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CN115197890A - 一种胰岛细胞培养基及其制备方法和用途 - Google Patents

一种胰岛细胞培养基及其制备方法和用途 Download PDF

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CN115197890A CN202210623177.1A CN202210623177A CN115197890A CN 115197890 A CN115197890 A CN 115197890A CN 202210623177 A CN202210623177 A CN 202210623177A CN 115197890 A CN115197890 A CN 115197890A
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Abstract

本发明提供了一种胰岛细胞培养基及其制备方法和用途，属于细胞培养技术领域。本发明胰岛细胞培养基可将胰岛细胞体外培养时间延长至30天以上，且仍然能够保持胰岛细胞的活性，对胰岛细胞培养具有重要意义。

Description

一种胰岛细胞培养基及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胰岛细胞培养基及其制备方法和用途。
背景技术
胰岛细胞是人体内重要的一种细胞，调节人体中血糖含量。胰岛细胞与糖尿病有关，对胰岛细胞进行研究或者利用胰岛细胞对药物进行筛选评价，对于糖尿病的治疗有重要意义。
但是胰岛细胞不能冻存，且体外不能长时间存活，因此限制了体外对胰岛细胞的研究。CMRL 1066培养基为培养胰岛细胞常用的培养基，但其在体外培养胰岛细胞的时间很短。目前。缺少可以延长胰岛细胞体外培养时间，使胰岛细胞在体外保持良好活性的胰岛细胞培养基。如果能够研究一种胰岛细胞培养基，延长胰岛细胞体外培养时间，保持胰岛细胞的体外活性，这将有利于对胰岛细胞的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰岛细胞培养基及其制备方法和用途。
本发明提供了一种胰岛细胞培养基，每1L胰岛细胞培养基由如下组分组成：氯化钙30～35mg、硫酸铜0.001～0.1mg、磷酸二氢钾80～90mg、磷酸氢二钠150～160mg、硫酸亚铁0.1～1mg、氯化钾280～290mg、硫酸镁70～80mg、氯化钠7～9g、硫酸锌0.01～0.1mg、L-精氨酸盐酸盐210～220mg、L-谷氨酰胺140～150mg、甘氨酸1～10mg、L-组氨酸盐酸盐20～30mg、L-异亮氨酸1～10mg、L-亮氨酸10～20mg、L-赖氨酸盐酸盐20～30mg、L-蛋氨酸1～10mg、L-苯丙氨酸1～10mg、L-丝氨酸10～20mg、L-苏氨酸1～10mg、L-丙氨酸1～10mg、L-天门冬酰胺10～20mg、L-天门冬氨酸10～20mg、L-半胱氨酸盐酸盐30～40mg、L-脯氨酸10～20mg、L-色氨酸0.1～1mg、L-酪氨酸1～10mg、L-缬氨酸1～10mg、D-葡萄糖1～2g、次黄嘌呤1～10mg、硫辛酸0.1～1mg、酚红1～10mg、胸苷0.1～1mg、丙酮酸钠100～110mg、维生素H0.01～0.1mg、D-泛酸钙0.1～1mg、氯化胆碱0.1～1mg、叶酸1～10mg、肌醇0.1～1mg、烟酰胺0.1～1mg、酸吡哆醇0.1～1mg、核黄素0.1～1mg、盐酸硫胺1～10mg、维生素B12 1～10mg、HBS 2～3g、IBMX 10～20mg、尼克酰胺1～2g、青霉素0.1～1g、链霉素0.1～1g，余量为水。
进一步地，每1L胰岛细胞培养基由如下组分组成：氯化钙33～34mg、硫酸铜0.001～0.002mg、磷酸二氢钾82～83mg、磷酸氢二钠153～154mg、硫酸亚铁0.4～0.5mg、氯化钾285～286mg、硫酸镁74～75mg、氯化钠7.4～7.5g、硫酸锌0.01～0.02mg、L-精氨酸盐酸盐210～211mg、L-谷氨酰胺145～146mg、甘氨酸7～8mg、L-组氨酸盐酸盐22～23mg、L-异亮氨酸2～3mg、L-亮氨酸12～13mg、L-赖氨酸盐酸盐29～30mg、L-蛋氨酸4～5mg、L-苯丙氨酸5～6mg、L-丝氨酸10～11mg、L-苏氨酸3～4mg、L-丙氨酸9～10mg、L-天门冬酰胺15～16mg、L-天门冬氨酸12～13mg、L-半胱氨酸盐酸盐36～37mg、L-脯氨酸11～12mg、L-色氨酸0.5～0.6mg、L-酪氨酸1～2mg、L-缬氨酸3～4mg、D-葡萄糖1.1～1.2g、次黄嘌呤4～5mg、硫辛酸0.1～0.2mg、酚红1～2mg、胸苷0.6～0.7mg、丙酮酸钠109～110mg、维生素H 0.02～0.03mg、D-泛酸钙0.7～0.8mg、氯化胆碱0.6～0.7mg、叶酸1～2mg、肌醇0.5～0.6mg、烟酰胺0.6～0.7mg、酸吡哆醇0.2～0.3mg、核黄素0.3～0.4mg、盐酸硫胺1～2mg、维生素B12 1～2mg、HBS2.4～2.5g、IBMX 11～12mg、尼克酰胺1.2～1.3g、青霉素0.1～0.2g、链霉素0.1～0.2g，余量为水。
进一步地，每1L胰岛细胞培养基由如下组分组成：氯化钙33.29mg、硫酸铜0.0016mg、磷酸二氢钾83mg、磷酸氢二钠153.7mg、硫酸亚铁0.45mg、氯化钾285mg、硫酸镁74.62mg、氯化钠7.4g、硫酸锌0.016mg、L-精氨酸盐酸盐211mg、L-谷氨酰胺146mg、甘氨酸7.41mg、L-组氨酸盐酸盐23mg、L-异亮氨酸2.6mg、L-亮氨酸13mg、L-赖氨酸盐酸盐29mg、L-蛋氨酸4.48mg、L-苯丙氨酸5mg、L-丝氨酸10.5mg、L-苏氨酸3.57mg、L-丙氨酸9mg、L-天门冬酰胺15.01mg、L-天门冬氨酸13mg、L-半胱氨酸盐酸盐36.24mg、L-脯氨酸11.5mg、L-色氨酸0.6mg、L-酪氨酸1.8mg、L-缬氨酸3.5mg、D-葡萄糖1.1g、次黄嘌呤4mg、硫辛酸0.2mg、酚红1.2mg、胸苷0.7mg、丙酮酸钠110mg、维生素H 0.024mg、D-泛酸钙0.715mg、氯化胆碱0.698mg、叶酸1.32mg、肌醇0.541mg、烟酰胺0.615mg、酸吡哆醇0.206mg、核黄素0.376mg、盐酸硫胺1mg、维生素B12 1.36mg、HBS 2.5g、IBMX 11.12mg、尼克酰胺1.22g、青霉素0.1g、链霉素0.1g，余量为水。
进一步地，所述胰岛细胞培养基的pH值为7.2-7.4。
进一步地，所述胰岛细胞培养基的渗透压为260-300mmol/L。
本发明还提供了一种制备前述的胰岛细胞培养基的方法，它包括如下步骤：
1)将各组分溶解于水中；
2)灭菌，即得。
进一步地，步骤2)中，所述灭菌为使用0.22μm过滤器过滤灭菌。
本发明还提供了前述的胰岛细胞培养基在培养胰岛细胞中的用途。
胰岛分离提取胰岛细胞时因分离不纯存在一些杂细胞，通过长期培养可以去除这些杂细胞，提高胰岛细胞的纯度。但是，胰岛细胞很难在体外长时间培养，利用现有培养基在体外培养胰岛细胞一般只能培养7天左右。因此寻找新的培养基，延长胰岛细胞在体外培养的时间十分必要。
本发明胰岛细胞培养基可将胰岛细胞体外培养时间延长至30天以上，且仍然能够保持胰岛细胞的活性，对胰岛细胞培养具有重要意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明胰岛细胞培养基培养胰岛细胞1d、5d、10d、15d、20d、25d和30d的细胞形貌。
图2为对照组1培养基培养胰岛细胞0d、2d、3d、4d、6d、10d和15d的细胞形貌。
图3为对照组2培养基培养胰岛细胞0d、2d、3d、4d的细胞形貌。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明胰岛细胞培养基
本发明胰岛细胞培养基的配方如表1所示。
表1.本发明猪胰岛细胞培养基的配方
Figure BDA0003677662570000031
Figure BDA0003677662570000041
Figure BDA0003677662570000051
双抗(Ps)为青霉素和链霉素的混合水溶液；其中，每100mL双抗中含青霉素和链霉素各1g。
测定本发明胰岛细胞培养基的pH值和渗透压，如果pH值不在7.2-7.4范围，可用1NNaOH或1N HCl调节胰岛细胞培养基的pH值至7.2-7.4，如果渗透压不在260-300mmol/L范围，需重新配置胰岛细胞培养液。使用0.22μm过滤器过滤灭菌上述胰岛细胞培养基。
如果组分的分子量与表1中不一致，可根据最终的原料浓度重新计算所需要的剂量。经过计算，每1L本发明胰岛细胞培养基中各原料组分的用量如下：氯化钙33.29mg、硫酸铜0.0016mg、磷酸二氢钾83mg、磷酸氢二钠153.7mg、硫酸亚铁0.45mg、氯化钾285mg、硫酸镁74.62mg、氯化钠7.4g、硫酸锌0.016mg、L-精氨酸盐酸盐211mg、L-谷氨酰胺146mg、甘氨酸7.41mg、L-组氨酸盐酸盐23mg、L-异亮氨酸2.6mg、L-亮氨酸13mg、L-赖氨酸盐酸盐29mg、L-蛋氨酸4.48mg、L-苯丙氨酸5mg、L-丝氨酸10.5mg、L-苏氨酸3.57mg、L-丙氨酸9mg、L-天门冬酰胺15.01mg、L-天门冬氨酸13mg、L-半胱氨酸盐酸盐36.24mg、L-脯氨酸11.5mg、L-色氨酸0.6mg、L-酪氨酸1.8mg、L-缬氨酸3.5mg、D-葡萄糖1.1g、次黄嘌呤4mg、硫辛酸0.2mg、酚红1.2mg、胸苷0.7mg、丙酮酸钠110mg、维生素H 0.024mg、D-泛酸钙0.715mg、氯化胆碱0.698mg、叶酸1.32mg、肌醇0.541mg、烟酰胺0.615mg、酸吡哆醇0.206mg、核黄素0.376mg、盐酸硫胺1mg、维生素B12 1.36mg、HBS 2.5g、IBMX 11.12mg、尼克酰胺1.22g、青霉素100mg、链霉素100mg，余量为水。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明胰岛细胞培养基对胰岛细胞的培养
1、实验方法
实施例1制备的胰岛细胞培养基为实验组，并设置对照组1和对照组2。
对照组1：采用实施例1表1中的组分配方制备培养基，只是将IBMX的用量由11.12mg改为5.56mg。培养基的pH值为7.2-7.4，渗透压为260-300mmol/L。
对照组2：采用市售的CMRL 1066培养基，CMRL 1066培养基为目前培养胰岛细胞常用的培养基。
分别采用上述三种培养基培养胰岛细胞，具体方法如下：
按照本领域常规手段分离一头成年猪的胰岛细胞，猪的编号为210，分离后将此批次细胞分为3份，分别使用实验组、对照组1和对照组2培养基培养细胞至T175细胞培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱，37.5摄氏度，5％二氧化碳进行胰岛细胞培养。培养不同时间后，观察胰岛细胞状态：经培养后胰岛细胞聚团生长，说明胰岛细胞状态好；经培养后胰岛细胞不聚团生长，且分散凋零，说明胰岛细胞状态不好。同时在培养的最后一天对各组胰岛细胞进行活死细胞染色，绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞。
2、实验结果
使用实验组培养基培养胰岛细胞1d、5d、10d、15d、20d、25d和30d的细胞形貌如图1所示。由图1可知使用本发明培养基培养胰岛细胞，培养30天后胰岛细胞仍然能够聚团生长，保持良好的状态，通过活死细胞染色可知死细胞数量很少，细胞活性良好。证明使用本发明培养基，胰岛细胞体外培养时间可延长至30天以上。
使用对照组1培养基培养胰岛细胞0d、2d、3d、4d、6d、10d和15d的细胞形貌如图2所示。由图2可知使用对照组1培养基培养胰岛细胞，在体外培养15d后胰岛细胞分散凋零，状态不好，通过活死细胞染色可知细胞大量凋亡，活性变差。说明使用对照组1培养基培养胰岛细胞，培养时间不超过15天。
使用对照组2培养基培养胰岛细胞0d、2d、3d、4d的细胞形貌如图3所示。由图3可知使用对照组2培养基培养胰岛细胞后，胰岛细胞在体外培养4d时已基本凋亡，没有活细胞存在。
由上述结果可知：与其他胰岛细胞培养基相比，本发明制备的胰岛细胞培养液可以有效延长胰岛细胞在体外的培养时间，保持细胞活性。
综上，本发明胰岛细胞培养基可将胰岛细胞体外培养时间延长至30天以上，且仍然能够保持胰岛细胞的活性，对胰岛细胞培养具有重要意义。

Claims (8)

1.一种胰岛细胞培养基，其特征在于：每1L胰岛细胞培养基由如下组分组成：氯化钙30～35mg、硫酸铜0.001～0.1mg、磷酸二氢钾80～90mg、磷酸氢二钠150～160mg、硫酸亚铁0.1～1mg、氯化钾280～290mg、硫酸镁70～80mg、氯化钠7～9g、硫酸锌0.01～0.1mg、L-精氨酸盐酸盐210～220mg、L-谷氨酰胺140～150mg、甘氨酸1～10mg、L-组氨酸盐酸盐20～30mg、L-异亮氨酸1～10mg、L-亮氨酸10～20mg、L-赖氨酸盐酸盐20～30mg、L-蛋氨酸1～10mg、L-苯丙氨酸1～10mg、L-丝氨酸10～20mg、L-苏氨酸1～10mg、L-丙氨酸1～10mg、L-天门冬酰胺10～20mg、L-天门冬氨酸10～20mg、L-半胱氨酸盐酸盐30～40mg、L-脯氨酸10～20mg、L-色氨酸0.1～1mg、L-酪氨酸1～10mg、L-缬氨酸1～10mg、D-葡萄糖1～2g、次黄嘌呤1～10mg、硫辛酸0.1～1mg、酚红1～10mg、胸苷0.1～1mg、丙酮酸钠100～110mg、维生素H 0.01～0.1mg、D-泛酸钙0.1～1mg、氯化胆碱0.1～1mg、叶酸1～10mg、肌醇0.1～1mg、烟酰胺0.1～1mg、酸吡哆醇0.1～1mg、核黄素0.1～1mg、盐酸硫胺1～10mg、维生素B12 1～10mg、HBS 2～3g、IBMX10～20mg、尼克酰胺1～2g、青霉素0.1～1g、链霉素0.1～1g，余量为水。
2.根据权利要求1所述的胰岛细胞培养基，其特征在于：每1L胰岛细胞培养基由如下组分组成：氯化钙33～34mg、硫酸铜0.001～0.002mg、磷酸二氢钾82～83mg、磷酸氢二钠153～154mg、硫酸亚铁0.4～0.5mg、氯化钾285～286mg、硫酸镁74～75mg、氯化钠7.4～7.5g、硫酸锌0.01～0.02mg、L-精氨酸盐酸盐210～211mg、L-谷氨酰胺145～146mg、甘氨酸7～8mg、L-组氨酸盐酸盐22～23mg、L-异亮氨酸2～3mg、L-亮氨酸12～13mg、L-赖氨酸盐酸盐29～30mg、L-蛋氨酸4～5mg、L-苯丙氨酸5～6mg、L-丝氨酸10～11mg、L-苏氨酸3～4mg、L-丙氨酸9～10mg、L-天门冬酰胺15～16mg、L-天门冬氨酸12～13mg、L-半胱氨酸盐酸盐36～37mg、L-脯氨酸11～12mg、L-色氨酸0.5～0.6mg、L-酪氨酸1～2mg、L-缬氨酸3～4mg、D-葡萄糖1.1～1.2g、次黄嘌呤4～5mg、硫辛酸0.1～0.2mg、酚红1～2mg、胸苷0.6～0.7mg、丙酮酸钠109～110mg、维生素H 0.02～0.03mg、D-泛酸钙0.7～0.8mg、氯化胆碱0.6～0.7mg、叶酸1～2mg、肌醇0.5～0.6mg、烟酰胺0.6～0.7mg、酸吡哆醇0.2～0.3mg、核黄素0.3～0.4mg、盐酸硫胺1～2mg、维生素B12 1～2mg、HBS 2.4～2.5g、IBMX 11～12mg、尼克酰胺1.2～1.3g、青霉素0.1～0.2g、链霉素0.1～0.2g，余量为水。
3.根据权利要求2所述的胰岛细胞培养基，其特征在于：每1L胰岛细胞培养基由如下组分组成：氯化钙33.29mg、硫酸铜0.0016mg、磷酸二氢钾83mg、磷酸氢二钠153.7mg、硫酸亚铁0.45mg、氯化钾285mg、硫酸镁74.62mg、氯化钠7.4g、硫酸锌0.016mg、L-精氨酸盐酸盐211mg、L-谷氨酰胺146mg、甘氨酸7.41mg、L-组氨酸盐酸盐23mg、L-异亮氨酸2.6mg、L-亮氨酸13mg、L-赖氨酸盐酸盐29mg、L-蛋氨酸4.48mg、L-苯丙氨酸5mg、L-丝氨酸10.5mg、L-苏氨酸3.57mg、L-丙氨酸9mg、L-天门冬酰胺15.01mg、L-天门冬氨酸13mg、L-半胱氨酸盐酸盐36.24mg、L-脯氨酸11.5mg、L-色氨酸0.6mg、L-酪氨酸1.8mg、L-缬氨酸3.5mg、D-葡萄糖1.1g、次黄嘌呤4mg、硫辛酸0.2mg、酚红1.2mg、胸苷0.7mg、丙酮酸钠110mg、维生素H0.024mg、D-泛酸钙0.715mg、氯化胆碱0.698mg、叶酸1.32mg、肌醇0.541mg、烟酰胺0.615mg、酸吡哆醇0.206mg、核黄素0.376mg、盐酸硫胺1mg、维生素B12 1.36mg、HBS 2.5g、IBMX11.12mg、尼克酰胺1.22g、青霉素0.1g、链霉素0.1g，余量为水。
4.根据权利要求1～3任一项所述的胰岛细胞培养基，其特征在于：所述胰岛细胞培养基的pH值为7.2-7.4。
5.根据权利要求1～3任一项所述的胰岛细胞培养基，其特征在于：所述胰岛细胞培养基的渗透压为260-300mmol/L。
6.一种制备权利要求1～5任一项所述的胰岛细胞培养基的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)将各组分溶解于水中；
2)灭菌，即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述灭菌为使用0.22μm过滤器过滤灭菌。
8.权利要求1～5任一项所述的胰岛细胞培养基在培养胰岛细胞中的用途。
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