaggctaa aatagaataa aatagatgta ctaaaaaaat tagtctataa aaaccattaa 7020
ccctaaaccc taaatggatg tactaataaa atggatgaag tattatatag gtgaagctat 7080
ttgcaaaaaa aaaggagaac acatgcacac taaaaagata aaactgtaga gtcctgttgt 7140
caaaatactc aattgtcctt tagaccatgt ctaactgttc atttatatga ttctctaaaa 7200
cactgatatt attgtagtac tatagattat attattcgta gagtaaagtt taaatatatg 7260
tataaagata gataaactgc acttcaaaca agtgtgacaa aaaaaatatg tggtaatttt 7320
ttataactta gacatgcaat gctcattatc tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg 7380
cactgcaggc atcgatcgaa gcttacgcgt ccatggctgc aggagctcgt cgactctaga 7440
ctcgagggcg cgccgacagg atatattggc gggtaaacc 7479
<210> 2
<211> 7382
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC79005的T-DNA片段
<400> 2
ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat 60
gtactgaatt agtactgata tcggtacccg gggcggccgc gagctcgatc cactagtaac 120
ggccgccagt gtgctggaat tcgcccttgg cgcgccgatc tagtaacata gatgacaccg 180
cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt 240
ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt 300
taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg 360
caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatct cagaagaact 420
cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 480
cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 540
ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 600
ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct 660
cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 720
gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 780
cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 840
gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 900
gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 960
cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 1020
cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 1080
gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 1140
agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 1200
tccacattct agagtcgacc tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa 1260
agaaacagta ccaagcaaat aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata 1320
gctgctgcat atgccatcat ccaagtatat caagatcaaa ataattataa aacatacttg 1380
tttattataa tagataggta ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat 1440
catgtatatg catcagtaaa acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc 1500
catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta 1560
ataaatacac caggtagttt gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc 1620
gcccaaccac accacatcat cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca 1680
gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcatcttca 1740
attcgtaact atgaatatgt atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca 1800
ggtagtttga aacagaattc tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag accacatcat 1860
cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc acggcatata 1920
ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa 1980
tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc 2040
aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc 2100
acggatctaa cacaaacacg gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc 2160
ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag aaggtagaga gggggggggg gggaggacga 2220
gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg ggtggatttg ggggagatct ggttgtgtgt 2280
gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg aaagagggtg tggagggggt gtctatttat 2340
tacggcgggc gaggaaggga aagcgaagga gcggtgggaa aggaatcccc cgtagctgcc 2400
gtgccgtgag aggaggagga ggccgcctgc cgtgccggct cacgtctgcc gctccgccac 2460
gcaatttctg gatgccgaca gcggagcaag tccaacggtg gagcggaact ctcgagaggg 2520
gtccagaggc agcgacagag atgccgtgcc gtctgcttcg cttggcccga cgcgacgctg 2580
ctggttcgct ggttggtgtc cgttagactc gtcgacggcg tttaacaggc tggcattatc 2640
tactcgaaac aagaaaaatg tttccttagt ttttttaatt tcttaaaggg tatttgttta 2700
atttttagtc actttatttt attctatttt atatctaaat tattaaataa aaaaactaaa 2760
atagagtttt agttttctta atttagaggc taaaatagaa taaaatagat gtactaaaaa 2820
aattagtcta taaaaaccat taaccctaaa ccctaaatgg atgtactaat aaaatggatg 2880
aagtattata taggtgaagc tatttgcaaa aaaaaaggag aacacatgca cactaaaaag 2940
ataaaactgt agagtcctgt tgtcaaaata ctcaattgtc ctttagacca tgtctaactg 3000
ttcatttata tgattctcta aaacactgat attattgtag tactatagat tatattattc 3060
gtagagtaaa gtttaaatat atgtataaag atagataaac tgcacttcaa acaagtgtga 3120
caaaaaaaat atgtggtaat tttttataac ttagacatgc aatgctcatt atctctagag 3180
aggggcacga ccgggtcacg ctgcactgca ggcatacgcg tgatccacta gtaacggccg 3240
ccagtgtgct ggaattcgcc cttggcgcgc cgatctagta acatagatga caccgcgcgc 3300
gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat 3360
tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta catgttaatt 3420
attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca 3480
ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatctcactc agcctcgagg 3540
gtggcggtca ctgggatgaa ctcgaacctg tcgatgatca cgccggcggt gccgctgaag 3600
ttcctcacgc ccacgatgtt accgagggag gaggtgaaag cgttggcgct ctcgaagtaa 3660
ccgaagtcgc tggattggag gttgtccagg gaggtagcgg tagctggcac ggtgttggag 3720
aagatggagg agttacccca gttcacgttg aggtggatcg gggtcacgga agcgtacctc 3780
acgcgcaccc tgtacctggt ggaggtggat gggaagtgga ttggcacctc gatgtagccc 3840
ctgttctgga tgttgttgcc gctgctgttg agcctcacga ggtcgccacc ggtgaagcct 3900
gggccggaaa tgacggaacc gttgaagagg aagttgccct tcacggccgg gatttgggtg 3960
atgctgtcgg aggcgatgat gttgttgaac tcagcgctgc ggtggatcca ggagaacatc 4020
ggagccctga tgatgctcac ggagctgttg ctgaagccgg agcggaacat ggacacgtgg 4080
ctcagcctgt gggagaagcc ttgcctgggt ggcacgttgt tgttctgtgg tgggatctcg 4140
tccagggagt ccacggtgcc gctcttcctg tagacagcgg atggcaggtt ggaggaggtg 4200
ccgtaggcga actcggtgcc gtcgagcacg gacagttgct ggttgttgat accgatgttg 4260
aagggcctcc tgtacagggt ggaggacagg gtcctgtaga caccctgacc cagttgagcc 4320
acgatgcgtt gctgtggagc ggcgttgccc atggtgccgt agagcgggaa ggtgaactcg 4380
gggccgctga agcccactgg ggaggccatg atctggtggc cggaccagta gtactcgccc 4440
ctgtgagcgt cggtgtagat ggtgatgctg ttcaggatgt ccatcaggtg tgggctcctg 4500
atggagccct cgataccctg ggcggaaccg cggaagctac cgtcgaagtt ctccagcact 4560
gggttggtgt agatctccct ggtgagttgg gacacggtgc ggatcgggta ggtcctggag 4620
tcgtagttcg ggaagaggga cacaatgtcc agcacggtga gggtcaactc cctcctgaac 4680
tggttgtacc tgatccagtc cctggagtcc ggaccccaga cgcgctccag gccggtgttg 4740
taccagcgca cagcgtggtc ggtgtagttg ccaatcagcc tggtcaggtc gttgtagcgg 4800
ctgttgatgg tggcagcatc gaagccccac ctttggccga acacgctcac gtcgcgcagc 4860
acgctgaggt gcaggttagc ggcttgcacg tacacggaca ggagcggcac ttggtagttc 4920
tggacggcga acagtgggat agcggtggtc agggcgctgt tcatgtcgtt gaattgaatg 4980
cgcatttcct cgcggagagc tgggttggtc gggtcggcct cccactccct gaagctctcg 5040
gcgtagattt ggtagaggtt gctcaggccc tccagcctgg agatggcctg gttcctggcg 5100
aactcttcga tcctctggtt gatcagctgc tcgatttgca ccaggaaggc gtcccattgg 5160
gatggaccga agatacccca gatgatgtcc accaggccga gcacgaagcc agcacctggc 5220
acgaactcgc tgagcaggaa ctgggtcaag gacagggaga tgtcgatggg ggtgtaaccg 5280
gtctcgatgc gctcgccacc cagcacctcc acctctgggt tgctcaggca gttgtatggg 5340
atgcactcgt tgatgtttgg gttgttgtcc attctagagt cgacctgcag aagtaacacc 5400
aaacaacagg gtgagcatcg acaaaagtgc tgcatatgcc atcatccaag tatatcaaga 5460
tcaaaataat tataaaacat acttgtttat tataatagat aggtactcaa ggttagagca 5520
tatgaataga tgctgcatat gccatcatgt atatgcatca gtaaaaccca catcaacatg 5580
tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcttaaact cgtaactatg aagatgtatg 5640
acacacacat acagttccaa aattaataaa tacaccaggt agtttgaaac agtattctac 5700
tccgatctag aacgaatgaa cgaccgccca accacaccac atcatcacaa ccaagcgaac 5760
aaaaagcatc tctgtatatg catcagtaaa acccgcatca acatgtatac ctatcctaga 5820
tcgatatttc catccatcat cttcaattcg taactatgaa tatgtatggc acacacatac 5880
agatccaaaa ttaataaatc caccaggtag tttgaaacag aattctactc cgatctagaa 5940
cgaccgccca accagaccac atcatcacaa ccaagacaaa aaaaagcatg aaaagatgac 6000
ccgacaaaca agtgcacggc atatattgaa ataaaggaaa agggcaaacc aaaccctatg 6060
caacgaaaca aaaaaaatca tgaaatcgat cccgtctgcg gaacggctag agccatccca 6120
ggattcccca aagagaaaca ctggcaagtt agcaatcaga acgtgtctga cgtacaggtc 6180
gcatccgtgt acgaacgcta gcagcacgga tctaacacaa acacggatct aacacaaaca 6240
tgaacagaag tagaactacc gggccctaac catggaccgg aacgccgatc tagagaaggt 6300
agagaggggg ggggggggag gacgagcggc gtaccttgaa gcggaggtgc cgacgggtgg 6360
atttggggga gatctggttg tgtgtgtgtg cgctccgaac aacacgaggt tggggaaaga 6420
gggtgtggag ggggtgtcta tttattacgg cgggcgagga agggaaagcg aaggagcggt 6480
gggaaaggaa tcccccgtag ctgccgtgcc gtgagaggag gaggaggccg cctgccgtgc 6540
cggctcacgt ctgccgctcc gccacgcaat ttctggatgc cgacagcgga gcaagtccaa 6600
cggtggagcg gaactctcga gaggggtcca gaggcagcga cagagatgcc gtgccgtctg 6660
cttcgcttgg cccgacgcga cgctgctggt tcgctggttg gtgtccgtta gactcgtcga 6720
cggcgtttaa caggctggca ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc ttagtttttt 6780
taatttctta aagggtattt gtttaatttt tagtcacttt attttattct attttatatc 6840
taaattatta aataaaaaaa ctaaaataga gttttagttt tcttaattta gaggctaaaa 6900
tagaataaaa tagatgtact aaaaaaatta gtctataaaa accattaacc ctaaacccta 6960
aatggatgta ctaataaaat ggatgaagta ttatataggt gaagctattt gcaaaaaaaa 7020
aggagaacac atgcacacta aaaagataaa actgtagagt cctgttgtca aaatactcaa 7080
ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt ctctaaaaca ctgatattat 7140
tgtagtacta tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta taaagataga 7200
taaactgcac ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt ataacttaga 7260
catgcaatgc tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca ctgcaggcat 7320
cgatcgaagc ttacgcgtcc atggctgcag gagctcgtcg actctagact cgagggcgag 7380
cc 7382
<210> 3
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC79005的甘蔗基因组和插入部分的5'区域之间的接合核苷酸序列
<400> 3
ggagaggcga agccctaggc cggcgctgtc gccacgccag gatcggtcgc ccaggttgac 60
gtgactgggt tgcctgcgct gaacctaata acacattgct gggttgtggt gtaaacaaat 120
tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga attagtactg 180
atatcggtac ccggggcggc cgcgag 206
<210> 4
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC79005的甘蔗基因组和插入部分的3'区域之间的接合核苷酸序列
<400> 4
ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc actgcaggca tcgatcgaag cttacgcgtc 60
catggctgca ggagctcgtc gactctagac tcgagggcga gccccgagcg ggggcagctg 120
aggcgccatt gggaggagga agagggcagc gctccggggc ggaagtcgtg gggcggcacg 180
agggaagggc acacgacgga cggacg 206
<210> 5
<211> 7588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC79005: 侧翼序列和T-DNA
<400> 5
ggagaggcga agccctaggc cggcgctgtc gccacgccag gatcggtcgc ccaggttgac 60
gtgactgggt tgcctgcgct gaacctaata acacattgct gggttgtggt gtaaacaaat 120
tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga attagtactg 180
atatcggtac ccggggcggc cgcgagctcg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg 240
aattcgccct tggcgcgccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc 300
tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta 360
atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta 420
acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt 480
aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag 540
aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc 600
cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg 660
tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg 720
atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc 780
gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca 840
tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct 900
tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc 960
atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact 1020
tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa 1080
ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg 1140
gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac 1200
acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc 1260
acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatccacat tctagagtcg 1320
acctgcagaa gtaacaccaa acaacagggt gagcatcgac aaaagaaaca gtaccaagca 1380
aataaatagc gtatgaaggc agggctaaaa aaatccacat atagctgctg catatgccat 1440
catccaagta tatcaagatc aaaataatta taaaacatac ttgtttatta taatagatag 1500
gtactcaagg ttagagcata tgaatagatg ctgcatatgc catcatgtat atgcatcagt 1560
aaaacccaca tcaacatgta tacctatcct agatcgatat ttccatccat cttaaactcg 1620
taactatgaa gatgtatgac acacacatac agttccaaaa ttaataaata caccaggtag 1680
tttgaaacag tattctactc cgatctagaa cgaatgaacg accgcccaac cacaccacat 1740
catcacaacc aagcgaacaa aaagcatctc tgtatatgca tcagtaaaac ccgcatcaac 1800
atgtatacct atcctagatc gatatttcca tccatcatct tcaattcgta actatgaata 1860
tgtatggcac acacatacag atccaaaatt aataaatcca ccaggtagtt tgaaacagaa 1920
ttctactccg atctagaacg accgcccaac cagaccacat catcacaacc aagacaaaaa 1980
aaagcatgaa aagatgaccc gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat aaaggaaaag 2040
ggcaaaccaa accctatgca acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc cgtctgcgga 2100
acggctagag ccatcccagg attccccaaa gagaaacact ggcaagttag caatcagaac 2160
gtgtctgacg tacaggtcgc atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc taacacaaac 2220
acggatctaa cacaaacatg aacagaagta gaactaccgg gccctaacca tggaccggaa 2280
cgccgatcta gagaaggtag agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt accttgaagc 2340
ggaggtgccg acgggtggat ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg ctccgaacaa 2400
cacgaggttg gggaaagagg gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg ggcgaggaag 2460
ggaaagcgaa ggagcggtgg gaaaggaatc ccccgtagct gccgtgccgt gagaggagga 2520
ggaggccgcc tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg 2580
acagcggagc aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca 2640
gagatgccgt gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt 2700
gtccgttaga ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa 2760
atgtttcctt agttttttta atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat 2820
tttattctat tttatatcta aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc 2880
ttaatttaga ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt ctataaaaac 2940
cattaaccct aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga 3000
agctatttgc aaaaaaaaag gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc 3060
tgttgtcaaa atactcaatt gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct 3120
ctaaaacact gatattattg tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa 3180
tatatgtata aagatagata aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt 3240
aattttttat aacttagaca tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc 3300
acgctgcact gcaggcatac gcgtgatcca ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc 3360
gcccttggcg cgccgatcta gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt 3420
tgcgcgctat attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat 3480
aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta 3540
attcaacaga aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa 3600
actttattgc caaatgtttg aacgatctca ctcagcctcg agggtggcgg tcactgggat 3660
gaactcgaac ctgtcgatga tcacgccggc ggtgccgctg aagttcctca cgcccacgat 3720
gttaccgagg gaggaggtga aagcgttggc gctctcgaag taaccgaagt cgctggattg 3780
gaggttgtcc agggaggtag cggtagctgg cacggtgttg gagaagatgg aggagttacc 3840
ccagttcacg ttgaggtgga tcggggtcac ggaagcgtac ctcacgcgca ccctgtacct 3900
ggtggaggtg gatgggaagt ggattggcac ctcgatgtag cccctgttct ggatgttgtt 3960
gccgctgctg ttgagcctca cgaggtcgcc accggtgaag cctgggccgg aaatgacgga 4020
accgttgaag aggaagttgc ccttcacggc cgggatttgg gtgatgctgt cggaggcgat 4080
gatgttgttg aactcagcgc tgcggtggat ccaggagaac atcggagccc tgatgatgct 4140
cacggagctg ttgctgaagc cggagcggaa catggacacg tggctcagcc tgtgggagaa 4200
gccttgcctg ggtggcacgt tgttgttctg tggtgggatc tcgtccaggg agtccacggt 4260
gccgctcttc ctgtagacag cggatggcag gttggaggag gtgccgtagg cgaactcggt 4320
gccgtcgagc acggacagtt gctggttgtt gataccgatg ttgaagggcc tcctgtacag 4380
ggtggaggac agggtcctgt agacaccctg acccagttga gccacgatgc gttgctgtgg 4440
agcggcgttg cccatggtgc cgtagagcgg gaaggtgaac tcggggccgc tgaagcccac 4500
tggggaggcc atgatctggt ggccggacca gtagtactcg cccctgtgag cgtcggtgta 4560
gatggtgatg ctgttcagga tgtccatcag gtgtgggctc ctgatggagc cctcgatacc 4620
ctgggcggaa ccgcggaagc taccgtcgaa gttctccagc actgggttgg tgtagatctc 4680
cctggtgagt tgggacacgg tgcggatcgg gtaggtcctg gagtcgtagt tcgggaagag 4740
ggacacaatg tccagcacgg tgagggtcaa ctccctcctg aactggttgt acctgatcca 4800
gtccctggag tccggacccc agacgcgctc caggccggtg ttgtaccagc gcacagcgtg 4860
gtcggtgtag ttgccaatca gcctggtcag gtcgttgtag cggctgttga tggtggcagc 4920
atcgaagccc cacctttggc cgaacacgct cacgtcgcgc agcacgctga ggtgcaggtt 4980
agcggcttgc acgtacacgg acaggagcgg cacttggtag ttctggacgg cgaacagtgg 5040
gatagcggtg gtcagggcgc tgttcatgtc gttgaattga atgcgcattt cctcgcggag 5100
agctgggttg gtcgggtcgg cctcccactc cctgaagctc tcggcgtaga tttggtagag 5160
gttgctcagg ccctccagcc tggagatggc ctggttcctg gcgaactctt cgatcctctg 5220
gttgatcagc tgctcgattt gcaccaggaa ggcgtcccat tgggatggac cgaagatacc 5280
ccagatgatg tccaccaggc cgagcacgaa gccagcacct ggcacgaact cgctgagcag 5340
gaactgggtc aaggacaggg agatgtcgat gggggtgtaa ccggtctcga tgcgctcgcc 5400
acccagcacc tccacctctg ggttgctcag gcagttgtat gggatgcact cgttgatgtt 5460
tgggttgttg tccattctag agtcgacctg cagaagtaac accaaacaac agggtgagca 5520
tcgacaaaag tgctgcatat gccatcatcc aagtatatca agatcaaaat aattataaaa 5580
catacttgtt tattataata gataggtact caaggttaga gcatatgaat agatgctgca 5640
tatgccatca tgtatatgca tcagtaaaac ccacatcaac atgtatacct atcctagatc 5700
gatatttcca tccatcttaa actcgtaact atgaagatgt atgacacaca catacagttc 5760
caaaattaat aaatacacca ggtagtttga aacagtattc tactccgatc tagaacgaat 5820
gaacgaccgc ccaaccacac cacatcatca caaccaagcg aacaaaaagc atctctgtat 5880
atgcatcagt aaaacccgca tcaacatgta tacctatcct agatcgatat ttccatccat 5940
catcttcaat tcgtaactat gaatatgtat ggcacacaca tacagatcca aaattaataa 6000
atccaccagg tagtttgaaa cagaattcta ctccgatcta gaacgaccgc ccaaccagac 6060
cacatcatca caaccaagac aaaaaaaagc atgaaaagat gacccgacaa acaagtgcac 6120
ggcatatatt gaaataaagg aaaagggcaa accaaaccct atgcaacgaa acaaaaaaaa 6180
tcatgaaatc gatcccgtct gcggaacggc tagagccatc ccaggattcc ccaaagagaa 6240
acactggcaa gttagcaatc agaacgtgtc tgacgtacag gtcgcatccg tgtacgaacg 6300
ctagcagcac ggatctaaca caaacacgga tctaacacaa acatgaacag aagtagaact 6360
accgggccct aaccatggac cggaacgccg atctagagaa ggtagagagg gggggggggg 6420
gaggacgagc ggcgtacctt gaagcggagg tgccgacggg tggatttggg ggagatctgg 6480
ttgtgtgtgt gtgcgctccg aacaacacga ggttggggaa agagggtgtg gagggggtgt 6540
ctatttatta cggcgggcga ggaagggaaa gcgaaggagc ggtgggaaag gaatcccccg 6600
tagctgccgt gccgtgagag gaggaggagg ccgcctgccg tgccggctca cgtctgccgc 6660
tccgccacgc aatttctgga tgccgacagc ggagcaagtc caacggtgga gcggaactct 6720
cgagaggggt ccagaggcag cgacagagat gccgtgccgt ctgcttcgct tggcccgacg 6780
cgacgctgct ggttcgctgg ttggtgtccg ttagactcgt cgacggcgtt taacaggctg 6840
gcattatcta ctcgaaacaa gaaaaatgtt tccttagttt ttttaatttc ttaaagggta 6900
tttgtttaat ttttagtcac tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa 6960
aaactaaaat agagttttag ttttcttaat ttagaggcta aaatagaata aaatagatgt 7020
actaaaaaaa ttagtctata aaaaccatta accctaaacc ctaaatggat gtactaataa 7080
aatggatgaa gtattatata ggtgaagcta tttgcaaaaa aaaaggagaa cacatgcaca 7140
ctaaaaagat aaaactgtag agtcctgttg tcaaaatact caattgtcct ttagaccatg 7200
tctaactgtt catttatatg attctctaaa acactgatat tattgtagta ctatagatta 7260
tattattcgt agagtaaagt ttaaatatat gtataaagat agataaactg cacttcaaac 7320
aagtgtgaca aaaaaaatat gtggtaattt tttataactt agacatgcaa tgctcattat 7380
ctctagagag gggcacgacc gggtcacgct gcactgcagg catcgatcga agcttacgcg 7440
tccatggctg caggagctcg tcgactctag actcgagggc gagccccgag cgggggcagc 7500
tgaggcgcca ttgggaggag gaagagggca gcgctccggg gcggaagtcg tggggcggca 7560
cgagggaagg gcacacgacg gacggacg 7588
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物(右侧边界)
<400> 6
caggagctcg tcgactctag act 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物(右侧边界)
<400> 7
gtgtgccctt ccctcgtg 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物(左侧边界)
<400> 8
caggttgacg tgactgggtt g 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物(左侧边界)
<400> 9
cgtccgcaat gtgttattaa gttg 24
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针(右侧边界)
<400> 10
cattgggagg aggaaga 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针(左侧边界)
<400> 11
tggtgtaaac aaattgacgc 20
<210> 12
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC79005扩增子(右侧边界)
<400> 12
caggagctcg tcgactctag actcgagggc gagccccgag cgggggcagc tgaggcgcca 60
ttgggaggag gaagagggca gcgctccggg gcggaagtcg tggggcggca cgagggaagg 120
gcacac 126
<210> 13
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 事件CTC79005扩增子(左侧边界)
<400> 13
caggttgacg tgactgggtt gcctgcgctg aacctaataa cacattgctg ggttgtggtg 60
taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacg 104
<210> 14
<211> 13723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含cry1Ac和nptII基因的二元质粒
<400> 14
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttagtactga tatcggtacc cggggcggcc gcgagctcga 120
tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt ggcgcgccga tctagtaaca 180
tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg 240
cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca 300
tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca 360
tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat 420
ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga 480
taccgtaaac acattgctgg gaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc cgccaagctc 540
ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca cacccagccg 600
gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg gcaagcaggc 660
atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg cgcgccttga gcctggcgaa 720
cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat cgacaagacc 780
ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt cgaatgggca 840
ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg atactttctc 900
ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc acttcgccca atagcagcca 960
gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc ccgtcgtggc 1020
cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc agggcaccgg acaggtcggt 1080
cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg catcagagca 1140
gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag cggccggaga 1200
acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcca cattctagag tcgacctgca gaagtaacac 1260
caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat agcgtatgaa 1320
ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa gtatatcaag 1380
atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca aggttagagc 1440
atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc acatcaacat 1500
gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat gaagatgtat 1560
gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa cagtattcta 1620
ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca accaagcgaa 1680
caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata cctatcctag 1740
atcgatattt ccatccatca tcttcaattc gtaactatga atatgtatgg cacacacata 1800
cagatccaaa attaataaat ccaccaggta gtttgaaaca gaattctact ccgatctaga 1860
acgaccgccc aaccagacca catcatcaca accaagacaa aaaaaagcat gaaaagatga 1920
cccgacaaac aagtgcacgg catatattga aataaaggaa aagggcaaac caaaccctat 1980
gcaacgaaac aaaaaaaatc atgaaatcga tcccgtctgc ggaacggcta gagccatccc 2040
aggattcccc aaagagaaac actggcaagt tagcaatcag aacgtgtctg acgtacaggt 2100
cgcatccgtg tacgaacgct agcagcacgg atctaacaca aacacggatc taacacaaac 2160
atgaacagaa gtagaactac cgggccctaa ccatggaccg gaacgccgat ctagagaagg 2220
tagagagggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg ccgacgggtg 2280
gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg ttggggaaag 2340
agggtgtgga gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc gaaggagcgg 2400
tgggaaagga atcccccgta gctgccgtgc cgtgagagga ggaggaggcc gcctgccgtg 2460
ccggctcacg tctgccgctc cgccacgcaa tttctggatg ccgacagcgg agcaagtcca 2520
acggtggagc ggaactctcg agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc cgtgccgtct 2580
gcttcgcttg gcccgacgcg acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt agactcgtcg 2640
acggcgttta acaggctggc attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc cttagttttt 2700
ttaatttctt aaagggtatt tgtttaattt ttagtcactt tattttattc tattttatat 2760
ctaaattatt aaataaaaaa actaaaatag agttttagtt ttcttaattt agaggctaaa 2820
atagaataaa atagatgtac taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac cctaaaccct 2880
aaatggatgt actaataaaa tggatgaagt attatatagg tgaagctatt tgcaaaaaaa 2940
aaggagaaca catgcacact aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc aaaatactca 3000
attgtccttt agaccatgtc taactgttca tttatatgat tctctaaaac actgatatta 3060
ttgtagtact atagattata ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt ataaagatag 3120
ataaactgca cttcaaacaa gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt tataacttag 3180
acatgcaatg ctcattatct ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc actgcaggca 3240
tacgcgtgat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcgcccttg gcgcgccgat 3300
ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta gtttgcgcgc tatattttgt 3360
tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat cataaaaacc catctcataa 3420
ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac gtaattcaac agaaattata 3480
tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa gaaactttat tgccaaatgt 3540
ttgaacgatc tcactcagcc tcgagggtgg cggtcactgg gatgaactcg aacctgtcga 3600
tgatcacgcc ggcggtgccg ctgaagttcc tcacgcccac gatgttaccg agggaggagg 3660
tgaaagcgtt ggcgctctcg aagtaaccga agtcgctgga ttggaggttg tccagggagg 3720
tagcggtagc tggcacggtg ttggagaaga tggaggagtt accccagttc acgttgaggt 3780
ggatcggggt cacggaagcg tacctcacgc gcaccctgta cctggtggag gtggatggga 3840
agtggattgg cacctcgatg tagcccctgt tctggatgtt gttgccgctg ctgttgagcc 3900
tcacgaggtc gccaccggtg aagcctgggc cggaaatgac ggaaccgttg aagaggaagt 3960
tgcccttcac ggccgggatt tgggtgatgc tgtcggaggc gatgatgttg ttgaactcag 4020
cgctgcggtg gatccaggag aacatcggag ccctgatgat gctcacggag ctgttgctga 4080
agccggagcg gaacatggac acgtggctca gcctgtggga gaagccttgc ctgggtggca 4140
cgttgttgtt ctgtggtggg atctcgtcca gggagtccac ggtgccgctc ttcctgtaga 4200
cagcggatgg caggttggag gaggtgccgt aggcgaactc ggtgccgtcg agcacggaca 4260
gttgctggtt gttgataccg atgttgaagg gcctcctgta cagggtggag gacagggtcc 4320
tgtagacacc ctgacccagt tgagccacga tgcgttgctg tggagcggcg ttgcccatgg 4380
tgccgtagag cgggaaggtg aactcggggc cgctgaagcc cactggggag gccatgatct 4440
ggtggccgga ccagtagtac tcgcccctgt gagcgtcggt gtagatggtg atgctgttca 4500
ggatgtccat caggtgtggg ctcctgatgg agccctcgat accctgggcg gaaccgcgga 4560
agctaccgtc gaagttctcc agcactgggt tggtgtagat ctccctggtg agttgggaca 4620
cggtgcggat cgggtaggtc ctggagtcgt agttcgggaa gagggacaca atgtccagca 4680
cggtgagggt caactccctc ctgaactggt tgtacctgat ccagtccctg gagtccggac 4740
cccagacgcg ctccaggccg gtgttgtacc agcgcacagc gtggtcggtg tagttgccaa 4800
tcagcctggt caggtcgttg tagcggctgt tgatggtggc agcatcgaag ccccaccttt 4860
ggccgaacac gctcacgtcg cgcagcacgc tgaggtgcag gttagcggct tgcacgtaca 4920
cggacaggag cggcacttgg tagttctgga cggcgaacag tgggatagcg gtggtcaggg 4980
cgctgttcat gtcgttgaat tgaatgcgca tttcctcgcg gagagctggg ttggtcgggt 5040
cggcctccca ctccctgaag ctctcggcgt agatttggta gaggttgctc aggccctcca 5100
gcctggagat ggcctggttc ctggcgaact cttcgatcct ctggttgatc agctgctcga 5160
tttgcaccag gaaggcgtcc cattgggatg gaccgaagat accccagatg atgtccacca 5220
ggccgagcac gaagccagca cctggcacga actcgctgag caggaactgg gtcaaggaca 5280
gggagatgtc gatgggggtg taaccggtct cgatgcgctc gccacccagc acctccacct 5340
ctgggttgct caggcagttg tatgggatgc actcgttgat gtttgggttg ttgtccattc 5400
tagagtcgac ctgcagaagt aacaccaaac aacagggtga gcatcgacaa aagaaacagt 5460
accaagcaaa taaatagcgt atgaaggcag ggctaaaaaa atccacatat agctgctgca 5520
tatgccatca tccaagtata tcaagatcaa aataattata aaacatactt gtttattata 5580
atagataggt actcaaggtt agagcatatg aatagatgct gcatatgcca tcatgtatat 5640
gcatcagtaa aacccacatc aacatgtata cctatcctag atcgatattt ccatccatct 5700
taaactcgta actatgaaga tgtatgacac acacatacag ttccaaaatt aataaataca 5760
ccaggtagtt tgaaacagta ttctactccg atctagaacg aatgaacgac cgcccaacca 5820
caccacatca tcacaaccaa gcgaacaaaa agcatctctg tatatgcatc agtaaaaccc 5880
gcatcaacat gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcatcttc aattcgtaac 5940
tatgaatatg tatggcacac acatacagat ccaaaattaa taaatccacc aggtagtttg 6000
aaacagaatt ctactccgat ctagaacgac cgcccaacca gaccacatca tcacaaccaa 6060
gacaaaaaaa agcatgaaaa gatgacccga caaacaagtg cacggcatat attgaaataa 6120
aggaaaaggg caaaccaaac cctatgcaac gaaacaaaaa aaatcatgaa atcgatcccg 6180
tctgcggaac ggctagagcc atcccaggat tccccaaaga gaaacactgg caagttagca 6240
atcagaacgt gtctgacgta caggtcgcat ccgtgtacga acgctagcag cacggatcta 6300
acacaaacac ggatctaaca caaacatgaa cagaagtaga actaccgggc cctaaccatg 6360
gaccggaacg ccgatctaga gaaggtagag aggggggggg ggggaggacg agcggcgtac 6420
cttgaagcgg aggtgccgac gggtggattt gggggagatc tggttgtgtg tgtgtgcgct 6480
ccgaacaaca cgaggttggg gaaagagggt gtggaggggg tgtctattta ttacggcggg 6540
cgaggaaggg aaagcgaagg agcggtggga aaggaatccc ccgtagctgc cgtgccgtga 6600
gaggaggagg aggccgcctg ccgtgccggc tcacgtctgc cgctccgcca cgcaatttct 6660
ggatgccgac agcggagcaa gtccaacggt ggagcggaac tctcgagagg ggtccagagg 6720
cagcgacaga gatgccgtgc cgtctgcttc gcttggcccg acgcgacgct gctggttcgc 6780
tggttggtgt ccgttagact cgtcgacggc gtttaacagg ctggcattat ctactcgaaa 6840
caagaaaaat gtttccttag tttttttaat ttcttaaagg gtatttgttt aatttttagt 6900
cactttattt tattctattt tatatctaaa ttattaaata aaaaaactaa aatagagttt 6960
tagttttctt aatttagagg ctaaaataga ataaaataga tgtactaaaa aaattagtct 7020
ataaaaacca ttaaccctaa accctaaatg gatgtactaa taaaatggat gaagtattat 7080
ataggtgaag ctatttgcaa aaaaaaagga gaacacatgc acactaaaaa gataaaactg 7140
tagagtcctg ttgtcaaaat actcaattgt cctttagacc atgtctaact gttcatttat 7200
atgattctct aaaacactga tattattgta gtactataga ttatattatt cgtagagtaa 7260
agtttaaata tatgtataaa gatagataaa ctgcacttca aacaagtgtg acaaaaaaaa 7320
tatgtggtaa ttttttataa cttagacatg caatgctcat tatctctaga gaggggcacg 7380
accgggtcac gctgcactgc aggcatcgat cgaagcttac gcgtccatgg ctgcaggagc 7440
tcgtcgactc tagactcgag ggcgcgccga caggatatat tggcgggtaa accttagaat 7500
aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc 7560
aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagta ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg 7620
cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct 7680
aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta 7740
gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga accggagaca ttacgccatg aacaagagcg 7800
ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg tcagcaccga cgaccaggac ttgaccaacc 7860
aacgggccga actgcacgcg gccggctgca ccaagctgtt ttccgagaag atcaccggca 7920
ccaggcgcga ccgcccggag ctggccagga tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg 7980
tgacagtgac caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg 8040
agcgcatcca ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca 8100
ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt 8160
ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt 8220
ttggcccccg ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc 8280
aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt 8340
accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct 8400
tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag 8460
aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga 8520
gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac 8580
cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc 8640
cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta 8700
aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg 8760
caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg 8820
accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc 8880
gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta 8940
accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc 9000
gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag 9060
gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc 9120
gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc 9180
tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg 9240
gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc 9300
actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag 9360
gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga 9420
aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg 9480
ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc 9540
cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg 9600
agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt 9660
agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac 9720
gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt 9780
gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg 9840
caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt 9900
gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc 9960
gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc 10020
gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct 10080
ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc 10140
gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga 10200
ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc 10260
ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg 10320
ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg 10380
aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat 10440
gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt 10500
gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga 10560
gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt 10620
tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg 10680
ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg 10740
cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga 10800
cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg 10860
ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct 10920
agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac 10980
gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa 11040
gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga 11100
tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc 11160
ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct 11220
gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat 11280
ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga 11340
ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 11400
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 11460
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc 11520
agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt 11580
actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 11640
catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 11700
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 11760
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 11820
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 11880
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 11940
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 12000
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 12060
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 12120
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 12180
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 12240
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 12300
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 12360
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 12420
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 12480
agggattttg gtcatgcatt ctaggtatta tttgccaacg accttcgtga tctcgccctt 12540
gacatagtgg acaaattctt cgagctggtc ggcccgggac gcgagacggt cttcttcttg 12600
gcccagatag gcttggcgcg cttcgaggat cacgggctgg tattgcgccg gaaggcgctc 12660
catcgcccag tcggcggcga catccttcgg cgcgatcttg ccggtaaccg ccgagtacca 12720
aatccggctc agcgtaagga ccacattgcg ctcatcgccc gcccaatccg gcggggagtt 12780
ccacagggtc agcgtctcgt tcagtgcttc gaacagatcc tgttccggca ccgggtcgaa 12840
aagttcctcg gccgcggggc cgacgagggc cacgctatgc tcccgggcct tggtgagcag 12900
gatcgccaga tcaatgtcga tggtggccgg ttcaaagata cccgccagaa tatcattacg 12960
ctgccattcg ccgaactgga gttcgcgttt ggccggatag cgccagggga tgatgtcatc 13020
gtgcaccaca atcgtcacct caaccgcgcg caggatttcg ctctcgccgg gggaggcgga 13080
cgtttccaga aggtcgttga taagcgcgcg gcgcgtggtc tcgtcgagac ggacggtaac 13140
ggtgacaagc aggtcgatgt ccgaatgggg cttaaggccg ccgtcaacgg cgctaccata 13200
cagatgcacg gcgaggaggg tcggttcgag gtggcgctcg atgacaccca cgacttccga 13260
cagctgggtg gacacctcgg cgatgaccgc ttcacccatt tattatttcc ttcctctttt 13320
ctacagtatt taaagatacc ccaagaagct aattataaca agacgaactc caattcactg 13380
ttccttgcat tctaaaacct taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag 13440
ttggcgtata acatagtatc gacggagccg attttgaaac cgcggtgatc acaggcagca 13500
acgctctgtc atcgttacaa tcaacatgct accctccgcg agatcatccg tgtttcaaac 13560
ccggcagctt agttgccgtt cttccgaata gcatcggtaa catgagcaaa gtctgccgcc 13620
ttacaacggc tctcccgctg acgccgtccc ggactgatgg gctgcctgta tcgagtggtg 13680
attttgtgcc gagctgccgg tcggggagct gttggctggc tgg 13723
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物: 甘蔗多泛素基因
<400> 15
accattaccc tggaggttga ga 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物: 甘蔗多泛素基因
<400> 16
gtcctggatc ttcgccttca 20
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针: 甘蔗多泛素基因
<400> 17
ctctgacacc atcgac 16
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC79005的甘蔗基因组和插入部分的5'区域之间的接合序列
<400> 18
acacattgct gggttgtggt gtaaac 26
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在事件CTC79005的甘蔗基因组和插入部分的3'区域之间的接合序列
<400> 19
tcgagggcga gccccgagcg ggggca 26
<210> 20
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘蔗优化的截断cry1Ac基因(苏云金芽孢杆菌B. thurigiensis).
<400> 20
atggacaaca acccaaacat caacgagtgc atcccataca actgcctgag caacccagag 60
gtggaggtgc tgggtggcga gcgcatcgag accggttaca cccccatcga catctccctg 120
tccttgaccc agttcctgct cagcgagttc gtgccaggtg ctggcttcgt gctcggcctg 180
gtggacatca tctggggtat cttcggtcca tcccaatggg acgccttcct ggtgcaaatc 240
gagcagctga tcaaccagag gatcgaagag ttcgccagga accaggccat ctccaggctg 300
gagggcctga gcaacctcta ccaaatctac gccgagagct tcagggagtg ggaggccgac 360
ccgaccaacc cagctctccg cgaggaaatg cgcattcaat tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ctatcccact gttcgccgtc cagaactacc aagtgccgct cctgtccgtg 480
tacgtgcaag ccgctaacct gcacctcagc gtgctgcgcg acgtgagcgt gttcggccaa 540
aggtggggct tcgatgctgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac caggctgatt 600
ggcaactaca ccgaccacgc tgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtctggggt 660
ccggactcca gggactggat caggtacaac cagttcagga gggagttgac cctcaccgtg 720
ctggacattg tgtccctctt cccgaactac gactccagga cctacccgat ccgcaccgtg 780
tcccaactca ccagggagat ctacaccaac ccagtgctgg agaacttcga cggtagcttc 840
cgcggttccg cccagggtat cgagggctcc atcaggagcc cacacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgctcac aggggcgagt actactggtc cggccaccag 960
atcatggcct ccccagtggg cttcagcggc cccgagttca ccttcccgct ctacggcacc 1020
atgggcaacg ccgctccaca gcaacgcatc gtggctcaac tgggtcaggg tgtctacagg 1080
accctgtcct ccaccctgta caggaggccc ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcaactg 1140
tccgtgctcg acggcaccga gttcgcctac ggcacctcct ccaacctgcc atccgctgtc 1200
tacaggaaga gcggcaccgt ggactccctg gacgagatcc caccacagaa caacaacgtg 1260
ccacccaggc aaggcttctc ccacaggctg agccacgtgt ccatgttccg ctccggcttc 1320
agcaacagct ccgtgagcat catcagggct ccgatgttct cctggatcca ccgcagcgct 1380
gagttcaaca acatcatcgc ctccgacagc atcacccaaa tcccggccgt gaagggcaac 1440
ttcctcttca acggttccgt catttccggc ccaggcttca ccggtggcga cctcgtgagg 1500
ctcaacagca gcggcaacaa catccagaac aggggctaca tcgaggtgcc aatccacttc 1560
ccatccacct ccaccaggta cagggtgcgc gtgaggtacg cttccgtgac cccgatccac 1620
ctcaacgtga actggggtaa ctcctccatc ttctccaaca ccgtgccagc taccgctacc 1680
tccctggaca acctccaatc cagcgacttc ggttacttcg agagcgccaa cgctttcacc 1740
tcctccctcg gtaacatcgt gggcgtgagg aacttcagcg gcaccgccgg cgtgatcatc 1800
gacaggttcg agttcatccc agtgaccgcc accctcgagg ctgagtga 1848
<210> 21
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nptII基因
<400> 21
tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat 60
accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg 120
ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa 180
tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac 240
gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc 300
gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt 360
acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag 420
cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg 480
agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc 540
agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg 600
cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac 660
cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg 720
tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc 780
atcttgttca atccacat 798
<210> 22
<211> 8686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTC79005事件: 侧翼序列和T-DNA片段
<400> 22
ggtaatcctt caaaggattt taaaaaatac taaatctgag ctaggatctg cagatgagga 60
agaaagacga agacgagata gagagcggga aattgagatg taaccctagc tgatggaacg 120
ggcacaggca caaatacggg catgggccga gatcgagggg cggcgcatca gcagcagtgc 180
agtaggcgag cagggccgcc gcattggtgg gccgcccatg ccggtgcacc gccgccgctc 240
tcgcgggggc cgccgtgcca tggctcgtcc gatgcaggat caccggcgac ggagaggcga 300
agccctaggc cggcgctgtc gccacgccag gatcggtcgc ccaggttgac gtgactgggt 360
tgcctgcgct gaacctaata acacattgct gggttgtggt gtaaacaaat tgacgcttag 420
acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga attagtactg atatcggtac 480
ccggggcggc cgcgagctcg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg aattcgccct 540
tggcgcgccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 600
gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 660
cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca 720
acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 780
attgccaaat gtttgaacga tctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 840
gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc 900
caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac 960
ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca 1020
agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc 1080
tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 1140
caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga 1200
atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata 1260
ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata 1320
gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg 1380
tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca 1440
ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat 1500
cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg 1560
ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatccacat tctagagtcg acctgcagaa 1620
gtaacaccaa acaacagggt gagcatcgac aaaagaaaca gtaccaagca aataaatagc 1680
gtatgaaggc agggctaaaa aaatccacat atagctgctg catatgccat catccaagta 1740
tatcaagatc aaaataatta taaaacatac ttgtttatta taatagatag gtactcaagg 1800
ttagagcata tgaatagatg ctgcatatgc catcatgtat atgcatcagt aaaacccaca 1860
tcaacatgta tacctatcct agatcgatat ttccatccat cttaaactcg taactatgaa 1920
gatgtatgac acacacatac agttccaaaa ttaataaata caccaggtag tttgaaacag 1980
tattctactc cgatctagaa cgaatgaacg accgcccaac cacaccacat catcacaacc 2040
aagcgaacaa aaagcatctc tgtatatgca tcagtaaaac ccgcatcaac atgtatacct 2100
atcctagatc gatatttcca tccatcatct tcaattcgta actatgaata tgtatggcac 2160
acacatacag atccaaaatt aataaatcca ccaggtagtt tgaaacagaa ttctactccg 2220
atctagaacg accgcccaac cagaccacat catcacaacc aagacaaaaa aaagcatgaa 2280
aagatgaccc gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat aaaggaaaag ggcaaaccaa 2340
accctatgca acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc cgtctgcgga acggctagag 2400
ccatcccagg attccccaaa gagaaacact ggcaagttag caatcagaac gtgtctgacg 2460
tacaggtcgc atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc taacacaaac acggatctaa 2520
cacaaacatg aacagaagta gaactaccgg gccctaacca tggaccggaa cgccgatcta 2580
gagaaggtag agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt accttgaagc ggaggtgccg 2640
acgggtggat ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg ctccgaacaa cacgaggttg 2700
gggaaagagg gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg ggcgaggaag ggaaagcgaa 2760
ggagcggtgg gaaaggaatc ccccgtagct gccgtgccgt gagaggagga ggaggccgcc 2820
tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg acagcggagc 2880
aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca gagatgccgt 2940
gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt gtccgttaga 3000
ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa atgtttcctt 3060
agttttttta atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat tttattctat 3120
tttatatcta aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc ttaatttaga 3180
ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt ctataaaaac cattaaccct 3240
aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga agctatttgc 3300
aaaaaaaaag gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc tgttgtcaaa 3360
atactcaatt gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct ctaaaacact 3420
gatattattg tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata 3480
aagatagata aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat 3540
aacttagaca tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcact 3600
gcaggcatac gcgtgatcca ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc gcccttggcg 3660
cgccgatcta gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat 3720
attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat 3780
ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga 3840
aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc 3900
caaatgtttg aacgatctca ctcagcctcg agggtggcgg tcactgggat gaactcgaac 3960
ctgtcgatga tcacgccggc ggtgccgctg aagttcctca cgcccacgat gttaccgagg 4020
gaggaggtga aagcgttggc gctctcgaag taaccgaagt cgctggattg gaggttgtcc 4080
agggaggtag cggtagctgg cacggtgttg gagaagatgg aggagttacc ccagttcacg 4140
ttgaggtgga tcggggtcac ggaagcgtac ctcacgcgca ccctgtacct ggtggaggtg 4200
gatgggaagt ggattggcac ctcgatgtag cccctgttct ggatgttgtt gccgctgctg 4260
ttgagcctca cgaggtcgcc accggtgaag cctgggccgg aaatgacgga accgttgaag 4320
aggaagttgc ccttcacggc cgggatttgg gtgatgctgt cggaggcgat gatgttgttg 4380
aactcagcgc tgcggtggat ccaggagaac atcggagccc tgatgatgct cacggagctg 4440
ttgctgaagc cggagcggaa catggacacg tggctcagcc tgtgggagaa gccttgcctg 4500
ggtggcacgt tgttgttctg tggtgggatc tcgtccaggg agtccacggt gccgctcttc 4560
ctgtagacag cggatggcag gttggaggag gtgccgtagg cgaactcggt gccgtcgagc 4620
acggacagtt gctggttgtt gataccgatg ttgaagggcc tcctgtacag ggtggaggac 4680
agggtcctgt agacaccctg acccagttga gccacgatgc gttgctgtgg agcggcgttg 4740
cccatggtgc cgtagagcgg gaaggtgaac tcggggccgc tgaagcccac tggggaggcc 4800
atgatctggt ggccggacca gtagtactcg cccctgtgag cgtcggtgta gatggtgatg 4860
ctgttcagga tgtccatcag gtgtgggctc ctgatggagc cctcgatacc ctgggcggaa 4920
ccgcggaagc taccgtcgaa gttctccagc actgggttgg tgtagatctc cctggtgagt 4980
tgggacacgg tgcggatcgg gtaggtcctg gagtcgtagt tcgggaagag ggacacaatg 5040
tccagcacgg tgagggtcaa ctccctcctg aactggttgt acctgatcca gtccctggag 5100
tccggacccc agacgcgctc caggccggtg ttgtaccagc gcacagcgtg gtcggtgtag 5160
ttgccaatca gcctggtcag gtcgttgtag cggctgttga tggtggcagc atcgaagccc 5220
cacctttggc cgaacacgct cacgtcgcgc agcacgctga ggtgcaggtt agcggcttgc 5280
acgtacacgg acaggagcgg cacttggtag ttctggacgg cgaacagtgg gatagcggtg 5340
gtcagggcgc tgttcatgtc gttgaattga atgcgcattt cctcgcggag agctgggttg 5400
gtcgggtcgg cctcccactc cctgaagctc tcggcgtaga tttggtagag gttgctcagg 5460
ccctccagcc tggagatggc ctggttcctg gcgaactctt cgatcctctg gttgatcagc 5520
tgctcgattt gcaccaggaa ggcgtcccat tgggatggac cgaagatacc ccagatgatg 5580
tccaccaggc cgagcacgaa gccagcacct ggcacgaact cgctgagcag gaactgggtc 5640
aaggacaggg agatgtcgat gggggtgtaa ccggtctcga tgcgctcgcc acccagcacc 5700
tccacctctg ggttgctcag gcagttgtat gggatgcact cgttgatgtt tgggttgttg 5760
tccattctag agtcgacctg cagaagtaac accaaacaac agggtgagca tcgacaaaag 5820
tgctgcatat gccatcatcc aagtatatca agatcaaaat aattataaaa catacttgtt 5880
tattataata gataggtact caaggttaga gcatatgaat agatgctgca tatgccatca 5940
tgtatatgca tcagtaaaac ccacatcaac atgtatacct atcctagatc gatatttcca 6000
tccatcttaa actcgtaact atgaagatgt atgacacaca catacagttc caaaattaat 6060
aaatacacca ggtagtttga aacagtattc tactccgatc tagaacgaat gaacgaccgc 6120
ccaaccacac cacatcatca caaccaagcg aacaaaaagc atctctgtat atgcatcagt 6180
aaaacccgca tcaacatgta tacctatcct agatcgatat ttccatccat catcttcaat 6240
tcgtaactat gaatatgtat ggcacacaca tacagatcca aaattaataa atccaccagg 6300
tagtttgaaa cagaattcta ctccgatcta gaacgaccgc ccaaccagac cacatcatca 6360
caaccaagac aaaaaaaagc atgaaaagat gacccgacaa acaagtgcac ggcatatatt 6420
gaaataaagg aaaagggcaa accaaaccct atgcaacgaa acaaaaaaaa tcatgaaatc 6480
gatcccgtct gcggaacggc tagagccatc ccaggattcc ccaaagagaa acactggcaa 6540
gttagcaatc agaacgtgtc tgacgtacag gtcgcatccg tgtacgaacg ctagcagcac 6600
ggatctaaca caaacacgga tctaacacaa acatgaacag aagtagaact accgggccct 6660
aaccatggac cggaacgccg atctagagaa ggtagagagg gggggggggg gaggacgagc 6720
ggcgtacctt gaagcggagg tgccgacggg tggatttggg ggagatctgg ttgtgtgtgt 6780
gtgcgctccg aacaacacga ggttggggaa agagggtgtg gagggggtgt ctatttatta 6840
cggcgggcga ggaagggaaa gcgaaggagc ggtgggaaag gaatcccccg tagctgccgt 6900
gccgtgagag gaggaggagg ccgcctgccg tgccggctca cgtctgccgc tccgccacgc 6960
aatttctgga tgccgacagc ggagcaagtc caacggtgga gcggaactct cgagaggggt 7020
ccagaggcag cgacagagat gccgtgccgt ctgcttcgct tggcccgacg cgacgctgct 7080
ggttcgctgg ttggtgtccg ttagactcgt cgacggcgtt taacaggctg gcattatcta 7140
ctcgaaacaa gaaaaatgtt tccttagttt ttttaatttc ttaaagggta tttgtttaat 7200
ttttagtcac tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa aaactaaaat 7260
agagttttag ttttcttaat ttagaggcta aaatagaata aaatagatgt actaaaaaaa 7320
ttagtctata aaaaccatta accctaaacc ctaaatggat gtactaataa aatggatgaa 7380
gtattatata ggtgaagcta tttgcaaaaa aaaaggagaa cacatgcaca ctaaaaagat 7440
aaaactgtag agtcctgttg tcaaaatact caattgtcct ttagaccatg tctaactgtt 7500
catttatatg attctctaaa acactgatat tattgtagta ctatagatta tattattcgt 7560
agagtaaagt ttaaatatat gtataaagat agataaactg cacttcaaac aagtgtgaca 7620
aaaaaaatat gtggtaattt tttataactt agacatgcaa tgctcattat ctctagagag 7680
gggcacgacc gggtcacgct gcactgcagg catcgatcga agcttacgcg tccatggctg 7740
caggagctcg tcgactctag actcgagggc gagccccgag cgggggcagc tgaggcgcca 7800
ttgggaggag gaagagggca gcgctccggg gcggaagtcg tggggcggca cgagggaagg 7860
gcacacgacg gacggacgga ggaagaagaa gagcgcggag gtagctggcc gagcgtgacc 7920
tgcatgtcaa gtcaatggtc gcgggtgcga gtagaaaaga gggaggacga ccggacacac 7980
cgccgcgtca ggtcaccgat gacctaacgt gtctggtcac tattcacgcg ctaaaaacac 8040
ttactagact cgatctaacg cgggcagccc tctgagtccg atcatttatt ctgtgcgtcc 8100
ggtcatcgac gtgtgcggga aagcgttggc tgttaacggc tagttttgaa tcgtgtgacg 8160
tggcacatcg tggttgctcg actgttacga ccggacacgg ggctgagtcc ggtcgatgag 8220
tccgatcacc cccgagctgc gtaacggttg gtttttcaga gggggtcttt aaatagacct 8280
tggtcggctc caagcctttt ctcttggtat tttgatcatc ttgacatcct cttaagctaa 8340
gcatacttcc tcccactcat ctctcttgct tggttgtgaa tccaaagtga gattgagtga 8400
ttccaagtgt atttgcttgt gagtttgcat atagtggcac ttggggatcg tttgagctgc 8460
ggaattcttg ttactcttgg tggctaccgc cacctagaca gcttggagca acagatgagt 8520
tgtggcaaga gttggtgatt atttttggtc acctcccggt gattgtgagg ggtttttgtg 8580
cctttcccgg cagagcgtta aaggcaactc tagtggattg cgcatgtcat tgagctacct 8640
cacttatggg tcggttcttg cggtttccaa cgtgtggacg aggttc 8686
<210> 23
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTC79005事件: 侧翼序列 - 左边界(5')
<400> 23
ggtaatcctt caaaggattt taaaaaatac taaatctgag ctaggatctg cagatgagga 60
agaaagacga agacgagata gagagcggga aattgagatg taaccctagc tgatggaacg 120
ggcacaggca caaatacggg catgggccga gatcgagggg cggcgcatca gcagcagtgc 180
agtaggcgag cagggccgcc gcattggtgg gccgcccatg ccggtgcacc gccgccgctc 240
tcgcgggggc cgccgtgcca tggctcgtcc gatgcaggat caccggcgac ggagaggcga 300
agccctaggc cggcgctgtc gccacgccag gatcggtcgc ccaggttgac gtgactgggt 360
tgcctgcgct gaacctaata acacattgct ggg 393
<210> 24
<211> 911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTC79005事件: 侧翼序列 - 右边界(3')
<400> 24
ccgagcgggg gcagctgagg cgccattggg aggaggaaga gggcagcgct ccggggcgga 60
agtcgtgggg cggcacgagg gaagggcaca cgacggacgg acggaggaag aagaagagcg 120
cggaggtagc tggccgagcg tgacctgcat gtcaagtcaa tggtcgcggg tgcgagtaga 180
aaagagggag gacgaccgga cacaccgccg cgtcaggtca ccgatgacct aacgtgtctg 240
gtcactattc acgcgctaaa aacacttact agactcgatc taacgcgggc agccctctga 300
gtccgatcat ttattctgtg cgtccggtca tcgacgtgtg cgggaaagcg ttggctgtta 360
acggctagtt ttgaatcgtg tgacgtggca catcgtggtt gctcgactgt tacgaccgga 420
cacggggctg agtccggtcg atgagtccga tcacccccga gctgcgtaac ggttggtttt 480
tcagaggggg tctttaaata gaccttggtc ggctccaagc cttttctctt ggtattttga 540
tcatcttgac atcctcttaa gctaagcata cttcctccca ctcatctctc ttgcttggtt 600
gtgaatccaa agtgagattg agtgattcca agtgtatttg cttgtgagtt tgcatatagt 660
ggcacttggg gatcgtttga gctgcggaat tcttgttact cttggtggct accgccacct 720
agacagcttg gagcaacaga tgagttgtgg caagagttgg tgattatttt tggtcacctc 780
ccggtgattg tgaggggttt ttgtgccttt cccggcagag cgttaaaggc aactctagtg 840
gattgcgcat gtcattgagc tacctcactt atgggtcggt tcttgcggtt tccaacgtgt 900
ggacgaggtt c 911
<210> 25
<211> 26920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9/crRNA/HR模板构建体
<400> 25
cttagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 60
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 120
ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 180
caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc 240
gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 300
caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt 360
gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat 420
caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg 480
cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga 540
cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc 600
cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt 660
cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 720
cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct 780
gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 840
gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg 900
cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga 960
acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt 1020
accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 1080
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 1140
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 1200
tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa 1260
caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag 1320
gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc 1380
tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc 1440
aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg 1500
gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 1560
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 1620
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 1680
aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg 1740
aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct 1800
acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg 1860
cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 1920
taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag 1980
cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 2040
tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac 2100
cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat 2160
aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag 2220
gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg 2280
gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt 2340
gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 2400
gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 2460
ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 2520
gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 2580
ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 2640
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 2700
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 2760
ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 2820
aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 2880
gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 2940
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 3000
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 3060
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 3120
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 3180
ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 3240
cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 3300
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 3360
gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 3420
cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 3480
gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 3540
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 3600
aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 3660
gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 3720
cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 3780
tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 3840
ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 3900
tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 3960
cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 4020
catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 4080
cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4140
aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4200
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4260
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4320
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4380
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4440
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4500
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4560
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4620
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4680
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4740
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 4800
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4860
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4920
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4980
tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtattatt tgccaacgac cttcgtgatc 5040
tcgcccttga catagtggac aaattcttcg agctggtcgg cccgggacgc gagacggtct 5100
tcttcttggc ccagataggc ttggcgcgct tcgaggatca cgggctggta ttgcgccgga 5160
aggcgctcca tcgcccagtc ggcggcgaca tccttcggcg cgatcttgcc ggtaaccgcc 5220
gagtaccaaa tccggctcag cgtaaggacc acattgcgct catcgcccgc ccaatccggc 5280
ggggagttcc acagggtcag cgtctcgttc agtgcttcga acagatcctg ttccggcacc 5340
gggtcgaaaa gttcctcggc cgcggggccg acgagggcca cgctatgctc ccgggccttg 5400
gtgagcagga tcgccagatc aatgtcgatg gtggccggtt caaagatacc cgccagaata 5460
tcattacgct gccattcgcc gaactggagt tcgcgtttgg ccggatagcg ccaggggatg 5520
atgtcatcgt gcaccacaat cgtcacctca accgcgcgca ggatttcgct ctcgccgggg 5580
gaggcggacg tttccagaag gtcgttgata agcgcgcggc gcgtggtctc gtcgagacgg 5640
acggtaacgg tgacaagcag gtcgatgtcc gaatggggct taaggccgcc gtcaacggcg 5700
ctaccataca gatgcacggc gaggagggtc ggttcgaggt ggcgctcgat gacacccacg 5760
acttccgaca gctgggtgga cacctcggcg atgaccgctt cacccattta ttatttcctt 5820
cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 5880
attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 5940
tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6000
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6060
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6120
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6180
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6240
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6300
aatgtactga attagtactg ataaatggcg cgccaagctt tggcaaacag ctattatggg 6360
tattatgggt ggtaccacgc gtcgatccac tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattcg 6420
cccttggcgc gccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 6480
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 6540
aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 6600
ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 6660
ctttattgcc aaatgtttga acgatctcag aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg 6720
atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg 6780
ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc 6840
acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac catgatattc 6900
ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg 6960
agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga 7020
tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg 7080
tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg 7140
gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc 7200
aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg 7260
cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct gcagttcatt cagggcaccg 7320
gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg 7380
gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa 7440
gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatcc acatggtggt gtgacctgca 7500
gaagtaacac caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat 7560
agcgtatgaa ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa 7620
gtatatcaag atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca 7680
aggttagagc atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc 7740
acatcaacat gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat 7800
gaagatgtat gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa 7860
cagtattcta ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca 7920
accaagcgaa caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata 7980
cctatcctag atcgatattt ccatccatca tcttcaattc gtaactatga atatgtatgg 8040
cacacacata cagatccaaa attaataaat ccaccaggta gtttgaaaca gaattctact 8100
ccgatctaga acgaccgccc aaccagacca catcatcaca accaagacaa aaaaaagcat 8160
gaaaagatga cccgacaaac aagtgcacgg catatattga aataaaggaa aagggcaaac 8220
caaaccctat gcaacgaaac aaaaaaaatc atgaaatcga tcccgtctgc ggaacggcta 8280
gagccatccc aggattcccc aaagagaaac actggcaagt tagcaatcag aacgtgtctg 8340
acgtacaggt cgcatccgtg tacgaacgct agcagcacgg atctaacaca aacacggatc 8400
taacacaaac atgaacagaa gtagaactac cgggccctaa ccatggaccg gaacgccgat 8460
ctagagaagg tagagagggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg 8520
ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg 8580
ttggggaaag agggtgtgga gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc 8640
gaaggagcgg tgggaaagga atcccccgta gctgccgtgc cgtgagagga ggaggaggcc 8700
gcctgccgtg ccggctcacg tctgccgctc cgccacgcaa tttctggatg ccgacagcgg 8760
agcaagtcca acggtggagc ggaactctcg agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc 8820
cgtgccgtct gcttcgcttg gcccgacgcg acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt 8880
agactcgtcg acggcgttta acaggctggc attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc 8940
cttagttttt ttaatttctt aaagggtatt tgtttaattt ttagtcactt tattttattc 9000
tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa actaaaatag agttttagtt ttcttaattt 9060
agaggctaaa atagaataaa atagatgtac taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac 9120
cctaaaccct aaatggatgt actaataaaa tggatgaagt attatatagg tgaagctatt 9180
tgcaaaaaaa aaggagaaca catgcacact aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc 9240
aaaatactca attgtccttt agaccatgtc taactgttca tttatatgat tctctaaaac 9300
actgatatta ttgtagtact atagattata ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt 9360
ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt 9420
tataacttag acatgcaatg ctcattatct ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc 9480
actgcaggga tccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 9540
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 9600
aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 9660
ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 9720
ctttattgcc aaatgtttga acgatcccta ggacgatctc acttgtacag ctcgtccatg 9780
ccgtgggtga tgccagctgc ggtgacgaac tccagcagga ccatgtggtc gcgcttctcg 9840
ttggggtcct tgctcagagc ggactgggtg ctcaggtagt ggttgtcggg cagcagcacg 9900
ggaccgtcgc cgatgggcgt gttctgctgg tagtggtcgg cgagctggac gctgccgtcc 9960
tcgatgttgt ggcggatctt gaagttgacc ttgatgccgt tcttctgctt gtcagccatg 10020
atgtagacgt tgtggctgtt gtagttgtac tccagcttgt gccccaggat gttgccgtcc 10080
tccttgaagt cgatgccctt cagctcgatg cggttcacca gggtgtcgcc ctcgaacttc 10140
acctcggctc gggtcttgta gttgccgtcg tccttgaaga agatggtgcg ctcctggacg 10200
tagccttcgg gcatggcgga cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc ggggtagcgg 10260
ctgaagcact gcacgccgta ggtgaaggtg gtcacgaggg tgggccaggg cacgggcagc 10320
ttgccggtgg tgcagatgaa cttcagggtc agcttgccgt aggtggcgtc gccctcgccc 10380
tcgccgctga cgctgaactt gtggccgttc acgtcgccgt ccagctcgac caggatgggc 10440
accaccccag tgaacagctc ctcgcccttg ctcactacaa aaaagctccg cacgaggctg 10500
catttgtcac aaatcatgaa aagaaaaact accgatgaac aatgctgagg gattcaaatt 10560
ctacccacaa aaagaagaaa gaaagatcta gcacatctaa gcctgacgaa gcagcagaaa 10620
tatataaaaa tataaaccat agtgcccttt tcccctcttc ctgatcttgt ttagcacggc 10680
ggaaatttta aaccccccat catctccccc aacaacggcg gatcgcagat ctacatccga 10740
gagccccatt ccccgcgaga tccgggccgg atccacgccg gcgagagccc cagccgcgag 10800
atcccgcccc tcccgcgcac cgatctgggc gcgcacgaag ccgcctctcg cccacccaaa 10860
ctaccaaggc caaagatcga gaccgagacg gaaaaaaaaa cggagaaaga aagaggagag 10920
gggcggggtg gttaccggcg gcggcggagg cctcccttgg atcttatggt gtgttgtccc 10980
tgtgtgttct ccaatagtgt ggcttgagtg tgtggaagat ggttctagag gatctgctag 11040
agtcagcttg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt 11100
cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat 11160
ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 11220
ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat 11280
cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac 11340
agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct 11400
caatcggacc atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 11460
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aacacaaaca cggatctaac acaaacatga acagaagtag aactaccggg ccctaaccat 25260
ggaccggaac gccgatctag agaaggtaga gagggggggg gggggaggac gagcggcgta 25320
ccttgaagcg gaggtgccga cgggtggatt tgggggagat ctggttgtgt gtgtgtgcgc 25380
tccgaacaac acgaggttgg ggaaagaggg tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg 25440
gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg ccgtgccgtg 25500
agaggaggag gaggccgcct gccgtgccgg ctcacgtctg ccgctccgcc acgcaatttc 25560
tggatgccga cagcggagca agtccaacgg tggagcggaa ctctcgagag gggtccagag 25620
gcagcgacag agatgccgtg ccgtctgctt cgcttggccc gacgcgacgc tgctggttcg 25680
ctggttggtg tccgttagac tcgtcgacgg cgtttaacag gctggcatta tctactcgaa 25740
acaagaaaaa tgtttcctta gtttttttaa tttcttaaag ggtatttgtt taatttttag 25800
tcactttatt ttattctatt ttatatctaa attattaaat aaaaaaacta aaatagagtt 25860
ttagttttct taatttagag gctaaaatag aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc 25920
tataaaaacc attaacccta aaccctaaat ggatgtacta ataaaatgga tgaagtatta 25980
tataggtgaa gctatttgca aaaaaaaagg agaacacatg cacactaaaa agataaaact 26040
gtagagtcct gttgtcaaaa tactcaattg tcctttagac catgtctaac tgttcattta 26100
tatgattctc taaaacactg atattattgt agtactatag attatattat tcgtagagta 26160
aagtttaaat atatgtataa agatagataa actgcacttc aaacaagtgt gacaaaaaaa 26220
atatgtggta attttttata acttagacat gcaatgctca ttatctctag agaggggcac 26280
gaccgggtca cgctgcactg caggcatcga tcgaagctta cgcgtccatg gctgcaggag 26340
ctcgtcgact ctagactcga gggcgagccc cgagcggggg cagctgaggc gccattggga 26400
ggaggaagag ggcagcgctc cggggcggaa gtcgtgcggc ggcacgaggg aagggcacac 26460
gacggacgga cggaggaaga agaagagcgc ggaggtagct ggccgagcgt gacctgcatg 26520
tcaagtcaat ggtcgcgggt gcgagtagaa aagagggagg acgaccggac acaccgccgc 26580
gtcaggtcac cgatgaccta acgtgtctgg tcactattca cgcgctaaaa acacttacta 26640
gactcgatct aacgcgggca gccctctgag tccgatcatt tattctgtgc gtccggtcat 26700
cgacgtgtgc gggaaagcgt tggctgttaa cggctagttt tgaatcgtgt gacgtggcac 26760
accacgactt ccgccccgga gcgcggtacc actagtatta attaagttta aacggcgcgc 26820
caagggcgaa ttccagcaca ctggcggccg ttactagtgg atcgagctcg tcgactctag 26880
actcgagggc gcgcctgaca ggatatattg gcgggtaaac 26920
<210> 26
<211> 17650
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HR_模板构建体
<400> 26
cttagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 60
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 120
ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 180
caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc 240
gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 300
caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt 360
gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat 420
caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg 480
cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga 540
cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc 600
cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt 660
cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 720
cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct 780
gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 840
gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg 900
cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga 960
acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt 1020
accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 1080
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 1140
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 1200
tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa 1260
caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag 1320
gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc 1380
tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc 1440
aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg 1500
gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 1560
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 1620
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 1680
aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg 1740
aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct 1800
acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg 1860
cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 1920
taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag 1980
cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 2040
tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac 2100
cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat 2160
aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag 2220
gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg 2280
gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt 2340
gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 2400
gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 2460
ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 2520
gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 2580
ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 2640
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 2700
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 2760
ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 2820
aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 2880
gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 2940
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 3000
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 3060
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 3120
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 3180
ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 3240
cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 3300
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 3360
gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 3420
cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 3480
gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 3540
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 3600
aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 3660
gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 3720
cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 3780
tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 3840
ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 3900
tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 3960
cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 4020
catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 4080
cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4140
aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4200
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4260
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4320
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4380
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4440
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4500
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4560
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4620
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4680
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4740
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 4800
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4860
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4920
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4980
tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtattatt tgccaacgac cttcgtgatc 5040
tcgcccttga catagtggac aaattcttcg agctggtcgg cccgggacgc gagacggtct 5100
tcttcttggc ccagataggc ttggcgcgct tcgaggatca cgggctggta ttgcgccgga 5160
aggcgctcca tcgcccagtc ggcggcgaca tccttcggcg cgatcttgcc ggtaaccgcc 5220
gagtaccaaa tccggctcag cgtaaggacc acattgcgct catcgcccgc ccaatccggc 5280
ggggagttcc acagggtcag cgtctcgttc agtgcttcga acagatcctg ttccggcacc 5340
gggtcgaaaa gttcctcggc cgcggggccg acgagggcca cgctatgctc ccgggccttg 5400
gtgagcagga tcgccagatc aatgtcgatg gtggccggtt caaagatacc cgccagaata 5460
tcattacgct gccattcgcc gaactggagt tcgcgtttgg ccggatagcg ccaggggatg 5520
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ctaccataca gatgcacggc gaggagggtc ggttcgaggt ggcgctcgat gacacccacg 5760
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tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6000
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6060
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6120
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6180
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6240
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6300
aatgtactga attagtactg ataaatggcg cgccaagctt tggcaaacag ctattatggg 6360
tattatgggt ggtaccacgc gtcggatccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga 6420
taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg 6480
cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat 6540
tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg 6600
attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tccctaggac gatctcactt 6660
gtagagctcg tccatgccgt agaggaacag gtgatggcgg ccctcggacc tctcgtactg 6720
ctcaacaata gtgtaatcct cgttatggct agtaatatcc agcttagtat ccacgtagta 6780
gtagccaggg agctgaaccg gcttcttggc catgtagata gtcttgaact ccaccaggta 6840
atggccacca tccttcagct tgagagcctg atgaatctcg cccttcagaa cgccatccct 6900
agggtagagc ctctcagtgg aggcctccca ccccatggtc ttcttctgca tgacagggcc 6960
gtctggaggg aagttggtgc cgcgcatctt caccttgtag atgagggtgc catcttggag 7020
ggagctatcc tgagtcacag taaccaggcc accatcttca aagttcatga cgcgttccca 7080
cttgaagcct tctgggaagg agagcttctt gtaatcagga atatcagcag ggtgcttcac 7140
gtaggctttg gagccgtaca tgaactgagg ggagaggata tcccaggcga aagggagagg 7200
gccgccctta gtcactttga gcttagcagt ctgggtgcct tcataagggc ggccctcgcc 7260
ctcaccttca atctcgaact catggccgtt catggagccc tccatcctga ccttgaagcg 7320
catgaactcc ttgatcacgg ccatgttgtt gtcctcgctg gaggcggtgc cgctggagcc 7380
gctgccagtg gagccagtgc cgtggccgag gaacaggtgg tgcctgccct cgctgcgctc 7440
gtactgctcc acgatggtgt agtcctcgtt gtgggaggtg atgtcgagct tggtgtcgac 7500
gtagtagtag cctggcagct gcacaggctt cttggccatg tagatggtct tgaactcgac 7560
caggtagtgg ccaccgtcct tgagcttcag ggcctggtgg atctcgccct tgagcacgcc 7620
gtccctgggg tacagcctct cagtgctagc ctcccagccc atggtcttct tctgcatgac 7680
cgggccatcg ggcgggaagt tagtgcccct catcttcacc ttgtagatga gggtgccatc 7740
ctggaggctg gagtcctgag tgacggtcac gaggccaccg tcctcgaagt tcatgacgcg 7800
ctcccacttg aagccctcgg ggaaggacag cttcttgtag tcggggatgt cggccgggtg 7860
cttcacgtag gccttgctgc cgtacatgaa ctgcggggag aggatgtccc aagcgaatgg 7920
cagcgggccg cccttagtga ccttgagctt ggcggtctgg gtgccctcgt aaggcctgcc 7980
ctcgccctcg ccctcgatct cgaactcgtg gccgttcatg ctgccctcca tcctcacctt 8040
gaagcgcatg aactccttga tcacttcctc gcccttggac accactacaa aaaagctccg 8100
cacgaggctg catttgtcac aaatcatgaa aagaaaaact accgatgaac aatgctgagg 8160
gattcaaatt ctacccacaa aaagaagaaa gaaagatcta gcacatctaa gcctgacgaa 8220
gcagcagaaa tatataaaaa tataaaccat agtgcccttt tcccctcttc ctgatcttgt 8280
ttagcacggc ggaaatttta aaccccccat catctccccc aacaacggcg gatcgcagat 8340
ctacatccga gagccccatt ccccgcgaga tccgggccgg atccacgccg gcgagagccc 8400
cagccgcgag atcccgcccc tcccgcgcac cgatctgggc gcgcacgaag ccgcctctcg 8460
cccacccaaa ctaccaaggc caaagatcga gaccgagacg gaaaaaaaaa cggagaaaga 8520
aagaggagag gggcggggtg gttaccggcg gcggcggagg cctcccttgg atcttatggt 8580
gtgttgtccc tgtgtgttct ccaatagtgt ggcttgagtg tgtggaagat ggttctagag 8640
gatctgctag agtcagcttg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 8700
gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata 8760
tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc 8820
ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc 8880
tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca 8940
ataaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt 9000
tgaaaagtct caatcggacc atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 9060
tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca 9120
gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct 9180
tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg 9240
tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatcggac cccctcagcc tgcacctcga 9300
gggcgctccg gggcggaagt cgtgggtaat ccttcaaagg attttaaaaa atactaaatc 9360
tgagctagga tctgcagatg aggaagaaag acgaagacga gatagagagc gggaaattga 9420
gatgtaaccc tagctgatgg aacgggcaca ggcacaaata cgggcatggg ccgagatcga 9480
ggggcggcgc atcagcagca gtgcagtagg cgagcagggc cgccgcattg gtgggccgcc 9540
catgccggtg caccgccgcc gctctcgcgg gggccgccgt gccatggctc gtccgatgca 9600
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tcgcccaggt tgacgtgact gggttgcctg cgctgaacct aataacacat tgctgggttg 9720
tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta 9780
ctgaattagt actgatatcg gtacccgggg cggccgcgag ctcgatccac tagtaacggc 9840
cgccagtgtg ctggaattcg cccttggcgc gccgatctag taacatagat gacaccgcgc 9900
gcgataattt atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata 9960
attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa 10020
ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa 10080
caggattcaa tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatctcag aagaactcgt 10140
caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga 10200
ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta 10260
tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc 10320
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cgtcgggcat gcgcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct 10440
cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga 10500
tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc 10560
gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat 10620
cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga 10680
gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct 10740
gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg 10800
ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc 10860
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acattctaga gtcgacctgc agaagtaaca ccaaacaaca gggtgagcat cgacaaaaga 10980
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gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata attataaaac atacttgttt 11100
attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata gatgctgcat atgccatcat 11160
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tgcgctccga acaacacgag gttggggaaa gagggtgtgg agggggtgtc tatttattac 12060
ggcgggcgag gaagggaaag cgaaggagcg gtgggaaagg aatcccccgt agctgccgtg 12120
ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt gccggctcac gtctgccgct ccgccacgca 12180
atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc aacggtggag cggaactctc gagaggggtc 12240
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gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc gacggcgttt aacaggctgg cattatctac 12360
tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt tttaatttct taaagggtat ttgtttaatt 12420
tttagtcact ttattttatt ctattttata tctaaattat taaataaaaa aactaaaata 12480
gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa aatagaataa aatagatgta ctaaaaaaat 12540
tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc taaatggatg tactaataaa atggatgaag 12600
tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa aaaggagaac acatgcacac taaaaagata 12660
aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc aattgtcctt tagaccatgt ctaactgttc 12720
atttatatga ttctctaaaa cactgatatt attgtagtac tatagattat attattcgta 12780
gagtaaagtt taaatatatg tataaagata gataaactgc acttcaaaca agtgtgacaa 12840
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gcgggtaaac 17650
<210> 27
<211> 18754
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9/crRNA模板构建体
<400> 27
cttagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 60
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 120
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gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 300
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accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4920
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gaaaagatga cccgacaaac aagtgcacgg catatattga aataaaggaa aagggcaaac 8220
caaaccctat gcaacgaaac aaaaaaaatc atgaaatcga tcccgtctgc ggaacggcta 8280
gagccatccc aggattcccc aaagagaaac actggcaagt tagcaatcag aacgtgtctg 8340
acgtacaggt cgcatccgtg tacgaacgct agcagcacgg atctaacaca aacacggatc 8400
taacacaaac atgaacagaa gtagaactac cgggccctaa ccatggaccg gaacgccgat 8460
ctagagaagg tagagagggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg 8520
ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg 8580
ttggggaaag agggtgtgga gggggtgtct atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc 8640
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cgtgccgtct gcttcgcttg gcccgacgcg acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt 8880
agactcgtcg acggcgttta acaggctggc attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc 8940
cttagttttt ttaatttctt aaagggtatt tgtttaattt ttagtcactt tattttattc 9000
tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa actaaaatag agttttagtt ttcttaattt 9060
agaggctaaa atagaataaa atagatgtac taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac 9120
cctaaaccct aaatggatgt actaataaaa tggatgaagt attatatagg tgaagctatt 9180
tgcaaaaaaa aaggagaaca catgcacact aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc 9240
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actgatatta ttgtagtact atagattata ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt 9360
ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt 9420
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actgcaggga tccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 9540
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 9600
aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 9660
ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 9720
ctttattgcc aaatgtttga acgatcccta ggacgatctc acttgtacag ctcgtccatg 9780
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tcgatgttgt ggcggatctt gaagttgacc ttgatgccgt tcttctgctt gtcagccatg 10020
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acctcggctc gggtcttgta gttgccgtcg tccttgaaga agatggtgcg ctcctggacg 10200
tagccttcgg gcatggcgga cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc ggggtagcgg 10260
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ttgccggtgg tgcagatgaa cttcagggtc agcttgccgt aggtggcgtc gccctcgccc 10380
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catttgtcac aaatcatgaa aagaaaaact accgatgaac aatgctgagg gattcaaatt 10560
ctacccacaa aaagaagaaa gaaagatcta gcacatctaa gcctgacgaa gcagcagaaa 10620
tatataaaaa tataaaccat agtgcccttt tcccctcttc ctgatcttgt ttagcacggc 10680
ggaaatttta aaccccccat catctccccc aacaacggcg gatcgcagat ctacatccga 10740
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agtcagcttg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt 11100
cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat 11160
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ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata 11640
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tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca 11880
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acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta 12000
tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta 12060
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gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt 12240
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acctgaggct catctacctg gccctcgccc acatgatcaa gttccgcggc cacttcctca 14220
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agacctacaa ccagctgttc gaggagaacc ccatcaacgc ctccggcgtg gacgctaagg 14340
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tcaccctcgc caacggcgag atccgcaaga ggccactgat cgagaccaac ggcgagactg 16920
gcgagatcgt gtgggacaag ggcagggact tcgccaccgt gaggaaggtc ctgtccatgc 16980
ctcaggtgaa catcgtcaag aagaccgagg tccagaccgg cggcttctcc aaggagagca 17040
tcctcccaaa gcgcaacagc gacaagctga tcgccaggaa gaaggactgg gacccgaaga 17100
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ccaagtatgt gaacttcctg tacctcgcct cccactacga gaagctgaag ggcagccccg 17460
aggacaacga gcagaagcag ctcttcgtcg agcagcacaa gcactacctg gacgagatca 17520
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agtccatcac cggcctgtac gagactcgca tcgacctcag ccagctgggc ggcgacccga 17820
agaagaagcg caaagtctga gggaccctcg atcgacaagc tcgagtttct ccataataat 17880
gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga 17940
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gggcgcgcct gacaggatat attggcgggt aaac 18754
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9 - crRNA
<400> 28
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<210> 29
<211> 8686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 22的互补序列 (反向-互补)
<400> 29
gaacctcgtc cacacgttgg aaaccgcaag aaccgaccca taagtgaggt agctcaatga 60
catgcgcaat ccactagagt tgcctttaac gctctgccgg gaaaggcaca aaaacccctc 120
acaatcaccg ggaggtgacc aaaaataatc accaactctt gccacaactc atctgttgct 180
ccaagctgtc taggtggcgg tagccaccaa gagtaacaag aattccgcag ctcaaacgat 240
ccccaagtgc cactatatgc aaactcacaa gcaaatacac ttggaatcac tcaatctcac 300
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tgtcaagatg atcaaaatac caagagaaaa ggcttggagc cgaccaaggt ctatttaaag 420
accccctctg aaaaaccaac cgttacgcag ctcgggggtg atcggactca tcgaccggac 480
tcagccccgt gtccggtcgt aacagtcgag caaccacgat gtgccacgtc acacgattca 540
aaactagccg ttaacagcca acgctttccc gcacacgtcg atgaccggac gcacagaata 600
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tgaatagtga ccagacacgt taggtcatcg gtgacctgac gcggcggtgt gtccggtcgt 720
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agctacctcc gcgctcttct tcttcctccg tccgtccgtc gtgtgccctt ccctcgtgcc 840
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cccccgctcg gggctcgccc tcgagtctag agtcgacgag ctcctgcagc catggacgcg 960
taagcttcga tcgatgcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa 1020
tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt 1080
gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat 1140
ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg 1200
gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg 1260
catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat 1320
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ttttgtttcg ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc 2280
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tcaacgagtg catcccatac aactgcctga gcaacccaga ggtggaggtg ctgggtggcg 3000
agcgcatcga gaccggttac acccccatcg acatctccct gtccttgacc cagttcctgc 3060
tcagcgagtt cgtgccaggt gctggcttcg tgctcggcct ggtggacatc atctggggta 3120
tcttcggtcc atcccaatgg gacgccttcc tggtgcaaat cgagcagctg atcaaccaga 3180
ggatcgaaga gttcgccagg aaccaggcca tctccaggct ggagggcctg agcaacctct 3240
accaaatcta cgccgagagc ttcagggagt gggaggccga cccgaccaac ccagctctcc 3300
gcgaggaaat gcgcattcaa ttcaacgaca tgaacagcgc cctgaccacc gctatcccac 3360
tgttcgccgt ccagaactac caagtgccgc tcctgtccgt gtacgtgcaa gccgctaacc 3420
tgcacctcag cgtgctgcgc gacgtgagcg tgttcggcca aaggtggggc ttcgatgctg 3480
ccaccatcaa cagccgctac aacgacctga ccaggctgat tggcaactac accgaccacg 3540
ctgtgcgctg gtacaacacc ggcctggagc gcgtctgggg tccggactcc agggactgga 3600
tcaggtacaa ccagttcagg agggagttga ccctcaccgt gctggacatt gtgtccctct 3660
tcccgaacta cgactccagg acctacccga tccgcaccgt gtcccaactc accagggaga 3720
tctacaccaa cccagtgctg gagaacttcg acggtagctt ccgcggttcc gcccagggta 3780
tcgagggctc catcaggagc ccacacctga tggacatcct gaacagcatc accatctaca 3840
ccgacgctca caggggcgag tactactggt ccggccacca gatcatggcc tccccagtgg 3900
gcttcagcgg ccccgagttc accttcccgc tctacggcac catgggcaac gccgctccac 3960
agcaacgcat cgtggctcaa ctgggtcagg gtgtctacag gaccctgtcc tccaccctgt 4020
acaggaggcc cttcaacatc ggtatcaaca accagcaact gtccgtgctc gacggcaccg 4080
agttcgccta cggcacctcc tccaacctgc catccgctgt ctacaggaag agcggcaccg 4140
tggactccct ggacgagatc ccaccacaga acaacaacgt gccacccagg caaggcttct 4200
cccacaggct gagccacgtg tccatgttcc gctccggctt cagcaacagc tccgtgagca 4260
tcatcagggc tccgatgttc tcctggatcc accgcagcgc tgagttcaac aacatcatcg 4320
cctccgacag catcacccaa atcccggccg tgaagggcaa cttcctcttc aacggttccg 4380
tcatttccgg cccaggcttc accggtggcg acctcgtgag gctcaacagc agcggcaaca 4440
acatccagaa caggggctac atcgaggtgc caatccactt cccatccacc tccaccaggt 4500
acagggtgcg cgtgaggtac gcttccgtga ccccgatcca cctcaacgtg aactggggta 4560
actcctccat cttctccaac accgtgccag ctaccgctac ctccctggac aacctccaat 4620
ccagcgactt cggttacttc gagagcgcca acgctttcac ctcctccctc ggtaacatcg 4680
tgggcgtgag gaacttcagc ggcaccgccg gcgtgatcat cgacaggttc gagttcatcc 4740
cagtgaccgc caccctcgag gctgagtgag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 4800
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 4860
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 4920
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 4980
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggcgcgcc aagggcgaat 5040
tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tcacgcgtat gcctgcagtg cagcgtgacc 5100
cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca 5160
catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta 5220
aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa 5280
tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac 5340
tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac 5400
ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt 5460
ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa 5520
actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa 5580
agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt 5640
cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca 5700
accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc 5760
gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc 5820
atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct 5880
cctctcacgg cacggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 5940
ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt 6000
tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 6060
caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc 6120
ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt 6180
gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc 6240
tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg 6300
cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt 6360
tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt 6420
tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct 6480
gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt 6540
catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 6600
atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt 6660
ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac 6720
ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag 6780
tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg 6840
atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat 6900
ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg 6960
catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct 7020
tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac 7080
tctagaatgt ggattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 7140
aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 7200
cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 7260
aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 7320
gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 7380
ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 7440
gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 7500
aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 7560
ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 7620
atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 7680
gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 7740
tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 7800
gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 7860
cgccttcttg acgagttctt ctgagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga 7920
ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag 7980
catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga 8040
gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat 8100
aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggc gcgccaaggg cgaattccag 8160
cacactggcg gccgttacta gtggatcgag ctcgcggccg ccccgggtac cgatatcagt 8220
actaattcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt 8280
gtttacacca caacccagca atgtgttatt aggttcagcg caggcaaccc agtcacgtca 8340
acctgggcga ccgatcctgg cgtggcgaca gcgccggcct agggcttcgc ctctccgtcg 8400
ccggtgatcc tgcatcggac gagccatggc acggcggccc ccgcgagagc ggcggcggtg 8460
caccggcatg ggcggcccac caatgcggcg gccctgctcg cctactgcac tgctgctgat 8520
gcgccgcccc tcgatctcgg cccatgcccg tatttgtgcc tgtgcccgtt ccatcagcta 8580
gggttacatc tcaatttccc gctctctatc tcgtcttcgt ctttcttcct catctgcaga 8640
tcctagctca gatttagtat tttttaaaat cctttgaagg attacc 8686
<210> 30
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 23的互补序列 (反向-互补)
<400> 30
cccagcaatg tgttattagg ttcagcgcag gcaacccagt cacgtcaacc tgggcgaccg 60
atcctggcgt ggcgacagcg ccggcctagg gcttcgcctc tccgtcgccg gtgatcctgc 120
atcggacgag ccatggcacg gcggcccccg cgagagcggc ggcggtgcac cggcatgggc 180
ggcccaccaa tgcggcggcc ctgctcgcct actgcactgc tgctgatgcg ccgcccctcg 240
atctcggccc atgcccgtat ttgtgcctgt gcccgttcca tcagctaggg ttacatctca 300
atttcccgct ctctatctcg tcttcgtctt tcttcctcat ctgcagatcc tagctcagat 360
ttagtatttt ttaaaatcct ttgaaggatt acc 393
<210> 31
<211> 911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 24的互补序列 (反向-互补)
<400> 31
gaacctcgtc cacacgttgg aaaccgcaag aaccgaccca taagtgaggt agctcaatga 60
catgcgcaat ccactagagt tgcctttaac gctctgccgg gaaaggcaca aaaacccctc 120
acaatcaccg ggaggtgacc aaaaataatc accaactctt gccacaactc atctgttgct 180
ccaagctgtc taggtggcgg tagccaccaa gagtaacaag aattccgcag ctcaaacgat 240
ccccaagtgc cactatatgc aaactcacaa gcaaatacac ttggaatcac tcaatctcac 300
tttggattca caaccaagca agagagatga gtgggaggaa gtatgcttag cttaagagga 360
tgtcaagatg atcaaaatac caagagaaaa ggcttggagc cgaccaaggt ctatttaaag 420
accccctctg aaaaaccaac cgttacgcag ctcgggggtg atcggactca tcgaccggac 480
tcagccccgt gtccggtcgt aacagtcgag caaccacgat gtgccacgtc acacgattca 540
aaactagccg ttaacagcca acgctttccc gcacacgtcg atgaccggac gcacagaata 600
aatgatcgga ctcagagggc tgcccgcgtt agatcgagtc tagtaagtgt ttttagcgcg 660
tgaatagtga ccagacacgt taggtcatcg gtgacctgac gcggcggtgt gtccggtcgt 720
cctccctctt ttctactcgc acccgcgacc attgacttga catgcaggtc acgctcggcc 780
agctacctcc gcgctcttct tcttcctccg tccgtccgtc gtgtgccctt ccctcgtgcc 840
gccccacgac ttccgccccg gagcgctgcc ctcttcctcc tcccaatggc gcctcagctg 900
cccccgctcg g 911
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 18的互补序列 (反向-互补)
<400> 32
gtttacacca caacccagca atgtgt 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 19的互补序列 (反向-互补)
<400> 33
tgcccccgct cggggctcgc cctcga 26
<210> 34
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (Cry1Ac 蛋白) - 截断cry1Ac蛋白(苏云金芽孢杆菌B. thurigiensis)
<400> 34
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn
450 455 460
Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn
465 470 475 480
Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly
485 490 495
Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly
500 505 510
Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg
515 520 525
Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn
530 535 540
Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr
545 550 555 560
Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala
565 570 575
Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe
580 585 590
Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val
595 600 605
Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu
610 615
<210> 35
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> nptII蛋白
<400> 35
Met Trp Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp
1 5 10 15
Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys
20 25 30
Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu
35 40 45
Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu
50 55 60
Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala
65 70 75 80
Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly
85 90 95
Glu Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu
100 105 110
Lys Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp
115 120 125
Pro Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg
130 135 140
Ala Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp
145 150 155 160
Glu Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys
165 170 175
Ala Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala
180 185 190
Cys Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile
195 200 205
Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu
210 215 220
Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg
225 230 235 240
Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala
245 250 255
Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260 265
<210> 36
<211> 7382
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 02的互补序列 (反向-互补)
<400> 36
ggctcgccct cgagtctaga gtcgacgagc tcctgcagcc atggacgcgt aagcttcgat 60
cgatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 120
tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 180
tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta 240
caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 300
aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc 360
cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 420
tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc 480
tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 540
tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat 600
taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc 660
cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga 720
agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac 780
cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc 840
cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc 900
ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac 960
cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 1020
atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct 1080
ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 1140
catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat 1200
gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 1260
cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 1320
tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 1380
gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 1440
cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat 1500
ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 1560
gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt 1620
ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg 1680
gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 1740
gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 1800
tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 1860
tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 1920
gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcactttt gtcgatgctc accctgttgt 1980
ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga atggacaaca acccaaacat caacgagtgc 2040
atcccataca actgcctgag caacccagag gtggaggtgc tgggtggcga gcgcatcgag 2100
accggttaca cccccatcga catctccctg tccttgaccc agttcctgct cagcgagttc 2160
gtgccaggtg ctggcttcgt gctcggcctg gtggacatca tctggggtat cttcggtcca 2220
tcccaatggg acgccttcct ggtgcaaatc gagcagctga tcaaccagag gatcgaagag 2280
ttcgccagga accaggccat ctccaggctg gagggcctga gcaacctcta ccaaatctac 2340
gccgagagct tcagggagtg ggaggccgac ccgaccaacc cagctctccg cgaggaaatg 2400
cgcattcaat tcaacgacat gaacagcgcc ctgaccaccg ctatcccact gttcgccgtc 2460
cagaactacc aagtgccgct cctgtccgtg tacgtgcaag ccgctaacct gcacctcagc 2520
gtgctgcgcg acgtgagcgt gttcggccaa aggtggggct tcgatgctgc caccatcaac 2580
agccgctaca acgacctgac caggctgatt ggcaactaca ccgaccacgc tgtgcgctgg 2640
tacaacaccg gcctggagcg cgtctggggt ccggactcca gggactggat caggtacaac 2700
cagttcagga gggagttgac cctcaccgtg ctggacattg tgtccctctt cccgaactac 2760
gactccagga cctacccgat ccgcaccgtg tcccaactca ccagggagat ctacaccaac 2820
ccagtgctgg agaacttcga cggtagcttc cgcggttccg cccagggtat cgagggctcc 2880
atcaggagcc cacacctgat ggacatcctg aacagcatca ccatctacac cgacgctcac 2940
aggggcgagt actactggtc cggccaccag atcatggcct ccccagtggg cttcagcggc 3000
cccgagttca ccttcccgct ctacggcacc atgggcaacg ccgctccaca gcaacgcatc 3060
gtggctcaac tgggtcaggg tgtctacagg accctgtcct ccaccctgta caggaggccc 3120
ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcaactg tccgtgctcg acggcaccga gttcgcctac 3180
ggcacctcct ccaacctgcc atccgctgtc tacaggaaga gcggcaccgt ggactccctg 3240
gacgagatcc caccacagaa caacaacgtg ccacccaggc aaggcttctc ccacaggctg 3300
agccacgtgt ccatgttccg ctccggcttc agcaacagct ccgtgagcat catcagggct 3360
ccgatgttct cctggatcca ccgcagcgct gagttcaaca acatcatcgc ctccgacagc 3420
atcacccaaa tcccggccgt gaagggcaac ttcctcttca acggttccgt catttccggc 3480
ccaggcttca ccggtggcga cctcgtgagg ctcaacagca gcggcaacaa catccagaac 3540
aggggctaca tcgaggtgcc aatccacttc ccatccacct ccaccaggta cagggtgcgc 3600
gtgaggtacg cttccgtgac cccgatccac ctcaacgtga actggggtaa ctcctccatc 3660
ttctccaaca ccgtgccagc taccgctacc tccctggaca acctccaatc cagcgacttc 3720
ggttacttcg agagcgccaa cgctttcacc tcctccctcg gtaacatcgt gggcgtgagg 3780
aacttcagcg gcaccgccgg cgtgatcatc gacaggttcg agttcatccc agtgaccgcc 3840
accctcgagg ctgagtgaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 3900
cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 3960
ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 4020
caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 4080
tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggcgcgcca agggcgaatt ccagcacact 4140
ggcggccgtt actagtggat cacgcgtatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 4200
ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 4260
tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 4320
acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 4380
aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 4440
atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 4500
ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 4560
tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 4620
attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 4680
attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 4740
tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 4800
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 4860
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 4920
gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 4980
acggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg 5040
taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac 5100
acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc 5160
gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt 5220
agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc 5280
gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac 5340
ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc 5400
gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc 5460
aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg 5520
tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta 5580
cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga 5640
attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt 5700
actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg 5760
gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt 5820
attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga 5880
tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca 5940
tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata 6000
aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca 6060
gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt 6120
cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ctagaatgtg 6180
gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg 6240
ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc 6300
gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca 6360
ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct 6420
cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga 6480
tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg 6540
gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat 6600
cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga 6660
gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg 6720
cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg 6780
ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat 6840
agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct 6900
cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga 6960
cgagttcttc tgagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 7020
tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 7080
taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 7140
atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 7200
cgcggtgtca tctatgttac tagatcggcg cgccaagggc gaattccagc acactggcgg 7260
ccgttactag tggatcgagc tcgcggccgc cccgggtacc gatatcagta ctaattcagt 7320
acattaaaaa cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac 7380
aa 7382
<210> 37
<211> 7588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 05的互补序列 (反向-互补)
<400> 37
cgtccgtccg tcgtgtgccc ttccctcgtg ccgccccacg acttccgccc cggagcgctg 60
ccctcttcct cctcccaatg gcgcctcagc tgcccccgct cggggctcgc cctcgagtct 120
agagtcgacg agctcctgca gccatggacg cgtaagcttc gatcgatgcc tgcagtgcag 180
cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa 240
attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat 300
atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt 360
tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag tattttgaca 420
acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata 480
gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta 540
atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta gcctctaaat 600
taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat aaaatagaat 660
aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa 720
catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac gagtctaacg 780
gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat 840
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tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc 960
tcctcctcct ctcacggcac ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt 1020
tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc 1080
gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc 1140
tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc tctctacctt ctctagatcg 1200
gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc 1260
cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga 1320
cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc 1380
cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt 1440
gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc 1500
ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta 1560
gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat 1620
acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata 1680
catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg 1740
atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc 1800
aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag 1860
ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt 1920
tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag 1980
tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg 2040
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catctccagg ctggagggcc tgagcaacct ctaccaaatc tacgccgaga gcttcaggga 2460
gtgggaggcc gacccgacca acccagctct ccgcgaggaa atgcgcattc aattcaacga 2520
catgaacagc gccctgacca ccgctatccc actgttcgcc gtccagaact accaagtgcc 2580
gctcctgtcc gtgtacgtgc aagccgctaa cctgcacctc agcgtgctgc gcgacgtgag 2640
cgtgttcggc caaaggtggg gcttcgatgc tgccaccatc aacagccgct acaacgacct 2700
gaccaggctg attggcaact acaccgacca cgctgtgcgc tggtacaaca ccggcctgga 2760
gcgcgtctgg ggtccggact ccagggactg gatcaggtac aaccagttca ggagggagtt 2820
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cgacggtagc ttccgcggtt ccgcccaggg tatcgagggc tccatcagga gcccacacct 3000
gatggacatc ctgaacagca tcaccatcta caccgacgct cacaggggcg agtactactg 3060
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gctctacggc accatgggca acgccgctcc acagcaacgc atcgtggctc aactgggtca 3180
gggtgtctac aggaccctgt cctccaccct gtacaggagg cccttcaaca tcggtatcaa 3240
caaccagcaa ctgtccgtgc tcgacggcac cgagttcgcc tacggcacct cctccaacct 3300
gccatccgct gtctacagga agagcggcac cgtggactcc ctggacgaga tcccaccaca 3360
gaacaacaac gtgccaccca ggcaaggctt ctcccacagg ctgagccacg tgtccatgtt 3420
ccgctccggc ttcagcaaca gctccgtgag catcatcagg gctccgatgt tctcctggat 3480
ccaccgcagc gctgagttca acaacatcat cgcctccgac agcatcaccc aaatcccggc 3540
cgtgaagggc aacttcctct tcaacggttc cgtcatttcc ggcccaggct tcaccggtgg 3600
cgacctcgtg aggctcaaca gcagcggcaa caacatccag aacaggggct acatcgaggt 3660
gccaatccac ttcccatcca cctccaccag gtacagggtg cgcgtgaggt acgcttccgt 3720
gaccccgatc cacctcaacg tgaactgggg taactcctcc atcttctcca acaccgtgcc 3780
agctaccgct acctccctgg acaacctcca atccagcgac ttcggttact tcgagagcgc 3840
caacgctttc acctcctccc tcggtaacat cgtgggcgtg aggaacttca gcggcaccgc 3900
cggcgtgatc atcgacaggt tcgagttcat cccagtgacc gccaccctcg aggctgagtg 3960
agatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4020
gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4080
catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4140
cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4200
tatgttacta gatcggcgcg ccaagggcga attccagcac actggcggcc gttactagtg 4260
gatcacgcgt atgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga 4320
gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa 4380
gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta 4440
tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc 4500
taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat 4560
gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag 4620
tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta 4680
ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt 4740
taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt 4800
taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg 4860
ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg 4920
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cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag 5040
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ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc 5220
tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc 5280
ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta 5340
cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt 5400
acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt 5460
tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt 5520
tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact 5580
tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt 5640
tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 5700
ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 5760
gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 5820
gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 5880
ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 5940
atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 6000
gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 6060
tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 6120
attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 6180
ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 6240
cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg actctagaat gtggattgaa caagatggat 6300
tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac 6360
agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc 6420
tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc 6480
tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 6540
cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc 6600
ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 6660
atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 6720
ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 6780
cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga 6840
cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca 6900
tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg 6960
atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 7020
ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagatc 7080
gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 7140
ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 7200
cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 7260
tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 7320
tactagatcg gcgcgccaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac tagtggatcg 7380
agctcgcggc cgccccgggt accgatatca gtactaattc agtacattaa aaacgtccgc 7440
aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaacccag caatgtgtta 7500
ttaggttcag cgcaggcaac ccagtcacgt caacctgggc gaccgatcct ggcgtggcga 7560
cagcgccggc ctagggcttc gcctctcc 7588
<210> 38
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 03的互补序列 (反向-互补)
<400> 38
ctcgcggccg ccccgggtac cgatatcagt actaattcag tacattaaaa acgtccgcaa 60
tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caacccagca atgtgttatt 120
aggttcagcg caggcaaccc agtcacgtca acctgggcga ccgatcctgg cgtggcgaca 180
gcgccggcct agggcttcgc ctctcc 206
<210> 39
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 04的互补序列 (反向-互补)
<400> 39
cgtccgtccg tcgtgtgccc ttccctcgtg ccgccccacg acttccgccc cggagcgctg 60
ccctcttcct cctcccaatg gcgcctcagc tgcccccgct cggggctcgc cctcgagtct 120
agagtcgacg agctcctgca gccatggacg cgtaagcttc gatcgatgcc tgcagtgcag 180
cgtgacccgg tcgtgcccct ctctag 206
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 40
gaggtgccaa tccacttccc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 41
gagttacccc agttcacgtt gag 23
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 42
acctccacca ggtacag 17
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 43
tgccgaatat catggtggaa 20
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 44
cggccacagt cgatgaatc 19
<210> 45
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 45
tggccgcttt tct 13
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 46
gccgcttgta gccttcca 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
ccgccgacct ggtgga 16
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 48
cgtgacctca atgcg 15
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 49
cacaatcgtc acctcaaccg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 50
atcaacgacc ttctggaaac g 21
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 51
cgcaggattt cgctctcg 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 52
tttgacaaca ggactctac 19
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 53
tgcaatgctc attatctcta g 21
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 54
tagcttcacc tatataatac ttc 23
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 55
tgcactgcag gcatcgatc 19
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 56
tcgtcgactc tagactcgag 20
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 57
gataatgcca gcctgttaaa c 21
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
ggtaatcctt caaaggattt taaaaaatac 30
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 59
agatagagag cgggaaattg agatgtaac 29
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
tcgtccgatg caggatcac 19
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
ggttgacgtg actgggttg 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 62
gttgacgtga ctgggttgc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 63
ggccgttact agtggatcg 19
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 64
gccgttacta gtggatcgag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
caacaaccca aacatcaacg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
atggctgcag gagctcgtcg actcta 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
cgtcggtgta gatggtgatg 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
tgatgcatat acagagatgc ttttt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
ttcatccatt ttattagtac atcca 25
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
acggatgcga cctgtacg 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
tcagtaaaac ccacatcaac 20
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
gaccacatca tcacaaccaa g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
gctccgaaca acacgaggtt g 21
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
atgaagtatt atataggtga ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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agaggctatt cggctatgac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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cagccgaact gttcgccagg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 77
agcacgagga agcggtcagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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tgagatgaca ggagatcctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 79
caacagctcc gtgagcatca tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 80
ccagcgactt cggttacttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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ctctcggcgt agatttggta g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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cagaacaaca acgtgccacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 83
agcatcacca tctacaccga c 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 84
gatccaggag aacatcggag c 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 85
gtcactggga tgaactcgaa c 21
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 86
gggtcctgta gacaccctga 20
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 87
gctcaccctg ttgtttggtg tt 22
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 88
ctgtcggcat ccagaaattg 20
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 89
tcccctcggg atcaaagta 19
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 90
tagcgtgttt gtgcttttgc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 91
ggccgctgaa attaaatcaa 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 92
gagtcagtga gcgaggaagc 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 93
cggtgaaaac ctctgacaca 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 94
atacaggcag cccatcagtc 20

Claims (43)

1.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少14个连续的核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少15个连续的核苷酸。
3.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18的至少16个连续的核苷酸。
4.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:18。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13。
6.一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少14个连续的核苷酸。
7.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少15个连续的核苷酸。
8.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19的至少16个连续的核苷酸。
9.权利要求6的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:19。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:12。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:22。
13.包含正向引物和反向引物的引物对，其中正向引物包括SEQ ID NO:6且反向引物包括SEQ ID NO:7，或正向引物包括SEQ ID NO:8且反向引物包括SEQ ID NO:9。
14.一种检测来自事件CTC79005-2的转基因甘蔗的植物材料的方法，包括以下步骤：
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA；
c)提供包含至少一个正向和一个反向引物的引物对；
d)扩增引物对之间的区域；并且
e)检测扩增产物的存在。
15.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸。
16.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一对引物由包含选自SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。
17.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其至少一对引物包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸。
18.权利要求14的方法，其中步骤c)中的引物对被设计为与包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:37的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合，其中至少一个引物对由包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的序列的连续的核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:36的序列的连续的核苷酸的第二引物组成。
19.权利要求14的方法，其中正向引物包含SEQ ID NO:6且反向引物包含SEQ ID NO:7，或正向引物包含SEQ ID NO:8且反向引物包含SEQ ID NO:9。
20.权利要求14的方法，其中扩增产物包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
21.权利要求14的方法，其中扩增产物的检测是通过包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针杂交进行的。
22.一种检测来自事件CTC79005-2的转基因甘蔗的材料的方法，包括以下步骤：
a)获得用于分析的植物材料样品；
b)从样品中提取DNA或RNA；
c)提供一种探针或提供探针的组合，其设计成与多核苷酸结合，该多核苷酸包含选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO 38和SEQ ID NO:39组成的组的序列的连续的核苷酸；
d)将所述探针与样品杂交；并且
e)检测探针的实际杂交。
23.一种检测来自包含Cry1Ac蛋白(事件CTC79005-2)的转基因甘蔗的材料的试剂盒，其包含用于检测多核苷酸的存在的工具，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18和/或SEQ IDNO.19的至少14个连续的核苷酸，和/或杀虫晶体蛋白(Cry)。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述工具包含设计成与包含选自SEQ ID NO:22和SEQID NO:29的序列的连续的核苷酸的多核苷酸结合的引物对，其中至少一对引物包含选自由SEQ ID NO.23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的组的连续的核苷酸序列。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述工具包含含有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的探针。
26.基因构建体，其包含SEQ ID NO:1。
27.基因构建体，其包含SEQ ID NO:2。
28.权利要求26或27的基因构建体，其包含SEQ ID NO:14。
29.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。
30.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
31.一种转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22，其中所述植物是抗虫的。
32.来自权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述植物部分、植物细胞、植物组织或种子包含SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19。
33.权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的组织培养物。
34.从权利要求33的组织培养物再生的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中再生的植物包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19。
35.来自权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的植物、植物细胞、植物部分或种子的用途，其中这样的用途意在再生植物、生产种子、种植植物田或加工制造植物产品。
36.一种商品产品，由权利要求29的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物生产。
37.一种产生事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括以下步骤：
a)将包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的基因构建体引入农杆菌菌株中；
b)从甘蔗(Saccharum spp.)的未成熟叶卷或顶部茎秆中获得胚性愈伤组织；
c)将胚性愈伤组织与农杆菌培养物共培养；
d)在含有氨基糖苷类抗生素的培养基中选择含有功能片段的经转化细胞；以及
e)再生经转化的甘蔗植物，其中转基因甘蔗植物包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
38.权利要求37的转基因甘蔗植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
39.一种生产抗虫甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括将第一甘蔗植物与第二甘蔗植物杂交，其中第二甘蔗植物是权利要求29的植物，并由此生产子代甘蔗植物。
40.一种由权利要求39的方法生产的甘蔗(Saccharum spp.)植物和来自所述植物的植物部分、植物细胞、植物组织或种子。
41.一种制造事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括引入包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的基因修饰到甘蔗(Saccharum spp.)植物，以产生事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中所述转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物与未进行转基因的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比具有提高的抗虫性。
42.一种培育CTC79005-2事件的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的方法，包括在包含昆虫侵染的条件下种植包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22的事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，其中，与在相同条件下种植的未进行遗传修饰的甘蔗(Saccharum spp.)植物相比，该转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物的抗虫性增加。
43.一种事件CTC79005-2的转基因甘蔗(Saccharum spp.)植物，包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22。
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