CN115044652A

CN115044652A - 基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN115044652A
Application number: CN202110253881.8A
Authority: CN
Inventors: 杜宗敏; 游旸; 张平平; 杨瑞馥
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2022-09-13

Abstract

本发明公开了基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂盒及应用。本发明提供了本发明提供的试剂盒，其包括如下：1)UCP免疫层析试纸；2)CRISPR反应系统；所述CRISPR反应系统包括crRNA、Cas蛋白、两端标记生物素和FAM的探针、重组酶聚合酶扩增引物；本发明将CRISPR/Cas12a特异性识别靶标核酸序列的特性和UCP免疫层析试纸相结合，建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统和UCP免疫层析技术相结合的核酸检测方法，用UCP免疫层析和生物传感器进行CRISPR/Cas核酸检测结果的判读。本方法具有背景低、干扰小、可实现定量检测的特点。

Description

基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂盒及应用。

背景技术

病原体核酸检测对于感染性疾病的快速诊断具有重要意义。常规的检测方法需要专业人员在实验室使用专门的检测设备开展检测工作，如PCR仪、电泳仪、成像仪等设备完成检测，对人员、环境和设备均有较高的要求。在病原体的实际检测工作中需要灵敏、快速、设备依赖性小、无需专业的检测人员操作就能实现的核酸快速检测。

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein)系统是广泛存在于古生菌和细菌中的可清除外来入侵遗传物质入侵的获得性免疫系统。该系统主要由Cas效应蛋白和成簇短的回文间隔序列组成，发挥作用时首先由CRISPR基因座转录和加工出具有特殊结构的tracrRNA和crRNA，成熟的crRNA与Cas效应蛋白结合形成蛋白-核酸复合物，其间隔序列通过碱基配对识别外来入侵遗传物质，引导Cas蛋白定位在特异性靶核酸位点上，Cas蛋白发挥核酸内切酶的作用将靶核酸切割，达到清除外源遗传物质入侵的作用。根据Cas效应蛋白的种类，可将CRISPR/Cas系统分为两大类、6个型别和32个亚型。其中二类CRISPR系统仅需要一个单独的Cas蛋白与crRNA或tracRNA共同作用，就可以实现特异性核酸序列的识别和切割，因而非常有利于开发成基因编辑的工具。近几年，研究发现一些Cas效应蛋白在识别和切割特异性核酸靶标后，还能激活非特异切割ssDNA或ssRNA的反式核酸酶活性，如Cas12、Cas13、Cas14等蛋白。利用Cas蛋白的非特异性核酸酶活性，研究人员已经开发出基于Cas12蛋白的核酸检测系统DETECTR,HOLMES；基于Cas13蛋白的SHERLOCK系统，可实现灵敏、快速的病原体核酸检测。已有研究者将Cas检测系统和免疫胶体金试纸相结合，制备成免疫层析试纸条，进一步拓展了CRISPR/Cas核酸检测技术在快速检测领域的应用前景。

上转换发光材料(Up-Converting Phosphor，UCP)是一种可对能量进行上转的稀土金属合成物，即UCP材料可吸收低能量的红外光，但却发射高能量的可见光，因此具有背景低、干扰小、灵敏度高的特点。将UCP纳米颗粒表面进行一系列的化学修饰、活化、抗原抗体标记并与免疫层析技术相结合，可以进一步提高免疫层析快速检测的灵敏度和稳定性。

发明内容

本发明的目的是提供一种病原体核酸检测试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括如下：

1)UCP免疫层析试纸；

所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有UCP颗粒标记抗体的样品结合垫、含有T线和C线的NC膜和吸水垫；

所述T线由链霉亲和素形成；

所述C线由所述UCP颗粒标记抗体的二抗形成；

2)CRISPR反应系统；

所述CRISPR反应系统包括crRNA、Cas蛋白、两端标记生物素和FAM的探针、重组酶聚合酶扩增引物；

所述Cas蛋白为第二类V型或VI型CRISPR系统中的Cas蛋白；

所述探针的两个末端分别标记生物素和能与所述UCP颗粒标记抗体结合的基团；

所述crRNA包括病原体核酸的靶标序列；

所述重组酶聚合酶扩增引物为能够扩增靶标序列的重组酶聚合酶扩增引物。

上述试剂盒中，所述Cas蛋白为Cas12a蛋白。

上述试剂盒中，所述探针的核苷酸探针的两端分别标记生物素和荧光素。

上述试剂盒中，所述UCP颗粒标记抗体为抗FAM抗体。

上述试剂盒中，上述病原体核酸为鼠疫菌核酸；

所述crRNA为特异结合鼠疫菌核酸的pla基因的crRNA、特异结合鼠疫菌核酸的lcrV基因的crRNA和/或特异结合鼠疫菌核酸的ymt基因的crRNA。

上述试剂盒中，所述重组酶聚合酶扩增引物为能够特异性扩增鼠疫菌核酸的pla基因全长或部分的引物、能够特异性扩增鼠疫菌核酸的lcrV基因全长或部分的引物和/或能够特异性扩增鼠疫菌核酸的ymt基因全长或部分的引物。

上述试剂盒中，所述crRNA的核苷酸序列为序列表中序列1、序列2或序列3；

或，所述重组酶聚合酶扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所述的单链DNA分子组成；

或，所述重组酶聚合酶扩增引物由序列6所示的单链DNA分子和序列7所述的单链DNA分子组成；

或，所述重组酶聚合酶扩增引物由序列8所示的单链DNA分子和序列9所述的单链DNA分子组成；

或，所述两端标记生物素和FAM的探针的核苷酸序列由5个C组成，且该探针的一端标记FAM，另一端标记biotin。

上述的试剂盒在制备具有如下1)-4)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)检测目标核酸是否为病原体核酸；

2)检测待测样品中是否含有病原体核酸；

3)检测待测菌是否为鼠疫菌；

4)检测待测样品中是否含有鼠疫菌。

上述应用中，所述病原体核酸为鼠疫菌核酸。

上述待测样品可以为血清或者鼠疫菌，只要提取核酸作为模板即可。

本发明将CRISPR/Cas12a特异性识别靶标核酸序列的特性和UCP免疫层析试纸相结合，建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统和UCP免疫层析技术相结合的核酸检测方法，用UCP免疫层析和生物传感器进行CRISPR/Cas核酸检测结果的判读。本方法具有背景低、干扰小、可实现定量检测的特点。现以鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis，以下简称鼠疫菌)的核酸检测为例对本方法进行介绍。本发明建立的检测方法可以广泛应用于传染病病原学诊断、遗传疾病筛查、肿瘤诊断等核酸分子诊断中。本方法可实现灵敏、特异的定量检测标本中的鼠疫菌核酸，最低检测限可达到埃摩尔级。

附图说明

图1为crRNA优化检测结果。

图2为Cas12a-荧光检测体系特异性验证结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中鼠疫菌201株记载在如下文献中：TongWang，et.al,Applied andEnvironmental Microbiology,2019,85(12):e00097-19；公众可从申请人处获得。

假结核耶尔森氏菌Pa3606株(pYV⁺)记载在如下文献中：Johnson SL,etal.Genome Announc.2015,Apr 30；3(2):e00148-15；公众可从申请人处获得。

下述实施例中如无特殊说明，PBS为浓度为0.1M、pH值为7.4的PBS溶液。

实施例1、基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的Cas12a-UCP免疫层析核酸检测方法的建立

一、基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂的制备

1、CRISPR/Cas12a反应体系的建立

1)crRNA的制备

鼠疫菌靶标基因(pla、lcrV、ymt)分别位于鼠疫菌3个编码毒力因子的质粒上，阳性结果可以分别用于指示待检菌株具有相应质粒。

针对鼠疫菌靶标基因(pla、lcrV、ymt)的crRNA序列设计和制备。

合成带有T7启动子单链DNA进行退火，用TranscriptAid T7 High YieldTranscription Kit进行体外转录。转录完成后，用M5 HiPerRNAclean Mini kit进行纯化，纯化得到的RNA用做crRNA并通过体外转录获得crRNA产物。每个靶基因设计至少3条crRNA序列，通过实验筛选最优序列。

2)Cas12a蛋白的制备

质粒pMBP-LbCas12a转化入大肠杆菌BL21，接种含有pMBP-LbCas12a质粒的大肠杆菌BL21于LB培养基中培养。菌液密度达到OD_600nm＝0.6时加入0.5mM IPTG诱导。将盛有菌液的三角烧瓶置于摇床中，设定温度16℃，转速200rpm，震荡培养12h。培养结束后，4000rpm离心收集菌体，超声破碎菌体，离心收集含有重组Cas12a蛋白的菌体裂解液上清。用镍柱亲和层析方法纯化蛋白。收获的Cas12a蛋白用PBS溶液过夜透析，用TEV酶切体系在30℃下孵育1h，过镍柱捕获带有His标签的MBP蛋白标签，收集无标签的Cas12a蛋白流出液，浓缩后测定浓度，跑SDS-PAGE电泳检查纯度达到95％以上，分装-80℃冻存备用，得到Cas12a蛋白溶液，浓度为0.5mg/ml，溶剂为浓度为0.1M、pH值为7.4的PBS溶液。

Cas12a蛋白的氨基酸序列为来源于Lachnospiraceae bacterium ND2006株的Cas12a蛋白(Zetsche,B.et al.2015,Cell,163,759–771，氨基酸序列为序列10)。

3)FAM-C5-biotin

合成FAM-C5-biotin探针，核苷酸序列如下：5’-CCCCC-3’，且该探针的一端标记FAM，另一端标记biotin。

4)重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)引物

设计合成靶标基因pla、lcrV、ymt的RPA上下游引物各3对，并经过系统优化配对筛选，确定针对每个靶基因最优的引物对。TwistAMPbasic试剂对以上3个目的基因分别进行RPA扩增，各组分按照试剂盒说明书加入。

各靶基因最终使用引物对序列如下：

pla-F：ATATAGTTATAATAATGGAGCTTATACCGGAAACT(3-f)(序列4)

pla-R:TATTCTTATCAATGGTCTGAGTACCTCCTTTG(2-r)(序列5)

lcrV-F：TGCGAGGGCAAATTATTTAATATGATTAGAGCCTA(4-f)(序列6)

lcrV-R：ACGCCCGCAATTCCCATTGTGTATTCGGCGATGAT(3-r)(序列7)

ymt-F：TGTATCCTGATTTCCCACCAATCAACGATACAAGA(1-f)(序列8)

ymt-R：TTTCATGCAAGTTGAGTAGGTCCTCTTGCCGTTGC(1-r)(序列9)

2、上转换发光颗粒免疫层析试纸(UCP免疫层析试纸条)的制备

UCP免疫层析试纸条包括样品结合垫、分析膜、吸水垫以及粘性底衬；可以按照专利CN101788559A中的方法进行操作：

1)用小鼠anti-6-FAM抗体包被UCP颗粒，并制备样品结合垫。

anti-6-FAM抗体购自上海睿铂赛生物科技有限公司。

UCP颗粒标记anti-6-FAM抗体：每0.5mgUCP颗粒和50μg的anti-6-FAM抗体在包被液中包被1h。12000rpm离心，用100μLUCP保存液重悬颗粒，得到UCP颗粒标记anti-6-FAM抗体溶液。

在100μL UCP颗粒标记anti-6-FAM抗体溶液加入900μL稀释液(pH为7.2且浓度为0.03mol/L磷酸盐缓冲液，含有0.5％-2％蔗糖，0.5％-3％BSA)喷在样品垫上，得到样品结合垫，UCP颗粒标记anti-6-FAM抗体的包被浓度为2mg/ml。

2)含有T线和C线的分析膜的制备

以硝酸纤维素膜作为分析膜固相材料，制备成具有一定规格的条带，并在条带上的不同位置分别喷点生物活性分子链霉亲和素和羊抗鼠IgG，分别制成检测带和质控带，烘干该条带备用。

链霉亲和素溶液，溶质为链霉亲和素(索莱宝，S9170-10mg)，溶剂为磷酸盐包被缓冲液(每100mL含有0.8gNaCl，0.58gNa₂HPO₄·12H₂O，0.06gNaH₂PO₄·2H₂O)，浓度为2mg/mL。

羊抗兔IgG溶液，溶质为羊抗兔IgG(赛默飞，N24916)，溶剂为浓度为0.01M、pH值为7.4的磷酸盐包被缓冲液，浓度为1mg/mL。

将30μL链霉亲和素溶液喷施在NC膜上，形成T线，包被浓度为2mg/mL；

将30μL羊抗兔IgG溶液喷施在硝酸纤维素膜(NC膜)上，形成C线，包被浓度为1mg/mL，得到含有T线和C线的分析膜。

3)免疫层析试纸条

将1)得到的样品结合垫、2)得到的含有T线和C线的分析膜和吸水垫按照层析方向依次组装在塑料背板上，与塑料外壳装配成免疫层析试纸条。

3、制备基于CRISPR检测原理的核酸检测试剂盒

将上述2制备的上转换发光颗粒免疫层析试纸和上述1制备的CRISPR反应系统单独包装，构建得到基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂盒。

二、方法的建立

1、目的核酸的扩增

来源于待测样品的待测核酸或待测核酸为模板用TwistAmpPbasic试剂(TwistDx,英国,目录号：TABAS03)对3个目的基因pla、lcrV、ymt任一种进行RPA扩增(引物为一的4)中所示序列)，各组分按照试剂盒说明书加入反应体系，37℃下扩增15min，得到pla基因的RPA产物、lcrV基因的RPA产物或ymt基因的RPA产物。

2、Cas12a对底物的识别和探针切割

1)crRNA的选取

配置如下表1中所示的Cas12a的检测体系，其中crRNA为表2所示的对应不同靶基因的不同crRNA，RPA产物为上述1得到的对应靶基因的RPA产物。

Cas12a的检测体系37℃孵育40min，强阳性样品所需时间可缩短到10min，得到不同crRNA对应pla基因的CRISPR反应产物(pla-1、pla-2、pla-3)、不同crRNA对应lcrV基因的Cas12a检测反应产物(lcrV-1、lcrV-2、lcrV-3、lcrV-4、lcrV-5)或不同crRNA对应ymt基因的Cas12a检测反应产物(ymt-1、ymt-2、ymt-3、ymt-4、ymt-5)。

表1为Cas12a的检测体系

表2为crRNA序列

将上述不同crRNA对应pla基因的CRISPR反应产物、不同crRNA对应lcrV基因的Cas12a检测反应产物和不同crRNA对应ymt基因的Cas12a检测反应产物用荧光读板器读取荧光信号。

结果如图1所示，pla-1、pla-2、pla-3分别为pla-crRNA-1、pla-crRNA-2、pla-crRNA-3对应的pla基因的CRISPR反应产物，lcrV-1、lcrV-2、lcrV-3、lcrV-4、lcrV-5分别为lcrV-crRNA-1、lcrV-crRNA-2、lcrV-crRNA-3、lcrV-crRNA-4、lcrV-crRNA-5对应的lcrV基因CRISPR反应产物，ymt-1、ymt-2、ymt-3、ymt-4、ymt-5分别为ymt-crRNA-1、ymt-crRNA-2、ymt-crRNA-3、ymt-crRNA-4、ymt-crRNA-5对应的ymt基因CRISPR反应产物，选取信号最高的crRNA用于后续检测，分别选定lcrV-2(序列2)，pla-3(序列3)，ymt-2(序列1)为对应基因的crRNA序列。

2)、crRNA特异性检测

目的核酸的扩增：培养鼠疫菌201株(pMT1⁺,pCD1⁺,and pPCP1⁺),假结核耶尔森氏菌Pa3606株(pYV⁺)和小肠结肠炎菌ATCC9610株(pYV^-)，分别用pH值7.2、浓度为0.01M的PBS溶液重悬3种菌体，得到3种菌株10⁸CFU/mL的菌悬液。取1mL菌悬液2400g离心10min收集菌，加入200μL ddH₂O，在沸水浴上煮10min，138000g离心10min后收集上清液，得到3种菌株的基因组DNA。

Cas12a对底物的识别和探针切割：分别取10μL 3种菌株的DNA为模板进行RPA扩增(引物为一的4)中所示序列)，得到3种菌株的RPA产物；

分别用3种菌株的RPA产物替换表1所示的体系中的RPA产物，且采用上述1)筛选的lcrV-2(序列2)，pla-3(序列3)，ymt-2(序列1)作为不同靶基因的crRNA序列，37℃孵育40min，用荧光读板器读取荧光信号。由于检测特异性仅由crRNA和探针决定，因此仅用荧光法对特异性进行筛选评价。

结果如图2所示，图中分别代表用三种引物对检测鼠疫菌201株(Y.pestis),假结核耶尔森氏菌Pa3606株(Y.pseudotuberculosis)和小肠结肠炎菌ATCC9610株(pYV^-)(Y.enterocolitica)基因组DNA的结果；鼠疫菌有3个致病基因编码质粒，分别为pCD1，pMT1，pPCP1，其中pCD1为上述三种菌所共有的(该质粒在小肠结肠炎菌和假结核耶尔森氏菌中称为pYV^-)，pMT1，pPCP1为鼠疫菌特有的质粒；可以看出，只有鼠疫菌的3种基因检测都得到了阳性结果，假结核菌只有lcrV基因检测得到阳性结果，小肠结肠炎菌ATCC9610株(pYV^-)由于缺少相应质粒，因此所有基因检测均为阴性，说明本发明的Cas12a检测体系特异性好，能区分鼠疫菌的近源菌株。

3、试纸检测

将上述CRISPR反应产物与适量样品处理液(含1％BSA,0.5％SDS,0.25M NaCl,pH7.20的0.3M PBS)混合使总体积为500μL，得到上样液，取80μL上样液加入试纸条的样品结合垫，室温层析展开15min。

在上样液中靶标核酸序列存在的情况下，上样液流经样品结合垫，UCP颗粒标记anti-6-FAM抗体和上样液中的FAM-C5-Biotin结合，得到UCP颗粒-FAM抗体-FAM-C5-Biotin复合体；Cas12a非特异性核酸酶活性激活，Cas12a将UCP颗粒-FAM抗体-FAM-C5-Biotin复合体切开(依据Cas12a酶激活程度不同而程度有所不同)，得到C5-Biotin和UCP颗粒-FAM抗体-FAM，流经分析膜时，与FAM分离的C5-Biotin被分析膜的检测线上的链霉亲和素捕获而固定在检测线上，UCP颗粒-FAM抗体-FAM则继续向试纸条顶部层析，层析到达质控线时UCP颗粒-FAM抗体-FAM被质控线上的羊抗鼠IgG捕获而固定在质控线上。

在上样液中靶标核酸序列不存在的情况下，上样液流经样品结合垫，UCP颗粒标记anti-6-FAM抗体和上样液中的FAM-C5-Biotin结合，得到UCP颗粒-FAM抗体-FAM-C5-Biotin复合体；不激活Cas12a非特异性核酸酶活性，流经分析膜时，UCP颗粒-FAM抗体-FAM-C5-Biotin复合体被分析膜检测线上的链霉亲和素捕获而固定在检测线上，不会再被质控线上的羊抗鼠IgG捕获。

以不加入待测核酸得到的试纸检测为空白对照。

定性结果判读：

通过UPT传感器(北京热景生物技术有限公司，UPT-3A型生物传感器)检测待测核酸检测试纸的T线和C线的磷光信号，根据T线和C线信号值比T/C判断，用空白对照的T/C值减去3倍标准偏差设定为cutoff值，

若待测核酸的T/C值小于cutoff值的样本为阳性，即待测样品中含有或候选含有鼠疫菌核酸；

若待测核酸的的T/C值大于等于cutoff值的样本为阴性，即待测核酸不含有或候选不含有鼠疫菌的核酸。

上述检测可以用pla靶基因直接判断，也可以结合lcrV和ymt为靶基因的检测结果综合分析，3个基因均为阳性，检测准确度更高。

定量结果判断：

1)制备标准曲线，

用标准品浓度的鼠疫菌PBS悬液和通过UPT传感器检测的标准品的T线和C线荧光信号比值T/C制备标准曲线；

上述标准品浓度可以为鼠疫菌的浓度或者鼠疫菌核酸浓度；

上述标准品为鼠疫菌或者鼠疫菌核酸；

2)通过UPT传感器检测待测样品的试纸条T线和C线荧光信号值，并计算比值T/C，代入标准曲线中，得到待测样品中鼠疫菌的浓度或者鼠疫菌核酸浓度。

实施例2、Cas12a-UPT免疫层析检测鼠疫菌

使用靶向基因pla检测鼠疫菌DNA。

1、目的核酸的扩增

提取鼠疫菌201株的基因组DNA。

将上述鼠疫菌DNA用PBS溶液稀释为表3所示的不同浓度(10^-2-10³aM),分别作为模板，用TwistAmpBasic试剂对目的基因pla进行RPA扩增(引物为pla-F/pla-R)，各组分按照试剂盒说明书加入反应体系。

37℃下扩增15min，得到pla基因的RPA产物。

2、Cas12a对底物的识别和探针切割

将pla基因的RPA产物加入表1所示的体系(crRNA为pla-crRNA-3)中，37℃孵育40min，得到pla基因的CRISPR反应产物。

3、试纸检测

将上述pla基因的CRISPR反应产物与适量样品处理液(含1％BSA,0.5％SDS,0.25MNaCl,pH 7.20的0.03M PBS)混合使总体积为500μL，得到上样液，取80μL上样液加入上转换发光颗粒免疫层析试纸的样品结合垫，室温层析展开15min。

通过UPT传感器检测待测核酸检测试纸的T线和C线的磷光信号，根据T线和C线信号值比T/C判断，用空白对照的T/C值减去3倍标准偏差设定为cutoff值，

若待测核酸的T/C值小于cutoff值的样本为阳性，即待测核酸含有或候选含有鼠疫菌的核酸；

本检测的Cutoff值为1.72。

结果如表3所示。

表3为UCP传感器扫描试纸条获得的检测带(T)与质控带(C)信号比值T/C结果

结果显示，用本方法可以检测出样本中3aM的鼠疫菌DNA。

实施例3、Cas12a-UCP免疫层析检测模拟血液标本中的鼠疫菌

1、目的核酸的扩增

小鼠血清(北京百奥莱博，C1201)100μL加入100μL含有10¹-10⁷CFU鼠疫菌201株的PBS溶液，制备成模拟小鼠血液标本，每个浓度梯度制备8个标本，共56份模拟阳性血液标本。

另外取100μL小鼠血清加入100μLPBS，制备64份模拟阴性血液标本。

提取各个样本中的基因组DNA，以提取得到的DNA为模板，用TwistAmpBasic试剂对目的基因pla进行RPA扩增，得到不同浓度鼠疫菌中pla基因的RPA产物。

2、Cas12a对底物的识别和探针切割

与实施例1的二方法相同，用表1所示的体系(crRNA为pla-crRNA-3)，加入不同浓度鼠疫菌中pla基因的RPA产物，37℃孵育40min，强阳性样品所需时间可缩短到10min，得到不同浓度鼠疫菌pla基因的CRISPR反应产物。

3、试纸检测

将上述CRISPR反应产物分别与适量样品处理液(含1％BSA,0.5％SDS,0.25MNaCl,pH 7.20的0.03M PBS)混合使总体积为500μL，得到上样液，取80μL上样液加入试纸条的样品结合垫，室温层析展开15min。

通过UPT传感器检测待测核酸检测试纸的T线和C线的磷光信号，根据T线和C线信号值比T/C判断，用空白对照的T/C值减去3倍标准偏差设定为cutoff值，若待测核酸的T/C值小于cutoff值的样本为阳性，即待测核酸含有或候选含有鼠疫菌的核酸；

本实验测cutoff值为0.27。

结果如表4所示，Cas12a-UPT最低检测限为100CFU/100μL血液标本。

检测限以上的48份阳性模拟标本和64份阴性模拟标本的检测结果如表5所示，检测的灵敏度为93.75％(45/48)，特异性为90.63％(58/64)。

表4为模拟血液标本检测中UCP传感器扫描试纸条获得的检测带(T)与质控带(C)信号比值T/C结果

			T/C值
								重复	10<sup>1</sup>CFU	10<sup>2</sup>CFU	10<sup>3</sup>CFU	10<sup>4</sup>CFU	10<sup>5</sup>CFU	10<sup>6</sup>CFU	10<sup>7</sup>CFU
1	0.508	0.31	0.211	0.175	0.185	0.161	0.127
								2	0.473	0.21	0.169	0.093	0.168	0.102	0.106
3	0.281	0.144	0.166	0.098	0.12	0.104	0.095
								4	1.528	0.16	0.225	0.055	0.014	0.027	0.037
5	0.948	0.391	0.135	0.026	0.022	0.02	0.064
								6	0.622	0.161	0.107	0.081	0.038	0.108	0.016
7	0.456	0.095	0.08	0.164	0.158	0.085	0.13
								8	0.161	1.133	0.168	0.403	0.122	0.034	0.021
MEAN	0.622	0.326	0.158	0.137	0.103	0.080	0.075

表5为模拟血液标本检测结果的统计表

组别	样本数目	Cas12-UPT检测结果阳性	Cas12-UPT检测结果阴性
				阳性标本	48	45	3
阴性标本	64	6	58

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>基于CRISPR/Cas12a系统和上转换发光颗粒免疫层析的核酸检测试剂盒及应用

<160> 10

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212>DNA/RNA

<213>Artificial sequence

<400> 1

uaauuucuacuaaguguagaugtaaatctgaattacatga c 41

<210> 2

<211> 41

<212>DNA/RNA

<213>Artificial sequence

<400> 2

uaauuucuacuaaguguagauatggaaatatctatatttt t 41

<210> 3

<211> 41

<212>DNA/RNA

<213>Artificial sequence

<400> 3

uaauuucuacuaaguguagaucuguauguaaauuccgcaa a 41

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 4

atatagttataataatggagcttataccggaaact 35

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 5

tattcttatcaatggtctgagtacctcctttg 32

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 6

tgcgagggcaaattatttaatatgattagagccta 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 7

acgcccgcaattcccattgtgtattcggcgatgat 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 8

tgtatcctgatttcccaccaatcaacgatacaaga 35

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<211> 35

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 9

tttcatgcaagttgagtaggtcctcttgccgttgc 35

<210> 10

<211> 1228

<212> PRT

<213>Artificial sequence

<400> 10

Met Ser Lys Leu Glu Lys PheThrAsnCys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu ArgPhe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

35 40 45

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

50 55 60

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu AsnAsn Tyr Ile Ser Leu

65 70 75 80

PheArg Lys LysThrArgThr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys GlyAsn

100 105 110

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

130 135 140

AsnGlyPheThrThr Ala PheThrGlyPhePhe Asp AsnArg Glu Asn

145 150 155 160

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala PheArgCys Ile

165 170 175

Asn Glu Asn Leu ThrArg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

180 185 190

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

195 200 205

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp PhePhe Glu Gly Glu Phe

210 215 220

PheAsnPhe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

225 230 235 240

Ile GlyGlyPhe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

245 250 255

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

260 265 270

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

275 280 285

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

290 295 300

ArgAsnThr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

305 310 315 320

Leu Glu Lys Leu Phe Lys AsnPhe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Val Lys AsnGly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

340 345 350

Gly Glu TrpAsn Val Ile Arg Asp Lys TrpAsn Ala Glu Tyr Asp Asp

355 360 365

Ile His Leu Lys LysLys Ala Val ValThr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

370 375 380

ArgArg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

405 410 415

Ile IleIle Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

420 425 430

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

435 440 445

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

450 455 460

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala PhePheGly Glu Gly Lys Glu Thr

465 470 475 480

AsnArg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

485 490 495

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile ArgAsn Tyr Val Thr

500 505 510

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

515 520 525

Gln Phe Met GlyGlyTrp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

530 535 540

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

545 550 555 560

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val AsnGly

565 570 575

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

580 585 590

Leu Pro Lys Val PhePhe Ser Lys LysTrp Met Ala Tyr TyrAsn Pro

595 600 605

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys AsnGlyThrPhe Lys LysGly

610 615 620

Asp Met PheAsn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp PhePhe Lys

625 630 635 640

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp PheAsn

645 650 655

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala GlyPhe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

675 680 685

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu GluGly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His GlyThr Pro Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Phe Lys Leu LeuPhe Asp Glu AsnAsn His Gly Gln Ile

725 730 735

Arg Leu Ser GlyGly Ala Glu Leu Phe Met ArgArg Ala Ser Leu Lys

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

755 760 765

Asn Pro Asp Asn Pro Lys LysThrThrThr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

770 775 780

Lys Asp Lys ArgPhe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

785 790 795 800

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile AsnThr Glu Val

805 810 815

Arg Val Leu Leu Lys His Asp AspAsn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

ArgGly Glu ArgAsn Leu Leu Tyr Ile Val ValVal Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile IleAsnAsnPheAsn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu ArgPhe Glu Ala Arg Gln AsnTrpThr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser GlyPhe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

930 935 940

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

945 950 955 960

Lys Ser Asn Pro Cys Ala ThrGlyGly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

965 970 975

ThrAsn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln AsnGlyPhe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

GlyPhe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp

1010 1015 1020

Ser Lys LysPhe Ile Ser SerPhe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro

1025 1030 1035

Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys AsnPhe Ser

1040 1045 1050

ArgThr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys LysTrp Lys Leu Tyr Ser Tyr

1055 1060 1065

GlyAsnArg Ile Arg Ile PheArgAsn Pro Lys LysAsnAsn Val

1070 1075 1080

Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu

1085 1090 1095

PheAsn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln GlnGly Asp Ile Arg Ala

1100 1105 1110

Leu LeuCys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser SerPhe Met

1115 1120 1125

Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met ArgAsn Ser Ile ThrGly

1130 1135 1140

ArgThr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Gly Ile Phe Tyr Asp Ser ArgAsn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala

1160 1165 1170

Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala AsnGly Ala Tyr Asn Ile Ala

1175 1180 1185

Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala Glu Asp

1190 1195 1200

Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp

1205 1210 1215

Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His

1220 1225

Claims

1.一种病原体核酸检测试剂盒，其包括如下：

1)UCP免疫层析试纸；

所述T线由链霉亲和素形成；

所述C线由所述UCP颗粒标记抗体的二抗形成；

2)CRISPR反应系统；

所述Cas蛋白为第二类V型或VI型CRISPR系统中的Cas蛋白；

所述crRNA包括病原体核酸的靶标序列；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas蛋白为Cas12a蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的核苷酸探针的两端分别标记生物素和荧光素。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述UCP颗粒标记抗体为抗FAM抗体。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：

所述病原体为鼠疫菌；

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

所述重组酶聚合酶扩增引物为能够特异性扩增鼠疫菌核酸的pla基因全长或部分的引物、能够特异性扩增鼠疫菌核酸的lcrV基因全长或部分的引物和/或能够特异性扩增鼠疫菌核酸的ymt基因全长或部分的引物。

7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于：

所述crRNA的核苷酸序列为序列表中序列1、序列2或序列3；

或，所述两端标记生物素和FAM的探针的核苷酸序列为5个C组成。

8.权利要求1-7任一所述的试剂盒在制备具有如下1)-4)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测目标核酸是否为病原体核酸；

2)检测待测样品中是否含有病原体核酸；

3)检测待测菌是否为鼠疫菌；

4)检测待测样品中是否含有鼠疫菌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述病原体核酸为鼠疫菌核酸。