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CN114729889A - 荧光检测用生物分子检查芯片 - Google Patents

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CN114729889A CN202080078441.7A CN202080078441A CN114729889A CN 114729889 A CN114729889 A CN 114729889A CN 202080078441 A CN202080078441 A CN 202080078441A CN 114729889 A CN114729889 A CN 114729889A
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岩长祐伸
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National Institute for Materials Science
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Abstract

提供一种使用用于通过荧光检测方法进行生物分子检测的超表面的检查芯片。检测用芯片具备具有超表面的第一基板和位于第一基板的对面且具有微流路的第二基板，上述超表面具有使应检测的生物分子的固定高效化的间隙，同时，在包括应检测的生物分子发出的荧光的波长范围的区域显示荧光增强，上述第二基板由可见光或近红外光可透射的材料构成，荧光在第一基板与第二基板之间发生共振。

Description

荧光检测用生物分子检查芯片
技术领域
本发明涉及荧光检测用生物分子检查芯片。
背景技术
已经有利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance：SPR)的生物分子检测方法(例如参照专利文献1)。
表面等离子共振传感器是检测在金、银等金属薄膜表面发生的表面等离子共振现象的设备。表面等离子激元是在金属-电介质界面产生的电子疏密波的一种，其波数根据与金属薄膜表面相接的达到数100nm的试样厚度、光学特性(介电常数、折射率)的变化而变化。由于该变化无法直接测定，因此，一般的方法是，在SPR传感器中，使激光从试样的反面抵达而产生渐逝波(evanescent wave)，测定该渐逝波与表面等离子激元共振时的激光入射角度的变化，从而间接测定表面状态的变化。专利文献1中提示，通过用具有各种特性、功能的高分子对传感器表面进行化学修饰，能够提供可检测更多生物成分的传感器设备。具体地，公开了使用金属薄膜作为传感器基板、使用SPR装置作为设备，能够提供利用抗原-抗体反应的免疫传感器，而且，公开了抗体免疫球蛋白G以最低浓度0.1μg/ml的检测结果。但疾病诊断中基准值设为5ng/ml左右，因而不能认为提供了精度充分高的方法。
作为医学诊断、检测中使用的方法，有ELISA法。这是一种通过对对象生物分子导入酶反应，由试样的吸光度来检测目标分子的浓度的方法。目前作为高精度方法被确立为标准方法。虽然根据目标分子的不同而不同，但作为基于与很多抗体共通的双链、双轻链结构的典型抗体的免疫球蛋白G(IgG)中，对于15ng/ml左右而言，是可保证检测的。早期癌症诊断等中需要精度比1ng/ml高的生物分子检测方法，但迄今为止还没有发现能充分满足这一要求的方法。
此外，在生物分子的检测中，荧光检测方法是已知的(例如参照专利文献2和3)。荧光检测方法是下述方法：对被激发光激发而发出荧光的目标物质或荧光标记的目标物质照射激发光，对荧光进行检测，从而检测目标物质。
根据专利文献2，公开了一种微流路芯片，其特征在于，在具有反应室、入口和出口以及分别连接上述反应室与上述入口和上述出口的供应流路和排出流路的微流路芯片中，具有具备凹部的基板支架、安装于该基板支架的凹部的反应基板、以覆盖该基板支架和上述反应基板的方式配置的第一片材以及以覆盖该第一片材的方式配置的第二片材，上述第一片材具有通孔，利用该通孔，在上述第二片材与上述反应基板之间形成上述反应室，上述反应基板具有在上述反应室中露出的第一面以及介由设于上述基板支架的凹部的观察窗在外部露出的第二面，在上述反应基板的第一面形成由局部型表面等离子激元产生的微细结构构成的反应点。
荧光标记的单个引物分子结合于专利文献2的反应点，捕获荧光标记的dNTP分子。公开了这些荧光色素由棱镜产生的渐逝光为激发光来进行发光并利用局部型表面等离子激元来观测局部发光的配置，但完全没有公开检测的效果(检测极限、检测灵敏度等)。
另一方面，根据专利文献3的现有技术，公开了对于导入由镜子夹着而构成的激光腔区域的对象物质照射激发光，使激发的荧光在激光腔的厚度方向上共振而提高光强度的生物芯片模块。但是，即使利用这样的激光腔的共振，也未获得充分的荧光强度。
最近，世界上正在进行表现功能性的人工纳米结构表面(也称为超表面)的研究，其中有荧光增强性能特别优异的超表面(例如参照专利文献4和非专利文献1～3)。专利文献4和非专利文献3中公开了使待测物质的光学应答增强的表面增强拉曼分析用基板，其包括基材、位于上述基材表面的板坯材料以及至少位于上述板坯材料上的金属材料。上述基材具有至少与上述板坯材料接触的表面层，上述板坯材料由具有比上述表面层的折射率高的折射率的材料构成，具有从上述板坯材料表面到达上述基材的上述表面层的、周期性排列的多个孔，上述金属材料位于上述板坯材料表面和分别隔着上述多个孔的上述基材表面层上，具有互补金属结构，具有由上述多个孔的直径和周期决定的多种共振。
此外，非专利文献1中公开了在SOI(Silicon on Insulator，绝缘体上硅)基板上，通过电子束光刻(EBL)和博施(BOSCH)法形成由硅构成的多个纳米棒，该基板具有显著的荧光增强性能。此外，根据非专利文献1，提出了这样的制作了多个纳米棒的基板在生物分子荧光检测方法中的应用。
非专利文献2中报道了通过在专利文献1所示互补金属结构上赋予自组装单分子膜(SAM)，与罗丹明色素的荧光信号没有SAM的情况相比，进一步增强了数十倍。
但在将专利文献4、非专利文献1～3所示超表面应用于荧光检测方法时，无法利用单独的超表面将液体中的生物分子高效地固定于超表面，无法提供疾病诊断等要求的高精度荧光检测方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第3657790号公报
专利文献2：日本特开2011-220996号公报
专利文献3：日本特开2006-177878号公报
专利文献4：日本特开2017-173084号公报
非专利文献
非专利文献1：Masanobu Iwanaga，Appl.Sci.(应用科学)，2018，8，1328
非专利文献2：Bongseok Choi等，Chem.Commun.(化学通讯)，2015，51，11470-11473
非专利文献3：Masanobu Iwanaga等，Nanoscale(纳米级)，2016，8，11099-11107
发明内容
发明所要解决的课题
根据以上情况，本发明的课题在于，提供使用超表面的检查芯片，用于通过荧光检测方法进行生物分子检测。
用于解决课题的方法
根据本发明的荧光检测用生物分子检查芯片具备具有超表面的第一基板和位于上述第一基板的对面且具有微流路的第二基板，上述超表面具有使应检测的生物分子的固定高效化的间隙，同时，在包括上述生物分子发出的荧光的波长范围的区域显示荧光增强，上述第二基板由可见光或近红外光可透射的材料构成，上述荧光在上述第一基板与上述第二基板之间共振，由此解决上述课题。
上述超表面可以是金属互补叠层结构或纳米棒结构。
上述荧光增强可以是具有可见光区域或近红外光区域波长的光的强度的增强。
由上述第一基板和上述第二基板形成的微流路的高度可以在10μm以上100μm以下的范围。
由上述第一基板和上述第二基板形成的微流路的高度可以在15μm以上50μm以下的范围。
上述超表面为上述金属互补叠层结构，上述金属互补叠层结构包括基材、位于上述基材表面的板坯材料以及至少位于上述板坯材料上的金属材料，上述基材具有至少与上述板坯材料接触的表面层，上述板坯材料由具有比上述表面层的折射率高的折射率的材料构成，同时，具有从其表面到达上述基材的上述表面层的、周期性排列的多个孔，上述金属材料分别位于上述板坯材料表面和形成上述多个孔的底面的上述基材表面层上，由此解决上述课题。
上述金属材料可以是具有可近似于德鲁德(Drude)金属的复介电常数的物质。
具有可近似于上述德鲁德金属的复介电常数的物质可选自由金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铝(Al)、铂(Pt)、钛(Ti)、镍(Ni)和它们的合金组成的组。
上述多个孔可以是具有2种以上不同直径的圆孔或具有2种以上不同单边长度的棱柱状孔，并且/或者按2种以上不同周期排列。
上述多个孔的周期可以在300nm以上1000nm以下的范围。
上述多个孔的直径或单边长度可以在100nm以上500nm以下的范围。
上述板坯材料的厚度可以在100nm以上2μm以下的范围。
可以是：上述超表面为上述纳米棒结构，上述纳米棒结构具备基材和在上述基材表面周期性直立的多个纳米棒，上述基材由具有比上述多个纳米棒的折射率小的折射率的材料构成。
可以是：上述基材由具有1以上1.6以下的折射率的材料构成，上述多个纳米棒由具有2以上5以下的折射率的半导体或电介质构成。
上述半导体或衍生物可以选自由硅、锗、氮化镓和二氧化钛组成的组。
上述多个纳米棒的周期可以在300nm以上1000nm以下的范围。
上述多个纳米棒的直径或单边长度可以在100nm以上500nm以下的范围。
上述多个纳米棒的高度可以在100nm以上2μm以下的范围。
可以是：上述多个纳米棒是具有2种以上不同直径的圆柱或具有2种以上不同单边长度的棱柱，并且/或者按2种以上不同周期排列。
发明效果
根据本发明的荧光检测用生物分子检查芯片，通过使具有使生物分子的捕获和固定高效化的间隙且具有显著的荧光增强特性的第一基板与具备微流路的第二基板对面配置，即使是液体试样中的生物分子，也能够进行荧光检测。本发明的检查芯片中，第一基板和第二基板以及它们之间的微米级空间构成微共振器，由生物分子产生的荧光发生共振。此时，第一基板的超表面使荧光增强，同时，向第二基板侧高效放射，从而来自微共振器的荧光放射集中在一个方向，提高荧光检测的效率。由此，即使是更低浓度的生物分子，也能够高灵敏度且高再现性良好地进行荧光检测。
附图说明
图1为显示本发明的荧光检测用生物分子检查芯片的示意图。
图2为显示使用了本发明的荧光检测用生物分子检查芯片的检测原理的示意图。
图3为具有金属互补叠层结构的超表面的示意图。
图4为具有纳米棒结构的超表面的示意图。
图5为显示使用了本发明检查芯片的检测装置的示意图。
图6为使用本发明的荧光检测用生物分子检查芯片判定试样溶液中是否存在目标生物分子的流程图。
图7为显示硅纳米棒结构超表面的SEM图像。
图8为显示作为金互补叠层结构的超表面的SEM图像。
图9为显示实施例1的检查芯片的外观(A)和配置有该检查芯片的流路装置的外观(B)的图。
图10为显示实施例3的检查芯片的外观的图。
图11为显示检测后的实施例1的检查芯片情况的图。
图12为显示使用了实施例1的检查芯片的发射光谱的图。
图13为显示使用了比较例1的检查芯片的发射光谱的图。
图14为显示由实施例1的荧光测定得到的标准曲线的图。
图15为显示由实施例2的荧光测定得到的标准曲线的图。
图16为显示由实施例3的荧光测定得到的标准曲线的图。
图17为显示由实施例4的荧光测定得到的标准曲线的图。
图18为显示由实施例5的荧光测定得到的标准曲线的图。
图19为显示由比较例1的荧光测定得到的标准曲线的图。
图20为显示由比较例2的荧光测定得到的标准曲线的图。
图21为显示通过实施例6的捕获抗体的有无进行的荧光强度比较的图。
图22为实施例8的检查芯片的荧光图像。
图23为显示通过实施例9的各种缓冲液进行的荧光强度比较的图。
图24为显示实施例10的各通道的荧光图像和生物分子固定状态的示意图。
图25为显示实施例10的荧光强度比较的图。
图26为显示实施例11的检查芯片的超表面上的分子情况的示意图。
图27为显示实施例11的各种浓度CEA的荧光图像的图。
图28为显示由实施例11的荧光测定得到的CEA荧光强度的浓度依赖性的图。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的实施方式进行说明。需说明的是，对同样的要素标记同样的编号，省略其说明。
对本发明的荧光检测用生物分子检查芯片进行说明。
图1为显示本发明的荧光检测用生物分子检查芯片的示意图。
图2为显示使用了本发明的荧光检测用生物分子检查芯片的检测原理的示意图。
本发明的荧光检测用生物分子检查芯片100具备具有超表面110的第一基板120和位于该超表面110侧的对面、具有微流路130的第二基板140。超表面110具有使应检测的生物分子(以下为了简便，称为目标生物分子)的固定高效化的间隙，而且显示荧光增强。
这里，“目标生物分子”是作为疾病诊断标记分子而使用的抗体、抗原、Ⅲ型前胶原、副产物蛋白等生物分子，举例来说，是肝炎病毒IgM型抗体、肝炎病毒s抗原、CEA分子、p53分子、p53抗体等生物分子、RNA、DNA等核酸及其细分化分子等。
“具有间隙的超表面”的意思是，由具有比生物分子大的数十～数百纳米级的间隙的立体结构构成的表面。通过具有这样的间隙来增大超表面110表面积，能够使生物分子的固定高效化。此外，可以通过使流体速度局部降低来使生物分子的固定高效化。因为在图1中宏观显示且在图2中将分子示意性放大显示，所以均未显示间隙，但超表面110是具有间隙的。而且，图2中显示的是下述情况：捕获分子被固定在超表面110上，捕获抗体结合于该捕获分子，进一步，带荧光标记的生物分子高效结合于捕获抗体。超表面110能够以这种方式使生物分子的固定高效化。后述图3的350、图4的430对应于间隙。
“显示荧光增强的超表面”的意思如上所述是人造纳米表面结构，在发出荧光的物质位于其上时，与位于硅晶圆、高度平滑的石英基板等平坦的表面上时相比，荧光强度增强。根据本发明的检查芯片100，第一基板120的超表面110进一步在包括目标生物分子(例如图2的带荧光标记的生物分子)发出的荧光的波长范围的区域显示荧光增强，因此即使目标生物分子的浓度为低浓度，也能够对其浓度进行高精度检测。需说明的是，“目标生物分子发出的荧光”的意思是，目标生物分子自身发出的荧光、标记在目标生物分子上的荧光标记发出的荧光或标记在被目标生物分子捕获的二抗上的荧光标记发出的荧光。
本发明的检查芯片100中，第二基板140由可见光或近红外光可透射的材料(光透射性材料)构成。如果对位于第一基板120上的目标生物分子照射光(激发光)，则目标生物分子或者标记化的荧光标记被激发而发出荧光。如图2所示，该目标生物分子发出的荧光在第一基板120与第二基板140之间共振。其结果是，来自目标生物分子的荧光强度被增强，即使目标生物分子的浓度为低浓度，也能够对其浓度进行高精度检测。进一步，通过共振而增强的荧光不向超表面110放射而是向第二基板140侧放射，因而如果第二基板140由光透射性材料构成，则荧光会从第二基板140透射而被高效检测。本申请说明书中，可见光的意思是具有波长360nm以上且小于830nm范围的波长的光。此外，近红外光的意思是具有波长830nm以上1600nm以下范围的波长的光。
需说明的是，本申请说明书中，可见光或近红外光可透射的材料的意思是可见光或近红外光的平均透射率为60％以上的材料。上述平均透射率优选为80％以上。这样的可见光或近红外光可透射的材料可以使用透明陶瓷、玻璃等无机材料和塑料等有机材料，从加工性的观点出发，优选为有机硅系树脂、(甲基)丙烯酸系树脂、环氧系树脂、苯乙烯系树脂、聚碳酸酯、酯系树脂、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂、聚酰胺、环烯烃聚合物等。其中，优选为作为有机硅系树脂的聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
超表面110显示的荧光增强是具有可见光区域或近红外光区域的波长的光的强度增强，优选是在520nm以上1500nm以下的波长范围内有峰的光的增强。由此，提高生物分子的检测精度。进一步优选使在540nm以上620nm以下或800nm以上900nm以下的波长范围内有峰的光增强。
由第一基板120和第二基板140形成的微流路的高度，即第一基板120与第二基板140的微流路之间的距离D(图2)优选在10μm以上100μm以下的范围。如果在该范围内，则作为微共振器的功能更明显，同时，作为微流路使目标生物分子固定在第一基板120上的效率提高。另一方面，在使距离D小于10μm的情况下，可预见流路内难以形成稳定的液流，或在第二基板140由于自身重量而变形时发生与第一基板120接触等不良状况，是不优选的。距离D更优选在15μm以上50μm以下的范围。
超表面110优选为金属互补叠层结构或纳米棒结构。这些结构具有使生物分子的固定高效化的间隙，而且可显示荧光增强。
图3为具有金属互补叠层结构的超表面的示意图。
具有金属互补叠层结构的超表面300包括基材310、位于基材310表面的板坯材料320以及位于板坯材料320和基材310的表面层340上的金属材料330。
基材310具有至少与板坯材料320相接的表面层340。板坯材料320由具有比表面层340的折射率高的折射率的材料构成。进一步，板坯材料320具有从板坯材料320表面到达基材310的表面层340的周期性排列的多个孔350。利用这样的结构，基材310和板坯材料320具有由六边网格状、正方网格状等周期性排列的多个孔350的周期Λ1和直径D1决定的周期结构体中的特征性光共振条带状态。这种情况下，为了增大光在板坯材料320中的条带状态密度(限制效应)，板坯材料320的折射率必须比表面层340的折射率大。
金属材料330分别位于板坯材料320表面和形成多个孔350的底面的基材310的表面层340上，由此形成互补金属叠层结构。换句话说，典型的是，金属材料330不覆盖板坯材料320的多个孔350的孔侧壁360，金属材料330彼此仅分开丛板坯材料320的厚度减去金属材料330的厚度而得到的距离。利用以上那样的结构，具有金属互补叠层结构的超表面300可以形成目标生物分子发出的荧光通过不被金属材料330覆盖的孔侧壁360而被封闭在板坯材料320内的共振状态。进一步，通过赋予金属材料330，上述共振的线宽分别宽带化。由此，该多个共振中的至少1个与来自目标生物分子的荧光波长重合，在该共振的线宽范围内，荧光被高效地增强。
板坯材料320优选由折射率为2以上的材料构成。这是因为，表面层340多使用折射率1.5左右的材料。板坯材料320的折射率的上限没有特别限制，根据可获得的材料，约为5以下。作为构成板坯材料320的材料的具体例子，可列举选自由Si、Ge、SiN、SiC、II-VI族半导体、III-V族半导体和二氧化钛(TiO2)组成的组的物质。如果是这些材料，则折射率为2以上，加工性优异或生长技术在不断发展，因此能够容易地形成板坯材料320。
板坯材料320优选具有100nm以上2μm以下范围的厚度。如果在该范围内，则容易形成光的条带状态。而且，通过在该厚度范围内的板坯材料320上组合金属材料330而形成互补叠层结构，表现出光的放射率大幅共振的状态，使放射目标生物分子发出的荧光的效率提高。更优选板坯材料320具有150nm以上250nm以下范围的厚度，由此，光在板坯材料320中的限制效应增加，与金属材料330组合的互补叠层结构中，容易构成适合荧光增强的共振状态(例如非专利文献2、3)。
多个孔350的周期Λ1为光的波长左右，优选在300nm以上1000nm以下的范围。如果在该范围内，则超表面300能够使520nm以上1500nm以下波长范围的光增强。周期Λ1更优选在400nm以上750nm以下的范围。由此，超表面300能够使540nm以上900nm以下波长范围的光增强。多个孔350可以是具有2种以上不同周期的孔。这种情况下，如果2种以上不同周期分别在300nm以上1000nm以下的范围，则也能够使可见光区域和近红外光区域中多个波长范围的光增强，因而还可进行荧光标记不同的2种以上生物分子的检测。
如果多个孔350的直径D1比周期Λ1小而且在100nm以上500nm以下的范围，则能够利用超表面300使540nm以上1000nm以下波长范围的光增强。直径D1更优选在250nm以上350nm以下的范围。如果在该范围内，则能够利用超表面300使540nm以上900nm以下波长范围的光增强。
需说明的是，多个孔350可以是具有2种以上不同直径的孔。这种情况下，如果2种以上不同直径分别在100nm以上500nm以下的范围，则也能够使可见光区域和近红外光区域中多个波长范围的光增强，因而还可进行荧光标记不同的2种以上生物分子的检测。
当然，也可以是多个孔350按2种以上不同直径形成而且按2种以上不同周期排列，由此，能够控制可荧光增强的可见光和近红外光的波长区域，能够应对多种生物分子。
孔的形状在图3中显示为圆柱状(圆孔)，但不限于这种情况，也可以是以三棱柱状、四棱柱状为代表的棱柱状等其他形状，只要呈现共振状态就没有限制。
基材310的表面层340优选由折射率小于2的材料构成。表面层340的折射率的下限没有特别限定，根据可获得的材料，约为1以上。表面层340可采用所谓透明绝缘体，作为具体例子，可列举选自由SiO2、Al2O3、玻璃和塑料组成的组的材料。塑料包括作为第二基板140的材料所例示的树脂。如果是这些材料，则可利用与上述板坯材料320折射率的大小关系，高效地将光限制在板坯材料320中。需说明的是，基材310由Si基板、石英基板等大块基板与表面层340形成，大块基板可以是能够保持板坯材料320和金属材料330的任意基板。作为能够容易地获得、加工性优异的超表面的材质，可列举以基材310为Si基板、将表面层340设为SiO2、与由Si构成的板坯材料320融合的超表面。此外，也可以将基材310设为玻璃基板等，形成Si层成膜作为板坯材料320。
优选表面层340的厚度与板坯材料320的厚度相同或比板坯材料320的厚度大。由此，能够将板坯材料320作为光损耗小的波导。表面层340更优选具有200nm以上的厚度。
金属材料330没有特别限制，优选为具有可近似于德鲁德金属的复介电常数的材料。德鲁德金属是对具有自由电子的金属进行建模而得到的，是复介电常数ε(ω)＝1-ωp 2/ω(ω+iγ)所表示的金属。这里，ω为角频率，ωp为等离子频率，i为虚数单位，γ为阻尼常数。已知一般很多金属除了在发生电子的带间跃迁的波长附近以外都可作为德鲁德金属来近似(例如Frederich Wooten，Optical Properties of Solids(固体的光学性质)(Academic Press(学术出版社)，1972，第52页～第65页)。需说明的是，本申请说明书中，在能够以ωp和γ为拟合参数、使实测的复介电常数ε(ω)相对于各ω偏离20％以下而与上述算式拟合的情况下，设为能够将对象金属材料330近似于德鲁德金属。
作为在可见光区域或近红外光区域具有这样的可近似于德鲁德金属的复介电常数的物质，可例示选自由金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铝(Al)、铂(Pt)、钛(Ti)、镍(Ni)和它们的合金组成的组的物质。金属材料330优选具有30nm以上100nm以下范围的厚度。如果厚度小于30nm，则光会透射，可存在无法作为金属发挥功能的情况。如果厚度超过100nm，则孔350的侧壁会堵塞，可存在无法形成互补金属叠层结构的情况。更优选金属材料330具有30nm以上40nm以下范围的厚度。
图4为具有纳米棒结构的超表面的示意图。
具有纳米棒结构的超表面400具备在基材410表面上周期性直立的多个纳米棒420。其中，基材410优选由具有比纳米棒420的材料小的折射率的材料构成。
基材410由在射入检查芯片100的光的波长区域透明、折射率为1以上1.6以下的材料构成时，作为纳米棒420的材料，优选为折射率为2以上5以下的半导体或电介质。这是因为，纳米棒的材料具有的折射率越大，则纳米棒具有越明显的共振状态。该明显的共振状态是产生荧光增强效果等共振增强效果所必需的物理条件，可通过反射或透射光谱容易地确认。另一方面，基材410的折射率为与纳米棒420的材料同等程度以上的折射率时，共振状态不明显，不能期待显著的共振增强效果。
例如，射入检查芯片100的光的波长在500nm以上1100nm以下的范围时，纳米棒420的材料选自由硅、锗、氮化镓和二氧化钛组成的组。这些材料具有2以上5以下的折射率。
多个纳米棒420的周期Λ2为光的波长左右，如果在300nm以上1000nm以下的范围，则超表面400能够使520nm以上1500nm以下波长范围的光增强。周期Λ2更优选具有300nm以上450nm以下的范围。由此，超表面400能够使540nm以上900nm以下波长范围的光增强。多个纳米棒420可以是具有2种以上不同周期的纳米棒。这种情况下，如果与上述金属互补叠层结构同样地2种以上不同周期分别在300nm以上1000nm以下的范围，则也能够使可见光区域和近红外光区域中多个波长范围的光增强，因而还能够进行荧光标记不同的2种以上生物分子的检测。
如果多个纳米棒420的直径D2比上述周期Λ2小且在100nm以上500nm以下的范围，则与该周期Λ2在优选范围的情况同样地，超表面400能够使520nm以上1500nm以下波长范围的光增强。直径D2更优选在200nm以上350nm以下的范围。由此，超表面400能够使540nm以上900nm以下波长范围的光增强。
需说明的是，多个纳米棒420可以是具有2种以上不同直径的纳米棒。这种情况下，如果2种以上不同直径分别在100nm以上500nm以下的范围，则也能够使可见光区域和近红外光区域多个波长范围的光增强，因而还能够检测荧光标记不同的2种以上生物分子。
当然，多个纳米棒420可以按2种以上不同周期和2种以上不同直径排列，由此，能够高精度控制可进行荧光增强的光的波长区域，能够应对多种生物分子。
多个纳米棒420的高度优选在100nm以上2μm以下的范围。如果在该范围内，则局限于纳米棒的电磁共振效果变得显著，能够产生明显的共振状态。更优选多个纳米棒420具有150nm以上250nm以下范围的高度，由此可利用低层次的共振状态，可期待大的荧光增强。
纳米棒的形状在图4中显示为圆柱状，但不限于这种情况，也可以是以三棱柱状、四棱柱状为代表的棱柱状等其他形状，只要呈现共振状态就没有限制。
图5为显示使用了本发明检查芯片的检测装置的示意图。
检测装置500至少具备对检查芯片100照射激发光的光源510和检测从检查芯片100放射出的荧光的检测单元520。
作为光源510，可以采用氙灯、发光二极管、激光二极管、半导体激光和有机EL发光体等。检测装置500可以进一步具备波长选择滤光片、镜面、分束器等光学系统，以能够使得来自光源510的激发光以希望的波长和角度向检查芯片100入射并从图1所示第二基板140透射而照射于超表面110。
检测单元520只要是能够检测由激发光激发出的荧光的部件即可，可以采用任选的检测单元，举例来说，为光检测器、CCD相机、CMOS相机、光电二极管阵列、分光计等。此外，检测装置500可以进一步具备物镜、成像透镜等光学系统。
检测装置500可以进一步具备使激发光与荧光分离的滤光片530。由此能够抑制杂散光，实现低背景的高精度光测定。
此外，检测装置500可以具备获得来自检测单元520的数据并进行分析的计算机540。计算机540可以基于获得的数据来进行信号、背景等的分析。例如，在计算机540具备存储荧光强度与浓度的关系、荧光标记与其发光峰的关系以及荧光标记与各种生物分子的关系等数据的内存的情况下，能够由获得的数据来确定检测的生物分子的种类、算出确定的生物分子的浓度。此外，也可以是计算机540将分析出的数据向显示器、打印机等输出装置550输出、显示。
此外，检测装置500可以具备分别保持1种以上试样溶液、捕获分子、捕获抗体等试剂、洗涤液等的供应容器以及保持测定后的废液的回收容器，可以进一步具备与这些容器连接的分注机构(图中未显示)。分注机构的动作可以由计算机540来控制。由此可实现自动检测、分析。
图6是使用本发明的荧光检测用生物分子检查芯片判定试样溶液中是否存在目标生物分子的流程图。
作为使用图5的检测装置500判定目标生物分子存在的有无的例子进行说明。按步骤进行详述。
步骤S610：使含有用于捕获目标生物分子的捕获分子的溶液流经图1所示检查芯片100的微流路130，固定在超表面110上。超表面110具有间隙，因此仅通过使含有捕获分子的溶液流经微流路130，捕获分子就能容易地被固定。这样的捕获分子根据目标生物分子适当选择。在使含有捕获分子的溶液流入前，可以为了使流路内充满液体而使磷酸生理盐水(PBS)等缓冲液等流入。
例如，目标生物分子为免疫球蛋白等蛋白质时，可以使用可通过FC结合来捕获蛋白质的任意捕获分子。作为这样的捕获分子，代表性地，可列举抗体结合蛋白或亲和素衍生物。
抗体结合蛋白选自由Protein A、Protein G、Protein AG和它们的衍生物组成的组。亲和素衍生物只要具有与生物素结合的能力即可，没有特别限制，优选选自由链霉亲和素、亲和素、中性亲和素和它们的衍生物组成的组。
目标生物分子除了可以是蛋白质以外还可以是RNA、DNA等核酸。这种情况下，可以使用通过杂交来特异性捕获核酸的互补DNA作为捕获分子(通常被称为适体)。
步骤S610中，为了促进捕获分子向超表面110的固定，可以使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-hydroxysuccinimide，N-羟基琥珀酰亚胺)等试剂，使捕获分子的结合末端活化。使含有捕获分子的溶液流过后，使缓冲液等流过，进行悬浮分子的除去和流路内的洗涤。需说明的是，通过微流路的含有捕获分子的溶液可以回收到废液用的回收容器(图中未显示)中。
步骤S620：使含有待测生物分子的溶液流经检查芯片100的微流路130。由此，在待测生物分子中存在目标生物分子时，目标生物分子被在步骤S610中固定在超表面110上的捕获分子特异性捕获，被固定在超表面110上。在目标生物分子为上述免疫球蛋白等蛋白质、捕获分子为上述抗体结合蛋白或亲和素衍生物时，目标生物分子在流经微流路130期间被捕获。这里，通过微流路的含有待测生物分子的溶液也可以回收到废液用的回收容器中。
在目标生物分子本身由后述激发光激发而发出荧光，或者，在目标生物分子用荧光标记(其由后述激发光激发而发出荧光)进行了标记的情况下，进入步骤S630。这里，在进入步骤630之前，也优选在微流路中流过缓冲液等，将悬浮分子、非特异吸附分子除去。
另一方面，目标生物分子本身不发荧光且没有用荧光标记进行标记的情况下，在步骤S620之后，可以使含有进行了荧光标记的抗体分子(也称为二抗)的溶液流经检查芯片100的微流路130。这样的二抗是因为交叉特性而与目标生物分子特异性结合性质的抗体分子，可以作为目标生物分子本身的荧光标记的替代品来采用。此外还有二抗彼此结合的性质，期待有助于荧光的扩增。
需说明的是，对目标生物分子或二抗进行标记的荧光标记采用公知的标记，举例来说，从DyLight、荧光素、丙烯酰丹、罗丹明、BODIPY、吖啶橙、曙红、芘、吖啶橙、PyMPO、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 660和AlexaFluor 680组成的组中选择。这些荧光标记的激发波长和荧光波长是已知的。
目标生物分子或二抗的标记可利用市售的荧光标记试剂盒中记载的公知方法来进行。
步骤S630：使激发光从检查芯片100的第二基板140侧入射，照射在超表面110上。这样的激发光是从图5的检测装置500的光源510发出的。如果超表面110上存在目标生物分子，则通过激发光的照射，目标生物分子基于自身发出荧光，或者基于标记在目标生物分子上的荧光标记或标记在与目标生物分子结合的二抗上的荧光标记发出荧光。以这种方式，本发明中，没有必要例如像专利文献2那样配置棱镜来用渐逝光对目标生物分子进行激发。
如果发出荧光，则如图2所示，荧光在检查芯片100的第一基板120与第二基板140之间共振，从第二基板140侧放射。
步骤S640：对从第二基板140侧放射的光进行检测。该步骤中，使用图5的检测装置500中的检测单元520，对放射的荧光进行检测。
步骤S650：基于检测到的荧光，判定待测生物分子中是否存在目标生物分子。在检测到的光是基于上述荧光标记的荧光或目标生物分子自身的荧光时，可以判定存在目标生物分子。在检测到的光不是基于上述荧光标记的荧光或目标生物分子自身的荧光时，可以判定不存在目标生物分子。这样的判定可以由检测装置500的计算机540来进行，也可以根据输出装置550中显示的光谱或光学图像来判定。
以上步骤中使用的检查芯片100可以通过将固定于超表面110的捕获分子等除去而重复使用。在捕获分子等蛋白质的除去中，优选使用碱性水溶液进行超声波洗涤。
下面，使用具体的实施例对本发明进行详述，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例
[超表面]
作为超表面，分别制作硅纳米棒结构和金互补叠层结构。
为了制作由硅纳米棒结构构成的超表面，准备具有绝缘体上的硅(SOI：SiliconOn Insulator)层和嵌入氧化膜(BOX：Buried Oxide)层的Si基板410(图4)。该基板整体称为SOI基板。SOI层的厚度为200nm，BOX层的厚度为375nm。需说明的是，SOI层为结晶性Si，BOX层为SiO2。
分别设计为周期Λ2为400nm、直径D2为300nm和周期Λ2为300nm、直径D2为220nm的圆柱周期排列。对SOI基板进行电子束光刻(EBL)，制作抗蚀剂掩模。通过BOSCH加工，进行各向异性的选择性蚀刻，仅对SOI层进行蚀刻。其结果是，得到了周期Λ2为400nm且直径D2为302nm、316nm或320nm的各种硅纳米棒结构。此外，还得到了周期Λ2为300nm且直径D2为236nm的硅纳米棒结构。以这种方式，制造高度与SOI层的厚度相同的多个硅棒。BOSCH加工后，用O2等离子将残留的掩模除去。用扫描型电子显微镜(SEM，日立制作所制，型号SU8230)对得到的硅纳米棒结构超表面进行观察。将结果示于图11(B)。
金互补叠层结构超表面设为：在具有嵌入氧化膜340(图3)的Si基板310(图3)上具有Si板坯材料320(图3)、具有金(Au)作为金属材料330。板坯材料320中形成的孔是直径D1为302nm、291nm、250nm或315nm中的任一种，深度为230nm，一个方向的周期Λ1为410.5nm，与之正交方向的周期为710nm。该周期是周期性配置的孔形成的矩形单元格的短边和长边的长度。
金互补叠层结构超表面通过与专利文献4的实施例1同样的步骤来制作。用SEM对得到的金互补叠层结构超表面进行观察。将结果示于图8。
图7为显示硅纳米棒结构超表面的SEM图像。
图8为显示作为金互补叠层结构的超表面的SEM图像。
图7中显示的是高度为200nm、与高度方向垂直的截面是单边320nm的正方形的四棱柱状硅纳米棒按400nm周期排列的纳米棒结构。图8中显示的是周期410.5/710nm、直径291nm的圆孔周期性排列的金互补叠层结构顶视图。该结构的高度为230nm。
为了确认图7所示硅纳米棒结构显示荧光增强，分别使罗丹明590(R590)分子分散于具有该结构的SOI基板和比较用的平坦的Si基板，照射波长532nm的入射激光，测定此时的荧光光谱，进行比较。其结果是，具有硅纳米棒结构的SOI基板中，确认到发光峰波长590nm的发光强度的增强。该结果与非专利文献1的报道也是一致的，即，硅纳米棒结构是在波长550nm以上570nm以下、580nm以上600nm以下和650nm以上690nm以下的各波长范围显示荧光增强的超表面。
此外，非专利文献3中，分别使R590分子分散于金互补叠层结构(周期410.5/710nm、孔的直径265nm)和比较用的平坦的Si基板，测定荧光光谱，进行比较，由此认为在使用金互补叠层结构的情况下，在550nm以上600nm以下、650nm以上700nm以下和750nm以上800nm以下的波长区域，发光强度增强。以这种方式，可见金互补叠层结构(周期410.5/710nm、圆的直径265nm)也是在550nm以上600nm以下的范围内显示荧光增强的超表面。
为了确认金互补叠层结构也显示其他波长的荧光增强，分别使IR783分子分散于具有金互补叠层结构(周期410.5/710nm、孔的直径250nm)的基板和比较用的平坦的Si基板，测定荧光光谱，进行比较。该结果确认了在具有金互补叠层结构的基板中，波长850nm以上900nm以下的发光强度的增强。根据这一结果，确认了金互补叠层结构(周期410.5/710nm、圆的直径250nm)是在850nm以上900nm以下的范围内也显示荧光增强的超表面。
[试样]
捕获分子使用Protein AG-顺式或顺式-链霉亲和素(Click Biosystems，PRO1001或PRO1005)。捕获抗体使用抗亲和素抗体(Abcam，ab53494)。
目标生物分子使用免疫球蛋白G(IgG，Abcam，ab206202)、p53抗体(NovusBiologicals，NB200-171)、小鼠单克隆p53抗体(Abcam，ab16465)、CEA(Abcam，ab742)和已用荧光分子(AF555，Alexa Fluor555)标记的p53抗体(Abcam，ab210717)、已用荧光分子(AF555、Alexa Fluor555)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Abcam，ab150114)、已用荧光分子(AF555，Alexa Fluor555)标记的山羊抗兔IgG抗体(Abcam，ab150078)或已用荧光分子(DL555，DyLight555)标记的IgG(Novus Biologicals，NBP1-76055)。
此外，使用生物素标记试剂盒(和光纯药347-90891)、荧光分子HiLyte555(HL555)标记试剂盒(和光纯药348-90141)、荧光分子吲哚菁绿(ICG)标记试剂盒(和光纯药345-91431)，根据需要对目标生物分子添加荧光标记、生物素标记。
以下的实施例1～实施例8和比较例1～比较例2中，使用上述超表面来制造检查芯片，使用上述试样来进行荧光测定。
[实施例1]
实施例1中，在周期400nm、直径320nm的圆柱状硅纳米棒结构超表面110(图1)的第一基板120(图1)上，通过自吸附粘贴具有微流路(流路高度D30μm)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)制第二基板140(图1)，构成检查芯片。将检查芯片的外观示于图9(A)，将配置有该芯片的流路装置的外观示于图9(B)。需说明的是，已知PDMS中可见光的平均透射率为60％以上。
图9为显示实施例1的检查芯片和配置有该芯片的流路装置的外观的图。
如上所述，检查芯片是使具有微流路的聚二甲基硅氧烷(PDMS)制第二基板140(图1)自吸附在具有硅纳米棒结构超表面110(图1)的第一基板120(图1)上而构成的。因此，检查芯片的制作工序显著简化。
根据图9(A)可见，检查芯片具有3个微流路(微通道)，各流路内配置有超表面110。利用这样的构成，可以根据流路数，对于多个目标生物分子并行进行目标生物分子的固定和荧光检测。矩形超表面位于图中横宽六边形的中心。以下述方式构成：从图中位于右侧的供应口供应试样等，从图中位于左侧的排出口将废液排出。图9(B)是配置有连接管(其用于对检查芯片进行试剂从外部流入和试剂向外部排出)以及覆盖检查芯片的盖子的流路装置的照片。该盖子兼具检查芯片的压紧功能，具有在仅靠第一基板与第二基板的自吸附来密封流路的检查芯片中不会发生漏液的功能。
使用实施例1的检查芯片和流路装置，如下操作进行已荧光标记的目标生物分子的检测。使PBS从连接管的供应口向检查芯片的微流路流入4分钟，进行润洗。接下来，使作为捕获分子的Protein AG-顺式的PBS稀释液(浓度146μg/mL)连续流动20分钟后，再次用PBS对微流路内进行4分钟润洗。流动速率为10μL/分钟。接下来，使400μL作为目标生物分子的、用HL555荧光标记的IgG分子的PBS稀释液(浓度5ng/mL、0.5ng/mL和0.05ng/mL)分别间歇性(ON/OFF＝1/3)流入检查芯片的各微流路。平均流动速率为8μL/分钟。然后，用PBS对微流路进行润洗，将悬浮分子和非特异吸附分子除去，使干燥氮气流入，使微流路内干燥。
将微流路内干燥后的检查芯片置于图5所示检测装置中，进行荧光测定。作为光源510，使用发出波长532nm的光的激光器(ATOK公司制，型号Action532Q-0050)；作为检测单元520，使用成像光谱检测器(Princeton-Instruments公司制，型号IsoPlane160-ProEM1024HS)。照射在超表面上的激光功率为0.17mW，测定时间为20秒。将对测定后的检查芯片进行SEM观察的结果示于图11。将在流过用HL555荧光标记的目标生物分子的稀释液(浓度5ng/mL)的超表面上测得的荧光光谱示于图12。将由荧光光谱得到的目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图14。
[实施例2]
实施例2中使用周期300nm、直径236nm的圆柱状硅纳米棒结构超表面，除此以外与实施例1同样地操作，构成检查芯片和流路装置。得到的检查芯片的外观与图9(A)是同样的，流路装置的外观与图9(B)是同样的。
实施例2中，将目标生物分子设为用AF555荧光标记的IgG分子。分别使250μL该目标生物分子的PBS稀释液(浓度2ng/ml、0.1ng/ml和0.005ng/ml)流经检查芯片的各微流路。流动速率为8.3μL/分钟。用PBS进行的润洗与实施例1同样地进行。将实施例2的目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图15。
[实施例3]
实施例3中，在具有周期410.5/710nm、孔的直径为302nm的金互补叠层结构超表面110(图1)的第一基板120(图1)上，通过自吸附粘贴具有微流路(流路高度30μm)的PDMS制第二基板140(图1)，构成检查芯片。将该检查芯片的外观示于图10。
图10为显示实施例3的检查芯片的外观的图。
如上所述，检查芯片是使具有微流路的PDMS制第二基板140(图1)自吸附在具有由金互补叠层结构构成的超表面110(图1)的第一基板120(图1)上而构成的。因此，检查芯片的制作工序显著简化。
根据图10可见，检查芯片具有3个微流路(微通道)，各流路内配置有超表面。利用这样的构成，可以根据流路数，对于多个目标生物分子并行进行目标生物分子的固定和荧光检测。矩形超表面位于图中横宽六边形的中心。以下述方式构成：从图中位于右侧的供应口供应试样等，从图中位于左侧的排出口将废液排出。检查芯片使用图9(B)所示盖子压紧，同时，与连接管连接，构成流路装置。
作为目标生物分子，将用HL555荧光标记的IgG分子进一步用生物素标记并使用，除此以外，通过与实施例1同样的步骤进行目标生物分子的检测。将目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图16。
[实施例4]
实施例4中使用具有直径316nm的圆柱状硅纳米棒结构的超表面的第一基板，除此以外，与实施例1同样地操作，构成检查芯片。检查芯片的外观与图9(A)是同样的。作为目标生物分子，使用用AF555荧光标记的作为肿瘤标记的p53抗体，除此以外，通过与实施例1同样的步骤，进行目标生物分子的检测。将目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图17。
[实施例5]
实施例5中，使用具有孔的直径为291nm的金互补叠层结构的超表面的第一基板，除此以外，与实施例3同样地操作，构成检查芯片。检查芯片的外观与图10是同样的。作为捕获分子，使用顺式-链霉亲和素，同时，作为目标生物分子，将用HL555荧光标记的p53抗体进一步用生物素标记并使用，除此以外，通过与实施例1同样的步骤，进行目标生物分子的检测。将目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图18。
[实施例6]
实施例6中，使用实施例5中制作的检查芯片和流路装置，对因捕获抗体有无而得到的目标生物分子的检测效率进行比较。
首先，将目标生物分子的浓度设为50ng/mL，除此以外，通过与实施例1同样的步骤，进行目标生物分子的检测。接着，在使目标生物分子流入由PBS润洗过的实施例5的流路装置之前，使作为捕获抗体的、抗生物素抗体稀释液(浓度10μg/mL)流动25分钟，除此以外，通过同样的步骤，进行目标生物分子的检测。对因捕获抗体有无而得到的荧光强度进行比较。将结果示于图21。
[实施例7]
实施例7中，使用具有周期400nm、直径302nm的圆柱状硅纳米棒结构的超表面的第一基板，同时，将在PDMS制第二基板上形成的微流路的流路高度D设为15μm，除此以外，与实施例1同样地操作，构成检查芯片和流路装置。检查芯片的外观与图9(A)是同样的，流路装置的外观与图9(B)是同样的。使用得到的流路装置，通过与实施例1同样的步骤，进行目标生物分子的检测。作为目标生物分子，将用AF555荧光标记的IgG分子进一步生物素标记并使用。这里，IgG浓度设为5ng/ml、0.33ng/ml和0.022ng/ml。
[比较例1]
比较例1中，使用周期400nm、直径302nm的圆柱状硅纳米棒结构超表面，除此以外，与实施例1同样地操作，构成检查芯片和流路装置，进行目标生物分子的检测。目标生物分子的浓度设为50ng/mL、5ng/mL和0.5ng/mL。测定荧光检测时，将PDMS制第二基板除去，对单独的具有超表面的基板(第一基板)进行测定，与通过微共振器进行检测的实施例进行比较。目标生物分子的荧光检测通过与实施例1同样的步骤进行。将关于浓度为50ng/mL的目标生物分子的荧光光谱示于图13。将由荧光光谱得到的目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图19。
[比较例2]
比较例2中，仅单独使用具有孔的直径为250nm的金互补叠层结构超表面的第一基板。作为捕获分子，将500ng/mL Protein A的PBS稀释液滴加在超表面上，为了向表面固定，在室温、湿润环境下保持1小时，然后，用PBS润洗。接下来，作为目标生物分子，将2μL用ICG标记的IgG分子的PBS稀释液(浓度90ng/mL、9000ng/mL和450000ng/mL)分别滴加在分别准备的基板的超表面上，在室温、湿润环境下温育2小时。然后，用PBS润洗，将未固定的悬浮分子等除去，使干燥氮气流入，使超表面干燥。
通过与实施例1同样的步骤，进行目标生物分子的检测。将目标生物分子浓度与荧光强度的关系示于图20所示。
[实施例8]
实施例8中，使用具有孔的直径为315nm的金互补叠层结构超表面的第一基板，除此以外，与实施例3同样地操作，构成检查芯片和流路装置。检查芯片的外观与图10是同样的。
使用实施例8的检查芯片和流路装置，如下进行未经荧光标记的目标生物分子的检测。使PBS从流路装置中连接管的供应口向检查芯片的微流路流动5分钟，使流路内充满液体。接下来，使作为捕获分子的Protein AG-顺式的PBS稀释液(浓度146μg/mL)流动23分钟。流动速率为11μL/分钟。然后，用PBS对微流路内进行6分钟润洗。然后，使360μL作为目标生物分子的未进行荧光标记的p53抗体的PBS稀释液(浓度1ng/mL)流入微流路。流动速率为7.7μL/mL。再次用PBS对微流路内进行10分钟润洗。接下来，将用DL555荧光标记的山羊多克隆抗兔IgG作为二抗，流加400μL(浓度9.1μg/mL)，用PBS对微流路进行润洗，将悬浮分子和非特异吸附分子除去，使干燥氮气流入，使微流路内干燥。
将微流路内干燥后的检查芯片置于图5所示检测装置中，进行荧光图像测定。作为光源510，使用532nm波长的发光二极管；作为检测单元520，使用CCD相机(Lumenera公司制，型号INFINITY-3S)。测定时间为2秒。将CCD相机得到的荧光图像示于图22。
为了便于理解，将实施例1～8和比较例1～2的检查芯片的一览表和实验条件汇总示于表1和表2，对以上结果进行说明。
[表1]
表1：检查芯片一览
Figure BDA0003637989100000231
[表2]
表2：实验条件一览
例子 捕获分子 捕获抗体 生物分子 荧光标记
实施例1 ProteinAG-顺式 - IgG HL555
实施例2 ProteinAG-顺式 - IgG AF555
实施例3 ProteinAG-顺式 抗生物素抗体 IgG<sup>*1</sup> HL555
实施例4 ProteinAG-顺式 - p53抗体 AF555
实施例5 顺式-链霉亲和素 - p53抗体 HL555
实施例6 ProteinAG-顺式 抗生物素抗体 IgG<sup>*1</sup> HL555
实施例7 ProteinAG-顺式 抗生物素抗体 IgG<sup>*1</sup> AF555
比较例1 ProteinAG-顺式 - IgG HL555
比较例2 ProteinAG-顺式 - IgG ICG
实施例8 ProteinAG-顺式 - IgG<sup>*2</sup> DL555<sup>*3</sup>
*1：用生物素标记的带荧光标记的生物分子
*2：无荧光标记的生物分子
*3：带荧光标记的二抗
图11为显示检测后的实施例1的检查芯片的情况的图。
图11(A)显示的是检测后实施例的检查芯片的外观，是包括超表面的低倍率SEM图像。微流路的边界明显显现，明确观察到因液流有无所导致的基板表面状态差异。该结果支持未发生漏液。图11(B)是超表面上表面的SEM图像。根据图11(B)，未观察到捕获分子、生物分子等凝集的情形。根据这一结果，提示通过实施例1的步骤，捕获分子、生物分子等不会在本发明检查芯片的超表面凝集而形成复合体等，能够以分子水平分别固定于最外面。虽然图中没有显示，但其他实施例的检查芯片中也同样没有漏液。
图12为显示使用了实施例1的检查芯片的发射光谱的图。
图13为显示使用了比较例1的检查芯片的发射光谱的图。
图12显示的是，对于实施例1的检查芯片，使得用HL555标记的IgG分子的浓度5ng/ml的目标生物分子流过后测得的发射光谱。根据图12，在波长570nm附近显示出发光峰，在610nm附近显示出发光的次级峰，可以确认，该发光是基于IgG上荧光标记的HL555的荧光。根据这一结果，确认本发明的检查芯片中荧光增强的波长区域(参照表1)确实存在于HL555荧光的波长范围内，可以使用本发明的检查芯片，通过图6所示步骤，通过荧光检测方法对荧光标记的目标生物分子进行检测。
进一步，如图12所示，实施例1的发射光谱显示出周期10nm左右的短周期干涉条纹。另一方面，如图13所示，比较例1的发射光谱不显示同样的干涉条纹。此外，虽然图中没有显示，但比较例2的发射光谱也同样不显示来自微共振器的干涉条纹。
根据图12的结果和比较例1和2的结果，表明通过在检查芯片中使用具有微流路的第二基板140(图1)，荧光在第一基板120(图1)的超表面110(图1)与第二基板140(图1)之间共振后，透过第二基板而放射，表明由具有超表面的第一基板和具有微流路的第二基板与它们之间的微米级空间形成了微共振器。
虽然图中没有显示，但使用了其他实施例2～8的检查芯片的发射光谱也同样显示出来自微共振器的干涉条纹，确认到具有超表面的第一基板与具有微流路的第二基板作为微共振器来发挥功能，在它们之间，从微共振器放射出荧光。此外，根据这些结果，可见，适合于荧光在第一基板与第二基板之间发生共振的基板间距为15μm以上50μm以下。
图14为显示由实施例1的荧光测定得到的标准曲线的图。
图15为显示由实施例2的荧光测定得到的标准曲线的图。
图16为显示由实施例3的荧光测定得到的标准曲线的图。
图17为显示由实施例4的荧光测定得到的标准曲线的图。
图18为显示由实施例5的荧光测定得到的标准曲线的图。
图19为显示由比较例1的荧光测定得到的标准曲线的图。
图20为显示由比较例2的荧光测定得到的标准曲线的图。
图14显示的是，由实施例1中的荧光光谱对波长590nm以上598nm以下的信号强度进行积分并对应于目标生物分子的浓度进行作图而得到的标准曲线。图15～图20分别是由实施例2～5和比较例1～2的荧光光谱同样地对信号强度进行积分并对应于目标生物分子的浓度进行作图而得到的标准曲线。
根据图14，在使用实施例1的检查芯片时，即使在0.05ng/ml的低浓度下也可观测到荧光信号。进一步，如黑色虚线所示，荧光强度相对于IgG分子浓度显示指数响应，可见在进行测定的浓度下，还没有达到提示检测极限的平稳期(一个定值)。
根据图15，可见在使用实施例2的检查芯片时，即使目标生物分子的浓度为0.005ng/mL(如果进行换算则为0.034pM，M为molar，即摩尔/升)的低浓度，也可检测到信号(荧光强度)。这表明形成微共振器的本发明的检查芯片能够高效地对目标生物分子进行检测。进一步可见，信号y相对于浓度x的衰减率可以用图中的黑色虚线所示y＝x＾0.4来近似。这表明信号的衰减相对于浓度而言极小，提示即使是更低浓度(例如1pg/mL级)的目标生物分子，也可使用本发明的检出芯片进行荧光检测。即，如果使用本发明的检查芯片，则能够以相对于可通过ELISA法检测的保证值17ng/mL(带HRP标记的IgG，Abcam，ab6721)约为34000倍的检测灵敏度对目标生物分子进行检测。
根据图16～图18(实施例3～5)可见，与图14(实施例1)同样地，在低浓度区域也观测到了荧光信号，能够检测目标生物分子。虽然图中没有显示，但在使用实施例7的检查芯片时也同样，在低浓度区域也能够检测到目标生物分子。这表明通过使本发明的检出芯片为第一基板(其具有金属互补叠层结构或纳米棒结构的超表面)朝向第二基板(其具备微流路)而构成微共振器，适合低浓度生物分子的荧光检测，而与目标生物分子的种类无关。
另一方面，根据图19(比较例1)可见，信号y相对于浓度x的衰减率由y∝x^0.6表示，信号与目标生物分子浓度的减少一起而急剧衰减。根据这一结果，表明本发明的检查芯片中荧光的放射控制对于低浓度目标生物分子的检测是有效的。
此外，根据图20(比较例2)可见，信号与目标生物分子浓度的减少一起进一步急剧衰减。对图14～图18与图20进行比较，可见在本发明的检查芯片中，通过利用微流路输送试样，捕获分子被高效地固定于超表面，目标生物分子被进一步高效地捕获。
图21为显示通过实施例6的捕获抗体的有无进行的荧光强度比较的图。
根据图21，通过使用抗生物素抗体作为捕获抗体，检测强度达到19倍。根据这一结果可见，使用本发明的检查芯片通过荧光检测方法对目标生物分子进行检测时，通过使用发生生物素-抗生物素结合反应的捕获抗体，可促进特异性结合，其结果是，可进行灵敏度更高的检测。
图22为实施例8的检查芯片的荧光图像。
图22中是用灰度来表示，显示白色的区域发出的是黄色的光。根据这一结果确认，通过使用本发明的检查芯片、按照图6所示步骤，即使是未经荧光标记的目标生物分子，也可使用荧光标记的二抗进行检测。
[实施例9]
实施例9中，使用与实施例3相同的检查芯片和流路装置，对再现性以及缓冲液(buffer)的影响进行研究。
通过与实施例1同样的步骤，使用顺式-链霉亲和素作为捕获分子、用HL555荧光标记的IgG分子的稀释液(浓度10ng/mL、NS缓冲液、10％血清、全血清)作为目标生物分子，进行荧光检测。需说明的是，为了进行比较，对于没有捕获分子以及捕获分子和目标生物分子均没有的情况也进行荧光检测。
对实验例进行汇总。
实验1)与实施例1同样地使捕获分子流入流路装置后，使得用NS缓冲液(Abcam公司制，ab193972)稀释的目标生物分子以7μL/分钟的平均流动速率流通30分钟。
实验2)将目标生物分子用90％NS缓冲液和10％人血清稀释，除此以外，与实验1同样地进行。
实验3)未事先使捕获分子流入流路装置，除此以外，与实验1同样地进行。
实验4)实验1测定的翌日，为了确认再现性，使用按照同一设计制作的超表面，进行与实验1同样的实验。
实验5)与实施例1同样地使捕获分子流入流路装置后，使得用100％人血清稀释的目标生物分子以4μL/分钟的平均流动速率流通50分钟。
实验6)为了确认背景信号水平，不使捕获分子和目标生物分子流入，仅使NS缓冲液以7μL/分钟的平均流动速率在流路装置中流通30分钟。
荧光测定通过下述方法来实施：在使用PBS的润洗液充满微流路的状态下，以用527nm波段的带通滤光片限制波长区域的LED光作为激发光来进行，用CCD相机拍摄利用591nm荧光带通滤光片得到的荧光图像。
将得到的荧光测定结果示于图23。
图23中，测定编号1～6分别对应于上述实验1～实验6。根据实验1与实验4的比较，可见本发明的检查芯片的再现性优异。
根据实验2的结果可见，在缓冲液中使用10％人血清时，如果使用本发明的检查芯片，虽然与PBS那样的NS缓冲液相比观察到强度稍微降低，但也能够良好地进行荧光检测。进一步令人惊讶的是，在缓冲液中使用全血清时，虽然荧光强度降低，但相对于实验3(没有捕获分子)、实验6(背景信号水平)而言，也显示出可充分差别化的荧光强度。根据这一结果，表明本发明的检查芯片也可与NS缓冲液同样地使用血清。
[实施例10]
实施例10中，使用与实施例3同样的检查芯片和流路装置，实施小鼠单克隆p53抗体的间接检测。
首先，使作为捕获分子的顺式-链霉亲和素的PBS稀释液(浓度20μg/mL)以11～12μL/分钟的流动速率流通30分钟。接下来，用PBS对微流路内进行10分钟润洗。接下来，在流路装置的3个通道中分别使生物素标记的小鼠单克隆p53抗体(通道1)、NS缓冲液(通道2)和生物素标记的小鼠单克隆p53抗体(通道3)以11～13μL/分钟的流动速率流通30分钟。将通道2设为空白。生物素标记的小鼠单克隆p53抗体用NS缓冲液稀释至5μg/mL。
接下来，将3个通道用PBS洗涤15分钟，在通道1和通道2中使荧光分子标记的山羊抗小鼠AF555-IgG的NS缓冲液稀释液流通30分钟，在通道3中使荧光分子标记的山羊抗兔AF555-IgG的NS缓冲液稀释液流通30分钟。荧光分子标记的山羊抗小鼠抗体和山羊抗兔抗体均为二抗。这些稀释液的浓度为100ng/mL，平均流动速率为11～12μL/分钟。然后，将微流路用PBS进行10分钟润洗，将悬浮分子和非特异吸附分子除去，使干燥氮气流入，使微流路内干燥后，与实施例9同样地操作，进行荧光测定。
图24为显示实施例10的各通道的荧光图像和生物分子固定状态的示意图。
图25为显示实施例10的荧光强度比较的图。
图24(A)～(C)分别显示的是配置在流路装置的通道1～3中的各检查芯片的荧光图像和示意性结合状态。根据图24(A)，通道1中，小鼠单克隆p53抗体2420被固定在固定于检查芯片的超表面的捕获分子(顺式-链霉亲和素)2410上，进一步固定有二抗(荧光分子标记的山羊抗小鼠AF555-IgG)2430。图中，显示白色的区域是基于二抗的发光。
根据图24(C)，通道3中，与通道1(参照图24(A))同样地，小鼠单克隆p53抗体2420被固定在固定于检查芯片的超表面的捕获分子(顺式-链霉亲和素)2410上，进一步固定有二抗(荧光分子标记的山羊抗兔AF555-IgG)2440。图中，白色虚线所示的区域是基于二抗的发光。该发光是由小鼠-兔间异种交叉反应所导致的。
另一方面，通道2中没有目标生物分子(小鼠单克隆p53抗体)流过，因此如图24(B)所示，检查芯片的超表面上，与其他通道同样地固定的捕获分子(顺式-链霉亲和素)2410和偶然的、非特异性固定的二抗(荧光分子标记的山羊抗小鼠AF555-IgG)2430继续存在。通道2中几乎确认不到发光，因而可以认为，本发明的检查芯片中，二抗非特异吸附引起的假信号足够小。
根据图25的通道1与通道2的比较，确认在超表面上存在未经荧光标记的目标生物分子时，通过使用荧光标记的二抗，能够对其进行特异性检测。
进一步，根据图25的通道1与通道3的比较，可见小鼠单克隆p53抗体与山羊抗兔抗体之间产生的交叉反应很小，荧光被抑制。这提示通过荧光强度的测定，可以选择性、特异性地对各个动物物种的p53抗体进行检测。
[实施例11]
实施例11中，使用与实施例3相同的检查芯片和流路装置，研究三明治测定配置中CEA的间接检测。CEA是医疗诊断中使用的肿瘤标记。
首先，使作为捕获分子的顺式-链霉亲和素的PBS稀释液(浓度20μg/mL)在流路装置中流通50分钟，将捕获分子固定在检查芯片的超表面上。接下来，准备作为兔单克隆的抗CEA抗体(Abcam，ab229074)和作为目标生物分子的天然蛋白质CEA(Abcam，ab742)。作为抗CEA抗体，准备生物素标记的抗体和未标记的抗体。
生物素标记的抗CEA抗体和抗CEA抗体的浓度均使用NS缓冲液制备成100ng/mL。CEA浓度使用NS缓冲液制备成30ng/mL、3ng/mL和0.3ng/mL三种。
将生物素标记的抗CEA抗体(100μL)、各浓度的目标生物分子CEA(100μL)和抗CEA抗体(100μL)的反应液在室温(299K)下以400rpm温育60分钟，形成三种抗CEA抗体-目标生物分子CEA-生物素标记的抗CEA抗体的三明治复合体混合物。各混合物中目标CEA的终浓度分别为10ng/mL、1ng/mL和0.1ng/mL。
使各鸡尾酒混合物以10μL/分钟的平均流动速率在流路装置的各通道中流通28分钟，使洗涤用缓冲液(Abcam，ab195215)在ELISA试剂盒内流动10分钟，用PBS润洗10分钟。
接下来，使作为二抗的荧光分子标记的AF555-IgG以9μL/分钟的平均流动速率在各通道中流通30分钟。AF555-IgG是山羊-多克隆抗兔抗体(Abcam，ab150078)。用PBS对通道进行10分钟润洗后，与实施例9同样地操作，进行荧光测定。
图26为显示实施例11的检查芯片的超表面上的分子情况的示意图。
根据图26，显示的是捕获分子(顺式-链霉亲和素)被固定在超表面上，其上固定有抗CEA抗体-目标生物分子CEA-生物素标记的抗CEA抗体的三明治复合体的情形。虽然目标生物分子CEA没有标签(没有荧光标记)，但能够进行荧光检测。
进一步，根据图26，显示的是三明治复合体中生物素标记的抗CEA抗体上固定有作为二抗的AF555-IgG的情形。二抗是多克隆的，因此二抗彼此发生结合，荧光增强。
图27为显示实施例11的各种浓度CEA的荧光图像的图。
图28为显示由实施例11的荧光测定得到的CEA荧光强度的浓度依赖性的图。
图27中是用灰度来表示，显示白色的区域发出的是黄色的光。根据图27，随着三明治复合体中目标生物分子CEA浓度的增强，超表面(图中的矩形区域)的荧光强度也增强。应当注意的是，二抗虽然也流经检查芯片的超表面以外的区域，但超表面以外的区域观察不到显著的荧光。根据这一结果，可以认为二抗特异性结合于三明治复合体中生物素标记的抗CEA抗体。
图28中，虚线是使用下面的Hill方程的拟合曲线。
y＝y0+(S-y0)xn/(xn+KD n)
这里，y为荧光强度，y0为荧光测定中的背景水平，S为饱和信号强度，x为目标生物分子的浓度，n为公共反应的程度，KD为解离常数。
根据图28可知，曲线与拟合曲线高度一致，且由于存在荧光强度从饱和区域直线性减少的部分，因而实现了高灵敏度检测。目前的CEA医疗诊断基准为5ng/mL，如果使用本发明的检查芯片，即使是更低的浓度也能检测，表明能够高精度提供定量结果。
进一步，从作为零信号的CEA浓度开始每隔3σ(σ：标准偏差)求出CEA浓度，对检测极限(LOD)进行统计学评价，其结果是，LOD为0.85pg/mL(图28中用3σ表示)。这提示，在理想地抑制了背景的情况下，可以通过荧光测定对极低浓度的目标生物分子CEA进行检测。
产业可利用性
本发明的荧光检测用生物分子检查芯片可应用于通过荧光检测方法检测生物分子的所有技术。如果使用本发明的检查芯片，即使目标生物分子为低浓度，例如为1pg/mL级，也能够高精度检测。
符号说明
100：荧光检测用生物分子检查芯片，
110、300、400：超表面，
120：第一基板，
130：微流路，
140：第二基板，
310、410：基材，
320：板坯材料，
330：金属材料，
340：表面层，
350：孔，
360：孔侧壁，
420：纳米棒，
500：检测装置，
510：光源，
520：检测单元，
530：滤光片，
540：计算机，
550：输出装置。

Claims (19)

1.一种荧光检测用生物分子检查芯片，其中，
具备具有超表面的第一基板和位于所述第一基板的对面且具有微流路的第二基板，
所述超表面具有使应检测的生物分子的固定高效化的间隙，同时，在包括所述生物分子发出的荧光的波长范围的区域显示荧光增强，
所述第二基板由可见光或近红外光可透射的材料构成，
所述荧光在所述第一基板与所述第二基板之间发生共振。
2.根据权利要求1所述的检查芯片，其中，所述超表面为金属互补叠层结构或纳米棒结构。
3.根据权利要求1或2所述的检查芯片，其中，所述荧光增强是具有可见光区域或近红外光区域波长的光的强度的增强。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的检查芯片，其中，由所述第一基板和所述第二基板形成的微流路的高度在10μm以上100μm以下的范围。
5.根据权利要求4所述的检查芯片，其中，由所述第一基板和所述第二基板形成的微流路的高度在15μm以上50μm以下的范围。
6.根据权利要求2所述的检查芯片，其中，
所述超表面为所述金属互补叠层结构，
所述金属互补叠层结构包括基材、位于所述基材表面的板坯材料以及至少位于所述板坯材料上的金属材料，
所述基材具有至少与所述板坯材料接触的表面层，
所述板坯材料由具有比所述表面层的折射率高的折射率的材料构成，同时，具有从其表面到达所述基材的所述表面层的、周期性排列的多个孔，
所述金属材料分别位于所述板坯材料表面和形成所述多个孔的底面的所述基材的表面层上。
7.根据权利要求6所述的检查芯片，其中，所述金属材料是具有可近似于德鲁德金属的复介电常数的物质。
8.根据权利要求7所述的检查芯片，其中，具有可近似于所述德鲁德金属的复介电常数的物质选自由金Au、银Ag、铜Cu、铝Al、铂Pt、钛Ti、镍Ni和它们的合金组成的组。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个孔为具有2种以上不同直径的圆孔或具有2种以上不同单边长度的棱柱状孔，并且/或者按2种以上不同周期排列。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个孔的周期在300nm以上1000nm以下的范围。
11.根据权利要求6～10中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个孔的直径或单边长度在100nm以上500nm以下的范围。
12.根据权利要求6～11中任一项所述的检查芯片，其中，所述板坯材料的厚度在100nm以上2μm以下的范围。
13.根据权利要求2所述的检查芯片，其中，
所述超表面为所述纳米棒结构，
所述纳米棒结构具备基材和在所述基材表面周期性直立的多个纳米棒，
所述基材由具有比所述多个纳米棒的折射率小的折射率的材料构成。
14.根据权利要求13所述的检查芯片，其中，
所述基材由具有1以上1.6以下的折射率的材料构成，
所述多个纳米棒由具有2以上5以下的折射率的半导体或电介质构成。
15.根据权利要求14所述的检查芯片，其中，所述半导体或衍生物选自由硅、锗、氮化镓和二氧化钛组成的组。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个纳米棒的周期在300nm以上1000nm以下的范围。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个纳米棒的直径或单边长度在100nm以上500nm以下的范围。
18.根据权利要求13～17中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个纳米棒的高度在100nm以上2μm以下的范围。
19.根据权利要求13～18中任一项所述的检查芯片，其中，所述多个纳米棒是具有2种以上不同直径的圆柱或具有2种以上不同单边长度的棱柱，并且/或者按2种以上不同周期排列。
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