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CN115461474A - 用于评估阿尔茨海默病的蛋白标志物 - Google Patents

用于评估阿尔茨海默病的蛋白标志物 Download PDF

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CN115461474A
CN115461474A CN202180027051.1A CN202180027051A CN115461474A CN 115461474 A CN115461474 A CN 115461474A CN 202180027051 A CN202180027051 A CN 202180027051A CN 115461474 A CN115461474 A CN 115461474A
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CN
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plasma
serum
whole blood
subject
protein
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Application number
CN202180027051.1A
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叶玉如
傅洁瑜
江源冰
周晓璞
叶翠芬
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Hong Kong University of Science and Technology
Original Assignee
Hong Kong University of Science and Technology
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Abstract

本发明提供了与阿尔茨海默病(AD)相关的人的血液样品(如血浆、血清或全血样品)中存在的蛋白标志物，AD的诊断和治疗方法以及用于诊断AD的试剂盒。

Description

用于评估阿尔茨海默病的蛋白标志物
相关申请
本申请要求2020年5月14日提交的美国临时专利申请第63/024,940号的优先权，所述美国临时专利申请的内容在此出于所有目的通过引用以其整体并入。
发明背景
脑疾病如神经退行性疾病和神经炎性病症是影响大部分人群的破坏性病况。许多是不能治愈的，高度衰弱的，并且经常导致脑结构和功能随时间的渐进性退化。疾病患病率也由于世界范围内增长的老年人口而迅速增加，因为老年人处于发展这些病况的高风险中。目前，由于对许多神经退行性疾病和神经炎性病况的病理生理学的了解有限，因此这些疾病难以诊断。同时，目前的治疗无效，不能满足市场需求；由于人口老龄化，需求每年都在显著增加。例如，阿尔茨海默病(AD)的特点是学习和记忆的逐渐但渐进式下降，并且是老年人死亡的主要原因。AD患病率的增加正在推动对更好诊断的需要和需求。根据阿尔茨海默病国际组织(Alzheimer’s Disease International)，该疾病目前在全球影响了4680万人，但预计未来30年病例数将是三倍。中国是老年人口增长最快的国家之一。基于人口预测，到2030年，四分之一的人将超过60岁，这将使很大一部分人面临患AD的风险。事实上，从1990年到2010年，中国的AD病例数目从370万翻了一番，达到920万，预计到2050年中国将有2250万病例。中国香港的人口也在快速老龄化。据估计，到2025年，65岁以上的老年人将占人口的24％，到2050年，65岁以上的老年人将占人口的39.3％。预计到2039年AD病例的数目将上升到332,688。
更令人担忧的是，尽管AD患病率增加，但许多人未能得到正确的AD诊断。根据阿尔茨海默病国际组织的2015年世界阿尔茨海默病报告，在高收入国家，仅20-50％的痴呆病例记录在初级护理中。其余仍未诊断或诊断不正确。这种“治疗缺口(treatment gap)”在低收入国家和中等收入国家更为显著。在没有正式诊断的情况下，患者将无法获得他们所需的治疗和护理，他们或他们的护理者也没有资格获得关键支持计划。早期诊断和早期干预是缩小治疗缺口的两个重要手段。因此，可以快速地且准确地确定疾病风险的早期诊断工具在许多层面上具有显著的治疗价值。研究已经证实早在记忆丧失或认知下降的实际症状真正显现之前，AD就影响了大脑。然而，到目前为止，还没有用于早期检测的诊断工具；到患者使用目前可用的涉及主观临床评估的方法诊断为AD时，通常病理症状已经处于晚期状态。因此，为了改善AD治疗和长期管理的目的，迫切需要开发新的且有效的方法用于AD的早期诊断或用于检测增加的患者以后发展AD的风险。本发明通过公开与血浆或血清或全血蛋白标志物或它们的组合的使用相关的新方法和试剂盒来解决这种和其它相关需要，以评估发展成阿尔茨海默病(AD)的个体风险。
发明内容
本发明涉及与阿尔茨海默病(AD)相关的新型血浆蛋白标志物的发现。因此，本发明提供了用于诊断AD以及用于指示治疗AD的药剂的治疗功效的方法和组合物。因此，在第一方面，本发明提供了用于评估对象以后发展AD的风险的方法。所述方法包括以下步骤：
(1)将所述对象的选自表1-4的任一种蛋白质的血浆或血清或全血水平或浓度分别与未患有AD或处于增加的AD风险的平均健康对象的血浆或血清或全血中发现的相同蛋白质的标准对照水平进行比较；(2)检测到所述对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有正β值)的血浆或血清或全血水平高于所述标准对照水平，或者所述对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有负β值)的血浆或血清或全血水平低于所述标准对照水平；以及(3)将所述对象确定为具有增加的AD风险。虽然表2中鉴定的429种蛋白质中的任一种都适合用于该方法，但在一些情况下，所述蛋白质选自表1中列出的74种蛋白质、或表4中列出的19种蛋白质、或表3中列出的12种蛋白质。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(1)之前，测量蛋白质的血浆或血清或全血水平的步骤。在一些实施方案中，测量步骤通过从对象获得血浆或血清或全血样品的步骤进行。在一些实施方案中，当在步骤(3)中确定对象具有增加的AD风险时，然后向对象提供增加的后续监测(例如，与健康护理专业人员对类似年龄和医学背景的无风险或低风险人员规定的常规监测相比增加频率的监测测试)或如本公开内容中所述的治疗。
在第二方面，本发明提供了用于评估两个对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(i)将第一对象的选自表1-4的任一种蛋白质的血浆或血清或全血水平分别与第二对象的相同蛋白质的血浆或血清或全血水平进行比较；(ii)检测到所述第二对象的蛋白质的血浆或血清或全血水平分别高于所述第一对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有正β值)的血浆或血清或全血水平，或者检测到所述第二对象的蛋白质的血浆或血清或全血水平分别低于所述第一对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有负β值)的血浆或血清或全血水平；以及(iii)将所述第二对象确定为具有比所述第一对象更高的以后发展AD的风险。虽然表2中鉴定的429种蛋白质中的任一种都适合用于该方法，但在一些实施方案中，所述蛋白质选自表1中列出的74种蛋白质、或表4中列出的19种蛋白质、或表3中列出的12种蛋白质。在一些实施方案中，所述方法还包括测量蛋白质的血浆或血清或全血水平的步骤。在一些实施方案中，当在步骤(iii)中确定对象具有较高的AD风险时，然后向对象给予增加的后续监测(例如，与健康护理专业人员对类似年龄和医学背景的无风险或低风险人员规定的常规监测相比增加频率的监测测试)或如本公开内容中所述的治疗，然而被认为具有较低的AD风险的另一名对象受到健康护理专业人员对类似年龄和医学背景的无风险或低风险人员规定的常规监测。
在第三方面，本发明提供了用于评估对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险或者用于评估AD治疗方案的治疗功效的试剂盒。所述试剂盒包含能够测定所述对象的独立地选自表2中列出的429种蛋白质的任何5种、10种、15种或20种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平或浓度的试剂。在一些实施方案中，所述蛋白质独立地选自表1中列出的74种蛋白质、或表4中列出的19种蛋白质、或表3中列出的12种蛋白质。在一些实施方案中，所述试剂盒可另外包含能够测定对象的β淀粉样蛋白42、β淀粉样蛋白40和神经丝轻链多肽(NfL)中的每一种的血浆或血清或全血水平或浓度的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含所述蛋白质中每一种的标准对照，所述标准对照反映未患有AD或处于增加的AD风险的平均健康对象的血浆或血清或全血中发现的相同蛋白质的水平/浓度。
在第四方面，本发明提供了用于评估对象中的AD风险或用于评估AD治疗方案的治疗功效的检测芯片。所述芯片包含固体基底和能够测定所述对象的独立地选自表2中列出的429中蛋白质的任何5种、10种、15种或20种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平的试剂，其中每种试剂固定在所述基底上的可寻址位置。在一些实施方案中，所述蛋白质独立地选自表1中列出的74种蛋白质、或表4中列出的19种蛋白质、或表3中列出的12种蛋白质。
在第五方面，本发明提供了用于评估对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)通过将一组值输入到公式中来计算预测得分：
Figure GDA0003931695910000041
以及(2)将得分为0至0.25±0.05的对象确定为具有低的AD风险，将得分高于0.25±0.05至0.80±0.01的对象确定为具有中等的AD风险，以及将得分高于0.80±0.01至1的对象确定为具有高的AD风险。在该方法中，所述一组值包括表3中列出的12种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平，并且所述蛋白质的加权系数(βi)和截距(ε)在表5-8中列出。
在一些实施方案中，所述一组值由表3中的12种蛋白质中的每一种的血浆或血清或全血水平组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表5中，并且得分为0至0.25的对象具有低的AD风险；得分高于0.25至0.79的得分的对象具有中等的AD风险；得分高于0.79至1的对象具有高的AD风险。
在一些实施方案中，所述一组值由表4中的19种蛋白质中的每一种的血浆或血清或全血水平组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表6中，并且得分为0至0.21的对象具有低的AD风险；得分高于0.21至0.8的得分的对象具有中等的AD风险；得分高于0.8至1的对象具有高的AD风险。
在一些实施方案中，所述一组值由β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，以及表3中的12种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平之间的比值组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表7中，并且得分为0至0.20的对象具有低的AD风险；得分高于0.20至0.80的对象具有中等的AD风险；得分高于0.80至1的对象具有高的AD风险。
在一些实施方案中，所述一组值由β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，以及表4中的19种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平之间的比值组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表8中，并且得分为0至0.30的对象具有低的AD风险；得分高于0.30至0.80的对象具有中等的AD风险；得分高于0.80至1的对象具有高的AD风险。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(1)之前测量所述蛋白质的血浆或血清或全血水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法另外包括在测量步骤之前从对象获得血浆或血清或全血样品的另一步骤。在一些实施方案中，当在步骤(2)中确定对象具有高的AD风险时，然后给予对象增加的后续监测(例如，与健康护理专业人员对类似年龄和医学背景的无风险或低风险人员规定的常规监测相比增加频率的监测测试)和如本公开内容中所述的治疗。当在步骤(2)中确定对象具有中等的AD风险时，然后给予他如本公开内容中所述的增加的后续监测(例如，与健康护理专业人员对类似年龄和医学背景的无风险或低风险人员规定的常规监测相比增加频率的监测测试)。当对象被确定为具有低的AD风险时，然后给予他通常由医生对AD的无风险或低风险的人规定的常规监测。
在第六方面，本发明提供了用于评估两个对象中的阿尔茨海默病(AD)的相对风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(i)通过将一组值输入到公式中来计算所述两个对象中的每一个的预测得分：
Figure GDA0003931695910000061
以及(ii)将具有较高得分的对象确定为具有比其它对象更高的AD风险。在该方法中使用的一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平、NfL的血浆或血清或全血水平、表2中列出的至少一种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且相应的加权系数(βi)列于表1、2、3、4和9中。
在一些实施方案中，所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平、NfL的血浆或血清或全血水平、表2中列出的蛋白质的任何组合的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且相应的加权系数(βi)列于表1、2、3、4和9中。
在一些实施方案中，所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，表1、3或4中列出的至少一种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且相应的加权系数(βi)在表1、3、4和9中列出。
在一些实施方案中，所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，独立地选自表1、3或4的至少五种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且相应的加权系数(βi)在表1、3、4和9中列出。
在一些实施方案中，所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，独立地选自表1、3或4的至少十种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且相应的加权系数(βi)在表1、3、4和9中列出。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(i)之前测量每种蛋白质的血浆或血清或全血水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法另外包括在测量步骤之前从对象获得血浆或血清或全血样品的步骤。在一些实施方案中，当在步骤(ii)中确定对象具有较高的AD风险时，然后给予对象增加的后续监测(例如，与健康护理专业人员对类似年龄和医学背景的无风险或低风险人员规定的常规监测相比增加频率的监测测试)或如本公开内容中所述的治疗，然而被认为具有较低的AD风险的另一名对象受到健康护理专业人员对AD的无风险或低风险人员规定的常规监测。
在第七方面，本发明提供了用于评估用于治疗对象中的阿尔茨海默病(AD)的治疗剂的功效的方法，所述对象已经被诊断患有AD。所述方法包括以下这些步骤：(1)将施用治疗剂之前的对象的选自表1-4的任一种蛋白质的血浆或血清或全血水平与施用治疗剂之后的对象的蛋白质的血浆或血清或全血水平进行比较；(2)检测到在施用所述治疗剂之后所述对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有正β值)的血浆或血清或全血水平降低或者所述对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有负β值)的血浆或血清或全血水平增加；以及(3)将所述治疗剂确定为对治疗AD有效。在一些实施方案中，所述蛋白质选自表1。在一些实施方案中，所述蛋白质选自表3。在一些实施方案中，所述蛋白质选自表4。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(1)之前在施用之前和之后测量蛋白质的血浆或血清或全血水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在测量步骤之前，在施用之前和之后从对象获得血浆或血清或全血样品。
在一些实施方案中，当在步骤(3)中认为治疗剂对治疗AD有效时，对象将通过施用治疗剂继续其治疗；当在步骤(3)中认为治疗剂对治疗AD无效时，对象将停止通过施用治疗剂的治疗；相反，对象将通过施用不同的治疗剂开始AD治疗。
附图简述
图1：基于利用12种血浆蛋白的模型预测AD风险。(a)基于中国HK中国人AD群组中12种蛋白质(列于表3中)的血浆水平的AD预测模型的接收者操作特征(ROC)曲线。(b)按表型分类的AD预测得分的分布(对于来自中国HK中国人AD群组的NC和AD患者分别为n＝71和101)。预测的AD风险阶段由AD预测得分的分布定义(低：0-0.25；中等：0.25-0.79；高：0.79-1.0)。
图2：基于利用19种血浆蛋白的模型预测AD风险。(a)基于中国HK中国人AD群组中19种蛋白质(列于表4中)的血浆水平的AD预测模型的接收者操作特征(ROC)曲线。(b)按表型分类的AD预测得分的分布(对于来自中国HK中国人AD群组的NC和AD患者分别为n＝71和101)。预测的AD风险阶段由AD预测得分的分布定义(低：0-0.21；中等：0.21-0.8；高：0.8-1.0)。
图3：基于利用血浆Aβ42/40比、血浆NfL和12种血浆蛋白的模型预测AD风险。(a)基于中国HK中国人AD群组中血浆Aβ42/40比、血浆NfL和12种蛋白质(列于表3中)的血浆水平的AD预测模型的接收者操作特征(ROC)曲线。(b)按表型分类的AD预测得分的分布(对于来自中国HK中国人AD群组的NC和AD患者分别为n＝71和101)。预测的AD风险阶段由AD预测得分的分布定义(低：0-0.2；中等：0.2-0.8；高：0.8-1.0)。
图4：基于利用血浆Aβ42/40比、血浆NfL和19种血浆蛋白的模型预测AD风险。(a)基于中国HK中国人AD群组中血浆Aβ42/40比、血浆NfL和19种蛋白质(列于表4中)的血浆水平的AD预测模型的接收者操作特征(ROC)曲线。(b)按表型分类的AD预测得分的分布(对于来自中国HK中国人AD群组的NC和AD患者分别为n＝71和101)。预测的AD风险阶段由AD预测得分的分布定义(低：0-0.3；中等：0.3-0.8；高：0.8-1.0)。
定义
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物。所有三个术语都适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
在本公开内容中，术语“生物样品”或“样品”包括组织切片(如活检和尸检样品)和出于组织学目的而取的冷冻切片，或任何此类样品的加工形式。生物样品包括血液和血液部分或产物(例如，全血，血液(血清、血浆)的无细胞部分和血细胞)，痰或唾液，淋巴和舌组织，培养的细胞，例如原代培养物，外植体和转化的细胞，粪便，尿液，胃活检组织等。生物样品通常获自真核有机体，其可以是哺乳动物，可以是灵长类动物并且可以是人类对象。
术语“免疫球蛋白”或“抗体”(在本文中可互换使用)是指具有由两条重链和两条轻链组成的基本四条多肽链结构的抗原结合蛋白，所述链例如通过链间二硫键稳定，所述抗原结合蛋白具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链都折叠成结构域。
术语“抗体”还指抗体的抗原结合片段和表位结合片段，例如Fab片段，其可用于免疫亲和测定中。有许多充分表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键的抗体C-末端以产生F(ab)’2,F(ab)’2是Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下被还原以断裂铰链区中的二硫键，从而将(Fab’)2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有部分铰链区的Fab(对于其它抗体片段的更详细描述，参见，例如Fundamental Immunology,Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。尽管就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但本领域技术人员将理解，可以通过化学方法或通过利用重组DNA方法从头合成片段。因此，术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生或使用重组DNA方法合成的抗体片段。
当在描述特定分子与蛋白质或肽的结合关系的上下文中使用时，短语“特异性结合”是指确定蛋白质在蛋白质和其它生物制品的异质群体中存在的结合反应。因此，在指定的结合测定条件下，指定的结合剂(例如抗体)以背景的至少两倍与特定蛋白结合，并且基本上不与样品中存在的其它蛋白质大量结合。在这样的条件下抗体的特异性结合可能需要针对其对特定蛋白质或蛋白质而不是其类似的“姐妹”蛋白质的特异性而选择的抗体。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质或以特定形式特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(对于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见，例如Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual(1988))。通常，特异性或选择性结合反应是背景信号或噪声的至少两倍，更通常是背景的10-100倍以上。另一方面，术语“特异性结合”在提及与另一个多核苷酸序列形成双链复合物的多核苷酸序列的上下文中使用时，描述了基于Watson-Crick碱基配对的“多核苷酸杂交”，如在术语“多核苷酸杂交方法”的定义中所提供的。
如在本申请中使用的，“增加”或“降低”是指来自比较对照，例如已确立的标准对照(如在来自未诊断患有AD且没有增加的AD风险的健康对象的样品中发现的特定蛋白质的平均水平/量)的量的可检测的正或负变化。增加是正变化，其通常为对照值的至少10％、或至少20％、或50％、或100％，并且可以高达对照值的至少2倍、或至少5倍、或甚至10倍。类似地，降低是负变化，其通常为对照值的至少10％、或至少20％、30％或50％，或甚至高达对照值的至少80％或90％。以与上述相同的方式在本申请中使用表示与比较基础的定量变化或差异的其它术语，如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”。相比之下，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示与标准对照值相比数量变化很小或没有变化，通常在标准对照的±10％内、或在标准对照的±5％、2％内，或甚至更少的变化。
“标记物”、“可检测标记物”或“可检测部分”是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和可通过例如将放射性组分掺入蛋白质中而可检测的或用于检测与蛋白质特异性反应的抗体的蛋白质。通常，可检测标记物与具有确定结合特点的探针或分子(例如，对多肽抗原具有已知结合特异性的抗体)连接，以便允许容易地检测探针(以及因此其结合靶标)的存在。
本申请中使用的术语“量”是指样品中存在的目的物质如目的多肽的量。这样的量可以用绝对术语表示，即样品中物质的总量，或者用相对术语表示，即样品中物质的浓度。
本文所用的术语“对象”或“需要治疗的对象”包括由于AD的风险(例如，具有家族史)或已经被诊断为AD而寻求医学看护的个体。对象还包括当前经历治疗的个体，其寻求治疗方案的操作。需要治疗的对象或个体包括表现出AD症状或者处于患有AD或其症状的风险中的那些对象或个体。例如，需要治疗的对象包括具有AD的遗传倾向或家族史的个体，过去已经经历相关症状的个体，已经暴露于触发物质或事件的个体，以及患有病况的慢性或急性症状的个体。“需要治疗的对象”可以处于生命的任何年龄。
靶蛋白的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”分别用于指使用蛋白质结合或信号传导的体外和体内测定鉴定的抑制、活化或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂及其同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和活化剂。抑制剂是例如部分或完全阻断、降低、预防、延迟活化、失活、脱敏或下调靶蛋白活性的试剂。在一些情况下，抑制剂直接或间接结合蛋白质，如中和抗体。本文所用的抑制剂与灭活剂和拮抗剂同义。活化剂是例如刺激、增加、促进、增强活化、敏化或上调靶蛋白活性的试剂。调节剂包括靶蛋白的配体或结合配偶体，包括天然存在的配体和合成设计的配体的修饰，抗体和抗体片段，拮抗剂，激动剂，小分子，包括含碳水化合物的分子，siRNA，RNA适配体等。
本申请中使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”描述了导致预定医学病况的任何症状的消除、减少、减轻、逆转、预防和/或延迟发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病况涵盖对该病况的治疗性和预防性干预。
本文所用的术语“有效量”是指产生施用物质的治疗效果的量。所述效果包括预防、校正或抑制疾病/病况的症状和相关并发症进展至任何可检测的程度。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1卷-第3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage Calculations(1999))。
本文所用的术语“标准对照”是指包含预定量的分析物的样品，以指示这种类型的样品(例如，预定的DNA/mRNA或蛋白质)中存在的该分析物的量或浓度，所述样品取自未患有预定疾病或病况(例如，阿尔茨海默病)或者处于发展预定疾病或病况(例如，阿尔茨海默病)的风险中的平均健康对象。当在描述值的上下文中使用时，该术语还可以用于简单地指存在于“标准对照”样品中的该分析物的量或浓度。
在描述不患有相关疾病或病症(例如AD)且不处于发展相关疾病或病症的风险的健康对象的上下文中使用的术语“平均”是指诸如人样品(例如血清或血浆或全血)中的相关蛋白质的水平的某些特点，其是不患有所述疾病或病症且不处于发展所述疾病或病症的风险的随机选择的健康人的组别的代表。该选择的组别应该包括足够数目的人对象，使得这些个体中目的分析物的平均量或浓度以合理的准确度反映一般健康人群中的相应特征。任选地，选择的对象组别可被选择为具有与测试其相关疾病或病症的适应症或风险的人的背景类似的背景，例如匹配或相当的年龄、性别、种族和病史等。
本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶标生物过程或对生物标志物(例如蛋白质)水平的任何可检测的负面影响。通常，抑制反映为与不存在这种抑制的对照相比时，指示生物过程或其下游效应或生物标志物水平的一个或多个参数至少10％、20％、30％、40％或50％的降低。术语“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”以类似的方式定义，不同之处在于指示正面影响，即，正面变化为与对照相比至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％或甚至更多。术语“抑制剂”和“增强剂”分别用于描述表现出如上所述的抑制或增强作用的试剂。在本公开内容中还以类似方式使用的是术语“增加”、“降低”、“更多”和“更少”，其意在指示一个或多个预定参数至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％或甚至更多的正变化，或者一个或多个预定参数至少10％、20％、30％、40％、50％、80％或甚至更多的负变化。
本文所用的术语“中国人”是指华人，其及其祖先已经在中国的历史领土(包括内地和中国香港)居住了一段时间，例如，至少最近的3代、4代、5代、6代、7代或8代或最近的100年、150年、200年、250年或300年。
发明详述
I.引言
阿尔茨海默病(AD)是世界上最常见的痴呆形式之一，占所有痴呆病例的60-70％。它是一种不可逆的退行性脑病，并且是老年人中死亡的主要原因。这种疾病的标志是细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块的沉积和细胞内神经原纤维缠结，这导致记忆、推理、判断和运动能力下降，症状随时间推移而恶化。
目前，全世界估计有3500万人患有AD。由于更长的预期寿命，预计到2050年这一数字将显著上升至1亿。AD无法治愈；并且该疾病的病理生理学仍相对未知。美国食品和药物管理局(FDA)批准的治疗AD的药物只有五种，但这些药物仅减轻症状而不是改变疾病病理学，因为它们不能逆转病况或防止进一步恶化，并且在严重病况中无效。因此，早期诊断和早期治疗干预在AD的管理中至关重要。研究已经证实早在记忆丧失或认知下降的实际症状真正显现之前，AD就影响大脑。然而，迄今为止，还没有用于早期检测AD的有效和可靠的诊断工具；在使用当前使用的涉及主观的临床评估的标准方法将患者诊断为患有AD时，病理症状已经处于晚期阶段。本公开内容提供了利用一种或多种蛋白质标志物来评估AD风险以帮助早期诊断的高性能诊断方法。
II.标志物蛋白的定量
A.获得样品
实施本发明的第一步是从被测试的对象获得血液样品以评估发展AD的风险或者监测AD严重程度或进展。相同类型的样品应取自对照组(未患有AD且没有增加的AD风险的正常个体)和测试组(例如测试可能的AD或增加的AD风险的对象)。为此目的，通常遵循在医院或诊所中常规使用的标准程序。
为了检测标志物蛋白的存在/量或者评估测试对象中发展AD的风险的目的，采集个体患者的血液样品，并且可以测量相关标志物蛋白(例如，β淀粉样蛋白40、β淀粉样蛋白42、NfL或者表1-4中鉴定的一种或多种蛋白质)的血清/血浆或全血水平，然后与标准对照比较。如果当与对照水平相比时观察到这些标志物蛋白中的一种或多种的水平增加或降低(取决于表1-4中提供的蛋白的β值)，则认为测试对象患有AD或具有以后发展病况的升高的风险。为了监测AD患者的疾病进展或评估在AD患者中的治疗有效性的目的，可以在不同的时间点采集个体患者的血液样品，从而可以测量个体标志物蛋白的水平以提供指示疾病状态的信息。例如，当患者的标志物蛋白水平显示出随时间推移增加或降低的一般趋势时，认为患者的AD严重程度改善，或者认为患者已经接受的治疗有效(取决于如表中所示的蛋白质标志物的具体β值)。患者的标志物蛋白水平没有实质性变化指示AD状态没有变化以及给予患者的治疗无效。
此外，本申请的发明人已经设计了新的计算方法以基于多种标志物蛋白水平(例如，β淀粉样蛋白40、β淀粉样蛋白42、NfL或者表1-4中鉴定的一种或多种蛋白质)产生综合风险得分，以评估个体的AD风险或者评估两个或更多个个体之间的相对AD风险。
B.制备用于蛋白质检测的样品
来自对象的血液样品适用于本发明，并且可以通过众所周知的方法并且如标准医学文献中所述获得。在本发明的某些应用中，血清或血浆或全血可以是优选的样品类型。在其它情况下，可以使用全血样品。
使用本发明的方法从要测试或监测AD的人获得血液样品。从个体采集血液样品根据医院或诊所通常遵循的标准方案进行。收集适量的血液，并可以在进一步制备之前根据标准程序储存。
在对根据本发明的患者样品中发现的标志物蛋白的分析可以使用例如血清或血浆或全血进行。制备用于蛋白质提取/定量检测的患者样品的方法在本领域技术人员中是众所周知的。
C.测定标志物蛋白的水平
可以使用多种免疫测定来检测任何特定身份的蛋白质，如β淀粉样蛋白40、β淀粉样蛋白42、NfL或者表1-4中鉴定的任一种。在一些实施方案中，可以通过用对蛋白质具有特异性结合亲和力的抗体从测试样品中捕获蛋白质来进行夹心测定。然后可以用对其具有特异性结合亲和力的标记抗体检测该蛋白质。这种免疫测定可以使用微流体装置如微阵列蛋白芯片进行。也可以通过凝胶电泳(如2维凝胶电泳)和使用特异性抗体的蛋白质印迹分析来检测目的蛋白(例如，β淀粉样蛋白40、β淀粉样蛋白42、NfL或者表1-4中鉴定的一种或多种蛋白质)。可选地，使用适当的抗体，标准免疫组织化学技术可以用于检测给定蛋白质(例如，β淀粉样蛋白40、β淀粉样蛋白42、NfL或者表1-4中鉴定的一种或多种蛋白质)。单克隆和多克隆抗体(包括具有所需结合特异性的抗体片段)均可用于多肽的特异性检测。可以通过已知技术产生对特定蛋白质(例如，β淀粉样蛋白40、β淀粉样蛋白42、NfL或者表1-4中鉴定的一种或多种蛋白质)具有特异性结合亲和力的此类抗体及其结合片段。
在实施本发明时，也可以使用其它方法来测量标志物蛋白的水平。例如，已经基于质谱技术开发了多种方法来快速和准确地定量靶蛋白，即使在大量样品中亦如此。这些方法涉及高度复杂的设备，如使用多反应监测(MRM)技术的三重四极杆(三重Q)仪器，基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪(MALDI TOF/TOF)，使用选择性离子监测(SIM)模式的离子阱仪器以及基于电喷雾电离(ESI)的QTOP质谱仪。参见，例如，Pan等人,J ProteomeRes.2009February；8(2):787–797。
III.建立标准对照
为了建立用于实施本发明方法的标准对照，首先选择一组没有AD或如常规定义的发展AD的风险增加的健康人。这些个体在适当的参数内，如果适用，用于使用本发明的方法筛选和/或监测AD的目的。任选地，个体具有与测试对象相同的性别、相似的年龄或相似的种族背景。
所选择的个体的健康状态通过充分确立的、常规使用的方法来确认，所述方法包括但不限于个体的一般身体检查和其病史的一般回顾。
此外，选择的健康个体组别必须具有合理的大小，使得从该组获得的血清或血浆或全血样品中标志物蛋白的平均量/浓度可以合理地被认为是没有AD或AD风险增加的健康人群的一般群体中正常或平均水平的代表。优选地，选择的组别包含至少10、20、30或50个人类对象。
一旦基于在选择的健康对照组的每个对象中发现的个体值建立标志物蛋白的平均值，该平均值或中值或代表值或概况被认为是标准对照。也在同一过程中确定标准偏差。在一些情况下，可以为具有不同特点(如年龄、性别或种族背景)的单独定义的组别建立单独的标准对照。
IV.监测和治疗
在相关方面，本发明还提供了在检测到AD或在患者中以后发展AD的风险增加时AD患者的治疗方法。在一些实施方案中，所述方法包括在确定对象具有增加的AD风险时，向所述对象施用治疗，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(如多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀)、美金刚胺、谷氨酸受体阻断剂、西酞普兰、氟西汀、帕罗西汀(paroxeine)、舍曲林、曲唑酮、劳拉西泮、奥沙西泮、阿立哌唑、氯氮平、氟哌啶醇、奥氮平、喹硫平、利培酮、齐拉西酮、去甲替林、三环抗抑郁药、苯并二氮杂
Figure GDA0003931695910000161
羟基安定、唑吡坦、扎来普隆、水合氯醛、辅酶Q10、泛醌、珊瑚钙、银杏(Ginkgo biloba)、石杉碱甲、ω-3脂肪酸、磷脂酰丝氨酸或其任何组合。
在一些情况下，当完成以上和本文所述的诊断方法步骤时，任选地进行另外的诊断检查以提供进一步的证实信息(例如，通过经由CT扫描的脑成像或其他成像技术以显示脑体积的过度损失，或者通过测试认知能力以显示加速下降)，并且患者已经被确定为已经患有AD或处于以后发展AD的显著增加的风险，合适的治疗性或预防性方案可以由医师或其他医学专业人员指示来治疗患者，管理/减轻正在进行的症状，或者延迟疾病的未来发作。美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了多种胆碱酯酶抑制剂，包括多奈哌齐(AriceptTM，被批准用于治疗AD的所有阶段(包括中度至重度)的唯一胆碱酯酶抑制剂)、卡巴拉汀(ExelonTM，被批准用于治疗轻度至中度的AD)、加兰他敏(RazadyneTM，轻度至中度患者)和美金刚胺(NamendaTM)。多奈哌齐是被批准用于治疗AD的所有阶段(包括中度至重度)的唯一胆碱酯酶抑制剂。这些药物中的任何一种或多种可以开处方用于治疗已经根据本发明的方法被诊断患有AD的患者。治疗的另一种可能性是施用曲唑酮，其目前被批准用作抗抑郁药并且已经被报道为用于改善AD症状的有效药剂。
对于被认为在将来的时间处于发展高的AD风险或增加的风险但尚未表现出任何临床症状的患者，连续监测也是合适的，尤其是在增加的频率下。例如，可以对患者进行更频繁的预定定期测试(例如，每六个月一次、每年一次或每两年一次)，以检测其认知能力的任何加速变化。适用于此类定期监测的方法包括认知的一般实施者评估(GPCOG)、Mini-Cog、区分衰老和痴呆的八项信息访谈(AD8)以及老年人认知衰退的简短信息调查表(IQCODE)。此外，还可以推荐用曲唑酮进行预防性治疗。
V.试剂盒和装置
本发明提供了用于实施本文所述的方法以评估对象的血清/血浆或全血中的相关标志物蛋白水平的组合物和试剂盒，其可用于各种目的，如检测或诊断AD的存在，确定发展病况的风险以及监测患者中病况的进展，包括评估在已经接受疾病诊断并已经经历治疗的患者中对病况施用的疗法的治疗功效。
用于进行测定标志物蛋白水平的测定的试剂盒通常包含用于特异性结合标志物蛋白氨基酸序列的至少一种抗体。任选地，该抗体用可检测部分标记。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些情况下，试剂盒可以包含至少两种不同的抗体，一种用于特异性结合标志物蛋白(即，第一抗体)，另一种用于检测第一抗体(即，第二抗体)，其通常与可检测部分连接。
通常，试剂盒还包含适当的标准对照。标准对照表示未患有AD或处于发展AD的增加的风险的健康对象的血清或血浆或全血中标志物蛋白的平均值。在一些情况下，这种标准对照可以以设定值的形式提供。此外，本发明的试剂盒可以提供指导手册以指导用户分析测试样品和评估测试对象中AD的存在或风险或者疾病状态/进展。
在另一方面，本发明还可以体现在装置或者包括一个或多个这样的装置的系统中，其能够执行本文描述的所有或一些方法步骤。例如，在一些情况下，装置或系统在接收到从被测试用于检测AD，评估发展AD的风险，或者评估疾病状态/进展的对象采集的血清或血浆或全血样品后执行以下步骤：(a)确定样品中标志物蛋白的量或浓度；(b)将所述量/浓度与标准对照值进行比较；以及(c)提供指示对象中是否存在AD或者对象是否处于发展AD的增加的风险中，或者相对于测试的另一个患者，患者是否具有以后发展AD的更高的风险的输出。在其它情况下，本发明的装置或系统在已经执行步骤(a)之后执行步骤(b)和(c)的任务，并且来自(a)的量或浓度已经被输入到装置中。优选地，装置或系统是部分或完全自动化的。
实施例
以下实施例仅以说明的方式提供，而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各种非关键参数。
引言
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病，其主要影响65岁以上的个体。其特征在于淀粉样蛋白β(Aβ)斑块的积聚和tau蛋白的神经原纤维缠结，以及脑中的突触功能障碍和神经元损失2。疾病症状包括记忆丧失、推理和判断受损以及运动能力降低3。全世界估计有4700万人患有该疾病，预计到2050年这一数字将上升到1.32亿4。然而，由于对该疾病的不完全理解和延迟诊断，目前尚无治愈方法，使得AD成为全世界公共卫生面临的最大威胁之一。
目前，AD诊断主要限于回顾病史、标准化记忆测试和医师专业知识，这可以说是主观的。采用诸如磁共振成像(MRI)和正电子放射断层造影术(PET)的成像技术，其检测脑中的结构变化和AD相关生物标志物Aβ和tau的存在，以及用于测量Aβ、tau和神经丝轻链多肽(NfL)的脑脊髓液(CSF)水平的蛋白质组学技术使得能够更准确地诊断和分类疾病5。然而，MRI和PET的高成本以及用于CSF收集的腰椎穿刺的侵入性性质使其无法进行常规临床检查，从而阻碍了它们用于AD的早期诊断。随着全世界AD病例数目的增加，发展侵入性较小和成本效益较高的诊断技术以促进在群体规模上对患者进行有效的AD筛选和分类是至关重要的。
在这种情况下，基于血液的AD测试将是理想的解决方案。最近的研究已经表明AD患者血液中改变的AD相关生物标志物水平(Aβ42/40比值、tau和NfL)指示疾病病理学，并且可以用于诊断目的6。然而，这些生物标志物中都不具有足够的诊断精度，这限制了它们的临床应用潜力7。一个主要原因是外周血液系统的组成更复杂并且不仅受脑而且受其它身体系统如外周、免疫、心血管和代谢系统的影响。因此，现有的AD相关生物标志物不能充分捕获血液中疾病相关的表型变化。实际上，研究已经表明细胞因子和血管生成蛋白在AD中也具有改变的血浆水平，并且其中一些已经通过实验证实了它们对AD病理学的贡献8。因此，开发针对AD的准确和敏感的基于血液的诊断测试需要更全面的蛋白质组学研究以充分捕获AD血浆特征。
在该研究中，除了测量AD相关生物标志物(Aβ和NfL)的血浆水平，本申请的发明人还测量了从中国香港中国人AD群组的180名老年人收集的样品中的429血浆蛋白的水平。通过整合这些AD相关蛋白的血浆水平，本申请的发明人已经开发了AD预测模型，其在很大程度上将AD患者与正常对照(NC)区分开。这些发现共同提供了用于评估AD风险的高性能的基于血液的策略。
材料和方法
对中国香港中国人AD群组的对象招募：招募了就诊香港中文大学威尔斯亲王医院专科门诊部的一组中国香港中国人参与者(对于AD和正常对照[NC]分别为n＝106和74)。所有参加者均≥60岁。AD的临床诊断是基于美国精神病学协会的精神疾病的诊断和统计手册，第5版(DSM-5)建立的9。所有参与者接受病史评估、用于认知和功能评估的蒙特利尔认知评估(MoCA)以及通过MRI的神经成像评估10。记录每个个体的数据，包括年龄、性别、教育、病史、心血管疾病史、脑区体积和白细胞计数。排除患有任何显著的神经疾病或精神障碍的个体。本研究得到了香港中文大学威尔斯亲王医院和香港科技大学的批准。所有参与者都为研究参与和样品收集提供了书面知情同意书。
来自血液样品的DNA和血浆提取：使用K3EDTA管(VACUETTE)从参与者收集全血(3mL)。将血液样品以2,000×g离心15分钟以分离细胞沉淀和血浆。收集血浆，等分，并在-80℃下储存直至使用。将细胞沉淀送到PanorOmic Science中心(Genomics andBioinformatics Cores,University of Hong Kong,Hong Kong,China)，使用QIAsymphonySP平台(QIAGEN)上的QIAsymphony DSP DNA Midi Kit(QIAGEN)进行基因组DNA提取。将基因组DNA用水或洗脱缓冲液ATE(QIAGEN)洗脱并储存在4℃。通过BioDropμLITE+(BioDrop)测定DNA浓度。
血浆蛋白的检测：通过Olink生物标志物组测量429种蛋白质的血浆水平，所述生物标志物组包括心血管代谢、心血管II、心血管III、细胞调节、发育、免疫应答、炎症、新陈代谢、神经探索性、神经病学、肿瘤学II、肿瘤学III和器官损伤。通过Quanterix NF-lightSimoa Assay Advantage Kit和Neurology 3-Plex A Kit测量“ATN”生物标志物(即，Aβ40/42、tau和神经丝轻链多肽[NfL])的血浆水平。
全基因组测序、变体调用和主成分分析：将参与者的DNA样品提交至Novogene进行文库构建和WGS。样品在Illumina HiSeq X(平均深度：5×)上测序。使用GotCloudpipeline11分析覆盖候选变体上游和下游500千碱基的基因组区域。存储在VCF文件中的基因型结果用于主成分分析。前五个主成分由具有以下参数的PLINK软件生成：–pca headertabs、--maf 0.05、--hwe 0.00001和--not-chr x y。
对血浆蛋白与AD之间关联的分析：来自GenABEL包的R rntransform函数用于标准化基于秩的血浆蛋白水平。使用以下线性模型(βi，相应因素的加权系数；ε，线性方程的截距)，基于标准化蛋白水平与AD表型之间的关联、调整年龄、性别、病史和群体结构(即前五个主成分)，确定AD中血浆蛋白的改变：
标准化蛋白质水平～β1AD+β2年龄+β3性别+βi疾病+βjPCj+ε
AD预测得分的产生：对于每个预测模型，通过使用以下公式将发现群组中参与者的候选蛋白的血浆水平和AD表型信息拟合到逻辑回归模型中来产生相应候选蛋白的加权系数(βi)和截距(ε)：
Figure GDA0003931695910000211
使用以下线性模型，基于候选蛋白的血浆水平以及相应的加权系数(βi)和截距(ε)计算个体AD预测得分：
Figure GDA0003931695910000212
预测的AD风险阶段由AD预测得分的分布定义，分为低风险、中风险和高风险组别。
对预测准确性的评价：R plot.roc和auc函数用于产生AD风险预测的预测模型的接收器操作特性(ROC)曲线和相应的曲线下面积(AUC)。模型的预测准确性由AUC的值表示。
统计分析与数据可视化。进行蛋白质检测的研究者对人类参与者的表型不了解。通过线性回归分析，调整年龄、性别、病史和群体结构(即，使用全基因组测序数据从主成分分析获得的前5个主成分)来评估人类参与者中候选因素之间关联的显著性。显著性水平设定为P<0.05。使用GraphPad Prism 8.0版产生所有其它统计图。
实施例I：在评估AD风险中使用个体血浆蛋白的模型
测量从中国HK中国人AD群组(n＝180)收集的样品中429种血浆蛋白的水平(表2)。与NC相比，这429种血浆蛋白在AD中均显示出显著变化(p<0.05；表2)。特别地，74种新的血浆蛋白在AD中显示出强烈的改变(表1)。基于AD患者中74或429种血浆蛋白的改变的血浆水平，开发了一种评估工具，用于使用来自血浆蛋白的信息比较个体之间的AD风险。如果个体具有AD血液中升高的蛋白质的较高血浆水平(β>0)或AD血液中降低的蛋白质的较低血浆水平(β<0；表1，2)，则个体将具有较高的AD风险。
实施例II：通过整合12或19种血浆蛋白预测AD风险的模型
通过整合12种蛋白质(即CD164、CETN2、GAMT、GSAP、hK14、LGMN、NELL1、PRDX1、PRKCQ、TMSB10、VAMP5和VPS37A；表3)的血浆水平，本申请的发明人开发了准确预测AD风险的混合预测模型(AUC＝0.8916；图1a)。通过为个体分配AD预测得分来建立AD风险评分系统。所得得分区分NC和AD患者(表5和图1b)。基于预测的得分，进一步提出了三个AD风险阶段来预测疾病风险。AD预测得分低于0.25的个体将具有低的AD风险。通过比较，得分范围为0.25至0.79或得分大于0.79的个体将分别具有中等的或较高的AD风险。
通过进一步将7种血浆蛋白(即，AOC3、CASP-3、CD8A、KLK4、LIF-R、LYN和NFKBIE)的血浆水平整合到12-蛋白模型中(表4)，本申请的发明人开发了混合预测模型，其进一步改善AD风险的预测(AUC＝0.9661；图2a)。AD预测得分更好地区分NC和AD患者(表6和图2b)。AD预测得分低于0.21的个体将具有低的AD风险。通过比较，得分范围为0.21至0.8或得分大于0.8的个体将分别具有中等的或高的AD风险。
实施例III：预测AD风险的血浆AN生物标志物和12或19种血浆蛋白的组合模型
然后通过将血浆Aβ42/40比和血浆NfL水平(AN)整合到12种蛋白质或19种蛋白质模型中来开发组合预测模型。两种组合模型均改善了AD预测(对于AN+12种蛋白质和AN+19种蛋白质，AUC分别为0.9456和0.9855；图3a，4a)。此外，这两个组合模型产生清楚分离NC和AD患者的AD预测得分(表7-8和图3b，4b)。对于利用AN和12种蛋白质的模型，AD预测得分低于0.2，范围为0.2-0.8和大于0.8的个体将分别具有低的、中等的和高的AD风险。对于利用AN和19种蛋白质的模型，AD预测得分低于0.3、范围为0.3-0.8和大于0.8的个体将分别具有低的、中等的和高的AD风险。总之，这些结果表明，我们开发的AD风险预测模型充分利用了各种候选血浆蛋白在疾病病理中的作用，并且可以作为预测AD风险的高性能策略。
本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物(包括GenBank登录号和等同物)出于所有目的通过引用整体并入。
表1.与AD表型相关的74种血浆蛋白的列表。β，效应大小。
Figure GDA0003931695910000231
Figure GDA0003931695910000241
表2.与AD表型相关的429种血浆蛋白的列表。β，效应大小。
Figure GDA0003931695910000242
Figure GDA0003931695910000251
Figure GDA0003931695910000261
Figure GDA0003931695910000271
Figure GDA0003931695910000281
Figure GDA0003931695910000291
Figure GDA0003931695910000301
Figure GDA0003931695910000311
Figure GDA0003931695910000321
Figure GDA0003931695910000331
Figure GDA0003931695910000341
表3.用于AD风险预测和评价的12种血浆蛋白的列表。β，效应大小。
蛋白质名称 Uniprot ID β 倍数变化 P值
CETN2 P41208 -1.215 0.599 1.50E-13
PRKCQ Q04759 -1.123 0.761 9.09E-12
VPS37A Q8NEZ2 -1.151 0.522 1.17E-11
GAMT Q14353 -1.117 0.904 6.75E-11
TMSB10 P63313 -0.817 0.892 2.02E-06
PRDX1 Q06830 -0.746 0.834 3.14E-06
GSAP A4D1B5 -0.928 0.958 4.06E-06
VAMP5 O95183 -0.785 0.940 9.83E-06
CD164 Q04900 -0.722 0.954 8.02E-05
LGMN Q99538 -0.643 0.926 2.19E-04
hK14 Q9P0G3 0.530 1.220 3.08E-03
NELL1 Q92832 -0.338 0.850 2.84E-02
表4.用于AD风险预测和评价的19种血浆蛋白的列表。β，效应大小。
蛋白质名称 Uniprot ID β 倍数变化 P值
LYN P07948 -1.481 0.444 2.82E-21
CASP-3 P42574 -1.358 0.248 9.24E-19
CETN2 P41208 -1.215 0.599 1.50E-13
PRKCQ Q04759 -1.123 0.761 9.09E-12
VPS37A Q8NEZ2 -1.151 0.522 1.17E-11
GAMT Q14353 -1.117 0.904 6.75E-11
NFKBIE O00221 -1.171 0.550 1.87E-10
LIF-R P42702 0.722 1.139 1.18E-06
TMSB10 P63313 -0.817 0.892 2.02E-06
PRDX1 Q06830 -0.746 0.834 3.14E-06
GSAP A4D1B5 -0.928 0.958 4.06E-06
VAMP5 O95183 -0.785 0.940 9.83E-06
CD164 Q04900 -0.722 0.954 8.02E-05
LGMN Q99538 -0.643 0.926 2.19E-04
KLK4 Q9Y5K2 0.457 1.966 7.05E-04
AOC3 Q16853 -0.531 0.963 1.71E-03
CD8A P01732 0.509 1.201 1.82E-03
hK14 Q9P0G3 0.530 1.220 3.08E-03
NELL1 Q92832 -0.338 0.850 2.84E-02
表5.利用12种血浆蛋白的模型的加权系数(βi)和截距(ε)。
Figure GDA0003931695910000351
表6.利用19种血浆蛋白的模型的加权系数(βi)和截距(ε)。
Figure GDA0003931695910000361
表7.利用血浆Aβ42/40比、血浆NfL和12种血浆蛋白的模型的加权系数(βi)和截距(ε)。
Figure GDA0003931695910000362
表8.利用血浆Aβ42/40比、血浆NfL和19种血浆蛋白的模型的加权系数(βi)和截距(ε)。
Figure GDA0003931695910000371
表9.血浆Aβ42/40比和NfL水平的加权系数(βi)。
Figure GDA0003931695910000372
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Claims (43)

1.用于评估对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的方法，其包括：
(1)将所述对象的选自表1-4的任一种蛋白质的血浆或血清或全血水平与未患有AD或处于增加的AD风险的平均健康对象的血浆或血清或全血中发现的相同蛋白质的标准对照水平进行比较；
(2)检测到所述对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有正β值)的血浆或血清或全血水平相对于所述标准对照水平增加，或者检测到所述对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有负β值)的血浆或血清或全血水平相对于所述标准对照水平降低；以及
(3)将所述对象确定为具有增加的AD风险。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质选自表1。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质选自表3。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白质选自表4。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括在步骤(1)之前，测量所述蛋白质的血浆或血清或全血水平。
6.根据权利要求5所述的方法，其还包括在测量步骤之前，从所述对象获得血浆或血清或全血样品。
7.用于评估两个对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的方法，其包括：
(i)将第一对象的选自表1-4的任一种蛋白质的血浆或血清或全血水平与第二对象的相同蛋白质的血浆或血清或全血水平进行比较；
(ii)检测到所述第二对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有正β值)的血浆或血清或全血水平高于所述第一对象的所述蛋白质的血浆或血清或全血水平，或者检测到所述第二对象的蛋白质(其在表1、2、3或4中具有负β值)的血浆或血清或全血水平低于所述第一对象的所述蛋白质的血浆或血清或全血水平；以及
(iii)将所述第二对象确定为具有比所述第一对象更高的AD风险。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白质选自表1。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质选自表3。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述蛋白质选自表4。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其还包括在步骤(i)之前，测量所述蛋白质的血浆或血清或全血水平。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括在测量步骤之前，从所述对象获得血浆或血清或全血样品。
13.用于评估对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的试剂盒，其包含能够测定所述对象的独立地选自表2的任何5种、10种、15种或20种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平的试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述蛋白质选自表1。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述蛋白质选自表3。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述蛋白质选自表4。
17.根据权利要求13所述的试剂盒，其还包含能够测定所述对象的β淀粉样蛋白42、β淀粉样蛋白40和神经丝轻链多肽(NfL)中的每一种的血浆或血清或全血水平的试剂。
18.根据权利要求13所述的试剂盒，其还包含所述蛋白质中每一种的标准对照，所述标准对照反映未患有AD或处于增加的AD风险的平均健康对象的血浆或血清或全血中发现的相同蛋白质的水平。
19.用于评估对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的检测芯片，其包含固体基底和能够测定所述对象的独立地选自表2的任何5种、10种、15种或20种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平的试剂，其中每种试剂固定在所述基底上的可寻址位置。
20.根据权利要求19所述的芯片，其中所述蛋白质选自表1。
21.根据权利要求20所述的芯片，其中所述蛋白质选自表3。
22.根据权利要求21所述的芯片，其中所述蛋白质选自表4。
23.用于评估对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的方法，其包括：
(1)通过将一组值输入到公式中来计算预测得分：
Figure FDA0003877883970000031
以及
(2)将得分为0至0.25±0.05的对象确定为具有低的AD风险，将得分高于0.25±0.05至0.80±0.01的对象确定为具有中等的AD风险，以及将得分高于0.80±0.01至1的对象确定为具有高的AD风险，
其中所述一组值包括表3中列出的12种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平，并且其中所述蛋白质的加权系数(βi)和截距(ε)在表5-8中列出。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一组值由表3中的12种蛋白质中的每一种的血浆或血清或全血水平组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表5中，并且其中得分为0至0.25的对象具有低的AD风险；得分高于0.25至0.79的对象具有中等的AD风险；得分高于0.79至1的对象具有高的AD风险。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述一组值由表4中的19种蛋白质中的每一种的血浆或血清或全血水平组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表6中，并且其中得分为0至0.21的对象具有低的AD风险；得分高于0.21至0.8的对象具有中等的AD风险；得分高于0.8至1的对象具有高的AD风险。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述一组值由β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，以及表3中的12种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平之间的比值组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表7中，并且其中得分为0至0.20的对象具有低的AD风险；得分高于0.20至0.80的对象具有中等的AD风险；得分高于0.80至1的对象具有高的AD风险。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述一组值由β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，以及表4中的19种蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平之间的比值组成，相应的加权系数(βi)和截距(ε)列于表8中，并且其中得分为0至0.30的对象具有低的AD风险；得分高于0.30至0.80的对象具有中等的AD风险；得分高于0.80至1的对象具有高的AD风险。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其还包括在步骤(1)之前，测量所述蛋白质的血浆或血清或全血水平。
29.根据权利要求28所述的方法，其还包括在测量步骤之前，从所述对象获得血浆或血清或全血样品。
30.用于评估两个对象中的阿尔茨海默病(AD)的风险的方法，其包括：
(i)通过将一组值输入到公式中来计算所述两个对象中的每一个的预测得分：
Figure FDA0003877883970000051
以及
(ii)将具有较高得分的对象确定为具有比其它对象更高的AD风险，
其中所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平、NfL的血浆或血清或全血水平、表2中列出的至少一种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且其中相应的加权系数(βi)列于表1、2、3、4和9中。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平、NfL的血浆或血清或全血水平、表2中列出的蛋白质的任何组合的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且其中相应的加权系数(βi)列于表1、2、3、4和9中。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，表1、3或4中列出的至少一种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且其中相应的加权系数(βi)在表1、3、4和9中列出。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，独立地选自表1、3或4的至少五种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且其中相应的加权系数(βi)在表1、3、4和9中列出。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述一组值包括β淀粉样蛋白42和β淀粉样蛋白40的血浆或血清或全血水平，NfL的血浆或血清或全血水平，独立地选自表1、3或4的至少十种蛋白质的血浆或血清或全血水平之间的比值，并且其中相应的加权系数(βi)在表1、3、4和9中列出。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其还包括在步骤(i)之前，测量所述蛋白质中每一种的血浆或血清或全血水平。
36.根据权利要求35所述的方法，其还包括在测量步骤之前，从所述对象获得血浆或血清或全血样品。
37.评估用于治疗对象中的阿尔茨海默病(AD)的治疗剂的功效的方法，其包括：
(1)比较在向所述对象施用所述治疗剂之前和之后所述对象的选自表1-4的任一种蛋白质的血浆或血清或全血水平；
(2)检测到在施用所述治疗剂之后所述对象的所述蛋白质(其在表1、2、3或4中具有正β值)的血浆或血清或全血水平降低或者所述对象的所述蛋白质(其在表1、2、3或4中具有负β值)的血浆或血清或全血水平增加；以及
(3)将所述治疗剂确定为对治疗AD有效。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质选自表1。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质选自表3。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质选自表4。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其还包括在步骤(1)之前，在施用之前和之后测量所述蛋白质的血浆或血清或全血水平。
42.根据权利要求41所述的方法，其还包括在测量步骤之前，在施用之前和之后从所述对象获得血浆或血清或全血样品。
43.根据权利要求1-12和23-42中任一项的方法，其中所述对象是中国人后裔。
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