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CN115216443A - 体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的nk细胞的方法及应用 - Google Patents

体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的nk细胞的方法及应用 Download PDF

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CN115216443A CN202210865697.3A CN202210865697A CN115216443A CN 115216443 A CN115216443 A CN 115216443A CN 202210865697 A CN202210865697 A CN 202210865697A CN 115216443 A CN115216443 A CN 115216443A
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Abstract

本发明涉及一种体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的自然杀伤细胞(NK细胞)的培养基及其用途和制备NK细胞的方法。培养基包括：基础培养基、维生素C、IGF‑1、血清、谷氨酰胺、双抗、IL2、IL7、IL15、SCF和Flt3‑L；该培养基在促进人多能干细胞来源的造血干/祖细胞分化为NK细胞中使用；制备NK细胞的方法包括：利用上述培养基培养人多能干细胞来源造血干/祖细胞，以便获得所述NK细胞。该培养基可有效促进造血干/祖细胞分化成NK细胞，具有培养周期短和得到的NK细胞纯度高等优点。

Description

体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的NK细胞的方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及一种体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的NK细胞的方法及应用，更具体地，本发明涉及一种培养基及其用途和制备NK细胞的方法。
背景技术
免疫细胞疗法在肿瘤治疗中具有重要意义。自然杀伤细胞(Nature killercells，NK)作为健康人体内清除癌变细胞的主要细胞，具有显著的抗癌效果，对急性淋系白血病等血液瘤和肝癌等实体瘤具有重要意义。
目前较为成熟的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治疗具有严重的副反应，例如神经毒性和“细胞因子风暴”(cytokine releasesyndrome，CRS)，患者病情凶险，预后差。与T细胞相比，NK细胞具有更高的安全性，目前临床试验尚未报道过继NK细胞治疗产生如移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease，GvHD)和CRS 等严重副作用。同时，NK细胞发挥功能无MHC限制性决定了未来NK的应用范围比T细胞的应用范围更为广泛。目前临床试验采用从健康人外周血单个核细胞分离并扩增的NK 细胞，存在供体来源不足、一个捐献者提供的NK细胞只能治疗一位病人等问题，且存在个体间差异，难以做到规模化和标准化，对于评估患者预后存在较大困难。以上问题对提供剂量足够且有抗肿瘤活性的NK细胞提出新的要求。
目前，通过诱导人诱导性多能干细胞(hiPSC)向造血干/祖细胞(HSPCs)分化，得到大量CD34+CD43+HSPCs，HSPCs具有淋系和髓系分化潜能；随后诱导HSPCs向NK细胞分化，得到功能成熟的NK细胞(iPS-NK)；再扩增NK细胞到临床应用规模。
因此，亟需开发一种新的获得NK细胞的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种培养基及其用途和制备NK细胞的方法，本发明的培养能够使造血干/祖细胞分化产生NK细胞，且该培养基可有效促进造血干/祖细胞分化成NK细胞，具有培养周期短和得到的NK细胞纯度高等优点。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前，使造血干/祖细胞分化产生NK细胞的培养方法中，可能需要根据造血干/祖细胞的分化状态更换培养基，操作繁琐；并且，传统的培养方法中，将造血干/祖细胞体外分化形成NK细胞的时间一般为14～30天，培养周期长。
为了解决上述问题，发明人经过大量实验对培养基的组分和添加量进行调整，最终发现，在培养基中同时加入维生素C和IGF-1，可有效促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，该培养过程仅需8～10天，且得到的NK细胞纯度为90％以上，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：基础培养基、维生素C、IGF-1、血清、谷氨酰胺、双抗、IL2、IL7、IL15、 SCF和Flt3-L。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述培养基在促进造血干/祖细胞分化为NK 细胞中的用途。发明人经过实验发现，采用前述培养基，可促进造血干/祖细胞分化为NK 细胞，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备NK细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前述的培养基培养造血干/祖细胞，以便获得所述NK细胞。根据本发明实施例的制备NK细胞的方法可促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、Activin A、bFGF和GSK3抑制剂。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、TGF-β通路抑制剂和WNT通路抑制剂。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞(lateral mesoderm，简称LM)。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：HDM培养基、VEGF、bFGF、TGF-β受体阻断剂、促血小板生成素、IL-6、SCF和IL-3。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例中从造血干细胞到NK细胞培养过程的示意图；
图2是根据本发明实施例1中培养过程的第2、4、6、8天的细胞形态图；
图3是根据本发明实施例1中的早期中胚层细胞、侧板中胚层细胞及生血内皮细胞的分化效率检测结果；
图4是根据本发明实施例1中分化第8天生成NK细胞的检测结果；
图5是根据本发明实施例2中获得的NK细胞生成CD45和CD56的情况以及其与外周血中的NK形态对比；
图6是根据本发明实施例2中获得的NK细胞CD45、CD56、CD16、CD94、NKG2D 和NKP46的表达；
图7是根据本发明实施例3中检测K562刺激或PMA刺激后的NK细胞分泌INF-γ的情况；
图8是根据本发明实施例4中检测NK细胞杀伤肿瘤细胞的情况；
图9是根据本发明实施例4中检测NK细胞在不同效靶比情况下对不同肿瘤细胞的杀伤能力；
图10是根据本发明实施例5中不同组中分化第10天生成NK细胞的检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“多能干细胞”或“PSC”是指在合适条件下能够分化为广泛多样的特化细胞类型，而在其他合适的条件下能够自我更新并保持在基本上未分化的多能状态的细胞。多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
在本文中，术语“人诱导性多能干细胞”或“hiPSC”是指干细胞由已诱导或改变的分化的成年\新生儿或胎儿细胞产生，即为，能够分化成所有三种胚层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所生产的hiPSC不是指在自然界中发现的细胞。
在本文中，术语“早期中胚层”是指在早期胚胎发生期间出现的三个胚层中的一个，其产生各种特殊的细胞类型，包括循环系统的血细胞，肌肉、心脏、真皮、骨骼和其他支持性和结缔组织。术语“早期中胚层细胞”是指能够产生中胚层的早期阶段的细胞。
在本文中，术语“侧板中胚层”是指中胚层中位于距离脊索最远的区域，其可形成心脏、血管、循环系统的血细胞、体腔内壁、肢体中除了肌肉以外的其他中胚层成分，还可以帮助形成一系列胚外膜，使得营养能从母体传送给胎儿。术语“侧板中胚层细胞”是指能够产生侧板中胚层的细胞。需要说明的是，血液谱系发育顺序是：多能干细胞-早期中胚层细胞 -侧板中胚层细胞-生血内皮细胞-造血干祖细胞。具体可以参考文献Mapping thePairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone,Heart,and OtherMesoderm Cell Types. Cell,2016,166,451-467。
在本文中，术语“生血内皮细胞”或“HEC”是指内皮细胞-造血转变的过程中具有产生造血干/祖细胞的内皮细胞亚群。
在本文中，术语“造血干/祖细胞”或“HPSC”是指具有血液谱系分化潜能的多能细胞，可产生所有血细胞类型，包括骨髓样(如单核细胞和巨噬细胞、粒细胞(如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(例如T细胞、B细胞和NK细胞)(参见例如，Doulatov等人，2012；Notta等人，2015)。
在本文中，术语“分化”是指非特异性(“自由的”)或较少特异性细胞获得特定细胞(例如血细胞或肌细胞)的特征的过程。
本发明提出了一种培养基及其用途和制备NK细胞的方法，下面将分别对其进行详细描述。
培养基
在本发明的第一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：基础培养基、维生素C、IGF-1、血清、谷氨酰胺、双抗、IL2、IL7、IL15、SCF和Flt3-L。
发明人经过大量实验对培养基的组分和添加量进行调整，最终发现，在培养基中同时加入维生素C和IGF-1，维生素C和IGF-1具有协同增效的作用，可有效促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，得到的NK细胞纯度为90％以上；该培养过程仅需8-10天，培养周期短。此外，发明人经过实验发现，当培养基中不添加维生素C和/或IGF-1时，会增加培养周期、且降低NK细胞纯度。
在一些优选方案中，所述基础培养基选自α-MEM培养基。
在一些优选方案中，所述双抗为青霉素和链霉素。
在一些优选方案中，所述维生素C在所述培养基中的终浓度为0.1-100mg/ml，优选为 40-60mg/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述IL2在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述IL7在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述IL15在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述SCF在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述Flt3-L在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为 40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述血清在所述培养基中的终浓度为5-25％，优选为15-25％。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述谷氨酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5-1.5％。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为 NK细胞的效率。
在一些优选方案中，所述双抗是以溶液的形式提供的。示例性地，双抗选自厂家为Hyclone、货号为SV30010的双抗溶液。
在一些优选方案中，所述双抗在所述培养基的终浓度为0.5-1.5％。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高造血干/祖细胞分化为NK细胞的效率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、Activin A、bFGF和GSK3抑制剂。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞，且最终得到的早期中胚层细胞纯度可高达100％。更重要的是，本发明中通过bFGF和GSK3抑制剂的加入，可进一步促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞。
在一些优选方案中，所述BMP信号通路激活剂在所述第一分化培养基中的终浓度为 0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高多能干细胞分化为早期中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述Activin A在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高多能干细胞分化为早期中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述bFGF在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高多能干细胞分化为早期中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述GSK3抑制剂在所述第一分化培养基中的终浓度为 0.1-100μM，优选为40-60μM。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高多能干细胞分化为早期中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4。
在一些优选方案中，所述GSK3抑制剂选自CHIR99021。
在一些优选方案中，所述HDM培养基包括：DMEM/F12、ITS和维生素C。
在一些优选方案中，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、TGF-β通路抑制剂和WNT通路抑制剂。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进早期中胚层细胞向侧板中胚层细胞分化，且最终得到的侧板中胚层细胞纯度可高达100％。
在一些优选方案中，所述BMP信号通路激活剂在所述第二分化培养基中的终浓度为 0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述TGF-β通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-10μM，优选为4-6μM。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述WNT通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-10μM，优选为4-6μM。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞的效率。
在一些优选方案中，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4。
在一些优选方案中，所述TGF-β通路抑制剂选自A-83-01。
在一些优选方案中，所述WNT通路抑制剂选自IWR-1-endo。
在一些优选方案中，所述HDM培养基包括：DMEM/F12、ITS和维生素C。
在一些优选方案中，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：HDM培养基、VEGF、bFGF、TGF-β受体阻断剂、促血小板生成素(Thrombopoietin， TPO)、IL-6、SCF和IL-3。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞，缩短造血干/祖细胞的获得时间(48小时)、提高造血干 /祖细胞的获得效率(90％以上)。
在一些优选方案中，所述VEGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述bFGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述TGF-β受体阻断剂在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100μM，优选为4-6μM。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述促血小板生成素在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述IL-6在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述IL-3在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述SCF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞的效率。
在一些优选方案中，所述TGF-β受体阻断剂选自SB43154。
在一些优选方案中，所述HDM培养基包括：DMEM/F12、ITS和维生素C。
在一些优选方案中，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
用途
在本发明的第五方面，本发明提出了一种第一方面所述的培养基在促进造血干/祖细胞分化为NK细胞中的用途。发明人经过实验发现，采用第一方面所述的培养基可促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，得到的NK细胞纯度高，且分化周期短。
本领域技术人员能够理解的是，第一方面所述的培养基所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种第二方面所述的培养基在促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞中的用途。发明人经过实验发现，采用第二方面所述的培养基可促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞，且得到的早期中胚层细胞纯度高。
本领域技术人员能够理解的是，第二方面所述的培养基所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种第三方面所述的培养基在促进早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞中的用途。发明人经过实验发现，采用第二方面所述的培养基可促进早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞，且得到的侧板中胚层细胞纯度高。
本领域技术人员能够理解的是，第三方面所述的培养基所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种第四方面所述的培养基在促进生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞中的用途。发明人经过实验发现，采用第二方面所述的培养基可促进生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞，且得到的造血干/祖细胞纯度高。
本领域技术人员能够理解的是，第四方面所述的培养基所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
方法
目前，国内外实验室建立的hiPSC向NK细胞分化的诱导方案为胚体(EB)分化法。其中，EB向NK细胞分化较好模拟了体内NK分化所需要的细胞和理化微环境，体外试验EB 诱导的NK细胞对多种肿瘤细胞有良好的细胞毒性；但EB分化过程中产生种类复杂的细胞，不利于NK细胞的大量获得和后续临床应用。此外，EB向NK细胞分化周期长，一般hiPSCs 需要1周诱导出EB，再经历4-5周分化得到NK细胞，且技术难度大，成本高。
为了解决上述问题，发明人先诱导hiPSCs分化为CD34+CD43+HSPCs，再取悬浮的HSPCs与小鼠骨髓基质细胞共培养得到有功能的NK细胞，与EB分化方法相比，本发明的方法分化培养周期明显缩短，且得到的NK细胞纯度较高。
基于此，在本发明的第九方面，本发明提出了一种制备造血干/祖细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将多能干细胞在多能干细胞分化培养基中进行分化培养处理，以便获得所述造血干/祖细胞；所述多能干细胞分化培养基包括第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基和第四分化培养基。发明人经过大量实验得到了上述四种培养基，在分化培养多能干细胞时，可根据多能干细胞分化的情况，选择不同的培养基，以便更好的模拟多能干细胞在体内的发育环境。因此，该方法可促进多能干细胞(尤其是人多能干细胞)分化为造血干/祖细胞，且具有稳定高效、周期短、获得的造血干/祖细胞纯度高等优点。
在一些优选方案中，所述分化培养处理包括：将所述多能干细胞在所述第一分化培养基中进行第一培养处理；将所述第一培养处理的产物在所述第二分化培养基中进行第二培养处理；将所述第二培养处理的产物在所述第三分化培养基中进行第三培养处理；将所述第四培养处理的产物在所述第四分化培养基中进行第四培养处理，以便获得所述造血干/祖细胞。发明人经过实验发现，第一分化培养基可促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞，第二分化培养基可促进早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞，第三分化培养基可促进侧板中胚层细胞分化为生血内皮细胞，第四分化培养基可促进生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞。
需要说明的是，第一分化培养基具体参见第二方面所述的培养基，第二分化培养基具体参见第三方面所述的培养基，第四分化培养基具体参见第四方面所述的培养基。
在一些优选方案中，所述第三分化培养基包括：HDM培养基、VEGF和bFGF。
在一些优选方案中，所述VEGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高侧板中胚层细胞分化为生血内皮细胞的效率。
在一些优选方案中，所述bFGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml，优选为40-60ng/ml。发明人经过大量实验得到上述较优用量，在上述用量下，培养基可进一步提高侧板中胚层细胞分化为生血内皮细胞的效率。
在一些优选方案中，所述第一培养处理的时间为22-24h。发明人经过实验发现，上述培养时间分化得到的早期中胚层细胞的纯度可高达100％。
在一些优选方案中，所述第二培养处理的时间为22-24h。发明人经过实验发现，上述培养时间分化得到的侧板中胚层细胞的纯度可高达100％。
在一些优选方案中，所述第三培养处理的时间为45-48h。发明人经过实验发现，上述培养时间分化得到的生血内皮细胞的纯度可达70％以上。
在一些优选方案中，所述第四培养处理的时间为4-5天。发明人经过实验发现，上述培养时间分化得到的造血干/祖细胞的纯度可达90％以上。
本领域技术人员能够理解的是，第二方面、第三方面和第四方面所述的培养基所描述的特征和优点，同样适用于该制备造血干/祖细胞的方法，在此不再赘述。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种制备NK细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第一方面所述的培养基培养造血干/祖细胞，以便获得所述NK细胞。根据本发明实施例的制备NK细胞的方法可促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，得到的NK 细胞纯度为90％以上，且该培养过程仅需8-10天，培养周期短。该方法具有稳定高效、周期短、获得的NK细胞功能完善且纯度高等优点。
在一些优选方案中，如图1所示，所述方法进一步包括：在培养所述造血干/祖细胞之前，预先于所述培养基中加入小鼠骨髓基质细胞。发明人发现，小鼠骨髓基质细胞与造血干/祖细胞共培养，小鼠骨髓基质细胞可作为造血干/祖细胞的营养细胞，可快速诱导造血干 /祖细胞分化为NK，提高造血干/祖细胞分化效率。
在一些优选方案中，所述培养的时间为8～10天。由此，该方法具有培养周期短的优点。
在一些优选方案中，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞进行分化培养获得的。
在一些优选方案中，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞在多能干细胞分化培养基中分化获得的。
需要说明的是，多能干细胞分化培养基和多能干细胞在多能干细胞分化培养基中分化的方法具体参见第九方面所述的制备造血干/祖细胞的方法。
本领域技术人员能够理解的是，第一方面所述的培养基和第九方面所述的制备造血干 /祖细胞的方法所描述的特征和优点，同样适用于该制备NK细胞的方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的实施例中，双抗选自厂家为Hyclone、货号为SV30010的双抗溶液。
实施例1：单层造血分化
首先，利用构建的单层造血分化体系将hiPSCs分化为HSPCs。具体为：第0天，将hiPSCs于第一分化培养基(HDM培养基+50ng/ml BMP4+50ng/ml Activin A+50ng/ml bFGF+50μM CHIR99021)中进行培养，将hiPSCs诱导分化为早期中胚层细胞。第1天，将第一分化培养基更换为第二分化培养基(HDM培养基+50ng/ml BMP4+5μM A-83-01+5 μM IWR-1-endo)，将早期中胚层细胞诱导为侧板中胚层(lateral mesoderm，LM)细胞。第2天，将第二分化培养基更换为第三分化培养基(HDM培养基+50ng/ml VEGF+50ng/ml bFGF)，诱导侧板中胚层细胞向生血内皮细胞分化。第4天之后，将第三分化培养基更换为第四分化培养基(HDM培养基+50ng/ml VEGF+50ng/ml bFGF+50μM SB43154+50ng/ml 促血小板生成素(简称TPO)+50ng/ml IL6+50ng/ml SCF+50ng/ml IL3)，诱导生血内皮细胞向HSPC转变。并且，采用显微镜拍照并观察hiPSCs分化为HSPCs过程中第2、4、6、 8天的细胞形态图，具体参见图2；采用流式细胞仪分别检测早期中胚层细胞、侧板中胚层细胞及生血内皮细胞的分化效率，具体参见图3；采用流式细胞仪检测第8天的悬浮细胞，具体参见图4。如图2所示，在第6天开始产生HSPCs，第8天可收集大量悬浮的HSPCs。如图3所示，T+早期中胚层细胞分化效率接近100％，HAND1+侧板中胚层细胞分化效率也接近100％，CD34+生血内皮细胞分化效率达到80％以上。如图4所示，第8天的细胞绝大部分是CD34+CD43+CD44+的造血干/祖细胞。
本申请的HDM培养基包括DMEM/F12(Hyclone)、ITS(insulin transferrin-selenium， GIBCO)和维生素C(Vc，GIBCO)，其中，基于100mL的所述DMEM/F12，ITS的用量为1mL，维生素C的用量为7mg。
实施例2：制备NK细胞
将实施例1中得到的HSPCs进行NK细胞分化。具体为：提前一天于培养基(α-MEM 培养基+20％FBS+1％GlutaMAXTM-1+1％P/S+50mg/ml ascorbic acid+50ng/ml IL-2+50ng/ml IL-7+50ng/ml IL-15+50ng/ml SCF+50ng/ml Flt-3L+50ng/ml IGF-1)中铺好小鼠骨髓基质细胞 (OP9-DLL1)，次日收集实施例1中得到的HSPCs，并将HSPCs与铺好小鼠骨髓基质细胞的培养基中共培养，培养10天收集悬浮的细胞，然后进行细胞形态观察、流式细胞仪检测、免疫荧光技术检测，具体参见图5-6。
如图5所示，培养第10天的iPS-NK细胞功能成熟(即终止分化)，由人多能干细胞分化而来的iPS-NK细胞与外周血中的NK细胞(PB-NK细胞)形态相似，且高表达CD45 和CD56的NK标志基因，且得到的iPS-NK细胞的纯度在90％以上。
图6中分别为，通过免疫荧光技术检测分化的iPS-NK细胞中CD45和CD56的表达(图6的左边)，以及通过流式细胞仪检测分化的iPS-NK细胞中CD16/CD94/NKG2D/NKP46 等NK成熟相关基因的表达(图6的右边)。
实施例3：NK细胞的分泌功能检测
采用细胞流式仪检测实施例2获得的iPS-NK细胞的分泌功能。通过流式细胞仪检测 K562刺激或PMA刺激4小时后的iPS-NK细胞分泌INF-γ的情况，具体参见图7，结果表明，分化得到的iPS-NK细胞具有完善的干扰素分泌功能。
实施例4：NK细胞的肿瘤杀伤功能检测
将实施例2获得的iPS-NK细胞与白血病细胞(K562)按照1：1的比例共培养24小时，然后采用显微镜进行细胞形态观察和流式细胞仪检测其杀伤肿瘤细胞的能力，具体参见图8，结果表明，iPS-NK细胞能显著杀伤K562肿瘤细胞(AnnexinV为凋亡细胞)。
将实施例2获得的iPS-NK细胞与表达荧光素酶基因的不同肿瘤细胞按照不同效靶比进行共培养，在24小时加入荧光底物并采用酶标仪检测荧光强度并计算杀伤活性，具体参见图9，结果表明，iPS-NK细胞对不同肿瘤细胞均有强劲的杀伤作用。
实施例5：不同培养基制备NK细胞
本实施例通过对实验组、对照组、+Vc组和+IGF-1组进行比较，发现添加维生素C及IGF-1能显著提高NK的分化效率。具体为，实验组(即为“+Vc+IGF-1”)的培养基为α-MEM 培养基+20％FBS+1％GlutaMAXTM-1+1％P/S+50mg/ml ascorbic acid+50ng/ml IL-2+50ng/ml IL-7+50ng/ml IL-15+50ng/ml SCF+50ng/ml Flt-3L+50ng/ml IGF-1，该实验组中同时添加维生素C和IGF-1；对照组与实验组的区别仅在于培养基中不添加维生素C和IGF-1；+Vc组与实验组的区别仅在于培养基中不添加IGF-1；+IGF-1组与实验组的区别仅在于培养基中不添加维生素C。然后将实验组、对照组、+Vc组和+IGF-1组中的HSPCs进行NK细胞分化，具体分化培养条件参见实施例2，分化到第10天收集细胞，采用流式细胞仪检测 CD45+CD56+的NK细胞，具体参见图10。结果表明，同时添加维生素C及IGF-1能显著提高NK的分化效率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于，包括：
基础培养基、维生素C、IGF-1、血清、谷氨酰胺、双抗、IL2、IL7、IL15、SCF和Flt3-L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基选自α-MEM培养基；
任选地，所述双抗为青霉素和链霉素；
任选地，所述维生素C在所述培养基中的终浓度为0.1-100mg/ml；
任选地，所述IL2在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述IL7在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述IL15在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述SCF在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述Flt3-L在所述培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述血清在所述培养基中的终浓度为5-25％；
任选地，所述谷氨酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5-1.5％；
任选地，所述双抗是以溶液的形式提供的；
任选地，所述双抗在所述培养基的终浓度为0.5-1.5％。
3.权利要求1或2所述的培养基在促进造血干/祖细胞分化为NK细胞中的用途。
4.一种制备NK细胞的方法，其特征在于，包括：利用权利要求1或2所述的培养基培养造血干/祖细胞，以便获得所述NK细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括：
在培养所述造血干/祖细胞之前，预先于所述培养基中加入小鼠骨髓基质细胞；
任选地，所述培养的时间为8～10天；
任选地，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞进行分化培养获得的；
优选地，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞在多能干细胞分化培养基中进行分化培养处理获得的；
任选地，所述多能干细胞分化培养基包括第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基和第四分化培养基；
任选地，所述分化培养处理包括：
将所述多能干细胞在所述第一分化培养基中进行第一培养处理；
将所述第一培养处理的产物在所述第二分化培养基中进行第二培养处理；
将所述第二培养处理的产物在所述第三分化培养基中进行第三培养处理；
将所述第三培养处理的产物在所述第四分化培养基中进行第四培养处理，以便获得所述造血干/祖细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一分化培养基包括：
HDM培养基、BMP信号通路激活剂、Activin A、bFGF和GSK3抑制剂；
任选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100mg/ml；
任选地，所述Activin A在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述bFGF在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述GSK3抑制剂在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100μM；
任选地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4；
任选地，所述GSK3抑制剂选自CHIR99021；
任选地，所述第一培养处理的时间为22-24h；
任选地，所述第二分化培养基包括：
HDM培养基、BMP信号通路激活剂、TGF-β通路抑制剂和WNT通路抑制剂；
任选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述A8-301在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-10μM；
任选地，所述WNT通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-10μM；
任选地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4；
任选地，TGF-β通路抑制剂选自A-83-01；
任选地，所述WNT通路抑制剂选自IWR-1-endo；
任选地，所述第二培养处理的时间为22-24h；
任选地，所述第三分化培养基包括：
HDM培养基、VEGF和bFGF；
任选地，所述VEGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述bFGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述第三培养处理的时间为45-48h；
任选地，所述第四分化培养基包括：
HDM培养基、VEGF、bFGF、TGF-β受体阻断剂、促血小板生成素、IL-6、SCF和IL-3；
任选地，所述VEGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述bFGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述TGF-β受体阻断剂在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100μM；
任选地，所述促血小板生成素在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述IL-6在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述IL-3在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述SCF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述TGF-β受体阻断剂选自SB43154；
任选地，所述第四培养处理的时间为4-5天。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述HDM培养基包括：
DMEM/F12、ITS和维生素C；
任选地，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
8.一种培养基，其特征在于，包括：
HDM培养基、BMP信号通路激活剂、Activin A、bFGF和GSK3抑制剂；
任选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100mg/ml；
任选地，所述Activin A在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述bFGF在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述GSK3抑制剂在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100μM；
任选地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4；
任选地，所述GSK3抑制剂选自CHIR99021；
任选地，所述HDM培养基包括：
DMEM/F12、ITS和维生素C；
任选地，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
9.一种培养基，其特征在于，包括：
HDM培养基、BMP信号通路激活剂、TGF-β通路抑制剂和WNT通路抑制剂；
任选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述TGF-β通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-10μM；
任选地，所述WNT通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1-10μM；
任选地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4；
任选地，所述TGF-β通路抑制剂选自A-83-01；
任选地，所述WNT通路抑制剂选自IWR-1-endo；
任选地，所述HDM培养基包括：
DMEM/F12、ITS和维生素C；
任选地，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
10.一种培养基，其特征在于，包括：
HDM培养基、VEGF、bFGF、TGF-β受体阻断剂、促血小板生成素、IL-6、SCF和IL-3；
任选地，所述VEGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述bFGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述TGF-β受体阻断剂在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100μM；
任选地，所述促血小板生成素在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述IL-6在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述IL-3在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述SCF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/ml；
任选地，所述TGF-β受体阻断剂选自SB43154；
任选地，所述HDM培养基包括：
DMEM/F12、ITS和维生素C；
任选地，基于100mL的所述DMEM/F12，所述ITS的用量为1mL，所述维生素C的用量不低于1mg，优选为7mg。
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