CN114574458B

CN114574458B - 可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体

Info

Publication number: CN114574458B
Application number: CN202210187146.6A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 童颖佳; 高松; 徐沙; 陈坚; 余世琴; 曾伟主; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2042-02-28
Also published as: CN114574458A

Abstract

本发明公开了一种查尔酮合成酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供了一系列有助于柚皮素积累量提高的查尔酮合成酶突变体。在适当的培养条件下，突变体A308K、A308R、S208N、S208C、E61K、E61R、E61A、E61T、E61C、A308K‑S208N、A308K‑E61K和S208N‑E61K查尔酮合成酶合成柚皮素的产量分别为野生酶的1.41倍、1.24倍、1.44倍、1.28倍、1.30倍、1.10倍、1.17倍、1.09倍、1.11倍、1.05倍、1.23倍和1.23倍。

Description

可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体

技术领域

本发明涉及可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoids)是一类由中央三碳联结两个具有酚羟基苯环的植物次级代谢产物，在植物界广泛存在。该类化合物以C6-C3-C6结构为基础，根据三碳键(C3)的氧化程度和构象的差别分为以下几类：黄酮、黄酮醇、黄烷酮(二氢黄酮)、黄烷酮醇(二氢黄酮醇)、异黄酮、异黄烷酮(二氢异黄酮)、查耳酮、二氢查耳酮、黄烷、黄烷醇及其他黄酮类等。其在植物体内通常与糖类结合形成配基形式的苷类，少部分以游离态的苷元形式存在。黄酮类化合物不仅在植物的生长发育中起着重要作用，而且还具有抗菌、抗氧化自由基、抗衰老、抗心脑血管疾病、保肝等药理活性。因此，黄酮类化合物的研究一直是国内外生物医药领域研究的热门课题。

在植物中，黄酮类化合物的生物合成途径始于苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂酸4-羟化酶(C4H)催化L-苯丙氨酸合成对香豆酸，或始于酪氨酸解氨酶(TAL)催化L-酪氨酸转化为对香豆酸。随后，4-羟基肉桂酸-CoA连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)将对香豆酸转化为柚皮素。柚皮素作为平台化合物，通过一系列衍生反应，如甲氧基化、羟基化、糖基化和异戊烯基化等可以合成各种高附加值黄酮类化合物。在柚皮素合成途径的4种酶中，催化1分子对香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A合成一分子查尔酮柚皮素的查尔酮合成酶已经被证实是其中的关键限速步骤。提高查尔酮合成酶的拷贝数或者是表达强度均能显著提高柚皮素的产量。

对于限速酶，提高其拷贝数或者表达量有可能会增加宿主菌代谢负担从而影响菌体的生长和产物的合成。通过定点突变技术提高酶的催化效率可以在不影响菌体生长前提下提高途径效率。CaoWeijia等(《Enhanced pinocembrin production in Escherichiacoli by regulating cinnamic acid metabolism》，公开日2016年)通过定点突变查尔酮合成酶提高了生松素的产量，但是截至目前，通过定向进化查尔酮合成酶提高柚皮素的产量仍未见报道。

发明内容

为提高柚皮素的产量，本发明利用基因工程和酶工程的手段，将来源于Sophorajaponica的查尔酮合成酶的第61位、208位和308位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体，并进行发酵验证，制备出了可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体，为发酵法高产柚皮素提供了高效酶元件。

本发明提供了查尔酮合成酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的查尔酮合成酶为亲本，分别将下述位点进行取代得到(a)～(f)的突变体：

(a)所述突变体是将第308位置的丙氨酸取代为赖氨酸或者精氨酸，突变体命名为A308K和A308R；

(b)所述突变体是将第208位置的丝氨酸取代为天冬酰胺或者半胱氨酸，突变体命名为S208N和S208C；

(c)所述突变体是将第61位置的谷氨酸取代为赖氨酸或者精氨酸或者丙氨酸或者苏氨酸或者半胱氨酸，突变体分别命名为E61K、E61R、E61A、E61T和E61C；

(d)所述突变体是将第308位置的丙氨酸取代为赖氨酸，将第208位置的丝氨酸取代为天冬酰胺，突变体命名为A308K-S208N；

(e)所述突变体是将第308位置的丙氨酸取代为赖氨酸，将第61位置的谷氨酸取代为赖氨酸，突变体命名为A308K-E61K；

(f)所述突变体是将第208位置的丝氨酸取代为天冬酰胺，将第61位置的谷氨酸取代为赖氨酸，突变体命名为S208N-E61K。

在一种实施方式中，所述查尔酮合成酶来源于Sophora japonica。

在一种实施方式中，编码所述查尔酮合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的重组载体。

在一种实施方式中，所述重组载体包括但不限于pY26系列。

本发明提供了表达所述突变体，或携带所述基因，或含有所述重组载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括原核微生物和真核微生物。

在一种实施方式中，所述微生物细胞的出发菌株包括酿酒酵母。

优选地，以酿酒酵母YJ1为出发菌株，所述酿酒酵母YJ1是在酿酒酵母CEN.PK2-1D中敲除了GAL80基因，并在其基因组整合表达4-香豆酰辅酶A连接酶和查尔酮异构酶；所述4-香豆酰辅酶A连接酶的NCBI登录号为KF765780.1，所述查尔酮异构酶的NCBI登录号为P28012.1；所述GAL80基因的Gene ID：854954。

在一种实施方式中，将整合表达4-香豆酰辅酶A连接酶和查尔酮异构酶的pY26-aro10UD-P_GAL1-Pc4CL-P_GAL7-MsCHI-TRP1质粒整合至敲除了GAL80基因的酿酒酵母的aro10位点。

在一种实施方式中，所述pY26-aro10UD-P_GAL1-Pc4CL-P_GAL7-MsCHI-TRP1质粒公开于文献《Improving(2S)-naringenin production by exploring native precursorpathways and screening higher-active chalcone synthases from plants rich inflavonoids》中。

在一种实施方式中，所述aro10的Gene ID：851987。

本发明提供了一种生产柚皮素的方法，利用所述的微生物细胞转化对香豆酸生产柚皮素。

在一种实施方式中，将所述微生物细胞的单菌落在不含尿嘧啶的YNB培养基中，在220rpm培养培养20～24h得到菌液，将菌液按照1～5％(v/v)的量转接至YPD培养基，并向YPD培养基中添加200～250mg/L对香豆酸。

在一种实施方式中，在28～35℃、220rpm下培养不少于60h。

优选地，培养不少于72h。

本发明提供了所述查尔酮合成酶突变体，或所述基因，或所述微生物细胞在制备柚皮素、柚皮素衍生物或含有柚皮素的产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以槐米(Sophora japonica)中查尔酮合成酶为出发基因，通过定点突变技术改变查尔酮合成酶氨基酸序列，最终获得12株能提升柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体A308K、A308R、S208N、S208C、E61K、E61R、E61A、E61T、E61C、A308K-S208N、A308K-E61K和S208N-E61K。通过对表达查尔酮合成酶突变体的菌株进行发酵，柚皮素产量达到165.33mg/L、145.11mg/L、168.98mg/L、149.87mg/L、152.82mg/L、129.24mg/L、137.49mg/L、128.75mg/L、130.05mg/L、123.92mg/L、143.96mg/L和143.71mg/L，分别为表达野生型查尔酮合成酶菌株的1.41倍、1.24倍、1.44倍、1.28倍、1.30倍、1.10倍、1.17倍、1.09倍、1.11倍、1.05倍、1.23倍和1.23倍。

附图说明

图1为定点突变改造的查尔酮合成酶表达载体(pY26-SjCHS1)构建图。

图2为查尔酮合成酶突变体A308K、A308R、S208N、S208C、E61K、E61R、E61A、E61T、E61C与野生型查尔酮合成酶积累柚皮素的比较图。

图3为查尔酮合成酶突变体A308K-S208N、A308K-E61K和S208N-E61K与野生型查尔酮合成酶积累柚皮素的比较图。

图4为将第308位的丙氨酸突变为其他17种氨基酸的查尔酮合成酶突变体合成酶积累柚皮素的产量图。

图5为将第208位的丝氨酸突变为其他17种氨基酸的查尔酮合成酶突变体合成酶积累柚皮素的产量图。

图6为将第61位的谷氨酸突变为其他17种氨基酸的查尔酮合成酶突变体合成酶积累柚皮素的产量图。

具体实施方式

1、培养基及试剂

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。加入20g/L琼脂粉，以配制YPD固体培养基。

YNB培养基：酵母氮源基础培养基1.74g/L(不含硫酸铵)，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，氨基酸(5g/L尿嘧啶，10g/L色氨酸，10g/L亮氨酸，10g/L组氨酸，根据需要适当缺失相应氨基酸)。

2、底盘细胞YJ1的构建

基于酿酒酵母CEN.PK2-1D构建敲除GAL80的底盘细胞(GAL80涉及半乳糖代谢调控，敲除之后可以组成型表达GAL7启动子，而不需要诱导表达)；利用酵母同源重组的原理敲除GAL80(Gene ID：854954)，以G418为筛选标记，构建得底盘细胞C800，具体构建过程见文献Promoter-Library-Based Pathway Optimization for Efficient(2S)-NaringeninProduction From p-Coumaric Acid in Saccharomyces cerevisiae,Song Gao,Hengruizhou,Jingwen Zhou,Jian chen.J Agric Food Chem,2020Jun 24。

基于酿酒酵母C800构建底盘细胞YJ1；利用酵母同源重组的原理将pY26-aro10UD-P_GAL1-Pc4CL-P_GAL7-MsCHI-TRP1(《Improving(2S)-naringenin production by exploringnative precursor pathways and screening higher-active chalcone synthases fromplants rich in flavonoids》，公开日2021年)整合至酿酒酵母C800基因组的aro10位点，所述aro10的Gene ID：851987；以TRP为筛选标记，构建得底盘细胞YJ1。

3、柚皮素的HPLC检测

利用色谱柱(250×4.6mm，5μm，Thermo-Fisher，MA，USA)，在40℃检测条件用日本岛津的SPD-20A检测器，流动相以含0.1％的三氟乙酸的水溶液(A)和含0.1％的三氟乙酸的乙腈(B)，1mL/min的流速洗脱，检测波长290nm，洗脱条件为0-10min，90％-60％ A；10-15min，60％-40％A；15-17min，40％-90％ A；17-25min，90％ A。

实施例1：重组质粒pY26-SjCHS1的构建及表达

(1)重组质粒pY26-SjCHS1的构建

来源于Sophora japonica的查尔酮合成酶1具有催化3分子对香豆酰辅酶A和1分子丙二酰辅酶A合成1分子查尔酮柚皮素的能力，密码子优化后最终获得核苷酸序列如SEQID NO.2所示，构建于pY26质粒上，命名为pY26-SjCHS1，由苏州金唯智公司合成。

(2)查尔酮合成酶的表达

将测序正确的质粒用醋酸锂化学转化法转化至酿酒酵母YJ1中，在不含尿嘧啶的YNB平板上，30℃培养3天，至长出单菌落；挑取单菌落于不含尿嘧啶的YNB培养基中，220rpm培养24h；然后按照1％(v/v)的量转接于YPD培养基中，并添加250mg/L对香豆酸，在30℃下培养72h取样液相检测柚皮素产量，结果显示，柚皮素产量为74.36mg/L。

实施例2：查尔酮合成酶单突变体制备及表达

(1)突变体的制备

根据pY26-SjCHS1质粒序列，分别设计并合成引入A308K、A308R、S208N、S208C、E61K、E61R、E61A、E61T和E61C突变的引物，对查尔酮合成酶的基因序列进行定点突变，分别测序确认查尔酮合成酶突变体的编码基因是否正确，得到单突变查尔酮合成酶；将携带突变体基因的载体导入酿酒酵母YJ1中进行表达。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用PCR技术，以携带编码野生型查尔酮合成酶基因的表达载体pY26-SjCHS1质粒为模板，进行PCR扩增，引物对如下(大写字母为突变碱基)：

引入A308K突变的定点突变引物对F1/R1为：

F1：gctcatccaggtggtcccAAAattctagatcaag，

R1：gggaccacctggatgagctacccag；

引入A308R突变的定点突变引物对F2/R2为：

F2：gtagctcatccaggtggtcccAGAattctagatcaagtcgaag，

R2：cttcgacttgatctagaatTCTgggaccacctggatgagctac；

引入S208N突变的定点突变引物对为F3/R3：

F3：agtgatactcacttggatAATttggtgggccaag，

R3：tccaagtgagtatcactaggaccacgaaaggtcacc；

引入S208C突变的定点突变引物对为F4/R4：

F4：agtgatactcacttggatTGTttggtgggccaagc，

R4：atccaagtgagtatcactaggaccacgaaag；

引入E61K突变的定点突变引物对为F5/R5：

F5：gaaaagttcaagcgtatgtgcAAAaaatctatgataaagaagag，

R5：ctcttctttatcatagatttTTTgcacatacgcttgaacttttc；

引入E61R突变的定点突变引物对为F6/R6：

F6：gaaaagttcaagcgtatgtgcAGAaaatctatgataaagaagag，

R6：ctcttctttatcatagatttTCTgcacatacgcttgaacttttc；

引入E61A突变的定点突变引物对为F7/R7：

F7：aagttcaagcgtatgtgcGCTaaatctatgataaag，

R7：gcacatacgcttgaacttttcctttaggtct；

引入E61T突变的定点突变引物对为F8/R8：

F8：aagttcaagcgtatgtgcACTaaatctatgataaag，

R8：gcacatacgcttgaacttttcctttaggtct；

引入E61C突变的定点突变引物对为F9/R9：

F9：aagttcaagcgtatgtgcTGTaaatctatgataaag，

R9：gcacatacgcttgaacttttcctttaggtct。

PCR体系为：25μL 2×Phanta Max Master Mix，1μL正向引物(10μmol·L^-1)，1μL反向引物(10μmol·L^-1)，1μL模板DNA，加入蒸馏水至50μL。查尔酮合成酶PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入30个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸5min；最后72℃延伸5min，4℃保温。

(2)突变体的表达

将测序正确的突变体质粒用醋酸锂化学转化法转化至酿酒酵母YJ1中，在不含尿嘧啶的YNB平板上，30℃培养3天，至长出单菌落；挑取单菌落于不含尿嘧啶的YNB培养基中，220rpm培养24h得到活化菌液；将活化的菌液按照1％(v/v)转接于YPD培养基中，并添加250mg/L对香豆酸，72h取样液相检测柚皮素产量。

结果显示表达包含突变体A308K、A308R、S208N、S208C、E61K、E61R、E61A、E61T和E61C查尔酮合成酶突变体质粒的菌株柚皮素的产量分别为165.33mg/L、145.11mg/L、168.98mg/L、149.87mg/L、152.82mg/L、129.24mg/L、137.49mg/L、128.75mg/L和130.05mg/L，柚皮素产量分别为表达野生型查尔酮合成酶菌株的1.41倍、1.24倍、1.44倍、1.28倍、1.30倍、1.10倍、1.17倍、1.09倍和1.11倍。

实施例3：查尔酮合成酶双突变体的制备及表达

(1)突变体A308K-S208N的制备

以实施例2构建的突变体A308K为初始模板，并利用实施例2设计的S208N突变的引物，利用PCR技术(方法如实施例2中所述)，对携带有编码突变体A308K基因的质粒进行定点突变，构建突变体A308K-S208N。并通过测序确认查尔酮合成酶A308K-S208N突变体是否正确。

(2)突变体A308K-E61K的制备

以实施例2构建的突变体A308K为初始模板，并利用实施例2设计的E61K突变的引物，利用PCR技术(方法如实施例2中所述)，对携带有编码突变体A308K基因的质粒进行定点突变，构建突变体A308K-E61K。并通过测序确认查尔酮合成酶A308K-E61K突变体是否正确。

(3)突变体S208N-E61K的制备

以实施例2构建的突变体S208N为初始模板，并利用实施例2设计的E61K突变的引物，利用PCR技术(方法如实施例2中所述)，对携带有编码突变体S208N基因的质粒进行定点突变，构建突变体S208N-E61K。并通过测序确认查尔酮合成酶S208N-E61K突变体是否正确。

(4)突变体的表达

突变体表达过程如实施例1中查尔酮合成酶的表达所述。结果显示表达包含突变体A308K-S208N、A308K-E61K和S208N-E61K查尔酮合成酶突变体质粒的菌株柚皮素的产量分别为123.92mg/L、143.96mg/L和143.71mg/L。

对比例1

具体实施方式参见实施例2，区别在于，将第308位的丙氨酸突变为其余17中氨基酸，分别构建得到突变体A308N、A308D、A308C、A308Q、A308E、A308G、A308H、A308I、A308L、A308M、A308F、A308P、A308S、A308T、A308W、A308Y、A308V；

同样的，将第208位的丝氨酸突变为其余17个氨基酸，分别构建得到突变体S208N、A208D、A208R、A208Q、A208E、A208G、A208H、A208I、A208L、A208M、A208F、A208P、A208S、A208T、A208W、A208Y、A208V；

将第61位的谷氨酸突变为其余14个氨基酸，分别构建得到突变体E61N、A308D、E61Q、E61G、E61H、E61I、E61L、E61M、E61F、E61P、E61S、E61W、E61Y、E61V。

将上述构建得到的突变体按照实施例2中的方法进行突变体的表达，72h检测发酵液中的柚皮素的含量，结果如图4、图5、图6所示，发酵所得的柚皮素含量均低于原始酶。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> BAA220031A

<130> 可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> Sophora japonica

<400> 1

Met Val Thr Val Glu Glu Ile Arg Asn Ala Gln Arg Ser Gln Gly Pro

1 5 10 15

Ala Thr Ile Leu Ala Phe Gly Thr Ala Thr Pro Ser Asn Cys Ile Thr

20 25 30

Gln Ala Asp Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Asp Ser Glu His

35 40 45

Met Thr Asp Leu Lys Glu Lys Phe Lys Arg Met Cys Glu Lys Ser Met

50 55 60

Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Val Thr Glu Glu Phe Leu Lys Glu Asn

65 70 75 80

Pro Asn Met Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Val Arg Gln Asp

85 90 95

Ile Val Val Val Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Ser Lys

100 105 110

Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val

115 120 125

Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Leu Met Met Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp

165 170 175

Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu

180 185 190

Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Asp Thr His Leu Asp Ser

195 200 205

Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Met Ile Ile

210 215 220

Gly Ala Asp Pro Asp Thr Ala Val Glu Arg Pro Ile Phe Gln Leu Val

225 230 235 240

Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp Gly

245 250 255

His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val Pro

260 265 270

Gly Ile Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe Ala

275 280 285

Pro Val Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp Val Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Ala Lys Leu Gly Leu Lys

305 310 315 320

Glu Glu Lys Leu Arg Ser Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Ser Val Glu Glu Gly Arg Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val Leu

370 375 380

His Ser Val Pro Leu Gln Gly

385 390

<210> 2

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtcaccg ttgaagaaat taggaatgcc caacgttccc aaggacctgc caccattctt 60

gcgtttggca cggctacccc ctctaactgc attacccaag cagactatcc agattactat 120

tttcgtatta ccgattccga gcacatgaca gacctaaagg aaaagttcaa gcgtatgtgc 180

gagaaatcta tgataaagaa gagatatatg catgtaactg aggagtttct gaaggaaaac 240

cccaacatgt gtgcttacat ggctccttca ctagatgtta gacaagacat cgtagttgta 300

gaggtaccta agttgggtaa agaggcagcg agtaaggcaa taaaggagtg ggggcaaccc 360

aagtccaaga ttacacacct tgttttttgc acaactagtg gggtagacat gccaggtgct 420

gattatcagc taaccaagtt gcttggtcta aggccgtcag taaagaggct tatgatgtat 480

caacaaggat gcttcgcagg aggaaccgtg cttaggcttg caaaagacct tgccgagaac 540

aacaagggtg cgagagtatt ggttgtttgt tcagagatca cggcggtgac ctttcgtggt 600

cctagtgata ctcacttgga tagcttggtg ggccaagccc tattcggaga tggagcagct 660

gcaatgataa ttggcgcgga cccggatacc gctgtcgaga ggcctatctt ccagttggtt 720

tcagctgctc aaaccatttt acctgattcc gacggtgcga tcgacggtca tctgagggaa 780

gtcggactaa ccttccatct attgaaagac gtccctggaa ttatctcaaa gaacatagaa 840

aaatcactgg ttgaggcttt tgcgcccgtt ggaatttcag actggaacag tatattctgg 900

gtagctcatc caggtggtcc cgcgattcta gatcaagtcg aagccaaact aggactaaaa 960

gaggagaaac ttaggtcaac taggcacgta ctatcagaat atgggaatat gagtagcgcg 1020

tgtgtactat ttatcttgga cgaaatgagg aaaaaatctg tcgaggaggg cagggccacg 1080

actggtgaag gcctggaatg gggagtttta tttgggtttg ggccaggttt gacagtggag 1140

accgtagttc tgcattcagt tcccctacag gggtaa 1176

Claims

1. 查尔酮合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的查尔酮合成酶为亲本，分别将下述位点进行取代得到（a）~（f）中的任一种突变体：

（a）所述突变体是将第308位置的丙氨酸取代为赖氨酸或者精氨酸；

（b）所述突变体是将第208位置的丝氨酸取代为天冬酰胺或者半胱氨酸；

（c）所述突变体是将第61位置的谷氨酸取代为赖氨酸或者精氨酸或者丙氨酸或者苏氨酸或者半胱氨酸；

（d）所述突变体是将第308位置的丙氨酸取代为赖氨酸，将第208位置的丝氨酸取代为天冬酰胺；

（e）所述突变体是将第308位置的丙氨酸取代为赖氨酸，将第61位置的谷氨酸取代为赖氨酸；

（f）所述突变体是将第208位置的丝氨酸取代为天冬酰胺，将第61位置的谷氨酸取代为赖氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.表达权利要求1所述的突变体，或携带权利要求2所述基因，或含有权利要求3所述重组载体的微生物细胞。

5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核微生物或真核微生物。

6.根据权利要求4或5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞的出发菌株为酿酒酵母。

7.一种生产柚皮素的方法，其特征在于，利用权利要求4~6任一所述微生物细胞转化对香豆酸生产柚皮素。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞的单菌落培养20~24h得到菌液，将菌液按照1~5%（v/v）的量转接至YPD培养基，并向YPD培养基中添加200~250mg/L对香豆酸。

9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在28~35℃下培养不少于60 h。

10.权利要求1所述的查尔酮合成酶突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求4~6任一所述的微生物细胞在制备柚皮素或含有柚皮素的产品中的应用。