CN115490766B - 一种人pf4的特征多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人PF4的特征多肽及其应用，所述多肽的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，所述序列SEQ ID NO:1：VRPRHITSL；所述序列SEQ ID NO:2：DLQAPL；所述序列SEQ ID NO:3：KKIIKKLLES。本发明提供的人PF4的特征多肽制备方法简便快捷，易于获取。在检测应用时，将PF4与肝素类药物混合孵育后，使用胃蛋白酶进行酶解反应，脱盐富集后，通过多反应监测技术即可完成PF4与肝素类药物形成的复合物的检测，所需检测设备要求低、分析检测速度快，检测成本较低，可以作为肝素类药物免疫原性的评价方法之一。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人PF4的特征多肽及其应用。
背景技术
血小板因子4（platelet factor 4, PF4）又称趋化因子配体4（chemokine (C-X-Cmotif) ligand 4, CXCL4），属于趋化因子超家族的CXC亚族。由骨髓巨核细胞合成后储存在α-颗粒中，当血小板受到内源性或外源性刺激被激活后，PF4从血小板的α-颗粒中释放出来。人体内PF4主要以四聚体存在，其单体的分子量为7.8 kDa，含有70个氨基酸残基。与其它CXC趋化因子的亚族蛋白相同，PF4氨基酸序列中含有4个高度保守的半胱氨酸残基。PF4的赖氨酸残基Lys-61、Lys-62、Lys-65和Lys-66构成了PF4的主要肝素结合结构域，Arg-20、Arg-22、Lys-46、Arg-49协同参与肝素与PF4的结合。并且4个Lys组成的结构域对PF4的生物活性有至关重要的作用。PF4主要的生理功能是促进凝血，当人体出现创伤时，血小板活化释放出PF4，释放出的PF4通过与内皮细胞结合来修复伤口，防止人体失血过多；PF4还能通过中和肝素来抑制肝素介导的AT III信号通路，从而促进凝血。
HIT（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）是在使用肝素类药物过程中可能引起的不良反应之一，会导致局部静脉栓塞和血栓形成，严重时致人死亡。HIT的发生机制首先由人体内的PF4与肝素类药物发生相互作用形成复合物；机体对该复合物产生抗体，抗体再进一步与复合物结合形成多分子免疫原复合物。多分子复合物会激活血小板，并引起血小板聚集，从而导致血小板减少。因此快速对PF4和肝素类药物产生的复合物的大小和数量进行检测表征具有十分重要的应用价值和意义。
分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography, SEC）是表征混合物中各部分组成的分子量和含量占比最常用的方法，其也广泛应用于蛋白质与蛋白质或蛋白质与小分子相互作用形成复合物的表征。分子排阻色谱法可以通过用标准物质建立标准曲线来预测高聚物的分子量。但由于血小板因子4-肝素复合物分子量太大，没有合适的标准物质对其分子量进行标定，难以被准确有效的测定。而且分子排阻色谱法需要将血小板因子4与肝素类药物形成的复合物直接通过色谱柱，复合物在色谱柱内有可能分解，从而影响检测结果的准确性。
多角度光散射（Multi angle light scattering，MALS）也是一种常用来绝对定量分子量大小及其含量的方法，是一种基于静态光散射技术的使用多角度光散射在宽广的散射角范围内通过进行测量物质光学性质从而得到其分子量大小及含量的检测方法。多角度光散射测量分子量大小时，无须做任何理论假设，测量结果不依赖于标准品，是一种直接、绝对的测量方法。但其检测需要的样品量一般为毫克级，血小板因子4的价格较高，做样成本较高，因为在实际应用中检测成本较高，不适合规模化应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种人PF4的特征多肽，
所述人PF4的特征多肽应用于PF4与肝素类药物形成的复合物检测时对设备要求低，分析检测速度快，检测成本低，可以作为肝素类药物免疫原性的评价方法之一。
为了实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种人PF4的特征多肽，所述多肽的序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。
进一步地，所述序列SEQ ID NO：1：VRPRHITSL。
进一步地，所述序列SEQ ID NO：2：DLQAPL。
进一步地，所述序列SEQ ID NO：3：KKIIKKLLES。
进一步地，所述SEQ ID NO：1肽段的质荷比m/z=360.2；所述SEQ ID NO：2肽段的质荷比m/z=656.4；所述SEQ ID NO：3肽段的质荷比m/z=400.6。
第二方面，本发明提供一种所述人PF4的特征多肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：重悬PF4后，加入甲酸调节pH为2-3，加入胃蛋白酶（pepsin）进行酶解；
步骤2：取酶解溶液脱盐富集，真空干燥后低温保存即得。
进一步地，步骤1中所述的PF4与胃蛋白酶的质量比为1：1~5；优选质量比为1：1.5。
进一步地，步骤1中所述的酶解的温度为20~60 ℃，优选温度为37 ℃；酶解时间为1~15min；优选时间为10 min。
进一步地，步骤2中所述的脱盐富集的过程包括：
使用2个柱体积的乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的甲酸的80%乙腈溶液洗脱。
更进一步地，步骤2中所述的脱盐富集的过程包括：使用2个柱体积的乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗脱。干燥洗脱液。
进一步地，步骤2中所述的保存温度为-10℃~-50℃；优选为-20℃。
第三方面，本发明提供一种所述人PF4的特征多肽的应用，具体应用于PF4与肝素类药物形成的复合物的分析检测中，检测步骤包括：
a：使用PF4和肝素类药物混合孵育以形成复合物；
b：对复合物体系进行酶解；
c：富集酶解产物，并使用多反应监测技术进行样品检测。
进一步地，步骤a中所述的肝素类药物选自肝素钠、依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙、汀肝素钠、帕肝素钠、舍托肝素钠、瑞肝素钠、贝米肝素钠中的一种或多种。
进一步地，步骤a中所述的混合孵育过程包括：
将PF4与肝素类药物分别按照摩尔比为2：1、1：1、1：2、1：4和1：8混合，向各混合体系中分别加入PBS缓冲液定容，混合均匀后20~60℃孵育0.5~3 h；优选条件为37℃孵育1.0h。
进一步地，步骤b中所述的酶解的过程包括：
每个样品中加入甲酸调节pH=2.0-3.0，然后加入胃蛋白酶，PF4与胃蛋白酶的质量比例为1:1~5，在20~60℃下酶解1~15min，使用1 M NaOH中和体系以淬灭酶解反应；优选条件为PF4与胃蛋白酶的质量比例为1：1.5，酶解温度为37℃，酶解时间为10 min。
进一步地，步骤c中所述的富集酶解产物的过程包括：
使用200 μL乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗脱。干燥洗脱液。在质谱分析前保存于-20℃。
进一步地，步骤c中所述的多反应监测技术具体使用十八烷基碳链键合硅胶液相色谱质谱联用技术对酶解产物中的多肽VRPRHITSL，DLQAPL和/或KKIIKKLLES进行检测，并加入13C和15N同位素标记的VRPRHITSL[13C6,15N]、DLQAPL[13C6,15N]和/或K[13C6,15N2]KIIKKLLES进行绝对定量。
进一步地，步骤c中所述的多反应监测技术中液相色谱质谱联用检测条件为：
使用Hypersil™ BDS C18色谱柱（150×2.1 mm）进行分离，流速为0.2 mL/min，洗脱梯度如下（比例为体积百分比）：0-3 min 2%流动相B, 3-5 min 2%-20%流动相B, 5-10min 20%-35%流动相B, 10-13 min 35%流动相B, 13.01-20 min 98%流动相B, 20.01-27min 98%-2%流动相B；
在正离子模式下使用三重四极杆质谱进行定量分析，设定参数如下：正离子模式，MRM检测模式，离子源喷雾电压为4500 V，传输管温度为 275℃，鞘气气压为 25 arb，反吹气气压为 0 arb，辅助气压为 0 arb，碰撞气气压为 1.5 arb，离子聚焦透镜电压为75，通道参数如下：
进一步地，其中VRPRHITSL多肽离子的检测形式为[M]3+,质荷比为360.2，子离子为256.2、509.3、323.7、219.1。
DLQAPL多肽离子检测形式为[M]+，质荷比为656.4，子离子为229.2、428.2、300.2、357.2。
KKIIKKLLES多肽离子检测形式为[M]3+，质荷比为400.6，子离子为106.0、242.2、370.3。
VRPRHITSL的同位素标记多肽为VRPRHITSL[13C6,15N]，多肽离子的检测形式为[M]3+,质荷比为362.5，子离子为256.2、509.3、323.7、226.1。
DLQAPL的同位素标记多肽为DLQAPL[13C6,15N]，多肽离子检测形式为[M]+，质荷比为656.4，子离子为236.2、428.2、307.2、357.2。
KKIIKKLLES的同位素标记多肽为K[13C6,15N2]KIIKKLLES，多肽离子检测形式为[M]3+，质荷比为403.3，子离子为106.0、246.2、374.3。
从多反应监测得到的多肽含量可以反映PF4与肝素类药物形成复合物的大小和数量，PF4与肝素类药物形成的复合物越大、越多，最终多反应监测所检测到的多肽VRPRHITSL，DLQAPL和/或KKIIKKLLES就越少。随着PF4和肝素类药物形成的复合物的聚合度逐渐增大，非肝素类药物结合域的多肽DLQAPL会因为被包被在复合物中，因此酶解产生的多肽DLQAPL的量会随之降低；随着PF4和依诺肝素钠形成复合物的数量逐渐增多，肝素类药物结合域多肽VPRHITSL和KKIIKKLLES与肝素类药物的结合增多，因此酶解产生的多肽VRPRHISL和KKIIKKLLES的量会随之降低。将对不同的PF4/肝素类药物比例的孵育体系酶解后获得的VRPRHITSL，DLQAPL和/或KKIIKKLLES含量结果进行比较，可以推断不同PF4/肝素类药物的比例下形成复合物的大小和数量。将相同的PF4/肝素类药物比例下的PF4与不同种类的肝素类药物的孵育体系酶解后获得的VRPRHITSL，DLQAPL和/或KKIIKKLLES含量结果进行比较，可以推断在相同的PF4/肝素类药物比例下，PF4与不同种类的肝素类药物形成复合物的大小和数量。
与现有技术相比，本发明具有如下效果：
首先，本发明提供了一种人PF4的特征多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3，所述特征多肽制备方法简便，易于获得。在应用于PF4与肝素类药物形成的复合物的分析检测中，具有对设备要求低，分析检测速度快，检测成本低的显著优势。
其次，本发明提供了一种人PF4特征多肽在PF4与肝素类药物形成的复合物的分析检测中的应用方法，所述应用方法与分子排阻色谱法相比，本发明中的特征多肽在应用的过程中不需要将PF4与肝素类药物形成的复合物直接通过色谱柱，避免了复合物在色谱柱内发生变化的可能；与多角度光散射法相比，本发明中的特征多肽在应用的过程中需要的PF4仅为微克级，而且分析速度快，成本低。并且本发明提供的检测分析方法使用常规的液相色谱、高分辨质谱、三重四极杆质谱即可，使得本发明应用方法可广泛应用于科研院所、企业、检测机构等，具有较强的实用性。
附图说明
图1. VRPRHITSL、DLQAPL以及KKIIKKLLES的提取离子流图（m/z= 360.2，z=3；m/z=656.4，z=1；m/z=400.6，z=3）。
图2. VRPRHITSL的高分辨一级质谱图（m/z=360.2，z=3）。
图3. DLQAPL的高分辨一级质谱图（m/z=656.4，z=1）。
图4. KKIIKKLLES的高分辨一级质谱图（m/z=400.6，z=3）。
图5. VRPRHITSL的二级质谱图（m/z=360.2，z=3）。
图6. DLQAPL的二级质谱图（m/z=656.4，z=1）。
图7. KKIIKKLLES的二级质谱图（m/z=400.6，z=3）。
图8. PBS缓冲液体系中不同PF4/依诺肝素钠比例下VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES的绝对定量结果。
图9.血浆体系中不同PF4/依诺肝素钠比例下VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES的绝对定量结果。
图10.实施例三所述的血浆体系中不同PF4/依诺肝素钠与实施例四所述的血浆体系中不同PF4/肝素钠比例下VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES的绝对定量结果。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。
实施例一
1.样品制备
1.1蛋白酶解
使用超纯水重悬PF4，浓度为0.5 μg/μL，取1.04 μL PF4溶液，使用PBS缓冲液稀释至30 μL，终浓度为17.33 ng/μL。加入12 μL 20%甲酸调节pH= 2.0，然后加入0.78 μL的胃蛋白酶（1 μg/μL），蛋白质与酶的质量比例为1：1.5。在37 ℃下酶解10 min，使用1 M NaOH中和体系以淬灭酶解反应。
1.2 C18手工柱脱盐富集
使用200 μL乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗脱。干燥洗脱液，在质谱分析前保存于-20℃。
2.液相色谱质谱联用技术检测样品
2.1配制流动相
流动相A为0.1%甲酸的水溶液；
流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液；
2.2 C18-MS/MS分析
使用Thermo Scientific Easy-nLC 1200 液相色谱仪；色谱柱预柱为AcclaimPepMap TM 100 (2 cm×75 μm, nano Viper 2Pk)，分析柱为Acclaim PepMap TM RSLC(25 cm×75 μm, nano Viper, C18, 2 μm)流速为300 nL/min，洗脱梯度如下（比例均为体积百分比）：0-4 min 2%-7%流动相B, 4-44 min 7%-22%流动相B, 44-54 min 22%-35%流动相B, 54-59 min 35%-90%流动相B, 59.01-74 min 90%流动相B。
质谱型号为Orbitrap Fusion Lumos；质谱采用Orbitrap作为质量分析器，正离子模式扫描，一级扫描范围200-2000，一级分辨率120000，二级分辨率15000，一级离子自动增益控制（AGC）设置4×105，二级5×104，用高能碰撞诱导解离（HCD）方式碎裂，碰撞能设置为30%。
3.数据处理
图1-图7为C18-MS/MS数据处理结果。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得胃蛋白酶酶解PF4的结果。对比C18-MS/MS结果，获得了PF4的特征性多肽的序列，序列分别为VRPRHITSL、DLQAPL、KKIIKKLLES，提取离子流图如图1所示。酶解产物数据分析中可以检测到VRPRHITSL的离子m/z=360.2（如图2所示）及其产生的碎片离子（如图5所示）；也可以检测出DLQAPL的离子m/z=656.4（如图3所示）及其产生的碎片离子（如图6所示）；同样可以检测出KKIIKKLLES的离子m/z=400.6（如图4所示）及其产生的碎片离子（如图7所示）。以上数据结果对PF4的特征肽进行了定性，说明本制备方法可以得到PF4的特征肽VRPRHITSL、DLQAPL、KKIIKKLLES。
实施例二
1.样品制备
1.1复合物形成
将1.04 μL 0.5 μg/μL的PF4分别与1.5 μL、3.0 μL、6.0 μL、12.0 μL以及24.0 μL浓度为0.1 μg/ μL依诺肝素钠混合，即PF4与依诺肝素钠的摩尔比为2:1、1:1、1:2、1:4和1:8，向混合体系中分别加入27.46 μL、25.96 μL、22.96 μL、16.96 μL以及4.96 μL的PBS缓冲液，混合均匀后37℃孵育1.0 h。
1.2 胃蛋白酶酶解
每个样品中加入12 μL 20%甲酸调节pH=2.0，然后加入0.78 μL 1 μg/μL的胃蛋白酶，蛋白质与酶的比例为1:1.5，在37 ℃下酶解10 min，使用1 M NaOH中和体系以淬灭酶解反应。
1.3同位素标记多肽内标加入
将已知量的VRPRHITSL、DLQAPL、KKIIKKLLES的同位素标记多肽作为定量内标加入，每个样品中分别添加100 ng VRPRHITSL[13C6,15N]，60 ng DLQAPL[13C6,15N]，120 ng K[13C6,15N2]KIIKKLLES。
1.4 C18手工柱脱盐富集
使用200 μL乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗脱。干燥洗脱液。在质谱分析前保存于-20℃。
2.多反应监测技术检测样品
2.1配制流动相
流动相A为0.1%甲酸的水溶液；
流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液；
2.2 C18-MRM分析
使用Hypersil™ BDS C18 色谱柱（150×2.1 mm）进行分离，流速为0.2 mL/min，洗脱梯度如下（比例为体积百分比）：0-3 min 2%流动相B, 3-5 min 2%-20%流动相B, 5-10min 20%-35%流动相B, 10-13 min 35%流动相B, 13.01-20 min 98%流动相B, 20.01-27min 98%-2%流动相B；
在正离子模式下使用三重四极杆质谱进行定量分析，设定参数如下：正离子模式，MRM检测模式，离子源喷雾电压为4500 V，传输管温度为 275℃，鞘气气压为 25 arb，反吹气气压为 0 arb，辅助气压为 0 arb，碰撞气气压为 1.5 arb，离子聚焦透镜电压为75，通道参数如下：
表1. MRM通道参数
表2. 同位素标记多肽内标物MRM通道参数
3.数据处理
图8为C18-MRM数据处理结果，使用同位素标记多肽作为内标进行绝对定量，计算不同比例下三条多肽的绝对含量。
实施例三
1.样品制备
1.1复合物形成
将1.04 μL 0.5 μg/μL的PF4分别与1.5 μL、3.0 μL、6.0 μL、12.0 μL以及24.0 μL浓度为0.1 μg/ μL依诺肝素钠混合，即PF4与依诺肝素钠的摩尔比为2:1、1:1、1:2、1:4和1:8，向混合体系中分别加入27.46 μL、25.96 μL、22.96 μL、16.96 μL以及4.96 μL的血浆，混合均匀后37 ℃孵育1.0 h。
1.2 胃蛋白酶酶解
每个样品中加入12 μL 20%甲酸调节pH= 2.0，然后加入0.78 μL 1 μg/μL的胃蛋白酶，蛋白质与酶的比例为1:1.5，在37 ℃下酶解10 min，使用1 M NaOH中和体系以淬灭酶解反应。
1.3同位素标记多肽内标加入
将已知量的VRPRHITSL、DLQAPL、KKIIKKLLES的同位素标记多肽作为定量内标加入，每个样品中分别添加100 ng VRPRHITSL[13C6,15N]， 60 ng DLQAPL[13C6,15N]，120 ng K[13C6,15N2]KIIKKLLES。
1.4 C18手工柱脱盐富集
使用200 μL乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的0.1%甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗脱。干燥洗脱液，在质谱分析前保存于-20℃。
2.多反应监测技术检测样品
2.1配制流动相
流动相A为0.1%甲酸的水溶液；
流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液；
2.2 C18-MRM分析
使用Hypersil™ BDS C18色谱柱（150×2.1 mm）进行分离，流速为0.2 mL/min，洗脱梯度如下（比例均为体积百分比）：0-3 min 2%流动相B，3-5 min 2%-20%流动相B，5-10min 20%-35%流动相B，10-13 min 35%流动相B，13.01-20 min 98%流动相B, 20.01-27 min98%-2%流动相B；
在正离子模式下使用三重四极杆质谱进行定量分析，设定参数如下：正离子模式，MRM检测模式，离子源喷雾电压为4500 V，传输管温度为 275℃，鞘气气压为 25 arb，反吹气气压为 0 arb，辅助气压为 0 arb，碰撞气气压为 1.5 arb，离子聚焦透镜电压为75。MRM通道参数与实施例一中相同。
3.数据处理
图9为C18-MRM数据处理结果，使用同位素标记多肽作为内标进行绝对定量，计算不同比例下三条肽的绝对含量。
实施例四
1.样品制备
1.1复合物形成
将1.04 μL 0.5 μg/μL的PF4分别与0.53 μL、1.07 μL、2.13 μL、4.27 μL以及8.53μL浓度为1 μg/ μL肝素钠混合，即PF4与肝素钠的摩尔比为2:1、1:1、1:2、1:4和1:8，向混合体系中分别加入28.43 μL、27.89 μL、26.83 μL、24.69 μL以及20.43 μL的血浆，混合均匀后37 ℃孵育1.0 h。
1.2胃蛋白酶酶解
每个样品中加入12 μL 20%甲酸调节pH= 2.0，然后加入0.78 μL 1 μg/μL的胃蛋白酶，蛋白质与酶的比例为1:1.5，在37 ℃下酶解10 min，使用1 M NaOH中和体系以淬灭酶解反应。
1.3同位素标记多肽内标加入
将已知量的VRPRHITSL、DLQAPL、KKIIKKLLES的同位素标记多肽作为定量内标加入，每个样品中分别添加100 ng VRPRHITSL[13C6,15N]，60 ng DLQAPL[13C6,15N]，120 ng K[13C6,15N2]KIIKKLLES。
1.5 C18手工柱脱盐富集
使用200 μL乙腈活化填料，随后使用2个柱体积的 0.1%甲酸的水溶液平衡C18手工柱，将待脱盐的样品重复上样2次，随后使用2个柱体积的 0.1%甲酸的水溶液冲洗C18手工柱，最后使用2个柱体积的0.1% 甲酸的80%乙腈溶液洗脱。干燥洗脱液，在质谱分析前保存于-20 ℃。
2.多反应监测技术检测样品
2.1配制流动相
流动相A为0.1%甲酸的水溶液；
流动相B为0.1%甲酸的乙腈溶液；
2.2 C18-MRM分析
使用Hypersil™ BDS C18 色谱柱（150×2.1 mm）进行分离，流速为0.2 mL/min，洗脱梯度如下（比例均为体积百分比）：0-3 min 2%流动相B, 3-5 min 2%-20%流动相B, 5-10min 20%-35%流动相B, 10-13 min 35%流动相B, 13.01-20 min 98%流动相B, 20.01-27min 98%-2%流动相B；
在正离子模式下使用三重四极杆质谱进行定量分析，设定参数如下：正离子模式，MRM检测模式，离子源喷雾电压为4500 V，传输管温度为 275℃，鞘气气压为 25 arb，反吹气气压为 0 arb，辅助气压为 0 arb，碰撞气气压为 1.5 arb，离子聚焦透镜电压为75.
MRM通道参数与实施例一中相同。
3.数据处理
图10为实施例三所述的血浆体系中不同PF4/依诺肝素钠与实施例四所述的血浆体系中不同PF4/肝素钠比例下VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES的绝对定量结果。计算不同比例下三条肽的绝对含量。
分析实施例二、三、四中的数据可以得到结论：一、随着PF4/肝素类药物的比例逐渐减小，酶解产生的多肽DLQAPL的量随之降低，因此PF4和肝素类药物形成的复合物的聚合度逐渐增大；二、随着PF4/肝素类药物的比例逐渐减小，酶解产生的PF4上两个肝素类药物结合域肽段VRPRHITSL和KKIIKKLLES的量也会随之减少，因此PF4和肝素钠形成复合物的数量逐渐增多。
对比实施例二和实施例三，可以得到结论：一、PF4与肝素类药物不仅可以在PBS缓冲液中形成复合物，而且还可以在具有复杂环境的血浆中形成复合物；二、相同比例下血浆体系中多肽VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES的含量更高，表明PF4和肝素类药物在血浆中形成的复合物更少更小。对比实施例三和实施例四，可以得到结论：一、不同比例下PF4与依诺肝素钠和肝素钠形成复合物的数量和大小有相同的趋势，都随着PF4/肝素类药物的比例逐渐减小而增大增多；二、使用不同种类肝素类药物在相同比例下的多肽VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES的含量有显著的区别，因此使用肝素钠时多肽不同肝素类药物在相同比例下形成复合物的大小和数量具有显著的区别。
因此该方法可以准确检测多肽VRPRHITSL、DLQAPL和KKIIKKLLES在不同比例下的含量，准确表征PF4和肝素类药物形成的复合物的数量和大小，也可以非常灵敏地对不同肝素类药物形成复合物的性质加以区分。
Claims (3)
1.一种人PF4的特征多肽组合，其特征在于，所述特征多肽组合由序列SEQ ID NO：1、序列SEQ ID NO：2和序列SEQ ID NO：3组成；
其中所述序列SEQ ID NO：1：VRPRHITSL；
所述序列SEQ ID NO：2：DLQAPL；
所述序列SEQ ID NO：3：KKIIKKLLES。
2.一种权利要求1所述人PF4的特征多肽组合的应用，其特征在于，具体应用在PF4和肝素类药物形成的复合物的分析检测中，检测步骤包括：
a：使用PF4和肝素类药物混合孵育以形成复合物；
b：对步骤a所述的复合物进行酶解后，加入同位素标记多肽内标；
c：富集酶解产物，并使用多反应监测技术进行样品检测；
步骤b中所述的酶解为重悬PF4后，加入甲酸调节pH为2-3，加入胃蛋白酶进行酶解；所述的酶解的温度为20~60 ℃；酶解时间为1~15min；
步骤b所述加入同位素标记多肽内标为加入13C和15N同位素标记的VRPRHITSL[13C6,15N]、DLQAPL[13C6,15N]和/或K[13C6，15N2]KIIKKLLES进行绝对定量；
步骤c中所述的多反应监测技术中液相色谱检测条件为：
使用Hypersil™ BDS C18色谱柱150×2.1 mm进行分离，流速为0.2 mL/min，洗脱梯度如下：0-3 min 2%流动相B，3-5 min 2%-20%流动相B，5-10 min 20%-35%流动相B，10-13min 35%流动相B，13.01-20 min 98%流动相B，20.01-27 min 98%-2%流动相B；上述百分比为体积百分比；
步骤c中所述的多反应监测技术中质谱检测条件为：
在正离子模式下使用三重四极杆质谱进行定量分析，设定参数如下：正离子模式，MRM检测模式，离子源喷雾电压为4500 V，传输管温度为275℃，鞘气气压为25 arb，反吹气气压为0 arb，辅助气压为0 arb，碰撞气气压为1.5 arb，离子聚焦透镜电压为75，通道参数如下表所示：
。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤a中所述的肝素类药物选自肝素钠、依诺肝素钠、达肝素钠、那屈肝素钙、汀肝素钠、帕肝素钠、舍托肝素钠、瑞肝素钠、贝米肝素钠中的一种或多种。
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