CN115078711B

CN115078711B - 一种流式荧光检测用清洗液

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Publication number: CN115078711B
Application number: CN202210682331.2A
Authority: CN
Inventors: 方剑秋; 李猛; 方云琪; 白艳军
Original assignee: Shanghai Wanzijian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Wanzijian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2025-05-06
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN115078711A

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种流式荧光检测用清洗液，所述清洗液包括基础洗液、蛋白质类和醇类，所述基础洗液包括缓冲盐和表面活性剂，所述基础洗液的溶剂为水，所述基础洗液中缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠或氯化钾中的一种或多种；所述表面活性剂为非离子表面活性剂。使用本发明的清洗液，满足流式荧光发光平台清洗效果的同时，不仅能稳定检测信号，减小微球沉降，而且兼顾了本底信号，避免非特异性吸附。

Description

一种流式荧光检测用清洗液

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种流式荧光检测用清洗液。

背景技术

流式荧光发光免疫分析法以编码微球为固相载体，将抗体(或抗原)通过化学键连接到编码微球上，捕获血清或血浆中目标抗原(或抗体)，与标记了发光物质的抗体(或抗原)发生反应。当免疫反应结束后，通常要使用清洗液对反应物进行洗涤，以去除未参加反应的物质。洗涤后，微球通过吸样管进入仪器，激光激发微球上PE荧光，经光电转化后输入计算机，并由软件分析处理，从而实现对待检物质的检测。

目前很多技术人员对清洗液进行了研究，例如现有技术公开了一种电化学发光清洗液，其主要组分包括Tris缓冲液等，主要应用于贝克曼全自动免疫分析仪。还有现有技术公开了一种化学发光清洗液，主要成分包括磷酸盐缓冲液等，这是针对雅培化学发光免疫分析仪开发的一款洗液。还有现有技术公开了一种清洗液，主要成分有磷酸盐缓冲液、无机盐等，可以适应酶促化学发光、直接化学发光系统。

然而以上清洗液对于流式荧光发光法均存在检测信号不稳定、部分实验本底信号异常、微球沉降等方面的不足，因此亟需针对这几方面进行改善。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种流式荧光检测用清洗液，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种流式荧光检测用清洗液，所述清洗液包括基础洗液、蛋白质类和醇类，所述基础洗液包括缓冲盐和表面活性剂，所述基础洗液的溶剂为水。

所述基础洗液中缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠或氯化钾中的一种或多种。

以基础洗液的总体积为基准，所述缓冲盐的终浓度为5～10g/L。

所述表面活性剂为非离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80、Span-60、Triton X-45、TritonX-100或Triton X-305中的一种或多种。

所述基础洗液中还包括防腐剂。所述防腐剂为KroVin系列防腐剂或ProClin系列防腐剂。

所述清洗液的pH为5.5-8.5。

在一些实施方案中，所述蛋白质类选自BSA、酪蛋白、卵清蛋白或血清中的一种或多种。所述血清选自牛血清、羊血清、鸡血清中的任一种或多种。

所述蛋白质类为BSA、酪蛋白或卵清蛋白时，以清洗液的总体积为基准，清洗液中蛋白质类的终浓度为1-50g/L。

所述醇类选自甘油、甘露醇、PVP、PVA、PEG中的一种或多种。

所述醇类为甘露醇、PVP、PVA、PEG时，醇类的终浓度为0.1-50g/L。

本发明还提供所述清洗液在流式荧光检测中的用途。

如上所述，本发明的一种流式荧光检测用清洗液，具有以下有益效果：使用本发明的清洗液，满足流式荧光发光平台清洗效果的同时，不仅能稳定检测信号，减小微球沉降，而且兼顾了本底信号，避免非特异性吸附。

具体实施方式

本发明提供一种流式荧光检测用清洗液，所述清洗液包括基础洗液、蛋白质类和醇类，所述基础洗液包括缓冲盐和表面活性剂。

在本发明的某些实施方式中，所述基础洗液中缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠或氯化钾中的一种或多种。

在本发明的某些实施方式中，以基础洗液的总体积为基准，所述缓冲盐的终浓度为5～10g/L，例如为5～6g/L、6～7g/L、7～8g/L、8～9g/L、9～10g/L。

在本发明的某些实施方式中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80、Span-60、Triton X-45、TritonX-100或Triton X-305中的一种或多种。以基础洗液的总体积为基准，所述表面活性剂的终浓度为0.05％-0.5％v/v，例如为0.05-0.1％v/v、0.1-0.2％v/v、0.2-0.3％v/v、0.3-0.4％v/v、0.4-0.5％v/v。

在本发明的某些实施方式中，所述基础洗液中还包括防腐剂。所述防腐剂为KroVin系列防腐剂或ProClin系列防腐剂。

所述KroVin系列防腐剂例如为KroVin100、KroVin 400、KroVin 500或KroVin750；所述ProClin系列防腐剂例如为ProClin50、ProClin150、ProClin200、ProClin300、ProClin950或ProClin5000。

以基础洗液的总体积为基准，所述防腐剂的终浓度为0.05％-0.2％v/v，例如为0.05％-0.1％v/v、0.1％-0.15％v/v、0.15％-0.2％v/v。

所述基础洗液的溶剂为水。

基础洗液中的缓冲盐、表面活性剂和防腐剂是为了保证基本清洗效果以及体系的稳定。仅仅使用基础洗液作为流式荧光发光法的洗液，对于不同项目，其检测结果的稳定性、准确性及微球沉降等方面均存在不足。

所述清洗液的pH为5.5-8.5。优选的，所述清洗液的pH为6.0～8.0。

所述蛋白质类为BSA、酪蛋白或卵清蛋白时，以清洗液的总体积为基准，清洗液中蛋白质类的终浓度为1-50g/L。在一优选的实施方式中，清洗液中蛋白质类的终浓度为5-40g/L，例如为5-10g/L、10-20g/L、20-30g/L或30-40g/L。

所述蛋白质类为血清时，清洗液中蛋白质类的终浓度为0.1％-5％v/v，例如为0.1-1％v/v、1-1.5％v/v、1.5-2％v/v、2-2.5％v/v、2.5-3％v/v、3-3.5％v/v、3.5-4％v/v、4-4.5％v/v、4.5-5％v/v。

在一个实施方案中，所述醇类选自甘油、甘露醇、PVP、PVA、PEG中的一种或多种。具体的，所述PEG选自PEG200、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG6000、PEG8000。

所述醇类为甘油时，甘油的终浓度为0.05％-0.5％v/v。所述甘油的终浓度例如为0.05-0.1％v/v、0.1-0.2％v/v、0.2-0.3％v/v、0.3-0.4％v/v或0.4-0.5％v/v。

所述醇类为甘露醇、PVP、PVA、PEG时，醇类的终浓度为0.1-50g/L。所述醇类的终浓度例如为0.1-1g/L、1-10g/L、10-20g/L、20-30g/L、30-40g/L或40-50g/L。

本发明还提供所述清洗液在流式荧光检测中的用途。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明的洗液是由基础洗液、蛋白质类和醇类组成；其中，在1L基础洗液中，蛋白类物质的加入量按终浓度为1-50g/L加入，醇类的加入量按终浓度为0.1-50g/L加入；所述洗液的pH＝5.5-8.5。

下述实施例中使用的基础洗液配制方案如下：

以纯化水为溶剂，按如下重量、体积配制基础洗液，配置完成后总体积为1L：

Na₂HPO₄	1.1g
		NaCl	5.0g
KH₂PO₄	0.5g
		KCl	1.4g
TritonX-100	1mL
		ProClin300	1mL

如上配制好的基础洗液pH值为5.5-8.5，将配制好的基础洗液用0.22μm滤膜过滤后，于室温保存。

实施例1一种用于流式荧光发光法的洗液

洗液配置方法如下：以基础洗液为溶剂，按如下重量、体积配制清洗液，配置完成后调整pH＝5.5-8.5，洗液总体积为1L：

牛血清	5mL
		BSA	20g
基础洗液	定容至1L

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例2一种用于流式荧光发光法的洗液

羊血清	1mL
		酪蛋白	10g
基础洗液	定容至1L

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例3一种用于流式荧光发光法的洗液

BSA	25g
		卵清蛋白	5g
基础洗液	定容至1L

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例4一种用于流式荧光发光法的洗液

甘油	2mL
		PEG6000	10g
基础洗液	定容至1L

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例5一种用于流式荧光发光法的洗液

PVA	5g
		PEG200	30g
基础洗液	定容至1L

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例6一种用于流式荧光发光法的洗液

PVP	2g
		PEG2000	20g
基础洗液	定容至1L

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例7一种用于流式荧光发光法的洗液

洗液配置方法如下：以基础洗液为溶剂，按如下重量、体积配制清洗液，配置完成后调整pH＝6.0-6.6，洗液总体积为1L：

如上配制好的洗液用0.22μm滤膜过滤后，于2-8℃下保存。

实施例8一种用于流式荧光发光法的洗液

洗液配置方法如下：以基础洗液为溶剂，按如下重量、体积配制清洗液，配置完成后调整pH＝6.6-7.3，洗液总体积为1L：

卵清蛋白	10g
		牛血清	2mL
PEG1000	25g
		甘露醇	5g
基础洗液	定容至1L

实施例9一种用于流式荧光发光法的洗液

洗液配置方法如下：以基础洗液为溶剂，按如下重量、体积配制清洗液，配置完成后调整pH＝7.3-8.0，洗液总体积为1L：

羊血清	5mL
		卵清蛋白	5g
PVA	1g
		PVP	2g
甘油	3mL
		基础洗液	定容至1L

实施例10

实验结果测定：使用实施例1-9以及基础洗液进行流式荧光发光免疫分析测定，分别进行如下实验：

10.1清洗效果验证

采用贝克曼库尔特流式细胞仪Dxflex分别对基础洗液以及实施例1-9的洗液进行测定，表中试剂A、试剂B、试剂C均为糖类抗原125定量检测试剂盒、肌红蛋白(MYO)检测试剂盒、抗双链DNA抗体(dsDNA)检测试剂盒中的试剂，测定步骤根据说明书进行，大致如下：

测定项目选择糖类抗原125(CA125)、肌红蛋白(MYO)、抗双链DNA抗体(dsDNA)，检测样本为CA125、MYO、dsDNA校准品20例，每个样本检测信号的平均值如表1所示：

表1：基础洗液和实施例1-9洗液本底信号检测结果

本底信号(RLU)	CA125	MYO	dsDNA
				基础洗液	2293	2192	1916
实施例1	1213	1052	664
				实施例2	1256	1024	865
实施例3	1125	995	542
				实施例4	1610	1332	1033
实施例5	1584	1361	1201
				实施例6	1609	1488	994
实施例7	1027	894	655
				实施例8	939	912	571
实施例9	1028	985	601

表1的结果表明，本发明洗液的清洗效果较好，各项目本底信号均较低。

10.2体系信号稳定性

采用贝克曼库尔特流式细胞仪Dxflex分别对基础洗液以及实施例1-9的洗液在不同时间测定同一组样本，样本为CY211、dsDNA、CK-MB各自的校准品，第一次测定后室温放置60min再次使用贝克曼库尔特流式细胞仪Dxflex读取信号值，检测信号结果如表2所示：

表2：基础洗液及实施例1-9洗液体系信号稳定性检测结果

表2的结果表明，本发明的洗液，在体系信号稳定性方面较基础洗液表现更佳。

10.3沉降实验

分别使用基础洗液以及实施例7-9配置包被有抗原/抗体的磁球的工作液，混匀，平分为4份，每份1mL。隔一段时间取200μL上清液用贝克曼库尔特流式细胞仪Dxflex读取球数，重复检测3次，取平均值纳入结果统计，检测结果如表3所示：

表3：基础洗液及实施例7-9洗液自然沉降速率测定

表3的结果表明，包被有抗原/抗体的磁球，在基础洗液中的沉降速率较其在实施例7-9洗液中快，且在20min时已经有较明显的区别。综上可以认为本发明的洗液相对于基础洗液在自然重力下不易使微球沉降。

10.4准确度实验

采用贝克曼库尔特流式细胞仪Dxflex分别对基础洗液以及实施例7-9的洗液进行测定，各测定同一组样本20例，样本为CA125、CEA、NSE、CY211、ProGRP的校准品，检测信号平均值结果如表4所示：

表4：基础洗液和实施例7-9洗液准确度检测结果

由表4可知，5项指标的测值均接近，各项两组数据进行t检验，差异无统计学意义(p>0.05)，且R²值均大于0.990，呈高度正相关性。以上结果说明本发明的清洗液测试的准确度良好，加入组分不影响检测准确度。

10.5精密度实验

按照实施例7-9，各配置三批清洗液，分别为第1批、第2批和第3批。取浓度为40ng/ml的AFP样本，采用贝克曼库尔特流式细胞仪Dxflex，分别对实施例7-9三批次检测结果进行测定，每批清洗液重复检测20次，计算批内及批间变异系数，检测结果如表5所示：

表5：实施例7-9洗液精密度检测结果

表5的结果表明，本发明的洗液批内变异系数(CV)<10％，批间变异系数(CV)<15％，符合一般诊断试剂的批内变异系数小于10％，批间变异系数小于15％的要求。以上结果说明本发明洗液检测的精密性和重复性良好。

10.6洗液存储稳定性

按实施例7-9分别配制1.4L清洗液，分成7瓶，每瓶约200mL，在2-8℃分别放置0天2个月、4个月、6个月、9个月、12个月、15个月后进行检测。使用浓度为5±0.5ng/mL的CEA样本各重复检测20次，计算变异系数，检测结果如表5所示：

表5：基础洗液及实施例7-9洗液存储稳定性检测结果

表5的结果表明，以实施例7-9配制的洗液在2-8℃条件下保存时间15个月以内时，样本CV值都在5％以内。从试剂状态来看，3种实施例洗液澄清透明，未出现沉淀，说明此发明洗液存储稳定性良好。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.如下所述的流式荧光检测用清洗液在流式荧光发光免疫分析法检测中的用途，其特征在于，所述流式荧光检测用清洗液包括基础洗液，所述基础洗液包括缓冲盐和TritonX-100，所述基础洗液的溶剂为水，所述流式荧光检测用清洗液选自以下任一配方：

1)基础洗液、10g/L的酪蛋白、25g/L的BSA、20g/L的PEG1500、体积浓度为0.1％的甘油；

2)基础洗液、10g/L的卵清蛋白、体积浓度为0.2％的牛血清、25g/L的PEG1000、5g/L的甘露醇；

3)基础洗液、体积浓度为0.5％的羊血清、5g/L的卵清蛋白、1g/L的PVA、2g/L的PVP、体积浓度为0.3％甘油。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基础洗液中缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠或氯化钾中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以基础洗液的总体积为基准，所述缓冲盐的终浓度为5～10g/L。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以基础洗液的总体积为基准，所述TritonX-100的终浓度为0.05％-0.5％v/v。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基础洗液中还包括防腐剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述防腐剂为KroVin防腐剂或ProClin防腐剂。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，以基础洗液的总体积为基准，所述防腐剂的终浓度为0.05％-0.2％v/v。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述清洗液的pH为5.5-8.5。