CN115379845B

CN115379845B - 使用了基因组编辑多能干细胞的治疗药

Info

Publication number: CN115379845B
Application number: CN202180026619.8A
Authority: CN
Inventors: 户田正博; 冈野荣之; 田村亮太; 佐藤瑞仁; 杨正博
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2024-10-25
Anticipated expiration: 2041-03-31
Also published as: EP4129311A1; JPWO2021201100A1; JP7680047B2; US20240226175A1; WO2021201100A1; JP2025107250A; EP4129311A4; CN115379845A

Abstract

为了治疗脑功能障碍、脑疾病、或肿瘤，提供细胞制剂，其特征在于，包含由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。

Description

使用了基因组编辑多能干细胞的治疗药

技术领域

本发明涉及中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂和肿瘤治疗用细胞制剂。该细胞制剂在中枢神经系统疾病损伤，例如脑功能障碍、外伤性脑损伤、脊髓损伤、神经变性疾病、以及脑肿瘤和其他肿瘤的治疗中使用。在使用细胞制剂作为治疗用细胞制剂时，特别是在用于中枢神经系统疾病损伤的治疗的情况下，细胞的肿瘤化成为问题，因为本发明的细胞制剂能够通过自杀基因而使细胞灭亡，所以是安全性高的细胞制剂。

背景技术

作为外伤性脑损伤的脑挫裂伤主要通过跌倒/交通外伤产生，依然在从年轻人到老年人中大范围、高频率地发病。物理损伤使神经细胞、各种胶质细胞等脑实质的细胞坏死，破坏/损伤神经回路网，带来严重的神经症状，最坏的情况会导致不幸的结局。对脑挫裂伤的治疗针对从受伤开始48小时、特别是最初24小时发生的挫伤性水肿(early massiveedema)进行，但是对高渗透压利尿剂等保守性治疗为抵抗性。在通过保守性治疗也意识损伤进展的情况下，通过开颅术摘除挫伤坏死组织，虽然进行手术也能够期待生命预后的改善，但功能预后依然不良(Vella MA.Surg Clin North Am.2017)。

脑血管意外(脑梗死、脑出血、蛛网膜下出血)是应该称为日本的国民病的疾病，曾经是日本本土死亡原因的第1位。脑梗死通过血流损伤而使神经细胞、各种胶质细胞等脑实质的细胞坏死。破坏/损伤神经回路网，带来严重的神经症状，最坏的情况会导致不幸的结局(Lindvall O.Stroke.2011)。通过对脑梗死超急性期的组织型纤溶酶原激活物(tPA)施与等新的治疗/危险因子的管理等预防医学的进步/公共卫生的改善，脑血管意外的死亡人数现在减少到第3位，但依然是死亡率高的疾病。

另一方面，神经变性疾病是神经细胞由于各种原因而变性、脱落从而产生的高级脑功能障碍疾病，对于预防、治疗方法进行了大量的研究，但没有使变性、脱落的脑神经系统恢复的治疗药。

无论如何，现在针对神经功能损伤的治疗法是预防和防止恶化，虽然在与功能损伤对应的康复等中多少能得到一些功能恢复，但在现有的治疗法中，修复作为中枢神经的特征的神经回路网的损伤、获得完全的功能恢复是困难的。由此，以功能恢复、特别是高级脑功能的恢复为目标要求能够实现完全的神经回路网修复的治疗方法。作为再构建损伤了的神经回路网的承担者，考虑干细胞非常有用。作为其方法，有(1)存在于侧脑室下区、海马颗粒下层的内源性神经干细胞的激活和(2)干细胞移植。但是，(1)的新生神经的生存率极低，仅依靠此手段，神经回路网再构建是不可能的。因此，(2)作为损伤神经回路网的再构建的手段是必须的。

在干细胞移植中，使用怎样的移植供体细胞是重要的。作为移植供体细胞的候选到目前为止提出了各种细胞。到目前为止报告了使用ES细胞来源的神经干细胞(NSC)、间充质干细胞(MSC)的脑挫裂伤动物模型中的功能改善效果(非专利文献1～6)，2014年对慢性期脑挫裂伤患者移植了骨髓来源的MSC(SB623)(非专利文献7)。现在包括正在进行的临床研究在内，使用MSC的是大多数(NCT02210624)。但是，由MSC带来的作用严格意义上不是以回路网再构建为目标，而是基于移植细胞分泌具有神经营养/保护作用、血管新生促进作用的体液因子，间接地促进再生这样的理论的。

另一方面，承认了从神经分化能力的高度角度，神经上皮型干细胞作为移植供体细胞优异的报告(非专利文献8)。在以神经干细胞作为供体细胞方面，存在伦理方面/实用方面的问题，但人iPS细胞来源的神经干细胞是能解决这些问题的理想的供体细胞。iPS细胞中也与其他移植细胞疗法同样地存在对致肿瘤性的问题的担心，也研究了不使用作为致肿瘤性的原因之一的c-Myc等的制作法，但不能完全否定，相反还报告了过于要避免肿瘤化，造成干细胞自身的增殖能力降低、多分化能力丧失(Nakagawa M.Nat Biotechnol2008；Stadtfeld M.Science.2008)。

作为肿瘤的治疗药，开发了针对靶标分子的利用各种机制的化学化合物，但由于是化学物质而通常存在副作用的问题，安全的肿瘤治疗剂依然是紧迫的课题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Riess P.J Neurotrauma.2007

非专利文献2:Tajiri N.Front Syst.Neurosci.2014

非专利文献3:Tian C.Exp Clin Transplant.2013

非专利文献4:Qi L.J Craniofac Surg.2018

非专利文献5:Zanier ER.Crit Care Med.2011

非专利文献6:Turtzo LC.PLoS One.2015

非专利文献7:Steinberg GK.Stroke.2016

非专利文献8:Uchida K.Neurosci Res.2005

发明内容

发明要解决的课题

在考虑临床应用的情况下，能够解决伦理/实用上的问题的人iPS细胞来源的神经干细胞作为供体细胞是理想的。但是，如上所述，iPS细胞也与其他移植细胞疗法同样地有致肿瘤性的问题。本发明的第一目的是提供解决了这样的致肿瘤性的问题的人iPS细胞来源的神经干细胞。

另外，本发明者通过将自杀基因(编码能将前药转换成具有细胞毒性的物质的酶的基因)导入人iPS细胞中，然后，诱导成神经干细胞，从而成功地制作了脑肿瘤治疗用细胞制剂(WO2018/207808和WO2019/098361)。本发明的第二目的是提供恒常地稳定表达被导入这样的人iPS细胞的自杀基因的手段。

进而，如果能够事先预测上述的细胞制剂的治疗效果，则能够防止无用的治疗，进行有效的治疗。本发明的第三目的是提供预测上述的细胞制剂的治疗效果的手段。

进而，神经干细胞对肿瘤显示迁移性和指向性，其通过怎样的分子产生尚不明。如果能够将其搞清楚，则能够制作强化了对肿瘤的迁移性和指向性的神经干细胞、有效地挑选迁移性和指向性高的神经干细胞。本发明的第四目的是鉴定出带给神经干细胞这样的迁移性、指向性的分子，提供强化了迁移性和指向性的神经干细胞的制作手段、和迁移性和指向性高的神经干细胞的有效挑选手段。

进而，在细胞制剂中使用的神经干细胞必须安全性高。但是，在导入自杀基因时使用的CRISPR/Cas9等的基因组编辑技术有在不希望的部位导入突变的脱靶效应的问题。另外，在制作具有自杀基因的神经干细胞时，为了细胞的选择而与自杀基因一起插入耐药性基因等选择标志物基因，但从安全性的观点考虑，期望除去这样的外来基因。本发明的第五目的是提供安全性高的神经干细胞的制作手段。

用于解决课题的手段

本发明者为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果获得了以下知识。

1)发现了在作为移植供体细胞使用iPS细胞来源的神经干细胞时，通过预先在iPS细胞中导入自杀基因，能够在移植细胞肿瘤化了的情况下，通过施与前药使移植细胞灭亡，能够解决前述的致肿瘤性的问题。另外发现了，在由神经干细胞的移植经过一定期间之后施与前药的情况下，有肿瘤化风险的未分化的细胞灭亡，另一方面，由移植细胞带来的治疗效果持续。

2)发现了通过将自杀基因插入到iPS细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域的3’侧，从而自杀基因对前药的敏感性增大。

3)发现了通过测定肿瘤细胞中的胸腺嘧啶核苷酸合酶基因和二氢嘧啶脱氢酶基因的表达量，能够推定导入了自杀基因的治疗用干细胞对该肿瘤细胞的抗肿瘤效果。

4)发现了肝配蛋白B(ephrinB)与肝配蛋白B受体(EphB)的配体与受体的配对、以及CXC基序型趋化因子12(CXCL12)与CXC基序型趋化因子受体4(CXCR4)的配体与受体的配对，参与神经干细胞对肿瘤的迁移性和指向性。

5)发现了作为基因组编辑技术代替CRISPR/Cas9使用脱靶效应的频率低的CRISPR/Cas3，将所插入的选择标志物基因使用Cre/loxP系统除去，从而能够制作安全性高的神经干细胞，另外还发现，这样制作的神经干细胞与通过现有的方法制作的神经干细胞具有同样的治疗效果。进而发现了，通过将Cre/loxP系统中的loxP序列替换成具有突变的loxP序列，能够进一步提高神经干细胞的安全性，另外，还发现了通过将使用了具有该突变的loxP序列的Cre/loxP系统与同源重组载体组合，从而不仅能够除去选择标志物基因，还能够在多能干细胞的基因组中插入第2基因。

6)发现了由多能干细胞分化出的神经干细胞对包含脑肿瘤的肿瘤、损伤脑显示强的指向性和迁移性。

本发明是基于以上的见解完成的。

即，本发明提供以下〔1〕～〔38〕。

〔1〕中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，包含由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。

〔2〕根据〔1〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在脑功能障碍的治疗中使用。

〔3〕根据〔1〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在外伤性脑损伤的治疗中使用。

〔4〕根据〔1〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在脊髓损伤的治疗中使用。

〔5〕根据〔1〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在神经变性疾病的治疗中使用。

〔6〕根据〔1〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在脑肿瘤的治疗中使用。

〔7〕根据〔1〕～〔6〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，自杀基因被插入到了多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧。

〔8〕根据〔7〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧连接有编码2A肽的序列，在编码该2A肽的序列的3’侧连接有自杀基因。

〔9〕根据〔1〕～〔8〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是在其基因组中不包含选择标志物基因的神经干细胞。

〔10〕根据〔9〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是通过包括以下的工序(A)～(D)的方法得到的神经干细胞，

工序(A)，是通过基因组编辑而在多能干细胞的基因组中插入基因构建物的工序，所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、和Cre蛋白质的二个靶标序列，并且选择标志物基因夹在Cre蛋白质的二个靶标序列之间的基因构建物，

工序(B)，通过选择标志物基因，从工序(A)中得到的多能干细胞中选择基因组中被插入了自杀基因的多能干细胞，

工序(C)，通过Cre蛋白质，从工序(B)中得到的多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因，

工序(D)，使工序(C)中得到的多能干细胞分化成神经干细胞。

〔11〕根据〔10〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，Cre蛋白质的靶标序列是loxP序列。

〔12〕根据〔10〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因构建物所包含的Cre蛋白质的二个靶标序列是在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，在基因构建物中，在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游，在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游。

〔13〕根据〔9〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是通过包括以下的工序(a)～(d)的方法得到的神经干细胞，

工序(a)，是通过基因组编辑在多能干细胞的基因组中插入基因构建物的工序，所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且选择标志物基因夹在所述二个突变loxP序列之间的基因构建物，

工序(b)，通过选择标志物基因，从工序(a)中得到的多能干细胞中，选择基因组中被插入了自杀基因的多能干细胞，

工序(c)，是在通过Cre蛋白质和同源重组载体从工序(b)中得到的多能干细胞的基因组除去选择标志物基因的同时，在基因组中插入第2基因的工序，所述同源重组载体是包含第2基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且第2基因夹在所述二个突变loxP序列之间的同源重组载体，

工序(d)，使工序(c)中得到的多能干细胞分化成神经干细胞。

〔14〕根据〔10〕～〔13〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因组编辑是利用CRISPR/Cas3的基因组编辑。

〔15〕根据〔1〕～〔14〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。

〔16〕根据〔15〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，与能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药一起使用。

〔17〕根据〔1〕～〔16〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使选自肝配蛋白A受体、肝配蛋白A、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量增加了的神经干细胞。

〔18〕根据〔17〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的表达量增加了的神经干细胞。

〔19〕根据〔1〕～〔16〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量作为指标挑选出的神经干细胞。

〔20〕根据〔19〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4作为指标挑选出的神经干细胞。

〔21〕神经干细胞的制造方法，其特征在于，包括以下的工序(1)和(2)，

工序(1)，通过基因组编辑，在多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧插入自杀基因，

工序(2)，使工序(1)中得到的多能干细胞向神经干细胞分化。

〔22〕根据〔21〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，在工序(1)中，以在紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧连接编码2A肽的序列，在该编码2A肽的序列的3’侧连接自杀基因的方式，将自杀基因插入到多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧。

〔23〕根据〔21〕或〔22〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，工序(1)包括以下的工序(1-A)～(1-C)，

工序(1-A)，是通过基因组编辑在多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧插入基因构建物的工序，所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、和Cre蛋白质的二个靶标序列，并且选择标志物基因夹在Cre蛋白质的二个靶标序列之间的基因构建物，

工序(1-B)，通过选择标志物基因，从工序(1-A)中得到的多能干细胞中选择基因组中被插入了自杀基因的多能干细胞，

工序(1-C)，通过Cre蛋白质，从工序(1-B)中得到的多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因。

〔24〕根据〔23〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，Cre蛋白质的靶标序列是loxP序列。

〔25〕根据〔23〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，基因构建物所包含的Cre蛋白质的二个靶标序列是在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，在基因构建物中，在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游，在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游。

〔26〕根据〔21〕或〔22〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，工序(1)包括以下的工序(1-a)～(1-c)，

工序(1-a)，是通过基因组编辑，在多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧插入基因构建物的工序，所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且选择标志物基因夹在所述二个突变loxP序列之间的基因构建物，

工序(1-c)，是在通过Cre蛋白质和同源重组载体从工序(1-b)中得到的多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因的同时，在基因组中插入第2基因的工序，所述同源重组载体是包含第2基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且第2基因夹在所述二个突变loxP序列之间的同源重组载体。

〔27〕根据〔23〕～〔26〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，基因组编辑是利用CRISPR/Cas3的基因组编辑。

〔28〕根据〔21〕～〔27〕所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。

〔29〕推定〔15〕所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂对脑肿瘤细胞的抗肿瘤效果的方法，该方法的特征在于，包括测定所述脑肿瘤细胞的胸腺嘧啶核苷酸合酶基因和二氢嘧啶脱氢酶基因的表达量的工序。

〔30〕对肿瘤或损伤部位的迁移性和/或指向性高的神经干细胞的挑选方法，该挑选方法的特征在于，以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的至少一者的表达量作为指标进行挑选。

〔31〕根据〔30〕所述的挑选方法，其特征在于，以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的表达量作为指标进行挑选。

〔32〕肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，包含通过〔21〕～〔28〕所述的方法制造的神经干细胞，该神经干细胞是由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。

〔33〕根据〔32〕所述的肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是其基因组中不包含选择标志物基因的神经干细胞。

〔34〕根据〔32〕或〔33〕所述的肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使选自肝配蛋白A受体、肝配蛋白A、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量增加了的神经干细胞。

〔35〕根据〔34〕所述的肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的表达量增加了的神经干细胞。

〔36〕根据〔32〕或〔33〕所述的肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的至少一者的表达量作为指标挑选出的神经干细胞。

〔37〕根据〔34〕所述的肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4作为指标挑选出的神经干细胞。

〔38〕根据〔32〕～〔37〕所述的肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，肿瘤是胰癌。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请特愿2020-063477、特愿2020-165847、特愿2020-219455的说明书和/或附图所记载的内容。

发明的效果

本发明提供新的肿瘤治疗制剂、中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂。特别是在包含脑挫裂伤的外伤性脑损伤、脑梗死等脑功能障碍的治疗或者作为由神经变性产生的神经细胞脱落的结果产生的神经变性疾病的治疗中使用细胞制剂的情况下，细胞的肿瘤化成为问题，但因为本发明的细胞制剂能够通过自杀基因而使细胞灭亡，所以是安全性高的细胞制剂。

附图说明

图1A是显示自杀基因表达/治疗用神经干细胞(NSC)的建立的图(1)。

图1B是关于自杀基因表达/治疗用NSC的建立的图(2)。

图1C是关于自杀基因表达/治疗用NSC的建立的图(3)。

图1D是关于自杀基因表达/治疗用NSC的建立的图(4)。

图2A是关于治疗用NSC(酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)-NSC)对恶性神经胶质瘤的迁移性的图。

图2B是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对恶性神经胶质瘤模型小鼠的抗肿瘤效果的图(1)。

图2C是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对恶性神经胶质瘤模型小鼠的抗肿瘤效果的图(2)。

图2D是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对恶性神经胶质瘤模型小鼠的抗肿瘤效果的图(3)。

图2E是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对恶性神经胶质瘤模型小鼠的抗肿瘤效果的图(4)。

图3A是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(1)。

图3B是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(2)。

图3C是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(3)。

图3D是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(4)。

图3E是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(5)。

图3F是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(6)。

图3G是关于治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用的图(7)。

图4A是关于5-FU释放对运动功能的影响的图(1)。

图4B是关于5-FU释放对运动功能的影响的图(2)。

图5A是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(分化细胞)的图(1)。

图5B是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(分化细胞)的图(2)。

图5C是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(分化细胞)的图(3)。

图6A是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(模型小鼠)的图(1)。

图6B是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(模型小鼠)的图(2)。

图6C是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(模型小鼠)的图(3)。

图6D是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(模型小鼠)的图(4)。

图6E是关于治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(模型小鼠)的图(5)。

图7A是关于yCD-NSC的抗肿瘤效果的生物标志物的图(1)。

图7B是关于yCD-NSC的抗肿瘤效果的生物标志物的图(2)。

图7C是关于yCD-NSC的抗肿瘤效果的生物标志物的图(3)。

图7D是关于yCD-NSC的抗肿瘤效果的生物标志物的图(4)。

图8是显示配体-受体配对分析的概要的图。

图9是被移植到脑内的神经干细胞(NSC)和间充质干细胞(MSC)的照片。

图10是自分泌细胞之间的相互作用的热图。

图11是显示通过富集分析而提示出的NSC和GSC特异性的自分泌配体-受体对的图。

图12是EphB/ephrinB基因表达的热图。

图13是旁分泌细胞之间的相互作用的热图。

图14是显示已经报告的利用了切除神经胶质母细胞瘤的单细胞RNA测序的t-SNEplot(能够全面地分析单一细胞的基因表达，将细胞的类似性在二维作图上可视化的分析法)的图。

图15A是表示以前的治疗用干细胞的制作方法的示意图。

图15B是表示利用Cre/loxP的选择标志物基因的除去方法的示意图。

图15C是表示在实施例3中使用的各种载体的结构的图。

图16A是表示实施例3中的嘌呤霉素基因和Venus基因的除去方法的示意图。

图16B是表示实施例3中的克隆的步骤的示意图。

图16C是表示实施例3中的基因组PCR的结果的图(1)。

图16D是表示实施例3中的基因组PCR的结果的图(2)。

图16E是表示实施例3中的基因组PCR的结果的图(3)。

图16F是表示实施例3中的基因组PCR的结果的图(4)。

图17A是表示利用自杀基因的脑肿瘤治疗方法的示意图。

图17B是实施例3中使用的iPS细胞(上排)、胚状体(下排左)、和神经干细胞(下排右)的显微镜照片。

图17C是显示实施例3中使用的细胞株的基因表达量的图。各棒图自左起表示GAPDH、yCD、嘌呤霉素、Venus的表达量。

图18是实施例3中使用的神经干细胞在嘌呤霉素存在或不存在下的显微镜照片。

图19是显示实施例3中使用的神经干细胞的各种5-FC浓度下的显微镜照片(上排)和细胞生存率(下排)的图。

图20是表示实施例3中使用的神经干细胞在5-FC存在或不存在下的抗肿瘤效果的照片(左)和图(右)。

图21是显示loxP序列和突变lox序列的碱基序列的图。

图22是利用Cre/突变lox系统的抗菌剂耐性基因的除去法和利用Cre/突变lox系统的第2基因插入方法的示意图。

图23是显示实施例4中使用的载体的结构的图。

图24是关于耐药性/荧光基因删除法的图(1)。

图25A是关于耐药性/荧光基因删除法的图(2)。

图25B是关于耐药性/荧光基因删除法的图(3)。

图25C是关于耐药性/荧光基因删除法的图(4)。

图26是关于第2基因插入法的图(1)。

图27A是关于第2基因插入法的图(2)。

图27B是关于第2基因插入法的图(3)。

图27C是关于第2基因插入法的图(4)。

图28是显示通过耐药性/荧光基因删除法建立的iPS细胞和神经干细胞中的各种基因的表达的图。

图29是显示通过耐药性/荧光基因删除法建立的iPS细胞和神经干细胞对5-FC和嘌呤霉素的应答的图。

图30是显示通过第2基因插入法建立的iPS细胞和神经干细胞对5-FC和嘌呤霉素的应答的图。

图31是显示通过耐药性/荧光基因删除法或第2基因插入法建立的神经干细胞的抗肿瘤效果的图。

图32是显示实施例5的实验方法的概要的图。

图33A是显示神经干细胞对胰癌的指向性和迁移性的图(1)。

图33B是显示神经干细胞对胰癌的指向性和迁移性的图(2)。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

(A)细胞制剂

本发明的肿瘤治疗制剂、中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂的特征在于，包含由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。

作为自杀基因，可列举单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)、羧酸酯酶(carboxylesterase)、脱氧胞苷激酶基因和阿糖胞苷(deoxycytidine kinase/cytosinearabinoside)、胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)基因(CD-UPRT基因)。在本发明中，可以列举胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)基因(CD-UPRT基因)作为适合的例子。

本发明中的所谓“中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂”，是指针对中枢神经系统疾病和中枢神经系统损伤的治疗用细胞制剂，更具体地，是指为了治疗中枢神经系统(例如，脑、脊髓等)中的疾病、损伤而使用的细胞制剂。作为治疗对象的疾病、损伤不特别限定，可以列举例如，脑肿瘤、神经变性疾病、脑功能障碍、脊髓损伤等，优选为脑肿瘤或脑功能障碍。作为治疗对象的脑功能障碍不特别限定，可以列举由物理损伤造成的功能损伤，例如，由脑挫裂伤造成的功能损伤、由脑血管意外(例如，脑梗死、脑出血、蛛网膜下出血)造成的功能损伤等。所谓神经变性疾病，是以由神经变性造成的神经细胞的脱落为病因的疾病，可以列举帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、额颞叶变性症等作为具体例。作为脑肿瘤，可列举例如，胶质瘤(神经胶质瘤)、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓膜瘤、下垂体腺瘤、神经鞘瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肉瘤、脊髓肿瘤等。本发明中，这些中的任意脑肿瘤都可以作为治疗对象，优选以胶质瘤作为治疗对象。此外，在将本发明的细胞制剂用于脑肿瘤的治疗的情况下，“治疗”不仅包含杀死肿瘤细胞，也包含使肿瘤细胞减少、抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明中的所谓“肿瘤治疗用细胞制剂”，是指在肿瘤的治疗中使用的细胞制剂。本发明的细胞制剂是利用神经干细胞向肿瘤组织的迁移性、指向性这样的特性而使自杀基因作用于肿瘤组织的。这里所说的“治疗”不仅包括使肿瘤细胞灭亡，也包括使肿瘤细胞减少、阻碍肿瘤细胞的增殖。作为肿瘤，根据所述神经干细胞的特性，不仅实施例中列举的脑肿瘤、胰癌，多种肿瘤、例如乳癌、胃癌、肺癌等也可以成为对象。

本发明中的“多能干细胞”可以解释成本领域技术人员通常使用的含义，包含例如，iPS细胞、ES细胞。作为多能干细胞，也可以使用ES细胞，但优选使用iPS细胞。使用的iPS细胞只要是能向神经干细胞分化的即可，对其来源、导入的重编程因子、重编程因子的导入方法等不特别限定，但因为本发明的细胞制剂主要用于治疗人的脑中的疾病、损伤，所以这样的情况下优选使用来源于人的iPS细胞。该情况下，iPS细胞可以使用来源于施与细胞制剂的患者的iPS细胞，也可以使用来源于患者以外的人的iPS细胞。使用的iPS细胞可以按照公知的方法制作，但也可以从京都大学iPS细胞研究所(CiRA)等研究机构获得。

本发明中的“神经干细胞”是指具有提供分化成神经元和胶质细胞的细胞的能力的干细胞。本发明的细胞制剂包含该神经干细胞，但只要不给脑损伤、脑疾病的治疗效果带来大的坏影响，就也可以包含除了神经干细胞以外的细胞。如果按照后述的Sugai K.MolBrain 2016记载的方法由iPS细胞制作神经干细胞，则不仅生成神经干细胞，还生成神经前体细胞。因此，本发明的细胞制剂有时包含神经干细胞和神经前体细胞两者。

神经干细胞对肿瘤的迁移性、指向性越高，则能够使更多的神经干细胞聚集在疾病、损伤部位，能够期待更高的治疗效果。因此，在神经干细胞中，优选使上述的与迁移性和指向性有关的配体与受体的配对中，在神经干细胞内表达的、具体为肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B、肝配蛋白B受体、CXC基序型趋化因子受体4的表达量增加。关于肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B、肝配蛋白B受体、和CXC基序型趋化因子受体4，优选使这五者全部的表达量增加，但既可以仅增加了肝配蛋白B、肝配蛋白B受体、和CXC基序型趋化因子受体4三者的表达量，也可以仅增加选自所述三者中的至少一者的表达量。这些配体和受体的表达量的增加可以按照公知的方法进行。例如，可以通过将这些配体和受体的基因导入神经干细胞中的方法(根据需要可以与强表达启动子等增加基因的表达量的控制区域一起导入)、使用具有增加这些配体和受体的表达量的作用的物质的方法等来进行。

另外，也可以通过使用对肿瘤的迁移性、指向性本来就高的神经干细胞，来期待高的治疗效果，所以作为神经干细胞，可以使用通过后述的本发明的挑选方法挑选出的神经干细胞。

羧酸酯酶(carboxylesterase)将CPT-11转换成毒性高的7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)，强力地抑制Ⅰ型拓扑异构酶(topoisomerase I)。阿糖胞苷被脱氧胞苷激酶基因磷酸化而发挥抗肿瘤效果。CD基因和UPRT基因分别是以5-氟胞嘧啶(5-FC)和5-氟尿嘧啶(5-FU)为前药的自杀基因。表达这些自杀基因的载体有市售，可以利用这样的载体来制作表达这些自杀基因的多能干细胞、神经干细胞。CD基因和UPRT基因分别单独也具有抗肿瘤效果，但已知通过将这两基因导入细胞，能够得到单独导入CD基因时的约100倍的抗肿瘤效果。

自杀基因向多能干细胞的导入也可以使用病毒载体来进行，但优选使用基因组编辑进行。这是因为，在使用慢病毒载体等病毒载体将自杀基因插入多能干细胞的基因组中时，自杀基因被随机插入到染色体中，因而担心插入部位的基因突变、周围基因的激活、由位置效应造成的自杀基因的沉默。认为通过不使用病毒载体、而是使用基因组编辑，能够避免这样的问题。

基因组编辑可以使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas3、Cre/loxP等进行，其中，优选使用CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas3进行，特别优选使用CRISPR/Cas3进行。CRISPR/Cas3比CRISPR/Cas9识别靶标序列更长，因而脱靶效应的频率更低，能够制作安全性更高的神经干细胞。通过基因组编辑，能够将自杀基因插入到多能干细胞的持家基因的区域、安全港(safe/harbour)区域AAVS1。作为持家基因，可列举例如，β-肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因、亲环蛋白基因、α-微管蛋白基因等。在本发明中，优选将自杀基因插入到紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧。另外，此时，优选以在紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧连接编码2A肽的序列、在该编码2A肽的序列的3’侧连接自杀基因的方式，将自杀基因插入到紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧。

在将自杀基因导入多能干细胞时，为了细胞的选择，通常将外来的耐药性基因、荧光基因等选择标志物基因也一起导入。但是，从安全性的角度，不优选在由多能干细胞分化而成的神经干细胞的基因组中残存选择标志物基因这样的外来基因。因此，优选除去选择标志物基因。除去选择标志物基因的手段不特别限定，优选使用Cre/loxP系统等Cre蛋白质与Cre蛋白质的靶标序列的组合。这里，所谓“Cre蛋白质的靶标序列”，是指loxP序列(序列号1)、具有突变的loxP序列(突变loxP序列)等。loxP序列由上游重复序列、间隔序列、和下游重复序列组成，突变loxP序列中的突变可以存在于这些序列的任意位置。作为在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列的具体例，可以列举lox71(序列号2)，作为在间隔序列中具有突变的突变loxP序列的具体例，可以列举lox2272(序列号4)，作为在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列的具体例，可以列举lox66(序列号3)。

作为使用Cre/loxP系统而除去选择标志物基因的方法，可以例示：制作包含自杀基因、选择标志物基因、和二个loxP序列、且选择标志物基因夹在两个loxP序列之间的基因构建物，将其插入多能干细胞的基因组，然后，通过Cre蛋白质从多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因的方法。但是，在该方法中，在多能干细胞的基因组中残存一个loxP序列，这有与Cre蛋白质反应的危险。因此，优选将基因构建物中所包含的loxP序列替换成突变loxP序列，使得基因组中残留的loxP序列变成不易与Cre蛋白质反应的突变loxP序列。具体地，可以例示：将基因构建物所包含的二个loxP序列替换成在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，制作在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游、在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游这样的基因构建物，将其插入多能干细胞的基因组，然后，通过Cre蛋白质从多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因的方法。在该方法中，基因组中残留的是在上游重复序列和下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，可以减轻与Cre蛋白质反应的危险。

除了上述的基因构建物之外，还可以不仅使用同源重组载体、从基因组中除去选择标志物基因，而且与此同时在基因组中插入第2基因。此时，使用基因构建物包含自杀基因、选择标志物基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，且选择标志物基因夹在所述二个突变loxP序列之间的基因构建物。另外，同源重组载体使用包含第2基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，且第2基因夹在所述二个突变loxP序列之间的同源重组载体。作为第2基因，可以使用与自杀基因不同的与治疗有关的基因。

基因构建物中的突变loxP序列的位置不特别限定，如图22C所示，可以在重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游、在间隔序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游，也可以相反。但是，在重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游的情况下，突变loxP序列优选在上游重复序列中具有突变；相反，在重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游的情况下，突变loxP序列优选在下游重复序列中具有突变。这是因为，由此突变loxP序列会残留在基因组中。

同源重组载体中的突变loxP序列的位置可以设计成与基因构建物中的突变loxP序列相同那样的位置。即，在基因构建物中，在重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游、在间隔序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游的情况下，在同源重组载体中，设计成在重复序列中具有突变的突变loxP序列位于第2基因的上游、在间隔序列中具有突变的突变loxP序列位于第2基因的下游。在基因构建物中的突变loxP序列的位置与上述相反的情况下，设计成同源重组载体中的突变loxP序列的位置也与上述相反。

如果Cre蛋白质和上述的同源重组载体作用于插入了上述的基因构建物的基因组，则发射同源重组，选择标志物基因从基因组被除去，同时第2基因被插入基因组中。同源重组载体中预先插入有编码Cre蛋白质的基因，由此可以使Cre蛋白质和同源重组载体同时作用。

由多能干细胞向神经干细胞的分化可以按照介由类胚体的方法、不介由类胚体的方法、公知的任意方法进行。在由iPS细胞使其分化的情况下，例如，可以按照Stem CellReports.2017Nov 14；9(5):1675-1691记载的方法进行。例如，根据上述方法，由iPS细胞的类胚体的形成可以使用公知的类胚体形成培养基来进行，类胚体培养基包含TGFβ家族抑制剂(例如，SB431542)和BMP抑制剂(例如，LDN-193189)。由类胚体向神经干细胞的分化可以使用公知的神经球培养基进行。例如，神经球培养基包含上皮生长因子、成纤维细胞生长因子-2、白血病抑制因子、B-27supplement(补剂)等。通过将类胚体用神经球培养基进行培养，从而形成被称为神经球的包含神经干细胞的细胞块。回收形成的神经球，分散成单一细胞，通过用神经球培养基进行培养，再次形成神经球。将这样的操作重复几次后，回收神经球，从而得到神经干细胞。

此外，如上所述，在本说明书中，“神经干细胞”这样的“物”不是通过结构或特性、而是通过制造方法特定，但这是因为，细胞是生物体的一部分，因而其结构、特性极为复杂，进行特定它们的操作需要显著过大的经济支出、时间。

本发明的细胞制剂除了神经干细胞之外，还可以包含制剂上容许的其他成分。作为这样的其他成分，可列举担载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。另外，为了保护冷冻保存时的细胞也可以包含二甲基亚砜、血清白蛋白等，为了防止细菌的混入、增殖也可以包含抗生素等。

为了在肿瘤、脑疾病、脑损伤的治疗获得所期望的效果，本发明的细胞制剂中所含的神经干细胞的数量可以考虑肿瘤等疾病、脑疾病、脑损伤的种类、对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等而适宜确定。

本发明的细胞制剂可以多次(例如，2～10次)、隔开间隔(例如，1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次)进行施与。施与量可以考虑疾病、损伤的种类、对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等适宜确定，但优选每一个体(人)以干细胞1×10 ⁶个～1×10 ¹⁰个、1～10次进行施与。

对本发明的细胞制剂的施与部位、施与方法不特别限定。作为施与方法，可列举向脑或肿瘤组织的局部施与、颈动脉内施与、静脉内施与等。

本发明的细胞制剂也可以与被自杀基因激活的前药一起使用。前药可以根据自杀基因的种类来确定，例如，在作为自杀基因使用CD-UPRT基因的情况下，可以使用能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药(例如，5-FC)。可以通过使用这样的前药，对具有自杀基因的细胞诱导细胞死亡。是否使用前药，可以根据作为治疗对象的疾病、损伤来确定。例如，在以脑功能障碍作为治疗对象的情况下，因为由前药的使用带来的细胞死亡诱导并不直接与治疗效果相关，而是以肿瘤细胞的灭亡、可能肿瘤化的细胞的灭亡为目的，所示前药并不是必须使用。另一方面，在以脑肿瘤作为治疗对象的情况下，由前药的使用带来的细胞死亡诱导直接与治疗效果有关，所以前药的使用是必须的。

前药的施与部位、施与方法也不特别限定。作为施与方法，除了上述经口施与、对脑或者组织的局部施与、颈动脉内施与、静脉内施与之外，还可列举腹腔内施与等。

前药的施与时期可以根据作为治疗对象的疾病、损伤来确定。例如，在以脑的损伤作为治疗对象的情况下，可以在肿瘤细胞产生的时间点施与，另外，为了预防肿瘤细胞的发生，也可以在施与本发明的细胞制剂之后经过一定时间后开始施与。这样的预防性施与的开始时期只要是不丧失神经干细胞所具有的治疗效果、且能够杀灭有肿瘤化风险的未分化细胞的时期，就不特别限定，例如，可以是从施与本发明的细胞制剂开始3～60天后，也可以是5～20天后。另外，在以脑肿瘤作为治疗对象的情况下，可以在本发明的细胞制剂的施与前、施与的同时、和施与后的任一者，通常在细胞制剂的施与后分多次施与。对于其他肿瘤也是同样的。

前药的施与量可以考虑使用的前药的种类、对象的性别、年龄、体重、患部的状态等而适宜确定，但在施与5-FC的情况下，优选每一个体(人)以1天50-200mg/kg、1天4次施与。

(B)神经干细胞的制造方法

本发明的神经干细胞的制造方法的特征在于，包括下述的工序(1)和(2)的特征。

在工序(1)中，通过基因组编辑，在多能干细胞的紧接着β-肌动蛋白基因的翻译区域之后的3’侧插入自杀基因。该工序可以与“(A)细胞制剂”中记载的自杀基因向多能干细胞的导入同样地进行。

工序(2)中，使工序(1)中得到的多能干细胞向神经干细胞分化。该工序可以与“(A)细胞制剂”中记载的由多能干细胞向神经干细胞的分化同样地进行。

(C)推定抗肿瘤效果的方法

本发明的推定抗肿瘤效果的方法的特征在于，是推定上述的本发明的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂对脑肿瘤细胞的抗肿瘤效果的方法，包括测定所述脑肿瘤细胞的胸腺嘧啶核苷酸合酶基因和二氢嘧啶脱氢酶基因的表达量的工序。

基因的表达量的测定可以通过公知的方法、例如RT-qPCR法来进行。

测定的结果是，在胸腺嘧啶核苷酸合酶基因和二氢嘧啶脱氢酶基因的表达量高的情况下，可以推定本发明的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂对作为测定对象的脑肿瘤细胞的抗肿瘤效果低，另一方面，在所述基因的表达量低的情况下，可以推定本发明的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂对作为测定对象的脑肿瘤细胞的抗肿瘤效果高。

(D)迁移性和指向性高的神经干细胞的挑选方法

本发明的挑选方法的特征在于，是挑选对肿瘤或损伤部位的迁移性和/或指向性高的神经干细胞的方法，以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量作为指标进行挑选。

对于肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B、肝配蛋白B受体、和CXC基序型趋化因子受体4，优选以这五者全部的表达量作为指标进行挑选，但既可以仅以肝配蛋白B、肝配蛋白B受体、和CXC基序型趋化因子受体4三者的表达量作为指标进行挑选，也可以以选自所述三者中的至少一者的表达量作为指标进行挑选。

作为具体的挑选方法，可以例示例如，包含下述的工序(1)和(2)的方法。

工序(1)，测定选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量，

工序(2)，在工序(1)中测定得到的表达量高于基准值情况下，挑选该神经干细胞作为“对肿瘤或损伤部位的迁移性和/或指向性高的神经干细胞”。

这里，在挑选中使用的基准值不特别限定，例如，可以预先测定一般使用的神经干细胞(例如，市售的神经干细胞等)的肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B、或CXC基序型趋化因子受体4的表达量，将其作为基准值。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于该实施例。此外，在以下的实施例中，“NSC”通常是指“NS/PCs(神经干细胞/祖细胞，Neural stem/Progenitorcells)”。

〔实施例1〕

(A)方法

＜人iPS细胞＞

使用的人iPS细胞(1210B2)从京都大学iPS细胞研究所(CiRA)获得。1210B2通过使用附加型载体在人外周血单核细胞中导入重编程因子的方法(Okita K,Yamakawa T,Matsumura Y,Sato Y,Amano N,Watanabe A,Goshima N,Yamanaka S.An efficientnonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stemcells from cord blood and peripheral blood cells.Stem Cells.2013Mar；31(3):458-66.)而构建。人iPS细胞接种在经iMatrix-511(ニッピ社制)涂覆的塑料培养皿中，使用Stem Fit AK03或AK03N培养基(味の素社制)通过已知的无饲养层(feeder-free)的方法(Nakagawa M.Sci Rep.2014)进行维持培养。

＜由人iPS细胞向神经干/前体细胞(NSC)的分化诱导＞

由人iPS细胞向NSC的分化诱导通过已知的方法(Sugai K.Mol Brain.2016.)进行。首先在iPS细胞的培养基中添加10μM ROCK抑制剂Y276352(和光纯药工业社制)，孵育1～3小时后，用PBS洗涤，使用TrypLE Select(Life Technologies社制)分散成单一细胞。将分散成单一细胞的人iPS细胞悬浮在添加了10μM ROCK抑制剂Y276352的EB(类胚体，embryoid body)形成培养基(在未添加C液的Stem Fit培养基中添加10μM SB431542,100nMLDN-193189)中，在低粘附96孔培养板(Prime Surface 96V，住友ベークライト社制)的每1孔中以9.0×10 ³细胞/75μl接种，进行培养。1天后加入EB形成培养基75μl，以后，每天交换一半量的EB形成培养基，培养13～14天培养，从而得到EB。从各孔回收EB，在NS(neurosphere)培养基(在D-MEM/Ham’s F-12培养基(含有HEPES)(和光纯药工业社制)中添加20ng/ml重组人表皮生长因子(PeproTech社制),20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子-2(PeproTech社制),10³单位/ml重组人白血病抑制因子(ナカライテスク社制),2％ B-27supplement(Thermo Fisher Scientific社制),1单位/ml肝素钠(エイワイファーマ社制))培养7天。培养基交换在培养第3天或第4天进行1次。将细胞块离心回收，使用TrypLESelect(胰蛋白酶替代物)分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中。以1×10 ⁵细胞/ml的浓度接种在低粘附瓶(Corning社制)中，每隔3～4天进行培养基交换，培养10天，从而获得1次NSC。同样地，将1次NSC离心回收，使用TrypLE Select分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中，以1×10⁵细胞/ml的浓度接种在低粘附瓶中，每隔3～4天进行培养基交换，培养7～10天，从而获得2次、3次、4次、5次NSC。

＜利用CRISPR/Cas9向GAPDH、ACTB、AAVS1基因区域的yCD-UPRT基因导入-治疗用干细胞yCD-NSC的制作＞

在各基因区域导入了yCD-UPRT基因的iPS细胞的制作

为了使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，制作在持家基因区域GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、ACTB(β-肌动蛋白)、和安全港(safe/harbour)区域AAVS1(PPP1R12C)插入了yCD-UPRT融合自杀基因的iPS细胞。作为用于基因组编辑的DNA构建物，为了在GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因区域插入yCD-UPRT，制作将GAPDH与yCD-UPRT与Bsd(杀稻瘟菌素(blasticidin)耐性基因)以2A肽序列相连的形式插入的同源重组用构建体(HR-GAPDH-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)，和以GAPDH的终止密码子附近为靶标的gRNA和Cas9表达载体构建体(U6-GAPDH-gRNA4-Cas9)。在β-肌动蛋白的情况下，与GAPDH同样地构建以β-肌动蛋白的终止密码子附近为靶标的gRNA表达载体，同源重组用的构建物仍然以β-肌动蛋白与yCD-UPRT与Bsd以2A肽序列相连的形式插入的方式构建(β-肌动蛋白-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)。AAVS1区域的同源重组用构建物制成在EF-1启动子下表达yCD-UPRT-2A-Bsd的形式，在两端添加了绝缘子序列。以这些基因与yCD-UPRT与Bsd以2A肽序列相连的形式插入。

将这些构建物通过电穿孔导入人iPS细胞株(1210B2)，在杀稻瘟菌素S存在下培养，进行克隆。同源重组iPS细胞株的确认可以通过利用各克隆的基因组PCR和基因组测序的碱基序列确认来进行。

yCD-UPRT表达NSC的制作(yCD-NSC)

由在各基因区域装入了yCD-UPRT的iPS细胞向NSC进行分化诱导，得到2次～5次NSC(yCD-NSC)。培养基中通常添加杀稻瘟菌素S1μg/ml进行培养。yCD-UPRT表达NSC确认了通过在培养基添加5-FC 1-5μg/ml而诱导细胞死亡。

补充信息

※关于yCD-NSC对恶性神经胶质瘤的迁移和抗肿瘤效果

在由人神经胶质瘤细胞株U87(ffLuc)产生的肿瘤块的上方1mm处移植yCD-NSC(用hKO1标记)，对其迁移性使用脑切片培养定量地进行评价(Tamura R.Mol Brain.2019)。作为比校对象，使用脂肪组织来源的和骨髓来源的人间充质干细胞株(用hKO1标记)。以方向和移动距离作为参数，制成Rose Diagram Maps(Angular histogram)，从而定量地评价了脑内迁移性。yCD-NSC的抗肿瘤效果通过对U87神经胶质瘤模型小鼠移植yCD-NSC，施与5-FC进行了评价。

※关于yCD-NSC的安全性

在正常脑的右纹状体中与上述同样地移植5×10⁵个yCD-NSC(ffLuc)，从7天后开始施与5-FC，施与2周。作为对照也制作了5-FC非施与组。然后在150天后斩首，评价了脑组织。由5-FC转换的5-FU理论上被认为不影响终末分化的细胞所占的脑内的细胞，但可能影响存在于脑室附近的神经前体细胞、血管内皮等略微伴有分裂的细胞，因此使用血管内皮细胞标志物(CD31)和神经干细胞/前体细胞标志物(神经上皮干细胞蛋白)在组织学上进行了评价。另外，从yCD-NSC移植后第35天开始5-FC施与，通过IVIS确认了使植活的yCD-NSC消失。

※关于yCD-NSC的生物标志物

评价了5-FU对U87,U251,SF126,hG008,hG021,GL261,TSG的敏感性(CCK-8检测)。作为对象使用TMZ进行了比校。另外，对于各个细胞株、和yCD-NSC的胸苷酸合酶(TS)、二氢嘧啶脱氢酶(DPD)活性，通过RT-qPCR法和蛋白质印迹法进行定量分析。

yCD-UPRT表达NSC向神经元的分化、和分化细胞的5-FU敏感性

使yCD-UPRT表达NSC在体外(in vitro)分化成神经元。分化通过βIII微管蛋白和NeuN的表达和形态进行了确认。未分化增殖细胞的残存通过Ki-67、PCNA、神经上皮干细胞蛋白的表达进行了确认。细胞死亡通过Cleaved caspase 3(被切割的胱天蛋白酶3)的表达进行了评价。加入5-FC，利用由被导入的yCD-UPRT释放的5-FU，评价了这些分化细胞/未分化细胞的变化。

ffLuc表达yCD-NSC的制作

使所制作的yCD-NSC感染ffLuc(Venus荧光蛋白质与Luc2萤火虫萤光素酶的融合基因)表达慢病毒载体(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y,Tsuji O,Kumagai G,Hara CM,Okano HJ,Miyawaki A,Toyama Y,Okano H,Nakamura M.Comparative study of methodsfor administering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury inmice.Cell Transplant.2011；20(5):727-39.)，获得了ffLuc稳定地高表达的yCD-NSC。

＜脑挫裂伤模型小鼠中的yCD-NSC的治疗效果的研究＞

将全身麻醉的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,10周)以距离前囟左外侧1.25mm、吻侧1.25mm为中心直径2.5mm的圆形进行开颅。骨瓣为了之后送回而进行了保护。将脑表露出，使用ACU22XTアモイルス冷冻手术装置(キーラーアンドワイナー)2.5mm探针，将脑表冷却，从而制作了脑挫裂伤(60℃30sec×10sets)。接着将1×10⁵个yCD-NSC移植到距离前囟相同部位挫伤正下方(左外侧2.5mm、吻侧1.25mm、深2mm)。将摘出的骨瓣送回，进行皮肤缝合而结束。

关于小鼠的行动评价，首先，在术前进行Rota rod(转棒，UGO BASILE)2次，进行SMART型大鼠小鼠用握力测定装置MK-380Si(室町机械)1次，使小鼠习惯仪器。Rota rod历时30秒将旋转数从2r.p.m增加至20r.p.m，测量直到小鼠从棒落下或不能稳定步行的时间。各测定日施行3次Rota rod，测定平均时间。本方法是按照已有报告进行的(Tabuse J ClinNeurosci.2010)。关于握力测定，在测定器附属的网上盖上塑料盖，限制能够握持的网的面积，从而能够进行仅单肢的握力测定。握力对于4肢全部测定，在小鼠以5趾握持着网时，水平拉尾巴，测定直到肢从网脱离的峰值。对各肢分别测定7次，将除去了最大值和最小值的5次的平均值进行比校(Alamri FF.Behav Brain Res.2018)。

术后在第3、5、7、14、21、28、35、42天之后，通过上述方法评价了运动功能。同一个体的yCD-NSC的经时变化利用IVIS活体成像系统每隔1周进行了观察。IVIS拍摄时，在异氟醚吸入麻醉下将VivoGlo^TM萤光素30mg/ml腹腔内施与200μl，在达到峰的5分钟进行拍摄。

另外，在脑挫裂伤制作后第7、14、28、42天的时间点各将4只斩首，灌流固定而获得脑组织。斩首时，将Evans blue(Sigma-Aldrich)2％溶液(溶剂为无菌生理盐水)在斩首2小时之前以0.2ml/只从尾静脉注入，然后再进行斩首。

另外，以挫伤的下方约1mm为目标(距离脑表深3mm)，在同一天移植1×10⁵个yCD-NSC。然后在第42天斩首而评价了组织。移植的yCD-NSC通过使用STEM121人细胞特异性的抗体而进行了评价。

＜脑挫裂伤模型小鼠中的yCD-NSC的安全性的研究＞

与上述同样地制作挫伤和移植yCD-NSC，然后在7天之后以5mg/匹/天腹腔内施与5-FC，在2周内每天连续进行。与5-FC非施与组和yCD-NSC非移植组的两对照比较了运动功能(握力)。这样确认了，5-FU释放对脑功能没有坏影响。

(B)结果

＜自杀基因表达/治疗用NSC的建立＞

在利用慢病毒载体的对人iPS细胞的自杀基因(yCD-UPRT)的基因导入中，在向神经干细胞/前体细胞(NSC)的分化诱导过程中发生了基因的沉默(图1A)。于是，本发明者使用基因组编辑技术CRISPR/Cas9，通过导入到持家基因区域β肌动蛋白(ACTB)，从而成功地实现了yCD-UPRT的恒常的稳定表达(图1B)。yCD-UPRT通过将作为前药的抗真菌剂5-FC转换为抗癌剂5-FU，从而诱导细胞死亡(图1C)。

本发明者为了进行自杀基因的插入部位的最佳化，对其他持家基因GAPDH、安全港(safe/harbour)区域AAVS1也通过CRISPR/Cas9基因导入了yCD-UPRT。在AAVS1区域与病毒载体同样地沉默，在GAPDH区域，对前药5-FC的敏感性为β肌动蛋白区域的一半以下(图1D)。于是，本发明者将β肌动蛋白确定为yCD-UPRT的最佳基因导入区域。对5-FC的敏感性利用CCK-8检测进行了定量分析。

＜治疗用NSC(yCD-NSC)对恶性神经胶质瘤模型小鼠的抗肿瘤效果＞

本发明者构建了实时拍摄iPS细胞来源的NSC在脑内对肿瘤迁移的样子，定量地评价指向性的自有的方法(参照图2A Rose diagram map)。其结果显示，iPS细胞来源的NSC，与有时被作为移植细胞疗法使用的其他脂肪来源的(AMSC)和骨髓来源的间充质干细胞(BMSC)相比，在脑内更加良好地显示指向/迁移性，显示了作为细胞运输载体的有用性(图2A)。将通过图1所示的方法建立的治疗用NSC(yCD-NSC)移植到神经胶质瘤模型小鼠(U87)(图2B)。这是利用了对肿瘤的迁移性的治疗。其结果通过5-FC施与，与对照相比显示了有效的治疗效果(图2C)。此外，对照制作了移植yCD-NSC但不施与5-FC的组、不移植yCD-NSC但施与5-FC的组的2组。

在评价了施与5-FC后2周的时间点的脑组织时，与对照相比，确认了明显的肿瘤缩小和完全消失(图2D)。此外，肿瘤用黄色/Venus荧光蛋白进行了标记。生存期间也与两对照组明显延长(图2E)。

＜治疗用NSC(yCD-NSC)对脑挫裂伤的脑保护作用＞

本发明者建立并报告了使用了冷却装置的脑挫裂伤模型。通过在左前脑制作脑挫裂伤，从而能够稳定地制作呈现右下肢轻度偏瘫的模型(图3A)。使yCD-NSC感染ffLuc(Venus荧光蛋白质与Luc2萤火虫萤光素酶的融合基因)表达慢病毒载体，使得能够通过IVIS鉴定移植yCD-NSC(图3B)。此外，通过图2所示的方法使神经胶质瘤细胞株感染，评价了治疗效果。yCD-NSC不仅对肿瘤细胞，对损伤脑(脑挫裂伤)也显示明显的迁移能力。移植到脑挫裂伤的对侧的yCD-NSC不足2周，就在脑挫裂伤部位确认了信号(图3C)。

对脑挫裂伤部位移植yCD-NSC，通过IVIS追踪植活，如果在35天后施与5-FC，则yCD-NSC的信号完全消失(图3D)。在细胞疗法中，移植细胞的肿瘤化经常作为问题被列举，但本发明者建立的yCD-NSC通过5-FC施与而灭亡，可以说具有针对肿瘤化的安全装置，可能实现安全的再生医疗。

对脑挫裂伤，移植了yCD-NSC的治疗组与对照组相比显著地确认了运动功能(握力)的改善(图3E)。进而，通过色素(Evans blue)将脑损伤部位可视化的结果是，对于脑挫裂伤后14天的脑组织，在移植了yCD-NSC的脑中确认了明显的脑损伤部位的缩小(图3F)。这意味着yCD-NSC对急性期损伤脑的脑保护作用。另外，在挫伤的下方1mm地点移植yCD-NSC42天后评价了脑组织时，明显地确认了向挫伤部位迁移/聚集(图3G)。

＜5-FU释放对运动功能的影响＞

本发明者通过对急性期发挥了脑保护效果的NSC中以未分化状态残存的(有肿瘤化风险)，施与5-FC使其灭亡，从而确认了是否无脑功能的降低。在挫伤制作日(Day0)的超急性期移植NSC，在直到Day7的急性期发挥脑保护作用，然后在亚急性期施与5-FC 2周(图4A)。其结果虽然从Day7开始施与了5-FC，运动功能也没有降低，与5-FC非施与组获得了同样的功能恢复(图4B)。另外，与NSC非移植对照相比显著地显示了功能改善效果(图4B)。

＜治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(分化细胞)＞

作为yCD-NSC不影响分化后的细胞的证明，使yCD-NSC自身在体外(in vitro)分化成神经元，进行了施与前药5-FC的实验(图5A)。神经球伸出非常长的突起，预想形态上向神经元的分化。这样长地伸出突起的细胞的作为神经元标志物的βIII微管蛋白是阳性(图5B)。这样显示分化成了神经元。但是，另一方面Ki-67阳性的增殖性细胞也还有一部分残存(图5B)。可知如果施与5-FC，则仅这些Ki-67阳性的增殖性细胞灭亡，βIII微管蛋白阳性的分化细胞对释放的5-FU不灭亡。显示了PCNA阳性的增殖性细胞发生细胞死亡，βIII微管蛋白阳性的分化细胞不发生细胞死亡(图5B)。

另外，进而也观察到一部分表达作为成熟神经元标志物的NeuN的细胞，明确显示这样的细胞仍然不由于5-FC施与后释放的5-FU而发生细胞死亡(图5C)。

＜治疗用NSC(yCD-NSC)的安全性(模型小鼠)＞

对神经胶质瘤干细胞hG008(绿)模型小鼠移植的yCD-NSC(红)迁移到肿瘤细胞，存在于肿瘤内，但施与5-FC的结果是虽然肿瘤细胞也被杀伤，但自身也灭亡，不残存(图6A)。

5-FC理论上被认为不影响终末分化的细胞所占的脑内的细胞，但可能影响存在于脑室附近的神经前体细胞、血管内皮等略微伴有分裂的细胞。于是，这次对正常脑移植yCD-NSC，施与5-FC，结果对移植部位附近的脑室壁的神经前体细胞(图6B)和血管内皮细胞(图6C)没有确认到产生了明显的凋亡的细胞。yCD-NSC聚集于肿瘤、损伤脑，因而提示对这些组织的附近不见得显示指向性。用IVIS追踪了对正常脑移植了yCD-NSC之后的经过，但5-FC施与后信号消失，表示了自身的灭亡(图6D)。此外，图6E的脑组织图像中的A、B和C分别相当于荧光组织图像图6A、B、和C的部位。

＜yCD-NSC的抗肿瘤效果的生物标志物＞

5-FU的活性代谢体FdUMP抑制作为DNA的从头(de novo)系酶的胸苷酸合酶(TS)的酶活性(图7A)。这样DNA的从头(de novo)合成系统被抑制，时间依赖性地发生DNA损伤。另外，通常被摄入肿瘤内的5-FU被作为分解酶的二氢嘧啶脱氢酶(DPD)分解(图7A)。由此预想，DPD活性越低，则肿瘤内的5-FU浓度越高；靶标酶的TS活性越低，则TS活性越被FdUMP高效地抑制，从而抗肿瘤效果被增强。于是考虑，TS、DPD的表达成为本发明者利用yCD-NSC的抗肿瘤效果的生物标志物。通过CCK-8检测评价了各神经胶质瘤细胞株对5-FU的敏感性。其结果是敏感性为(良好)GL261,TSG,hG008,U87,U251(不良)(图7B)。

通过RT-qPCR法定量分析了TS和DPD的mRNA水平的基因表达。可知在U251中，TS、DPD均为高值(图7C)。蛋白质印迹法中也是同样的结果。如果制成将图7C作图而得的图，则对5-FU显示明显效果的hG008、TSG、GL261在双方的相对基因表达为0.5以下(以U87作为1进行评价)。另外对5-FU抵抗性最高的U251呈现双方为3.0程度的相对基因表达(图7D)。由这些结果，TS和DPD能够成为本治疗的生物标志物。另外，ACTB(yCD-NSC)也是TS活性特别高、对5-FU的反应不能说良好(图7D)。即，还要求确定5-FC的敏感性更良好的自杀基因插入部位，本发明者评价的ACTB区域相当于此。另外，NSC对5-FU的敏感性不能说良好这点，也是提示影响内源性的神经干细胞的可能性少的“安全性”的结果。

〔实施例2〕

＜背景＞

神经干细胞(Neural stem cell:NSC)和间充质干细胞(Mesenchymal stem cell:MSC)由于具有向肿瘤、损伤部位迁移的性质，一直以来作为治疗基因的细胞运输载体(CDV)使用(引用文献1和2)。NSC可以从胎儿来源的组织等采集，从其低增殖性的问题、伦理的侧面考虑，使用不容易。本发明者通过从人诱导多能干细胞(iPS细胞)分化诱导NSC而解决了该问题。并且研究了将NSC作为针对神经胶质母细胞瘤的治疗基因(胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶:CD-UPRT)的CDV使用治疗战略。另一方面，对神经胶质母细胞瘤，NSC、MSC的哪一个会成为优异的CDV，其答案尚未明。

本发明者使用脑切片培养(Tamura R.Mol Brain.2019[特愿2019-052704])评价了移植到脑内的NSC和MSC(脂肪组织、骨髓来源)对神经胶质母细胞瘤细胞的迁移性，结果表明，NSC相对于MSC显著地显示良好的迁移/指向性。于是这一次，通过对本发明者保有的NSC株、MSC株、神经胶质母细胞瘤株进行RNA测序分析，表明了给NSC与MSC的迁移带来差异的关键分子。

＜方法＞

作为恶性神经胶质瘤的难治性的根源报告了神经胶质瘤干细胞(Glioma stemcell:GSC)。GSC与神经胶质细胞(GC)不同，具有自我复制和肿瘤形成能力，具有高的浸润性和化学/放射线疗法抵抗性，被认为是复发的根源。

由人iPS cell来源的NSC(iPSC-NSC)、人脂肪组织来源的MSC2株(AMSC1,AMSC2)、人骨髓来源的MSC2株(BMSC1,BMSC2)、人GC株(U87,U251,SF126)、人GSC株(hG008,hG021)(引用文献3)使用miRNeasy Serum/Plasma kit(QIAGEN)，通过QIAcube(QIAGEN)automation system提取RNA。RNA测序分析通过委托Macrogen Inc.的分析来进行。

另外，已经报告了的切除神经胶质母细胞瘤的RNA测序数据使用了NCBI ShortRead Archive(SRR359290and SRR359291)的数据库(引用文献4)。

基因表达的差异使用DESeq2 suite of bioinformatics tools，通过Benjamini-Hochberg法以p＝0.001、并且以log2 fold-change ratio为10倍作为截止值。

配体-受体配对分析

配体-受体配对参照已经报告的数据库(引用文献5)。精选了2552对配体-受体对(引用文献6)，在某细胞间确认了配体和受体的两者的表达时，作为匹配的对选出(参照图8)。

单细胞RNA测序

对于已经报告的切除神经胶质母细胞瘤的单细胞RNA测序数据进行了再研究(引用文献7)。

＜结果＞

首先，为了提取自排斥信号途径，对于自分泌相互作用进行了评价。着眼于自排斥的理由是因为，NSC和MSC在无肿瘤状态下即使单独移植，在脑内行为也不同。NSC扩散而植活，MSC形成细胞块(图9)。另外该植活的样子与GSC(扩散的植活)和GC(细胞块形成)类似[Tamura R.Mol Brain.2019]，因而GSC与GC的差异也是有力的信息。其结果在NSC-NSC和GSC-GSC之间鉴定了92对配体-受体对(图10)。这些在MSC中没有被鉴定。

根据富集分析(用于判定特定的基因集与表达比之间有无相关的分析)，提示了这些对与Eph/ephrin排斥信号的关系。特别是与MSC相比，EphB/ehrinB在NSC中上调。实际上有EphB/ephrinB参与GSC的浸润这样的报告(引用文献8)。由此提示，特别是EphB/ephrinB产生NSC彼此的自排斥，与扩散的植活有关。

接着，关于GSC与NSC或MSC的傍分泌相互作用进行了评价。即，有GSC释放的配体、和感受该配体的NSC的受体，认为该对与指向性有关。在NSC与GSC之间确认了27对配体-受体对。但是，这些在本发明者的体外(in vitro)的神经胶质瘤细胞株中表达并未上升。该结果提示，可能体外(in vitro)培养的GSC未能完全反映脑内的神经胶质母细胞瘤。于是，本发明者使用已经报告的切除的神经胶质母细胞瘤的RNA测序数据，进行了生物信息学(insilico)配体-受体配对分析。其结果在被切除的神经胶质母细胞瘤与NSC之间确认了8对配体-受体对。着眼于到目前为止报告较多的CXCL12/CXCR4信号(引用文献2)。其结果CXCR4在NSC中高表达，在MSC中没有确认表达。CXCL12与在体外(in vitro)培养的GSC相比，在切除的神经胶质母细胞瘤中高表达。

进而，本发明者再研究了已经报告的神经胶质母细胞瘤的单细胞RNA测序的数据。其结果是，在由于聚集在神经胶质母细胞瘤周围的微小环境而被知晓的肿瘤浸润巨噬细胞中也确认了CXCL12的高表达。体外(in vitro)培养的GSC中CD14、CD163这样的巨噬细胞标志物为低表达。这些数据提示了，脑内的肿瘤浸润巨噬细胞的CXCL12也可能产生表达CXCR4的NSC(MSC不表达)的指向性。

由以上可以得出如下结论：由EphB-ephrinB产生的自排斥反应、和由CXCL12-CXCR4产生的指向性参与，这两因子带来了具有NSC对神经胶质母细胞瘤的指向性的迁移。到目前位置没有发现指出NSC和MSC对神经胶质母细胞瘤的迁移/指向性的差异、和产生该差异的关键分子的报告。另外，CXCL12在其他恶性肿瘤(胰癌等)中被指出高表达，因而也预想对神经胶质母细胞瘤以外的肿瘤的迁移性。

＜引用文献＞

1.Kim,S.U.,Jeung,E.B.,Kim,Y.B.,Cho,M.H.,Choi,K.C.Potential tumor-tropic effect of genetically engineered stem cells expressing suicide enzymesto selectively target invasive cancer in animal models.Anticancer Res.31:1249-1258(2011).

2.Vescovi,A.L.,Galli,R.,Reynolds,B.A.Brain tumour stem cells.Nat RevCancer.6:425-436(2006).

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6.Ramilowski,J.A.et al.A draft network of ligand-receptor-mediatedmulticellular signalling in human.Nat Commun.22,7866(2015).

7.Neftel,C.et al.An Integrative Model of Cellular States,Plasticity,and Genetics for Glioblastoma.Cell.178,835-849(2019).

8.Nakada,M.et al.The phosphorylation of ephrin-B2 ligand promotesglioma cell migration and invasion.Int J Cancer.126:1155-1165(2010).

〔实施例3〕

(A)背景

本发明者显示诱导多能干细胞(iPS细胞)来源的神经干细胞/祖细胞(NSC)对肿瘤组织、损伤脑显示高的迁移能力，因此考察了作为治疗基因的细胞运输载体利用的治疗法。作为治疗基因，使用酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)融合基因(yCD-UPRT))，通过利用基因组编辑技术插入到iPS细胞的持家基因座(ACTB)，从而实现恒常的稳定表达。

到这里对iPS细胞进行基因导入后，通过耐药性基因/荧光基因进行细胞的选择，但临床应用时，期望尽可能除去耐药性基因等外来基因。另外，CRISPR-Cas9等基因组编辑技术存在由突变进入非目标场所的脱靶效应带来的安全性担心。最近，作为新的基因组编辑技术开发了CRISPR/Cas3，被报告由于比CRISPR/Cas9识别靶标序列长，因而脱靶效应的频率低。

(B)发明概要

为了制作安全性高的治疗用干细胞，开发了在使用脱靶效应低的基因组编辑技术将治疗基因导入iPS细胞之后，除去用于细胞选择的外来基因的新技术。

具体地，制作将yCD-UPRT融合基因/耐药性基因/荧光基因使用基因组编辑技术CRISPR/Cas3插入了持家基因座(ACTB)的iPS细胞。荧光/药剂选择后，使用Cre/loxP系统除去外来基因(耐药性基因/荧光基因)。此外，被导入了自杀基因(编码能代谢前药而转换为杀肿瘤物质的酶的基因)的细胞通过前药施与而自身灭亡[Tamura R.Neurosurgicalreview.2019]。

(C)方法

＜人iPS细胞＞

使用的人iPS细胞(1210B2)从京都大学iPS细胞研究所(CiRA)获得。1210B2通过使用附加型载体在人外周血单核细胞中导入重编程因子的方法(Okita K,Yamakawa T,Matsumura Y,Sato Y,Amano N,Watanabe A,Goshima N,Yamanaka S.An efficientnonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stemcells from cord blood and peripheral blood cells.Stem Cells.2013Mar；31(3):458-66.)而构建。人iPS细胞接种在经iMatrix-511(ニッピ社制)涂覆的塑料培养皿中，使用Stem Fit AK03或AK03N培养基(味の素社制)通过已知的无饲养层(feeder-free)的方法(Nakagawa M,Taniguchi Y,Senda S,Takizawa N,Ichisaka T,Asano K,Morizane A,DoiD,Takahashi J,Nishizawa M,Yoshida Y,Toyoda T,Osafune K,Sekiguchi K,YamanakaS.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of humaninduced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014Jan 8；4:3594.)进行维持培养。

＜由人iPS细胞向神经干/前体细胞(NSC)的分化诱导＞

由人iPS细胞向NSC的分化诱导通过已知的方法(Sugai K,Fukuzawa R,ShofudaT,Fukusumi H,Kawabata S,Nishiyama Y,Higuchi Y,Kawai K,Isoda M,Kanematsu D,Hashimoto-Tamaoki T,Kohyama J,Iwanami A,Suemizu H,Ikeda E,Matsumoto M,Kanemura Y,Nakamura M,Okano H.Pathological classification of human iPSC-derived neural stem/progenitor cells towards safety assessment oftransplantation therapy for CNS diseases.Mol Brain.2016Sep 19；9(1):85.)进行。首先在iPS细胞的培养基中添加10μM ROCK抑制剂Y276352(和光纯药工业社制)，孵育1～3小时后，用PBS洗涤，使用TrypLE Select(Life Technologies社制)分散成单一细胞。将分散成单一细胞的人iPS细胞悬浮在添加了10μM ROCK抑制剂Y276352的EB(类胚体，embryoidbody)形成培养基(在未添加C液的Stem Fit培养基中添加10μM SB431542,100nM LDN-193189)中，在低粘附96孔培养板(Prime Surface 96V，住友ベークライト社制)的每1孔中以9.0×10 ³细胞/75μl接种，进行培养。1天后加入EB形成培养基75μl，以后，每天交换一半量的EB形成培养基，培养13～14天培养，从而得到EB。从各孔回收EB，在NS(neurosphere)培养基(在D-MEM/Ham’s F-12培养基(含有HEPES)(和光纯药工业社制)中添加20ng/ml重组人表皮生长因子(PeproTech社制),20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子-2(PeproTech社制),10³单位/ml重组人白血病抑制因子(ナカライテスク社制),2％B-27supplement(ThermoFisher Scientific社制),1单位/ml肝素钠(エイワイファーマ社制))培养7天。培养基交换在培养第3天或第4天进行1次。将细胞块离心回收，使用TrypLE Select(胰蛋白酶替代物)分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中。以1×10 ⁵细胞/ml的浓度接种在低粘附瓶(Corning社制)中，每隔3～4天进行培养基交换，培养10天，从而获得1次NSC。同样地，将1次NSC离心回收，使用TrypLE Select分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中，以1×10⁵细胞/ml的浓度接种在低粘附瓶中，每隔3～4天进行培养基交换，培养7～10天，从而获得2次、3次、4次、5次NSC。

＜利用CRISPR/Cas3对ACTB基因区域的yCD-UPRT基因导入-治疗用干细胞(Therapeutic stem cell:TSC)的制作＞

在ACTB基因区域导入了yCD-UPRT基因的iPS细胞的制作(TiPS1,2)

使用CRISPR/Cas3基因组编辑技术，制作在持家基因区域ACTB(β-肌动蛋白)插入了yCD-UPRT融合自杀基因的iPS细胞。用于基因组编辑的同源重组用载体在ACTB(β-肌动蛋白)基因区域装入yCD-UPRT，因而制作了以ACTB与yCD-UPRT以2A肽序列连接，在其下游被loxP序列夹着的IRES序列、嘌呤霉素耐性基因、2A肽、荧光蛋白质Venus相连的形式被插入那样的构建物(HR-ACTB-2A-yCD-UPRT-loxP-IRES-嘌呤霉素-2A-Venus-loxP)。作为基因组切割用载体，制作了表达以ACTB的终止密码子附近作为靶标的crRNA和一系列的Cas3相关蛋白质的构建物(Cas3-crRNA-All-in)。将这些构建物通过电穿孔导入人iPS细胞株(1210B2)，在嘌呤霉素S存在下进行培养，通过集落挑取进行克隆。同源重组iPS细胞株(TiPS1)的确认通过利用各克隆的基因组PCR和基因组测序的碱基序列确认来进行。作为Cre/loxP重组用载体，制作了在EF启动子的下游连接了荧光蛋白质mCherry、IRES序列、Cre蛋白、人类生长激素多聚腺苷化信号而成的构建物(EF-mCherry-IRES-Cre-hCGpolyA)。将该构建物通过电穿孔导入TiPS1中，通过分拣而克隆发出mCherry的荧光、且Venus的荧光消失了的细胞(图15和16)。选择标志物除去iPS细胞株(TiPS2)的确认通过利用各克隆的基因组PCR和基因组测序的碱基序列确认来进行。

yCD-UPRT表达NSC的制作(TSC1,2)

由在ACTB中装入了yCD-UPRT的iPS细胞(TiPS1,2)向NSC进行分化诱导，获得2次～5次NSC。TSC1是由TiPS1分化诱导而得的选择标志物序列残存的治疗用NSC，TSC2是由TiPS2分化诱导而得的除去了选择标志物序列的治疗用NSC(图17)。由于显示即使除去选择标志物(TSC2)，细胞的增殖、CD的表达量等也未见变化，因而以TSC1作为比校对象进行了培养。在TSC1培养基中通常添加嘌呤霉素S1μg/ml进行培养。确认了TSC1和2通过在培养基中添加5-氟胞嘧啶(5-FC)1-7μg/ml而细胞死亡被诱导。细胞死亡的评价使用了作为细胞增殖/细胞毒性测定试剂盒的Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo Molecular Technologies,Kumamoto,Japan)来进行。

TiPSC1,2,TSC1,2的基因表达分析

通过实时qPCR，将基因组未编辑iPS细胞株(iPS-nega)、TiPSC1、TSC1、TiPSC2、TSC2、使用CRISPR/Cas9进行了基因组编辑的iPS-Cas9、NSC-Cas9的mRNA表达进行了比校。使用TB Green(注册商标)Premix Ex Taq ^TMII(タカラバイオ)，测定GAPDH、ACTB、yCD-UPRT、嘌呤霉素耐性基因、Venus基因的mRNA表达量，用ACTB的表达量将各基因的表达量归一化。

TSC1,2的抗肿瘤效果的确认(TSC1,2)

使用低粘附96孔培养板(Prime Surface 96V，住友ベークライト社制)，将神经胶质瘤细胞株U87(1×10⁴个)或神经胶质瘤干细胞株hG008(1×10⁴个)与TSC1或者TSC2(5×10³个)共培养1天，然后添加5-FC(2μg/ml)，在5天后使用作为细胞增殖/细胞毒性测定试剂盒的Cell Counting Kit-8(CCK-8)评价了细胞死亡。

(D)结果

＜向NSC的化诱导＞

TiPS1和TiPS2通过上述方法能够无问题地分化诱导成NSC(TSC1和TSC2)。TSC1确认了Venus荧光蛋白质的标记(图17B)。基因表达在TiPS1和TSC1中确认了yCD-UPRT和选择标志物表达，在TiPS2和TSC2中确认了yCD-UPRT的表达和选择标志物未表达(图17C)。另外，通过GAPDH或者ACTB的表达量修正了的yCD-UPRT的表达量与iPS-Cas9、NSC-Cas9没有大差异。(图17C)。此外，与ACTB相比yCD-UPRT的表达量为25～50％左右，但这是因为杂合地插入。

＜TSC1,2对嘌呤霉素的耐性＞

TSC1由于嘌呤霉素耐性基因，可以通过嘌呤霉素添加而无问题地选择细胞。TSC2被嘌呤霉素立即杀灭，通过Cre/loxP系统确认了嘌呤霉素耐性基因如预计那样被删除了(图18)。

＜TSC1,2对5-FC的敏感性＞

TSC1,2均对5-FC的敏感性良好，以1μg/ml的浓度完全灭亡(图19)。与同样地对ACTB基因座通过CRISPR/Cas9导入yCD-UPRT而制作的NSC的敏感性为同等(图19)。

＜TSC1,2的抗肿瘤效果＞

将TSC1,2与神经胶质瘤细胞株U87和神经胶质瘤干细胞hG008细胞株共培养，施与5-FC(2μg/ml)。细胞死亡通过CCK-8检测进行了评价，结果任一者都在前药施与后发生了显著的肿瘤细胞死亡(图20)。对单独的U87和hG008，即使施与5-FC，也不特别发生肿瘤细胞死亡(图20)。

〔实施例4〕

(A)突变loxP序列的概要

如图21A所示，lox序列由上游重复序列、间隔序列、下游重复序列组成。已经开发了在各部位插入了突变的突变lox序列(图21A中的下划线为突变部位)。

在将lox71与lox66重组的情况下，一方为lox71/66，另一方为loxP(图21B)。lox71/66由于在两端有突变，因而不易被Cre识别。因此，如果使得基因组中残留lox71/66，则能够提高安全性。另外，在间隔序列中有突变的lox2272只能与相同的lox2272发生重组(图21C)。

(B)背景

(1)使用Cre/突变lox系统的抗菌剂耐性基因的除去法

为了提高实施例3中记载的耐药性基因/荧光基因的删除法的安全性，开发了代替loxP使用突变loxP序列(臂区域突变)的耐药性基因/荧光基因的删除法。

Cre/loxP系统通过表达Cre蛋白质而能够删除被loxP所夹的DNA序列(耐药性基因等)，但最终残留1个loxP序列，因而有万一与Cre反应的危险性。于是，为了降低其危险性，开发了将预订要删除的DNA序列(耐药性基因等)用在重复序列中具有突变的loxP(lox71和lox66)夹入的方法。作为loxP的突变序列的lox71在上游重复序列部分装入了突变，lox66在下游重复序列部分装入了突变。该结果是将所夹的基因删除后残留的lox71/66融合序列在两端具有突变，因而与Cre反应的危险性极低，能够实现更安全的基因治疗(图22B)。

(2)使用Cre/突变lox系统的第2基因插入方法

开发了使用突变loxP序列(间隔序列突变)，插入第2基因且删除耐药性基因/荧光基因的方法。

突变lox2272由于在间隔序列具有突变，因而具有通过Cre而与相同的突变lox序列反应的特性。利用该特性，能够利用间隔序列突变loxP实现目的基因的同源重组(在实施例中，被lox71-lox2272所夹的区域与被lox66-lox2272所夹的区域的重组)。其结果能够除了自杀基因还插入了其他治疗基因(第2基因)，并且删除药剂基因。Cre/突变lox系统通过Cas3等基因组编辑技术，导入效率高且脱靶问题极少，是安全的(图22C)。

(C)方法

(1)耐药性/标志物基因的除去

通过电穿孔将Cas3表达质粒(图23(1))和ACTB重组质粒(图23(2))导入人iPS细胞，将人iPS细胞基因组的ACTB终始密码子替换成2A-yCD/UPRT-lox71-IRES-嘌呤霉素耐性基因-2A-Venus-lox66。将1μg/ml的嘌呤霉素添加到培养基中进行培养，选择发生了重组的细胞。在同一细胞再次通过电穿孔导入EF-mCherry-IRES-Cre质粒(图23(4))，72小时后克隆了Venus-/mCherry+的细胞。由克隆出的细胞提取基因组，通过PCR扩增插入部位的DNA并确认带长，然后通过测序确认序列。然后，向NS/PCs分化诱导。

(2)第2基因的插入

将Cas3表达质粒(图23(1))和ACTB重组质粒(图23(3))通过电穿孔导入人iPS细胞，将人iPS细胞基因组的ACTB终止密码子替换成2A-yCD/UPRT-lox71-IRES-嘌呤霉素耐性基因-2A-Venus-lox2272。将1μg/ml的嘌呤霉素加入培养基中进行培养，从而选择发生了重组的细胞。将包含EF-mCherry-IRES-Cre和lox66-IRES-AmCyan-lox2272序列的质粒(图23(5))再次通过电穿孔导入同一细胞中，在72小时后克隆了Venus-/AmCyan+/mCherry+的细胞。由克隆出的细胞提取基因组，通过PCR扩增插入部位的DNA并确认了带长，然后确认基因序列。然后，向NS/PCs分化诱导。

(3)基因表达的确认

通过实时qPCR将(1)和(2)中选择的细胞的mRNA表达进行了比校。使用TB Green(注册商标)Premix Ex Taq ^TMII(タカラバイオ)测定GAPDH、ACTB、yCD-UPRT、嘌呤霉素耐性基因、Venus、AmCyan的基因的mRNA表达量，用ACTB或者GAPDH的表达量将各基因的表达量归一化。

(4)抗肿瘤效果的确认

使用低粘附96孔培养板(Prime Surface 96V，住友ベークライト社制)，将神经胶质瘤干细胞株hG008(6×10 ³个)与(1)或者(2)中建立的NS/PCs(3×10 ³个)共培养1天，然后添加5-FC(5μg/ml)，在5天后进行细胞增殖/细胞毒性测定试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测。

(D)结果

(1)耐药性/标志物基因的除去

建立了插入了自杀基因、除去了耐药性基因/标志物的(装入了ACTB-2A-yCD/UPRT-lox71/66的)iPS细胞，能够分化诱导至胚状体(embryoid body:EB)和NS/PCs(图24)。通过基因组PCR和基因序列分析，确认了基因组正确地被装入(图25A～C)。

(2)第2基因的插入

建立了插入了自杀基因和第2基因、且除去了耐药性基因/标志物的(装入了ACTB-2A-yCD/UPRT-lox71/66-IRES-AmCyan-lox2272)iPS细胞，能够分化诱导至NS/PCs。在胚状体(embryoid body:EB)和NS/PCs中确认了第2基因的AmCyan的荧光(图26)。通过基因组PCR和基因序列分析，确认了基因组正确地被装入(图27A～C)。

(3)基因表达的确认

在(1)中建立的iPS细胞、NS/PCs中，能够确认yCD表达、Venus和嘌呤霉素耐性基因的消失(图28)。在(2)中建立的iPS细胞、NS/PCs细胞中，能够确认yCD和第2基因(AmCyan)的表达、Venus和嘌呤霉素耐性基因的消失(图28)。

进而，在(1)中建立的iPS细胞、NS/PCs细胞中，确认了通过5-FC和嘌呤霉素的施与而细胞灭亡(图29)。在(2)中建立的iPS细胞、NS/PCs细胞中，确认了通过5-FC和嘌呤霉素的施与而细胞灭亡(图30)

(4)抗肿瘤效果的确认

将在(1)或者(2)中建立的NS/PCs与神经胶质瘤干细胞株hG008共培养，施与5-FC(5μg/ml)。细胞死亡通过CCK-8检测进行了评价，结果任一者在前药施与后都发生了显著的肿瘤细胞死亡(图31)。

〔实施例5〕对脑肿瘤以外的肿瘤的效果

以下，作为脑肿瘤以外的肿瘤的1例记载了对胰癌的作用，但对于其他肿瘤也具有同样的作用。

(A)背景

消化器官癌的罹患率高，特别是胰癌是2016年的男性的癌死亡数的第5位(17060例)、女性的癌死亡数的第3位(16415例)，在女性中超过了胃癌的死亡数[参照日本国立癌研究中心癌信息服务]。作为5年相对生存率，胰癌在男性中为7.9％、女性中为7.5％，与其他脏器癌相比是预后最不良的[全癌协部位别临床病期别10年相对生存率]。进行利用了手术、化学疗法、放射线疗法的多学科治疗，但由于作为全身施与的化学疗法的副作用强，并且考虑容易造成远端转移的性质、以及对肿瘤动脉的浸润等方面原因，现状是诊断时就已经被判定为不能切除或难以根治切除的状态的例子也较多，因此期望开发新的治疗法。作为对胰癌的主要化学疗法剂之一使用5-FU，本发明者建立的自杀基因导入iPS细胞来源的NS/PCs对恶性肿瘤显示指向/迁移性，因而能够在肿瘤局部施与高浓度的抗癌剂5-FU。

(B)方法

将人胰癌细胞株BxPC3 5×10 ⁶个移植到NOD/SCID小鼠(6周、雌)的左侧腹部皮下。7天后背部皮下移植、或尾静脉施与自杀基因yCD-UPRT导入iPS-NS/PCs(ffLuc)5×10 ⁵个(图32)。NS/PCs预先感染了ffLuc(Venus荧光蛋白质与Luc2萤火虫萤光素酶的融合基因)表达慢病毒载体(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y,Tsuji O,Kumagai G,Hara CM,Okano HJ,Miyawaki A,Toyama Y,Okano H,Nakamura M.Comparative study of methods foradministering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury inmice.Cell Transplant.2011；20(5):727-39.)，获得了稳定地高表达ffLuc的NS/PCs。

同一个体的NS/PCs的经时变化利用IVIS活体成像系统进行了观察。IVIS拍摄时在异氟醚吸入麻醉下腹腔内施与200μl的VivoGlo ^TM萤光素30mg/ml，在达到峰的10分钟进行了拍摄(图33A和B)。

(C)结果

在背部皮下移植了iPS-NS/PCs(ffLuc)的模型小鼠中，通过IVIS，在18天后在胰癌移植部位(左侧腹部)确认了信号聚集。在尾静脉施与后的模型小鼠中，在施与当天在肺集中，但3天后开始渐渐在胰癌移植部位(左侧腹部)观察到信号聚集，18天后看到非常强的聚集。

由以上表明，iPS-NS/PCs对胰癌也显示强的指向/迁移性，iPS-NS/PCs对胰癌也能够作为良好的细胞运输载体使用(图33A和B)。

本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。

产业可利用性

本发明的肿瘤治疗细胞制剂、中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂能够作为药物使用，本发明能够在药物制造等产业中利用。

序列表

<110> 学校法人庆应义塾

<120> 使用了基因组编辑多能干细胞的治疗药

<130> FP-239PCT

<150> JP 2020/063477

<151> 2020-3-31

<150> JP 2020/165847

<151> 2020-9-31

<150> JP 2020/219455

<151> 2020-12-28

<160> 44

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> loxP

<400> 1

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lox71

<400> 2

taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lox66

<400> 3

ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> lox2272

<400> 4

ataacttcgt ataggatact ttatacgaag ttat 34

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gacgtggagg aaaatcccg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gggtcggatc taccgttcg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 7

ccctggagaa gagctacgag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 8

cgggattttc ctccacgtca 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 9

aagtcttcta acatgcggtg ac 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 10

ggtgtacaga gtggtgtcct 20

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 11

cagccatgta cgttgctatc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 12

attttcctcc acgtcaccgc 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 13

aggaagtctt ctaacatgcg gt 22

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 14

ggtcggatct accgttcgt 19

<210> 15

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<212> DNA

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<223> 引物

<400> 15

ttctaacatg cggtgacgtg g 21

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 16

gtcagtctcc acaatctgct t 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 17

gcagaggaag tcttctaaca tgc 23

<210> 18

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<212> DNA

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<400> 18

aagggacttc ctgtaacaac g 21

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<212> DNA

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ctggcatcgt gatggactc 19

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<212> DNA

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<223> 引物

<400> 20

acacttggcc tcatttttaa ggt 23

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<212> DNA

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aagtactccg tgtggatcgg 20

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gtcacacttg gcctcatttt taag 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tccatcatga agtgtgacgt g 21

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tcacacttgg cctcattttt aagg 24

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<400> 25

gacgtggagg aaaatcccg 19

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<212> DNA

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<223> 引物

<400> 26

gggtcggatc cataacttcg 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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cgggattttc ctccacgtca 20

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<212> DNA

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aagtcttcta acatgcggtg ac 22

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<212> DNA

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ggtgtacaga gtggtgtcct 20

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<212> DNA

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cagccatgta cgttgctatc 20

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attttcctcc acgtcaccgc 20

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aggaagtctt ctaacatgcg gt 22

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aagggacttc ctgtaacaac g 21

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ctggcatcgt gatggactc 19

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Claims

1.中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，包含由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞，自杀基因被插入到了多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游，

自杀基因是胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。

2.由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞用于制造脑功能障碍的治疗剂的用途，

其中，自杀基因被插入到了多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游，

3.由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞用于制造外伤性脑损伤的治疗剂的用途，

4.由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞用于制造脊髓损伤的治疗剂的用途，

5.由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞用于制造神经变性疾病的治疗剂的用途，

6.由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞用于制造脑肿瘤的治疗剂的用途，

7.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游连接有编码2A肽的序列，在编码该2A肽的序列的3’侧连接有自杀基因。

8.根据权利要求1或7所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是在其基因组中不包含选择标志物基因的神经干细胞。

9.根据权利要求8所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是通过包括以下的工序(A)～(D)的方法得到的神经干细胞，

工序(A)，是通过基因组编辑而在多能干细胞的基因组中插入基因构建物的工序，

所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、和Cre蛋白质的二个靶标序列，并且选择标志物基因夹在Cre蛋白质的二个靶标序列之间的基因构建物，

工序(D)，使工序(C)中得到的多能干细胞分化成神经干细胞。

10.根据权利要求9所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，Cre蛋白质的靶标序列是loxP序列。

11.根据权利要求9所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因构建物所包含的Cre蛋白质的二个靶标序列是在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，在基因构建物中，在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游，在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游。

12.根据权利要求8所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是通过包括以下的工序(a)～(d)的方法得到的神经干细胞，

工序(a)，是通过基因组编辑在多能干细胞的基因组中插入基因构建物的工序，

所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且选择标志物基因夹在所述二个突变loxP序列之间的基因构建物，

工序(c)，是在通过Cre蛋白质和同源重组载体从工序(b)中得到的多能干细胞的基因组除去选择标志物基因的同时，在基因组中插入第2基因的工序，

所述同源重组载体是包含第2基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且第2基因夹在所述二个突变loxP序列之间的同源重组载体，

工序(d)，使工序(c)中得到的多能干细胞分化成神经干细胞。

13.根据权利要求9～12中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因组编辑是利用CRISPR/Cas3的基因组编辑。

14.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，与能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药一起使用。

15.根据权利要求1或7所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使选自肝配蛋白A受体、肝配蛋白A、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量增加了的神经干细胞。

16.根据权利要求15所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的表达量增加了的神经干细胞。

17.根据权利要求1或7所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量作为指标挑选出的神经干细胞。

18.根据权利要求17所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4作为指标挑选出的神经干细胞。

19.神经干细胞的制造方法，其特征在于，包括以下的工序(1)和(2)，

工序(1)，通过基因组编辑，在多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游插入自杀基因，

工序(2)，使工序(1)中得到的多能干细胞向神经干细胞分化，

20.根据权利要求19所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，在工序(1)中，以在β-肌动蛋白基因的翻译区域下游连接编码2A肽的序列，在该编码2A肽的序列的3’侧连接自杀基因的方式，将自杀基因插入到多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游。

21.根据权利要求19或20所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，工序(1)包括以下的工序(1-A)～(1-C)，

工序(1-A)，是通过基因组编辑在多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游插入基因构建物的工序，

22.根据权利要求21所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，Cre蛋白质的靶标序列是loxP序列。

23.根据权利要求21所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，基因构建物所包含的Cre蛋白质的二个靶标序列是在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，在基因构建物中，在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游，在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游。

24.根据权利要求19或20所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，工序(1)包括以下的工序(1-a)～(1-c)，

工序(1-a)，是通过基因组编辑，在多能干细胞的β-肌动蛋白基因的翻译区域下游插入基因构建物的工序，

工序(1-c)，是在通过Cre蛋白质和同源重组载体从工序(1-b)中得到的多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因的同时，在基因组中插入第2基因的工序，

所述同源重组载体是包含第2基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且第2基因夹在所述二个突变loxP序列之间的同源重组载体。

25.根据权利要求21所述的神经干细胞的制造方法，其特征在于，基因组编辑是利用CRISPR/Cas3的基因组编辑。