CN114630901A

CN114630901A - 基于atp的细胞分选和过度增殖癌症干细胞

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Publication number: CN114630901A
Application number: CN202080074448.1A
Authority: CN
Inventors: M·P·利桑蒂; F·苏特加; M·菲奥里罗
Original assignee: Lunela Biotechnology Co ltd
Current assignee: Lunela Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-09-13
Filing date: 2020-09-14
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-09-14
Also published as: KR20220061190A; CN114630901B; IL291306A; JP7714529B2; CA3154301A1; US20220365069A1; WO2021048830A1; EP4028509A1; JP2022552458A; EP4028509A4

Abstract

高线粒体ATP是赋予癌细胞过度增殖、干性、非锚定依赖性、抗氧化能力和多药抗性的代谢特征。在本方法下，细胞内ATP水平可以用作鉴别、分离和纯化侵袭性和过度增殖癌症干细胞(“CSC”)表型的代谢生物标志物。此外，可以将ATP与其他CSC标志物(例如CD44或ALDH活性)组合，以有益地将CSC群分级成亚群。例如，高ATP/高CD44CSC亚群表现出的非锚定依赖性生长水平是低ATP/高CD44CSC亚群的两倍。还公开了表明线粒体ATP合成牵涉循环肿瘤细胞(“CTC”)的干性、转移和检测有关联的补充性生物信息学数据，以及五员ATP相关转移基因特征(ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB)。本方法的基因特征可以用于鉴别体外细胞迁移和侵袭能力以及体内自发转移显著增加的CSC。本方法还为系统靶向癌细胞的干性、多药抗性和转移提供了细胞平台。

Description

基于ATP的细胞分选和过度增殖癌症干细胞

相关申请

本申请要求2019年9月13日提交的美国临时专利申请62/900,139的权益，并通过引用将其全部并入本文。

领域

本公开涉及基于ATP的细胞分选，以鉴别、分离和处理代谢过度活跃的、侵袭性的和过度增殖的癌症干细胞(cancer stem cell,“CSC”)表型，并用于预防转移或降低转移的可能性。

背景

研究人员一直在努力开发新的抗癌疗法。传统的癌症疗法(例如辐射、环磷酰胺等烷化剂和5-氟尿嘧啶等抗代谢物)试图通过干扰细胞生长和DNA复制所涉及的细胞机制来选择性地检测和根除快速生长的癌细胞。其他癌症疗法使用选择性地结合快速生长的癌细胞上的突变肿瘤抗原的免疫疗法(例如，单克隆抗体)。不幸的是，在这些治疗后肿瘤经常在相同或不同部位复发，这表明并非所有癌细胞都已被根除。复发可能是由于化疗剂量不足和/或出现对治疗有抗性的癌症克隆所致。因此，需要新的癌症治疗策略。

突变分析的进步已经允许深入研究癌症发展过程中发生的基因突变。尽管具有对基因组景观(genomic landscape)的了解，但现代肿瘤学仍难以鉴别不同癌症亚型的主要驱动突变。残酷的现实似乎是，每个患者的肿瘤都是独特的且单个肿瘤可能含有多种不同的克隆细胞。因此，需要一种强调不同癌症类型之间共性的新方法。靶向肿瘤细胞和正常细胞之间的代谢差异有望成为新的癌症治疗策略。对来自人类乳腺癌样品的转录图谱分析数据的分析揭示了多于95个升高的mRNA转录物与线粒体生物发生和/或线粒体翻译相关。此外，95种上调的mRNA中多于35种编码线粒体核糖体蛋白(mitochondrial ribosomalprotein,MRP)。人类乳腺癌干细胞的蛋白质组学分析同样揭示了几种线粒体蛋白质以及与线粒体生物发生相关的其他蛋白质的极大过表达。

线粒体是动态性极强的细胞器，不断分裂、伸长、相互连接，形成管状网络或碎片化颗粒，以满足细胞的需要和适应细胞微环境。线粒体融合和分裂的平衡决定了线粒体的形态、丰度、功能和空间分布，因此影响大量依赖于线粒体的重要生物过程，如ATP产生、线粒体自噬、细胞凋亡和钙稳态。反过来，线粒体动力学可以通过线粒体代谢、呼吸和氧化应激来调节。因此，分裂和融合活动的失衡对包括癌症在内的几种病理状况具有不利影响就不足为奇了。虽然癌细胞通常表现出碎片化线粒体，并且分裂增强或融合减少通常与癌症有关，但是仍需要全面了解线粒体动力学如何影响肿瘤发生。

完整和增强的代谢功能对于支持癌细胞升高的生物能和生物合成需求是必要的，特别是当它们向肿瘤生长和转移扩散发展时。毫不奇怪，依赖线粒体的代谢途径通过从几种燃料来源中提取能量，为癌细胞提供了重要的生化平台。

癌症干性样细胞(cancer stem-like cell)是相对较小的肿瘤细胞亚群，与正常成体干细胞和胚胎干细胞具有共同的特征。因此，CSC被认为是肿瘤再生和生命体全身性扩散的“主要生物学原因”，导致肿瘤复发和远端转移的临床特征，最终导致接受化疗和放疗的癌症患者的治疗失败和过早死亡。有证据表明，CSC还在肿瘤起始中起作用，因为在临床前动物模型中，分离的CSC在实验上表现为肿瘤起始细胞(tumor-initiating cell,TIC)。由于全世界所有癌症患者的约90％因转移性疾病而过早死亡，因此对于开发有效靶向和根除CSC的新治疗方法的需要非常急迫且在临床上未得到满足。大多数常规疗法不靶向CSC，并且通常会增加CSC在原发性肿瘤和远端部位的频率。

最近，能量代谢和线粒体功能与参与CSC维持和增殖的某些动力学有关，CSC是肿瘤块内参与肿瘤起始、转移扩散和抗癌治疗抗性的独特细胞亚群。例如，CSC表现出线粒体质量的不寻常和独特的增加，以及线粒体生物发生增强和更高的线粒体蛋白质翻译激活。这些行为表明对线粒体功能的严格依赖。与这些观察结果一致，已在多种肿瘤类型的CSC中检测到线粒体代谢功能和OXPHOS升高。

一种消除CSC的新兴策略利用了细胞代谢。CSC是最有活力的癌细胞之一。在本方法下，使用代谢抑制剂诱导ATP耗竭并使CSC饿死。到目前为止，发明人已经鉴定出许多FDA批准的具有脱靶线粒体副作用的药物，这些药物具有抗CSC特性并诱导ATP耗竭，包括例如发挥线粒体蛋白质翻译抑制剂作用的抗生素多西环素。多西环素是长效四环素类似物，目前尤其用于治疗多种形式的感染，例如痤疮、酒渣鼻和疟疾预防。在最近的II期临床研究中，术前口服多西环素(每天200mg，持续14天)可将早期乳腺癌患者的CSC负担降低17.65％至66.67％，正面响应率接近90％。

然而，某些缺点限制了单一抗线粒体药剂在癌症治疗中的使用，因为肿瘤块中可以采用适应性机制来克服线粒体功能的缺乏。这些适应性机制包括，例如，在由肿瘤细胞内以及周围生态位中的内在因素和外在因素驱动的代谢可塑性的多向过程中，CSC从氧化代谢转变为替代性能量通路的能力。值得注意的是，在CSC中，对这种代谢灵活性的操作在治疗方面可能会变得有利。接下来需要的是阻止这些代谢转变或以其他方式利用该转变来抑制癌细胞增殖的治疗方法。

5'-三磷酸腺苷(ATP)是所有活细胞和生物体的生物能量“通货”。在化学上，ATP是核苷三磷酸，它含有腺嘌呤、核糖和三个磷酸基团。ATP在其末端磷酸基团处裂解，产生两种主要反应产物，即ADP和无机磷酸盐(Pi)，从而释放高水平的储存能量。在真核细胞中，线粒体通过TCA循环和氧化磷酸化(OXPHOS)生成大量ATP，而糖酵解产生较少量ATP。线粒体功能障碍诱导ATP耗竭，导致线粒体驱动的细胞凋亡(细胞死亡)。

在MCF7乳腺癌细胞中，线粒体驱动的OXPHOS贡献了80％的ATP生成，而糖酵解贡献了剩余的20％。因此，与正常细胞一样，癌细胞仍然高度依赖线粒体产生ATP。然而，癌细胞中的ATP水平如何有助于“干性”和细胞周期进展以及它们经历不依赖锚定生长的能力(转移扩散的特征)在很大程度上仍是未知的。

由于ATP作为细胞代谢晴雨表的核心重要性，已开发出许多发光和荧光探针以响应于各种细胞刺激测量和跟踪ATP水平。例如，ATP-Red 1(CAS#:1847485-97-5,IUPAC名：[2-[3',6'-二(二乙氨基)-3-氧代螺[异吲哚-1,9'-氧杂蒽]-2-基]苯基]硼酸)是一种活体染料，仅在与ATP结合时才发出荧光，并且不识别ADP或其他营养物质。ATP-Red 1允许活细胞和组织中的ATP水平的动态可视化。

本公开的目的是，描述靶向和根除甚至“最适生存(fittest)”的癌细胞的可行ATP耗竭策略。

本公开的另一个目的是，描述具有特定过度增殖表型的细胞的独特组合物。

本公开的另一个目的是，鉴别新的抗癌治疗方法，其涉及通过靶向线粒体和驱动ATP耗竭而使在代谢上饿死CSC的新药物化合物。

概述

本方法描述了使用荧光ATP成像探针对癌细胞群进行代谢分级，并分离过度增殖的细胞亚群。所得组合物可用于多种有利目的，范围从快速药物开发和筛选到预测和预防转移和抗药性。本方法还提供了癌症转移的5元基因特征预后，以及用于癌细胞的代谢分级以及转移的诊断和预防的方法。

采用基于ATP的生物标志物的生物能细胞“分层”可以用于分离“最适生存”的癌细胞，用于鉴别、诊断、治疗和治疗性药物开发。特别是，荧光ATP成像探针，例如BiotrackerATP-Red 1可以用于对细胞群进行染色，并且如果需要，所得的基于ATP的荧光可用于在代谢上将细胞群分级为高ATP亚群、本体(bulk)亚群和低ATP亚群。使用这种新方法，本文公开的数据包括第一个证据，即高水平的线粒体ATP是侵袭性癌细胞行为(包括自发转移)的主要决定因素。

癌细胞群中存在大量的表型多样性和代谢异质性。这种异质性允许“最适生存”的癌细胞逃避当前的治疗方式，导致继发于抗药性的肿瘤复发和远端转移。

高细胞内ATP水平可用作侵袭性和过度增殖癌细胞表型的代谢生物标志物。在本方法下，荧光ATP标志物，例如活体染料BioTrackerTMATP-Red 1(EMD MilliporeCorporation,Burlington,Massachusetts)可用于对癌细胞群中的线粒体ATP水平定量，并通过流式细胞术分离高ATP癌细胞亚群和低ATP癌细胞亚群。这些亚群的表型分析表明，高线粒体ATP是赋予癌细胞过度增殖、干性、非锚定依赖性、抗氧化能力和多药抗性的代谢特征。用四种人类乳腺癌细胞系即MCF7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468获得了数量上相似的结果。

通过将ATP与诸如CD44或ALDH活性等其他CSC标志物组合，可以将CSC群有利地分级为两个亚群。高CD44/高ATP亚群的非锚定依赖性生长水平是高CD44/低ATP亚群的约两倍。因此，高CD44/低ATP癌细胞代表了更休眠的CSC群。重要的是，这些结果表明，ATP水平可能是CSC休眠的功能调节剂。

本方法还包括互补性生物信息学数据，这些数据表明，线粒体ATP合成涉及循环肿瘤细胞(CTC)的干性、转移和检测。本文公开了包含ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的五元ATP相关转移基因特征。根据这些基于转移的临床发现，高ATP的MDA-MB-231细胞表现出经历体外细胞迁移和侵袭以及体内自发转移的能力的显著增加。

因此，本方法为系统鉴别、研究和靶向癌细胞的干性、多药抗性和转移提供了新的细胞平台。本公开还在机理上解释了i)营养禁食和ii)热量限制模拟物通过诱导ATP耗竭改善癌症治疗的积极治疗益处。

在本方法的实施方案中，活体染料ATP-Red 1用作鉴别和分离细胞(更具体而言是癌细胞和CSC)的高ATP亚群和低ATP亚群的分子探针。癌细胞的高ATP亚群更大、更有活力、过度增殖并经历非锚定依赖性生长，这与更“干性样”的表型一致。这些富含ATP的细胞可以被ATP耗竭疗法靶向，以根除在能量上“最适生存”的CSC，降低抗性并预防转移。

本方法的一些实施方案可以采取过度增殖癌症干细胞的纯化组合物形式，过度增殖癌症干细胞为来自人类癌细胞群的细胞亚群的形式，所述癌细胞群响应于荧光三磷酸腺苷(ATP)成像探针表达一个范围的荧光信号，且所述细胞亚群表达基于ATP的荧光信号范围的上部。荧光ATP成像探针可以是例如BioTracker ATP-Red 1。取决于实施方案，所述上部或高ATP亚群可以是基于ATP的荧光信号的前10％、5％或1％。可以使用其他部分。在一些实施方案中，该组合物对于CD44标志物呈阳性。在一些实施方案中，该组合物对于ALDH标志物呈阳性。在一些实施方案中，该组合物是冷冻的。

在一些实施方案中，本方法可以采取纯化的细胞组合物的形式，该组合物包含用荧光ATP成像探针染色并表达癌细胞群的基于ATP的荧光信号范围的靶标部分的癌症干细胞亚群。该癌细胞群表达一个范围的基于ATP的荧光信号，并且基于ATP的荧光信号范围的靶标部分可以是基于ATP的荧光信号的上部(例如，高ATP亚群)和/或基于ATP的荧光信号的下部(例如，低ATP亚群)。靶标部分可以是基于ATP的荧光信号的前或后(bottom)10％、5％或1％，或选择的其他部分。

一些实施方案可以采取细胞的纯化组合物的形式，该组合物是通过以下方式获得的：用荧光ATP成像探针对人类癌细胞群进行染色，分离具有基于ATP的荧光信号的靶标部分的一部分人类癌细胞群，并纯化分离的细胞。例如，靶标部分可以是基于ATP的荧光信号的前10％、基于ATP的荧光信号的前5％、基于ATP的荧光信号的后10％、基于ATP的荧光信号的后5％等。分离的细胞对于CD44标志物和ALDH标志物之一呈阳性。

一些实施方案可以采用基于ATP的细胞分级方法的形式。细胞群中的细胞可以用与ATP结合时发出荧光的荧光ATP成像探针染色。可以测量细胞群中被染色的细胞的基于ATP的荧光信号。可以根据基于ATP的荧光信号的靶标部分来分离染色的细胞。荧光激活的细胞分选(FACS)和基于ATP的荧光信号的靶标部分的门控可以用于分离染色的细胞。可将门设置为收集具有测量的荧光信号的前10％和/或具有测量的荧光信号的后10％的染色的细胞。应当理解，可以使用其他百分比。细胞群可以源自例如血液、尿液、唾液、肿瘤组织、非癌性组织或转移性病灶。一些实施方案还可以包括测量分离的细胞的ALDH活性，测量分离的细胞的非锚定依赖性生长，测量分离的细胞的线粒体质量，测量分离的细胞的糖酵解代谢和氧化线粒体代谢，测量分离的细胞的细胞周期进展和增殖率，以及测量分离的细胞的多倍性。

本方法的实施方案可以采取用于从细胞群中分离和收集代谢活性细胞的方法的形式。细胞群中的细胞可以用与ATP结合时发出荧光的ATP标记染料染色。可以在细胞群中测量染色的细胞的荧光信号，然后基于测量的荧光信号对染色的细胞进行测量。然后可以例如通过使用FACS仪收集具有测量的荧光信号为高于预定阈值和低于预定阈值之一的至少一部分分离的细胞。预定阈值包括测量的荧光信号的上部的一部分，例如前25％、前20％、前15％、前10％、前5％、前2％和前1％。在不偏离本方法的情况下，可以使用其他百分比。在一些实施方案中，分离的细胞可以基于第二标志物来进一步分离，例如CD44(+)、CD133(+)、ESA(+)、ALDEFLOUR(+)、MitoTracker-High、EpCAM(+)、CD90(+)、CD34(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD106(+)、CD166(+)和Stro-1(+)。在不偏离本方法的情况下，可以使用其他标志物。在一些实施方案中，第二标志物可以采取涂覆于磁珠上的抗体的形式。

本方法还可以采取鉴别和处理生物样品中的癌症干细胞的方法的形式。可以从患者获得生物样品，然后可以用ATP标记染料对生物样品中的细胞进行染色，其中ATP标记染料在与ATP结合时会发出荧光。可以测量细胞群中染色的细胞的荧光信号，然后与指示存在癌症干细胞的预定阈值进行比较。如果所测量的荧光信号超过预定阈值，则可以向患者施用ATP耗竭治疗剂。ATP耗竭治疗剂可以是，例如多西环素、替加环素、阿奇霉素、恩波吡维铵、阿托伐醌、贝达喹啉、氯硝柳胺、伊立替康、放线酰胺素(Actinonin)、CAPE、小檗碱、布鲁替瑞定(Brutieridin)、Melitidin、寡霉素、AR-C155858、Mitoriboscin、Mitoketoscin、Mitoflavoscin、TPP-衍生物、十二烷基-TPP、2-丁烯-1,4-双-TPP，或多西环素、阿奇霉素和抗坏血酸的组合。

在一些实施方案中，本方法可以采取测试候选化合物的抗癌活性的方法的形式。可以用与ATP结合时发出荧光的ATP标记染料例如BioTracker ATP-Red 1对癌细胞群进行染色。可以测量染色的细胞的基于ATP的荧光信号，并且可以根据基于ATP的荧光信号的靶标部分分离染色的细胞，以制备过度活跃的癌细胞亚群。可以将候选化合物施用于该过度活跃的癌细胞亚群；可以测量候选化合物对过度活跃的癌细胞亚群的影响。ATP标记染料可以是BioTracker ATP-Red 1。基于ATP的荧光信号的靶标部分可以是例如前25％、前20％、前15％、前10％、前5％、前2％和前1％。在一些实施方案中，过度活跃的癌细胞亚群对于CD44标志物和ALDH标志物之一呈阳性。实施方案还可以涉及测量过度活跃的癌细胞亚群的ALDH活性，测量过度活跃的癌细胞亚群细胞的非锚定依赖生长，测量过度活跃的癌细胞亚群的线粒体质量，测量过度活跃的癌细胞亚群的糖酵解代谢和氧化线粒体代谢，测量过度活跃的癌细胞亚群的细胞周期进展和增殖率，以及测量过度活跃的癌细胞亚群的多倍性。

本方法还可以采取诊断和预防癌症患者的转移风险的方法的形式。可以确定患者癌症生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的5元基因特征的表达水平，然后与来自该患者的非癌性生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的基线表达水平进行比较。如果检测到的表达水平超过基线表达水平，则可以向患者施用ATP耗竭化合物。ATP耗竭化合物可以是，例如多西环素、替加环素、阿奇霉素、恩波吡维铵、阿托伐醌、贝达喹啉、氯硝柳胺、伊立替康、放线酰胺素、CAPE、小檗碱、布鲁替瑞定、Melitidin、寡霉素、AR-C155858、Mitoriboscin、Mitoketoscin、Mitoflavoscin、TPP-衍生物、十二烷基-TPP、2-丁烯-1,4-双-TPP，或多西环素、阿奇霉素和抗坏血酸的组合。

一些实施方案可以采取鉴别生物样品中循环肿瘤细胞的试剂盒的形式。试剂盒可以包括用于鉴定生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB上调的试剂，例如针对这些基因编码的蛋白质的抗体。例如，试剂盒可用于检测CTC的液体活检程序。

本方法还可以采取用于检测生物样品中循环肿瘤细胞(CTC)的方法的形式。可以确定生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的表达水平，然后如果测定的表达水平相对于对照上调，则确定存在CTC。生物样品可以是例如血液、尿液、唾液、肿瘤组织、非癌性组织或转移性病灶。可以使用本文所述的方法进一步处理样品以分离高ATP细胞。

鉴于本说明书、所附权利要求书以及通过引用并入本文的申请，这些和其他实施方案对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。

附图简要说明

图1A显示了ATP相关基因的热图，这些基因在两种3D生长条件(非锚定依赖性条件和体内肿瘤条件)下的转录均相对于2D贴壁生长上调。图1B和1C显示了GSE2034和GSE59000GEO数据集的火山图。图1D显示了两个乳腺癌转移GEO数据集(GSE2034和GSE59000)相交的维恩图(Venn diagram)，用于鉴别在两个数据集中被高度上调的ATP相关基因作为转移的预后生物标志物。

图2A-2N是分别显示APT5F1C与基因CDH1、ALDH2、SOX2、VIM、CD44、EPCAM、MKI67、RRP1B、CXCR4、VCAM1、CDK1、CDK2、CDK4和CDK6正相关的数据图。图2O-2Q是分别显示APT5F1C与UQCRB、COX20和NDUFA2正相关的数据图。

图3A显示了ER(+)、无复发存活者(N＝3,082)的卡普兰-梅尔曲线，图3B显示了ER(+)、无远端转移存活者(N＝1,395)的卡普兰-梅尔曲线，图3C显示了ER(+)、淋巴结阴性、他莫昔芬治疗、无复发存活者(N＝471)的卡普兰-梅尔曲线。

图4A显示了ATP-ABC基因表达谱的热图，图4B显示了OXPHOS基因表达谱的热图。图4C是MDA-MB-231细胞的高ATP亚群和低ATP亚群的蛋白质印迹分析。

图5A例示了本发明实施方案的代谢分级程序的实施方案。图5B例示了用ATP-Red1对MCF7细胞进行代谢分级以分离高ATP(前5％)和低ATP(后5％)细胞亚群的实例。

图6A和6B显示了来自连续实时测定系统的有关三个细胞亚群(低ATP 5％、本体5％、高ATP 5％)的细胞增殖的结果。

图7A是显示高ATP MCF7亚群中细胞发光变化的条形图，图7B显示了高ATP亚群、本体亚群和低ATP亚群的乳腺球形成测定结果。图7C显示了测定后细胞亚群的比较图像。图7D显示了CD44和ALDH阳性亚群的信号强度，图7E显示了该分析的Cell-Titer-Glo结果。

图8A和8B显示了关于3D乳腺球和高ATP MCF7细胞的代谢图谱分析的结果。

图9A和9B显示了MCF7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的高ATP亚群和低ATP亚群使用10％门控的Cell-Titer-Glo和3D乳腺球形成结果。

图10A显示了24小时后MCF7细胞群中高ATP亚群和低ATP亚群(10％)的发光。图10B到10E显示了高ATP亚群和低ATP亚群的代谢通量分析结果。

图11A-11D显示了MCF7、T47D、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的细胞周期进展，使用利用碘化丙啶的FACS分析来检测DNA含量。

图12A显示了低ATP亚群(后5％)的抗药性结果，图12B显示了高ATP亚群(前5％)的抗药性结果。

图13A和13B分别显示了MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中双标记的细胞(CD44和ATP)的乳腺球测定形成结果，图13C和13D分别显示了MCF7细胞和MDA-MB-231细胞中双标记的细胞(ALDH活性和ATP)的乳腺球测定形成结果。

图14A和14B显示了高ATP亚群的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭测定的结果。

图15显示了自发转移体内CAM测定的结果。

图16A-16C分别显示了Tempo-ATP MCF7细胞的发光变化、细胞周期进展和乳腺球形成测定结果。

描述

以下描述以充分的细节说明了本方法的实施方案，以使本方法的实践能够实施。尽管参考这些具体点实施方案描述了本方法，但是应当理解，本方法可以以不同的形式体现，并且该描述不应当解释为将任何所附权利要求局限于本文中阐述的具体实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开是彻底的和完整的，并且向本领域技术人员充分传达本方法的范围。

该描述使用了本领域普通技术人员应当理解的各种术语。为免生疑问，进行以下澄清。术语“治疗(treat)”、“治疗的(treated)”、“治疗(treatming)”和“治疗(treatment)”包括减少或减轻与所治疗的状态、病症或疾病(特别是癌症)相关或由其引起的至少一种症状。在某些实施方案中，治疗包括通过本发明的化合物减少和/或减轻与正在治疗的癌症相关或由其引起的至少一种症状。在一些实施方案中，治疗包括导致宿主中特定癌症的一类细胞例如CSC死亡，并且可以通过以下方式来实现：阻止癌细胞进一步增殖，和/或通过例如剥夺这些细胞生成能量的机制来抑制CSC功能。例如，治疗可以是减少癌症的一种或几种症状，或完全根除癌症。作为另一个实例，本方法可用于抑制癌症中的线粒体代谢，根除(例如，以高于增殖速率的速率杀死)癌症中的CSC，根除癌症中的TIC，根除癌症中的循环肿瘤细胞，抑制癌症的增殖，靶向并抑制CSC，靶向并抑制TIC，靶向并抑制循环肿瘤细胞，阻止转移(即，降低转移的可能性)，预防复发，使癌症对化疗剂敏感，使癌症对放疗敏感，使癌症对光疗法敏感。

术语“癌症干细胞”和“CSC”是指肿瘤内当移植到动物宿主体内时具有自我更新、分化和致瘤性能力的癌细胞亚群。与“本体(bulk)”癌细胞相比，CSC的线粒体质量增加，线粒体生物发生增强，并且线粒体蛋白翻译的激活更高。如本文所用，“循环肿瘤细胞”是已经从原发性肿瘤脱落到脉管系统或淋巴管中并且在血液循环中携带到身体周围的癌细胞。CellSearch循环肿瘤细胞测试(CellSearch Circulating Tumor Cell Test)可用于检测循环肿瘤细胞。

短语“高ATP”和“低ATP”分别是指来自起始细胞群、具有代表基于ATP的荧光信号的上部和下部的基于ATP的荧光信号的细胞亚群。上部可以代表起始细胞群的基于ATP的荧光信号的前25％，或前20％，或前15％，或前10％，或前5％，或前2％，或前1％。下部可以代表起始细胞群的基于ATP的荧光信号的后25％，或后20％，或后15％，或后10％，或后5％，或后2％，或后1％。

本文所用短语“药学有效量”表示，为了实现治疗结果，例如调控、调节或抑制蛋白激酶活性，例如抑制蛋白激酶活性或治疗癌症，必须施用于宿主或宿主的细胞、组织或器官的量。具有本领域普通技能的医师或兽医可以容易地确定和开出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平，从药物组合物所用的本发明化合物的多个剂量开始，并逐渐增加剂量，直至实现所需效果。

生物信息学分析证明了线粒体ATP合成在3D非锚定依赖性生长、干性和远端转移中的作用。特别是，使用生物信息学方法，线粒体ATP合成是3D非锚定依赖性生长和转移的关键决定因素。在两种不同的ER(+)乳腺癌细胞系(MCF7和T47D)中，对现有的蛋白质组学图谱分析数据进行了查询以比较2D单层与3D乳腺球。总体而言，从两种细胞系的1,519种常见蛋白质中，发现在3D-乳腺球中21种ATP相关蛋白质在两个数据集中都上调。下面的表1显示了这些蛋白质和登录号，以及在MCF7和T47D细胞中的表达倍数变化(球体与2-D贴壁生长)。在这21种ATP相关蛋白中，检测到7个线粒体ATP合酶亚基，包括ATP5F1B、ATP5F1C、ATP5IF1、ATP5MG、ATP5PB、ATP5PD和ATP5PO。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件，我们观察到，预测的3D非锚定依赖性生长的上游调节剂在两种细胞系之间高度保守，并且与现有的关于肿瘤生长和肿瘤细胞增殖的IPA数据集特别相关。

表1.MCF7和T47D细胞系的3D乳腺球中上调的21种ATP相关蛋白。

我们还重新分析了GEO转录图谱分析数据集，比较了MDA-MB-231细胞(一种三阴性乳腺癌细胞系)的2D生长、3D生长和体内肿瘤生长。图1A显示了ATP相关基因的热图，这些基因的转录在两种3D生长条件(非锚定依赖性条件和体内肿瘤条件)下均相对于2D贴壁生长上调。第一列标识了基因，第二列显示在2D MDA-MB-231细胞中的表达谱，第三列显示在3DMDA-MB-231细胞中的表达谱，第四列显示在异种移植MDA-MB-231细胞中的表达谱。较深的细胞表示较少的倍数变化，较浅的细胞表示较高的倍数变化。该热图显示了倍数变化的对数，例如，最浅的细胞是+/-4。在2D MDA-MB-231列中，较浅的细胞表示负变化(例如，ATP11A-AS1显示-4log倍的变化)，而3D和异种移植列中较浅的细胞表示正变化(例如，ATP12A显示4log倍的变化)。

与人类乳腺癌转移相关的两个不同GEO数据集中ATP相关基因(OXPHOS和ATP相关转运蛋白)的转录表达可用于鉴别与转移相关的ATP相关基因。图1B和1C显示了GSE2034和GSE59000 GEO数据集的火山图。具体来说，图1B比较了转移情景与无转移情景(GSE2034)中的基因表达，图1C比较了转移情景与原发性肿瘤(GSE59000)中的基因表达。通过检查肿瘤学与转移性癌症(OncoLand Metastatic Cancer)(QIAGEN OmicSoft Suite)中存在的注释，并通过使用Ingenuity Pathway Analysis软件(IPA；QIAGEN)对被注释具有小于0.05的未校正p值截止值的基因执行功能性“核心分析”，产生火山图。在两个GEO数据集中，ATP相关基因(OXPHOS和ATP相关转运蛋白)的转录谱(transcriptional profile)增加并与转移特异性相关。

图1D显示了两个乳腺癌转移GEO数据集(GSE2034和GSE59000)相交的维恩图，用于鉴别在两个数据集中高度上调的ATP相关基因作为转移的预后生物标志物。如结合图1B和1C所描述的，使用IPA软件执行两个GEO数据集的相交。1,055个基因的重叠集仅含有5个ATP相关基因。这些ATP相关基因，即ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB在两个转移GEO数据集中都高度上调，因此在预测癌症转移方面具有预后价值。这五个ATP相关基因可用作ATP相关转移基因特征、转移预后。最值得注意的是，ATP5F1C(也称为ATP5C1)编码线粒体ATP合酶的可溶性F1催化核心的γ亚基。UQCRB是线粒体复合物III的重要组成部分，它在功能上结合泛醌并参与电子传递。COX20是对线粒体复合物IV的组装至关重要的伴侣蛋白。NDUFA2对线粒体复合物I的功能至关重要。最后，ABCA2是ATP结合盒转运蛋白基因家族的成员。

在真正的乳腺癌转移病灶中，ATP5F1C转录表达与以下的共表达呈正相关：i)五个转移标志物基因(EPCAM、MKI67、RRP1B、VCAM1、CXCR4)；ii)四个细胞周期调控基因(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)；和iii)11个CSC标志物基因(CDH1、ALDH2、ALDH1BA1、ALDH9A1、SOX2、VIM、CDH2、ALDH7A1、ALDH1B1、CD44、ALDH3B2，按统计显著性排序列出)。图2A-2N是数据图，其显示了APT5F1C与这些基因中的每个基因均呈正相关，顺序为CDH1、ALDH2、SOX2、VIM、CD44、EPCAM、MKI67、RRP1B、CXCR4、VCAM1、CDK1、CDK2、CDK4和CDK6。

此外，ATP5F1C转录表达还与线粒体复合物I-V、mt-DNA编码的转录物和五元转移基因特征的其他三个成员(即UQCRB、COX20和NDUFA2)的共表达呈正相关。图2O-2Q是分别显示APT5F1C与UQCRB、COX20和NDUFA2正相关的数据图。这种转移基因特征的两个成员ATP5F1C和UQCRB的表达在功能上与人类骨骼肌组织中的最大摄氧量(V_O2max)和高百分比的1型纤维(线粒体富含)相关。

运动训练后骨骼肌中ATP5F1C的表达也显著增加，反映了患者肌肉健康提高。相反，ATP5F1C水平随着年龄的增长而降低，并且在早衰综合征患者中降低。这些结果高度暗示高ATP5F1C表达是细胞水平上线粒体ATP产生增加的生物标志物。

使用卡普兰-梅尔(KM)分析，我们确定ATP5F1C是远端转移和肿瘤复发的预后生物标志物，特别是在诊断时为淋巴结阴性并接受他莫昔芬治疗的ER(+)患者中(风险比(无复发存活)＝2.77；P＝3.4E-06；N＝471)。图3A显示了ER(+)、无复发存活者(N＝3,082)的卡普兰-梅尔曲线，图3B显示了ER(+)、无远端转移存活者(N＝1,395)的卡普兰-梅尔曲线，图3C显示了ER(+)、淋巴结阴性、他莫昔芬治疗的、无复发存活者(N＝471)的卡普兰-梅尔曲线。

在手术切除的淋巴结内，使用检测线粒体复合物IV的组织化学活性染色，这些结果与先前的研究一致，表明线粒体活性在乳腺癌转移性病灶中的功能被上调。此外，本发明人此前指出，在源自N＝28个乳腺癌患者的样品中，ATP5基因家族的16个成员的转录在人类乳腺癌细胞中相对于邻近基质细胞上调，包括ATP5F1C(4.64倍；p＝1.14E-05)。

使用现有的GEO数据集(GSE55470)评估ATP相关基因和OXPHOS基因作为患者乳腺癌循环肿瘤细胞(CTC)的转录生物标志物的用途。图4A显示了该数据集中ATP-ABC基因表达谱的热图，并包括图例。图4B基于图4A中的相同图例显示了OXPHOS基因表达谱的热图。通常，细胞越浅，表达的绝对值就越高。针对本申请使用黑色和白色难以区分正和负的倍数变化。对于对照血液，前五列的大多数细胞在原始热图中是绿色的，表示负的表达倍数变化。大部分其余列中的细胞是红色的，表示正的表达倍数变化。总体而言，该数据表明CTC中的高ATP含量可用作生物标志物来鉴别和跟踪全血中的CTC，从而有可能改善癌症诊断并阻止转移扩散。

图4C显示了高ATP亚群和低ATP亚群的MDA-MB-231细胞的蛋白质印迹分析结果。结果显示线粒体标志物和CTC标志物在高ATP MDA-MB-231细胞中均上调。相对于低ATP亚群中的MDA-MB-231细胞，复合物I至V的线粒体标志物，包括ATP5F1C，都在高ATP亚群的MDA-MB-231细胞中过表达。此外，两种已知的CTC和转移标志物(VCAM-1和Ep-CAM)都在高ATP亚群的MDA-MB-231细胞中过表达。β-肌动蛋白和β-微管蛋白用作等量蛋白质荷载的标志物。

总之，生物信息学数据和分析表明，线粒体ATP合成增加可能是3D非锚定依赖性生长和转移的关键驱动因素。基于该分析，与ATP水平较低的癌细胞相比，ATP水平最高的癌细胞会具有高度增殖性、更多的干性样、进行非3D锚定依赖性生长，并会具有其他侵袭性行为。同样，那些具有ATP最低水平的细胞会更休眠。这两个亚群对于尤其是癌症研究和药物筛选的用途具有相当大的价值。本方法提供了通过代谢分级从癌细胞群分离这些亚群的方法。癌细胞群有许多亚群。CSC是具有自我更新特性的小的癌细胞亚群，能够分化，并且它们在移植时表现出致瘤性。然而，如本文所述，并非所有CSC都是生而平等的。基于ATP水平分离和纯化的CSC具有在天然存在的癌细胞群中或甚至在使用诸如CD44、CD24和CD133等常规标志物分离和纯化的CSC中未曾发现的独特表型特性。

在本方法下，可以基于代谢条件，使用诸如ATP-Red 1等荧光ATP标记染料和流式细胞术，对细胞优选对癌细胞进行分级。ATP水平最终决定癌细胞的表型特征，例如“干性”和增殖能力。因此，ATP标记染料可以用于从总细胞群中鉴别和纯化能量上“最适生存”的癌细胞。发明人选择了Biotracker ATP-Red 1(荧光活体染料)来标记活癌细胞中的ATP。应当理解，在不背离本方法的情况下，可以使用其他荧光ATP成像探针，包括后来开发的探针。优选地，荧光ATP成像探针靶向线粒体ATP。

ATP-Red 1通常不发荧光，但与ATP(而不是与任何其他相关核苷酸或代谢物(包括ADP))结合时发出荧光。更具体地说，BioTracker ATP-Red1不识别糖类(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、核糖、山梨糖、蔗糖或木糖)或其他核苷酸(AMP、ADP、CMP、CDP、CTP、UMP、UDP、UTP、GMP、GDP或GTP)。重要的是，这种荧光ATP成像探针对ATP表现出“开启”荧光响应，荧光增强近6倍。使用荧光显微术，主要在作为细胞ATP产生的主要来源的线粒体内检测到ATP-Red 1。因此，优选ATP-Red1作为荧光探针，来通过流式细胞术对癌细胞群进行代谢分级。

可以将癌细胞群分离或分级为高ATP细胞亚群和低ATP细胞亚群，然后进行表型表征。这些亚群可以按照荧光信号的前后百分比(例如，前和后20％、前和后1％等)界定，以及按照基于选定的百分比的细胞选择和收集的FACS门控截止值界定。本文公开的数据主要依赖于前和后5％以及前和后10％作为门控截止值，但应当理解，在不偏离本方法的情况下，可以使用其他百分比。当然，所述百分比应当小于50％，并且应当预期到，百分比越大，对于给定细胞群的表型表征就会越不特异。

图5A说明了本实施方案的代谢分级程序的实施方案。可以将荧光ATP成像探针溶解在培养基中并孵育501。本文描述的结果涉及5μMBiotracker ATP-Red，其作为荧光ATP成像探针溶解在培养基中并在细胞中孵育30分钟。然后用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶消化，并重悬浮在FACS缓冲液中，并使其通过40μm细胞过滤器503。使用FACS分选仪(例如SONYSH800)分析源自3D球体或2D贴壁条件的细胞505。使用基于ATP的荧光信号(例如，前/后1％、2％、3％、4％、5％、10％等)，以所需的ATP含量对细胞进行门控并分选507。图5B说明了使用ATP-Red 1对MCF7细胞进行代谢分级，以分离高ATP(前5％)和低ATP(后5％)细胞亚群的实例。为了比较目的还选择了本体(5％)群。右图显示了不同荧光强度下的细胞计数，并鉴别了高ATP(前5％)亚群、低ATP(后5％)亚群和本体的中位数的区域。图5B的左图显示了每个亚群的基于ATP的平均荧光信号。基于平均信号强度，我们估计，高ATP MCF7细胞的ATP水平是低ATP群的约15倍，是本体细胞群的约2倍。

图6A和6B显示了来自连续实时测定系统针对所有三个细胞亚群(低ATP 5％、本体5％、高ATP 5％)的细胞增殖的结果。使用

RTCA DP仪器评估细胞增殖。首先针对ATP含量对细胞进行分选，计数，并接种(1x 10⁴于普通培养基中)在RTCA DP E-Plates中用于进行实时生长分析。这3个亚群(低ATP 5％、本体5％、高ATP 5％)通过图形都被表示出来。结果表明，在120小时后，高ATP群的增殖能力是本体细胞群的约2倍，是低ATP群的约5倍。数据表示平均值±SD，n＝3。单因素ANOVA，Dunnett的多重比较检验，**p<0.001，***p<0.001，****p<0.0001。从图6A中可以看出，高ATP亚群的细胞指数与其他亚群相比明显更高，并且低ATP亚群的细胞指数与其他亚群相比明显更低。图6B显示了每个亚群的细胞指数随时间变化的斜率。在每个时间点(24、48、72、96和120小时)，高ATP细胞群的斜率明显高于其他2个亚群。数据表示平均值±SD，n＝3。双因素ANOVA，经Tukey校正，*p<0.01。显然，在整个120小时评估中，高ATP亚群的增殖率最高。结果表明，高ATP群的增殖能力至少是本体细胞群的约2倍，并且至少是低ATP群的约5倍。这表明线粒体ATP水平是MCF7细胞增殖的关键决定因素，并且本方法用荧光ATP成像探针进行代谢分级是鉴别增殖能力最强和增殖能力最低的细胞亚群的有效技术。

进一步的测定证实，高ATP MCF7亚群在能量上过度增殖，具有显著增加的3D非锚定依赖性生长、癌症干细胞标志物和线粒体质量。为了证实ATP-Red 1的选择性，在流式细胞术之后，使用Cell-Titer-Glo测量细胞中的ATP水平。然而，由于Cell-Titer-Glo是基于荧光素酶的测定，它需要细胞裂解来检测ATP水平，因此其不能用于活细胞分选或成像。细胞计数后，然后使用Varioskan^TM LUX读板器，使用等量的单细胞通过发光来评估其相对ATP含量。图7A的条形图显示，高ATP MCF7亚群中细胞的ATP水平增加是低ATP细胞群的至少15倍，而本体细胞的ATP增加是低ATP细胞群的约7倍。这也表明MCF7群中高ATP亚群的ATP水平是本体细胞的至少两倍。

利用3D乳腺球测定来测量非锚定依赖性生长，非锚定依赖性生长是对CSC活性和CSC增殖的功能读出。图7B显示了使用5％作为门控截止值，高ATP亚群、本体亚群和低ATP亚群的3D乳腺球测定结果。图7C显示了测定后这些细胞亚群的比较图像。使用EVOS FL Auto2显微镜获取3D乳腺球图像。分图表示3个分选的细胞群细胞。显示了代表性图像。使用了4X物镜。比例尺＝1,000μm。高ATP MCF7细胞亚群的3D球体形成增加是低ATP亚群的9倍，并且几乎是本体亚群乳腺球形成的两倍。这些数据表明，高ATP细胞能够比本体CSC群更好地进行3D非锚定依赖性生长。

利用两个公认的CSC标志物，即CD44和ALDH活性，来检查亚群的“干性”。图7D显示，当使用5％的FACS门控截止值时，高ATP MCF7细胞亚群(右条)在CD44细胞表面表达方面的富集几乎是低ATP亚群(左条)的4倍，并且ALDH活性方面的富集是低ATP亚群的约5.5倍。使用MitoTracker-Deep-Red，一种公认的线粒体质量标志物，也获得了类似的结果，这揭示，高ATP MCF7亚群的增加是低ATP亚群的3倍。线粒体质量是CSC干性的特异性标志物。

这些表明，本方法的代谢分级富集了高ATP亚群的CSC活性。重要的是，高ALDH活性被认为是CSC中EMT(上皮间质转化)的生物标志物，而CD44被认为更像是上皮CSC标志物。因此，上皮和间质CSC以高ATP细胞亚群被极大富集。

针对抗氧化能力和多能性的荧光活性探针也选择出高ATP MCF7细胞群。将BioTracker ATP-Red 1成像探针的有效性与其他几种荧光活体染料进行了比较，特别是针对高ATP细胞群的选择性进行了比较。为此，用胰蛋白酶收获MCF7细胞2D单层，并用一组5种其他荧光BioTracker探针进行活体染色以获取i)抗氧化能力，包括胱氨酸摄取(“半胱氨酸-FITC”)和γ-谷氨酰转肽酶活性或GGT；ii)多能干细胞；iii)低氧；iv)衰老(β-半乳糖苷酶活性，或β-Gal)。然后，在流式细胞术之后立即使用Cell-Titer-Glo测定总ATP水平。

图7E显示了该分析的Cell-Titer-Glo结果，显示了最高5％(每个探针的右侧条)相对于最低5％(每个探针的左侧条)的发光倍数变化。值得注意的是，针对抗氧化能力(胱氨酸摄取和GGT活性)以及多能性的探针都被选择用于MCF7细胞的高ATP亚群。然而，在测试的其他荧光活性探针中，直接测量胱氨酸-FITC摄取的BioTracker探针在选择高ATP细胞亚群方面最有效，但不如ATP-Red 1有效(3倍相比20倍)。有趣的是，已知高抗氧化能力与干性和抗药性表型严格相关。低氧探针也有利地选择出高ATP细胞亚群。这可能是由于低氧和线粒体生物发生增加之间的关联。然而，衰老探针(β-半乳糖苷酶活性)没有选择出高ATP细胞群或低ATP细胞群。

图8A和8B显示了与3D乳腺球和高ATP MCF7细胞的代谢图谱分析相关的结果。比较培养为2D单层或3D球体的MCF7细胞的细胞内ATP水平，以更好地了解支撑3D非锚定依赖性生长的代谢。已知后一种细胞群以CSC高度富集。使用Promega试剂盒(Cell-Titer-Glo、GSH/GSSG-Glo、NADP-NADPH-Glo、NAD-NADH-Glo)比较了生长为2D贴壁单层或3D乳腺球的MCF7细胞的代谢物水平。先用胰蛋白酶将2D单层和3D乳腺球解离成单个细胞，用25号针注射，并通过40μm的细胞过滤器。细胞计数后，然后使用相等数量的单细胞来评估其相对发光含量。注意，源自3D乳腺球的细胞的ATP水平增加2倍多；还原型谷胱甘肽水平增加近2倍；NADP-NADPH水平增加2倍多，NAD-NADH水平增加近1.5倍，均相对于2D单层。数据表示相对于贴壁细胞的平均倍数增加±SD，n＝4。非配对t检验，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001。

图8A比较了3D球体(右条)相对于2D单层(贴壁，左条)对于靶向ATP、GSH/GSSG、NADP-NADPH和NAD-NADH的探针的发光变化。对源自3D球体的MCF7细胞的定量分析显示，ATP水平的增加是2D单层细胞的2.3倍。观察到GSH/GSSG比率和NADP/H水平的约2倍增加，并且用NAD/H获得了类似的结果。这些数据与3D非锚定依赖性生长也可能需要增加抗氧化能力的想法一致。

鉴于上文，预计2D单层细胞的高ATP亚群具有进行3D非锚定依赖性生长的能力。在低附着条件下，>90％的MCF7细胞通常会经历失巢凋亡，这是一种特殊形式的凋亡细胞死亡。较高的ATP水平可能会使CSC更好地抵抗因缺乏细胞-基质附着引起的悬浮生长的高应力。然而，较高的能量储备也可能赋予对多种应力源的抵抗力，从而导致多药抗性。

使用Promega试剂盒(Cell-Titer-Glo、GSH/GSSG-Glo、NADP-NADPH-Glo、NAD-NADH-Glo)，对高ATP和低APT MCF7细胞的NAD/H和两个关键抗氧化剂GSH和NADP/H进行代谢图谱分析。首先用BioTracker ATP-Red 1对2D单层细胞进行染色，并通过流式细胞术按ATP含量进行分选。细胞计数后，然后使用相等数量的单细胞来评估其相对发光含量。请注意，高ATP细胞显示出ATP水平增加近25倍；还原型谷胱甘肽水平增加6倍；NADP-NADPH平增加近8倍，NAD-NADH水平增加>2倍，均相对于低ATP MCF7细胞。数据表示相对于低ATP 5％细胞的平均倍数增加±SD，n＝4。未配对t检验，**p<0.005，***p<0.0005。如图8B所示，高ATP亚群中的细胞含有超过1.5倍的NAD/H，超过7.5倍的NADP/H，以及超过7倍的还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG比)，均相对于低ATP亚群的细胞。这些数据表明，高ATP亚群中的MCF7细胞更有活力，因此，它们增强了其抗氧化能力。已知癌细胞中高水平的抗氧化剂与抗药性有关，指示多药抗性表型。因此，高ATP MCF7亚群中的细胞模拟3D代谢表型，这表明从群体中分离高ATP细胞的本方法产生了独特的表型，因而具有许多潜在用途。

高ATP和低ATP亚群表型存在于多种癌症类型中。MCF7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的高ATP亚群均表现出3D非锚定依赖性生长增加。以10％的FACS门控截止值制备来自其他三种人类乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的高ATP和低ATP细胞亚群的组合物。使用Cell-Titer-Glo独立验证了高ATP和低ATP细胞亚群中ATP的相对量。首先用BioTracker ATP-Red 1对2D单层细胞进行染色，并使用流式细胞仪按ATP含量进行分选。细胞计数后，然后使用相等数量的单细胞来评估其相对发光含量。在这一系列实验中，我们使用10％的截止值来界定高ATP细胞群和低ATP细胞群。请注意，这种代谢分级方案可以成功地应用于其他乳腺癌细胞系。数据表示相对于10％低ATP细胞的平均倍数增加±SD，n＝3。非配对t检验，*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005。

图9A和9B显示了使用10％门控MCF7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的高ATP亚群和低ATP亚群的Cell-Titer-Glo和3D乳腺球形成结果。图9A示出了所有这些细胞系的高ATP亚群表现出表征高ATP亚群表型的ATP增加，如使用基于荧光素酶的Cell-Titer-Glo测定所证实的那样，总ATP水平增加2-3倍。如图9B所示，使用3D球体测定获得了类似的结果，指示取决于所检查的细胞系，CSC活性和增殖增加1.75倍至3倍。首先用BioTrackerATP-Red 1对单层细胞进行染色，并使用流式细胞仪按ATP含量进行分选。细胞计数后，将5x10³个细胞接种到涂覆有poly-HEMA的6孔板上，并在5天后计数。请注意，MCF7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的高ATP细胞群均显示出3D非锚定依赖性生长能力增加。数据表示相对于低ATP 10％细胞的平均倍数增加±SD，n＝3。非配对t检验，***p<0.0005,****p<0.0001。

高ATP亚群中的细胞表现出氧化线粒体代谢、糖酵解速率和细胞周期进展的增加。图10A显示了24小时后MCF7细胞群中高ATP亚群和低ATP亚群(10％)的发光。细胞计数后，在铺平板后24小时，使用相同数量的单细胞利用Varioskan^TM LUX读板器通过发光评估其相对ATP含量。对于这些需要大量细胞的实验，使用10％的截止值来界定高ATP细胞群和低ATP细胞群。数据表示相对于低ATP 10％细胞的平均倍数增加±SD，n＝3。非配对t检验，****p<0.0001。在将高ATP细胞作为2D单层铺平板后24小时，观察到的ATP水平增加减少3倍，表明高活力、高ATP表型是相对短暂的，与更干性样的表型一致。

图10B到10E显示了高ATP亚群和低ATP亚群的代谢通量分析结果。使用SeahorseXFe96通过代谢通量分析确定OCR(耗氧率)。请注意，高ATP MCF7细胞群表现出基础呼吸和最大呼吸以及线粒体ATP产生的增加。铺平板后24小时，分析细胞群。数据表示相对于低ATP10％细胞的％倍数增加±SD，n＝3。非配对t检验，*p<0.05，**p<0.005。使用SeahorseXFe96通过代谢通量分析确定ECAR(细胞外酸化率)。请注意，高ATP MCF7细胞群表现出糖酵解增加。铺平板后24小时，分析细胞群。数据表示相对于低ATP 10％细胞的％平均倍数增加±SD，n＝3。非配对t检验，ns＝不显著，***p<0.0005。图10B和10C中的能量谱表明，高ATP亚群相对于低ATP群在代谢上更活跃。细胞附着后24小时，高ATP MCF7细胞单层表现出基础呼吸增加2倍，最大呼吸增加1.5倍，ATP产生增加3倍。同样，高ATP MCF7单层细胞还表现出基础糖酵解速率增加1.5倍。图10D和10E中的糖酵解速率表明，高ATP亚群比低ATP亚群具有明显更高的生物能。

对高ATP细胞亚群增殖能力的评估表明，在多种癌症类型中，高ATP细胞亚群的增殖能力明显比低ATP亚群更强。使用利用碘化丙啶的FACS分析来检测DNA含量，图11A-11D显示了MCF7、T47D、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中的细胞周期进展。可以看出，根据从G0/G1期到S期和G2/M期的转变，高ATP细胞亚群的增殖能力明显比低ATP细胞亚群更强。更具体地说，G0/G1期从大约80-88％减少到60-64％，而S期从4-8％增加到9-21％。同样，G2/M期从7-12％增加到17-30％。在所有4种细胞系中都观察到了高ATP细胞亚群相对于低ATP亚群在细胞周期进展方面的这些明显增加。总体而言，这表示在所测试的4种细胞系中，S期细胞数量增加到1.9-3.6倍，G2/M期细胞数量增加到1.8-3.8倍。有趣的是，在MCF7细胞中观察到S期的最大增加，而在MDA-MB-231细胞中观察到G2/M期的最大增加。

相反，每个细胞系中的低ATP群基本上是静止的，80-88％的细胞处于细胞周期的G0/G1期，表现细胞周期停滞的主要表型。因此，低ATP细胞亚群非常符合癌细胞休眠的当前定义。

因此，高ATP水平是“干性”特征、非锚定依赖性生长和细胞增殖的主要决定因素。因此，本文所述的实际方法允许从总细胞群中成功地分离出生物能量学上“最适生存”和增殖最强的癌细胞，并形成具有独特表型特性的细胞的新组合物。这些特性对抗药性有影响。

高ATP亚群中的MCF7细胞表现出多药抗性表型。使用3D-乳腺球测定探讨高ATP和低ATP MCF7细胞亚群对四种不同类别药物的不同敏感性，用作抗药性的功能读数。药物类别包括他莫昔芬、多西环素、DPI和帕博昔布(Palbociclib)。图12A显示了低ATP亚群(后5％)的结果，图12B显示了高ATP亚群(前5％)的结果。图12A和12B显示了每种药物类别的两个浓度。

他莫昔芬是FDA批准的常规用于临床靶向ER(+)乳腺癌细胞的药物，通常会导致他莫昔芬抗性和治疗失败，从而导致肿瘤复发和远端转移。有趣的是，低ATP MCF7细胞的3D乳腺球形成对他莫昔芬处理非常敏感，在1μM时导致减少约40％，在5μM时减少>90％。相比之下，图12B显示高ATP MCF7细胞的3D-乳腺球形成对他莫昔芬具有显著的抗性，因为3D乳腺球的形成在5μM时仍然很高，占媒介物处理的对照水平的80％以上。因此，高ATP MCF7细胞显然对他莫昔芬具有抗性。

图12B显示高ATP MCF7细胞对线粒体OXPHOS抑制剂即二亚苯基碘鎓(DPI)也具有抗性。例如，对低ATP细胞的DPI处理在100nM时将3D乳腺球形成减少了>90％。另一方面，高ATP细胞的DPI处理(100nM)仅将3D乳腺球形成减少了约55％。因此，这两个亚群都对线粒体抑制剂敏感，但高ATP细胞显然更耐药。

多西环素是FDA批准的抗生素，充当线粒体核糖体翻译的抑制剂。比较图12A和图12B表明，在对低ATP MCF7细胞非常有效的浓度即25μM和50μM下，高ATP亚群在很大程度上对多西环素耐药。

帕博昔布是FDA批准的CDK4/6抑制剂，其功效在图12A和12B中也是明显的。低ATP细胞的帕博昔布处理在12.5nM时将3D乳腺球的形成减少了约75％。然而，高ATP细胞的帕博昔布处理(12.5nM)仅将3D球体形成减少了约50％。因此，高ATP细胞对CDK4/6抑制剂也更耐药。可以看出，高ATP亚群是对几种药物类型具有抗性的表型。

将Biotracker-ATP-Red 1与干性的公认标志物，CD44和ALDH活性进行了比较。为了直接比较ATP-Red 1与其他CSC标志物的有效性，对MCF7细胞和MDA-MB-231细胞都应用了双标记策略。对细胞进行CD44和ATP双重标记，使用不同的荧光通道进行检测。在CD44和ATP的情况下，这产生4个实验组：高CD44/高ATP、高CD44/低ATP、低CD44/高ATP以及低CD44/低ATP。

细胞分选后，对所得的四个亚群进行3D乳腺球测定，作为干性的功能读出。ATP与CD44细胞表面表达。使用MCF7和MDA-MB-231系，在细胞分选后，在不同的细胞亚群中测量3D非锚定依赖性生长，作为干性的功能读出。简而言之，首先用BioTracker-ATP(PE通道)和抗CD44(APC通道)对2D单层进行共染色，并使用SONY SH800细胞分选仪对其进行流式细胞术。细胞计数后，将5x10³个细胞接种在涂覆有poly-HEMA的6孔板中，并在铺平板后5天对3D乳腺球进行计数。如图13A和13B所示，低CD44/低ATP细胞显示出的非锚定依赖性生长最少，正如考虑到这些亚群的表型特性预期的那样。因此，选择低CD44/低ATP-细胞作为归一化的点。两个细胞亚群都表现出最多的非锚定依赖性生长：高CD44/高ATP和低CD44/高ATP。因此，在MCF7和MDA-MB-231细胞中，与CD44相比，高ATP水平是干性的主要决定因素。

仅考虑高CD44群并用ATP进行双重标记允许将高CD44群体分成2个亚群，一个亚群具有高增殖能力(高CD44/高ATP)，一个亚群具有低增殖能力(高CD44/低ATP)。因此，高CD44/低ATP群明显表现出显著更少的非锚定依赖性生长，并且代表更“休眠”的CD44(+)CSC亚群。

通过用ADLH活性和ATP进行双重标记，也获得了几乎相同的结果。在细胞分选后，使用MCF7和MDA-MB-231细胞系，在不同的细胞亚群中测量3D非锚定依赖性生长，作为干性的功能读出。简而言之，首先用BioTracker-ATP(PE通道)和ALDH活性(APC通道)对2D单层进行共染色，并使用SONY SH800细胞分选仪对其进行流式细胞术。细胞计数后，将5x10³个细胞接种在涂覆有poly-HEMA的6孔板中，并在铺平板后5天对3D乳腺球进行计数。图13C和13D分别显示了关于ALDH活性和ATP被双重标记的MCF7和MDA-MB-231细胞系的乳腺球形成测定结果。正如预期的那样，表现出最不依赖锚定生长的两个细胞群是高ALDH/高ATP和低ALDH/高ATP。因此，在MCF7和MDA-MB-231细胞中，与ALDH相比，高ATP水平是干性的主要决定因素。同样，用ATP进行双重标记允许将高ALDH群分成2个亚群，一个具有高增殖能力(高ALDH/高ATP)，一个具有低增殖能力(高ALDH/低ATP)。

上述内容证明，本方法是强大且有效的方法，其使用ATP作为休眠的第二标志物将CSC细分为更活跃、过度增殖的亚群和更休眠的亚群。结果还表明，ATP水平是CSC休眠的功能调节剂。

还探讨了线粒体ATP在细胞迁移、侵袭和自发转移中的作用。数据表明，线粒体ATP是癌细胞转移过程的能量生物标志物。MDA-MB-231细胞是在体外和体内研究细胞运动和转移的公认模型。使用Transwells，通过采用改良的Boyden室测定，评估了MDA-MB-231细胞的高ATP亚群和低ATP亚群进行细胞迁移和侵袭的能力。还选择了本体(5％)群用于比较。为了研究侵袭，用细胞外基质，即Matrigel涂覆Transwells，以阻止简单的细胞迁移。对于细胞迁移和侵袭测定，用血清作为化学引诱剂。使用结晶紫染色强度和细胞数对迁移和侵袭参数独立定量。

图14A和14B显示了该迁移和侵袭分析的结果。与低ATP细胞相比，高ATP MDA-MB-231细胞进行细胞迁移的能力提高20-40倍。正如预期的那样，本体(5％)细胞显示出中间表型。与低ATP细胞群相比，高ATP MDA-MB-231细胞进行侵袭的能力提高15-25倍。因此，高ATPMDA-MB-231细胞代表了体内促转移(pro-metastatic)细胞亚群。

为了进一步评估，使用公认的体内转移测定(涉及鸡卵的绒毛尿囊膜(chorio-allantoic membrane,CAM))定量测量自发转移。在细胞分选以分离高ATP细胞亚群和低ATP细胞亚群后，将30,000个细胞(MDA-MB-231)的接种物添加到每个卵的CAM上(第E9天)，然后将卵随机分组。在第E18天，收集下方CAM以使用针对人Alu序列的特异性引物通过qPCR分析来评估转移细胞的数量。还平行评估未注射的卵，作为特异性的阴性对照。每种实验条件处理超过20个卵。

图15显示了自发转移体内CAM测定的结果。数据表明，高ATP亚群中的MDA-MB-231细胞的转移性是低ATP细胞亚群的4.5倍。这些亚群源自相同的细胞系。因此，高ATP亚群中的MDA-MB-231细胞代表促转移CSC亚群。如上文结合图4C所讨论的，高ATP亚群中的MDA-MB-231细胞也过表达两种CTC和转移标志物(VCAM-1和Ep-CAM)，表明过度增殖CSC是负责播种远端转移的CTC。

因此，本方法可用于检测癌症转移的可能性。例如，可以对来自癌症的生物样品进行代谢分级以评估高ATP亚群的含量，并且可以使用该含量来评估癌症转移的可能性。对癌症患者的高ATP亚群中的细胞的早期检测和分析为诊断转移风险和确定合适的治疗(例如用本文讨论的ATP耗竭治疗剂进行治疗)提供宝贵的机会。

纯化高ATP MCF7细胞的Tempo-ATP蛋白质生物传感器为ATP作为癌细胞干性的新生物标志物的用途提供了独立验证。Tempo-ATP是一种荧光蛋白生物传感器，一种完全不同的用于检测活细胞中ATP水平的探针，并被用于检测高水平和低水平的ATP。

重组地过表达胞质荧光蛋白ATP生物传感器的Tempo-ATP-MCF7细胞由Tempo-Bioscience,Inc.(San Francisco,CA,USA)使用嘌呤霉素抗性标志物进行细胞选择而定制生成。这种基于蛋白质的荧光ATP生物传感器的激发波长为517-519-nm，发射波长为535-nm。它由与GFP样荧光报告蛋白符合读框地融合的ATP结合肽组成。使用流式细胞仪(激发＝517-519-nm；发射＝535-nm)，针对GFP含量作为细胞质ATP含量的替代标志物，对Tempo-ATP-MCF7细胞进行分选。细胞计数后，使用相等数量的单细胞来评估它们的代谢和表型性能。

结果如图16A-16C所示。高GFP亚群相对于低GFP亚群的发光相对增加如图16A所示。细胞周期进展数据总结在图16B中，并且乳腺球形成测定结果示于图16C中。正如迄今为止的讨论所预期的那样，高ATP Tempo-MCF7细胞表现出ATP显著增加，还原型谷胱甘肽、NADP/H和NAD/H更多，以及细胞周期进展和3D非锚定依赖性生长的增加。Tempo-ATP数据独立验证了BioTracker ATP-Red 1结果，特别是，高ATP水平是抗氧化能力、细胞增殖和3D非锚定依赖性生长的关键决定因素。尽管Tempo-ATP是有效的，但BioTracker ATP-Red 1明显更有效，因为它直接定位于线粒体内，而线粒体是ATP产生的主要细胞来源。

本方法证明，高ATP产生是癌细胞“干性”性状和增殖的关键驱动因素。本文公开的观察结果可以解释在癌细胞群中观察到的代谢异质性的分子基础，以及它与表型行为的关系，所述表型行为例如i)快速细胞周期进展和ii)非锚定依赖性生长，这两者都是CSC体内转移散播所需的。

正如所证明的，ATP可用作对癌细胞群进行代谢分级以及鉴别过度增殖(hyper-prolific)和休眠亚群的生物标志物。这进而表明ATP耗竭疗法可能对于治疗过度增殖亚群是有效的，并减少或消除肿瘤复发和转移的可能性。

在本方法下，允许技术人员测量活细胞中ATP水平的重要荧光染料，例如BioTracker ATP-Red 1，可用作代谢分级的成像探针。更特别地，BioTracker ATP-Red 1染色可以与生物能分级方案相结合，其中对总细胞群进行流式细胞术，以分离该群的高ATP亚群和低ATP亚群。MCF7细胞，一种ER(+)人乳腺癌细胞系，在上面讨论的许多实例中都使用过，但应当理解，本方法可以用于任何细胞系和任何癌症类型。代谢分级方法允许在总细胞群中分离出最有“活力”的癌细胞。有利的是，所得的高ATP癌细胞亚群可以通过ATP耗竭疗法被靶向根除，并作为药物发现和开发的基础。鉴于表型特性，高ATP亚群也可以用于评估预防或降低复发和转移的可能性的疗法。

在平行研究中，发明人鉴别了超过20种可用于有效实现ATP耗竭疗法的线粒体靶向治疗剂。这些潜在的治疗剂包括：FDA批准的药物(多西环素、替加环素、阿奇霉素、恩波吡维铵、阿托伐醌、贝达喹啉、氯硝柳胺、伊立替康)；天然产物/营养品(放线酰胺素、CAPE、小檗碱、布鲁替瑞定、Melitidin)；和实验化合物(寡霉素、AR-C155858、Mitoriboscins(参见国际申请号PCT/US2018/022403，其于2018年3月14日提交，并通过引用整体并入)、Mitoketoscins(参见国际申请PCT/US2018/039354，其于2018年6月25日提交，并通过引用整体并入)、Mitoflavoscins(参见国际专利申请PCT/US2018/057093，其于2018年10月23日提交，并通过引用整体并入)、TPP衍生物(包括十二烷基-TPP和2-丁烯-1,4-双-TPP，参见国际专利申请PCT/US2018/062174，其于2018年11月21日提交，并通过引用整体并入)。发现两种抗生素与维生素C的三重组合(多西环素、阿奇霉素和抗坏血酸)在亚抗微生物水平上对靶向线粒体、诱导ATP耗竭和抑制CSC增殖特别有效(参见国际专利申请PCT/US2019/066541，其于2019年12月16日提交，并通过引用整体并入)。ATP耗竭化合物可以是经修饰增加功效、细胞膜穿透和/或线粒体摄取的现有化合物，例如2018年5月18日提交并通过引用整体并入的国际专利申请PCT/US2018/033466和2018年11月29日提交并通过引用整体并入的国际专利申请PCT/US2018/062956描述的那些化合物。例如，与脂肪酸(例如肉豆蔻酸)缀合的多西环素可以用作ATP耗竭化合物。在某些情况下，施用剂量增加的化合物可能是合适的，例如当高ATP亚群对本领域通常处以的剂量的化合物表现出抗性时。可以施用化合物。应当理解，任何上述化合物都可以用作靶向高ATP亚群并预防或降低复发和转移可能性的ATP耗竭治疗剂。还应当理解，当发现患者癌症生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的5元基因特征的表达水平相对于该患者的非癌性生物样品升高时，任何上述化合物都可以用作施用于该癌症患者的治疗剂。

由于许多化合物是经重新目的化的FDA批准的具有出色安全性的抗生素，因此需要进行II期临床试验。例如，多西环素的II期临床初步研究已经表明，如使用CD44和ALDH1作为特异性CSC标志物所证明的，这种50年以上的抗生素在代谢靶向早期乳腺癌患者的CSC群方面确实有效。预期线粒体ATP耗竭疗法在功能上模拟禁食和/或热量限制，从而更有效地将CSC饿死。在本方法下，可以包括禁食和/或热量限制作为抗癌疗法的一部分，以提高ATP耗竭疗法的有效性。例如，接受ATP耗竭疗法的患者可以在接受治疗化合物给药之前禁食一段时间，例如12、16、24、36或48小时，和/或可以在接受治疗化合物给药后禁食一段时间，例如12、16、24、36或48小时。在一些实施方案中，可以在施用治疗化合物之前和之后进行禁食，以增加ATP消耗效果。这对预防癌症和在衰老过程中潜在地延长人类寿命具有重要意义。

高ATP亚群中的细胞显示出多药抗性表型，抗氧化能力增强。先前的研究表明，由于还原型谷胱甘肽水平增加、NADPH升高和NRF2信号传导激活造成的高抗氧化能力明显有助于多药抗性的发生。高ATP亚群中的MCF7细胞具有的抗氧化能力增强，还原型谷胱甘肽水平增加，并且对四种不同类别的药物(他莫昔芬、帕博昔布、多西环素和DPI)具有内在抗性。因此，高ATP CSC表型的存在可能有助于在机理上解释癌症治疗期间多药抗性的发病机制。在这种背景下，目前的癌症疗法可能只允许代谢“最适生存”的癌细胞存活。这些细胞进而造成最大的复发和转移风险。

上文公开的数据还表明了线粒体“功率(power)”和他莫昔芬抗性之间的直接因果关系。例如，通过长期暴露于浓度不断增加的他莫昔芬而生成的具有他莫昔芬抗性的MCF7-TAMR细胞表现出线粒体OXPHOS和ATP产生水平升高。在MCF7-TAMR细胞中，获得性他莫昔芬抗性是由于两种关键抗氧化蛋白(NQO1和GCLC)的过表达及其对线粒体代谢的积极代谢作用所致，正如无偏蛋白质组学分析所揭示的。此外，在MCF7细胞中NQO1或GCLC的重组过表达自主地赋予线粒体ATP产生和他莫昔芬抗性的约2倍增加。此外，雌激素受体(ER-α；ESR1)中体细胞突变(Y537S)的重组过表达在临床上与乳腺癌患者的获得性他莫昔芬抗性相关，在遗传学上赋予升高的线粒体生物合成、OXPHOS和高ATP产生。MCF7-TAMR细胞和MCF7-ESR1(Y537S)细胞在功能激活的生物学过程中的蛋白质组图谱也表现出相当大的重叠。最后，60种在功能上与线粒体ATP产生相关的基因产物预测了ER(+)/Luminal A乳腺癌患者的他莫昔芬抗性。这些预测性生物标志物包括18种不同的线粒体核糖体蛋白(MRP)和线粒体OXPHOS复合物的超过20种不同的成分。本文公开的数据表明，在之前没有暴露于他莫昔芬的情况下，高ATP亚群中的“原始”MCF7细胞对他莫昔芬具有内在抗性。这对于优化激素性乳腺癌疗法的有效性具有重要的临床意义。

此前有报道称，传统化疗方案的治疗实际上在选择性杀伤“本体”癌细胞的同时增加了CSC的数量。在本公开之前，没有提出解释该现象的代谢假说。Chan及其同事(来自Genentech,Inc.)检查了吉西他滨和依托泊苷对总癌细胞群的影响。值得注意的是，他们观察到，在用吉西他滨和依托泊苷处理后，存活细胞群表现出ATP含量增加、线粒体质量升高和线粒体呼吸更多。然而，他们没有对这些观察结果提出机理解释，也没有考虑CSC群。相反，他们只是简单地得出结论，测量ATP并不是评估化疗药剂有效性的好方法。鉴于本文公开的数据，对其结果的另一种解释是，吉西他滨和依托泊苷选择性地杀伤癌细胞的低ATP亚群和本体亚群，从而富集了更干性样和更具抗药性的、“有活力”的高ATP亚群。因此，应当启动有助于根除癌细胞中高ATP亚群的新药物发现。

尽管已经提出了多种机制，包括糖酵解和/或线粒体代谢增加，但也已提出在多种长期处理的结肠癌细胞系和卵巢癌细胞系(HT29、HCT116、A2780)中，较高的细胞内ATP水平可以解释对奥沙利铂和顺铂的获得性耐药性。然而，在以前的研究中，只有在长期筛选到抗药性细胞群后才测量ATP水平。因此，无法确立ATP产生与抗药性之间的直接因果关系。

此前，发明人使用更间接的方法分离“有活力的(energetic)”癌症干细胞(e-CSCS)，该方法使用自发荧光检测细胞内FAD、FMN和核黄素含量。参见2019年6月19日提交的国际专利申请PCT/US2019/037860，其通过引用整体并入。然而，使用ATP-Red 1是直接方法和实质性改善。例如，使用高自发荧光(AF；前5％)对MCF7 2D单层分级得到高AF细胞群，其非锚定依赖性生长增加1.5倍且APT产生增加近2倍。相反，在本方法中，使用ATP-Red 1(前5％)导致高ATP MCF7单层细胞亚群，其非锚定依赖性生长具有9倍增加且ATP含量增加超过15倍。来自其他癌细胞系(T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468)的高ATP亚群表现出类似的过度增殖特征。因此，使用ATP作为直接的能量生物标志物远远优于自发荧光。此外，ATP-Red 1还可以有效地对所测试的其他三种乳腺癌细胞系进行代谢分级。

根据肿瘤休眠的传统观点，休眠的癌细胞进行较慢速率的细胞增殖和/或细胞周期阻滞(静止)，以避免治疗诱导的细胞死亡，从而导致多药抗性。本文公开的数据表明相反的现象：使用3D乳腺球测定作为读数，低ATP亚群中的MCF7细胞增殖较少，超过87％的细胞处于细胞周期的G0/G1期，但对4种不同类别的药物更敏感。相反，高ATP亚群中的MCF7细胞增殖能力明显更强，超过38％的细胞处于S期或G2/M期，这表示明显的多药抗性表型。因此，高水平的线粒体ATP是细胞增殖和抗药性的关键驱动因素，因为它们代表了能量上“最适生存”的癌细胞群。

发明人已经证明，使用体内异种移植动物模型，用一组不同的抗线粒体治疗剂进行治疗i)代谢诱导ATP耗竭和ii)足以有效抑制癌细胞转移。这些结果表明，高ATP水平对CSC转移过程至关重要，并且与本文公开的数据一致，表明高ATP CSC是过度增殖的、干性样的、非锚定依赖性的，同时其抗氧化能力和内在多药抗性增加。因此，可以使用本方法分离的高ATP CSC可能造成肿瘤复发和体内转移。

上述生物信息学分析表明，ATP相关基因，尤其是编码线粒体ATP合酶催化核心的γ亚基的ATP5F1C与干性、增殖和转移密切相关。此外，ATP5F1C是肿瘤复发和远端转移的预后生物标志物，也是接受他莫昔芬治疗的ER(+)患者治疗失败的标志物。此外，高ATP MDA-MB-231细胞表现出进行体外细胞迁移和侵袭以及体内自发转移的能力显著增加。因此，线粒体ATP在转移散播中起关键作用。因此，线粒体ATP合成抑制剂作为传达转移预防的潜在治疗剂对于根除高ATP亚群中的CSC应当是有效的。

本方法的药物组合物包括在任何药学上可接受的载体中的ATP耗竭化合物(如上所鉴别的)。如果需要溶液，水可以是水溶性化合物或盐的精选载体。关于水溶性，诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇或其混合物等有机载体可能是合适的。此外，在不背离本方法的情况下，可以使用增加水溶性的方法。在后一种情况下，有机载体可以含有大量的水。然后可以以本领域技术人员已知的合适方式对任一情况的溶液进行灭菌，且出于例示，通过0.22微米过滤器过滤。灭菌后，可以将溶液分配到适当的容器中，例如去热原玻璃小瓶。分配可选地通过无菌方法进行。然后可以在小瓶上放置灭菌的闭合盖(clousre)，并且如果需要，可以冻干小瓶内容物。包括诸如糖酵解抑制剂或OXPHOS抑制剂等第二抑制剂化合物的实施方案可以共同施用本领域可用的第二抑制剂的形式。除非另有说明，否则不旨在将本方法局限于具体的施用形式。

除了ATP耗竭化合物之外，本方法的药物制剂还可以含有本领域已知的其他添加剂。例如，一些实施方案可以包括pH调节剂，例如酸(例如盐酸)和碱或缓冲剂(例如乙酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠、乳酸钠和磷酸钠)。一些实施方案可以包括抗微生物防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲醇。当将制剂置于专为多剂量使用而设计的小瓶中时，通常包括抗微生物防腐剂。可以使用本领域熟知的技术冻干本文所述的药物制剂。

在涉及口服施用ATP耗竭化合物的实施方案中，药物组合物可以采取胶囊、片剂、丸剂、粉剂、溶液、混悬剂等形式。含有诸如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙等各种赋形剂的片剂，可以与诸如淀粉(例如马铃薯或木薯淀粉)和某些复合硅酸盐等各种崩解剂以及诸如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶等黏合剂一起使用。此外，为了压片目的，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石。相似类型的固体组合物可用作软和硬填充明胶胶囊的填充剂。在这方面的材料还包括乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇。当口服施用需要水性悬浮剂和/或酏剂时，本公开主题的化合物可以与以下组合：各种甜味剂、调味剂、着色剂、乳化剂和/或助悬剂，以及诸如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种同类组合等稀释剂。在具有羰花青化合物和第二抑制剂化合物的实施方案中，可以以单独的形式施用第二抑制剂化合物，而不局限于羰花青化合物的形式。

本文提供的另外的实施方案包括本文公开的ATP耗竭化合物的脂质体制剂。形成脂质体悬浮液的技术在本领域是众所周知的。当化合物是水溶性盐时，使用常规脂质体技术，同样可以掺入脂质囊泡中。在这种情况下，由于活性化合物的水溶性，可以基本上将活性化合物截留在脂质体的亲水中心或核心内。所用的脂质层可以具有任何常规组成，并且可以含有胆固醇或可以不含胆固醇。当感兴趣的活性化合物是水不溶性的时，再次采用常规的脂质体形成技术，可以将盐基本上截留在形成脂质体结构的疏水脂质双层中。在任何一种情况下，可以例如通过使用标准超声和均质技术，减小所产生的脂质体的尺寸。可以将包含本文公开的活性化合物的脂质体制剂冻干以产生冻干物，可以用药学上可接受的载体例如水重构冻干物以再生脂质体悬浮剂。

关于药物组合物，本文ATP耗竭化合物的药学有效量应由保健从业者确定，并且应取决于患者的健康状况、体型和年龄以及递送途径。在一个非限制性实施方案中，约0.1mg/kg至约200mg/kg的剂量具有治疗功效，其中重量比是ATP耗竭化合物(包括使用盐的情况)的重量与个体的重量的比。在一些实施方案中，剂量可以是提供高达约1至5、10、20、30或40μM的活性化合物的血清浓度所需的化合物的量。在一些实施方案中，对于口服施用，可以使用约1mg/kg至约10mg/kg的剂量，并且在一些实施方案中，可以使用约10mg/kg至约50mg/kg的剂量。通常，对于肌内注射，可以使用约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量。在一些实施方案中，对于静脉内或口服施用，化合物的剂量可以是约1μmol/kg至约50μmol/kg，或任选地约22μmol/kg至约33μmol/kg。口服剂型可以包括任何合适量的活性物质，包括例如每个片剂或其他固体剂型5mg至50、100、200或500mg。

以下段落描述了结合本文所述数据和实施方案使用的材料和方法。应当理解，本领域技术人员可以使用本领域普遍接受的可选材料和方法，而不偏离本方法。

细胞系和试剂：ER(+)[MCF7和T47D]和三阴性[MDA-MB-231和MDA-MB-468]人类乳腺癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。ATP-Red 1(也称为BioTracker^TM ATP-Red活细胞染料；#SCT045)从Sigma-Aldrich,Inc购买获得。

图1A的热图是使用之前存储在NCBI数据库中的GSE36953 GEO数据集制备的。在三种不同的生长条件下从MDA-MB-231细胞(TNBC细胞系)制备总RNA：2D贴壁生长、3D非锚定依赖性生长和体内肿瘤生长。使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0阵列进行分析。热图是使用QIAGEN OmicSoft Suite软件生成的。ATP相关基因在两种3D生长条件(非锚定依赖性和体内肿瘤)下相对于2D贴壁生长都转录上调。

用ATP-Red 1进行Vital Staining(活体染色)后的流式细胞术：首先使人类乳腺癌细胞系生长为2D单层或3D球体。然后收集细胞并解离成单细胞悬浮液，然后使用SONYSH800细胞分选仪通过流式细胞术进行分析或分选。简而言之，在用探针ATP-Red 1进行活体染色后，分离出高ATP细胞亚群和低ATP细胞亚群。在ATP-Red 1信号内，通过门控选择高ATP细胞亚群和低ATP细胞亚群。除非另有说明，否则将具有最低(后5％或10％)荧光信号或最高(前5％或10％)荧光信号的细胞分别收集为低ATP和高ATP。由于门控设置，门控外的细胞在分选过程中被丢弃。但是，为了在分选过程中确保高纯度，通常需要这样的设置。使用FlowJo 10.1软件分析数据。

用Cell-Titer-Glo进行ATP测定：Cell-Titer-Glo(#G7570)获得自Promega,Inc.，并根据制造商的建议用来测量裂解细胞中的ATP水平。Cell-Titer-Glo是基于荧光素酶的测定系统。

3D锚定依赖性生长测定：使用酶促(1x Trypsin-EDTA，Sigma Aldrich，目录号T3924)和手动解聚(25号针)制备单细胞悬液。在非贴壁条件下，将5000个细胞铺平板于涂有甲基丙烯酸2-羟乙酯(poly-HEMA,Sigma,目录号P3932)的六孔板中的乳腺球培养基(DMEM-F12/B27/20ng/ml EGF/PenStrep)内。使细胞生长5天，并在5％(v/v)二氧化碳/空气中在大气压下保持在37℃的加湿培养箱中。5天后，使用配备有刻度目镜的显微镜对直径大于50μm的3D球体进行计数，计算形成球体的细胞的百分比并将其归一化为1(1＝100％MFE；乳腺球形成效率)。乳腺球测定一式三份独立进行并重复三次。

代谢通量分析：使用Seahorse XFe96分析仪(Agilent/Seahorse Bioscience,USA)分析细胞外酸化率和耗氧率。将细胞维持在补充有10％FBS(胎牛血清)、2mM GlutaMAX和1％Pen-Strep的DMEM中。将2万个乳腺癌细胞接种到XFe96孔细胞培养板的每孔中，并在37℃下、在5％CO₂加湿气氛中孵育至少12小时以使细胞附着。大约24小时后，将MCF7细胞在预热的XF测定培养基中洗涤，或者用于OCR测量，XF测定培养基补充有10mM葡萄糖、1mM丙酮酸盐、2mM L-谷氨酰胺，并调节至7.4pH。然后将细胞保持在37℃下非CO₂培养箱中的175μL/孔XF测定培养基中1小时。在孵育期间，将25μL 80mM葡萄糖、9μM寡霉素和1M 2-脱氧葡萄糖(用于ECAR测量)或10μM寡霉素、9μM FCCP、10μM鱼藤酮、10μM抗霉素A(用于OCR测量)在XF测定介质中加载到XFe96传感器盒的注射端口中。通过蛋白质含量(SRB测定)和Hoechst33342含量对测量结果进行归一化。使用XFe96软件和GraphPad Prism软件，使用单因素ANOVA和学生t检验计算分析数据集。所有实验一式五份独立进行三次。

通过FACS进行细胞周期分析：使用Attune NxT流式细胞仪通过FACS分析对高ATP细胞亚群和低ATP细胞亚群进行细胞周期分析。简而言之，在胰蛋白酶消化后，将重悬浮的细胞与10ng/ml的Hoescht溶液(Thermo Fisher Scientific)在37℃在黑暗条件中孵育40min。40分钟后，洗涤细胞，并重悬浮于PBS Ca/Mg中用于获得，或重悬浮于分选缓冲液[含有3％(v/v)FBS和2mM EDTA的1×PBS]用于FACS。每个条件分析了50,000个事件。将门控细胞手动分类至多个细胞周期阶段。

统计显著性：所有分析均使用GraphPad Prism 6进行。数据表示为平均值±标准差(或±SEM，在指出时)。所有实验至少独立进行3次，对于每个测试的实验条件技术重复>3次(除非另有说明，例如，当示出代表性数据时)。使用学生t检验或方差分析(ANOVA)确定统计学上显著的差异。对于多组之间的比较，使用单因素ANOVA来确定统计显著性。p<0.05视为显著的，所有统计检验都是双向的：p*<0.05；p**<0.01；p***<0.005；p****<0.0001。

生物信息学分析：如前所述，使用MCF7和T47D乳腺癌细胞系进行了比较2D单层和3D乳腺球的无偏无标记蛋白质组学。使用存档在NCBI数据库中与3D生长、转移和循环肿瘤细胞(CTC)相关的的各种公众可获得的GEO数据集(GSE36953、GSE2034、GSE59000、GSE55470)进行信息学分析。从这些GEO数据集中提取基因表达图谱分析数据。使用QIAGENOmicSoft Suite软件生成热图。通过检查肿瘤学与转移性癌症(QIAGEN OmicSoft Suite)中存在的注释产生火山图。此外，使用Ingenuity Pathway Analysis软件(IPA；QIAGEN)对注释的基因进行功能“核心分析”。使用cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)从转移性乳腺癌临时项目(The Metastatic Breast Cancer Project Provisional)(2020)中提取基因共表达谱；通过对来自146名患者的转移性乳腺癌样本进行RNA测序，进行mRNA表达图谱分析(RNA Seq V2 RSEM)。

卡普兰-梅尔(K-M)分析：为了对ATP5F1C进行K-M分析，我们使用开放访问的在线存活分析工具来询问来自高达3,951名乳腺癌患者的公众可获得的微阵列数据。为此，我们主要分析了来自ER(+)患者的数据。有偏阵列(biased array)数据被排除在分析之外。这允许我们将ATP5F1C(也称为ATP5C1)鉴别为有意义的预后标志物。在最佳自动选择的截止值下计算风险比，并使用对数秩检验计算p值并在R中绘制。使用K-M绘图仪，使用单变量分析，在线生成K-M曲线(作为高分辨率TIFF文件)：

https://kmplot.com/analysis/index.php？p＝service&cancer＝breast。

这种方法允许直接计算机验证作为肿瘤复发(RFS，无复发存活)和远端转移(DMFS，无远端转移存活)的标志物的ATP5F1C。所有这些分析均使用了最新的2020版的数据库。

细胞迁移测定：简而言之，将0.5ml具有0.1％BSA的无血清DMEM中的2.5×10⁴个细胞添加到8-μm孔、无涂覆膜修饰的Boyden室(Transwells)的孔中。下室含有于DMEM中的10％的胎牛血清用作化学引诱剂。将细胞在37℃孵育，并使其迁移整整6小时的时程。通过用棉签擦拭从膜的上表面去除非侵袭性细胞。将室在100％甲醇稀释的0.5％结晶紫中染色30-60min，在水中冲洗并在明视野显微镜下检查。侵袭和迁移的值通过对每个膜计算五个视野(20×物镜)来获得，并代表三个独立实验的平均值。请注意，预涂有细胞外基质(即Matrigel)的Transwells用于测量侵袭性细胞侵袭并阻止简单的细胞迁移。

转移测定：鸡胚转移测定由法国La Tronche(La Tronche-France)的INOVOTION(Société:811310127)进行。根据法国立法(decree n°2013–118,2013年2月1日；art.R-214–88)，使用卵生胚胎进行科学实验不需要伦理批准。动物研究是依据INOVOTION的动物实验许可号N°381029和B3851610001进行的。在37.5℃和50％相对湿度下，孵育受精的白来杭鸡(White Leghorn)卵9天。每种实验条件处理超过20个卵。在那一刻(E9)，通过在蛋壳中钻一个小孔进入气囊使绒毛尿囊膜(CAM)下降，并在CAM上方的蛋壳中切出一个1cm²的窗口。将MDA-MB-231肿瘤细胞系培养在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。在第E9天，用胰蛋白酶使细胞离壁，用完全培养基洗涤，并悬浮在移植培养基中。在通过流式细胞术进行基于ATP的细胞分选后，将30,000个细胞的接种物添加到每个卵的CAM中(E9)，然后将卵随机分组。在第E18天，收集下方CAM的1cm2部分，以评估每组8个样品中转移细胞的数量(n＝10)。提取CAM中的基因组DNA(商业试剂盒)，并使用人类Alu序列的特异性引物通过qPCR来分析。通过

CFX Maestro软件直接处理每组每个样品的Cq计算、平均Cq和相对转移量。还平行了评估未注射的卵，作为特异性的阴性对照。对所有数据进行单因素ANOVA和事后检验。

在描述本方法的实施方案时使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而非旨在限制。如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。如通过考虑以下详细描述将变得明显的，本方法包括许多替代、修改和等同方案。

应当理解，尽管术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等可以在本文中用于描述本方法的各种要素，但权利要求书不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分本方法的一个要素与另一个要素。因此，在不背离本方法的教导的情况下，下面讨论的第一要素可以称为一个要素方面，并且类似地，第三要素也可以称为一个要素方面。因此，术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等并非旨在必须传达相关要素的顺序或其他层次结构，而是仅用于识别的目的。操作(或步骤)的顺序不限于权利要求中呈现出的顺序。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本领域普通技术人员的通常理解的相同的含义。还应当理解，诸如在常用词典中定义的术语应当解释为具有在本申请的背景和相关技术中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义解释，除非本文如此明确定义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。

此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任一和所有可能组合，以及以替代(“或”)解释时无组合。

除非上下文另有说明，否则特别意欲本文所描述的本方法的各种特征可以以任何组合使用。此外，本方法还设想在一些实施方案中，可以排除或省略针对说明性实施例描述的任何特征或特征组合。

如本文所用，过渡短语“主要由……组成”(和语法变体)应解释为包括所列举的材料或步骤“以及那些实质上不影响权利要求的基本特征和新颖特征的那些”。因此，本文使用的术语“主要由……组成”不应解释为等同于“包括”。

本文所用的术语“约”在提及可测量值时，例如量或浓度等，旨在包括指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％，或甚至±0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可以包括其中的任何其他范围和/或单个值。

已经如此描述了本方法的某些实施方案，但应当理解，所附权利要求的范围不受以上描述中阐述的具体细节的限制，因为在不背离下文请求保护的其精神或范围的情况下，其许多明显的变化是可能的。

Claims

1.过度增殖癌症干细胞的纯化组合物，所述组合物包含人类癌细胞群中的细胞亚群，所述癌细胞群响应于荧光三磷酸腺苷(ATP)成像探针表达一个范围的荧光信号，并且所述细胞亚群表达所述基于ATP的荧光信号范围的上部。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述上部包括基于ATP的荧光信号的前10％。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述上部包括基于ATP的荧光信号的前5％。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物对于CD44标志物和ALDH标志物之一呈阳性。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含循环肿瘤细胞(CTC)。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是冷冻的。

7.纯化的细胞组合物，所述组合物包含用荧光三磷酸腺苷(ATP)成像探针染色并表达癌细胞群的基于ATP的荧光信号范围的靶标部分的癌症干细胞亚群。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述癌细胞群表达一个范围的基于ATP的荧光信号，并且所述基于ATP的荧光信号范围的靶标部分是所述基于ATP的荧光信号的上部和所述基于ATP的荧光信号的下部之一。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述靶标部分是基于ATP的荧光信号的前10％和基于ATP的荧光信号的前5％之一。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述靶标部分是基于ATP的荧光信号的后10％和基于ATP的荧光信号的后5％之一。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物对于CD44标志物和ALDH标志物之一呈阳性。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞亚群被荧光ATP成像染料染色。

13.纯化的细胞组合物，所述组合物通过以下方式获得：用荧光三磷酸腺苷(ATP)成像探针对人类癌细胞群进行染色，分离具有基于ATP的荧光信号的靶标部分的一部分人类癌细胞群，并纯化分离的细胞。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述靶标部分包括基于ATP的荧光信号的前10％、基于ATP的荧光信号的前5％、基于ATP的荧光信号的后10％和基于ATP的荧光信号的后5％之一。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述靶标部分包括基于ATP的荧光信号的前10％、基于ATP的荧光信号的前5％之一，并且所述分离的细胞对于CD44标志物和ALDH标志物之一呈阳性。

16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述荧光成像探针包括ATP-Red-1。

17.基于ATP的细胞分级方法，所述方法包括：

用与三磷酸腺苷(ATP)结合时发出荧光的荧光ATP成像探针对细胞群中的细胞进行染色；

测量所述细胞群中染色的细胞的基于ATP的荧光信号；和

根据基于ATP的荧光信号的靶标部分分离所述染色的细胞。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶标部分包括基于ATP的荧光信号的前10％、基于ATP的荧光信号的前5％、基于ATP的荧光信号的后10％和基于ATP的荧光信号的后5％中之一。

19.根据权利要求17所述的方法，其中根据基于ATP的荧光信号的靶标部分分离染色的细胞包括对所述基于ATP的荧光信号的靶标部分进行荧光激活的细胞分选(FACS)门控。

20.根据权利要求19所述的方法，其中将门设置为收集以下至少之一：(i)具有所测量的基于ATP的荧光信号的前10％的染色的细胞和(ii)具有所测量的基于ATP的荧光信号的后10％的染色的细胞。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述荧光ATP成像探针包括ATP-Red 1。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞群来源于血液、尿液、唾液、肿瘤组织、非癌性组织和转移性病灶中的一种。

23.根据权利要求17所述的方法，还包括以下至少之一：测量分离的细胞的ALDH活性，测量分离的细胞的非锚定依赖性生长，测量分离的细胞的线粒体质量，测量分离的细胞的糖酵解代谢和氧化线粒体代谢，测量分离的细胞的细胞周期进展和增殖率，以及测量分离的细胞的多倍性。

24.从细胞群中分离和收集代谢上过度增殖细胞的方法，所述方法包括：

用ATP标记染料对细胞群中的细胞进行染色，其中所述ATP标记染料在与ATP结合时发出荧光；

测量所述细胞群中染色的细胞的基于ATP的荧光信号；

根据测量的基于ATP的荧光信号分离所述染色的细胞；和

收集具有测量的基于ATP的荧光信号为高于预定阈值和低于预定阈值之一的至少一部分分离的细胞。

25.根据权利要求24所述的分离和收集方法，其中所述ATP标记染料包括ATP-Red 1。

26.根据权利要求24所述的分离和收集方法，其中所述预定阈值包含所述测量的基于ATP的荧光信号的上部的一部分。

27.根据权利要求26所述的分离和收集方法，其中所述预定阈值包括前25％、前20％、前15％、前10％、前5％、前2％、前1％中之一。

28.根据权利要求24所述的分离和收集方法，其中使用荧光激活的细胞分选(FACS)进行分离和收集。

29.根据权利要求24所述的分离和收集方法，其中基于第二标志物进一步分离所述分离的细胞。

30.根据权利要求29所述的分离和收集方法，其中所述第二标志物包括以下中的一种：CD44(+)、CD133(+)、ESA(+)、ALDEFLOUR(+)、MitoTracker-High、EpCAM(+)、CD90(+)、CD34(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD106(+)、CD166(+)以及Stro-1(+)。

31.根据权利要求30所述的分离和收集方法，其中基于第二标志物的细胞分离发生于以下情形中至少之一：(i)在用所述ATP标记染料对所述细胞群中的细胞进行染色之前，和(ii)在用所述ATP标记染料对所述细胞群中的细胞进行染色之后。

32.根据权利要求31所述的分离和收集方法，其中所述第二标志物包含涂覆于磁珠上的抗体。

33.根据权利要求24所述的分离和收集方法，还包括用第二标志物对所述细胞群中的细胞进行染色，并且其中所述测量所述细胞群中染色的细胞的基于ATP的荧光信号发生在用所述第二标志物和所述ATP标记染料进行染色之后。

34.鉴别和处理生物样品中的癌症干细胞的方法，所述方法包括：

从患者获得生物样品；

用ATP标记染料对所述生物样品中的细胞进行染色，其中所述ATP标记染料与ATP结合时发出荧光；

测量细胞群中染色的细胞的基于ATP的荧光信号；

将所测量的基于ATP的荧光信号与指示存在癌症干细胞的预定阈值进行比较；和

如果所测量的基于ATP的荧光信号超过所述预定阈值，则向所述患者施用至少一种ATP耗竭治疗剂。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述ATP耗竭治疗剂包括以下之一：多西环素、替加环素、阿奇霉素、恩波吡维铵、阿托伐醌、贝达喹啉、氯硝柳胺、伊立替康、放线酰胺素、CAPE、小檗碱、布鲁替瑞定、Melitidin、寡霉素、AR-C155858、Mitoriboscin、Mitoketoscin、Mitoflavoscin、TPP-衍生物、十二烷基-TPP、2-丁烯-1,4-双-TPP、与脂肪酸缀合的多西环素，以及多西环素、阿奇霉素和抗坏血酸的组合。

36.测试候选化合物的抗癌活性的方法，所述方法包括：

用ATP标记染料对癌细胞群进行染色，其中所述ATP标记染料在与ATP结合时发出荧光；

测量染色的细胞的基于ATP的荧光信号；

根据基于ATP的荧光信号的靶标部分分离所述染色的细胞，以制备过度活跃的癌细胞亚群；

将所述候选化合物施用于所述过度活跃的癌细胞亚群；和

测量所述候选化合物对所述过度活跃的癌细胞亚群的影响。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述ATP标记染料包括ATP-Red 1。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述基于ATP的荧光信号的靶标部分包括前25％、前20％、前15％、前10％、前5％、前2％和前1％中之一。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述过度活跃的癌细胞亚群对于CD44标志物和ALDH标志物之一呈阳性。

40.根据权利要求36所述的方法，还包括以下中的至少一种：测量所述过度活跃的癌细胞亚群的ALDH活性，测量所述过度活跃的癌细胞亚群细胞的非锚定依赖性生长，测量所述过度活跃的癌细胞亚群的线粒体质量，测量所述过度活跃的癌细胞亚群的糖酵解代谢和氧化线粒体代谢，测量所述过度活跃的癌细胞亚群的细胞周期进展和增殖率，以及测量所述过度活跃的癌细胞亚群的多倍性。

41.诊断和预防癌症患者转移风险的方法，包括：

确定所述患者的癌症的生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的表达水平；

将检测到的表达水平与患者的非癌性生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的基线表达水平进行比较；和

如果所检测到的表达水平超过所述基线表达水平，则向所述患者施用ATP耗竭化合物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述ATP耗竭化合物包含以下之一：多西环素、替加环素、阿奇霉素、恩波吡维铵、阿托伐醌、贝达喹啉、氯硝柳胺、伊立替康、放线酰胺素、CAPE、小檗碱、布鲁替瑞定、Melitidin、寡霉素、AR-C155858、Mitoriboscin、Mitoketoscin、Mitoflavoscin、TPP-衍生物、十二烷基-TPP、2-丁烯-1,4-双-TPP、与脂肪酸缀合的多西环素，以及多西环素、阿奇霉素和抗坏血酸的组合。

43.用于鉴别生物样品中的循环肿瘤细胞(CTC)的试剂盒，所述试剂盒包括用于鉴别所述生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB上调的试剂。

44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述试剂包含针对ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB中之一的至少一种抗体。

45.检测生物样品中的循环肿瘤细胞(CTC)的方法，所述方法包括：

确定所述生物样品中ABCA2、ATP5F1C、COX20、NDUFA2和UQCRB的表达水平；和

如果所确定的表达水平相对于对照上调，则表明存在CTC。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述生物样品包含血液、尿液、唾液、肿瘤组织、非癌性组织和转移性病灶之一。

47.根据权利要求45所述的方法，还包括通过用荧光ATP标记染料对所述生物样品进行染色，从所述样品中分离CTC，测量染色的样品的基于ATP的荧光信号；根据基于ATP的荧光信号的靶标部分分离所述染色的样品；以及收集具有所述基于AATP的荧光信号的靶标部分的细胞亚群。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述基于ATP的荧光信号的靶标部分包括前25％、前20％、前15％、前10％、前5％、前2％和前1％中之一。