CN115551537A - 肿瘤细胞疫苗 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种同种异体全细胞癌症疫苗平台，其包括用于治疗和预防癌症的组合物和方法。本文提供含有治疗有效量的来自一种或多种癌细胞系的细胞的组合物，癌细胞系中的一些或全部被修饰以(i)抑制或减少细胞对一种或多种免疫抑制因子的表达，和/或(ii)表达一种或多种免疫刺激因子或增加细胞对一种或多种免疫刺激因子的表达，和/或(iii)表达一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)，包括已突变的TAA或增加其表达，并且癌细胞系包含天然表达异质性肿瘤相关抗原和/或新抗原的癌细胞系。本文还提供疫苗组合物的制造方法、其制备方法以及其使用方法。
Description
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背景技术
癌症是死亡的主要原因。包括检查点抑制剂的免疫治疗方法的最新突破已大大促进癌症的治疗，但这些方法既不可定制，也不能广泛应用于各种适应症或一种适应症内的所有患者。此外，只有一部分患者适合这些免疫疗法并且对其产生反应。治疗性癌症疫苗具有在癌症患者中产生能够引起临床反应的抗肿瘤免疫反应的潜力，但这些疗法中的许多疗法具有单一目标，或者免疫调节目标的范围和/或抗原特异性的广度受到限制。定制用于适应症的靶向各个肿瘤内细胞异质性的治疗性疫苗的开发仍然具有挑战。
绝大部分治疗性癌症疫苗平台本身在单个配制物中可以靶向的抗原数目有限。这些疫苗缺乏广度会对功效产生不利影响，并且可以经由一种称为抗原逃逸的现象导致临床复发，并且出现抗原阴性肿瘤细胞。尽管这些方法可以在某种程度上减轻肿瘤负荷，但其不能消除抗原阴性肿瘤细胞或癌症干细胞。利用患者自身的免疫系统来靶向广泛抗原可以减轻肿瘤负荷，以及经由免疫反应的抗原异质性防止复发。因此，需要改善的全细胞癌症疫苗。本文提供解决此需要的方法和组合物。
发明内容
在各种实施例中，本公开提供一种同种异体全细胞癌症疫苗平台，其包括用于治疗和预防癌症的组合物和方法。本公开提供可定制用于治疗多种实体肿瘤适应症并且靶向各个肿瘤内的细胞异质性的组合物和方法。本公开的实施例的组合物和方法广泛适用于实体肿瘤适应症以及罹患这类适应症的患者。在一些实施例中，本公开提供癌细胞系的组合物，该等癌细胞系(i)如本文所述进行修饰，并且(ii)表达足够数目和量的肿瘤相关抗原(TAA)，使得当向罹患癌症(a cancer)、癌症(cancers)或癌性肿瘤的受试者施用时，产生TAA特异性免疫反应。
在一个实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中该组合物能够引发特异性针对该至少5种TAA的免疫反应。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少10种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中该组合物能够引发特异性针对该至少10种TAA的免疫反应。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少15种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中该组合物能够引发特异性针对该至少15种TAA的免疫反应。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或该等细胞系的该组合被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少15种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或该等细胞系的该组合被修饰以表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达。在另一实施例中，本文提供一种前述组合物，其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍数。
在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或该等细胞系的该组合被修饰以抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或该等细胞系的该组合被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。在另一实施例中，本文提供一种前述组合物，其中各细胞系或该等细胞系的该组合包含表达5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种与意图接受该组合物的该受试者的该癌症相关的TAA的细胞。在另一实施例中，该组合物包含2种、3种、4种、5种或6种癌细胞系。在另一实施例中，各细胞系或该等细胞系的组合被修饰以表达1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种免疫刺激因子或增加其表达。在另一实施例中，各细胞系或该等细胞系的组合被修饰以抑制或减少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种免疫抑制因子的表达。
在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含被修饰以表达至少2种免疫刺激因子的细胞或增加其表达。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中该等细胞系中的至少1种被修饰以减弱或敲除CD276、TGFβ1和TGFβ2中的一种或多种。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中该至少1种免疫刺激因子增加树突状细胞成熟。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍数。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1.5倍。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1.5倍。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1.7倍。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加至少2.0倍。
在一个实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
在另一实施例中，本文提供一种前述免疫原性组合物，其中各细胞系或该等细胞系的组合被修饰以(i)表达3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种TAA的表达。在另一实施例中，本文提供一种前述免疫原性组合物，相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，该组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍或2倍。
在另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
在一些实施例中，提供一种前述免疫原性组合物，其中该组合物包含4、5或6种癌细胞系。在一些实施例中，各细胞系或该等细胞系的组合包含被修饰以增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种TAA的表达的细胞。在另一实施例中，各细胞系或该等细胞系的组合被修饰以(i)表达3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种TAA的表达。
在本公开的另一实施例中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)表达CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMVpp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LYK6K、FAP、PRAME、HPV16/18E6/E7或它们的突变型式中的一种或多种或增加该等因子表达。在一些实施例中，其中该等突变型式包含：(i)选自由以下组成的群组的被修饰型式：modTERT、modPSMA、modMAGEA1、modTBXT、modBORIS、modFSHR、modMAGEA10、modMAGEC2、modWT1、modKRAS、modFBP、modTDGF1、mod紧密连接蛋白18、modLY6K、modFAP和modPRAME；或(ii)选自由以下组成的群组的融合蛋白：modCT83-MSLN、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65、modTBXT-modBORIS、modFSHR-modMAGEA10、modTBXT-modMAGEC2、modTBXT-modWT1、modTBXT-modWT1-KRAS、modWT1-modFBP、modPSMA-modTDGF1、modWT1-mod紧密连接蛋白18、modPSMA-modLY6K、modFAP-mod紧密连接蛋白18和modPRAME-modTBXT。在其它实施例中，该等突变型式包含：(i)选自由以下组成的群组的被修饰型式：mod间皮素(SEQ ID NO:62)、modTERT(SEQ ID NO:36)、modPSMA(SEQ ID NO:38)、modMAGEA1(SEQ ID NO:73)、modTBXT(SEQ ID NO:79)、modBORIS(SEQ ID NO:60)、modFSHR(SEQ ID NO:95)、modMAGEA10(SEQ ID NO:97)、modMAGEC2(SEQ ID NO:87)、modWT1(SEQ IDNO:81)、KRAS G12D(SEQ ID NO:83)or KRAS G12V(SEQ ID NO:85)、modFBP(SEQ ID NO:93)、modTDGF1(SEQ ID NO:89)、mod紧密连接蛋白18(SEQ ID NO:110)、modLYK6K(SEQ IDNO:112)、modFAP(SEQ ID NO:115)和modPRAME(SEQ ID NO:99)；或(ii)选自由以下组成的群组的融合蛋白：CT83-MSLN(SEQ ID NO:22)、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65(SEQ ID NO:40)、modTBXT-modBORIS(SEQ ID NO:42)、modFSHR-modMAGEA10(SEQ ID NO:44)、modTBXT-modMAGEC2(SEQ ID NO:46)、modTBXT-modWT1(SEQ ID NO:48)、modTBXT-modWT1(KRAS)(SEQID NO:50)、modWT1-modFBP(SEQ ID NO:52)、modPSMA-modTDGF1(SEQ ID NO:54)、modWT1-mod紧密连接蛋白18(SEQ ID NO:56)、modPSMA-modLY6K(SEQ ID NO:58)和modPRAME-modTBXT(SEQ ID NO:66)。
在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中该癌干细胞系被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中该癌干细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中该细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加该癌干细胞系不表达或表达极低的至少1种TAA的表达。在一些实施例中，该至少1种TAA选自由以下组成的群组：TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LY6K、FAP、PRAME、HPV16/18E6/E7和FAP，或它们的突变型式。
在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中该癌干细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加该癌干细胞系不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中该癌干细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加该癌干细胞系不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。在一些实施例中，该癌干细胞系选自由以下组成的群组：JHOM-2B、OVCAR-3、OV56、JHOS-4、JHOC-5、OVCAR-4、JHOS-2、EFO-21、CFPAC-1、Capan-1、Panc 02.13、SUIT-2、Panc 03.27、SK-MEL-28、RVH-421、Hs 895.T、Hs 940.T、SK-MEL-1、Hs 936.T、SH-4、COLO 800、UACC-62、NCI-H2066、NCI-H1963、NCI-H209、NCI-H889、COR-L47、NCI-H1092、NCI-H1436、COR-L95、COR-L279、NCI-H1048、NCI-H69、DMS 53、HuH-6、Li7、SNU-182、JHH-7、SK-HEP-1、Hep 3B2.1-7、SNU-1066、SNU-1041、SNU-1076、BICR 18、CAL-33、YD-8、CAL-29、KMBC-2、253J、253J-BV、SW780、SW1710、VM-CUB-1、BC-3C、KNS-81、TM-31、NMC-G1、GB-1、SNU-201、DBTRG-05MG、YKG-1、ECC10、RERF-GC-1B、TGBC-11-TKB、SNU-620、GSU、KE-39、HuG1-N、NUGC-4、SNU-16、OCUM-1、C2BBe1、Caco-2、SNU-1033、SW1463、COLO 201、GP2d、LoVo、SW403、CL-14、HCC2157、HCC38、HCC1954、HCC1143、HCC1806、HCC1599、MDA-MB-415、CAL-51、KO52、SKNO-1、Kasumi-1、Kasumi-6、MHH-CALL-3、MHH-CALL-2、JVM-2、HNT-34、HOS、OUMS-27、T1-73、Hs 870.T、Hs 706.T、SJSA-1、RD-ES、U2OS、SaOS-2、SK-ES-1、MKN-45、HSC-3、HSC-4、DETROIT 562和SCC-9。
在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中该细胞系DMS 53被修饰以(i)减弱TGFβ2，(ii)敲除CD276，和(iii)上调GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的表达。在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中该细胞系DMS 53被修饰以(i)减弱TGFβ2，(ii)敲除CD276，和(iii)上调GM-CSF和膜结合的CD40L的表达。在本公开的另一实施例中，本文提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS53，其中该组合物刺激特异性针对由该细胞系DMS 53表达的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应。在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中该等细胞系中的至少1种包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中该等细胞系中的至少1种是小细胞肺癌细胞系DMS 53并且包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达或者抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达的细胞。在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中至少1种细胞系包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中1种细胞系是小细胞肺癌DMS 53。
在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中该细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，并且(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。在本公开的另一实施例中，本文提供一种组合物，其包含治疗有效量的3种癌细胞系，其中各细胞系所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，并且(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中该等细胞系中的1种是小细胞肺癌细胞系DMS 53。
在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该组合物为疫苗组合物。在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该组合物能够引发受试者中的免疫反应。在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该组合物包含3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种癌细胞系。在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该组合物包含表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子或增加其表达的修饰。在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该组合物包含抑制或减少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫抑制因子的表达的修饰。在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该组合物包含表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种TAA或增加其表达的修饰。在一个实施例中，该等TAA中的一种或多种的氨基酸序列已被修饰以包括突变或新抗原决定基。
在本公开的一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该免疫反应是先天性免疫反应、适应性免疫反应、细胞免疫反应和/或体液反应。在一个实施例中，免疫反应是适应性免疫反应。在一些实施例中，适应性免疫反应包含选自由CD4+T细胞、CD8+T细胞、γ-δT细胞、自然杀手T细胞和B细胞组成的群组的抗原特异性细胞的产生。在本公开的其它实施例中，抗原特异性CD4+T细胞包含记忆细胞、T辅助1型细胞、T辅助9型细胞、T辅助17型细胞、T辅助22型细胞和T滤泡性辅助细胞。在一些实施例中，抗原特异性CD8+T细胞包含记忆细胞和细胞毒性T淋巴细胞。在其它实施例中，抗原特异性B细胞包含记忆细胞、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E和免疫球蛋白A。在一些实施例中，其中各细胞系或该等细胞系的组合表达至少10种TAA。在其它实施例中，TAA也在意图接受该组合物的受试者的癌症中表达。
在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该治疗有效量包含大约8×106个细胞的各细胞系。在另一实施例中，治疗有效量包含大约1×107个细胞的各细胞系。在一些实施例中，治疗有效量包含大约1.0×106-6.0×107个细胞的各细胞系。在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中该治疗有效量包含大约相同数目细胞的各细胞系。在一些实施例中，提供一种前述组合物，本文中该等细胞系是遗传异质性同种异体、遗传同质性同种异体、遗传异质性异种、遗传同质性异种或同种异体与异种的组合。
在多个实施例中，本文提供一种前述组合物，其中该等细胞系来自起源于以下的实体肿瘤的亲本细胞系：肺、前列腺、睪丸、乳房、结肠、膀胱、胃肠道系统、脑、脊髓、泌尿道、结肠、直肠、胃、头颈部、肝脏、肾脏、中枢神经系统、内分泌系统、间皮、卵巢、子宫内膜、胰腺、食道、神经内分泌系统、子宫或皮肤。在一些实施例中，亲本细胞系包含选自由以下组成的群组的细胞：鳞状细胞、癌细胞、腺癌细胞、腺鳞细胞、大细胞细胞、小细胞细胞、肉瘤细胞、透明细胞癌细胞、癌肉瘤细胞、混合间皮细胞和畸胎癌细胞。在一些实施例中，肉瘤细胞包含骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤、星形细胞瘤、粘液肉瘤、间叶或混合间皮。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是非小细胞肺癌细胞系或小细胞肺癌细胞系。在其它实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是小细胞肺癌细胞系。在其它实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53和NCI-H1694。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是前列腺癌细胞系或睪丸癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：PC3、DU-145、LNCAP、NEC8和NTERA-2cl-D1。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是结肠直肠癌细胞系。在其它实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116和LS411N。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是乳腺癌或三阴性乳腺癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7和T-47D。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是膀胱或泌尿道癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376和SCaBER。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是头颈癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1和OSC-20。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是胃或胃癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1和MKN1。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是肝癌或肝细胞癌(HCC)细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6和HuH-7。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是神经胶母细胞瘤癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是卵巢癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO和MCAS。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是食道癌细胞系。在其它实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19和OE21。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是肾或肾细胞癌癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ和VMRC-RCW。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是胰腺癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN11。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是子宫内膜癌细胞系。在其它实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA和石川(Ishikawa)。在一些实施例中，该细胞系或该等细胞系是皮肤或黑色素瘤癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T和A2058。在其它实施例中，该细胞系或该等细胞系是间皮瘤癌细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由以下组成的群组：NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89和IST-Mes2。
在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其还包含癌干细胞系。在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其还包含细胞系DMS 53。在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中该等细胞系中的1种属于与该等其它细胞系中的至少1种不同的癌症。在另一实施例中，至少3种细胞系各自为相同类型癌症。在一些实施例中，至少3种细胞系各自为不同细胞组织学类型或分子亚型。在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中该细胞组织学类型选自由以下组成的群组：鳞状、癌瘤、腺癌、大细胞、小细胞和肉瘤。
在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中增加该至少1种免疫刺激因子的表达的该修饰包含使用编码该至少1种免疫刺激因子的慢病毒载体。在一个实施例中，该至少1种免疫刺激因子以相较于未被修饰的细胞系高至少2.0倍的水平表达。在另一实施例中，该至少1种免疫刺激因子选自由以下组成的群组：GM-CSF、膜结合的CD40L、GITR、IL-15、IL-23和IL-12。在另一实施例中，免疫刺激因子是GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12。在另一实施例中，免疫刺激因子是GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-15。在另一实施例中，GM-CSF包含SEQ ID NO:8。在另一实施例中，膜结合的CD40L包含SEQ ID NO:3。在另一实施例中，IL-12包含SEQ ID NO:10。
在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中抑制或减少该至少1种免疫抑制因子的表达的该修饰包含该至少1种免疫抑制因子的敲除或减弱。在一个实施例中，该至少1种免疫抑制因子的表达减少至少大约5％、10％、15％、20％、25％或30％。在另一实施例中，修饰为减弱。
在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中抑制或减少该至少1种免疫抑制因子的表达的该等修饰包含减弱该至少1种免疫抑制因子的表达与敲除不同免疫抑制因子的表达的组合。在一些实施例中，该至少1种免疫抑制因子选自由以下组成的群组：CD276、CD47、CTLA4、HLA-E、HLA-G、IDO1、IL-10、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。在另一实施例中，该至少1种免疫抑制因子选自由以下组成的群组：CD276、HLA-E、HLA-G、TGFβ1和TGFβ2。在另一实施例中，该等免疫抑制因子是TGFβ1、TGFβ2和CD276。在另一实施例中，该等免疫抑制因子是TGFβ2和CD276。在本公开的另一实施例中，该等免疫抑制因子是TGFβ1和CD276。在一些实施例中，使用包含SEQ ID NO:25的短发夹RNA减弱TGFβ1。在其它实施例中，使用包含SEQ IDNO:24的短发夹RNA减弱TGFβ2。在其它实施例中，使用靶向包含SEQ ID NO:26的CD276基因组DNA序列的锌指核酸酶对敲除CD276。
在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中该组合物包含表达HLA超型异质性的细胞系，并且其中呈现至少2种不同HLA-A和至少2种HLA-B超型。在一些实施例中，该组合物表达HLA-A24、HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B27和HLA-B44超型中的主要组织相容性复合体分子。在其它实施例中，该组合物表达HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01、HLA-B07、HLA-B27和HLA-B44超型中的主要组织相容性复合体分子。在其它实施例中，该组合物表达HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08和HLA-B44超型。在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中该(等)细胞系是遗传同质性细胞系。在一些实施例中，本公开提供一种前述组合物，其中该(等)细胞系是遗传异质性细胞系。
本公开涵盖和提供多种方法。在一个实施例中，本公开提供一种受试者中的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量之前述组合物。在一个实施例中，本公开提供一种刺激受试者中特异性针对至少5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种或更多种肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量之前述组合物。在一些实施例中，本文提供一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的2种前述组合物。在一个实施例中，本文提供一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的2种或更多种本文所述的组合物，其中该等组合物包含细胞系的不同组合。在一个实施例中，本文提供一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的2种本文所述的组合物，其中该等组合物各自包含3种不同细胞系。在一些实施例中，免疫反应包含抗原特异性或疫苗特异性免疫球蛋白G抗体的产生增加。在其它实施例中，免疫反应包含IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A、IL-20、IL-22、TNFα、IFNγ、CCL5或CXCL10中的一种或多种的产生增加。在一个实施例中，免疫反应包含IFNγ的产生增加。在一些实施例中，免疫反应包含颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素和CD107a的产生增加。在其它实施例中，免疫反应包含调节T细胞、单核单核球衍生的抑制细胞和多形核衍生的抑制细胞的含量减少。在其它实施例中，免疫反应包含循环肿瘤细胞(CTC)、嗜中性粒细胞与淋巴细胞的比率(NLR)和血小板与淋巴细胞的比率(PLR)的水平降低。在其它实施例中，该免疫反应包含肿瘤微环境中免疫浸润的变化。
在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物。在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的2种或更多种本文所述的组合物，其中该等组合物包含细胞系的不同组合。在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的2种本文所述的组合物，其中该等组合物各自包含3种不同细胞系。在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物，并且还包含向该受试者施用治疗有效量的化学治疗剂。在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的一种或多种本文所述的组合物，并且还包含向该受试者施用治疗有效量的环磷酰胺。在一些实施例中，环磷酰胺的治疗有效量包含50毫克/天，持续1-10天，接着施用治疗有效量的组合物。
在一个实施例中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物，并且还包含向该受试者施用治疗有效量的检查点抑制剂。在另一实施例中，检查点抑制剂选自由CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9和2B4的抑制剂组成的群组。在一些实施例中，检查点抑制剂选自由以下组成的群组：派姆单抗(pembrolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、西利单抗(cetrelimab)、多斯利单抗(dostarlimab)、赛咪单抗(cemiplimab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、坎立珠单抗(camrelizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和纳武单抗(nivolumab)。在其它实施例中，提供一种前述方法，其还包含向该受试者施用被分离的肿瘤相关抗原(TAA)。在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物，并且还包含向该受试者施用一种或多种选自由ALK、PARP、VEGFRs、EGFR、FGFR1-3、HIF1α、PDGFR1-2、c-Met、c-KIT、Her2、Her3、AR、PR、RET、EPHB4、STAT3、Ras、HDAC1-11、mTOR和CXCR4的抑制剂组成的群组的抑制剂。
在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的本文所提供的组合物，并且还包含向该受试者施用治疗有效量的放射线疗法。在一个实施例中，本文提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含施用治疗有效量的本文所述的组合物，并且还包含向该患者施用癌症治疗手术。在一个实施例中，本文提供一种同时治疗受试者的两种或更多种癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物。
在另一实施例中，本文提供一种制备本文所述的疫苗组合物的方法，其包含以下步骤：(a)选择表达至少5种、10种、15种或20种或更多种TAA的一种或多种癌细胞系；以及(b)修饰(a)的该一种或多种癌细胞系中的每一种，其中该细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种TAA的表达。在一个实施例中，该细胞系或该等细胞系的组合包含另外被修饰以抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达的细胞。在另一实施例中，该修饰步骤包含将一种或多种载体引入至该等细胞系中的一或多个中。在另一实施例中，该一种或多种载体是慢病毒载体。在另一实施例中，该方法还包含使该等被修饰的细胞系适应无异种培养基的步骤。在另一实施例中，该方法还包含辐照该等细胞系的步骤。在另一实施例中，该方法还包含使该等细胞适应冷冻保存培养基的步骤。
在各种实施例中，本公开提供一种前述方法，其中该组合物或该等组合物通过选自由以下组成的群组的途径施用该受试者：肠胃外、经肠、口服、肌肉内、皮内、皮下、瘤内、结节内、鼻内、经皮、吸入、粘膜和局部。在一个实施例中，该途径是皮内。在一些实施例中，该组合物或该等组合物施用该受试者上选自由手臂、大腿和背部组成的群组的施用部位。在另一实施例中，组合物皮内施用该受试者上的不同施用部位上。在另一实施例中，组合物通过用位于自该施用部位的表面5°与15°之间的角度下的注射器注射而皮内施用。在一些实施例中，提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的第一剂量和治疗有效量之后续剂量的一种或多种本文所提供的组合物，其中该一种或多种组合物在第一年施用1-24次、在第二年施用1-16次和在第三年施用1-14次。在另一实施例中，本公开提供一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种本文所提供的组合物，其中该最初四剂每21天施用，直到第63天，并且接着每42天施用另外三剂，直到第189天。在一个实施例中，该方法还包含以42天时间间隔施用另外五剂，直到第399天，并且接着随后至少以两个84天时间间隔施用。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向该受试者施用第一剂量和后续剂量的治疗有效量的两种本文所提供的组合物，其中该最初四剂每14天施用，直到第42天，并且接着每42天施用另外三剂，直到第168天。在一个实施例中，该方法还包含以42天时间间隔施用另外五剂，直到第378天，并且接着随后至少以两个84天时间间隔施用。
在另一实施例中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用治疗有效量的两种组合物，其中各组合物包含至少2种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达，其中一种组合物施用该受试者的上半身，并且另一组合物施用该受试者的下半身。在另一实施例中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向该受试者施用第一剂量和后续剂量的治疗有效量的两种组合物，其中各组合物包含至少2种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以(i)表达GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L中的一种或多种或增加其表达，(ii)抑制或减少TGFβ1、TGFβ2和CD276中的一种或多种的表达，和(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种TAA的表达，其中一种组合物施用该受试者的上半身，并且另一组合物施用该受试者的下半身。在一些实施例中，本文所提供的方法还包含向该受试者施用一种或多种治疗剂或治疗。在其它实施例中，该受试者避免用其它疫苗或治疗剂治疗。在一些实施例中，该治疗剂或治疗选自由以下组成的群组：放射线疗法、化学疗法、手术、小分子抑制剂和检查点抑制剂。在一个实施例中，该治疗剂是环磷酰胺。在其它实施例中，检查点抑制剂选自由CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9和2B4的抑制剂组成的群组。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、西利单抗、多斯利单抗、赛咪单抗、斯巴达珠单抗、坎立珠单抗、德瓦鲁单抗或纳武单抗。在一些实施例中，一种或多种治疗剂或治疗在该第一剂量和/或该等后续剂量的至少1次施用之前施用。在其它实施例中，一种或多种治疗剂或治疗在该组合物的每次施用之前、同时或之后施用。在其它实施例中，第一治疗剂在该第一剂量之前施用，并且其中第二治疗剂与该第一剂量和该等后续剂量同时施用。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含：a.向该受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种本文所提供的组合物，其中该两种组合物在不同部位同时施用，并且在施用该第一剂量之后向该受试者施用后续剂量的该两种组合物，其中该两种组合物在不同部位同时施用；以及b.任选地，在施用(a)的该第一剂量之前向该受试者施用治疗有效剂量的环磷酰胺1-10天，并且任选地在施用(a)的该等后续剂量之前施用治疗有效剂量的环磷酰胺1-10天；c.任选地，(i)与(a)的每个剂量同时，或(ii)在(a)的该第一剂量之后每一周、两周、三周或四周，向该受试者施用检查点抑制剂。在另一实施例中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含：a.向该受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种本文所述的组合物，并且在施用该第一剂量之后向该受试者施用后续剂量的该两种组合物，其中该两种组合物在不同部位同时施用；b.任选地，在施用(a)的该第一剂量之前向该受试者施用环磷酰胺1-10天，并且任选地在施用(a)的该等后续剂量之前施用环磷酰胺1-10天；c.任选地，(i)与(a)的每个剂量同时，或(ii)在(a)的该第一剂量之后每一周、两周、三周或四周，向该受试者施用检查点抑制剂。在另一实施例中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含：a.向该受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种如技术方案1至138中任一项的组合物，并且在施用该第一剂量之后向该受试者施用后续剂量的该两种组合物，其中该两种组合物在不同部位同时施用，并且其中该等后续剂量在施用该第一剂量之后3周、6周、9周、15周、21周和27周施用；b.在施用(a)的该第一剂量和该等后续剂量之前每日向该受试者施用环磷酰胺7天；c.在(a)的该第一剂量之后3周、6周、9周、12周、15周、18周、21周、24周和27周向该受试者施用检查点抑制剂。在一个实施例中，环磷酰胺口服施用并且该检查点抑制剂是派姆单抗并且静脉内施用。在另一实施例中，环磷酰胺以50mg的剂量口服施用并且该检查点抑制剂是派姆单抗并且以200mg的剂量静脉内施用。
在另一实施例中，本公开提供一种治疗受试者的癌症的方法，其包含：a.向该受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种本文所提供的组合物，并且在施用该第一剂量之后向该受试者施用后续剂量的该两种组合物，其中该两种组合物在不同部位同时施用，并且其中该等后续剂量在施用该第一剂量之后2周、4周、6周、12周、18周和24周施用；b.在施用(a)的该第一剂量和该等后续剂量之前每日向该受试者施用环磷酰胺7天；以及在(a)的该第一剂量之后2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周和30周向该受试者施用检查点抑制剂。在一个实施例中，环磷酰胺以50mg的剂量口服施用并且该检查点抑制剂是德瓦鲁单抗并且以10mg/kg的剂量静脉内施用。在其它实施例中，该等方法还包含以下步骤：在施用该等组合物之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天和在施用该等组合物之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天禁止施用大麻碱。
在一些实施例中，各自成组或单独涵盖，受试者罹患选自由以下组成的群组的癌症：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、食道癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肾癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤和间皮瘤。在一个实施例中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一实施例中，神经胶质瘤是星形细胞瘤。在另一实施例中，星形细胞瘤是多形性神经胶母细胞瘤(GBM)。
本公开还提供试剂盒。在一个实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含一种或多种本文所提供的组合物。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含至少1个小瓶，该小瓶包含本文所述的组合物。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含第一小瓶中的第一疫苗组合物和第二小瓶中的第二疫苗组合物，其中该第一疫苗组合物和该第二疫苗组合物各自包含至少2种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含6个小瓶，其中该等小瓶各含有包含癌细胞系的组合物，并且其中该6个小瓶中的至少4个包含如下癌细胞系，该癌细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)增加1种细胞系或该等细胞系的该组合不表达或表达极低的至少1种TAA的表达，其中该等小瓶中的至少4个含有不同组合物。在一些实施例中，试剂盒还包含使用说明书。在一些实施例中，试剂盒用于治疗癌症。
还涵盖本文提供的组合物的单位剂量。在一个实施例中，本公开提供一种用于治疗癌症的药剂的单位剂量，该药剂包含不同癌细胞系的6种组合物，其中至少4种组合物所包含的细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达。在一些实施例中，细胞系包含：(a)选自由NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23组成的群组的非小细胞肺癌细胞系和/或小细胞肺癌细胞系；(b)DMS 53和选自由DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53和NCI-H1694组成的群组的五种小细胞肺癌细胞系；(c)DMS 53和前列腺癌细胞系或睪丸癌细胞系PC3、DU-145、LNCAP、NEC8和NTERA-2cl-D1；(d)DMS 53和结肠直肠癌细胞系HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116和LS411N；(e)DMS53和乳腺癌或三阴性乳腺癌细胞系Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7和T-47D；(f)DMS 53和膀胱或泌尿道癌细胞系UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376和SCaBER；(g)DMS 53和头或颈部癌细胞系HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1和OSC-20；(h)DMS53和胃或胃癌细胞系Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1和MKN1；(i)DMS 53和选自由Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6和HuH-7组成的群组的五种肝癌或肝细胞癌(HCC)细胞系；(j)DMS 53和神经胶母细胞瘤癌细胞系DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60；(k)DMS 53和选自由TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO和MCAS组成的群组的卵巢癌细胞系；(l)DMS 53和选自由TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19和OE21组成的群组的五种食道癌细胞系；(m)DMS 53和选自由A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ和VMRC-RCW组成的群组的五种肾癌或肾细胞癌癌细胞系；(n)DMS 53和胰腺癌细胞系PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN11；(o)DMS 53和选自由SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA和石川组成的群组的五种子宫内膜癌细胞系；(p)DMS53和选自由RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs852T和A2058组成的群组的五种皮肤或黑色素瘤癌细胞系；或(q)DMS 53和选自由NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89和IST-Mes2组成的群组的五种间皮瘤癌细胞系。
在另一实施例中，本公开提供一种用于治疗癌症的药剂的单位剂量，该药剂包含不同癌细胞系的6种组合物，其中各细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)表达该等癌细胞系不表达或表达极低的至少1种TAA或增加其表达。在一些实施例中，混合各包含3种细胞系的两种组合物。
在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCIH520和A549；其中(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；其中该治疗有效量为各细胞系大约1.0×107个细胞或大约6×107个细胞。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23，其中(a)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(b)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达，和(iii)表达MSLN和CT83；并且(c)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS53、LK-2和NCI-H23；其中(a)DMS53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(b)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达，和(iii)表达MSLN和CT83；并且(c)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；其中该治疗有效量为各细胞系大约1.0×107个细胞或大约6×107个细胞。
在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系LN-229、GB-1和SF-126，其中(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系DBTRG-05MG、KNS 60和DMS53，其中：(a)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(b)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMVpp65。
在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系HCT-15、RKO和HuTu-80，其中：(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系HCT-116、LS411N和DMS 53，其中：(a)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRASG12D和KRAS G12V；(b)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：(a)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系J82、HT-1376和TCCSUP，其中：(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：(a)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(b)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：(a)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(b)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1和DETROIT 562，其中：(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且(c)DETROIT562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系KON、OSC-20和DMS 53，其中：(a)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；(b)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系MKN-1、MKN-45和MKN-74，其中：(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中：(a)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；(b)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系CAMA-1、AU565和HS-578T，其中：(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系MCF-7、T47D和DMS53，其中：(a)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种前述疫苗组合物，其中该治疗有效量为各细胞系大约1.0×107个细胞或大约6×107个细胞。
在一个实施例中，本公开提供一种组合物，其包含第一混合物和第二混合物；其中该第一混合物包含治疗有效量的至少2种被辐照的癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且其中该第二混合物包含细胞系DMS 53，该细胞系被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在一个实施例中，该第一混合物和/或该第二混合物包含一种或多种被修饰以表达以下或增加以下表达的细胞系：CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMVpp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LYK6K、PRAME、HPV16/18E6/E7或它们的突变型式。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与非小细胞肺癌(NSCLC)相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内至施用该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与神经胶母细胞瘤相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126；其中：(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53；其中：(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的神经胶母细胞瘤的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126；其中：(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53；其中：(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与结肠直肠癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-15、RKO和HuTu-80，其中：(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-116、LS411N和DMS53；其中：(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的结肠直肠癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-15、RKO和HuTu-80，其中：(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-116、LS411N和DMS 53；其中：(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与前列腺癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：(d)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(f)DMS53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的前列腺癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：(d)DU 145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(f)DMS53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与膀胱癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系J82、HT-1376和TCCSUP，其中：(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的膀胱癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系J82、HT-1376和TCCSUP，其中：(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与卵巢癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的卵巢癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且(f)DMS53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与头颈癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中：(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系KON、OSC-20和DMS 53，其中：(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18E6和E7；(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的头颈癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中：(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系KON、OSC-20和DMS 53，其中：(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16E6和E7和HPV18 E6和E7；(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与胃癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MKN-1、MKN-45和MKN-74；其中：(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的胃癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MKN-1、MKN-45和MKN-74；其中(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且(f)DMS53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与乳腺癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS53，其中：(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MCF-7、T47D和DMS53，其中：(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。在另一实施例中，本公开提供一种治疗人类受试者的乳腺癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，该第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系CAMA-1、AU565和HS-578T，其中(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，该第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MCF-7、T47D和DMS 53，其中：(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；其中该第一疫苗组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二疫苗组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与NSCLC相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含：a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；b.在(a)中的该一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中该第一组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且该第二组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；c.在(a)中的该一周之后，经由注射以200mg的剂量进一步施用第一剂量的包含派姆单抗的组合物；d.在(b)中该第一剂量施用之后3周、6周、9周、15周、21周和27周，进一步施用后续剂量的该第一组合物和该第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；e.在(c)中该第一剂量之后3周、6周、9周、12周、15周、18周、21周、24周和27周以200mg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的该包含派姆单抗的组合物；其中该第一组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含：a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；b.在(a)中的该一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中该第一组合物为本文所提供的组合物；并且该第二组合物为本文所提供的不同组合物；c.在(a)中的该一周之后，经由注射以200mg的剂量进一步施用第一剂量的包含派姆单抗的组合物；d.在(b)中该第一剂量施用之后3周、6周、9周、15周、21周和27周，进一步施用后续剂量的该第一组合物和该第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；e.在(c)中该第一剂量之后3周、6周、9周、12周、15周、18周、21周、24周和27周以200mg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的该包含派姆单抗的组合物；其中该第一组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与NSCLC相关的TAA的免疫反应的方法，其包含：a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；b.在(a)中的该一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中该第一组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且该第二组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；c.在(a)中的该一周之后，以10mg/kg的剂量经由注射进一步施用第一剂量的包含德瓦鲁单抗的组合物；d.在(b)中该第一剂量施用之后2周、4周、10周、16周、22周和28周，进一步施用后续剂量的该第一组合物和该第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；e.在(c)中该第一剂量之后2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周和30周以10mg/kg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的该包含德瓦鲁单抗的组合物；其中该第一组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种刺激人类受试者中的特异性针对与NSCLC相关的TAA的免疫反应的方法，其包含：a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；b.在(a)中的该一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中该第一组合物为本文所提供的组合物并且该第二组合物为本文提供的不同组合物；c.在(a)中的该一周之后，以10mg/kg的剂量经由注射进一步施用第一剂量的包含德瓦鲁单抗的组合物；d.在(b)中该第一剂量施用之后2周、4周、10周、16周、22周和28周，进一步施用后续剂量的该第一组合物和该第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；e.在(c)中该第一剂量之后2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周和30周以10mg/kg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的该包含德瓦鲁单抗的组合物；其中该第一组合物皮内施用至该受试者的手臂中，并且该第二组合物皮内施用至该受试者的大腿中。
在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含肺癌细胞系NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23的细胞，并且其中：(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53的细胞，其中：(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMVpp65。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N和DMS 53的细胞，其中：(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP和DMS 53的细胞，其中：(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；(d)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3和DMS 53的细胞，其中：(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20和DMS 53的细胞，其中：(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含大约癌细胞系MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97和DMS 53的细胞，其中：(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS 53的细胞，其中：(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种肺癌疫苗的单位剂量，其包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的肺癌细胞系NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中：(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53，其中：(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMVpp65。
在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N和DMS 53，其中：(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；(d)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20和DMS 53，其中：(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且(c)DETROIT562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中：(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在另一实施例中，本公开提供一种癌症疫苗的单位剂量，该癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS 53，其中：(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且(f)DMS53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
在一些实施例中，提供一种前述组合物，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。在一些实施例中，本公开提供一种前述单位剂量，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。在其它实施例中，提供一种前述试剂盒，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。在其它实施例中，本公开提供一种前述方法，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。
附图说明
图1A和B示出与对照相比在被减弱HLA-G的shRNA稳定转导的细胞中HLA-G mRNA和蛋白质表达的减少。
图2A和B示出HLA-G表达的减少增加IFNγ产生。
图3A-C示出锌指核酸酶(ZFN)介导的基因编辑使A549(图3A)、NCI-H460(图3B)和NCI-H520(图3C)细胞系中的CD47表达减少。
图4A和B示出在ELISpot分析中NCI-H520细胞系中CD47的减少增加单核球衍生的树突状细胞和巨噬细胞的吞噬作用(图4A)和增加IFNγ反应(图4B)。
图5示出NCI-H460细胞系中ZFN介导的PD-L1基因编辑引起PD-L1表达减少99％。
图6示出NCI-H2009细胞系中ZFN介导的BST2基因编辑引起BST2表达减少98.5％。
图7A-C示出NCI-H460细胞系中shRNA(图7A)、Cas9(图7B)和ZFN介导(图7C)的基因编辑使TGFβ1和TGFβ2减少。
图8A和B示出DMS 53(图8A)细胞系和NCI-H520(图8B)细胞系中shRNA介导的TGFβ1和/或TGFβ2减弱。
图9A-E示出NCI-H2023(图9A)、NCI-H23(图9B)、A549(图9C)、LK-2(图9D)和NCI-H1703(图9E)细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2的减少。
图10A-C示出NCI-H460细胞系中TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1和TGFβ2的减弱增加针对亲本NCI-H460细胞和存活素(BIRC5)抗原的IFNγ反应。
图11A和B示出在IFNγELISpot分析中和在混合淋巴细胞共培养分析中在再刺激时用来自NCI-H520 TGFβ1 KD细胞的溶解产物负载树突状细胞(DC)增加针对亲本NCI-H460细胞的IFNγ反应。
图12示出TGFβ1 TGFβ2减弱与敲除之间的IFNγ反应比较。
图13示出TGFβ1 TGFβ2减弱与敲除之间的蛋白质组比较。
图14A-F示出经TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系的示例性组合诱导的针对未被修饰的亲本细胞系的IFNγ反应。
图15A和B示出经TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系的示例性组合诱导的针对癌症抗原的IFNγ反应。
图16A和B示出RERF-LC-Ad1细胞系中HLA-E表达的减少增加细胞免疫反应。
图17A和B示出NCI-H520细胞系中CTLA-4表达的减少增加细胞免疫反应。
图18A和B示出A549细胞系中CD276的减少增加细胞免疫反应。
图19A-D示出NCI-H2023细胞系中CD47表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图20A-D示出NCI-H23细胞系中CD47表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图21A-D示出A549细胞系中CD47表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图22A-D示出NCI-H460细胞系中CD47表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图23A-C示出NCI-H1703细胞系中CD47表达和TGFβ1分泌的减少。
图24A-C示出LK-2细胞系中CD47表达和TGFβ2分泌的减少。
图25A-C示出DMS 53细胞系中CD47表达和TGFβ2分泌的减少。
图26A-C示出NCI-H520细胞系中CD47表达和TGFβ2分泌的减少。
图27A-D示出NCI-H2023细胞系中CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图28A-D示出NCI-H23细胞系中CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图29A-D示出A549细胞系中CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图30A-D示出NCI-H460细胞系中CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图31A-C示出NCI-H1703细胞系中CD276表达和TGFβ1分泌的减少。
图32A-C示出LK-2细胞系中CD276表达和TGFβ2分泌的减少。
图33A-C示出DMS 53细胞系中CD276表达TGFβ2分泌的减少。
图34A-C示出NCI-H520细胞系中CD276表达和TGFβ2分泌的减少。
图35A和B示出NCI-H460(图35A)和A549(图35B)细胞系中CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少增加细胞免疫反应。
图36A-D示出A549细胞系中CD47和CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少。
图37A和B示出CD47和CD276表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少增加免疫原性。
图38A-D示出A549细胞系中膜结合的CD40L的表达增加树突状细胞(DC)成熟和细胞免疫反应。
图39示出NCI-H460细胞系中GM-CSF的过度表达增加细胞免疫反应。
图40示出A549细胞系中IL-12的表达增加细胞免疫反应。
图41A-D示出NCI-H520(图41A)、A549(图41B)、LK-2(图41C)和NCI-H460(图41D)细胞系中GITR的表达。
图42A-D示出GITR的表达增强细胞免疫反应。
图43A和B示出IL-15的表达增强细胞免疫反应。
图44A和B示出IL-23的表达增强细胞免疫反应。
图45示出XCL1的表达。
图46A-E示出NCI-H520细胞系(图46A)、LK-2细胞系(图46B和图46E)、A549细胞系(图46C)和NCI-H460细胞系(图46D)中间皮素的表达和增加之间皮素特异性IFNγ反应。
图47示出CT83的表达。
图48A-E示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO细胞系中GM-CSF的分泌和膜结合的CD40L的表达。
图49A-E示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO细胞系中GM-CSF的分泌和膜结合的CD40L的表达。
图50A-E示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系中GM-CSF的分泌和膜结合的CD40L的表达。
图51A-E示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系中GM-CSF的分泌和膜结合的CD40L的表达。
图52A-C示出TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO或TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系中GM-CSF的分泌和膜结合的CD40L的表达增加细胞免疫反应和DC成熟。
图53A-E示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO细胞系中GM-CSF的分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌。
图54A-F示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO细胞系中GM-CSF的分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌。
图55A和B示出A549(图55A)和NCI-H460(图55B)TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO细胞系的GM-CSF的分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌增加抗原特异性反应。
图56示出A549 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系中GM-CSF的分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌。
图57A-F示出NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系中GM-CSF的分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌。
图58A-D示出A549和NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系的GM-CSF的分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌增加DC成熟和抗原特异性反应。
图59示出HLA错配引起免疫原性增加。
图60示出某些细胞系中NSCLC抗原的表达。
图61A-C示出NSCLC疫苗和贝拉金普(Belagenpumatucel-L)的内源性TAA表达图谱的比较。
图62A和B示出与细胞系的混合物相比单个细胞系所引发的IFNγ反应。
图63示出针对所选抗原的IFNγ反应。
图64示出NSCLC疫苗细胞系上膜结合的CD40L的表达。
图65A和B示出LK-2细胞系的CT83和间皮素的表达和对CT83和间皮素抗原的IFNγ反应。
图66A和B示出由贝拉金普和NSCLC疫苗产生的IFNγ反应的比较。
图67A和B示出各个供体中由贝拉金普和NSCLC疫苗产生的IFNγ反应的比较。
图68A-C示出GBM抗原(图68A)和候选疫苗细胞系(图68B)和GBM患者肿瘤样品(图68C)中GBM CSC样标记物的表达。
图69A-C示出单个候选GBM疫苗细胞系(图69A)和细胞系混合物中引发的IFNγ反应(图69B-C)。
图70A和B示出GBM疫苗细胞系的GBM抗原的内源性表达(图70A)和由该等疫苗细胞系表达的在GBM患者肿瘤中也表达的GBM抗原数目(图70B)。
图71A-K示出相较于未被修饰的对照，GBM疫苗细胞系中引入的抗原的表达和针对该等抗原的IFNγ反应。SF-126的modTERT的表达(图71A)和GBM-疫苗A中对TERT的IFNγ反应(图71G)。LN-229的modPSMA的表达(图71B)和GBM-疫苗A中对PSMA的IFNγ反应(图71H)。KNS 60的modMAGEA1、EGFRvIII和pp65的表达(图71C-F)和GBM-疫苗B中对MAGEA1、EGFRvIII和pp65的IFNγ反应(图71I-K)。
图72示出GBM疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图73A-C示出相较于未被修饰的对照，由GBM疫苗(图73A)、GBM疫苗-A(图73B)和GBM疫苗-B(图73C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图74示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由GBM疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图75A-C示出所选细胞系(图75B)和CRC患者肿瘤样品(图75C)中CRC抗原(图75A)和CRC CSC样标记物的内源性表达。
图76A-C示出单个候选CRC疫苗细胞系(图76A)和混合物中引发的IFNγ反应(图76B和C)。
图77示出相较于细胞系混合物，由单独单个候选CRC疫苗细胞系引发的IFNγ反应
图78A和B示出CRC疫苗细胞系的CRC抗原的内源性表达(图78A)和由该等疫苗细胞系表达的在CRC患者肿瘤中亦表达的CRC抗原数目(图78B)。
图79A-J示出相较于未被修饰的对照，CRC疫苗细胞系中引入的抗原的表达和针对该等抗原的IFNγ反应。HuTu80的modPSMA的表达(图79A)和CRC-疫苗A中对PSMA的IFNγ反应(图79F)。HCT-116的modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V的表达(图79B-C)和CRC-疫苗B中对TBXT(图79G)、WT1(图79H)、KRAS G12D(图79I)和KRAS G12D(图79J)的IFNγ反应。
图80示出CRC疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图81A-C示出相较于未被修饰的对照，由CRC疫苗(图81A)、CRC疫苗-A(图81B)和CRC疫苗-B(图81C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图82示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由CRC疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图83示出单独CRC疫苗细胞系和细胞系混合物中诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图84示出候选和最终PCa疫苗细胞系组分中PCa抗原的内源性表达。
图85A和B示出PCa患者肿瘤中由PCa疫苗表达的抗原(图85A)和由该等疫苗细胞系表达的也在PCa患者肿瘤中表达的PCa抗原数目(图85B)。
图86A-D示出单独各个PCa候选疫苗细胞系(图86A)和该等细胞系的混合物中引发的IFNγ反应(图86B-C)并且混合物中未被修饰的LNCaP、NEC8和NTERA-2cl-D1细胞系免疫原性更大(图86D)。
图87A-F示出相较于未被修饰的对照，PCa疫苗细胞系中引入的抗原的表达和针对该等抗原的IFNγ反应。PC3的modTBXT的表达(图87A)和PCa-疫苗A中对TBXT的IFNγ反应(图87D)。PC3的modMAGEC2的表达(图87B)和PCa-疫苗A中对MAGEC2的IFNγ反应(图87E)。DU145的modPSMA的表达(图87C)和PCa-疫苗B中对PSMA的IFNγ反应(图87F)。
图88示出PCa疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图89A-C示出相较于未被修饰的对照，由PCa疫苗(图89A)、PCa疫苗-A(图89B)和PCa疫苗-B(图89C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图90示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由PCa疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图91A-E示出作为细胞系混合物的Pca疫苗细胞系比单个细胞系免疫原性更大。图91A示出对各个PCA疫苗-A细胞系的IFNγ反应。Pca疫苗-A(图91B和图91D)和PCa疫苗-B(图91C和图91E)比单个组分细胞系诱导更稳固的针对亲本细胞系和PCa抗原的IFNγ反应。
图92A和B示出候选UBC疫苗细胞系的膀胱癌抗原(图92A)和膀胱癌CSC样标记物(图92B)的内源性表达。
图93A-C示出由单独各个UBC候选疫苗细胞系(图93A)和混合物中(图93B和图93C)所引发的IFNγ反应。
图94A-C示出UBC疫苗细胞系的膀胱癌抗原的内源性表达(94A)、患者肿瘤中这些抗原的表达(图94B)和由UBC疫苗细胞系表达的也在膀胱癌患者肿瘤中表达的膀胱癌抗原数目(图94C)。
图95AA-H示出相较于未被修饰的对照，UBC疫苗细胞系中引入的抗原的表达和针对该等抗原的IFNγ反应。J82的modPSMA(图95A)和modCripto1(图95B)的表达和由UBC-疫苗A诱导的针对PSMA(图95E)和Cripto1(图95F)的IFNγ反应。SCaBER的modWT1(图95C)和modFOLR1(图95D)的表达和UBC-疫苗B中针对WT1的IFNγ反应(图95G)和FOLR1(图95H)。
图96示出UBC疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图97A-C示出相较于未被修饰的对照，由UBC疫苗(图97A)、UBC疫苗-A(图97B)和UBC疫苗-B(图97C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图98示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由UBC疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图99A和B示出候选卵巢癌疫苗组分细胞系的卵巢癌抗原(图99A)和卵巢癌CSC样标记物(图99B)的内源性表达。
图100A-C示出由单独各个OC候选疫苗细胞系(图100A)和混合物中(图100B和图100C)所引发的IFNγ反应。
图101A-C示出所选OC疫苗组分细胞系的内源性抗原表达(图101A)、患者肿瘤中这些抗原的表达(图101B)和由OC疫苗细胞系表达的也在卵巢癌患者肿瘤中表达的卵巢癌抗原数目(图101C)。
图102A-L示出相较于未被修饰的对照，OC疫苗细胞系中引入的抗原的表达和针对该等抗原的IFNγ反应。MCAS的modTERT的表达(图102A)和OC-疫苗A的对TERT的IFNγ反应(图102G)，TOV-112D的modFSHR(图102B)和modMAGEA10(图102D)的表达和OC-疫苗A的对FSHR(图102H)和MAGEA10(图102I)的IFNγ反应。TOV-21G的modWT1(图102C)和modFOLR1(图102E)的表达和OC疫苗-B的对WT1(图102K)和FOLR1(图102J)的IFNγ反应。ES-2(图102F)的modBORIS的表达和OC疫苗-B的对BORIS的IFNγ反应(图102L)。
图103A和B示出对未被修饰和疫苗组分细胞系TOV-21G(图103A)和ES-2(图103B)细胞系的IFNγ反应。
图104示出OC疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图105A-C示出相较于未被修饰的对照，由OC疫苗(图105A)、OC疫苗-A(图105B)和OC疫苗-B(图105C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图106示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由OC疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图107A和B示出候选和所选头颈癌疫苗组分细胞系的头颈癌抗原(图107A)和头颈癌CSC样标记物(图107B)的内源性表达。
图108A和B示出患者肿瘤中也由所选HN疫苗组分细胞系表达的抗原的表达(图108A)和由HN疫苗细胞系表达的也在头颈癌患者肿瘤中表达的头颈癌抗原数目(图108B)。
图109A-E示出由单独各个HN候选疫苗细胞系(图109A)和细胞系混合物(图109B和图109C)中所引发的IFNγ反应，大部分HN细胞系在混合物中免疫原性更大(图109D)，并且被修饰的HN疫苗组分细胞系比亲本细胞系免疫原性更大(图109E)。
图110A-K示出HSC-4的modPSMA的表达(图110A)和对PSMA的IFNγ反应(图110E)，HO-1-N-1(图110A)的modPRAME(图110B)和modTBXT(图110C)的表达和对PRAME(图110F)和TBXT(图110G)的IFNγ反应，KON的HPV16和HPV18 E6和E7的表达(图110D)和所有供体(图110H)和各个供体(图110I)中对HPV16 E6和E7的IFNγ反应，和所有供体(图110J)和各个供体(图110K)中对HPV18 E6和E7的IFNγ反应。
图111示出HN疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图112A-F示出相较于未被修饰的对照，由HN疫苗的单位剂量(图112A)诱导的针对所有HN抗原和非病毒HN抗原(图112D)、由HN疫苗-A(图112B)诱导的针对所有HN抗原和非病毒HN抗原(图112E)和由HN疫苗-B诱导的针对所有HN抗原(图112C)和非病毒HN抗原(图112F)的抗原特异性IFNγ反应。
图113A和B示出各个供体中针对所有HN抗原(上图)和非病毒HN抗原(下图)的抗原特异性反应。
图114A和B示出候选卵巢癌疫苗组分细胞系的胃癌抗原(图114A)和胃癌CSC样标记物(图114B)的内源性表达。
图115A-C示出由单独各个GCA候选疫苗细胞系(图115A)和混合物中(图115B和图115C)所引发的IFNγ反应。
图116A-C示出所选GCA疫苗组分细胞系的内源性抗原表达(图116A)、患者肿瘤中这些抗原的表达(图116B)和由GCA疫苗细胞系表达的也在胃癌患者肿瘤中表达的胃癌抗原数目(图116C)。
图117A-H示出MKN-1的modPSMA(图117A)和modLY6K(图117B)的表达和针对PSMA(图117E)和LY6K(图117F)的IFNγ反应，示出Fu97的modWT1(图117C)和modCLDN18(图117D)的表达和针对WT1(图117G)和CLDN18(图117H)的IFNγ反应。
图118示出GCA疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图119A-C示出相较于未被修饰的对照，由GCA疫苗(图119A)、GCA疫苗-A(图119B)和GCA疫苗-B(图119C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图120示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由GCA疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图121A和B示出候选乳腺癌疫苗组分细胞系的乳腺癌抗原(图121A)和乳腺癌CSC样标记物(图121B)的内源性表达。
图122A-D示出由单独各个BRC候选疫苗细胞系(图122A和图122C)和混合物中(图122B、图122C和图122D)所引发的IFNγ反应。
图123A-C示出所选BRC疫苗组分细胞系的内源性抗原表达(图123A)，患者肿瘤(图123B)和乳腺癌患者肿瘤(图123C)中这些抗原的表达。
图124A-H示出CAMA-1(图124A)的modPSMA的表达和针对PSMA的IFNγ反应(图124E)，示出AU565的modTERT的表达(图124B)和针对TERT的IFNγ反应(图124F)，并且示出T47D的modTBXT(图124C)和ModBORIS(图124D)的表达和针对TBXT(图124G)和BORIS(图124H)的IFNγ反应。
图125示出BRC疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的表达。
图126A-C示出相较于未被修饰的对照，由BRC疫苗(图126A)、BRC疫苗-A(图126B)和BRC疫苗-B(图126C)的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图127示出相较于未被修饰的对照，各个供体中由BRC疫苗的单位剂量诱导的抗原特异性IFNγ反应。
图128A-D示出相较于单个组分细胞系，BRC疫苗-A(图128A和图128C)和BRC疫苗-B(图128B和图128D)组合物诱导更大广度和量值的抗原特异性反应。
图129示出人类原生PSMA(huPSMA；SEQ ID NO:70)与所设计的具有非同义突变(NSM)的PSMA(PSMAmod；SEQ ID NO:38)之间的序列比对。
图130A-C示出群体中的HLA超型频率。
图131示出疫苗组合物的细胞系中存在的新抗原决定基和GBM中由图131中所述的群体子集内表达HLA-A和HLA-B超型对的供体识别的所设计的新抗原决定基的数目。
图132示出四种不同mRNA免疫疗法所靶向的新抗原决定基的数目。
具体实施方式
本公开的实施例提供一种癌症疫苗接种的平台方法，其提供能够由所公开的组合物、方法和方案治疗的癌症类型方面的广度与由所公开的组合物、方法和方案引发的免疫反应方面的量值。
在本公开的各种实施例中，同种异体全癌细胞疫苗的皮内注射诱导局部发炎反应，使免疫细胞募集至注射部位。不受任何理论或机制约束，在施用疫苗之后，在皮肤中局部存在(疫苗微环境，VME)的抗原呈递细胞(APC)，诸如朗格罕氏细胞(Langerhans cell，LC)和皮肤树突状细胞(DC)，通过吞噬作用吸收疫苗细胞组分并且接着迁移穿过真皮到达引流淋巴结。在引流淋巴结处，已吞噬疫苗细胞系组分的DC或LC可以引发原生T细胞和B细胞。原生T细胞和B细胞的引发启动针对由疫苗细胞系表达的肿瘤相关抗原(TAA)的适应性免疫反应。在本公开的一些实施例中，引发在活体内进行并且不在活体外或离体进行。在本文所提供的疫苗组合物的实施例中，由疫苗细胞系表达的众多TAA也在受试者的肿瘤中表达。抗原特异性T细胞在引流淋巴结的扩增和这些T细胞迁移至肿瘤微环境(TME)可以启动疫苗诱导的抗肿瘤反应。
同种异体疫苗的免疫原性可以经由构成疫苗组合物的细胞系的引入TAA(原生/野生型或如本文所述，被设计/突变)的基因修饰而增强。同种异体疫苗的免疫原性可以经由构成疫苗组合物的细胞系的减少免疫抑制因子的表达和/或增加免疫刺激信号的表达或分泌的基因修饰而进一步增强。这些因子的调节可以增强真皮中LC和DC对疫苗细胞组分的吸收，促进DC和LC迁移至引流淋巴结，并且增强引流淋巴结中的效应T细胞和B细胞引发，由此提供更有效的抗肿瘤反应。
在各种实施例中，本公开提供一种同种异体全细胞癌症疫苗平台，其包括用于治疗癌症和/或预防癌症和/或刺激免疫反应的组合物和方法。根据本公开的实施例的标准和方法包括但不限于：(i)用于选择包括于疫苗组合物中的细胞系的标准和方法；(ii)用于将多种细胞系组合成治疗性疫苗的标准和方法；(iii)用于进行细胞系修饰的标准和方法；和(iv)在存在和不存在额外治疗剂下用于施用治疗组合物的标准和方法。在一些实施例中，本公开提供一种同种异体全细胞癌症疫苗平台，其包括不限于施用包含细胞系组合的多种混合物，该等细胞系组合一起构成一个单位剂量，其中单位剂量在策略上随时间推移而施用，并且另外任选地包括施用其它治疗剂，诸如环磷酰胺，并且另外任选地施用检查点抑制剂。
在一些实施例中，本公开提供用于基于受试者的肿瘤类型修改受试者的治疗方案的组合物和方法。在一些实施例中，本公开提供一种癌症疫苗平台，其中可鉴别同种异体细胞系并且任选地进行修饰并且施用于受试者。在各种实施例中，细胞系的肿瘤来源(原发部位)、由细胞系表达的TAA的量和数目、细胞系修饰的数目和单位剂量中所包括的细胞系的数目各基于受试者的肿瘤类型、癌症阶段和其它考虑因素来定制。如本文所述，细胞系的肿瘤来源可与意图治疗的肿瘤相同或不同。在一些实施例中，癌细胞系可以是癌干细胞系。
定义
在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”和它们的类似术语具有美国专利法中归属于它们的含义并且意指“包括(includes)”、“包括(including)”和它们的类似术语；同样，术语“基本上由……组成”或“基本上组成”具有美国专利法中归属于它们的含义并且这些术语是开放的，允许存在多于所列举者，只要所列举者的基本或新颖特征不因存在多于所列举者变化即可，但不包括现有技术实施例。
除非另外特别陈述或由上下文显而易见，否则如本文所用的术语“一(a)”、“一(an)”和“所述”应理解为单数或复数。
如在本文中可以互换使用的术语“细胞”、“细胞系”、“癌细胞系”、“肿瘤细胞系”和它们的类似术语是指源自如本文所述的癌性肿瘤和/或源自起源于具体来源/器官/组织的肿瘤的亲本细胞系的细胞系。在一些实施例中，癌细胞系是如本文所述的癌干细胞系。在某些实施例中，已知癌细胞系表达或确实表达多种肿瘤相关抗原(TAA)和/或肿瘤特异性抗原(TSA)。在本公开的一些实施例中，癌细胞系被修饰以表达一种或多种TAA或增加其表达。在某些实施例中，癌细胞系包括在许多次细胞继代之后的细胞系、生长培养基或条件的任何变化、引入可改变诸如人类端粒酶逆转录酶(hTERT)永生化的细胞系特征的修饰、使用异种移植技术(包括经由异种模型连续继代，模型诸如患者来源的异种移植物(PDX)或下一代测序(NGS)小鼠)、和/或与一种或多种其它细胞系共培养以提供混合细胞系群体。如本文所用，术语“细胞系”包括在一些实施例中如通过短串联重复序列(STR)测序所确定，或如通过所属领域的技术人员另外所确定，经鉴别在特征或区段上具有任何重叠的所有细胞系。如本文所用，术语“细胞系”还涵盖任何遗传同质性细胞系，其中构成细胞系的细胞在纯系上来源于单个细胞，使得其在基因上系一致的。这可以例如通过异质性细胞系的限制稀释亚克隆来实现。术语“细胞系”还涵盖任何遗传异质性细胞系，其中构成细胞系的细胞并非如期望地在基因上一致并且含有癌细胞的多个亚群。本文描述细胞系的各种实例。除非另外特别陈述，否则术语“细胞系”或“癌细胞系”涵盖多个“细胞系”。
如本文所用，术语“肿瘤”是指异常细胞累积或肿块。肿瘤可以是良性(非癌性)、癌前(癌前，包括增生、异形型、化生、异常增生和原位癌)或恶性(癌性)。众所周知肿瘤可以是“热性”或“冷性”的。作为实例，尤其黑色素瘤和肺癌证实对检查点抑制剂的反应率相对较高并且通常称为“热性”肿瘤。这些肿瘤与具有低免疫浸润的称为“冷性”肿瘤或非T细胞发炎癌症的肿瘤(诸如尤其来自前列腺、胰腺、神经胶母细胞瘤和膀胱的肿瘤)形成鲜明对比。在一些实施例中，本文提供的组合物和方法适用于治疗或预防具有相关热性肿瘤的癌症。在一些实施例中，本文提供的组合物和方法适用于治疗或预防具有冷性肿瘤的癌症。本公开的疫苗组合物的实施例可以用于将冷性(即，耐治疗性或难治性)癌症或肿瘤转变成热性(即，能够治疗，包括基于检查点抑制的治疗)癌症或肿瘤。因为缺乏与低突变负荷相关的新抗原决定基，所以针对冷性肿瘤的免疫反应减弱。在各种实施例中，本文所述的组合物包含众多由点突变产生的潜在新抗原决定基，该等点突变可产生众多外源性抗原性抗原决定基。以此方式，患者的免疫系统可以将这些抗原决定基识别为非自身的，随后破坏自身耐受性，并且发动针对冷性肿瘤的抗肿瘤反应，包括诱导针对广泛抗原的适应性免疫反应(参见Leko,V.等人《免疫学杂志(J Immunol)》(2019))。
癌症干细胞负责启动肿瘤发展、细胞增殖和癌转移并且是化学疗法和放射线疗法之后复发的关键组分。在某些实施例中，癌干细胞系或显示癌症干细胞特征的细胞系包括在疫苗组合物中的一种或多种中。如本文所用，短语“癌症干细胞”(CSC)或“癌干细胞系”是指肿瘤内具有自我更新和引起构成肿瘤的癌细胞的异质谱系的能力的细胞或细胞系。CSC对传统癌症疗法具高度抗性并且假设其为癌转移和肿瘤复发的主要驱动因子。澄清一下，显示癌症干细胞特征的细胞系包括于“癌症干细胞”的定义内。表2中提供由原发性肿瘤部位鉴别的示例性癌症干细胞标记物并且在本文描述。“癌干细胞系”的定义涵盖表达这些标记物中的一种或多种的细胞系。本文描述示例性癌干细胞系，“癌干细胞系”的定义涵盖每一种。
如本文所用，短语“各细胞系或细胞系的组合”在多种细胞系呈组合提供的情况下是指该等细胞系中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种或组合。如本文所用，短语“被修饰的各细胞系或被修饰的细胞系的组合”在多种细胞系呈组合提供的情况下是指一种、一些或所有细胞系的修饰，并且还指可能并非所有包括在组合中的细胞系被修饰。作为实例，短语“一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰……”意指两种细胞系中的每一种被修饰或两种细胞系之一被修饰。通过另一实例，短语“一种组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或该等细胞系的组合所包含的细胞被修饰……”意指该等细胞系中的每一种(即，所有三种)被修饰或三种细胞系中的一或两种被修饰。
如本文所用，术语“致癌基因”是指与肿瘤形成有关的基因。致癌基因是促使癌症发展的突变基因。在正常未突变状态下，致癌基因称为原致癌基因，并且其在调控细胞分裂中起作用。
如本文所用，例如在用于制备如本文所述的适用于刺激免疫反应或治疗癌症的组合物的方法中短语“鉴别一种或多种……突变”是指新鉴别、在数据库或数据集内或另外使用如本文所述的一系列标准或其一种或多种组分鉴别、和任选地选择致癌基因或突变使用或包括于如本文所述的疫苗组合物中。
如本文所用，短语“……表达至少[]种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞……”是指天然或借助于基因修饰表达指定数目的TAA的细胞并且其中患者肿瘤的细胞表达或已知其表达该等相同TAA。患者肿瘤细胞对具体TAA的表达可以通过分析、手术程序(例如生检)或所属领域中已知的其它方法测定。在其它实施例中，临床医师可参考癌细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)和其它已知来源来鉴别已知由具体肿瘤类型的细胞表达的TAA列表。
如本文所用，短语“……不表达或表达极低……”意指所提及的基因或蛋白质(例如TAA或免疫抑制蛋白或免疫刺激蛋白)不由细胞系表达或以低水平表达，其中这类水平对免疫原性无影响或影响有限。举例来说，在所属领域中容易理解，TAA在细胞系中存在或表达的量不足以对包括该细胞系的疫苗组合物的治疗作用产生期望影响。在这类情况下，本公开提供增加这类TAA表达的组合物和方法。
如本文所用，术语“同等”通常意指相同值+/-10％。在一些实施例中，诸如细胞数目等测量值可以是+/-1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。类似地，如本文所用并且如与氨基酸位置或核苷酸位置相关，术语“大约”是指1个、2个、3个、4个或5个这类残基内。关于细胞数目，术语“大约”是指+/-1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
如本文所用，短语“……其中相较于未被修饰的癌细胞系，该组合物能够刺激IFNγ产生增加1.3倍……”意指当与尚未被修饰的相同细胞系的组合物相比较时，包含被修饰的细胞系的组合物能够刺激IFNγ产生多至少1.3倍。在此实例中，“至少1.3”意指1.3、1.4、1.5等或更高。此定义在此参照IFNγ产生的其它值使用，包含(但不限于)相较于未被修饰的癌细胞系IFNγ产生增加1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、4.0倍或5.0或更高(例如被修饰的细胞系相较于被修饰的细胞系、2种或3种被修饰的细胞系的组合物(例如疫苗组合物)相较细胞系于包含未被修饰的细胞系的相同组合物、或包含6种被修饰的细胞系的单位剂量相较于包含未被修饰的细胞系的相同单位剂量)。在其它实施例中，相较于未被修饰的癌细胞系，IFNγ产生增加大约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高。类似地，在各种实施例中，本公开提供使用本文所提供的方法和所属领域中已知的方法，包括(但不限于)ELISA、IFNγELISpot和流式细胞术，基于TAA表达、免疫刺激因子表达、免疫抑制因子表达和/或免疫反应刺激与未被修饰的细胞或细胞系相比较的被修饰的细胞或细胞系的组合物。
如本文所用，短语“增加倍数”是指相对于对照的表达单位或反应单位的变化。作为实例，ELISA变化倍数是指针对被修饰的细胞系所检测的分泌蛋白的含量除以针对未被修饰的细胞系所检测的分泌蛋白的含量或检测下限。在另一实例中，通过流式细胞术，抗原表达的变化倍数是指被修饰的细胞系的蛋白质表达的平均荧光强度(MFI)除以未被修饰的细胞系的蛋白质表达的MFI。IFNγELISpot变化倍数是指通过测试变量在HLA不同的供体中诱导的平均IFNγ点形成单位(SFU)除以由对照变量诱导的平均IFNγSFU。例如，三种被修饰的细胞系的组合物的在供体中的平均总抗原特异性IFNγSFU除以相同三种未被修饰的细胞系的组合物的在相同供体中的IFNγSFU。
在一些实施例中，当各细胞系中修饰数目(例如免疫刺激因子数目和免疫抑制因子数目)增加时，IFNγ产生增加倍数将增加。在一些实施例中，当细胞系数目(并且因此TAA数目)增加时，无论被修饰或未被修饰，IFNγ产生增加倍数将增加。因此，在一些实施例中，IFNγ产生增加倍数归因于TAA数目和修饰数目。
如本文所用，术语“被修饰”意指被基因修饰成表达一种或多种蛋白质或核酸、过度表达一种或多种蛋白质或核酸、增加、减少或抑制一种或多种蛋白质或核酸的表达。如本文所述，示例性蛋白质包括(但不限于)免疫刺激因子。示例性核酸包括可以用于减弱(KD)(即，减少表达)或敲除(KO)(即完全抑制表达)免疫抑制因子的序列。如本文所用，术语“减少”与“降低”或“部分降低”同义并且可结合基因减弱使用。同样，术语“抑制”与“完全降低”同义并且可以在基因敲除的情况下使用以描述基因自细胞完全切除。
除非明确陈述或由上下文显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包括性的。
如本文所用，术语“患者”、“受试者”、“受体”和它们的类似术语在本文中可以互换使用，是指任何哺乳动物，包括人类、非人类灵长类动物、家畜和农畜以及其它动物，包括(但不限于)犬、马、猫、牛、绵羊、猪、小鼠、大鼠和山羊。示例性受试者为人类，成年人、儿童和老年人。在一些实施例中，受试者可以是供体。
除非另有指示，否则如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”和它们的类似术语是指逆转、缓解、抑制这类术语适用的疾病、病症或病状的过程，或这类疾病、病症或病状的一种或多种症状，并且包括施用本文所述的组合物、医药组合物或剂型中的任一种，以预防症状或并发症发作、缓解症状或并发症、或消除疾病、症状或病症。如本文所用，治疗可以是治愈性或改善性的。
如本文所用，“预防”意指完全或部分预防、控制、减少或中断这类术语所应用的事物或事件的产生或出现，例如有待预防的疾病、病症或病状。
本文所提供的方法和组合物的实施例适用于预防肿瘤或癌症，这意指预防肿瘤的出现或显著延缓肿瘤发作。在一些实施例中，方法和组合物适用于治疗肿瘤或癌症，这意指如通过所属领域中众所周知的多种技术，诸如肿瘤体积减少所证明，显著抑制肿瘤生长。肿瘤体积可以通过多种已知程序(例如用针盘卡尺获得二维测量)测定。预防和/或治疗肿瘤可延长进行治疗的受试者的存活。
如本文所用，关于免疫反应的术语“刺激”与“促进”、“产生”和“引发”同义并且是指产生免疫反应的一种或多种指示物。本文描述免疫反应的指示物。可以根据本文所述的分析并且通过所属领域中众所周知的方法测定和测量免疫反应。
如本文所用，短语“治疗有效量”、“有效量”、“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”和它们的类似短语指示施用于受试者或施用于受试者的细胞、组织或器官以实现治疗作用，诸如改善性或治愈性作用所需的量。治疗有效量足以在细胞、组织、系统、动物或人类中引起研究人员、兽医、医生、临床医师或医疗保健提供者所寻求的生物或医学反应。举例来说，组合物的治疗有效量是无论被修饰或未被修饰的细胞系足以刺激如本文所述的免疫反应的量。在某些实施例中，组合物的治疗有效量是无论被修饰或未被修饰的细胞系足以抑制如本文所述的肿瘤生长的量。在某些实施例中，有效量或治疗有效量的确定是基于公开案、数据或其它信息，诸如给药方案和/或临床医师的经验。
如本文所用，术语“施用(administering)”、“施用(administer)”、“施用(administration)”和它们的类似术语是指将治疗剂转移、递送、引入或输送至需要用这类药剂治疗的受试者的任何模式。这类模式包括(但不限于)口服、局部、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、瘤内、皮内、鼻内和皮下投药。
如本文所用，术语“疫苗组合物”是指含有一种或多种(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)细胞系的本文所述的疫苗组合物中的任一种。如本文所述，疫苗组合物中的细胞系中的一种或多种可以被修饰。在某些实施例中，疫苗组合物中的细胞系中的一种或多种可未被修饰。术语“疫苗”、“肿瘤细胞疫苗”、“癌症疫苗”、“癌细胞疫苗”、“全癌细胞疫苗”、“疫苗组合物”、“组合物”、“混合物”、“疫苗混合物”和它们的类似术语在本文中可以互换使用。在一些实施例中，本文所述的疫苗组合物适用于治疗或预防癌症。在一些实施例中，本文所述的疫苗组合物适用于刺激或引发免疫反应。在这类实施例中，使用术语“免疫原性组合物”。在一些实施例中，本文所述的疫苗组合物适用作治疗方案的组分以增加该方案的免疫原性。
如在本文中可以互换使用的术语“剂量”或“单位剂量”是指包含治疗有效量的一种或多种细胞系的一种或多种疫苗组合物。如本文所述，组合物的“剂量”或“单位剂量”可以指1种、2种、3种、4种、5种或更多种不同组合物或混合物。在一些实施例中，组合物的单位剂量是指基本上同时施用的2种不同组合物(即，连续紧接)。在示例性实施例中，疫苗组合物的一个剂量包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个单独小瓶，其中各小瓶包含细胞系，并且其中各来自单独小瓶的细胞系在施用之前混合。在一些实施例中，剂量或单位剂量包括6个小瓶，各小瓶包含细胞系，其中将3种细胞系混合并且在一个部位施用，并且将另3种细胞系混合并且在第二部位施用。后续“剂量”可以类似地施用。在其它实施例中，涵盖在受试者身体上2个部位施用2种疫苗混合物，总共同时注射4次。
如本文所用，术语“癌症”是指异常细胞不受控制地分裂并且能够侵袭其它组织的疾病。因此，如本文所用，短语“……与受试者癌症相关”是指肿瘤相关抗原、新抗原或受试者癌症的其它基因型或表型特性的表达。与癌症相关的TAA是在大部分癌症细胞中以可检测水平表达的TAA。可检测表达水平并且通过本文所述的方法测定。存在超过100种不同类型癌症。大部分癌症根据其开始的器官或细胞类型命名；举例来说，在结肠中开始的癌症称为结肠癌；在皮肤黑色素细胞中开始的癌症称为黑色素瘤。癌症类型可分组成更宽类别。在一些实施例中，癌症可分组为实体(即，形成肿瘤)癌症和液体(例如血液癌症，诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)癌症。其它癌症类别包括：癌瘤(意指在皮肤中或在内衬或覆盖内脏的组织中开始的癌症，和其亚型，包括腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)；肉瘤(意指在骨胳、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔组织或支持组织中开始的癌症)；白血病(意指在造血组织(例如骨髓)中开始并且引起大量异常血细胞产生并且进入血液中的癌症；淋巴瘤和骨髓瘤(意指在免疫系统细胞中开始的癌症)；以及中枢神经系统癌症(意指在大脑组织和脊髓中开始的癌症)。术语骨髓化生不良综合征是指骨髓无法制造出足够健康的血细胞(白血球、红血球和血小板)并且在血液和/或骨髓中存在异常细胞的癌症类型。骨髓化生不良综合征可以变成急性骨髓性白血病(AML)。借助于非限制性实例，本文所述的组合物和方法用于治疗和/或预防本文所述的癌症，在各种实施例中包括肺癌(例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、转移性乳腺癌、乳腺管原位癌、侵袭性乳腺癌、炎性乳腺癌、佩吉特氏病(Paget disease)、乳房血管肉瘤、叶状肿瘤、睪丸癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肾癌、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤、星形细胞瘤、卵巢癌、神经内分泌癌、胰腺癌、食道癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、间皮瘤和/或肝细胞癌。
癌瘤的实例包括(但不限于)巨细胞和梭状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病腺癌；实体癌瘤；类癌肿瘤；细支气管肺泡癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性粒细胞癌；嗜氧性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；非包囊性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺腺癌；耵聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；戒环细胞癌；浸润性导管癌；髓性癌；小叶癌；发炎性癌；佩吉特氏病(Paget'sdisease)；乳腺腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；塞特利氏细胞癌(sertoli cellcarcinoma)；胚胎性癌；以及绒毛膜癌。
肉瘤的实例包括(但不限于)血管球肉瘤；肉瘤；纤维肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；癌肉瘤；滑膜肉瘤；血管肉瘤；卡堡氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；间叶细胞软骨肉瘤；骨胳巨细胞瘤；尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)；牙源性恶性肿瘤；造釉细胞牙肉瘤；恶性造釉细胞瘤；造釉细胞纤维肉瘤；骨髓肉瘤；以及肥大细胞肉瘤。
白血病的实例包括(但不限于)白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核球性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；和毛细胞白血病。
淋巴瘤和骨髓瘤的实例包括(但不限于)恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)；霍奇金氏；类肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样霉菌病；其它特指型非霍奇金氏淋巴瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；以及多发性骨髓瘤。
脑/脊髓癌的实例包括(但不限于)恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质肉瘤神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；肌原纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶母细胞瘤；寡树突神经胶细胞瘤；寡树突神经胶母细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；以及恶性神经鞘瘤。
其它癌症的实例包括(但不限于)胸腺瘤；卵巢基质肿瘤；泡膜细胞瘤；粒层细胞肿瘤；睾丸母细胞瘤；莱迪希氏细胞瘤(leydig cell tumor)；脂质细胞肿瘤；副神经节瘤；乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；恶性蓝痣；恶性纤维组织细胞瘤；恶性混合型肿瘤；苗勒氏管混合型肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳氏瘤(brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿样瘤；恶性中肾瘤；恶性血管内皮瘤；恶性血管外皮瘤；恶性软骨母细胞瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性组织细胞增多病；和免疫增殖性小肠疾病。
本文中所公开的所有参考文献、专利和专利申请案中关于各自被引用的主题以引用的方式并入，在一些情况下可以涵盖文件的全部内容。
疫苗组合物
本公开涉及一种进行癌症疫苗接种的平台方法，其提供关于能够用所公开的组合物、方法和方案治疗的癌症和肿瘤类型的范围的广度以及关于由所公开的组合物和方案引发的免疫反应的水平的量值。本公开的实施例提供包含癌细胞系的组合物。在一些实施例中，细胞系已如本文所述进行修饰。
本公开的组合物被设计成增加免疫原性和/或刺激免疫反应。举例来说，在一些实施例中，本文所提供的疫苗增加IFNγ产生和针对多种TAA的免疫反应的广度(例如疫苗能够靶向1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种或更多种TAA，此指示这些抗TAA T细胞前体的T细胞受体(TCR)谱系的多样性。在一些实施例中，本文提供的疫苗所产生的免疫反应是针对超过一种与所给定TAA相关的抗原决定基的反应(例如疫苗能够靶向所给定TAA上的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种或更多种抗原决定基)，此指示这些抗TAAT细胞前体的TCR谱系的多样性。
在某些实施例中，这可以通过以下来实现：选择表达与有待治疗的癌症相关的大量TAA的细胞系；减弱或敲除帮助肿瘤细胞逃避免疫系统监视的一种或多种免疫抑制因子的表达；表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达以增加疫苗微环境(VME)内的免疫活化；增加一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的表达以增加呈递至宿主免疫系统的相关抗原目标的范围，任选地其中TAA被设计或增强(例如通过突变而修饰)并且包含例如非同义突变(NSM)和/或新抗原决定基；施用包含至少1种癌症干细胞的疫苗组合物；和/或它们的任何组合。
疫苗组合物的一种或多种细胞系可以被修饰以减少超过一种免疫抑制因子(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种免疫抑制因子)的产生。疫苗的一种或多种细胞系可以被修饰以增加超过一种免疫刺激因子(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种免疫刺激因子)的产生。疫苗组合物的一种或多种细胞系可以天然表达或被修饰以表达超过一种TAA，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种或更多种TAA。
疫苗组合物可以包含来自1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种细胞系的细胞。此外，如本文所述，细胞系可以例如在施用之前组合或混合。在一些实施例中，可以减少或消除一种或多种免疫抑制因子自一种或多种细胞系或细胞系的组合。在一些实施例中，可以添加或增加一种或多种免疫刺激因子自一种或多种细胞系或细胞系的组合产生。在某些实施例中，可以选择一种或多种细胞系或细胞系的组合以表达TAA的异质性。在一些实施例中，细胞系可以被修饰以增加一种或多种免疫刺激因子、TAA和/或新抗原的产生。在一些实施例中，细胞系选择使得HLA超型的异质性在疫苗组合物中表示出。在一些实施例中，选择细胞系用于包括于疫苗组合物中，使得表示TAA的期望补体。
在各种实施例中，疫苗组合物包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中该细胞系或细胞系的组合表达表7-23的TAA中的超过一种。在一些实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少两种癌细胞系的细胞，其中各细胞系或细胞系的组合表达表7-23的TAA中的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种。在一些实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中该至少一种癌细胞系被修饰以表达表4的免疫刺激因子中的至少一种、表4的免疫刺激因子中的至少两种或表4的免疫刺激因子的至少三种。在其它实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中各细胞系或细胞系的组合被修饰以减少表6的免疫抑制因子中的至少一种或表6的免疫抑制因子中的至少两种。
在一种或多种细胞系被修饰以增加一种或多种TAA的产生的实施例中，所表达的TAA可以具有或可不具有DNA/蛋白质的原生编码序列。即，表达可以经密码子优化或被修饰。这类优化或修饰可以增强某些作用(例如可以减少TAA蛋白自疫苗细胞膜排出)。如本文所述，在一些实施例中，所表达的TAA蛋白质是包含一个或多个在癌症患者中鉴别的非同义突变(NSM)的所设计的抗原。在一些实施例中，NSM引入CD4、CD8或CD4和CD8新抗原决定基。
本文所述的疫苗组合物中的任一种可以施用于受试者以治疗癌症、预防癌症、延长患有癌症的受试者的存活和/或刺激受试者中的免疫反应。
细胞系
在本公开的各种实施例中，构成疫苗组合物并且用于本文所述的方法中的细胞系来源于亲本癌细胞系。
细胞系可以从如本文所述的大量来源获得并且是所属领域中容易地已知的。例如，癌细胞系可从以下获得：美国菌种保存中心(American Type Culture Collection，ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))、日本研究生物资源库(Japanese Collectionof Research Bioresources cell bank，JCRB，密苏里州堪萨斯城市(Kansas City,MO))、细胞系服务(Cell Line Service，CLS，德国埃佩尔海姆(Eppelheim,Germany))、德国微生物与细胞培养物保存中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ，德国不伦瑞克(Braunschweig,Germany))、理研生物资源研究中心(RIKENBioResource Research Center，RCB，日本筑波(Tsukuba,Japan))、韩国细胞系库(KoreanCell Line Bank，KCLB，韩国首尔(Seoul,South Korea))、NIHAIDS试剂计划(NIHAIDSReagent Program，NIH-ARP/Fisher BioServices，马里兰州罗克兰(Rockland,MD))、生物研究收集和研究中心(Bioresearch Collection andResearch Center，BCRC，中国台湾新竹)、国际实验室细胞系保存中心(Interlab Cell Line Collection，ICLC，意大利热那亚(Genova,Italy))、欧洲认证细胞培养物保存中心(European CollectionofAuthenticated Cell Cultures，ECACC，英国索尔兹伯里(Salisbury,UnitedKingdom))、昆明细胞库(Kunming Cell Bank，KCB，中国云南(Yunnan,China))、美国国家癌症研究所发展治疗计划(National Cancer Institute Development TherapeuticsProgram，NCI-DTP，美国贝塞斯达(Bethesda,MD))、里约热内卢细胞库(Rio de JaneiroCell Bank，BCRJ，巴西里约热内卢(Rio de Janeiro,Brazil))、伦巴第和艾米莉亚·罗马涅实验动物预防研究所(Zooprophylactic Institute of Lombardy and EmiliaRomagna，IZSLER，意大利米兰(Milan,Italy))、日本东北大学细胞系目录(TohokuUniversity cell line catalog，TKG，日本宫城(Miyagi,Japan))和伊朗国家细胞库(National Cell Bank ofIran，NCBI，伊朗德黑兰(Tehran,Iran))。在一些实施例中，经由关于TAA、免疫抑制因子表达和/或所属领域的技术人员容易获得的其它信息检查RNA-seq数据来鉴别细胞系。
在各种实施例中，本文所述的组合物和方法中的细胞系来自起源于以下的实体肿瘤的亲本细胞系：肺、前列腺、睪丸、乳房、泌尿道、结肠、直肠、胃、头颈部、肝脏、肾脏、神经系统、内分泌系统、间皮、卵巢、胰腺、食道、子宫或皮肤。在某些实施例中，亲本细胞系包含选自由以下组成的群组的相同或不同组织学的细胞：鳞状细胞、腺癌细胞、腺鳞细胞、大细胞细胞、小细胞细胞、肉瘤细胞、癌肉瘤细胞、混合间皮细胞和畸胎癌细胞。在相关实施例中，肉瘤细胞包含骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤、星形细胞瘤、粘液肉瘤、间叶或混合间皮细胞。
在某些实施例中，细胞系包含起源于以下的癌细胞：肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌(TNBC))、膀胱或泌尿道癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肝细胞(HCC)癌、肾或肾细胞癌(RCC)、胃或胃癌、卵巢癌、食道癌、睪丸癌、胰腺癌、中枢神经系统癌症、子宫内膜癌、黑色素瘤和间皮癌。
根据各种实施例，细胞系是同种异体细胞系(即，虽然来自相同物种的个体，但在基因上不同并且因此在免疫学上不相容的细胞。)在某些实施例中，细胞系是遗传异质性同种异体细胞系。在其它实施例中，细胞系是遗传同质性同种异体细胞系。
基于同种异体细胞的疫苗不同于自体疫苗，因为其不含患者特异性肿瘤抗原。本文所公开的同种异体疫苗组合物的实施例包含已知表达具体肿瘤类型的TAA的实验室生长的癌细胞系。本公开的同种异体细胞系的实施例在用于疫苗组合物中之前进行策略性选择、获得和修饰。本公开的实施例的疫苗组合物容易量产。相对于基于自体的疗法，在研发、制造、储存和其它领域中的此性能可降低成本并且产生经济效益。
肿瘤通常由随时间进化和改变的癌细胞的高异质群体构成。因此，可以假设，仅包含不靶向此癌症进化和进展的自体细胞系的疫苗组合物不足以引发有效疫苗接种所需的广泛免疫反应。如本文所公开的疫苗组合物的实施例中所述，使用一种或多种具有某些基因修饰的策略性选择的同种异体细胞系解决此差异。
在一些实施例中，基于同种异体细胞的疫苗来自设法治疗的癌症的同一类型的癌细胞系(例如乳房、前列腺、肺)。在其它实施例中，各种类型细胞系(即，来自不同原发性肿瘤来源的细胞系)组合(例如干细胞、前列腺、睪丸)。在一些实施例中，疫苗组合物中的细胞系是设法治疗的癌症的同一类型的细胞系与来自不同原发性肿瘤来源的细胞系的混合物。
示例性癌细胞系，包括(但不限于)以下表1中提供的癌细胞系，考虑用于本文所述的组合物和方法。本文中鉴别的细胞系来源仅出于例示性目的。在本文中的各种实施例中描述的细胞系可自多种来源获得。
表1.每个适应症的示例性疫苗组合物细胞系
除表1中鉴别的细胞系以外，在各种实施例中还考虑以下细胞系。
在各种实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种非小细胞肺(NSCLC)细胞系。作为实例，考虑以下NSCLC细胞系：NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23。本公开还考虑另外NSCLC细胞系。如本文所述，还考虑在包含NSCLC细胞系的疫苗中包括诸如DMS53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种前列腺癌细胞系。作为实例，考虑以下前列腺癌细胞系：PC3、DU-145、LNCAP、NEC8和NTERA-2cl-D1。本公开还考虑另外前列腺癌细胞系。如本文所述，还考虑在包含前列腺癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种结肠直肠癌(CRC)细胞系。作为实例，考虑以下结肠直肠癌细胞系：HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116和LS411N。本公开还考虑另外结肠直肠癌细胞系。如本文所述，还考虑在包含CRC细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系。作为实例，考虑以下TNBC细胞系：Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7和T-47D。本公开还考虑另外乳腺癌细胞系。如本文所述，还考虑在包含乳腺癌和/或TNBC癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种膀胱或泌尿道癌细胞系。作为实例，考虑以下泌尿道或膀胱癌细胞系：UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376和SCaBER。本公开还考虑另外膀胱癌细胞系。如本文所述，还考虑在包含膀胱或泌尿道癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种胃或胃癌细胞系。作为实例，考虑以下胃或胃癌细胞系：Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1和MKN1。本公开还考虑另外胃癌细胞系。如本文所述，还考虑在包含胃或胃癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)细胞系。作为实例，考虑以下SCCHN细胞系：HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1和OSC-20。本公开还考虑另外SCCHN细胞系。如本文所述，还考虑在包含SCCHN癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种小细胞肺癌(SCLC)细胞系。作为实例，考虑以下SCLC细胞系：DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841和NCI-H1694。本公开还考虑另外SCLC细胞系。如本文所述，还考虑在包含SCLC癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种肝脏或肝细胞癌(HCC)细胞系。作为实例，考虑以下HCC细胞系：Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-6、Li7、HLF、HuH-6、JHH-5和HuH-7。本公开还考虑另外HCC细胞系。如本文所述，还考虑在包含肝脏或HCC癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种肾癌、诸如肾细胞癌(RCC)细胞系。作为实例，考虑以下RCC细胞系：A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ和VMRC-RCW。本公开还考虑另外RCC细胞系。如本文所述，还考虑在包含肾脏或RCC癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种神经胶母细胞瘤(GBM)癌细胞系。作为实例，考虑以下GBM细胞系：DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60。本公开还考虑另外GBM细胞系。如本文所述，还考虑在包含GBM癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种卵巢癌细胞系。作为实例，考虑以下卵巢细胞系：TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO和MCAS。本公开还考虑另外卵巢细胞系。如本文所述，还考虑在包含卵巢癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种食道癌细胞系。作为实例，考虑以下食道细胞系：TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19、OE21。本公开还考虑另外食道细胞系。如本文所述，还考虑在包含食道癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种胰腺癌细胞系。作为实例，考虑以下胰腺细胞系：PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN1。本公开还考虑另外胰腺细胞系。如本文所述，还考虑在包含胰腺癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种子宫内膜癌细胞系。作为实例，考虑以下子宫内膜细胞系：SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA和石川。本公开还考虑另外子宫内膜细胞系。如本文所述，还考虑在包含子宫内膜癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种黑色素瘤癌细胞系。作为实例，考虑以下黑色素瘤细胞系：RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs294T、Hs 695T、Hs 852T和A2058。本公开还考虑另外黑色素瘤细胞系。如本文所述，还考虑在包含黑色素瘤癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
在一些实施例中，根据本公开制备和使用一种或多种间皮瘤癌细胞系。作为实例，考虑以下间皮瘤细胞系：NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89和IST-Mes2。本公开还考虑另外间皮瘤细胞系。如本文所述，还考虑在包含间皮瘤癌细胞系的疫苗中包括诸如DMS 53的癌干细胞系。
根据本公开的疫苗组合物的实施例用于治疗和/或预防各种类型的癌症。在一些实施例中，疫苗组合物可以包含源自同一癌症类型的癌细胞系。例如，疫苗组合物可以包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种NSCLC细胞系，并且这类组合物可适用于治疗或预防NSCLC。根据某些实施例，包含NCSLC细胞系的疫苗组合物可以用于治疗或预防除NSCLC以外的癌症，其实例在本文中描述。
在一些实施例中，疫苗组合物可以包含源自不同癌症类型的癌细胞系。例如，疫苗组合物可以包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种NSCLC细胞系，加1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种SCLC癌细胞系，任选地，加一种或其它癌细胞系，诸如癌干细胞系等，并且这类组合物可以适用于治疗或预防NSCLC和/或前列腺癌和/或乳腺癌等。根据一些实施例，如本文所述的包含不同癌细胞系的疫苗组合物可以用于治疗或预防多种癌症。在一些实施例中，具体肿瘤中TAA或多种TAA的靶向通过使用来源于生物系统内不同组织或器官的细胞系来优化以靶向同一系统内原发性来源的癌症。借助于非限制性实例，来源于生殖系统(例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睪丸、输精管、储精囊和前列腺)的肿瘤的细胞系可以组合；来源于消化系统(例如唾液腺、食道、胃、肝脏、胆囊、胰腺、肠、直肠和肛门)的肿瘤的细胞系可以组合；来源于呼吸系统(例如咽、喉、支气管、肺和子宫帽)的肿瘤的细胞系可以组合；以及来源于泌尿系统(例如肾脏、输尿管、膀胱和尿道)的肿瘤的细胞系可以组合。
根据疫苗组合物的各种实施例，本公开提供包含细胞系的组合的组合物。借助于非限制性实例，下文提供细胞系组合。在以下实例中的每一个中，细胞系DMS 53无论被修饰或未被修饰，都与相关列表中的5种其它癌细胞系组合。各叙述组合内细胞系中的一种或多种可以如本文所述被修饰。在一些实施例中，细胞系组合中的细胞系都未被修饰。
(1)NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23，用于治疗和/或预防NSCLC；
(2)DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53和NCI-H1694，用于治疗和/或预防SCLC；
(3)DMS 53、PC3、DU-145、LNCAP、NCC-IT和NTERA-2cl-D1，用于治疗和/或预防前列腺癌；
(4)DMS 53、HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116和LS411N，用于治疗和/或预防结肠直肠癌；
(5)DMS 53、Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7和T-47D，用于治疗和/或预防乳腺癌，包括三阴性乳腺癌(TNBC)；
(6)DMS 53、UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376和SCaBER，用于治疗和/或预防膀胱癌；
(7)DMS 53、HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1和OSC-20，用于治疗和/或预防头和/或颈癌；
(8)DMS 53、Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1和MKN1，用于治疗和/或预防胃癌；
(9)DMS 53、Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-6、Li7、HLF、HuH-6、JHH-5和HuH-7，用于治疗和/或预防肝癌；
(10)DMS 53、DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60，用于治疗和/或预防神经胶母细胞瘤；
(11)DMS 53、TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO和MCAS，用于治疗和/或预防卵巢癌；
(12)DMS 53、TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19和OE21，用于治疗和/或预防食道癌；
(13)DMS 53、A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ和VMRC-RCW，用于治疗和/或预防肾癌；
(14)DMS 53、PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN1，用于治疗和/或预防胰腺癌；
(15)DMS 53、SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA和石川，用于治疗和/或预防子宫内膜癌；
(16)DMS 53、RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs695T、Hs 852T和A2058，用于治疗和/或预防皮肤癌；和
(17)DMS 53、NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89和IST-Mes2，用于治疗和/或预防间皮瘤。
在一些实施例中，本文所描述的疫苗组合物和方法中的细胞系包括一种或多种癌症干细胞(CSC)细胞系，无论被修饰或未被修饰。CSC细胞系的一个实例是小细胞肺癌细胞系DMS53，无论被修饰或未被修饰。CSC显示视肿瘤解剖来源而不同的独特标记物。示例性CSC标记物包括prominin-1(CD133)、A2B5、醛去氢酶(ALDH1)、多蜂房蛋白(Bmi-1)、整合素-β1(CD29)、玻尿酸受体(CD44)、Thy-1(CD90)、SCF受体(CD117)、TRA-1-60、巢蛋白、Oct-4、阶段特异性胚抗原-1(CD15)、GD3(CD60a)、阶段特异性胚抗原-1(SSEA-1)或(CD15)、阶段特异性胚抗原-4(SSEA-4)、阶段特异性胚抗原-5(SSEA-5)和汤姆森-弗雷登雷希抗原(Thomsen-Friedenreich antigen，CD176)。
鉴别具有更大的具有干细胞样特性的潜能的癌细胞系的表达标记物视包括原发性肿瘤的解剖来源、器官或组织的多种因子而不同。表2中提供通过原发性肿瘤部位鉴别的示例性癌症干细胞标记物并且公开于多个参考文献中(例如Gilbert,CA和Ross,AH.《细胞生物化学杂志(J Cell Biochem.)》(2009)；Karsten,U和Goletz,S.SpringerPlus(2013)；Zhao,W等人《癌症转化医学(Cancer Transl Med.)》(2017))。
表2中列出示例性细胞系，该等细胞系表达具有对细胞系所源自的原发性肿瘤的解剖部位具有特异性的癌症干细胞样特性的一种或多种标记物。表3中提供示例性癌干细胞系。使用来自癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA-seq数据确定CSC标记物的表达(自www.broadinstitute.org/ccle检索,2019年11月23日；Barretina,J等人《自然(Nature.)》(2012))。将HUGO基因命名委员会基因符号输入CCLE搜索并且针对各CSC标记物下载mRNA表达。如果RNA-seq值(FPKM)超过0，则CSC标记物的表达视为阳性。
表2.根据原发性肿瘤解剖来源的示例性CSC标记物
表3.表达CSC标记物的细胞系
在某些实施例中，包含细胞系组合的疫苗组合物能够刺激免疫反应和/或预防癌症和/或治疗癌症。本公开提供使用一种或多种包含治疗有效量的细胞系的疫苗组合物的组合物和方法。
在混合物或疫苗组合物中来自多种各个细胞系的细胞的量(例如数目)可相同(如本文所定义)或不同。在各种实施例中，在疫苗组合物中来自细胞系或来自各细胞系(在施用多种细胞系的情况下)的细胞数目为大约1.0×106个、2.0×106个、3.0×106个、4.0×106个、5.0×106个、6.0×106个、7.0×106个、8×106个、9.0×106个、1.0×107个、2.0×107个、3.0×107个、4.0×107个、5.0×107个、6.0×107个、8.0×107个或9.0×107个细胞。
例如每个施用部位，施用于受试者的细胞的总数目可以在1.0×106至9.0×107的范围内。例如，施用2.0×106个、3.0×106个、4.0×106个、5.0×106个、6.0×106个、7.0×106个、8×106个、9.0×106个、1.0×107个、2.0×107个、3.0×107个、4.0×107个、5.0×107个、6.0×107个、8.0×107个、8.6×107个、8.8×107个或9.0×107个细胞。
在某些实施例中，疫苗组合物的每次施用中包括的细胞系数目可以在1至10种细胞系的范围内。在一些实施例中，来自各细胞系的细胞数目不相同并且使用不同比率的细胞系。举例来说，若一种混合物含有来自3种不同细胞系的5.0×107个总细胞，则一种细胞系可以是3.33×107个细胞并且其余2种细胞系可以是8.33×106个细胞。
HLA多样性
当受试者的HLA分子与由所施用疫苗组合物的细胞表达的HLA分子不同时，发生HLA错配。HLA匹配过程涉及表征5个主要HLA基因座，其包括三个I类基因座HLA-A、HLA-B和HLA-C和两个II类基因座HLA-DRB1和HLA-DQB1的HLA等位基因。当每个受试者在各基因座表达两个等位基因时，匹配或错配程度按照10的规模计算，其中10/10为所有10个等位基因处的完美匹配。
对错配HLA基因座的反应由免疫系统的先天性和适应性细胞介导。在先天免疫系统的细胞内，HLA等位基因中错配的识别在一定程度上由单核球介导。不受任何理论或机制约束，单核球感测到“非自身”触发单核球衍生的DC的浸润，接着其成熟，引起有效抗原呈递至原生T细胞。与由匹配的同源抗原活化的DC相比，同种异体抗原活化的DC产生的IL-12的量增加，并且此增加的IL-12产生引起对Th1 T细胞的反应偏斜和IFNγ产生增加。适应性免疫系统对HLA错配的识别在一定程度上由T细胞驱动。不受任何理论或机制约束，所有循环T细胞的1-10％是同种异体反应性的并且对自身不存在的HLA分子起反应。这比对常规外来抗原具有反应性的内源性T细胞的频率大若干数量级。免疫系统识别HLA等位基因的这些差异和产生免疫反应的能力是供体与患者之间进行成功移植的障碍，并且已被视为癌症疫苗研发中的障碍物。
基于HLA分子与抗原决定基锚定残基的结合亲和力，可以将多达945个不同HLA-A和HLA-B等位基因分配至九种超型之一。在一些实施例中，本文所提供的疫苗组合物展现HLA超型的异质性，例如HLA-A超型与HLA-B超型的混合物。如本文所述，可以考虑多种特征和标准以确保疫苗组合物的期望异质性，包括(但不限于)受试者种族(关于细胞供体和接受疫苗的受试者)。本文描述另外标准(例如实例22)。在某些实施例中，疫苗组合物表达HLA超型的异质性，其中表示至少两种不同HLA-A和至少两种HLA-B超型。
在一些实施例中，提供包含治疗有效量的多种细胞系的组合物以确保肿瘤细胞疫苗与受体之间的多种I类和II类HLA分子上的广泛HLA错配。
在一些实施例中，疫苗组合物表达HLA超型的异质性，其中该组合物表达主要组织相容性复合体(MHC)分子的异质性，以便表示HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01中的两种和HLA-B07、HLA-B08、HLA-B27和HLA-B44超型中的两种。在一些实施例中，疫苗组合物表达HLA超型的异质性，其中该组合物表达MHC分子的异质性并且至少表示HLA-A24。在一些例示性实施例中，组合物表达MHC分子的异质性，以便表示HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01、HLA-B07、HLA-B27和HLA-B44超型。在其它例示性实施例中，组合物表达MHC分子的遗传异质性，以便表示HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08和HLA-B44超型。
患者显示充当自身标记物的广泛HLA类型。在遇到非自身细胞时，会启动促进诸如IFNγ和IL-2的细胞因子释放的局部发炎反应。在一些实施例中，增加疫苗混合物内HLA-超型的异质性能够在递送疫苗时加强局部发炎反应，赋予辅助作用。如本文所述，在一些实施例中，增加由癌症疫苗组合物引发的肿瘤反应性T细胞的广度、量值和免疫原性通过包括多种细胞系而实现，该等细胞被选择成在HLA类型中具有错配，例如基于某些TAA的表达选择。本文所提供的疫苗组合物的实施例能够在受试者中有效引发广泛并且有效的抗癌反应，并且具有由HLA错配产生的另外辅助作用。疫苗组合物中细胞系组合的各种实施例表达HLA-A超型和HLA-B超型。本文中实例22中提供非限制性实例。
细胞系修饰
在某些实施例中，疫苗组合物包含被修饰的细胞。被修饰的细胞系可以在纯系上来源于单个被修饰的细胞，即基因同质，或来源于基因异质群体。
细胞系可以被修饰以表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达，抑制或减少一种或多种免疫抑制因子的表达，和/或表达一种或多种TAA或增加其表达，包括任选地如本文所述的经突变以呈递新抗原决定基的TAA(例如被设计或增强的具有NSM的抗原)。另外，细胞系可以被修饰以表达可间接调节路径，诸如表达或抑制微型RNA的因子或增加其表达。此外，细胞系可以被修饰以分泌非内源性或改变的外来体。
除修饰细胞系以表达TAA或免疫刺激因子以外，本公开还涵盖将一种或多种TAA(例如被分离的TAA或被纯化和/或重组TAA)或免疫刺激因子(例如以重组方式产生的治疗蛋白)与本文所述的疫苗共施用。
因此，在各种实施例中，本公开提供一种疫苗的单位剂量，该疫苗包含(i)第一组合物，该第一组合物包含治疗有效量的至少1种、2种、3种、4种、5种或6种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合包含表达至少5种、10种、15种、20种、25种、30种、35种或40种与意图接受该组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中该组合物能够引发特异性针对至少5种、10种、15种、20种、25种、30种、35种或40种TAA的免疫反应，和(ii)第二组合物，该第二组合物包含一种或多种被分离的TAA。在其它实施例中，第一组合物所包含的细胞系被进一步修饰以(a)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。
免疫刺激因子
免疫刺激蛋白为膜结合、分泌或两者的蛋白质，其增强和/或增加效应T细胞反应和/或体液免疫反应的效力。不受任何理论约束，免疫刺激因子可以增强抗肿瘤免疫性并且增加癌症疫苗免疫原性。存在增强免疫反应的许多因子。举例来说，这些因子可以影响抗原呈递机制或T细胞机制。这些因子的基因的插入可以通过使疫苗对抗肿瘤反应更加免疫刺激而增强对疫苗组合物的反应。
不受任何理论或机制约束，在疫苗微环境(VME)中包括在疫苗中的细胞系的组合对免疫刺激因子的表达可以调节适应性免疫反应的多个方面。细胞系对诸如GM-CSF和IL-15的分泌的细胞因子的表达可以诱导单核球分化，募集至疫苗递送部位的发炎性环境、募集至树突状细胞(DC)，由此富集抗原呈递细胞池汇集在VME中。某些细胞因子的表达还可以使已存在的DC和朗格罕氏细胞(Langerhans cell，LC)成熟和活化。某些细胞因子的表达可以促进DC和LC引发T细胞朝向效应表型。在VME中遇到表达IL-12的疫苗细胞的DC应激活引流淋巴结中的效应T细胞并且发动更有效的抗肿瘤反应。除增强DC成熟以外，某些免疫刺激因子与DC上的其受体的啮合可促进具有效应表型的T细胞激活，同时抑制T调控细胞(Treg)的激活。某些免疫刺激因子与DC上的其受体的接合可促进DC的迁移和T细胞介导之后天性免疫。
在本文所提供的疫苗组合物的一些实施例中，不针对某些细胞系，或在其它实施例中，不针对疫苗组合物中存在的所有细胞系进行表达免疫刺激因子的修饰。
本文提供疫苗组合物的实施例，该疫苗组合物包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系(例如GBM细胞系)的细胞，其中该细胞系被修饰以增加至少一种(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)免疫刺激因子的产生。在一些实施例中，免疫刺激因子选自表4中呈现的免疫刺激因子。还提供示例性NCBI基因ID，所属领域的技术人员可以利用其确定有待引入本公开的疫苗组合物中的序列。这些NCBI基因ID仅是示例性的。
表4.示例性免疫刺激因子
| 因子 | NCBI基因符号(基因ID) |
| CCL5 | CCL5(6352) |
| XCL1 | XCL1(6375) |
| 可溶性CD40L(CD154) | CD40LG(959) |
| 膜结合的CD40L | CD40LG(959) |
| CD36 | CD36(948) |
| GITR | TNFRSF18(8784) |
| GM-CSF | CSF2(1437) |
| OX-40 | TNFRSF4(7293) |
| OX-40L | TNFSF4(7292) |
| CD137(41BB) | TNFRSF9(13604) |
| CD80(B7-1) | CD80(941) |
| IFNγ | IFNG(3458) |
| IL-1β | IL1B(3553) |
| IL-2 | IL2(3558) |
| IL-6 | IL6(3569) |
| IL-7 | IL7(3574) |
| IL-9 | IL9(3578) |
| IL-12 | IL12A(3592)IL12B(3593) |
| IL-15 | IL15(3600) |
| IL-18 | IL-18(3606) |
| IL-21 | IL21(59067) |
| IL-23 | IL23A(51561)IL12B(3593) |
| TNFα | TNF(7124) |
在一些实施例中，疫苗组合物的细胞系可以被修饰(例如被基因修饰)以表达、过度表达一种或多种选自表4的免疫刺激因子或增加其表达。在某些实施例中，免疫刺激序列可以是原生人类序列。在一些实施例中，免疫刺激序列可以是被基因工程改造的序列。被基因工程改造的序列可以经由密码子优化进行修饰以增加蛋白质的表达，或改变蛋白质的细胞定位(例如经由蛋白酶裂解位点的突变)。
举例来说，本文所述的疫苗组合物中的任一种中的至少一种癌细胞系(即，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)可被基因修饰成表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达。由组合物内的细胞表达的免疫刺激因子可都相同，可都不同，或其任何组合。
在一些实施例中，疫苗组合物包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中该至少一种细胞系被修饰以表达表4的免疫刺激因子中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种。在一些实施例中，组合物包含治疗有效量的来自2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种癌细胞系的细胞。在一些实施例中，至少一种细胞系被修饰以增加表5的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子的产生。在一些实施例中，组合物包含治疗有效量的来自2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种癌细胞系的细胞，并且各细胞系被修饰以增加表4的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子的产生。
在一些实施例中，组合物包含治疗有效量的来自3种癌细胞系的细胞，其中细胞系中的1种、2种或所有3种被修饰以表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12或增加其表达。
例如在细胞系被修饰以表达超过一种免疫刺激因子或增加其表达的情况下修饰的示例性组合包括(但不限于)：在其它可能组合当中，GM-CSF+IL-12；CD40L+IL-12；GM-CSF+CD40L；GM-CSF+IL-12+CD40L；GM-CSF+IL-15；CD40L+IL-15；GM-CSF+CD40L；和GM-CSF+IL-15+CD40L。
在某些情况下，肿瘤细胞表达包括IL-12A(IL-12的p35组分)、GM-CSF(肾细胞系)和CD40L(白血病细胞系)的免疫刺激因子。因此，在一些实施例中，细胞系也可以被修饰以增加一种或多种免疫刺激因子的表达。
在一些实施例中，相对于尚未被修饰以表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达的相同细胞系或细胞系组合，如本文所述被修饰以表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达的细胞系组合或细胞系将表达免疫刺激因子至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
增加本文所述的疫苗组合物中的免疫刺激因子的方法包括(但不限于)借助于病毒载体或DNA质粒引入有待表达的核苷酸序列。免疫刺激因子的表达或表达增加可以是稳定表达或短暂表达。
在一些实施例中，本文所述的疫苗组合物中的任一种中的癌细胞被基因修饰成表达CD40配体(CD40L)。在一些实施例中，CD40L是膜结合的。在一些实施例中，CD40L是非膜结合的。除非另外说明，否则如本文所用，CD40L是指膜结合的CD40L。在一些实施例中，本文所述的疫苗组合物中的任一种中的癌细胞被基因修饰成表达GM-CSF、膜结合的CD40L、GITR、IL-12和/或IL-15。表5中呈现用于表达本文提供的免疫刺激因子中的一种或多种的示例性氨基酸和核苷酸序列。
表5.示例性免疫刺激因子的序列
本文提供一种GITR蛋白，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其编码核酸序列，例如SEQ ID NO:5。本文提供一种疫苗组合物，其包含一种或多种表达该蛋白质的细胞系。
本文提供一种GM-CSF蛋白，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其编码核酸序列，例如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。本文提供一种疫苗组合物，其包含一种或多种表达该蛋白质的细胞系。
本文提供一种IL-12蛋白，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其编码核酸序列，例如SEQ ID NO:9。本文提供一种疫苗组合物，其包含一种或多种表达该蛋白质的细胞系。
本文提供一种IL-15蛋白，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其编码核酸序列，例如SEQ ID NO:11。本文提供一种疫苗组合物，其包含一种或多种表达该蛋白质的细胞系。
本文提供一种IL-23蛋白，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其编码核酸序列，例如SEQ ID NO:13。本文提供一种疫苗组合物，其包含一种或多种表达该蛋白质的细胞系。
本文提供一种XCL1蛋白，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其编码核酸序列，例如SEQ ID NO:15。本文提供一种疫苗组合物，其包含一种或多种表达该蛋白质的细胞系。
在一些实施例中，本文所述的疫苗组合物中的任一种中的癌细胞被基因修饰成表达以下中的一种或多种：CD28、B7-H2(ICOS LG)、CD70、CX3CL1、CXCL10(IP10)、CXCL9、LFA-1(ITGB2)、SELP、ICAM-1、ICOS、CD40、CD27(TNFRSF7)、TNFRSF14(HVEM)、BTN3A1、BTN3A2、ENTPD1、GZMA和PERF1。
在一些实施例中，载体含有编码免疫刺激分子的多核苷酸序列。示例性免疫刺激分子可以包括多种细胞因子中的任一种。如本文所用，术语“细胞因子”是指由一个细胞群体释放的以细胞间介体形式作用于一个或多个其它细胞上的蛋白质。这类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人类生长激素、N-甲硫胺酰基人类生长激素和牛类生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；纤维母细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转型生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；红血球生成素(EPO)；骨性诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；群落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；颗粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及颗粒细胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，诸如IL-1至IL-36，包括IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。考虑用于本文中的其它免疫调节分子包括IRF3、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体(CD40L)、药物诱导性CD40(iCD40)等。
在某些实施例中，编码免疫刺激因子的多核苷酸处于一种或多种引导编码序列的表达的调控元件的控制下。在各种实施例中，在一种表达载体上编码超过一种(即，2种、3种或4种)免疫刺激因子。在一些实施例中，在单独表达载体上编码超过一种(即，2种、3种、4种、5种或6种)免疫刺激因子。在各种实施例中，通过使用LipoD293TM活体外DNA转染剂(SignaGen实验室)将293T细胞与慢病毒转移载体和包装质粒(OriGene)短暂共转染，产生含有所关注基因(例如GM-CSF、CD40L或IL-12和如本文所述的其它免疫刺激分子)的慢病毒。
对于慢病毒感染，在一些实施例中，在感染当天将细胞系以1-10×105个细胞/孔的密度接种于孔盘(例如6孔、12孔)中以实现50％-80％细胞汇合。在接种之后18-24小时，将细胞在10μg/mL凝聚胺存在下用慢病毒感染。在慢病毒感染之后18-24小时，将细胞分离并且转移至较大容器。在24-120小时之后，去除培养基并且经补充有抗生素的新鲜培养基置换。
免疫抑制因子
免疫抑制因子是膜结合、分泌或两者并且能够导致缺陷和减少细胞反应的蛋白质。已在肿瘤微环境(TME)的背景下表征多种免疫抑制因子。另外，某些免疫抑制因子可负面调控LC和DC自真皮迁移至引流淋巴结。
TGFβ1为对周边中以及TME中多种免疫细胞子集发挥其作用的抑制性细胞因子。在VME中，TGFβ1负面调控LC和DC从真皮迁移至引流淋巴结。类似地，TGFβ2由大部分肿瘤细胞分泌并且发挥类似于TGFβ1的免疫抑制作用。减少VME中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的疫苗细胞系的修饰确保疫苗不促进TGFβ介导的对LC或DC迁移的抑制。
在TME内，通过预防巨噬细胞吞噬和肿瘤清除，增加呈肿瘤逃逸模式的肿瘤细胞上的CD47表达。DC还表达SIRPα，并且DC上SIRPα的接合可以抑制DC存活和活化。疫苗中可能在TME和VME中起作用的另外免疫抑制因子包括CD276(B7-H3)和CTLA4。DC与TME中的表达CD276或CTLA4的肿瘤细胞接触抑制DC刺激能力，从而减少T细胞激活、增殖和/或促进T细胞增殖。疫苗细胞系上CTLA4和/或CD276的表达可以赋予对VME中的DC或LC的类似抑制作用。
在疫苗组合物的某些实施例中，在其中所含的细胞系的细胞中一种或多种免疫抑制因子的产生可受到抑制或减少。在一些实施例中，在疫苗组合物中所含的细胞系的细胞中一种或多种免疫抑制因子的产生(即，表达)受到抑制(即敲除或完全消除)。在一些实施例中，细胞系可以被基因修饰成减少(即，降低)或抑制免疫抑制因子的表达。在一些实施例中，从细胞完全切除免疫抑制因子。在一些实施例中，细胞系中的一种或多种被修饰，以便以减少或降低至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的程度产生一种或多种免疫抑制因子(即，表达)。在一些实施例中，一种或多种免疫抑制因子选自表6中呈现的群组。
同时，可以增加如本文所述的疫苗组合物中一种或多种免疫刺激因子、TAA和/或新抗原的产生。在疫苗组合物的一些实施例中，除部分降低或完全(例如切除和/或以无法检测到的水平表达)抑制细胞对一种或多种免疫抑制因子的表达外，组合物内的细胞类型中的一种或多种(即，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)也可以被基因修饰成例如通过确保某些免疫刺激因子和/或TAA的表达而增加疫苗的免疫原性。
这些作用、修饰和/或因子的任何组合可以用于产生本文所述的疫苗组合物。借助于非限制性实例，降低或减少免疫抑制因子的表达至少5％、10％、15％、20％、25％或30％与增加免疫刺激因子的表达比未被修饰的细胞系高至少2倍的组合可以有效提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤反应。借助于另一非限制性实例，减少免疫抑制因子至少5％、10％、15％、20％、25％或30％与修饰细胞以在疫苗组合物中表达某些TAA的组合可有效提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤反应。
在一些实施例中，癌症疫苗包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少细胞系的至少一种免疫抑制因子的产生，并且其中该至少一种免疫抑制因子是CD47或CD276。在一些实施例中，CTLA4、HLA-E、HLA-G、TGFβ1和/或TGFβ2的表达也减少。在一些实施例中，疫苗组合物中的一种或多种或所有细胞系被修饰以抑制或减少CD276、TGFβ1和TGFβ2的表达。在另一实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含三种细胞系，各细胞系被修饰以抑制(例如敲除)CD276的表达，并且减少(例如减弱)TGFβ1和TGFβ2的表达。
在一些实施例中，癌症疫苗组合物包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少至少CD47的表达。在一些实施例中，从细胞切除CD47或以减少至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的水平产生。在一些实施例中，从细胞切除CD47或以减少至少90％的含量产生。一种或多种细胞系中另外免疫抑制因子的产生可以减少。在一些实施例中，CD276、CTLA4、HLA-E、HLA-G、TGFβ1和/或TGFβ2的表达也减少或受到抑制。这些疫苗组合物中的一种或多种细胞系中一种或多种免疫刺激因子、TAA或新抗原的产生可以增加。
在一些实施例中，本文提供一种癌症疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少至少CD276的产生。在一些实施例中，从细胞切除CD276或以减少至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的水平产生。在一些实施例中，从细胞切除CD276或以减少至少90％的水平产生。一种或多种细胞系中另外免疫抑制因子的产生可以减少。在一些实施例中，CD47、CTLA4、HLA-E、HLA-G、TGFβ1和/或TGFβ2的表达也减少或受到抑制。这些疫苗组合物中的一种或多种细胞系中一种或多种免疫刺激因子、TAA或新抗原的产生可以增加。
在一些实施例中，本文提供一种癌症疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少至少HLA-G的产生。在一些实施例中，从细胞切除HLA-G或以减少至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的水平产生。在一些实施例中，从细胞切除HLA-G或以减少至少90％的水平产生。一种或多种细胞系中另外免疫抑制因子的产生可以减少。在一些实施例中，CD47、CD276、CTLA4、HLA-E、TGFβ1和/或TGFβ2的表达也减少或受到抑制。这些疫苗组合物中的一种或多种细胞系中一种或多种免疫刺激因子、TAA或新抗原的产生可以增加。
在一些实施例中，本文提供一种癌症疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少至少CTLA4的产生。在一些实施例中，从细胞切除CTLA4或以减少至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的水平产生。在一些实施例中，从细胞切除CTLA4或以减少至少90％的水平产生。一种或多种细胞系中另外免疫抑制因子的产生可以减少。在一些实施例中，CD47、CD276、HLA-E、TGFβ1和/或TGFβ2的表达也减少或受到抑制。这些疫苗组合物中的一种或多种细胞系中一种或多种免疫刺激因子、TAA或新抗原的产生可以增加。
在一些实施例中，本文提供一种癌症疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少至少HLA-E的产生。在一些实施例中，从细胞切除HLA-E或以减少至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的水平产生。在一些实施例中，从细胞切除HLA-E或以减少至少90％的水平产生。一种或多种细胞系中另外免疫抑制因子的产生可以减少。在一些实施例中，CD47、CD276、CTLA4、TGFβ1和/或TGFβ2的表达也减少或受到抑制。这些疫苗组合物中的一种或多种细胞系中一种或多种免疫刺激因子、TAA或新抗原的产生可以增加。
在一些实施例中，本文提供一种癌症疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1与TGFβ2的产生。在一些实施例中，从细胞切除TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1与TGFβ2或以减少至少5％、10％、15％、20％、25％或30％(即至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的水平产生。在疫苗组合物的一些实施例中，从细胞切除TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1与TGFβ2或以减少至少90％的水平产生。
在一些实施例中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ1与TGFβ2的表达经由使用慢病毒载体递送至细胞的短发夹RNA(shRNA)来减少。另外免疫抑制因子的产生可以减少。在一些实施例中，在TGFβ1、TGFβ2、或TGFβ1与TGFβ2表达减少的一种或多种细胞系中CD47、CD276、CTLA4、HLA-E和/或HLA-G的表达也减少。这些疫苗组合物的实施例中的一种或多种细胞系中一种或多种免疫刺激因子、TAA或新抗原的产生也可以增加。
在一些实施例中，选择用于减弱或敲除的免疫抑制因子可以由多种天然序列变异体编码。因此，可使用所属领域的技术人员已知的多种基因编辑/减弱方法实现免疫抑制因子的降低或抑制。如本文所述，在一些实施例中，一种或多种免疫抑制因子的完全敲除可能不如减弱理想。举例来说，TGFβ1有助于调控上皮-间质转化，因此，完全缺乏TGFβ1(例如经由敲除)可诱导肿瘤细胞中较小免疫原性表型。
表6提供可并入或如本文所述进行修饰或两者的组合的示例性免疫抑制因子。还提供所属领域的技术人员可以用于测定靶向进行减弱策略的序列的示例性NCBI基因ID。这些NCBI基因ID仅为示例性的。
表6：示例性免疫抑制因子
| 因子 | NCBI基因符号(基因ID) |
| B7-H3(CD276) | CD276(80381) |
| BST2(CD317) | BST2(684) |
| CD200 | CD200(4345) |
| CD39(ENTPD1) | ENTPD1(953) |
| CD47 | CD47(961) |
| CD73(NT5E) | NT5E(4907) |
| COX-2 | PTGS2(5743) |
| CTLA4 | CTLA4(1493) |
| HLA-E | HLA-E(3133) |
| HLA-G | HLA-G(3135) |
| IDO(吲哚胺2,3-二加氧酶) | IDO1(3620) |
| IL-10 | IL10(3586) |
| PD-L1(CD274) | CD274(29126) |
| TGFβ1 | TGFB1(7040) |
| TGFβ2 | TGFB2(7042) |
| TGFβ3 | TGFB3(7043) |
| VISTA(VSIR) | VSIR(64115) |
| M-CSF | CSF1(1435) |
| B7S1(B7H4) | VTCN1(79679) |
| PTPN2 | PTPN2(5771) |
在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFβ1、CD47+TGFβ2或CD47+TGFβ1+TGFβ2。在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD276+TGFβ1、CD276+TGFβ2或CD276+TGFβ1+TGFβ2。在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFB1+CD276、CD47+TGFβ2+CD276或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276。在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFβ1+B7-H3、CD47+TGFβ2+CD276或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276。在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFβ1+CD276+BST2、CD47+TGFβ2+CD276+BST2或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+BST2。在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFβ1+CD276+CTLA4、CD47+TGFβ2+CD276+CTLA4或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+CTLA4。在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFβ1+CD276+CTLA4、CD47+TGFβ2+CD276+CTLA4或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+CTLA4。
在示例性实施例中，疫苗组合物中免疫抑制因子的以下组合的产生减少或受到抑制：CD47+TGFβ1+CD276+CTLA4、CD47+TGFβ2+CD276+CTLA4或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+CTLA4、CD47+TGFβ2或TGFβ1+CTLA4或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+HLA-E或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+HLA-G或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+HLA-G+CTLA-4或CD47+TGFβ1+TGFβ2+CD276+HLA-E+CTLA-4。
所属领域的技术人员将认识到在本文所述的疫苗组合物的实施例中，组合物内至少一种(即，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)细胞系具有至少一种免疫抑制因子(例如表6中列出的因子中的一种或多种)的减弱或敲除。组合物内的细胞系可以具有相同免疫抑制因子，或各细胞系不同的免疫抑制因子或其某一组合的减弱或敲除。
任选地，组合物内的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种细胞系可以进一步被基因修饰成具有一种或多种另外免疫抑制因子(例如表6中列出的因子中的一种或多种)的减弱或敲除。举例来说，组合物内的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种细胞系可以进一步被基因修饰成具有相同另外免疫抑制因子，或各细胞系不同的另外免疫抑制因子或其某一组合的减弱或敲除。
在一些实施例中，本文提供一种癌症疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，其中该细胞系被修饰以减少SLAMF7、BTLA、EDNRB、TIGIT、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、TIM3(HAVCR2)、LAG3、ADORA2A和ARG1的产生。
本文所述的任一疫苗组合物内的细胞中的至少一种可进行一种或多种(即，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)基因修饰以实现本文所述的免疫抑制因子的部分或完全减弱和/或本文所述的免疫刺激因子、TAA和/或新抗原的表达(或增加其表达)。在一些实施例中，疫苗组合物中的至少一种细胞系进行少于5种(即，少于4种、少于3种、少于2种、1种或0种)基因修饰。在一些实施例中，疫苗组合物中的至少一种细胞进行不少于5种基因修饰。
所属领域的一般技术人员已知并且可获得减少或抑制一种或多种免疫抑制因子的表达的大量方法，其实施例在本文中描述。
根据一些实施例癌细胞系被修饰以抑制或减少免疫抑制因子的产生。本文提供用于选择有待用以抑制免疫抑制因子产生和/或减少免疫抑制因子产生的适当技术的方法和技术。可使用所属领域中已知的技术实现免疫抑制因子的表达水平的部分抑制或降低。
在一些实施例中，癌症品系的细胞在活体外使用重组DNA技术进行基因工程改造以引入基因建构体至细胞中。这些DNA技术包括(但不限于)转导(例如使用病毒载体)或转染程序(例如使用质粒、粘质粒、酵母人造染色体(YAC)、电穿孔、脂质粒)。可采用所属领域中已知的部分(例如减少表达水平至少5％、10％、15％、20％、25％或30％)或完全抑制细胞产生任何免疫抑制因子的任何合适的方法。
在一些实施例中，基因组编辑用于抑制或减少疫苗中的细胞的免疫抑制因子产生。基因组编辑技术的非限制性实例包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas系统。在某些实施例中，减少基因表达和随后具生物活性的蛋白质表达可以通过经由非同源末端连接(NHEJ)插入/缺失核苷酸，或经由同源定向修复(HDR)插入引起过早终止密码子的适当供体盒和表达非功能性蛋白质，或通过插入核苷酸来实现。
在一些实施例中，使用可以包括或可不包括Cre-Lox和FLP-FRT重组系统的自发性位点特异性同源重组技术。在一些实施例中，应用在较高频率但位点/基因特异性极小下将适当供体盒整合至基因组DNA中的转座子的方法与所需要的选择和鉴别技术组合使用。非限制性实例是piggyBac和Sleeping Beauty转座子系统，该等系统分别使用TTAA和TA核苷酸序列进行整合。
此外，可以使用由大范围核酸酶和转座子组成的基因编辑方法的组合方法。
在某些实施例中，用于抑制或减少免疫抑制因子表达的技术可以包括使用反义或核糖核酸酶方法减少或抑制免疫抑制因子的mRNA转录物的翻译；使用三螺旋方法抑制免疫抑制因子的基因的翻译；或有目标性的同源重组。
反义方法涉及与免疫抑制因子的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA)的设计。反义寡核苷酸结合于免疫抑制因子的互补mRNA转录物并且防止翻译。绝对互补可以是优先，但不是必需的。如本文中所提及，与RNA一部分“互补”的序列意指序列足够互补以能够与RNA杂交，形成稳定双螺旋体。在双股反义核酸的情况下，可以测试双螺旋体DNA的单股，或可分析三螺旋体的形成。杂交能力视互补程度和反义核酸的长度两者而定。在一些实施例中，与免疫抑制因子的5'或3'非翻译非编码区互补的寡核苷酸可以用于反义方法中以抑制免疫抑制因子的内源性mRNA的翻译。在一些实施例中，在短发夹RNA内使用反义寡核苷酸序列，实现免疫抑制因子的抑制或减少。
在一些实施例中，使用慢病毒介导的shRNA干扰使表达免疫抑制因子的基因沉默。(参见Wei等人,免疫疗法杂志(J.Immunother.)201235(3)267-275(2012)，以引用的方式并入本文中。)
微RNA(miRNA)为稳定表达的RNAi发夹，也可以用于减弱基因表达。在一些实施例中，被设计成催化裂解mRNA转录物的核糖核酸酶分子用于防止免疫抑制因子mRNA的翻译和表达。在某些实施例中，使mRNA在位点特异性识别序列处裂解的核糖核酸酶可以用于破坏mRNA。在一些实施例中，使用锤头状核糖核酸酶，其使mRNA在由与目标mRNA形成互补碱基对的侧接区域指定的位置处裂解。也可使用RNA核糖核酸内切酶。
在一些实施例中，例如通过使用有目标性的同源重组，使基因或其启动子失活或“敲除”，可以减少免疫抑制因子的内源性基因表达。在一些实施例中，通过靶向与免疫抑制因子的启动子和/或强化子基因的调控区互补的去氧核糖核苷酸序列，形成防止免疫抑制因子基因在目标细胞中翻译的三螺旋结构来减少内源性基因表达。在一些实施例中，通过核酸酶死亡Cas9型式(dCas9)和其与无法使目标DNA裂解的KRAB、VP64和p65的融合物来抑制启动子活性。dCas9分子保留基于目标序列结合于目标DNA的能力。dCas9靶向至转录起始位点通过阻断翻译开始而足以减少或减弱翻译。
在一些实施例中，使用“显性阴性”方法减少免疫抑制因子的活性，其中编码缺陷免疫抑制因子的基因建构体用于减少对相邻细胞的免疫抑制活性。
在一些实施例中，施用编码结合于并且“中和”细胞内任何其它免疫抑制因子的可溶性肽、蛋白质、融合蛋白或抗体的基因建构体。为此，可以利用编码与免疫抑制因子受体的结构域、免疫抑制因子受体的缺失突变体或与另一多肽(例如IgFc多肽)融合的这些免疫抑制因子受体域或突变体中的任一种对应的肽的基因建构体。在一些实施例中，使用编码模拟免疫抑制因子受体并且中和免疫抑制因子的抗独特型抗体或抗独特型抗体的Fab片段的基因建构体。可以施用编码这些免疫抑制因子受体肽、蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体或Fab的基因建构体以中和免疫抑制因子。
同样，也可使用编码特异性识别免疫抑制因子的一种或多种抗原决定基、或免疫抑制因子的保守变异体的抗原决定基、或免疫抑制因子的肽片段的抗体的基因建构体。这类抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人类化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、由Fab表达文库产生的片段和上述任一者的抗原决定基结合片段。所属领域中已知的任何技术都可以用于产生编码适合抗体的基因建构体。
在一些实施例中，抑制使免疫抑制因子前物裂解成活性同功型的酶以阻断免疫抑制因子的活化。这些酶的转录或翻译可以通过所属领域中已知的方式阻断。
在其它实施例中，药理学抑制剂可以用于减少酶活性，包括(但不限于)COX-2和IDO，以减少某些免疫抑制因子的量。
肿瘤相关抗原(TAA)
基于载体和基于蛋白质的疫苗方法在单一配制物中可以靶向的TAA的数目有限。相比之下，如本文所述的同种异体全细胞疫苗平台的实施例允许靶向大量不同TAA。通过选择表达一系列TAA的同种异体细胞系并且任选地对该等细胞系进行基因修饰以表达针对期望治疗目标(例如癌症类型)所关注的另外抗原，包括新抗原或非同义突变(NSM)，可以扩大和/或优化反应广度。
如本文所用，术语“TAA”是指肿瘤相关抗原并且可以指如由肿瘤细胞天然表达的“野生型”抗原，或可任选地指包含一个或多个突变(诸如新抗原决定基或如本文所述的一种或多种NSM)的突变抗原，例如设计抗原或所设计的抗原或被强化的抗原或被工程改造的抗原。
TAA是可以在正常组织和肿瘤组织中表达的蛋白质，但相对于健康组织，肿瘤组织中TAA蛋白的表达显著较高。TAA可以包括癌睪丸抗原(CT)，该等抗原对于胚胎发育来说是重要的，但限于在健康成年人中的男性生殖细胞中表达。CT常在肿瘤细胞中表达。
新抗原或新抗原决定基是在癌细胞中表达的异常突变基因。在许多情况下，新抗原可以被视为TAA，因为其由肿瘤组织表达并且正常组织不表达。靶向新抗原决定基具有许多优点，因为这些新抗原决定基真正是肿瘤特异性的并且在胸腺中不会中枢耐受。编码具有由非同义突变(NSM)产生的新抗原决定基的全长TAA的癌症疫苗能够引发广度和量值得到改善的更有效免疫反应。
如本文所用，非同义突变(NSM)是改变蛋白质的氨基酸序列的核苷酸突变。在一些实施例中，错义突变是蛋白质中一个氨基酸的变化，其由单个核苷酸中的点突变产生。错义突变是DNA序列中的一类非同义取代。还考虑另外突变，包括但限于截短、读框转移或改变氨基酸序列以与原生抗原蛋白不同的任何其它突变。
如本文所述，在一些实施例中，抗原通过以下来设计：(i)参考一个或多个公开可得的数据库以鉴别所选TAA中的NSM；(ii)鉴别在超过2名患者中出现的NSM；(iii)将在步骤(ii)中鉴别的各NSM引入相关TAA序列中；(iv)鉴别TAA中HLA-A和HLA-B超型受限的I类MHC抗原决定基，目前包括NSM；以及(v)将建立新抗原决定基(SB和/或WB)或增加肽-MHC亲和力的NSM包括于最终TAA序列中。本文提供预测建立HLA-A和HLA-B超型受限的新抗原决定基的示例性NSM(表135)。
在一些实施例中，在一个患者肿瘤样品中鉴别出的NSM包括在所设计的抗原(即，由一个或多个NSM引入所产生的突变抗原)中。在各种实施例中，将1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个NSM引入至TAA中以产生所设计的抗原。在一些实施例中，目标抗原可以具有较低数目NSM并且可能需要使用仅出现1次的NSM来达到与原生抗原蛋白的同源性的目标范围(94-97％)。在其它实施例中，目标抗原可以具有大量出现≥2次出现截止值的NSM并且可能需要使用出现3次的NSM来达到与原生抗原蛋白的同源性的目标范围(94-97％)。在所设计的抗原中包括大量NSM将所设计的抗原与原生抗原的同源性降低至目标同源性范围(94-98％)以下。
在一些实施例中，根据本公开的肿瘤细胞疫苗的1种、2种、3种、4种、5种或6种细胞系在至少一种TAA中包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种NSM(并且因此1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种所设计的抗原)。
在各种实施例中，在抗原全长上突变体(例如所设计的抗原)与原生全长蛋白质的序列同源性是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一些实施例中，将所设计的抗原并入治疗性同种异体全细胞癌症疫苗中以诱导针对所设计的TAA和已存在的TAA的抗原特异性免疫反应。
在一些实施例中，疫苗可由治疗有效量的至少一种癌细胞系构成，其中该细胞系或该等细胞系的组合表达至少一种所设计的TAA。在其它实施例中，疫苗包含治疗有效量的至少一种癌细胞系，其中该细胞系或该等细胞系的组合表达至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种所设计的TAA。
本文提供疫苗组合物的实施例，该等疫苗组合物包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中该至少一种癌细胞系表达(天然地，或被设计成表达)一种或多种TAA、新抗原(包括包含一个或多个NSM的TAA)、CT和/或TAA。在一些实施例中，细胞被重组慢病毒载体转导，该重组慢病毒载体编码有待由疫苗组合物中的细胞表达的一种或多种TAA、包括包含一个或多个NSM的TAA。
在一些实施例中，TAA、包括包含一个或多个NSM或新抗原决定基的TAA和/或其它抗原可内源性地在选择用于包括在疫苗组合物中的细胞上表达。在一些实施例中，细胞系可以被修饰(例如被基因修饰)以表达所选TAA，包括包含一个或多个NSM的TAA和/或其它抗原(例如CT、TSA、新抗原)。
本文所述的肿瘤细胞疫苗组合物中的任一种可以呈现一种或多种TAA，包括包含一个或多个NSM的TAA或新抗原决定基，并且在受试者中诱导广泛抗肿瘤反应。确保这类异质免疫反应可排除通常与某些癌症单一疗法相关的一些问题，诸如抗原逃逸。
根据本文所提供的疫苗组合物的各种实施例，疫苗组合物的至少一种细胞系可以被修饰以表达一种或多种新抗原，例如与以下相关的新抗原：肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌(TNBC))、膀胱或泌尿道癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肝细胞(HCC)癌、肾脏或肾细胞癌(RCC)、胃或胃癌、卵巢癌、食道癌、睪丸癌、胰腺癌、中枢神经系统癌症、子宫内膜癌、黑色素瘤和间皮癌。在一些实施例中，细胞系中的一种或多种表达新抗原蛋白的未突变部分。在一些实施例中，细胞系中的一种或多种表达新抗原蛋白的突变部分。
在一些实施例中，本文所述的任一疫苗组合物中的癌细胞中的至少一者可天然表达或被修饰以表达一种或多种TAA，包括包含一种或多种NSM的TAA、CT或TSA/新抗原。在某些实施例中，疫苗组合物中的癌细胞系中的超过一种(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)可表达或可被基因修饰成表达TAA、包括包含一个或多个NSM的TAA、CT或TSA/新抗原中的一种或多种。由组合物内的细胞系表达的TAA、包括包含一个或多个NSM的TAA、CT或TSA/新抗原可都相同，可都不同，或其任何组合。
因为疫苗组合物可含有不同类型和组织学的多种(即，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)癌细胞系，所以广泛和多种TAA、包括包含一个或多个NSM的TAA和/或新抗原可存在于组合物中(表7-23)。可使用细胞系的组合(例如5细胞系组合、6细胞系组合、7细胞系组合、8细胞系组合、9细胞系组合或10细胞系组合)靶向的TAA的数目和TAA的表达水平在细胞系组合中相较于组合中的各个细胞系较高。
在本文所提供的疫苗组合物的实施例中，本文所述的任一疫苗组合物中的癌细胞中的至少一种(即1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)可以表达或被修饰以表达一种或多种TAA、包括包含一个或多个NSM的TAA或新抗原。由组合物内的细胞表达的TAA、包括包含一个或多个NSM的TAA可都相同，可都不同，或其任何组合。下表7列出示例性非小细胞肺癌TAA和肺癌TAA的示例性子集。在一些实施例中，TAA系NSCLC特异性的。在一些实施例中，TAA系GBM特异性的。在其它实施例中，TAA系前列腺癌特异性的。
在一些实施例中，本文呈现一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的被工程改造的细胞，其中该等细胞系或细胞系的组合表达至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种或更多种表7-23中的TAA。在其它实施例中，表7-23中的TAA被修饰以包括一个或多个如本文所述的NSM。
在一些实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的被工程改造的细胞，其中该等细胞系表达至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种表7-23中的TAA(或被修饰以包括一个或多个NSM的表7-23中的TAA)。如本文所提供，在各种实施例中，细胞系表达至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种表7-23中的TAA(或被修饰以包括一个或多个NSM的表7-23中的TAA)并且任选地被修饰以表达表4的一种或多种免疫刺激因子或增加其表达，和/或抑制或减少表6中的一种或多种免疫抑制因子的表达。
表7：在非小细胞肺癌中表达的示例性TAA
| TAA名称 | NCBI基因符号(基因ID) |
| 存活素 | BIRC5(332) |
| CD44 | CD44(960) |
| CD44v6 | CD44(960) |
| CEA | CEACAM5(1048) |
| CT83 | CT83(203413) |
| DEPDC1 | DEPDC1(55635) |
| DLL3 | DLL3(10683) |
| NYESO1 | CTAG1(1485) |
| BORIS | CTCFL(140690) |
| EGFR | EGFR(1956) |
| Her2 | ERBB2(2064) |
| PSMA | FOLH1(2346) |
| KOC1 | IGF2BP3(10643) |
| VEGFR | KDR(3791)FLT1(2321) |
| KIF20A | KIF20A(10112) |
| MPHOSPH1 | KIF20B(9585) |
| KRAS | KRAS(3845) |
| LY6K | LY6K(54742) |
| MAGE-A1 | MAGEA1(4100) |
| MAGE-A3 | MAGEA3(4102) |
| MAGE-A4 | MAGEA4(4103) |
| MAGE-A6 | MAGEA6(4105) |
| 间皮素 | MSLN(10232) |
| MUC1 | MUC1(4582) |
| c-Myc | MYC(4609) |
| NUF2 | NUF2(83540) |
| PRAME | PRAME(23532) |
| CD133(Prominin-1) | PROM1(8842) |
| PTK7 | PTK7(5754) |
| 安全蛋白 | PTTG1(9232) |
| STEAP1 | STEAP1(26872) |
| hTERT | TERT(7015) |
| p53 | TP53(7157) |
| 5T4 | TPBG(7162) |
| TTK(CT96) | TTK(7272) |
| Brachyury/TBXT | T(6862) |
| WT1 | WT1(7490 |
| XAGE1B | XAGE1B(653067) |
表8.在前列腺癌中表达的示例性TAA
表9.在神经胶母细胞瘤癌症中表达的示例性TAA
*病毒抗原，无基因ID可以利用。改用寄存编号。
表10.在卵巢癌中表达的示例性TAA
表11.在结肠直肠癌中表达的示例性TAA
表12.在乳腺癌中表达的示例性TAA
| TAA名称 | NCBI基因符号(基因ID) |
| 存活素 | BIRC5(332) |
| 周期素B1 | CCNB1(891) |
| 钙粘素-3 | CDH3(1001) |
| CEA | CEACAM5(1048) |
| CREB结合蛋白 | CREBBP(1387) |
| CS1 | CSH1(1442) |
| CT83 | CT83(203413) |
| NYESO1 | CTAG1B(1485) |
| BORIS | CTCFL(140690) |
| 内皮因子 | ENG(2022) |
| PSMA | FOLH1(2346) |
| FOS样1 | FOSL1(8061) |
| FOXM1 | FOXM1(2305) |
| GPNMB | GPNMB(10457) |
| MAGEA1 | MAGEA1(4100) |
| MAGEA3 | MAGEA3(4102) |
| MAGEA4 | MAGEA4(4103) |
| MAGEA6 | MAGEA6(4105) |
| 间皮素 | MSLN(10232) |
| MMP11 | MMP11(4320) |
| MUC1 | MUC1(4582) |
| PRAME | PRAME(23532) |
| CD133 | PROM1(8842) |
| PTK7 | PTK7(5754) |
| ROR1 | ROR1(4919) |
| 乳腺球蛋白A | SCGB2A2(4250) |
| 多配体蛋白聚糖(Syndecan)-1 | SDC1(6382) |
| SOX2 | SOX2(6657) |
| SPAG9 | SPAG9(9043) |
| STEAP1 | STEAP1(26872) |
| Brachyury/TBXT | T(6862) |
| TROP2 | TACSTD2(4070) |
| hTERT | TERT(7015) |
| WT1 | WT1(7490) |
| YB-1 | YBX1(4904) |
表13.在膀胱癌中表达的示例性TAA
| 雄激素受体 | AR(367) |
| ATG7 | ATG7(10533) |
| AXL受体酪氨酸激酶 | AXL(558) |
| 存活素 | BIRC5(332) |
| BTK | BTK(695) |
| CEACAM1 | CEACAM1(634) |
| CEA | CEACAM5(1048) |
| βHCG | CGB3(1082) |
| NYESO1 | CTAG1B(1495) |
| LAGE1 | CTAG2(30848) |
| DEPDC1 | DEPDC1(55635) |
| EPH受体B4 | EPHB4(2050) |
| HER2 | ERBB2(2064) |
| FGFR3 | FGFR3(2261) |
| VEGFR | FLT3(2322) |
| PSMA | FOLH1(2346) |
| FOLR1α(FBP) | FOLR1(2348) |
| IGF2BP3 | IGF2BP3(10643) |
| MPHOSPH1 | KIF20B(9585) |
| LY6K | LY6K(54742) |
| MAGEA1 | MAGEA1(4100) |
| MAGEA3 | MAGEA3(4102) |
| MAGEA6 | MAGEA6(4105) |
| MAGEC2 | MAGEC2(51438) |
| c-Met | MET(4233) |
| MUC1 | MUC1(4582) |
| 巢蛋白-4 | 巢蛋白4(81607) |
| NUF2 | NUF2(83540) |
| RET | RET(5979) |
| STEAP1 | STEAP1(26872) |
| TDGF1(Cripto1) | TDGF1(6997) |
| hTERT | TERT(7015) |
| TROP2 | TACSTD2(4070) |
| WEE1 | WEE1(7465) |
| WT1 | WT1(7490) |
表14.在头和/或颈癌中表达的示例性TAA
*病毒抗原，无基因ID可以利用；提供GenBank寄存编号。
表15.在胃癌中表达的示例性TAA
表16.在肝癌中表达的示例性TAA
表17.在食道癌中表达的示例性TAA
表18.在肾癌中表达的示例性TAA
| TAA名称 | NCBI基因符号(基因ID) |
| 载脂蛋白L1 | APOL1(8542) |
| Axl受体酪氨酸激酶 | AXL(558) |
| 存活素 | BIRC5(332) |
| G250 | CA9(768) |
| 周期素D1 | CCND1(595) |
| CXCR4 | CXCR4(7852) |
| EPH受体B4 | EPHB4(2050) |
| FAP | FAP(2191) |
| VEGFR | FLT3(2322) |
| GUCY2C | GUCY2C(2984) |
| INTS1 | INTS1(26173) |
| c-KIT/CD117 | KIT(3815) |
| c-Met | MET(4233) |
| MMP7 | MMP7(4316) |
| RAGE1 | MOK(5891) |
| Muc1 | MUC1(4582) |
| PDGFRα | PDGFRA(5156) |
| PDGFRβ | PDGFRB(5159) |
| M2PK | PKM(5315) |
| 周脂素(perilipin)2 | PLIN2(123) |
| PRAME | PRAME(23532) |
| PRUNE2 | PRUNE2(158471) |
| RET | RET(5979) |
| RGS5 | RGS5(8490) |
| ROR2 | ROR2(4920) |
| STEAP1 | STEAP1(26872) |
| Tie-1 | TIE1(7075) |
| 5T4 | TPBG(7162) |
| gp75 | TYRP1(7306) |
表19.在胰腺癌中表达的示例性TAA
表20.在子宫内膜癌中表达的示例性TAA
表21.在皮肤癌中表达的示例性TAA
| TAA名称 | NCBI基因符号(基因ID) |
| B4GALNT1 | B4GALNT1(2583) |
| 存活素 | BIRC5(332) |
| 内皮唾酸蛋白(CD248) | CD248(57124) |
| CDKN2A | CDKN2A(1029) |
| CSAG2 | CSAG2(102423547) |
| CSPG4 | CSPG4(1464) |
| NYESO1 | CTAG1B(1485) |
| Trp2(DCT) | DCT(1638) |
| MAGE-A1 | MAGEA1(4100) |
| MAGE-A2 | MAGEA2(4101) |
| MAGE-A3 | MAGEA3(4102) |
| MAGE-A4 | MAGEA4(4103) |
| MAGE-A6 | MAGEA6(4105) |
| MAGE-A10 | MAGEA10(4109) |
| MITF | MITF(4286) |
| MART-1 | MLANA(2315) |
| NFE2L2 | NFE2L2(4780) |
| PMEL | PMEL(6490) |
| PRAME | PRAME(23532) |
| NY-MEL-1 | RAB38(23682) |
| NEF | S100B(6285) |
| SEMA4D | SEMA4D(10507) |
| SSX2 | SSX2(6757) |
| SSX4 | SSX4(6759) |
| ST8SIA1 | ST8SIA1(6489) |
| hTERT | TERT(7015) |
| TYR | TYR(7299) |
| Trp1 | TYRP1(7306) |
表22.在间皮癌中表达的示例性TAA
| TAA名称 | NCBI基因符号(基因ID) |
| APEX1 | APEX1(328) |
| CHEK1 | CHEK1(1111) |
| NYESO1 | CTAG1B(1485) |
| DHFR | DHFR(1719) |
| DKK3 | DKK3(27122) |
| EGFR | EGFR(1956) |
| ESR2 | ESR2(2100) |
| EZH1 | EZH1(2145) |
| EZH2 | EZH2(2146) |
| MAGE-A1 | MAGEA1(4100) |
| MAGE-A3 | MAGEA3(4102) |
| MAGE-A4 | MAGEA4(4103) |
| MCAM | MCAM(4162) |
| 间皮素 | MSLN(10232) |
| MUC1 | MUC1(4582) |
| PTK2 | PTK2(5747) |
| SSX-2 | SSX2(6757) |
| STAT3 | STAT3(6774) |
| THBS2 | THBS2(7058) |
| 5T4(TPBG) | TPBG(7162) |
| WT1 | WT1(7490) |
表23.在小细胞肺癌中表达的示例性TAA
在本文所提供的疫苗组合物的一些实施例中，组合物内的细胞系中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种可以被基因修饰成表达相同免疫刺激因子、TAA(包括包含一个或多个NSM的TAA)和/或新抗原或增加其表达；表达不同免疫刺激因子、TAA和/或新抗原或增加其表达；或其某一组合。在一些实施例中，TAA序列可以是原生内源性人类TAA序列。在一些实施例中，TAA序列可以是原生内源性人类TAA序列的被基因工程改造的序列。被基因工程改造的序列可以经由密码子优化进行修饰以增加TAA的表达，或被基因工程改造的序列可以被修饰以改变TAA的细胞定位(例如经由蛋白酶裂解位点的突变)。
表7-23中呈现示例性NCBI基因ID。如本文所提供，这些基因ID可以用于在本公开的疫苗组合物的一种或多种细胞系中表达(或过度表达)某些TAA。
在各种实施例中，本文所述的组合物中的细胞系中的一种或多种被修饰以表达间皮素(MSLN)、CT83(北九州肺癌抗原(kita-kyushu lung cancer antigen)1)TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMVpp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LY6K、PRAME、HPV16/18E6/E7、FAP或它们的突变型式(表24)。短语“或它们的突变型式”是指包含一个或多个突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个取代型突变)的上述TAA或本文所提供的其它TAA(包括如本文所述的新抗原决定基或NSM)的序列。因此，在各种实施例中，本文所述的组合物中的细胞系中的一种或多种被修饰以表达mod间皮素(modMSLN)、modTERT、modPSMA、modMAGEA1、modEGFRvIII、modhCMV pp65、modTBXT、modBORIS、modFSHR、modMAGEA10、modMAGEC2、modWT1、modKRAS、modFBP、modTDGF1、mod紧密连接蛋白18、modLY6K、modFAP、modPRAME、KRAS G12D突变、KRAS G12V突变和/或modHPV16/18E6/E7。在其它实施例中，TAA或“其突变型式”可以包含本文所提供的TAA或突变型式中的1种、2种或3种或更多种的融合物。在一些实施例中，融合物包含与突变TAA融合的原生或野生型序列。在一些实施例中，融合建构体中的各个TAA由裂解位点、诸如弗林蛋白酶裂解位点分隔开。因此，本公开提供TAA融合蛋白，诸如CT83-MSLN或modCT83-MSLN、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65、modTBXT-modBORIS、modFSHR-modMAGEA10、modTBXT-modMAGEC2、modTBXT-modWT1、modTBXT-modWT1(KRAS)、modWT1-modFBP、modPSMA-modTDGF1、modWT1-mod紧密连接蛋白18、modPSMA-modLY6K、modFAP-mod紧密连接蛋白18和modPRAME-modTBXT，原生TAA的序列容易自NCBI数据库获得(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)。上述TAA、突变型式和融合物的序列提供于表24中。
表24.MSLN、CT83和示例性设计抗原的序列
在一些实施例中，本文提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少两种癌细胞系的细胞，其中各细胞系或细胞系的组合表达表7-23的TAA中的至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种。在其它实施例中，表7-23中的TAA被修饰以包括一个或多个如本文所述的NSM。在一些实施例中，至少一种细胞系被修饰以增加至少1种、2种或3种免疫刺激因子、例如来自表4的免疫刺激因子的产生。在一些实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的来自至少一种癌细胞系的细胞，其中各细胞系或细胞系的组合被修饰以减少至少1种、2种或3种免疫抑制因子、例如来自表6的免疫抑制因子。在一些实施例中，提供一种疫苗组合物，其包含两种混合物，其中各混合物包含三种细胞系，该等细胞系被修饰以表达1种、2种或3种免疫刺激因子和抑制或减少1种、2种或3种免疫抑制因子的表达，并且其中各细胞系表达至少10种TAA或包含一个或多个NSM的TAA。
用于确定根据本公开的细胞系中或来自受试者的肿瘤中TAA的存在或表达水平的方法和分析是所属领域中已知的。作为实例，本公开考虑所有以下方法：沃伯格-克里斯蒂安法(Warburg-Christian method)、劳立分析(LowryAssay)、布拉福分析(BradfordAssay)、光谱法(诸如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱分析(LC/MS))、基于免疫印迹和抗体的技术(诸如蛋白质印迹法)、ELISA、免疫电泳、蛋白质免疫沉淀、流式细胞术和蛋白质免疫染色。
在一些实施例中，可以在生检试样中使用下一代测序和基于抗体的方法评估由患者肿瘤展示的抗原谱系。类似地，在一些实施例中，可使用相同技术确定循环肿瘤细胞(CTC)所表达的抗原来评估潜在转移性病变的抗原谱系。肿瘤生检和CTC中的抗原表达的评估可代表所表达的抗原子集。在一些实施例中，鉴别患者原发性肿瘤和/或CTC所表达的抗原子集，并且如本文所述，告知有待包括在疫苗组合物中的细胞系的选择以便提供与患者肿瘤和/或转移性病变中所表达的抗原的最佳可能匹配。
本公开的实施例提供细胞系的组合物，该等细胞系(i)如本文所述进行修饰，和(ii)表达足够数目和量的TAA，使得当施用罹患癌症、多种癌症或癌性肿瘤的患者时，产生TAA特异性免疫反应。
刺激免疫反应的方法和治疗方法
可以向有需要的受试者施用本文所述的疫苗组合物。本文提供用于诱导受试者中的免疫反应的方法，其涉及向受试者施用免疫学上有效量的被基因修饰的细胞。还提供用于预防或治疗受试者的肿瘤的方法，其通过施用抗肿瘤有效量的本文所述的疫苗组合物。这类组合物和方法可有效延长受试者的存活。
根据各种实施例，本文所提供的任一疫苗组合物的施用可以增加白血球的促炎性细胞因子产生(例如IFNγ分泌)。在一些实施例中，本文所提供的任一疫苗组合物的施用可以增加白血球的促炎性细胞因子产生(例如IFNγ分泌)至少1.5倍、1.6倍、1.75倍、2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍或更多倍。在其它实施例中，相较于未被修饰的癌细胞系，IFNγ产生增加大约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高。不受任何理论或机制约束，白血球的促炎性细胞因子产生(例如IFNγ分泌)的增加是与疫苗组合物之间接或直接相互作用的结果。
在一些实施例中，与不包含被修饰的细胞的组合物相比，包含如本文所述的一种或多种被修饰的细胞系的本文所提供的任一疫苗组合物的施用可以增加吞噬细胞对疫苗组合物的细胞的吸收，例如增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍或更多倍。
在一些实施例中，通过皮内注射向受试者提供疫苗组合物。不受任何理论或机制约束，在至少一些实施例中，皮内注射产生局部发炎反应，将免疫细胞募集至注射部位。在施用疫苗之后，皮肤中的抗原呈递细胞(APC)，诸如朗格罕氏细胞(LC)和皮肤树突状细胞(DC)，通过吞噬作用吸收疫苗细胞系组分，并且接着迁移穿过真皮，到达引流淋巴结。在引流淋巴结处，预期已吞噬疫苗细胞系组分的DC或LC引发原生T细胞和B细胞。预期原生T细胞和B细胞的引发开启针对由疫苗细胞系表达的肿瘤相关抗原(TAA)的适应性免疫反应。由疫苗细胞系组分表达的某些TAA也由患者肿瘤表达。预期引流淋巴结处抗原特异性T细胞的扩增和这些T细胞迁移至肿瘤微环境(TME)产生疫苗诱导的抗肿瘤反应。
根据各种实施例，同种异体疫苗组合物的免疫原性可以经由减少免疫抑制因子的表达同时增加免疫刺激信号的表达或分泌的基因修饰而进一步增强。这些因子的调节旨在增强真皮中LC和DC对疫苗细胞系组分的吸收，DC和LC迁移至引流淋巴结，引流淋巴结中的T细胞和B细胞引发，和由此引起更有效的抗肿瘤反应。
在一些实施例中，疫苗组合物中靶向的TAAs的广度可以经由包括多种细胞系而增加。例如，某一肿瘤类型内的不同组织学子集往往表达不同TAA子集。作为另一实例，在NSCLC中，腺癌和鳞状细胞癌表达不同抗原。根据本发明的一些实施例，由疫苗组合物诱导的适应性免疫反应的量值和广度可以经由包括表达相同或不同免疫刺激因子的另外细胞系而增强。例如，三种细胞系的混合物内的一种细胞系对诸如IL-12的免疫刺激因子的表达可以用于局部增强对递送至相同位点中的所有细胞系的免疫反应。混合物内超过一种细胞系的免疫刺激因子(诸如GM-CSF)的表达可以增加注射部位中的免疫刺激因子的量，由此增强诱导的针对混合物所有组分的免疫反应。疫苗混合物内存在的HLA错配的程度可进一步增强由该混合物诱导的免疫反应。
如本文所述，在各种实施例中，提供一种刺激受试者中特异性针对至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种或更多种TAA的免疫反应的方法，其包含施用治疗有效量的包含被修饰的癌细胞系的疫苗组合物。
“免疫反应”为免疫系统细胞、诸如B细胞、T细胞或单核球对诸如细胞或抗原(例如配制为抗原组合物或疫苗)的刺激的反应。免疫反应可以是B细胞反应，其引起诸如抗原特异性中和抗体的特异性抗体的产生。免疫反应也可以是T细胞反应，诸如CD4+反应或CD8+反应。B细胞和T细胞反应是“细胞”免疫反应的方面。免疫反应也可以是“体液”免疫反应，由抗体介导。在一些情况下，反应对具体抗原、诸如一种或多种TAA具有特异性(即，“抗原特异性反应”)，并且此特异性可以包括产生抗原特异性抗体和/或产生细胞因子，诸如干扰素γ，干扰素γ系与Th1 T细胞反应产生有关的关键细胞因子并且可以通过ELISpot和流式细胞术测量。
可以通过在免疫接种之后使用流式细胞术(FACS)分析、ELISpot分析或所属领域中已知的其它方法测量T细胞反应CD4+和CD8+来测试疫苗功效。受试者暴露于免疫原性刺激、诸如细胞或抗原(例如配制成抗原组合物或疫苗)会引发对刺激具有特异性的原发性免疫反应，即，暴露“引发”免疫反应。随后例如通过免疫接种暴露于刺激物可以增加或“加强”特异性免疫反应的量值(或持续时间或两者)。因此，通过施用抗原组合物“加强”预先存在的免疫反应可以增加抗原(或细胞)特异性反应的量值(例如通过增加抗体滴度和/或亲和力、通过增加抗原特异性B或T细胞的频率、通过诱导成熟效应功能或它们的组合)。
通过本文所述的方法监测/分析或刺激的免疫反应包括(但不限于)：(a)抗原特异性或疫苗特异性IgG抗体；(b)血清细胞因子水平的变化，细胞因子可以包括并且不限于：IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A、IL-20、IL-22、TNFα、IFNγ、TGFβ、CCL5、CXCL10；(c)由ELISpot测定的针对CD4和CD8 T细胞疫苗的IFNγ反应和抗原特异性反应；(d)对TAA或疫苗细胞组分的IFNγ反应的变化；(e)对抗原刺激起反应，T细胞的细胞内细胞因子IFNγ、TNFα和IL-2以及细胞溶解可能性的指示物颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素和CD107a的产生增加；(f)调控T细胞(Treg、单核性单核球衍生的抑制细胞(M-MDSC)和多形核衍生的抑制细胞(PMN-MDSC)的含量减少；(g)循环肿瘤细胞的含量减少(CTC)；(h)嗜中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)和血小板与淋巴细胞比率(PLR)；(i)TME中免疫浸润的变化；以及(j)树突状细胞成熟。
本文描述用于测定免疫反应的分析并且是所属领域中众所周知的。DC成熟可以例如通过分析诸如CD80、CD83、CD86和MHC II的DC成熟标记物的存在来评估。(参见Dudek,A.等人,《免疫学前沿(Front.Immunol.)》,4:438(2013))。抗原特异性或疫苗特异性IgG抗体可以通过ELISA或流式细胞术评估。血清细胞因子水平可使用多路方法，诸如Luminex或Meso Scale Discovery电化学发光(MSD)测量。T细胞活化和淋巴细胞群体中的变化可以通过流式细胞术测量。可使用基于RT-PCR的方法测量PBMC中的CTC。可使用标准全血球计数(CBC)化学组确定NLR和PLR比率。TME中免疫浸润的变化可以通过流式细胞术、肿瘤生检和下一代测序(NGS)或受试者的正电子发射断层摄影法(PET)扫描来评估。
鉴于不同类型的癌症和肿瘤之间的TAA表达的重叠，在某些实施例中，本公开提供可治疗多种不同癌症的组合物。举例来说，包含各三种细胞系的两种混合物的一种疫苗组合物可以施用于罹患两种或更多种类型癌症的受试者并且该疫苗组合物有效治疗两种、另外或所有类型的癌症。在示例性实施例中并且考虑到TAA表达图谱，包含被修饰的癌细胞系的相同疫苗组合物用于治疗同一患者(或不同患者)的前列腺癌和睪丸癌、胃癌和食道癌、或子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌。在热性肿瘤或冷性肿瘤的子集内也可出现TAA重叠。举例来说，在视为冷性肿瘤的GBM和SCLC中出现TAA重叠。包括在疫苗组合物的实施例中的示例性TAA包括GP100、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-A10、Sart-1、Sart-3、Trp-1和Sox2。在一些实施例中，包括在疫苗组合物中的细胞系可选自类似免疫状况的两种肿瘤类型以治疗相同受试者中的肿瘤类型中的一或两种。
如本文所用，例如细胞因子(诸如IFNγ)的变化或“产生增加”是指产生/分泌/表达相对于对照或基线水平变化或增加，并且指示对抗原或疫苗组分的免疫刺激反应。
组合治疗和方案
配制物、佐剂和额外治疗剂
本文所述的组合物可以配制成医药组合物。如本文所用，术语“医药学上可接受”是指医药学上可接受的材料、组合物或媒剂，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。在与医药配制物的其它成分相容的意义上，每种组分必须是“医药学上可接受的”。其也必须适于与组织、器官或其它人类组分接触使用，而无过量毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症，满足合理效益/风险比。(参见《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版；宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA)的Lippincott Williams&Wilkins:2005；《药物赋形剂手册(Handbookof Pharmaceutical Excipients)》,第5版；Rowe等人编,The Pharmaceutical Press andthe American Pharmaceutical Association:2005；和《医药添加剂手册(Handbook ofPharmaceutical Additives)》,第3版；Ash和Ash编,Gower Publishing Company:2007；《医药预配制和配制(Pharmaceutical Preformulation and Formulation)》,Gibson编,CRCPress LLC:《佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton,FL)》,2004))。
本公开的医药组合物的实施例被配制成与其预期投药途径(即，肠胃外、静脉内、动脉内、皮内、皮下、口服、吸入、经皮、局部、瘤内、经粘膜、腹膜内或胸膜内和/或直肠投药)相容。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如水、生理食盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；二甲亚砜(DMSO)；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调整张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以封装在安瓿、抛弃式注射器或一个或多个包含玻璃或聚合物(例如聚丙烯)的小瓶中。如本文所用，术语“小瓶”意指适于储存如本文所述的疫苗组合物的实施例的任一种类器皿、容器、管、烧瓶等。
在一些实施例中，组合物还包含医药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“载剂”涵盖稀释剂、赋形剂、佐剂以及它们的组合。医药学上可接受的载剂是所属领域中所众所周知的(参见《雷明顿：药学科学与实践》,第21版)。示例性“稀释剂”包括无菌液体，诸如无菌水、生理食盐水溶液和缓冲剂(例如磷酸盐、tris、硼酸盐、丁二酸盐或组氨酸)。示例性“赋形剂”是可以增强疫苗稳定性并且包括(但不限于)聚合物(例如聚乙二醇)、碳水化合物(例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖或纤维素)和醇(例如甘油、山梨糖醇或木糖醇)的惰性物质。
在各种实施例中，疫苗组合物和其细胞系组分是无菌并且流体的，以使得组合物和/或细胞系组分可以负载至一个或多个注射器中。在各种实施例中，组合物在制造和储存条件下应为稳定的，并且通常防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。在一些实施例中，载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过维持所需粒度(在分散液的情况下)、通过使用表面活性剂和通过所属领域的技术人员已知的其它方式来维持。微生物作用的防止可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂达成，例如对羟基苄酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在一些实施例中，可能期望组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)和/或氯化钠。在一些实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在一些实施例中，可以通过如下方法来制备无菌可注射溶液：将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种或组合一起并入适当溶剂中，视需要随后进行过滤灭菌。在某些实施例中，分散液是通过将活性化合物并入含有基础分散介质和来自本文中列举的成分的其它所需成分的无菌媒剂中来制备。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法的实施例包括真空干燥和冷冻干燥，由其先前无菌过滤溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。
先天免疫系统包含以非特异性方式提供对其它生物体感染的防御的细胞。虽然受试者中的先天性免疫是实时防御，但其并不持久或预防未来挑战。通常在先天性免疫中起作用的免疫系统细胞是吞噬细胞，诸如巨噬细胞和树突状细胞。先天免疫系统以多种方式与适应性(也称为后天性)免疫系统相互作用。
在一些实施例中，疫苗组合物单独活化免疫反应(即，先天性免疫反应、适应性免疫反应和/或其它免疫反应)。在一些实施例中，一种或多种佐剂任选地包括在疫苗组合物中，或相对于疫苗组合物同时或策略性地施用，以提供支持先天性免疫活化以增强疫苗组合物的效力的药剂。如本文所用，“佐剂”是并入疫苗组合物中或相对于疫苗组合物的施用同时或在所选时间点或以所选方式施用的“药剂”或物质。在一些实施例中，佐剂是小分子、化学组合物或治疗性蛋白质，诸如细胞因子或检查点抑制剂。已提出多种机制来解释不同药剂如何起作用(例如抗原储槽、树突状细胞、巨噬细胞的活化剂)。药剂可以用于以各种方式增强后天性免疫反应并且许多类型药剂可以活化先天性免疫。如细菌和病毒的生物体可以活化先天性免疫，生物体的组分、化学物质(诸如2'-5'寡核苷酸A)、细菌内毒素、RNA双螺旋体、单股RNA和其它组合物也可以活化先天性免疫。许多药剂经由在本文中称为“铎样受体(toll-like receptor)”(TLR)的分子家族起作用。与TLR的接合也可以引起细胞因子和趋化因子产生和树突状细胞(与后天性免疫性的发展有关的组分)的活化和成熟。TLR家族可以对多种试剂，包括脂蛋白、肽聚糖、鞭毛蛋白、咪唑喹啉、CpG DNA、脂多糖和双股RNA起反应。这些类型试剂有时称为病原体(或微生物)相关分子模式。在一些实施例中，佐剂是TLR4促效剂。
在一些实施例中，可以用于疫苗组合物中的一种佐剂是一元酸脂质A(MALA)型分子。一种示例性MALA是
佐剂，如例如以下中所述：Ulrich J.T.和Myers,K.R.,第21章,《疫苗设计：次单元与佐剂途径(Vaccine Design,the Subunit and AdjuvantApproach)》,Powell,M.F.和Newman,M.J.编Plenum Press,NY(1995)。
在其它实施例中，佐剂可以是“明矾”，其中此术语是指铝盐，诸如磷酸铝和氢氧化铝。
在一些实施例中，佐剂可以是具有疫苗佐剂特性的乳液。这类乳液包括水包油乳液。不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's adjuvant，IFA)是一种这类佐剂。另一适合水包油乳液是MF-59TM佐剂，其含有角鲨烯、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(也称为
80表面活性剂)和脱水山梨糖醇三油酸酯。其它合适乳液佐剂是MontanideTM佐剂(新泽西州费尔菲尔德(FairfieldNJ)的Seppic公司)，包括MontanideTMISA 50V(其为基于矿物油的佐剂)、MontanideTMISA 206和MontanideTMIMS 1312。虽然矿物油可存在于佐剂中，在一个实施例中，本公开的组合物的油组分都是可代谢油类。
在一些实施例中，佐剂可以是AS02TM佐剂或AS04TM佐剂。AS02TM佐剂是水包油乳液，其含有MPLTM佐剂和QS-21TM佐剂(本文中其它地方讨论的皂素佐剂)。AS04TM佐剂含有MPLTM佐剂和明矾。佐剂可以是Matrix-MTM佐剂。佐剂可以是皂素，诸如来源于皂皮树(Quillajasaponaria)物种树皮的皂素，或被修饰的皂素，参见例如美国专利第5,057,540号、第5,273,965号、第5,352,449号、第5,443,829号和第5,560,398号。由Antigenics公司(马萨诸塞州列克星敦(Lexington,MA))出售的产品QS-21TM佐剂是一种示例性含皂素的辅佐剂，可以用于本文所述的组合物的实施例。在其它实施例中，佐剂可以是来自ISCOMTM家族佐剂的试剂中的一种或试剂组合，最初由Iscotec(瑞典(Sweden))研发并且通常由来源于皂皮树的皂苷或合成类似物、胆固醇和磷脂形成，都形成为蜂窝样结构。
在一些实施例中，佐剂或试剂可以是充当佐剂的细胞因子，参见例如Lin R.等人《临床感染性疾病(Clin.Infec.Dis.)》21(6):1439-1449(1995)；Taylor,C.E.,《传染与免疫(Infect.Immun.)》63(9):3241-3244(1995)；和Egilmez,N.K.,第14章《疫苗佐剂与递送系统(Vaccine Adjuvants and Delivery Systems)》,John Wiley&Sons公司(2007)。在各种实施例中，细胞因子可以是例如颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)；参见例如Change D.Z.等人《血液学(Hematology)》9(3):207-215(2004),Dranoff,G.《免疫学评论(Immunol.Rev.)》188:147-154(2002)和美国专利5,679,356；或干扰素，诸如I型干扰素，例如干扰素-α(IFN-α)或干扰素-β(IFN-β)或II型干扰素，例如干扰素-γ(IFNγ)，参见例如Boehm,U.等人《免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)》15:749-795(1997)；和Theofilopoulos,A.N.等人《免疫学年鉴》23:307-336(2005)；介白素，特别包括介白素-1α(IL-1α)、介白素-1β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)；参见例如Nelson,B.H.,《免疫学杂志(J.Immunol.)》172(7):3983-3988(2004)；介白素-4(IL-4)、介白素-7(IL-7)、介白素-12(IL-12)；参见例如Portielje,J.E.等人,《癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)》52(3):133-144(2003)和Trinchieri.G.《自然免疫学评论(Nat.Rev.Immunol.)》3(2):133-146(2003)；介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)；胎儿肝脏酪氨酸激酶3配体(Flt3L)或肿瘤坏死因子α(TNFα)。
在一些实施例中，佐剂可以是未甲基化的CpG二核苷酸，任选地结合于本文所述的抗原。
可作为佐剂用于本文所述的组合物和方法的实践中的免疫增强剂的实例包括：MPLTM；MDP和衍生物；寡核苷酸；双股RNA；替代病原体相关分子模式(PAMPS)；皂苷；小分子免疫增强剂(SMIP)；细胞因子；以及趋化因子。
当两种或更多种佐剂或试剂组合使用时，可选择多种佐剂的相对量以相对于单独抗原，实现含有佐剂的组合物的所需性能特性。举例来说，可以选择佐剂组合以增强抗原的抗体反应，和/或增强受试者的先天性免疫系统反应。活化先天性免疫系统引起趋化因子和细胞因子的产生，这又可以活化适应性(后天性)免疫反应。活化适应性免疫反应的一个重要结果是形成记忆免疫细胞，以便在宿主再遇到该抗原时，免疫反应更快地出现并且通常品质更好。在一些实施例中，佐剂可以在其与本文所述的组合物组合之前预配制。
本文所述的疫苗组合物的实施例可以与一种或多种其它佐剂或试剂、包括治疗剂施用同时、在其之前或在其之后施用。在某些实施例中，这类试剂可以在所属领域中公认为针对具体癌症的标准治疗或预防。所考虑的示例性试剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、消炎剂、免疫检查点抑制剂、化学治疗剂、放射线治疗剂或其它活性和辅助剂。在其它实施例中，试剂为如本文所述的一种或多种被分离的TAA。
在一些实施例中，本文提供的疫苗组合物施用先前尚未接受过针对癌症或其它疾病或病症的某些治疗的受试者。如本文所用，短语“其中该受试者避免用其它疫苗或治疗剂治疗”是指受试者在接受本公开的疫苗之前尚未接受过癌症治疗或其它治疗或程序。在一些实施例中，受试者避免在施用如本文各种实施例中所述的治疗性疫苗之前接受一种或多种治疗性疫苗(例如流感疫苗、covid-19疫苗，诸如AZD1222、BNT162b2、mRNA-1273等)。在一些实施例中，受试者避免在施用如本文各种实施例中所述的治疗性疫苗之前接受一种或多种抗生素。“免疫耐受性”是免疫系统对可能诱导免疫反应的物质、抗原或组织的无反应状态。在某些实施例中，施用本公开的疫苗组合物以避免诱导免疫耐受性或逆转免疫耐受性。
在各种实施例中，疫苗组合物与用于治疗癌症的一种或多种活性剂、包括一种或多种化学治疗剂组合施用。这类活性剂的实例包括烷基化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide，CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙撑亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、氧氮芥盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧基-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；磨菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；
雷佐生(razoxane)；西佐糖(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(
Bristol-Myers Squibb Oncology,新泽西州普林斯顿(Princeton,N.J.))和太平洋紫杉醇蛋白质结合颗粒
和多西他赛(doxetaxel)(
Rhne-Poulenc Rorer,法国安东尼(Antony,France))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱、多西他赛、铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；温诺平(navelbine)；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓朴异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine，DMFO)；视黄酸衍生物，诸如TargretinTM(贝瑟罗汀(贝瑟罗汀))、PanretinTM(阿利维甲酸(alitretinoin))；以及ONTAKTM(迪夫托斯地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；以及以上任一种的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷诺昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))；和抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和以上中的任一种的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。其它癌症治疗剂包括索拉非尼(sorafenib)和其它蛋白激酶抑制剂，诸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、克卓替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼罗替尼(nilotinib)、帕尼单抗(panitumumab)、帕佐泮尼(pazopanib)、派加替尼(pegaptanib)、兰比珠单抗(ranibizumab)、卢佐替尼(ruxolitinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、维罗非尼(vemurafenib)和舒尼替尼(sunitinib)；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、依维莫司(everolimus)和其它mTOR抑制剂。
在其它实施例中，疫苗组合物与TLR4促效剂、TLR8促效剂或TLR9促效剂组合施用。这类促效剂可以选自肽聚糖、polyI:C、CpG、3M003、鞭毛蛋白和真核核糖体伸长和起始因子4a的利什曼原虫同源物(LeIF)。
在一些实施例中，疫苗组合物与如本文中所述的细胞激素组合施用。在一些实施例中，本文所公开的组合物可以与靶向以下各者中的一种或多种的分子结合施用：粘附：MAdCAM1、ICAM1、VCAM1、CD103；抑制介体：IDO、TDO；MDSC/Treg：NOS1、精氨酸酶、CSFR1、FOXP3、环磷酰胺、PI3Kγ、PI3Kδ、他喹莫德(tasquinimod)；免疫抑制：TGFβ、IL-10；引发和呈递：BATF3、XCR1/XCL1、STING、INFα；细胞雕亡再循环：IL-6、存活素、IAP、mTOR、MCL1、PI3K；T细胞迁移：CXCL9/10/11、CXCL1/13、CCL2/5、抗LIGHT、抗CCR5；致癌活化：WNT-β-cat、MEK、PPARγ、FGFR3、TKI、MET；表观遗传重新程序化：HDAC、HMA、BET；血管生成免疫调节：VEGF(α、β、γ)；低氧：HIF1α、腺苷、抗ADORA2A、抗CD73和抗CD39。
在某些实施例中，本文所公开的组合物可与组蛋白去乙酰基酶(HDAC)抑制剂结合施用。HDAC抑制剂包括异羟肟酸酯、环肽、脂族酸和苯甲酰胺。考虑用于本文中的例示性HDAC抑制剂包括(但不限于)辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA/伏立诺他(Vorinostat)/佐林扎(Zolinza))、曲古霉素(Trichostatin A，TSA)、PXD-101、缩酚酞(Depsipeptide)(FK228/罗米地辛(romidepsin)/
)、帕比诺他(panobinostat)(LBH589)、MS-275、莫塞诺他(Mocetinostat)(MGCD0103)、ACY-738、TMP195、妥西司他(Tucidinostat)、丙戊酸(valproic acid)、苯丁酸钠、5-氮杂-2'-去氧胞苷(地西他滨(decitabine))。参见例如Kim和Bae,《美国转化研究杂志(Am J Transl Res 2011)》；3(2):166-179；Odunsi等人,《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》2014年1月1日；2(1):37-49。其它HDAC抑制剂包括伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、帕比诺他(Panobinostat)(LBH589)、曲古霉素A(TrichostatinA，TSA)、莫塞诺他(Mocetinostat)(MGCD0103)、ACY-738、妥西司他(Tucidinostat)、西达本胺(Chidamide)、TMP195、西他司他(Citarinostat)(ACY-241)、贝林诺他(Belinostat)(PXD101)、罗米地辛(Romidepsin)(FK228、缩酚酞)、MC1568、土巴他汀(Tubastatin)A HCl、吉韦诺他(Givinostat)(ITF2357)、达诺司他(Dacinostat)(LAQ824)、CUDC-101、奎西诺他(Quisinostat)(JNJ-26481585)2HCl、普拉诺他(Pracinostat)(SB939)、PCI-34051、卓新诺他(Droxinostat)、阿贝司他(Abexinostat)(PCI-24781)、RGFP966、AR-42、瑞考司他(Ricolinostat)(ACY-1215)、丙戊酸钠盐(丙戊酸钠)、泰克地那林(Tacedinaline)(CI994)、CUDC-907、丁酸钠、姜黄素(Curcumin)、M344、突巴辛(Tubacin)、RG2833(RGFP109)、雷米诺他(Resminostat)、双丙戊酸钠(DivalproexSodium)、斯克太德(Scriptaid)和土巴他汀A。
在某些实施例中，疫苗组合物与氯奎宁(chloroquine)组合施用，氯奎宁是一种趋溶酶体剂，其阻止核内体酸化并且抑制由肿瘤细胞诱导的自体吞噬，从而经受住加速的细胞生长和营养剥夺。更一般来说，包含如本文所述的异型接合病毒载体的组合物可与充当自体吞噬抑制剂、放射敏化剂或化学敏化剂(诸如氯奎宁、米索硝唑(misonidazole)、甲硝哒唑(metronidazole)和诸如替拉扎明(tirapazamine)的低氧细胞毒素)的活性剂组合施用。在这一点上，异型接合病毒载体与氯奎宁或其它放射或化学敏化剂或自体吞噬抑制剂的这类组合可以进一步与其它癌症活性剂或放射线疗法或手术组合使用。
在其它实施例中，疫苗组合物与已知引起肿瘤细胞杀死并且伴随免疫反应活化(称为“免疫原性细胞死亡”)的一种或多种小分子药物，诸如环磷酰胺、多柔比星、奥沙利铂(oxaliplatin)和米托蒽醌组合施用。此外，与已知增强肿瘤细胞的免疫原性的药物组合，该等药物诸如帕土匹龙(patupilone)(埃坡霉素B(epothilone B))、靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27、组蛋白去乙酰基酶抑制剂(例如伏立诺他、罗米地辛(romidepsin)、帕比司他(panobinostat)、贝林诺他和恩替诺特)、n3-多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸，此外蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib))、紫草醌(shikonin)(紫草(Lithospermum erythrorhizon)根部主要成分)和溶瘤病毒，诸如TVec(塔利拉帕(talimogene laherparepvec))。在一些实施例中，如本文所述的包含异型接合病毒载体的组合物可以与可局部或全身施用的表观遗传疗法，诸如DNA甲基转移酶抑制剂(例如地西他滨、5-氮杂-2'-去氧胞苷)组合施用。
在其它实施例中，疫苗组合物与增加DC对肿瘤的ADCC吸收的一种或多种抗体组合施用。因此，本公开的实施例考虑将癌症疫苗组合物与诱导或增强抗原呈递细胞对肿瘤细胞或其片段的摄取和随后肿瘤抗原呈递至免疫系统的任何分子组合。这些分子包括诱导受体结合(例如Fc或甘露糖受体)和输送至抗原呈递细胞的试剂，诸如抗体、抗体样分子、多特异性多价分子和聚合物。这类分子可以在肿瘤内与包含异型接合病毒载体的组合物一起施用或通过不同途径施用。举例来说，如本文所述的包含异型接合病毒载体的组合物可以在肿瘤内与在肿瘤内注射以下各者一起施用：利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、坎帕斯(Campath)、帕尼单抗(panitumumab)、奥伐木单抗(ofatumumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿多-曲妥珠单抗恩他新(Ado-trastuzumab emtansine)、阿托珠单抗(Obinutuzumab)、抗HER1、抗HER2或抗HER3抗体(例如MEHD7945A；MM-111；MM-151；MM-121；AMG888)、抗EGFR抗体(例如尼妥珠单抗(nimotuzumab)、ABT-806)或其它类似抗体。能够接合Fc受体和可诱导内化的其它受体的任何多价骨架可以用于本文所述的组合疗法中(例如能够结合连接于Fc片段的目标的肽和/或蛋白质或能够接合受体的聚合物)。
在某些实施例中，疫苗组合物可以进一步与以下各者的抑制剂组合：ALK、PARP、VEGFRs、EGFR、FGFR1-3、HIF1α、PDGFR1-2、c-Met、c-KIT、Her2、Her3、AR、PR、RET、EPHB4、STAT3、Ras、HDAC1-11、mTOR和/或CXCR4。
在某些实施例中，癌症疫苗组合物可以进一步与促进协同刺激信号(例如通过阻断抑制路径)的抗体(诸如抗CTLA-4)，或活化协同刺激路径的抗体(诸如抗CD40、抗CD28、抗ICOS、抗OX40、抗CD27、抗ICOS、抗CD127、抗GITR、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、GM-CSF、IL-12和INFα组合。
检查点抑制剂
在某些实施例中，检查点抑制剂分子与本文所述的疫苗组合物组合施用。免疫检查点是指对于维持自体耐受性和调节免疫反应的持续时间和幅度来说至关重要的免疫系统的多种抑制路径。肿瘤使用某些免疫检查点路径作为免疫抵抗的主要机制，尤其抵抗对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。(参见Pardoll,2012《自然(Nature)》12:252；Chen和Mellman《免疫性(Immunity)》39:1(2013))。免疫检查点抑制剂包括以统计学上显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制路径的任何药剂。这类抑制剂可以包括结合于并且阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或结合于并且阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可以靶向用于阻断或抑制的例示性免疫检查点分子包括(但不限于)CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9、2B4(属于CD2家族的分子并且在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)和CGEN-15049。免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、或其它结合蛋白，其结合于并且阻断或抑制以下中的一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9、2B4、CD160和CGEN-15049。
例示性免疫检查点抑制剂包括抗PD1、抗PDL1和抗PDL2剂，诸如A167、AB122、ABBV-181、ADG-104、AK-103、AK-105、AK-106、AGEN2034、AM0001、AMG-404、ANB-030、APL-502、APL-501、赛帕利单抗(zimberelimab)、阿特珠单抗、AVA-040、AVA-040-100、阿维鲁单抗、巴提利单抗(balstilimab)、BAT-1306、BCD-135、BGB-A333、BI-754091、布地格单抗(budigalimab)、坎立珠单抗、CB-201、CBT-502、CCX-4503、赛咪单抗、科西贝利单抗(cosibelimab)、西利单抗、CS-1001、CS-1003、CX-072、CX-188、多斯利单抗、德瓦鲁单抗、恩沃利单抗(envafolimab)、舒格利单抗(sugemalimab)、HBM9167、F-520、FAZ-053、杰诺珠单抗(genolimzumab)、GLS-010、GS-4224、hAB21、HLX-10、HLX-20、HS-636、HX-008、IMC-001、IMM-25、INCB-86550、JS-003、JTX-4014、JYO-34、KL-A167、LBL-006、罗达泊单抗(lodapolimab)、LP-002、LVGN-3616、LYN-00102、LMZ-009、MAX-10181、MEDI-0680、MGA-012(瑞弗利单抗(Retifanlimab))、MSB-2311、纳武单抗、派姆单抗、普罗高单抗(prolgolimab)、普罗力单抗(prololimab)、三萨力单抗(sansalimab)、SCT-I10A、SG-001、SHR-1316、斯迪利单抗(sintilimab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、RG6084、RG6139、RG6279、CA-170、CA-327、STI-3031、托勒拉西(toleracyte)、toca 521、Sym-021、TG-1501、缇勒珠单抗(tislelizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、TT-01、ZKAB-001和WO/2017/124050中所述的能够阻断与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用的抗PD-1抗体。
至少一个目标是抗PD1、抗PDL1或抗PDL2的例示性多特异性免疫检查点抑制剂包括ABP-160(CD47×PD-L1)、AK-104(PD-1×CTLA-4)、AK-112(PD-1×VEGF)、ALPN-202(PD-L1×CTLA-4×CD28)、AP-201(PD-L1×OX-40)、AP-505(PD-L1×VEGF)、AVA-0017(PD-L1×LAG-3)、AVA-0021(PD-L1×LAG-3)、AUPM-170(PD-L1×VISTA)、BCD-217(PD-1×CTLA-4)、BH-2950(PD-1×HER2)、BH-2996h(PD-1×PD-L1)、BH-29xx(PD-L1×CD47)、α宾曲福斯(bintrafusp alfa)(PD-L1×TGFβ)、CB-213(PD-1×LAG-3)、CDX-527(CD27×PD-L1)、CS-4100(PD-1×PD-L1)、DB-001(PD-L1×HER2)、DB-002(PD-L1×CTLA-4)、DSP-105(PD-1×4-1BBL)、DSP-106、(PD-1×CD70)、FS-118(LAG-3×PD-L1)、FS-222(CD137/4-1BB×PD-L1)、GEN-1046(PD-L1×CD137/4-1BB)、IBI-318(PD-1×PD-L1)、IBI-322(PD-L1×CD-47)、KD-033(PD-L1×IL-15)、KN-046(PD-L1×CTLA-4)、KY-1043(PD-L1×IL-2)、LY-3434172(PD-1×PD-L1)、MCLA-145(PD-L1×CD137)、MEDI-5752(PD-1×CTLA-4)、MGD-013(PD-1×LAG-3)、MGD-019(PD-1×CTLA-4)、ND-021(PD-L1×4-1BB×HSA)、OSE-279(PD-1×PD-L1)、PRS-332(PD-1×HER2)、PRS-344(PD-L1×CD137)、PSB-205(PD-1×CTLA-4)、R-7015(PD-L1×TGFβ)、RO-7121661(PD-1×TIM-3)、RO-7247669(PD-1×LAG-3)、SHR-1701(PD-L1×TGFβ2)、SL-279252(PD-1×OX40L)、TSR-075(PD-1×LAG-3)、XmAb-20717(CTLA-4×PD-1)、XmAb-23104(PD-1×ICOS)和Y-111(PD-L1×CD-3)。
另外例示性免疫检查点抑制剂包括抗CTLA4剂，诸如：ADG-116、AGEN-2041、BA-3071、BCD-145、BJ-003、BMS-986218、BMS-986249、BPI-002、CBT-509、CG-0161、Olipass-1、HBM-4003、HLX-09、IBI-310、伊派利单抗(ipilimumab)、JS-007、KN-044、MK-1308、ONC-392、REGN-4659、RP-2、曲美木单抗(tremelimumab)和扎弗利单抗(zalifrelimab)。至少一个目标是抗CTLA4的另外例示性多特异性免疫检查点抑制剂包括：AK-104(PD-1×CTLA-4)、ALPN-202(PD-L1×CTLA-4×CD28)、ATOR-1015(CTLA-4×OX40)、ATOR-1144(CTLA-4×GITR)、BCD-217(PD-1×CTLA-4)、DB-002(PD-L1×CTLA-4)、FPT-155(CD28×CTLA-4)、KN-046(PD-L1×CTLA-4)、)、MEDI-5752(PD-1×CTLA-4)、MGD-019(PD-1×CTLA-4)、PSB-205(PD-1×CTLA-4)、XmAb-20717(CTLA-4×PD-1)和XmAb-22841(CTLA-4×LAG-3)。另外例示性免疫检查点抑制剂包括抗LAG3剂，诸如BI-754111、BJ-007、α艾法莫德(eftilagimodalfa)、GSK-2831781、HLX-26、IBI-110、IMP-701、IMP-761、INCAGN-2385、LBL-007、MK-4280、REGN-3767、瑞拉单抗(relatlimab)、Sym-022、TJ-A3和TSR-033。至少一个目标是抗LAG3的另外例示性多特异性免疫检查点抑制剂包括：CB-213(PD-1×LAG-3)、FS-118(LAG-3×PD-L1)、MGD-013(PD-1×LAG-3)、AVA-0017
(PD-L1×LAG-3)、AVA-0021(PD-L1×LAG-3)、RO-7247669(PD-1×LAG-3)、TSR-075(PD-1×LAG-3)和XmAb-22841(CTLA-4×LAG-3)。另外例示性免疫检查点抑制剂包括抗TIGIT剂，诸如AB-154、ASP8374、BGB-A1217、BMS-986207、CASC-674、COM-902、EOS-884448、HLX-53、IBI-939、JS-006、MK-7684、NB-6253、RXI-804、替拉格鲁单抗(tiragolumab)和YH-29143。考虑至少一个目标是抗TIGIT的另外例示性多特异性免疫检查点抑制剂。另外例示性免疫检查点抑制剂包括抗TIM3剂，诸如：BGB-A425、BMS-986258、ES-001、HLX-52、INCAGN-2390、LBL-003、LY-3321367、MBG-453、SHR-1702、Sym-023和TSR-022。至少一个目标是抗TIM3的另外例示性多特异性免疫检查点抑制剂包括：AUPM-327(PD-L1×TIM-3)和RO-7121661(PD-1×TIM-3)。另外例示性免疫检查点抑制剂包括抗VISTA剂，诸如：HMBD-002和PMC-309。至少一个目标是抗VISTA的另外例示性多特异性免疫检查点抑制剂包括CA-170(PD-L1×VISTA)。另外例示性免疫检查点抑制剂包括抗BTLA剂，诸如：JS-004。考虑至少一个目标是抗BTLA的另外例示性多特异性免疫检查点抑制剂。例示性刺激免疫检查点包括抗OX40剂，诸如ABBV-368、GSK-3174998、HLX-51、IBI-101、INBRX-106、INCAGN-1949、INV-531、JNJ-6892和KHK-4083。至少一个目标是抗OX40的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括AP-201(PD-L1×OX-40)、APVO-603(CD138/4-1BB×OX-40)、ATOR-1015(CTLA-4×OX-40)和FS-120(OX40×CD137/4-1BB)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗GITR剂，诸如BMS-986256、CK-302、GWN-323、INCAGN-1876、MK-4166、PTZ-522和TRX-518。至少一个目标是抗GITR的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括ATOR-1144(CTLA-4×GITR)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗CD137/4-1BB剂，诸如：ADG-106、AGEN-2373、AP-116、ATOR-1017、BCY-3814、CTX-471、EU-101、LB-001、LVGN-6051、RTX-4-1BBL、SCB-333、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌图木单抗(utomilumab)和WTiNT。至少一个目标是抗CD137/4-1BB的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括ALG.APV-527(CD137/4-1BB×5T4)、APVO-603(CD137/4-1BB×OX40)、BT-7480(巢蛋白-4×CD137/4-1BB)、CB-307(CD137/4-1BB×PSMA)、CUE-201(CD80×CD137/4-1BB)、DSP-105(PD-1×CD137/4-1BB)、FS-120(OX40×CD137/4-1BB)、FS-222(PD-L1×CD137/4-1BB)、GEN-1042(CD40×CD137/4-1BB)、GEN-1046(PD-L1×CD137/4-1BB)、INBRX-105(PD-L1×CD137/4-1BB)、MCLA-145(PD-L1×CD137/4-1BB)、MP-0310(CD137/4-1BB×FAP)、ND-021(PD-L1×CD137/4-1BB×HSA)、PRS-343(CD137/4-1BB×HER2)、PRS-342(CD137/4-1BB×GPC3)、PRS-344(CD137/4-1BB×PD-L1)、RG-7827(FAP×4-1BBL)和RO-7227166(CD-19×4-1BBL)。
另外例示性刺激免疫检查点包括抗ICOS剂，诸如BMS-986226、GSK-3359609、KY-1044和沃普瑞单抗(vopratelimab)。至少一个目标是抗ICOS的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括XmAb-23104(PD-1×ICOS)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗CD127剂，诸如MD-707和OSE-703。考虑至少一个目标是抗CD127的另外例示性多特异性刺激免疫检查点。另外例示性刺激免疫检查点包括抗CD40剂，诸如ABBV-428、ABBV-927、APG-1233、APX-005M、BI-655064、比勒斯单抗(bleselumab)、CD-40GEX、CDX-1140、LVGN-7408、MEDI-5083、米佐利单抗(mitazalimab)和塞立路单抗(selicrelumab)。至少一个目标是抗CD40的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括GEN-1042(CD40×CD137/4-1BB)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗CD28剂，诸如FR-104和赛拉利单抗(theralizumab)。至少一个目标是抗CD28的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括ALPN-101(CD28×ICOS)、ALPN-202(PD-L1×CD28)、CUE-201(CD80×CD137/4-1BB)、FPT-155(CD28×CTLA-4)和REGN-5678(PSMA×CD28)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗CD27剂，诸如：HLX-59和瓦里木单抗。至少一个目标是抗CD27的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括DSP-160(PD-L1×CD27/CD70)和CDX-256(PD-L1×CD27)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗IL-2剂，诸如ALKS-4230、BNT-151、CUE-103、NL-201和THOR-707。至少一个目标是抗IL-2的另外例示性多特异性刺激免疫检查点包括CUE-102(IL-2×WT1)。另外例示性刺激免疫检查点包括抗IL-7剂，诸如BNT-152。考虑至少一个目标是抗IL-7的另外例示性多特异性刺激免疫检查点。另外例示性刺激免疫检查点包括抗IL-12剂，诸如AK-101、M-9241和优特克单抗(ustekinumab)。考虑至少一个目标是抗IL-12的另外例示性多特异性刺激免疫检查点。
如本文所述，本公开提供施用疫苗组合物、环磷酰胺、检查点抑制剂和/或诸如Treg抑制剂的其它治疗剂的方法。Treg抑制剂是所属领域中已知的并且包括例如贝培阿地白介素(bempegaldesleukin)、氟达拉宾、吉西他滨、米托蒽醌、环孢霉素A、他克莫司(tacrolimus)、太平洋紫杉醇、伊马替尼、达沙替尼、贝伐单抗、艾代拉里斯(idelalisib)、抗CD25、抗叶酸受体4、抗CTLA4、抗GITR、抗OX40、抗CCR4、抗CCR5、抗CCR8或TLR8配体。
给药
如本文所用，“剂量”或“单位剂量”是指包含治疗有效量的一种或多种细胞系的一种或多种疫苗组合物。剂量可以是单一疫苗组合物、两种单独疫苗组合物或两种单独疫苗组合物加包含一种或多种本文所述的治疗剂的一种或多种组合物。当在单独组合物中时，“剂量”的两种或更多种组合物意指“同时”施用。在一些实施例中，两种或更多种组合物施用于受试者的不同部位(例如手臂、大腿或背部)上。如本文所用，“同时”施用两种组合物或治疗剂指示在第一种组合物或治疗剂施用约30分钟内，施用第二种组合物或治疗剂。在超过两种组合物和/或治疗剂同时施用的状况下，各组合物或药剂在30分钟内施用，其中这类施用的时机开始于第一种组合物或药剂的施用，并且以开始施用最后一种组合物或药剂结束。在一些状况下，同时施用可以在开始施用第一种组合物或药剂、约30分钟内或15分钟内或10分钟内或5分钟内完成(即，施用最后一种组合物或药剂开始)在施用第一种组合物“之前”或“之后”施用第二(或多种)治疗剂或组合物意指第一种组合物与另一治疗剂的施用相隔至少30分钟，例如至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时或至少48小时。
来自疫苗组合物中的多种各个细胞系的细胞的量(例如数目)可以相同(如本文所定义)、大约(如本文所定义)相同或不同。在各种实施例中，疫苗组合物的各细胞系以大约相同的量存在。在其它实施例中，一种疫苗组合物中的2种或3种细胞系以大约相同的量存在，并且第二组合物中的2种或3种不同细胞系以大约相同的量存在。
在一些实施例中，来自各细胞系(在施用多种细胞系的状况下)的细胞的数目为大约5.0×105、1.0×106、2.0×106、3.0×106、4.0×106、5.0×106、6.0×106、7.0×106、8×106、9.0×106、1.0×107、2.0×107、3.0×107、4.0×107、5.0×107、6.0×107、8.0×107、9.0×107、1.0×108、2.0×108、3.0×108、4.0×108或5.0×108个细胞。在一个实施例中，考虑大约1000万(例如1.0×107)个来自一种细胞系的细胞。在另一实施例中，在施用6种单独细胞系的情况下，考虑大约1000万个来自各细胞系的细胞或6000万(例如6.0×107)个总细胞。
疫苗组合物中例如每个施用部位施用的细胞总数目可以在1.0×106至3.0×108的范围内。举例来说，在一些实施例中，施用2.0×106、3.0×106、4.0×106、5.0×106、6.0×106、7.0×106、8×106、9.0×106、1.0×107、2.0×107、3.0×107、4.0×107、5.0×107、6.0×107、8.0×107、9.0×107、1.0×108、2.0×108或3.0×108个细胞。
如本文所述，每次施用混合物或疫苗组合物下所含的细胞系的数目可以在1至10种细胞系的范围内。在一些实施例中，来自各细胞系的细胞的数目不相同，并且混合物或疫苗组合物中包括不同比率的细胞系。举例来说，若一种混合物含有来自3种不同细胞系的5.0×107个总细胞，则一种细胞系可以是3.33×107个细胞并且其余2种细胞系可以是8.33×106个细胞。
疫苗组合物和包含额外治疗剂(例如化学治疗剂、检查点抑制剂等)的组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、颊内、经阴道或经由植入式储集囊施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或输注技术。还设想如下实施例，其中疫苗组合物和包含额外治疗剂(例如化学治疗剂、检查点抑制剂和其类似物)的组合物在结节内或肿瘤内施用。
在一些实施例中，疫苗组合物在皮内施用。在相关实施例中，皮内注射涉及以5至15°的施用角度注射混合物或疫苗组合物。
注射(例如皮内或皮下注射)可提供于单个部位(例如手臂、大腿或背部)或多个部位(例如手臂和大腿)处。在一些实施例中，疫苗组合物同时在两个部位施用，其中各部位接受包含不同组合物(例如混合物)的疫苗组合物。举例来说，在一些实施例中，受试者接受包含手臂中三种细胞系和大腿中三种不同或部分重叠细胞系的组合物。在一些实施例中，受试者在每个手臂和每个大腿中同时接受包含一种或多种细胞系的组合物。
在一些实施例中，受试者接受多个剂量的混合物或疫苗组合物并且剂量施用在受试者上的不同部位，以避免某些(例如引流)淋巴结处的可能抗原竞争。在一些实施例中，在剂量之间通过在受试者上交替施用部位(例如左臂和右臂或左大腿和右大腿)来施用多个剂量。在一些实施例中，多个剂量如下施用：第一剂量在一个手臂中施用，并且第二剂量在另一个手臂中施用；如果施用后续剂量，那么继续以此方式交替施用。在一些实施例中，多个剂量如下施用：第一剂量在一个大腿中施用，并且第二剂量在另一个大腿中施用；如果施用后续剂量，那么继续以此方式交替施用。在一些实施例中，多个剂量如下施用：第一剂量在一个大腿中施用，并且第二剂量在一个手臂中施用；如果施用后续剂量，那么可以对于受试者来说安全并且有效的任何组合交替施用。在一些实施例中，多个剂量如下施用：第一剂量在一个大腿和一个手臂中施用，并且第二剂量在另一个手臂和另一个大腿中施用；如果施用后续剂量，那么可以对于受试者来说安全并且有效的任何组合交替施用。
在一些实施例中，经由皮内注射，受试者接受包含总共六种细胞系(例如NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、LK-2、NCI-H23和A549或本文所述的其它6细胞系组合)的疫苗组合物，呈一种、两种或更多种单独混合物，各混合物包含6细胞系中的一种或两种或更多种的混合物。在一些实施例中，经由皮内注射，受试者接受包含三种细胞系(例如NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、LK-2、NCI-H23和A549中的三种或来自本文所述的其它6细胞系组合的三种细胞系)的混合物的疫苗组合物。在一些实施例中，经由皮内注射到手臂(例如上臂)，受试者接受包含三种细胞系的混合物的疫苗组合物，该等细胞系包含NCI-H460、NCI-H520和A549；并且经由皮内注射到腿(例如大腿)，受试者同时接受包含三种细胞系的混合物的疫苗组合物，该等细胞系包含DMS 53、LK-2和NCI-H23。
在施用额外治疗剂的情况下，剂量或多个剂量可以经由与疫苗组合物相同或不同的途径施用。作为实例，在一些实施例中，包含检查点抑制剂的组合物经由静脉内注射来施用，并且疫苗组合物经由皮内注射来施用。在一些实施例中，环磷酰胺口服施用，并且疫苗组合物在皮内施用。
方案
根据本公开的疫苗组合物可以在受试者上的多个施用部位、多次和以多种量施用。如果受试者免疫系统处于容许活化抗肿瘤免疫反应的状态下，那么可能影响肿瘤细胞疫苗的功效。如果受试者正进行或已接受放射线疗法、化学疗法或其它先前治疗，那么功效也可能因此受影响。在一些实施例中，这需要在活化和效应元件完全起作用时，抑制免疫系统的免疫抑制元件。除本文所述的免疫抑制因子以外，抑制抗肿瘤免疫性的其它元件包括(但不限于)T调控细胞(Treg)和检查点分子，诸如CTLA-4、PD-1和PD-L1。
在一些实施例中，疫苗相对于先前化学疗法和放射线疗法周期的施用时机被设定成使受试者免疫系统在疫苗施用之前的免疫容许状态达到最大。本公开提供用于调节免疫系统的方法，该等方法在疫苗接种之前一剂或低剂量施用诸如环磷酰胺的化学治疗剂以增加全细胞肿瘤疫苗的功效。在一些实施例中，节拍化学疗法(例如频繁、低剂量施用化学疗法药物，没有长期无药物中断)用于调节免疫系统。在一些实施例中，节拍化学疗法允许低含量药物存留在血液中，没有在较高剂量下常看到的毒性和副作用的并发症。作为实例，在一些实施例中，施用环磷酰胺以调节免疫系统包括在接受疫苗剂量之前的时间(例如在施用疫苗组合物之前15天至1小时)施用药物以维持水平小于1的效应T细胞与调节T细胞的比率。
在一些实施例中，在本文所提供的疫苗组合物的一些或所有施用之前可以施用化学疗法方案(例如清髓性化学疗法、环磷酰胺和/或氟达拉宾方案)。环磷酰胺(CYTOXANTM、NEOSARTM)是一种众所周知的癌症药物，其干扰癌细胞在体内的生长和扩散。环磷酰胺可以呈丸剂(口服)、液体或经由静脉内注射施用。大量研究显示，环磷酰胺可以增强疫苗功效。(参见例如Machiels等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,61:3689,2001；Greten,T.F.等人,《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》,2010,33:211；Ghiringhelli等人,《癌症免疫学与免疫治疗》,56:641,2007；Ge等人,《癌症免疫学与免疫治疗》,61:353,2011；Laheru等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》,14:1455,2008；和Borch等人,《肿瘤免疫学(OncoImmunol)》,e1207842,2016)。在一些实施例中，如本文所述的“低剂量”环磷酰胺有效耗乏Treg、减弱Treg活性和增强效应T细胞功能。在一些实施例中，静脉内低剂量施用环磷酰胺包括在2-5天内40-50mg/kg分次给药。其它低给药方案包括每7-10天1-15mg/kg或每周两次3-5mg/kg。根据本公开的一些实施例，低剂量口服包括初始和维持给药都是每天1-5mg/kg。口服片剂的剂型是25mg和50mg。在一些实施例中，环磷酰胺呈口服50mg片剂施用7天，直到第一个和任选的每个后续剂量的本文所述的疫苗组合物。
在一些实施例中，环磷酰胺在7天中的每一天呈口服50mg片剂施用，直到第一个后续剂量的疫苗组合物，并且任选地在每个后续剂量的疫苗组合物之前的7天中的每一天施用。在另一实施例中，在每次施用癌症疫苗混合物或单位剂量之前，患者服用或接受口服剂量的25mg环磷酰胺，每日两次，其中一个剂量在日出时的早晨并且第二剂量在入睡前的夜晚，历时7天。在某些实施例中，疫苗组合物在几年内多次在皮内施用。在一些实施例中，在施用疫苗组合物之后每两周或每三周施用检查点抑制剂。
在另一实施例中，在施用癌症疫苗混合物或单位剂量的疫苗组合物之前至少一天，患者接受200、250、300、500或600mg/m2单个静脉内剂量的环磷酰胺。在另一实施例中，在施用第4、8、12号疫苗剂量的癌症疫苗混合物或单位剂量之前至少一天，患者接受200、250、300、500或600mg/m2静脉内剂量的环磷酰胺。在另一实施例中，在施用癌症疫苗混合物或单位剂量之前至少1小时，患者接受呈静脉内注射的1000mg/kg单次剂量的环磷酰胺。在一些实施例中，施用200mg/kg的口服高剂量或500-1000mg/m2的IV高剂量。
环磷酰胺的施用可以经由以下任一种：口服(例如呈胶囊、用于溶液的散剂，或片剂)；静脉内(例如通过注射或输注经静脉(IV)施用)；肌肉内(例如经由注射到肌肉中(IM))；腹膜内(例如经由注射到腹部内层中(IP))；以及胸膜内(例如经由注射到肺内层中)。
在一些实施例中，可以在疫苗组合物之前、与其同时或在其之后施用免疫疗法检查点抑制剂(例如抗CTLA4、抗PD-1抗体(诸如派姆单抗和纳武单抗)、抗PDL1(诸如德瓦鲁单抗))。在某些实施例中，每3周经60分钟呈静脉内输注施用2mg/kg派姆单抗。在一些实施例中，每3周经30分钟呈静脉内输注施用200mg派姆单抗。在一些实施例中，每6周经30分钟呈静脉内输注施用400mg派姆单抗。在一些实施例中，每两周施用10mg/kg德瓦鲁单抗。在一些实施例中，每2周施用240mg纳武单抗(或每4周480mg)。在一些实施例中，每3周施用1mg/kg纳武单抗，接着在同一天施用伊派利单抗，4剂，接着每2周240mg(或每4周480mg)。在一些实施例中，每3周施用3mg/kg纳武单抗，接着在同一天施用1mg/kg伊派利单抗，4剂，接着每2周240mg(或每4周480mg)。在一些实施例中，每2周施用或3mg/kg纳武单抗。
在一些实施例中，每2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周施用德瓦鲁单抗或派姆单抗，施用多达8次，并且接着视需要减少至每6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。
在其它实施例中，本公开提供PD-1和PD-L1抑制剂以固定给药方案(即，不基于体重)施用。在非限制性实例中，PD-1抑制剂每周或在第2周、第3周、第4周、第6周和第8周以100-1200mg之间的量施用。在非限制性实例中，PD-L1抑制剂每周或在第2周、第3周、第4周、第6周和第8周以250-2000mg之间的量施用。
在一些实施例中，如本文所述的疫苗组合物或组合物与PD-1抑制剂同时或组合施用，该PD-1抑制剂以100mg与1500mg之间的固定剂量或基于重量0.5mg/kg与15mg/kg之间的剂量Q1W、Q2W、Q3W、Q4W、Q6W或Q8W给予。在另一实施例中，如本文所述的疫苗组合物或组合物与PD-L1抑制剂同时组合施用，该PD-L1抑制剂以250mg与2000mg之间的固定剂量或基于重量2mg/kg与30mg/kg之间的剂量Q2W、Q3W或Q4W给予。在其它实施例中，施用上述方案，但以短连续或串联的形式施用组合物，使得患者在同一次问诊期间接受疫苗组合物或组合物和检查点抑制剂。
植物印度大麻(Cannabis sativa L.)用作草药疗法已有数百年历史，并且是植物大麻素的重要来源。内源性大麻素系统(ECS)由受体、内源性配体(内源性大麻素)和代谢酶组成，并且在不同生理学和病理学过程中起作用。植物大麻素和合成大麻素可以与ECS的组分或其它细胞路径相互作用，并且因此可以影响包括癌症的疾病的发展或进展。在癌症患者中，大麻素可以用作姑息护理的一部分以缓解疼痛，减轻恶心和刺激食欲。另外，大量细胞培养和动物研究显示大麻素在多种癌症类型中的抗肿瘤作用。(关于评论，参见Daris,B.等人,《波斯尼亚基础医学科学杂志(Bosn.J.Basic.Med.Sci.)》,19(1):14-23(2019)。)植物大麻素是一组C21萜烯酚类化合物，主要由来自大麻属的植物产生。存在若干不同大麻素和相关分解产物。当中有四氢大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)、大麻酚(CBN)、大麻环萜酚(CBC)、Δ8-THC、大麻二酚酸(CBDA)、次大麻二酚(CBDV)和大麻萜酚(CBG)。
在本公开的某些实施例中，在施用诸如环磷酰胺的Treg细胞抑制剂之前或与之同时，停止所有植物大麻素的使用，和/或另外在施用根据本公开的疫苗组合物之前或与之同时，停止所有植物大麻素的使用。在一些实施例中，在多次施用环磷酰胺或疫苗组合物的情况下，任选地在每次施用之前或与之同时发生终止。在某些实施例中，直到施用疫苗组合物一段时间之后才恢复植物大麻素的使用。举例来说，考虑在施用环磷酰胺或疫苗剂量之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天和在施用之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天禁止施用大麻素。
在一些实施例中，患者将在化学疗法结束后的6-12周内接受第一剂量的疫苗。在癌症治疗中使用的高剂量化学疗法消除增殖细胞并且耗乏免疫细胞子集。化学疗法结束后，免疫系统将开始重建。T细胞再现的时间间隔为大致2-3周。因为T细胞系目标是活化的免疫细胞子集，所以在一些实施例中，在存在足够T细胞进行引发的窗口内施用癌症疫苗，而受试者仍然是淋巴细胞减少的。在此环境中，较少的细胞占据小生境，这将使引发的T细胞迅速分裂，响应于对细胞因子(例如IL7和IL15)的利用增加而经历“稳态增殖”。因此，通过在此窗口下给予疫苗，使如本文所述的癌症疫苗平台的实施例的潜在功效最大化以允许引发抗原特异性T细胞和扩大疫苗相关的T细胞反应。
选择细胞系和制备疫苗的方法
细胞系选择
对于既定癌症或在患者罹患超过一种癌症的情况下，基于若干标准鉴别一种细胞系或细胞系的组合用于包括于疫苗组合物中。在一些实施例中，如以下所提供，逐步进行细胞系的选择。并非所有癌症适应症都需要所有选择步骤和/或标准。
步骤1.基于例如癌细胞系百科全书(CCLE)数据库中RNA-seq数据的可用性，选择各适应症的细胞系。RNA-seq数据允许鉴别可能显示特异性针对所关注的癌症适应症的最大抗原广度的候选细胞系并且告知细胞系对免疫抑制因子的可能表达。如果CCLE中的RNA-seq数据的可用性受到限制，那么RNA-seq数据可以源自欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)数据库或所属领域中已知的其它来源。在一些实施例中，当RNA-seq值>0时，基于RNA-seq数据的所关注蛋白质(例如TAA)的可能表达视为“阳性”。
步骤2.对于所有适应症，优先考虑来源于转移部位的细胞系，以扩大抗原广度并且更有效地靶向癌转移患者中的晚期疾病。在一些实施例中包括来源于原发性肿瘤的细胞系以进一步扩大疫苗组合物的广度。在一些实施例中，还考虑细胞系所源自的癌转移的位置。举例来说，在一些实施例中，可以选择来源于淋巴结、腹水和肝脏转移部位的细胞系，而非所有三种细胞系都来源于肝脏转移部位。
步骤3.细胞系被选择成涵盖广泛癌症类型分类。举例来说，管式腺癌是胃癌的常见诊断分类。因此，可以选择匹配此分类的大量细胞系。对于原发性肿瘤部位变化的适应症，可以选择满足此多样性的细胞系。举例来说，对于头颈部小细胞癌(SCCHN)，在一些实施例中，选择细胞系以涵盖起源于口腔、颊粘膜和舌的肿瘤。这些选择标准能够靶向患者肿瘤类型的异质群体。在一些实施例中，细胞系被选择成涵盖种族多样化群体以产生来源于不同组织学和种族背景的细胞系候选池。
步骤4.在一些实施例中，基于其它因素选择细胞系。举例来说，在转移性结肠直肠癌(mCRC)中，可以包括报告为高微卫星不稳定性(MSI-H)和微卫星稳定性(MSS)细胞系。作为另一实例，对于病毒驱动的适应症，出于安全性和/或制造复杂性问题，可以排除编码病毒基因组的细胞系。
步骤5.在一些实施例中，细胞系被选择成涵盖驱动因子突变或适应症相关突变中变化程度的遗传复杂性。细胞系突变的异质性可以扩大抗原谱系以靶向具有一种或多种肿瘤类型的患者内的较大群体。作为实例，乳腺癌细胞系可以在Her2、孕酮受体和雌激素受体的缺失状态上多样化，使得最终单位剂量包括三阴性、双阴性、单阴性和野生型组合。各癌症类型具有复杂基因组状况，因此，针对具体适应症，选择类似基因突变的细胞系。举例来说，黑色素瘤最常具有BRAF、CDKN2A、NRAS和TP53的改变，因此在一些实施例中，所选黑色素瘤细胞系含有这些基因中的一种或多种的基因改变。
步骤6.在一些实施例中，依据基于RNA-seq数据的TAA、TSA和/或癌症/睪丸抗原表达进一步缩小细胞系。使用所属领域的技术人员显而易见的搜索方法鉴别与具体肿瘤相关的抗原或抗原集合(参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/和clinicaltrials.gov)。在一些实施例中，若抗原与阳性临床结果相关或鉴别作为由具体肿瘤或肿瘤类型高度表达，同时在正常组织中以较低水平表达，那么可以包括该等抗原。
步骤7.在步骤1至6结束之后，在一些实施例中，基于细胞培养特性和诸如倍增时间、粘附性、尺寸和血清需求的考虑因素，巩固其余细胞系候选物的列表。举例来说，可以选择倍增时间小于80小时的细胞系或需要培养基血清(FBS、FCS)＜10％的细胞系。在一些实施例中，可以选择不形成聚集体的粘附或悬浮细胞系以确保适当细胞计数和活力。
步骤8.在一些实施例中，基于免疫抑制因子的表达(例如如步骤1中所述的基于源自CCLE或EMBL的RNA-seq数据)选择细胞系。
在一些实施例中，患者肿瘤的生检和生检样品的后续TAA表达图谱将帮助选择细胞系。因此，本公开的实施例提供一种制备疫苗组合物的方法，其包含以下步骤：确定受试者肿瘤的TAA表达图谱；选择癌细胞系；修饰癌细胞系；以及在施用之前对细胞系进行辐照以防在施用患者之后增殖。
制备疫苗组合物
在某些实施例中，在制造扩大后，被修饰的细胞系中的所有细胞被辐照、悬浮和低温保存。在一些实施例中，细胞以10,000cGy辐照。根据一些实施例，细胞以7,000至15,000cGy辐照。根据一些实施例，细胞以7,000至15,000cGy辐照。
在某些实施例中，各小瓶含有120±10μL(1.2×107个细胞)的体积。在一些实施例中，每个部位注射的总体积是300μL或更少。在一些实施例中，每个部位注射的总体积是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300μL。在例如注射的总体积是300μL的情况下，本公开提供在一些实施例中，注射3×100μL体积或2×150μL，总计300μL。
在一些实施例中，组分细胞系的小瓶储存于液氮气相中，直到准备注射。在一些实施例中，组分细胞系中的每一个包装在单独小瓶中。
如本文所述，在施用之前，在一些实施例中，通过针头和注射器移出两个小瓶的内含物并且注射到第三小瓶中进行混合。在一些实施例中，对于各混合物重复此混合。在其它实施例中，六个小瓶的内含物分成两组-A和B，其中将三个小瓶的内含物任选地组合或混合到新小瓶(A)中，并且其余三个小瓶的内含物任选地组合或混合到新小瓶(B)中。
在某些实施例中，在低温保存之前细胞被辐照以防在施用患者之后增殖。在一些实施例中，细胞以7,000至15,000cGy经辐照，以使细胞无法增殖。
在一些实施例中，细胞系分开并且在相同生长培养基中生长。在一些实施例中，细胞系分开并且在不同细胞生长培养基中生长。
全肿瘤细胞疫苗组分细胞系的无异种转化
对用全肿瘤细胞疫苗治疗的受试者中的抗体反应的分析表明，存活率与针对牛α-Gal抗原的IgG抗体反应的发展之间存在负相关。(参见Xia等人,《细胞化学生物学(CellChem Biol)》23(12):1515-1525(2016))。这是重要的，因为大部分全肿瘤细胞疫苗由已在含有胎牛血清(FBS，其含有牛α-Gal抗原)的培养基中扩增并且低温保存的肿瘤细胞系构成。
在一些实施例中，为防止对FBS中存在的外来抗原起免疫反应，在大规模cGMP制造之前，使本文所公开的细胞系适应无异种培养基，该等培养基由来自人类来源的作为细胞生长必需的生长因子和补充剂构成。如本文所用，术语“适应”和“转换(converting)”或“转换(conversion)”可以互换使用，如所属领域的技术人员将理解，是指将细胞转移/改变至不同培养基。在一些实施例中，所选择的无异种培养基配制物可以在所有细胞系中是相同的，或在其它实施例中，可以是不同细胞系不同的。在一些实施例中，培养基组合物将不含任何非人类物质，并且可以包括人类来源蛋白质作为单独FBS的替代，或人类来源蛋白质与人类来源重组细胞因子和生长因子(例如EGF)的组合。另外，在一些实施例中，无异种培养基组合物还可以含有增强肿瘤细胞系生长的其它补充剂(例如氨基酸、能量来源)。将针对维持细胞系形态的能力和倍增时间不超过FBS中的倍增时间的两倍以及维持转基因的表达与FBS中类似的能力，选择无异种培养基配制物。
可采取多种程序以使诱导针对牛抗原的IgG、IgA、IgE、IgM和IgD抗体的可能性降到最低。这些包括(但不限于)：适于在无异种培养基中生长的细胞系；在FBS中生长并且在收获之前置于无异种培养基中一段时间(例如至少三天)的细胞系；在FBS中生长并且在收获和低温保存之前在无异种培养基中洗涤的细胞系；在含有Buminate(USP级医药人类血清白蛋白)作为FBS替代物的培养基中低温保存的细胞系；和/或在无异种和无动物组分的中间配制物(例如CryoStor)中低温保存的细胞系。在一些实施例中，这些程序中的一种或多种的实施可以通过从疫苗组合物去除牛抗原而降低诱导抗牛抗体的风险。
根据一个实施例，本文所述的疫苗组合物不包含非人类物质。在一些实施例中，本文所述的细胞系在无异种培养基中配制。无异种培养基的使用避免使用免疫显性异种抗原和诸如BSE朊病毒的可能人畜生物体。作为实例，在基因修饰之后，细胞系转移至无异种培养基并且扩增以产生种子库。种子库低温保存并且储存于液氮低温冷冻机中气相中。
本文提供NSCLC和GBM疫苗制剂的示例性无异种转换。
活体外分析
同种异体全细胞癌症疫苗(诸如本文所述的同种异体全细胞癌症疫苗)引发抗肿瘤免疫反应和证实对疫苗细胞系的修饰增强疫苗相关免疫反应的能力可以在活体外分析下模型化。不受任何理论约束，对疫苗细胞系组分进行的基因修饰经由增强疫苗微环境中的树突状细胞(DC)功能而加强适应性免疫反应。TAA、免疫抑制因子和/或免疫刺激因子的表达的可能作用可以在活体外，例如使用基于流式细胞术的分析和IFNγELISpot分析模型化。
在一些实施例中，为在活体外将对疫苗细胞系组分的修饰的作用模型化，DC来源于自健康供体周边血液单核细胞(PBMC)分离的单核球并且用于下游分析中以表征在一种或多种免疫刺激或免疫抑制因子存在或不存在下的免疫反应。在与未被修饰的亲本疫苗细胞系(对照)或被修饰的疫苗细胞系组分共培养期间疫苗细胞系组分被供体来源的不成熟DC吞噬。可以使用流式细胞术检测诸如CD40、CD83、CD86和HLA-DR的DC成熟标记物的变化来评估被修饰的疫苗细胞系组分对DC成熟和由此后续T细胞引发的作用。可替代地，在与疫苗细胞系组分共培养之后不成熟DC成熟，以磁性方式将成熟DC与疫苗细胞系组分分离，并且接着与自体CD14-PBMC共培养6天以模拟T细胞的活体内呈递和刺激。IFNγ产生是对T细胞刺激活性的测量，在IFNγELISpot分析中测量，或通过流式细胞术评估免疫细胞子集的增殖和表征。在IFNγELISpot分析中，将PBMC用负载有未被修饰的亲本疫苗细胞系组分的自体DC刺激以评估在活体内针对未被修饰的肿瘤细胞的可能反应。
IFNγELISpot分析可以用于评估同种异体疫苗驱动针对由疫苗细胞系表达的临床上相关TAA的免疫反应的潜能。为在IFNγELISpot分析中评估TAA特异性反应，在与DC共培养后，将该等PBMC用包含所关注TAA的已知的不同MHC-I抗原决定基的肽池刺激。在各种实施例中，疫苗组合物可以包含3种细胞系，该等细胞系诱导针对至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种非病毒抗原或针对IFNγ反应所评估的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％抗原的IFNγ反应。在一些实施例中，疫苗组合物可以是6种细胞系的单位剂量，该等细胞系诱导针对至少5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种非病毒抗原或针对IFNγ反应所评估的至少60％、70％、80％、90％或100％抗原的IFNγ反应。
活体内小鼠模型
同种异体全细胞疫苗对抗原特异性T细胞的诱导可以在活体内使用小鼠肿瘤激发模型来模型化，归因于小鼠与人类之间的TAA的不同异种同源性，本文实施例中提供的疫苗可以不直接施用于小鼠肿瘤模型。然而，疫苗的鼠类同源物可使用小鼠肿瘤细胞系产生。小鼠模型中其它免疫读取结果的一些实例是：特异性针对疫苗或TAA的体液免疫反应的表征；在后续免疫接种下细胞免疫反应的加强；在引流淋巴结处DC迁移和DC子集的表征；细胞和体液记忆反应的评估；肿瘤负荷的减少；和确定TME中的疫苗相关免疫学变化，诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与Treg的比率。将使用诸如ELISA、IFNγELISpot和流式细胞术的标准免疫学方法。
试剂盒
本文所述的疫苗组合物可以用于制造药剂，例如供治疗患有癌症的受试者或延长受试者存活用的药剂，该癌症是例如肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌(TNBC))、膀胱或泌尿道癌、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肝细胞(HCC)癌、肾脏或肾细胞癌(RCC)癌、胃或胃癌、卵巢癌、食道癌、睪丸癌、胰腺癌、中枢神经系统癌症、子宫内膜癌、黑色素瘤和间皮癌。
还提供用于治疗患有癌症的受试者或延长受试者存活的试剂盒，其含有本文所述的任一疫苗组合物，任选地连同注射器、针头和/或使用说明书一起。还提供制品，其包括至少一个含有本文所述的任一疫苗组合物的器皿或小瓶和治疗患有癌症的受试者或延长受试者存活的使用说明书。本文所述的任一疫苗组合物可连同投药说明书一起包括于包含容器、包装或分配器的试剂盒中。
在一些实施例中，本文提供一种试剂盒，其包含至少两个小瓶，各小瓶包含疫苗组合物(例如混合物A和混合物B)，其中各小瓶包含至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种细胞系，其中该等细胞系被修饰以抑制或减少一种或多种免疫抑制因子的产生，和/或表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达，和/或表达异质性肿瘤相关抗原或新抗原。
作为实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、LK-2、NCI-H23和A549。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS 53、DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS53、PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145和LNCAP。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS53、HCT-15、HuTu80、LS411N、HCT-116和RKO。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS 53、OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G和ES-2。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS 53、HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON和OSC-20。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS 53、J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER和UM-UC-3。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS 53、MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1和Fu97。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS 53、AU565、CAMA-1、HS-578T、MCF-7和T-47D。作为另一实例，提供一种试剂盒，其包含6个单独小瓶，其中各小瓶包含以下细胞系之一：DMS53、PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN1。
在一些实施例中，本文提供一种试剂盒，其包含至少两个小瓶，各小瓶包含疫苗组合物(例如混合物A和混合物B)，其中各小瓶包含至少3种细胞系，其中该等细胞系被修饰以减少一种或多种免疫抑制因子的产生或表达，和/或被修饰以增加一种或多种免疫刺激因子的表达，和/或表达肿瘤相关抗原的异质性或新抗原。在这些实施例中，两个小瓶一起为单位剂量。各单位剂量可每个小瓶具有约5×106个至约5×107个细胞，例如每个小瓶约5×106个至约3×107个细胞。
在一些实施例中，本文提供一种试剂盒，其包含至少六个小瓶，各小瓶包含疫苗组合物，其中各疫苗组合物包含一种细胞系，其中该细胞系被修饰以抑制或减少一种或多种免疫抑制因子的产生，和/或被修饰以表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达，和/或表达肿瘤相关抗原的异质性或新抗原。本文提供的实施例中的至少六个小瓶中的每一者可以是疫苗组合物的单位剂量。各单位剂量可每个小瓶具有约2×106个至约50×106个细胞，例如每个小瓶约2×106个至约10×106个细胞。
在一些实施例中，本文提供一种试剂盒，其包含单独小瓶，各小瓶包含疫苗组合物，其中各疫苗组合物包含一种细胞系，其中该细胞系被修饰以抑制或减少一种或多种免疫抑制因子的产生，和/或被修饰以表达一种或多种免疫刺激因子或增加其表达，和/或表达肿瘤相关抗原的异质性或新抗原。本文提供的实施例中的每一小瓶可以是疫苗组合物的单位剂量。各单位剂量可每个小瓶具有约2×106个至约50×106个细胞，例如每个小瓶约2×106个至约10×106个细胞。
在例示性实施例中，提供一种试剂盒，其包含各3种细胞系的两种混合物(即，2种不同疫苗组合物中总共6种细胞系)，如下：每种细胞系8×106个细胞；每次注射2.4×107个细胞；以及4.8×107个细胞总剂量。在另一例示性实施例中，提供每种细胞系1×107个细胞；每次注射3.0×107个细胞；以及6.0×107个细胞总剂量。在一些实施例中，本文所公开的任一试剂盒的小瓶含有约0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL或1.0mL本公开的疫苗组合物。在一些实施例中，小瓶中细胞的浓度是约5×107个细胞/毫升至约5×108个细胞/毫升。
如本文所述的试剂盒可以还包含针、注射器和其它用于施用的附件。
实例
实例1：在与周边血液单核细胞(PBMC)的共培养物中人类肺腺癌细胞系中的HLA-G
表达的减少增加IFNγ分泌
肿瘤细胞对HLA-G的异常表达与肿瘤免疫逃逸、癌转移和不良预后相关联。HLA-G与DC上的其受体ILT2和ILT4的接合可以促进免疫耐受性和引发具有免疫抑制表型的T细胞。全细胞疫苗的细胞系组分上HLA-G表达的减少可提高VME中的免疫原性。
人类腺癌细胞系中HLA-G表达的减少
人类腺癌细胞系RERF-LC-Ad1被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒表达对HLA-G减弱具有特异性的短发夹核糖核酸(shRNA)(成熟反义序列：TACAGCTGCAAGGACAACCAG)(SEQID NO:23)。亲本细胞或被对照(未沉默)shRNA转导的细胞充当对照。通过细胞测量术，通过用APC结合的小鼠单克隆抗体人类HLA-G(纯系87G)染色来测定在shRNA介导的HLA-G减弱之后的HLA-G表达量，并且接着进行FACs分选以富集HLA-G低群体。将被修饰和未被修饰的细胞分离并且用APC结合的小鼠单克隆抗体人类HLA-G(纯系87G)染色。在用嘌呤霉素进行选择以富集稳定表达shRNA的细胞之后，在mRNA层面下通过定量聚合酶链反应(qPCR)和在蛋白质层面下通过流式细胞术分析细胞对HLA-G的表达。对于qPCR，使细胞溶解在Trizol中，分离总RNA并且接着转录成互补DNA(cDNA)。使用ΔΔCt法，将相对HLA-G mRNA表达用对HLA-G和PSMB4(用于正规化)具有特异性的探针定量。与亲本(未被转导)细胞和被对照(未沉默)shRNA转导的细胞相比，被针对HLA-G的shRNA稳定转导的细胞中HLA-G mRNA表达减少至少75％(图1A)。通过流式细胞术测定在shRNA介导的HLA-G减弱之后的HLA-G表达量。将被修饰和未被修饰的细胞分离并且用APC结合的小鼠单克隆抗体人类HLA-G(纯系87G)染色。荧光(表达)强度计算为△平均荧光强度(ΔMFI＝MFI抗HLA-G-MFI未染色)。与亲本(未被转导)细胞相比，被针对HLA-G的shRNA稳定转导的细胞中HLA-G细胞表面表达减少70％(图1B)。
混合淋巴细胞肿瘤反应(MLR)中IFNγ分泌的增加
从健康供体血液分离PBMC并且与腺癌肺癌细胞系以10:1的PBMC:肿瘤细胞比率共培育，该等细胞系用丝裂霉素C(0.4μg/ml，16小时)预处理以防肿瘤细胞生长和增殖。在共培养第3天(和第7天)添加不同浓度的介白素-2(IL2)。在第7天和/或第10天收获细胞培养上清液并且通过ELISA测量IFNγ分泌。在第10天，相较于亲本和未沉默肿瘤细胞，PBMC与HLA-G表达减少的肿瘤细胞的共培养物中IFNγ的增加显著(p<0.01)(双向ANOVA与斯达克多重比较检验(Sidak's multiple comparisons test))(图2A)。另外，在共培养期间IFNγ分泌的显著增加与IL-2浓度无关(p<0.0001，双向ANOVA与杜凯氏多重比较检验(Tukey'smultiple comparisons test))(图2B)。
实例2：CD47表达的减少增加抗原呈递细胞对肿瘤细胞系的吞噬作用并且增强免
疫原性
CD47是“自身”细胞表面标记物并且由此阻止针对健康细胞的免疫反应。原发性肿瘤细胞以及肿瘤细胞系可以表达高水平CD47。
人类腺癌细胞系中CD47表达的减少
将人类NSCLC细胞系A549NCI-H460和NCI-H520用对CD47具有特异性的靶向以下基因组DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)对电穿孔：CACACAGGAAACTACacttgtGAAGTAACAGAATTA(SEQID NO:27)。在用PE结合的抗人类CD47单克隆抗体(纯系CC2C6)染色之后，通过流式细胞术鉴别全等位基因敲除细胞，并且接着进行FACS分选以富集CD47阴性群体。ZFN对CD47的基因编辑引起A549(图3A)、NCI-H460(图3B)和NCI-H520(图3C)细胞系对CD47的表达减少超过99％。
CD47的减少增加抗原呈递细胞对肿瘤细胞系的吞噬作用并且增强免疫原性
使用NCI-H520细胞系来测定减少CD47表达(CD47 KO)对吞噬作用和免疫原性的作用。具体来说，使用吞噬作用分析来测定CD47 KO对人类单核球来源的专业抗原呈递细胞(APC)DC与巨噬细胞的吞噬作用的作用。在IFNγELISpot分析中评估通过NCI-H520未修饰的亲本和CD47 KO诱导的免疫反应。
人类树突状细胞和巨噬细胞的产生
根据制造商说明书，通过磁力从分离自健康供体leukopak(StemCellTechnologies，#70500)的CD14+细胞获得人类不成熟树突状细胞(iDC)和M1巨噬细胞(MDM)。根据制造商说明书，通过在ImmunoCultTM-ACF树突状细胞培养基(StemCellTechnologies，#10986)中在ImmunoCultTM-ACF树突状细胞分化补充剂(StemCellTechnologies，#10988)存在下培养CD14+细胞来产生iDC。在第3天收获iDC用于吞噬作用分析，并且在第6天收获用于IFNγELISpot分析。通过在补充有10％FBS的RPMI中在100ng/mLGM-CSF(PeproTech，#300-03-100UG)存在下培养CD14+细胞7天来产生MDM。为使巨噬细胞偏向M1表型，在第7天，将RPMI+10％FBS培养基替换成含有20ng/mL LPS(InvivoGen，#tlrl-3pelps)和20ng/mL IFNγ(PeproTech，300-02-100UG)的巨噬细胞-SFM(Gibco，#12065074)。在第9天收获MDM用于吞噬作用分析。
吞噬作用分析
将未被修饰的亲本和CD47 KO NCI-H520细胞用10μg/mL丝裂霉素C(MMC)处理2小时并且静置过夜，接着在37℃下用1μM CSFE(Invitrogen，#C34554)标记30分钟。将iDC和MDM与用CSFE标记的未被修饰的亲本和CD47 KO NCI-H520细胞在37℃下共培养4小时。iDC和细胞系以1:1效应:目标比率在96孔低粘附性U形底盘中共培养。MDM以1:4效应:目标比率在96孔盘中共培养。在培育4小时之后，将共培养物用LIVE/DEAD Aqua(MolecularProbes，#L23105)、αCD45-PE-Cy7(BD Biosciences，纯系HI30)和αCD11c-BV605(BDBiosciences，纯系B-ly6)针对iDC，或αCD11b-BV421(BD Biosciences，纯系ICRF44)针对MDM进行表面染色。使用FlowJo(FlowJo有限责任公司)分析流式细胞术数据。MDM吞噬作用定义为通过流式细胞术，也呈CFSE(FITC)阳性的活CD45+CD11b+细胞的百分比。iDC吞噬作用定义为通过流式细胞术，也呈CFSE(FITC+)阳性的活CD45+CD11c+细胞的百分比。未与未被修饰的亲本或CD47 KO NCI-H520细胞共培养的MDM和iDC充当对照。
IFNγELISpot分析
在装载iDC之前24小时，以100Gy(Rad Source 1800Q)对未被修饰的亲本和CD47KO NCI-H520细胞进行x射线辐照。为装载iDC，将被辐照的未被修饰的亲本和CD47 KO NCI-H520(ATCC HTB-182)与iDC以1:1比率在25μg/mL匙孔螺血氰蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin，KLH)(Calbiochem#374807)和1μg/mL可溶性CD40L(sCD40L)(PeproTech，#AF31002100UG)存在下共培养24小时。接着通过添加100IU/mL IFNγ(PeproTech，300-02-100UG)、10ng/mL LPS(InvivoGen，#tlrl-3pelps)和2.5μg/mL雷西莫特(Resiquimod，R848)(InvivoGen，#tlrl-3r848)使负载肿瘤细胞的iDC成熟过夜。将成熟DC(mDC)用αCD45-PE(BDBiosciences，纯系HI30)标记并且根据制造商的说明书，使用EasySepTM释放人类PE阳性选择试剂盒(StemCell Technologies，#17654)以磁性方式从共培养物中分离。接着将被分离的mDC与自体CD14-PBMC以1:10DC:PBMC比率共培养6天。对于IFNγELISpot分析(MabTech，3420-4APT-10)，此与mDC的共培养物中分离CD14-PBMC并且用负载未被修饰的亲本NCI-H520的mDC刺激24小时。根据制造商说明书，检测IFNγ斑点形成单位(SFU)，计数(S6CoreAnalyzer，ImmunoSpot)，并且表示为超过对照的SFU数目/106PBMC。
单核球来源的树突状细胞和巨噬细胞对NCI-H520CD47KO细胞系的吞噬作用增加
相对于未被修饰的亲本细胞系的吞噬作用(7.0±1.2％活/CD45+/CD11b+/CFSE+)，CD47的减少平均使来源于2个健康供体的MDM的吞噬作用增加1.6倍(11.1±1.9％活/CD45+/CD11b+/CFSE+)。相对于未被修饰的亲本细胞系的吞噬作用(5.5±3.4％活/CD45+/CD11c+/CFSE+)，CD47的减少也平均使来源于2个健康供体的iDC的吞噬作用增加2.2倍(11.9±2.3％活/CD45+/CD11c+/CFSE+)(图4A)。
CD47的减少提高人类鳞状肿瘤细胞系的免疫原性
相对于负载有未被修饰的亲本CD47阳性细胞的DC(5，253±109SFU)，当自体PBMC与负载有CD47 KO细胞的DC共培养时通过ELISpot的IFNγ反应高1.9倍(9，980±903SFU)(p＝0.007，史都登氏T检验(Student's T-test))(n＝3)(图4B)。
实例3：计划性细胞死亡配体1表达的减少
DC上的PD1结合于肿瘤细胞上的PDL1(CD274)可以抑制DC功能并且可能减少发炎性(Th1)T细胞的引发并且促进免疫抑制(Th2)T细胞的引发。
使用锌指介导的基因编辑减少NSCLC细胞系NCI-H460对PDL1的表达。将细胞系用编码对PD-L1具有特异性的靶向以下基因组DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)对的DNA质粒电穿孔：CCAGTCACCTCTGAACATGaactgaCATGTCAGGCTGAGGGCT(SEQ ID NO:28)。在用PE结合的抗人类CD274单克隆抗体(纯系MIH1)染色之后通过流式细胞术鉴别全等位基因敲除细胞，并且接着进行FACS分选。在分选之后ZFN对PD-L1的基因编辑引起超过99％的PD-L1阴性NCI-H460细胞(图5)。
实例4：骨髓基质细胞抗原2(bst2)表达的减少
BST2为原发性肿瘤细胞和肿瘤细胞系上经由与浆细胞样树突状细胞上的ILT7(CD85g)的相互作用而抑制细胞因子产生(I型干扰素)的细胞表面标记物。
使用ZFN介导的基因编辑，实现NCI-H2009细胞系对BST2的表达的减少。将细胞系用编码对BST2具有特异性的靶向以下基因组DNA序列的ZFN对的DNA质粒电穿孔CCTAATGGCTTCCCTGGATgcagagAAGGCCCAAGGACAAAAG(SEQ ID NO:34)。在用BV421结合的抗人类BST2单克隆抗体(纯系HM1.24)染色之后通过流式细胞术鉴别全等位基因敲除细胞。ZFN对BST2的基因编辑引起NCI-H2009细胞对BST2的表达减少98.5％(图6)。随后可对经BST2-ZFN处理的NCI-H2009细胞的BST2阳性部分进行FACS分选至纯度。
实例5：肺癌细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少
TGFβ1和TGFβ2是肿瘤细胞分泌的高免疫抑制性分子以避开免疫监视。本实例描述产生TGFβ1和TGFβ2的分泌减少或不分泌的肺癌细胞系的程序和如何验证分泌的变化。
细胞系、培养和选择
肺癌细胞系NCI-H460(ATCC HTB-177)、DMS 53(ATCC CRL-2062)、NCI-H520(ATCCHTB-182)、A549(ATCC CCL-185)、NCI-H2023(ATCC CRL-5912)、NCI-H23(ATCC CRL-5800)和NCI-H1703(ATCC CRL-5889)是获自ATCC并且根据ATCC建议进行培养。LK-2(JCRB0829)是获自日本生物资源研究中心细胞库(Japanese Collection of Research Biosources CellBank，JCRB)并且根据JCRB建议进行培养。对于在慢病毒转导之后的哺乳动物细胞系选择，使用浓度在2至8μg/mL范围内的嘌呤霉素(puromycin)和杀稻瘟菌素(blasticidin)进行选择和维持。
shRNA介导的TGFβ1和TGFβ2的减弱
细胞系NCI-H460、DMS 53和NCI-H520、A549、NCI-H2023、NCI-H23、LK-2和NCI-H1703被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒表达对TGFβ1(shTGFβ1，成熟反义序列：TTTCCACCATTAGCACGCGGG(SEQ ID NO:25))和TGFβ2(shTGFβ2，成熟反义序列：AATCTGATATAGCTCAATCCG(SEQ ID NO:24))减弱具有特异性的短发夹核糖核酸(shRNA)。被对照shRNA(NS)转导的细胞或亲本未被修饰的细胞系充当对照。在进行抗生素选择以富集稳定表达shRNA的细胞之后，分析细胞的TGFβ1和TGFβ2分泌。
TGFβ1和TGFβ2的敲除
使用CRISPR-Cas9和ZFN方法完成TGFβ1和TGFβ2的敲除。对于CRISPR-Cas9敲除，将NCI-H460和NCI-H520细胞系用编码对TGFβ2具有特异性的靶向以下gDNA序列：GCTTGCTCAGGATCTGCCCG(SEQ ID NO:29)的Cas9和向导RNA或靶向序列GCACTACCAGAGCTAACTCA(SEQ ID NO:30)的对照向导RNA的质粒DNA电穿孔。通过ELISA，针对TGFβ1和TGFβ2的分泌，筛选全等位基因敲除纯系。对于ZFN介导的敲除，将NCI-H460细胞系用编码对TGFβ1具有特异性的靶向以下基因组DNA(gDNA)序列：CTCGCCAGCCCCCCGagccaGGGGGAGGTGCCGCCCGG(SEQ ID NO:31)和对TGFβ2具有特异性的靶向以下gDNA序列：AGCTCACCAGTCCCCCAGAagactaTCCTGAGCCCGAGGAAGTC(SEQ ID NO:32)的锌指核酸酶(ZFN)对的RNA电穿孔。通过对扩增单细胞进行基因组DNA测序来筛选全等位基因敲除纯系，并且接着分析TGFβ1和TGFβ2分泌。
TGFβ1和TGFβ2分泌分析
将TGFβ1和TGFβ2减弱或敲除的细胞和未被修饰或对照被修饰的亲本细胞以8.33×104个细胞/孔涂铺于24孔中，于常规生长培养基(含有10％FBS的RPMI)中涂铺。在涂铺二十四小时之后，将粘附细胞充分洗涤以去除FBS并且在RPMI+5％CTS中继续培养。在替换培养基四十八小时之后，收获细胞培养上清液，并且储存于-70℃下，直到根据制造商说明书(DB100B和DB250，R&D Systems)开始TGFβ1和TGFβ2分泌分析。TGFβ1和TGFβ2分泌含量表示为皮克/106个细胞/24小时。人类TGFβ1和TGFβ2的定量下限分别为15.4pg/mL(92.4皮克/106个细胞/24小时)和7.0pg/mL(42.0皮克/106个细胞/24小时)。当被修饰的细胞系分泌的TGFβ1或TGFβ2含量低于分析定量下限时，ELISA分析的定量下限用于估计TGFβ1或TGFβ2相对于未被修饰的亲本细胞系shRNA的减少百分比。在TGFβ1或TGFβ2分泌低于定量下限的状况下，定量下限用于确定完成分析的n下的统计显著性。
NCI-H460细胞中TGFβ1和TGFβ2分泌的减少
NCI-H460中TGFβ1的减弱使TGFβ1分泌减少62％。类似地，NCI-H460中TGFβ2的减弱使TGFβ2分泌减少84％。NCI-H460中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ1分泌减少57％和TGFβ2分泌减少>98％(表26)(图7A)。相较于来自用对照向导RNA处理的NCI-H460的纯系，在NCI-H460细胞中使用TGFβ2特异性向导RNA来源于Cas9介导的敲除的纯系显示纯系不分泌超过检测下限的TGFβ2(减少>99％)(3686±1478皮克/106个细胞/24小时)(图7B)。相较于来自用TGFβ2特异性ZFN对处理的NCI-H460的纯系，来源于用TGFβ1特异性ZFN对处理的NCI-H460的纯系不分泌超过分析检测下限的TGFβ1。相较于来自用TGFβ1特异性ZFN对处理的NCI-H460的纯系，来源于用TGFβ2特异性ZFN对处理的NCI-H460的纯系不分泌超过检测下限的TGFβ2。来源于用TGFβ1特异性ZFN对处理和用TGFβ2特异性ZFN对处理的NCI-H460的纯系不分泌超过检测下限的TGFβ1或TGFβ2(图7C)。
DMS 53细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
DMS 53中shRNA介导的TGFβ1的减弱使TGFβ1分泌减少66％。类似地，DMS 53中shRNA介导的TGFβ2的减弱使TGFβ2分泌减少53％。DMS 53中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ1分泌减少74％和TGFβ2分泌减少32％(表26)(图8A)。
NCI-H520细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
NCI-H520中TGFβ1的减弱无法评估，因为亲本细胞系缺乏可检测的TGFβ1分泌。NCI-H520中TGFβ2的减弱使TGFβ2分泌减少>99％。NCI-H520(ATCC HTB-182)中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ2分泌减少>99％(表26)(图8B)。
NCI-H2023细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
NCI-H2023中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ1分泌减少至低于定量下限(n＝8)，估计相较于未被修饰的亲本细胞系TGFβ1分泌减少>90％(933±125皮克/106个细胞/24小时)(n＝8)。相较于未被修饰的亲本细胞系，TGFβ1分泌显著减少(p<0.0002)。相较于未被修饰的亲本细胞系(341±32皮克/106个细胞/24小时)(n＝8)，NCI-H2023中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ2分泌减少65％(118±42皮克/106个细胞/24小时)(n＝8)。相较于未被修饰的亲本细胞系，TGFβ2(p＝0.0010)分泌显著减少(曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney UTest))(表25)(图9A)。
表25.shRNA介导肺癌细胞系中TGFβ1和TGFβ2分泌的减少
NCI-H23细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
相较于未被修饰的亲本细胞系(1,575±125皮克/106个细胞/24小时)(n＝8)，NCI-H23(ATCC CRL-5800)中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ1分泌减少59％(644±102皮克/106个细胞/24小时)(n＝8)。相较于未被修饰的亲本细胞系(506±42皮克/106个细胞/24小时)(n＝9)，NCI-H23(ATCC CRL-5800)中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ2分泌减少90％(48±9皮克/106个细胞/24小时)(n＝9)。相较于未被修饰的亲本细胞系，TGFβ1(p＝0.0011)和TGFβ2(p<0.0001)分泌显著减少(曼-惠特尼U检验)(表25)(图9B)。
A549细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
相较于未被修饰的亲本细胞系(5,796±339皮克/106个细胞/24小时)(n＝11)，A549中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ1分泌减少84％(914±54皮克/106个细胞/24小时)(n＝11)。相较于未被修饰的亲本细胞系(772±49皮克/106个细胞/24小时)(n＝11)，A549中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ2分泌减少95％(42±7皮克/106个细胞/24小时)(n＝11)。相较于未被修饰的亲本细胞系，TGFβ1(p＝0.0128)与TGFβ2(p＝0.0042)分泌显著减少(曼-惠特尼U检验)(表25)(图9C)。
LK-2细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
未被修饰的亲本(n＝9)与shRNA修饰的细胞系(n＝9)都未分泌超过ELISA分析定量下限的TGFβ1。相较于未被修饰的亲本细胞系(197±34皮克/106个细胞/24小时)(n＝10)，LK-2中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ2分泌减少61％(77±12皮克/106个细胞/24小时)(n＝10)。相较于未被修饰的亲本细胞系，TGFβ2(p＝0.0042)分泌显著减少(曼-惠特尼U检验)(表25)(图9D)。
NCI-H1703细胞中TGFβ1和TGFβ2的减弱
相较于未被修饰的亲本细胞系(1,736±177皮克/106个细胞/24小时)(n＝3)，NCI-H1703中TGFβ1与TGFβ2的组合减弱使TGFβ1分泌减少75％(429±133皮克/106个细胞/24小时)(n＝3)。未被修饰的亲本(n＝5)与shRNA修饰的细胞系(n＝5)都未分泌超过ELISA分析定量下限的TGFβ2(表25)(图9E)。
实例6：TGFβ1和/或TGFβ2的下调增强细胞免疫反应
将未被修饰的亲本、TGFβ1 KD、TGFβ2 KD或TGFβ1+β2 KD NCI-H460细胞用10μg/mLMMC处理2小时并且接着在添加健康供体PBMC之前24小时接种于6孔盘中。将PBMC与被MMC处理的NCI-H460在IL-2存在下共培养5-6天。在第5或6天，小心地从共培养物分离PBMC，计数，并且装载在预涂的IFNγELISpot培养盘(MabTech)上。接着将PBMC用被MMC处理的未被修饰的亲本NCI-H460细胞或包含已知I类MHC限制性存活素抗原决定基的11种肽的混合物刺激36-48小时。根据制造商说明书检测IFNγSFU，计数(CTL CRO Scanning Services)并且表示为SFU数目/106个PBMC。
相较于用未被修饰的亲本NCI-H460敏化(507±152SFU)，用TGFβ1 KD NCI-H460敏化的健康供体(HLA-A*01、HLA-A*02)来源的PBMC显著增加细胞免疫反应(1613±187SFU)(p<0.001)(图10A)。相较于未被修饰的亲本NCI-H460，TGFβ1与TGFβ2的减弱也显著增加IFNγ反应(1823±93SFU)(p<0.001)。相对于未被修饰的亲本细胞系(390±170SFU)，TGFβ2的减弱未增加IFNγ产生(p＝0.692)。在TGFβ1和TGFβ2减弱下免疫反应的增加可能归因于TGFβ1减弱的作用，因为单独TGFβ2减弱未增强免疫原性。相较于用未被修饰的亲本NCI-H460敏化(773±236SFU)，在来源于不同供体(HLA-A*01、HLA-A*11)的PBMC中，NCI-H460中TGFβ1的减弱显著增加细胞免疫反应(1883±144SFU)(p＝0.013)(图10B)。相对于用未被修饰的亲本NCI-H460细胞敏化，单独TGFβ2(1317±85SFU(p>0.999)和TGFβ1与TGFβ2(1630±62)(p＝0.249)的减弱也增加IFNγ反应，但未达到统计显著性。
存活素(BIRC5)是在多种癌症免疫疗法适应症中过度表达的特征明确的TAA。图10C展示相较于未被修饰的亲本NCI-H460细胞(28±44)，当供体PBMC用NCI-H460 TGFβ2 KD细胞敏化时(192±120SFU)，IFNγELISpot分析中对存活素的I类MHC限制性反应显著更稳固(p＝0.005)。用NCI-H460 TGFβ1 KD(30±64)(p＝0.999)或TGFβ1和TGFβ2 KD(30±38)(p＝0.999)敏化PBMC在两个独立实验中未展示存活素特异性IFNγ产生显著增加。
在混合淋巴细胞共培养反应中在从两个健康供体(HLA-A*24、HLA-A*30)(HLA-A*02、HLA-A*68)分离的PBMC中进一步表征TGFβ1 KD对此疫苗方法的免疫原性的作用(n＝3/供体)。在IL-2存在下，PBMC单独培养或与NCI-H520 TGFβ1无义对照或TGFβ1 KD细胞共培养10天。在没有肿瘤细胞的情况下培养的PBMC用作另外的对照。在第10天，通过ELISA，测量共培养上清液中的IFNγ分泌(图11A)。相较于单独PBMC(83±86pg/mL)，在与NCI-H520 TGFβ1KD细胞(272±259pg/mL)共培养的PBMC的上清液中IFNγ分泌显著增加(p＝0.046)。相较于单独PBMC，NCI-H520 TGFβ1无义KD的上清液中IFNγ分泌未显著增加(86±32pg/mL)(p＝0.512)。
在自体PBMC DC共培养分析中进一步评估TGFβ1减弱对NCI-H520的免疫原性的影响。将由分离自健康供体(HLA-A*24、HLA-A*30)的单核球分化的DC负载来自NCI-H520未修饰的亲本细胞、TGFβ1 KD、TGFβ2 KD或TGFβ1+β2 KD细胞的细胞溶解产物。将自体PBMC与负载溶解产物的DC在20U/mL IL-2存在下共培养5-6天。在第5或6天，小心地自共培养物分离PBMC，计数，并且以每孔1×105涂铺在预涂的IFNγELISpot培养盘(MabTech)上。接着将PBMC用被MMC处理的未被修饰的亲本NCI-H520细胞刺激36-48小时。结果指示通过IFNγELISpot分析，相较于未被修饰的亲本NCI-H520细胞(93±162SFU)，TGFβ1 KD倾向于增加对NCI-H520未修饰的亲本细胞的细胞免疫反应(357±181SFU)(p＝0.181)(图11B)。相较于与负载NCI-H520(ATCC HTB-182)未修饰的亲本溶解产物的DC共培养的自体PBMC，在与来自NCI-H520 TGFβ2 KD(13±23SFU)(p＝0.897)和TGFβ1和TGFβ2 KD(240±142SFU)(p＝0.603)的溶解产物共培养的自体PBMC中诱导的对未被修饰的亲本NCI-H520细胞的IFNγ反应未显著增加IFNγ反应尽管未达到统计显著性，通过自体PBMC与负载NCI-H520 TGFβ1 KD和TGFβ1和TGFβ2 KD的DC共培养所诱导的细胞免疫反应比NCI-H520 TGFβ2 KD和未被修饰的亲本溶解产物下的细胞免疫反应更稳固。
实例7：在细胞系中TGFβ的shRNA下调诱导比TGFβ敲除更强的免疫反应
活体外数据表明完全敲除TGFβ1和TGFβ2诱导针对肿瘤细胞的反应不如两个分子的shRNA减弱有效。代表性分析在图12中示出。在IFNγELISpot分析中分析之前，将正常供体PBMC与TGFβ1/TGFβ2 shRNA修饰或NCI-H460或TGFβ1/TGFβ2 ZFN敲除的NCI-H460共培养。数据显示shRNA修饰的细胞诱导的IFNγ分泌比ZFN敲除细胞显著更好(p＝0.0143，未配对t检验)。对于此实验，测试5个各个供体，shRNA修饰的细胞总共复制24次并且敲除细胞总共复制31次。
因为TGFβ1在调控上皮-间质转化中起关键作用，所以完全缺乏TGFβ1在肿瘤细胞中诱导免疫原性较小的表型(Miyazono,K等人,《医学前沿(Frontiers of Medicine)》.2018)。当相较于敲除，比较NCI-H460中TGFβ1 TGFβ2 shRNA减弱中重要免疫反应相关蛋白的表达的比率时，这是明显的(图13)。相较于敲除细胞，减弱细胞表达高含量的免疫原性蛋白和TAA。
总体来说，实例6和7中所呈现的数据证明在同种异体全细胞疫苗的情况下，TGFβ1和/或TGFβ2的减少可以增加对未被修饰的亲本肿瘤细胞和抗原的细胞免疫反应。此外，这些数据证明相较于TGFβ1和TGFβ2的敲除，shRNA介导的减弱诱导更稳固的免疫反应。
实例8.具有shRNA介导的下调的TGFβ1和/或TGFβ2分泌的细胞系的组合的免疫原
性
如实例2中所述，在进行修改下，通过IFNγELISpot测定TGFβ1和/或TGFβ2分泌减少的细胞系的示例组合的免疫原性。评估两种不同反应，第一种针对细胞系的组合，并且第二种针对已知的肿瘤相关、肿瘤特异性和癌症-睪丸抗原(统称为抗原)。为评估由细胞系的组合产生的免疫反应，DC以1.0:0.33DC:细胞系比率负载，以使得DC:总细胞系的比率为1:1。具体来说，将1.5×106DC与5.0×106细胞系1、5.0e5细胞系2和5.0e5细胞系3共培养。
为评估对抗原的反应，在IFNγELISpot分析中将在第6天自与mDC的共培养物分离的CD14-PBMC用抗原特异性肽池刺激24小时，接着检测IFNγSFU。抗原特异性反应表示为超过对照的SFU数目/106PBMC。如下自商业来源获得抗原肽池：Mage A1(JPT，PM-MAGEA1)、MageA3(JPT，PM-MAGEA3)、MageA4(JPT，PM-MAGEA4)、CEACAM(CEA)(JPT，PM-CEA)、MUC1(JPT，PM-MUC1)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、PRAME(Miltenyi Biotec，130-097-286)、WT1(JPT，PM-WT1)、TERT(JPT，PM-TERT)、STEAP(PM-STEAP1)和HER2(JPT，PM-ERB_ECD)。使用来源于HLA-A02(供体1-3)和HLA-A11(供体4)健康供体(n＝2-3/细胞系/供体)的细胞测定免疫反应。
通过IFNγELISpot测定三种TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系的六个示例组合的免疫原性(图14)。
示例疫苗细胞系组合1由NCI-2023、NCI-H23和LK-2 TGFβ1和TGFβ2修饰的细胞系构成。细胞系组合诱导5,499±1,016SFU的总IFNγ反应(n＝9/3供体)，由对NCI-2023的1,800±553SFU、对NCI-H23的2,069±393SFU和对LK-2的1,630±102SFU(图14A)组成(表26)。示例疫苗细胞系组合2由NCI-H23、DMS 53和NCI-H1703 TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系构成。此示例疫苗组合诱导3,604±1,491SFU的总IFNγ反应(n＝9/3供体)，由对NCI-H23的1,738±529SFU、对DMS 53的826±457SFU和对NCI-H1703的1,041±555SFU(图14B)组成(表26)。示例疫苗细胞系组合3由NCI-H2023、DMS 53和NCI-H1703 TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系构成。此示例细胞系组合诱导6,065±941SFU的总IFNγ反应(n＝9/3供体)，由对NCI-H2023的2,847±484SFU、对DMS 53的1,820±260SFU和对NCI-H1703的1,398±309SFU(图14C)组成(表26)。示例疫苗细胞系组合4由NCI-H23、DMS 53和LK-2TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系构成。此示例细胞系组合诱导9,612±5,293SFU的总IFNγ反应(n＝12/4供体)，由对NCI-H23的2,654±1,091SFU、对DMS 53的3,017±1,914SFU和对LK-2的3,942±2,474SFU组成。(图14D)(表26)。示例疫苗细胞系组合5由NCI-H2023、DMS 53和LK-2TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系构成。此示例细胞系组合诱导6,358±2,278SFU的总IFNγ反应(n＝9/3供体)，由对NCI-H2023的2,869±1,150SFU、对DMS 53的1,698±568SFU和对LK-2的1,791±637SFU(图14E)组成(表26)。示例疫苗细胞系组合6由NCI-H460、NCI-H520和A549 TGFβ1和TGFβ2修饰的细胞系组成。此示例细胞系组合诱导8,407±1,535SFU的总IFNγ(n＝12/4供体)，由对NCI-H460的2,320±666SFU、对NCI-H520的2,723±644SFU和对A549的3,005±487SFU(图14F)构成(表26)。
对于一些示例性细胞系组合，当PBMC与呈递来自三种疫苗细胞系组合的抗原的DC共培养时，相对于与呈递来自单一疫苗细胞系组分的抗原的DC共培养的PBMC，增强针对各个未被修饰的亲本细胞系的IFNγ反应(表26)。通过三种细胞系组合诱导的免疫反应比通过各个细胞系诱导的反应更稳固。
表26.针对示例组合中的细胞系或针对单一各个疫苗组分细胞系的IFNγ反应
针对示例疫苗组合4(NCI-H23、DMS 53和LK-2TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系)，测定对11种抗原的IFNγ反应。在3个HLA-A02健康供体(n＝3/供体)中评估针对抗原Mage A1、MageA3、MageA4、CEACAM(CEA)、MUC1、存活素、PRAME、WT1、TERT、STEAP和HER2的反应。相较于单一疫苗组分TGFβ1和/或TGFβ2修饰的细胞系，示例疫苗组合4以更大量值5,423±427SFU(图15A)和广度(图15B)诱导抗原特异性IFNγ反应；NCI-H23(4,1115±2,118SFU)、DMS 53(3,661±1,982SFU)和LK-2(2,772±2,936SFU)。对特异性抗原的反应呈图例中所指示的次序。图15B中详述由单一组分和组合细胞系疫苗诱导的针对各抗原的平均IFNγ反应。
实例9：HLA-E表达的减少改善细胞免疫反应
HLA-E属于HLAI类重链旁系同源物。HLA-E的人类肿瘤细胞表面表达可以经由结合于NK、DC和CD8 T细胞上的NKG2A受体而抑制这些免疫细胞子集的抗肿瘤功能。
RERF-LC-Ad1细胞系(JCRB1020)中HLA-E表达的减少
将人类腺癌细胞系RERF-LC-Ad1用对HLA-E具有特异性的靶向以下基因组DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)对电穿孔：TACTCCTCTCGGAGGCCCTGgcccttACCCAGACCTGGGCGGGT(SEQ IDNO:33)。在用PE结合的抗人类HLA-E(BioLegend，纯系3D12)染色之后通过流式细胞术鉴别全等位基因敲除细胞，并且接着进行FACS分选。在分选之后细胞扩增并且测定敲除百分比。自用PE结合的抗人类HLA-E(BioLegend，纯系3D12)染色的HLA-E KO或未被修饰的亲本细胞的MFI减去HLA-E KO或未被修饰的亲本细胞的未染色对照的MFI。在FACS分选之后ZFN对HLA-E的基因编辑引起超过99％的HLA-E阴性细胞(图16A)。敲除百分比表示为：(RERF-LC-Ad1 HLA-E KO MFI/亲本MFI)×100。
HLA-E表达的减少改善免疫反应
如实例8中所述，完成IFNγELISpot，但有一处修改。在此实验中，iDC负载仅一种细胞系，即RERF-LC-Ad1亲本或HLA-E KO细胞系。此处，1.5×106DC负载1.5×106RERF-LC-Ad1亲本或HLA-E KO细胞。当自体PBMC与负载HLA-E阴性细胞的DC共培养时(5085±1157SFU)，相对于负载未被修饰的亲本HLA-E阳性细胞的DC(2810±491SFU)，IFNγ反应高1.8倍。史都登氏检验，p＝0.012。n＝12，3个HLA-A不同供体(图16B)。
实例10：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)表达的减少增加细胞免疫反应
CTLA-4(CD152)充当免疫检查点并且在一些肿瘤细胞上组成性表达。CTLA-4结合于DC表面上的CD80或CD86可负面调控DC成熟并且抑制T细胞的增殖和效应功能。
人类鳞状细胞系中CTLA-4表达的减少
将NCI-H520细胞系用靶向CTLA-4的siRNA(Dharmacon，L-016267-00-0050)转染。将细胞于无抗生素培养基中以6×105接种于六孔盘的各孔中并且在5％CO2中在37℃下培育。根据DharmaFect siRNA转染方案，每孔使用4μL DharmaFECT 1转染剂(Dharmacon，T-20001-01)，将各孔用25nM最终浓度的CTLA-4siRNA转染。在siRNA转染之后72小时，通过流式细胞术测定活细胞上CTLA-4表达的减少，接着用于IFNγELISpot分析中。具体来说，将NCI-H520细胞用LIVE/DEADTM Aqua(Invitrogen，L34965)和人类α-CTLA4-APC(BioLegend，纯系L3D10)染色。相较于未被修饰的亲本NCI-H520(7.59％)，siRNA使CTLA-4的NCI-H520细胞表面表达(3.59％)减少2.1倍(图17A)。
NCI-H520(ATCC HTB-182)细胞系中CTLA-4表达的减少增加细胞免疫反应
在IFNγELISpot分析中，使用来源于HLA-A 02:01供体的细胞评估减少CTLA-4的细胞表面表达对细胞免疫反应的影响。在siRNA转染之后72小时开始ELISpot并且如实例9中所述进行。相较于未被修饰的亲本细胞系(1,730±210SFU)(n＝2)，NCI-H520中CTLA-4表达的减少引起IFNγ反应增加1.6倍(2,770±180SFU)(n＝2)(图17B)。
实例11：A549细胞系中CD276表达的减少增强细胞免疫反应
CD276(B7-H3)是B7和CD28家族的免疫检查点成员。人类实体癌中CD276的过度表达可诱导免疫抑制表型并且优先下调Th1介导的免疫反应。
使用CRISPR-Cas9系统，利用对TGCCCACCAGTGCCACCACT(SEQ ID NO:117)具有特异性的向导RNA(Synthego)完成A549中CD276表达的减少。初始异质群体含有71％其中CD276表达减少的A549细胞。将异质群体用BB700结合的α-人类CD276(BD Biosciences，纯系7-517)表面染色，并且通过细胞分选(BioRad S3e细胞分选仪)富集全等位基因敲除细胞。通过用PEα-人类CD276(BioLegend，纯系DCN.70)对分选富集的A540CD276 KO细胞和亲本A549细胞进行细胞外染色来证实CD276的减少。未染色和同型对照PEα-小鼠IgG1(BioLegend，纯系MOPC-21)染色的A549 CD276 KO细胞充当对照。Cas9介导的对CD276的基因编辑引起相较于对照，CD276减少>99％(图18A)。
在代表性实验中，iDC负载A549亲本细胞或A549 CD276 KO细胞并且与自体CD14-PBMC共培养6天，接着用负载来自野生型A549的细胞溶解产物的自体DC刺激。接着在ELISpot分析中，针对野生型A549细胞，分析细胞的IFNγ分泌。这些数据显示，CD276 KO细胞比野生型细胞刺激性更好(p＝0.017；未配对t检验)(图18B)。
实例12：CD47表达和TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少
在实例5中描述shRNA下调TGFβ1和TGFβ1和测定分泌的TGFβ1和TGFβ2的含量的方法。
利用shRNA下调TGFβ1和或TGFβ2使人类肺癌株中CD47表达减少
被修饰以减少TGFβ1和/或TGFβ2分泌的A549、NCI-H460、NCI-H2023、NCI-H23、NCI-H520、LK-2和NCI-H1703如实例2和此处所述的其它方法中所述进行修饰以减少CD47的表达。在ZFN介导的CD47敲除之后，将细胞系用FITC结合的α-CD47(BD Biosciences，纯系B6H12)进行表面染色，并且通过细胞分选(BioRad S3e细胞分选仪)富集全等位基因敲除细胞。使用纯度分选策略收集细胞以确保仅收集CD47阴性细胞。基于细胞数目将分选的细胞涂铺在适当尺寸的器皿中，生长并且扩增。在针对全等位基因敲除进行细胞富集之后，将TGFβ1和/或TGFβ2 KD CD47 KO细胞继代2-5次，并且通过流式细胞术测定CD47敲除百分比(BV421结合的人类αCD47，BD Biosciences，纯系B6H12)。自用BV421结合的人类α-CD47染色的被修饰或未被修饰的亲本细胞的MFI减去被修饰或未被修饰的亲本细胞的未染色对照的MFI。CD47敲除百分比表示为：(1-(TGFβ1/TGFβ2 KD CD47 KO MFI/亲本MFI))×100)。
ZFN对CD47的基因编辑引起细胞系中在FACS分选之后CD47阴性细胞超过99％(表27)，同时维持减少的TGFβ1和/或TGFβ2分泌(表28)。TGFβ1和/或TGFβ2下调并且CD47表达减少如下所示：图19中的NCI-H2023，图20中的NCI-H23，图21中的A549，图22中的NCI-H460，图23中的NCI-H1703，图24中的LK-2，图25中的DMS 53和图26中的NCI-H520。
表27.TGFβ1和/或TGFβ2 KD细胞系中的CD47KO
表28.TGFβ1和/或TGFβ2 KD细胞系CD47KO细胞系中的TGFβ1和TGFβ2分泌
实例13：CD276表达和TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少增加细胞免疫反应
将在实例5中通过shRNA减少TGFβ1和/或TGFβ2分泌的人类肿瘤细胞系NCI-H460、NCI-H520、DMS 53、A549、NCI-H2023、NCI-H23、LK-2和NCI-H1703用对CD276具有特异性的靶向以下基因组DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)对电穿孔：GGCAGCCCTGGCATGggtgtgCATGTGGGTGCAGCC(SEQ ID NO:26)。在TGFβ1和/或TGFβ2 KD株中ZFN介导的CD276敲除之后，将细胞系用BB700结合的α-人类CD276(BD Biosciences，纯系7-517)进行表面染色并且通过细胞分选(BioRad S3e细胞分选仪)富集全等位基因敲除细胞。使用纯度分选策略收集细胞以确保仅收集CD276阴性细胞。基于细胞数目将分选的细胞涂铺在适当尺寸的器皿中，生长并且扩增。在针对全等位基因敲除进行细胞富集之后，将TGFβ1和/或TGFβ2 KD CD276 KO细胞继代2-5次，并且通过流式细胞术测定CD276敲除百分比(BV421结合的人类α-CD276，BDBiosciences，纯系7-517)。自用BV421结合的人类α-CD276染色的被修饰或未被修饰的亲本细胞的MFI减去被修饰或未被修饰的亲本细胞的未染色对照的MFI。减少百分比表示为：(1-(TGFβ1/β2 KD CD276 KO MFI/亲本MFI))×100)。
ZFN对CD276的基因编辑引起细胞系中CD276阴性细胞超过99％(表29)，并且TGFβ1和/或TGFβ2分泌减少(表31)。TGFβ1和/或TGFβ2下调并且CD276表达减少如下所示：图27中的NCI-H2023，图28中的NCI-H23，图29中的A549，图30中的NCI-H460，图31中的NCI-H1703，图32中的LK-2，图33中的DMS 53和图34中的NCI-H520。
表29.TGFβ1和/或TGFβ2分泌减少的细胞系中CD276敲除
表30.TGFβ1和/或TGFβ2 KD CD276 KO细胞系中的TGFβ1和TGFβ2分泌
TGFβ1和TGFβ2 KD和CD276 KO增加细胞免疫反应
如实例9中所述进行IFNγELISpot。来源于HLA-A02和HLA-A03健康供体的细胞用于评估TGFβ1和TGFβ2分泌和CD276表达的减少是否可相较于未被修饰的亲本细胞系改善免疫反应。相对于未被修饰的亲本细胞系(250±63SFU)(n＝11)，在NCI-H460细胞系中，TGFβ1、TGFβ2和CD276的修饰使IFNγ反应增加2.3倍(569±87SFU)(n＝11)(p＝0.0078，曼-惠特尼U检验)(图35A)。相对于未被修饰的亲本细胞系(1,848±569SFU)(n＝11)，在A549细胞系中，TGFβ1、TGFβ2和CD276的修饰使IFNγ反应增加22.2倍(83±29SFU)(n＝11)(p＝0.0091，曼-惠特尼U检验)(图35B)。
实例14：CD276和CD47表达和TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少增加细胞免疫反应
使用shRNA，对A549细胞系进行修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌并且减少CD47和CD276的表达。实例5中描述用于分泌TGFβ1和TGFβ2和确定其含量的方法。实例12和实例13中分别描述用以减少CD47和CD276的表达和确定表达量的方法。如实例9中所述完成IFNγELISpot。
CD276和CD47的表达和TGFβ1和TGFβ2分泌减少的A549细胞的表征
相对于未被修饰的亲本细胞系(104,442MFI)，被修饰的细胞系(136MFI)上CD47表达减少99.9％(图36A)(表31)。相对于未被修饰的亲本细胞系(53,196MFI)，被修饰的细胞系(0MFI)上CD276表达减少100％(图36B)(表31)。相较于未被修饰的亲本细胞系(9093±175皮克/106个细胞/24小时)(n＝2)，被修饰的细胞系(2027±31皮克/106个细胞/24小时)(n＝2)使TGFβ1分泌减少78％(图36C)。被修饰的细胞系的TGFβ2分泌低于ELISA分析的定量下限(n＝2)，引起分泌含量相对于未被修饰的亲本细胞系(607±76皮克/106个细胞/24小时)(n＝2)减少100％(图36D)。
CD276和CD47表达和TGFβ1和TGFβ2分泌的减少增加细胞免疫反应
来源于HLA-A02(图37A)、HLA-A03(图37A)和HLA-A24(图37B)健康供体的细胞用于IFNγELISpot分析中以确定A549细胞系中TGFβ1和TGFβ2、CD276和CD47的修饰是否相对于未被修饰的亲本细胞系增强免疫反应。如实例9中所述完成IFNγELISpot。相对于未被修饰的亲本细胞系(2,233±493SFU)(n＝11)，被修饰的细胞系使IFNγ反应增加26.8倍(83±29SFU)(n＝11)(p＝0.0091，曼-惠特尼U检验)(图37A)。评估未被修饰的亲本、TGFβ1 TGFβ2KD CD47KO、TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO和TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 CD47KO A549修饰的细胞系针对10种抗原的反应。相对于由未被修饰的亲本细胞系(15,140SFU)(n＝3)诱导的总TAA反应，TGFβ1、TGFβ2和CD47的减少使总抗原特异性反应增加1.7倍(25,813SFU)(n＝3)，TGFβ1、TGFβ2和CD276的减少使总抗原特异性反应增加2.0倍(30,640SFU)(n＝3)，并且TGFβ1、TGFβ2、CD47和CD276的减少使总TAA反应增加2.0倍(29,993SFU)(n＝3)(图37B)。对特异性抗原的反应呈图例中所指示的次序。数据表明CD47和/或CD276的减少同时TGFβ1和TGFβ2分泌的减少可促进TAA特异性IFNγ产生增加。
表31.被修饰以分泌GM-CSF、表达膜结合的CD40L和分泌IL-12的TGFβ1和TGFβ2 KD细胞系中CD47或CD276的敲除
实例15：膜结合的CD154(膜结合的CD40配体)的表达增强细胞免疫反应
在发炎条件下CD40配体(CD40L)在T细胞和其它非免疫细胞上短暂表达并且结合于B细胞和专业抗原呈递细胞上的共刺激分子CD40。CD40L结合于CD40上调适应性细胞和体液免疫的多个方面。
A549细胞系中膜结合的CD40L的表达
将细胞系A549细胞系用慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒表达被修饰以减少ADAM17裂解并且由此促进膜结合的CD40L表达的CD40L序列。亲本未被修饰的细胞系充当对照。在以200μg/mL进行抗生素选择以富集稳定表达CD40L的细胞之后，使用流式细胞术，针对细胞表面上的CD40L表达，分析细胞，并且通过ELISA来检测溶解CD40L。在此实例中使用的膜结合的CD40L的序列在SEQ ID NO:1中示出。
为测定膜结合的CD40L的表达量，将未被修饰的亲本和被修饰的细胞用PE结合的人类α-CD40L(BD Biosciences，纯系TRAP1)染色。相较于未被修饰的亲本A549细胞系(1702MFI)，细胞表面上CD40L的表达增加25.5倍(43,466MFI)(图38A)。
通过ELISA定量溶解CD40L。经CD40L转导和未被修饰的亲本细胞以8.33×104个细胞/孔涂铺于24孔中，于常规生长培养基(含有10％FBS的RPMI)中涂铺。在涂铺二十四小时之后，将粘附细胞充分洗涤以去除FBS并且在RPMI+5％CTS中继续培养。在替换培养基四十八小时之后，收获细胞培养上清液，并且储存于-70℃下，直到根据制造商说明书(BioLegend，DCDL40)完成分析。人类CD40L的定量下限为62.5pg/mL或0.375纳克/106个细胞/24小时。CD40L的过度表达引起2.93纳克/106个细胞/24小时的sCD40L(图38B)。
A549 CD40L表达对DC成熟的作用通过流式细胞术来表征。iDC和A549未修饰的亲本细胞、具有外源性sCD40L(1μg/mL)(PeproTech，#AF31002100UG)的未被修饰的亲本细胞或过度表达膜结合的CD40L的A549细胞以1:1比率在96孔低粘附U形底盘中共培养。在培育24小时之后，将共培养物用LIVE/DEAD Aqua(Molecular Probes，#L23105)、αCD45-PE-Cy7(BD Biosciences，纯系HI30)和αCD11c-BV605(BD Biosciences，纯系B-ly6)和αCD83-APC(BD Biosciences，纯系HB15e)进行表面染色。使用FlowJo(FlowJo有限责任公司)分析流式细胞术数据。DC成熟增加定义为活CD45+CD11c+CD83+DC％增加。针对7个HLA不同健康供体评估DC成熟。
相对于未被修饰的亲本细胞系(10±3)，CD40L的A549表达使活CD45+CD11c+CD83+DC％显著增加3.9倍(40±5)(p<0.001，霍尔姆-斯达克多重比较检验(Holm-Sidak'smultiple comparisons test))(n＝7)。外源性sCD40L未显著增加活CD45+CD11c+CD83+DC％(16±3)(p＝0.4402，霍尔姆-斯达克多重比较检验)(n＝7)(图38C)。
膜结合的CD40L的表达增强细胞免疫反应
如实例9中所述，通过IFNγELISpot分析评估CD40L的过度表达对细胞免疫反应的诱导的作用。负载的iDC负载A549细胞、具有1μg/mL外源性sCD40L的A549细胞或过度表达CD40L的A549细胞。相较于未被修饰的亲本细胞系(15±15SFU)，A549细胞对CD40L的表达使IFNγ反应增加87倍(1,305±438SFU)(p＝0.0198，霍尔姆-斯达克多重比较检验)(n＝4)。相对于未被修饰的亲本细胞系(p＝0.5303，霍尔姆-斯达克多重比较检验)(n＝4)，共培养物中包括外源性sCD40L不显著增加IFNγ反应(255±103SFU)。由A549细胞上CD40L的过度表达引发的IFNγ反应显著超过在添加外源性sCD40L下所检测的反应(p＝0.0375，霍尔姆-斯达克多重比较检验)(n＝4)(图38D)。
实例16：GM-CSF的表达增强细胞免疫反应
将未被修饰的亲本NCI-H460细胞用空慢病毒载体(对照)或被设计成过度表达GM-CSF(SEQ ID NO:6)的慢病毒载体转染。对照和过度表达GM-CSF的细胞系在嘌呤霉素(2μg/mL)存在下生长，接着用于IFNγELISpot分析中。如实例6中所述进行IFNγELISpot。图39展示当相较于用对照NCI-H460细胞敏化时(1163±183SFU)(p＝0.002)，用过度表达GM-CSF的NCI-H460细胞敏化健康供体(HLA-A*01、HLA-A*02)来源的PBMC显著增加对未被修饰的亲本NCI-H460细胞的细胞免疫反应(2600±207SFU)。
实例17：介白素-12(IL-12)的表达增强细胞免疫反应
IL-12为一种促发炎细胞因子，其促进DC和LC来引发T细胞趋向效应表型。IL-12也可以直接作用于DC以逆转或防止免疫耐受性的诱导。
将A549细胞用慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒表达IL-12的p40和p35链两者以形成功能性IL-12p70细胞因子蛋白。p40和p35序列由P2A裂解序列分隔开。在此实例中使用的IL-12的序列在SEQ ID NO:9中示出。未被修饰的亲本、未被修饰的细胞系充当对照。在以600μg/mL吉欧霉素(zeocin)进行抗生素选择以富集稳定表达IL-12的细胞之后，如实例9中所述测定由亲本和IL-12修饰的细胞系产生的免疫反应。相较于由未被修饰的亲本细胞诱导的IFNγ反应(53±53SFU)(p＝0.0163，曼-惠特尼U检验)(n＝3)，在IL-12表达下IFNγSFU增加16倍(873±199SFU)(n＝3)(图40)。
实例18：糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)的表达增强细胞免疫反应
GITR为与抑制T-调控细胞(Treg)的遏制活性有关并且延长T-效应细胞的存活的表面受体分子。GITR结合于APC上的其配体GITR触发协同刺激CD8+与CD4+效应T细胞的信号传导，引起T细胞扩增和效应功能增强，同时遏制Treg的活性。
GITR的表达
基于GITR的天然的膜结合变异体(NP_004186)，产生密码子优化序列，并且克隆至pVAX1(Invitrogen，#V26020)(GenScript)的BamHI和XhoI限制性核酸内切酶中。在此实例中使用的GITR的序列在SEQ ID NO:4中示出。对于使用编码GITR的pVAX1转染细胞，在转染之前18-24小时使用45mL完全培养基将A549(5.38×106个细胞)、NCI-H460(1.79×107个细胞)、LK-2(2.39×107个细胞)或NCI-H520(1.02×107个细胞)涂铺至T175烧瓶中并且维持在37℃/5％CO2下。根据制造商说明书，使用脂染胺转染剂(Invitrogen，#2075084)进行质粒DNA转染。将细胞在37℃和5％CO2下培育72小时，接着通过流式细胞术评估GITR表达。
为测定GITR的细胞表面表达，将被转染的细胞和未被修饰的亲本对照用BV421结合的小鼠抗人类GITR抗体(BD Biosciences，纯系V27-580)进行表面染色。于BDLSRFortessa上获取流式细胞术数据并且使用FlowJo软件分析。在未被转染的未被修饰的亲本细胞系上检测到GITR的最低表达(各细胞系n＝3)(图41)。GITR在17.7±0.1％的经转染NCI-H520细胞(n＝3)(图41A)、29.3±3.3％的被转染LK-2细胞(n＝3)(图41B)、7.7±0.2％的被转染A549细胞(n＝3)(图41C)和14.1±0.9％的被转染NCI-H460细胞(n＝3)(图41D)上表达。
GITR的表达增强细胞免疫反应
使用来源于两个HLA-A02供体和一个HLA-A24健康供体的细胞(n＝3/供体)，如实例9中所述，通过IFNγELISpot评估GITR的表达对细胞免疫原性的作用。相较于未被修饰的亲本A549细胞系(128±38SFU)(n＝9)，A549细胞系对GITR的表达使IFNγ产生显著增加7.4倍(947±217SFU)(n＝9)(p＝0.0003，曼-惠特尼U检验)(图42A)。相较于未被修饰的亲本细胞系(773±255SFU)(n＝9)，在LK-2细胞系(1,053±449SFU)(n＝9)中GITR表达下IFNγ产生存在增加的倾向(图42B)。相较于未被修饰的亲本未被修饰的细胞系(1,953±385SFU)(n＝3)，在NCI-H520细胞系(2,953±504SFU)(n＝3)中GITR表达下免疫原性存在增加的倾向(图42C)。相较于未被修饰的亲本细胞(3,400±181SFU)(n＝3)，在NCI-H460(4,940±557SFU)细胞系中GITR表达下免疫原性存在增加的倾向(图42D)。
实例19：介白素-15(IL-15)的表达增强细胞免疫反应
IL-15为细胞因子的四α-螺旋束家族的成员，并且通过包括DC的多种细胞产生并且对CD8+记忆T细胞的分化来说是至关重要的。IL-15的两种同功型天然表达，其编码两种不同N端信号肽。这些信号肽用以减少或抑制IL-15蛋白自肿瘤细胞的分泌。产生IL-15的密码子优化序列，其中天然IL-15长信号肽区被IL-2信号肽替换以促进IL-15蛋白(GenScript)的分泌。将密码子优化序列克隆至pVAX1的BamHI和XhoI限制位点中。在此实例中使用的IL-15的序列在SEQ ID NO:11中示出。
IL-15分泌的定量
如实例18中所述，完成编码IL-15的质粒的转染。通过ELISA，使用人类IL-15Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，D1500)并且根据制造商说明书来分析上清液中分泌的IL-15的存在。IL-15ELISA的定量下限为3.98pg/mL或0.0239纳克/106个细胞/24小时。NCI-H520、LK-2、NCI-H460和A549细胞系分别表达9.04、5.99、59.43和34.74纳克/106个细胞/24小时的IL-15(图43A)。
IL-15增强细胞免疫反应
如实例9中所述，完成IFNγELISpot以评估IL-15对细胞免疫反应的作用。使用来源于HLA-A02健康供体(n＝3)的免疫细胞评估NCI-H460细胞系的IL-15分泌对细胞免疫反应的作用。相对于未被修饰的亲本NCI-H460细胞系(4,360±806SFU)，IL-15过度表达下IFNγ产生存在增加的倾向(5,593±474SFU)(图43B)。
实例20：介白素-23(IL-23)的表达增强细胞免疫反应
IL-23是四螺旋束细胞因子(p19)与可溶性I类细胞因子受体p40的二元复合物。IL-23充当增强DC成熟和遏制原始T细胞来源Treg的DC活化的促发炎细胞因子。
IL-23的表达
产生人类密码子优化IL-23p19和p40序列并且克隆至pVAX1(GenScript)的BamHI和XhoI限制位点中。p19和p40序列由柔性连接子GS3连接子分隔开。在此实例中使用的IL-23的序列在SEQ ID NO:13中示出。如实例18中所述完成转染。
根据制造商说明书使用人类IL-23Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，D2300B)来分析上清液中功能性(p19和p40二聚体)分泌的IL-23的存在。IL-23ELISA的定量下限为39.1pg/mL或0.235纳克/106个细胞/24小时。LK-2和A549细胞系分别表达1,559和1,929纳克/106个细胞/24小时的IL-23(图44A)。
IL-23的分泌增加细胞免疫反应
如实例9中所述，完成IFNγELISpot以评估IL-23对细胞免疫反应的作用。使用来源于HLA-A02健康供体的免疫细胞评估A549(ATCC CCL-185)细胞系的IL-15分泌对细胞免疫反应的作用。相对于未被修饰的亲本A549(ATCC CCL-185)细胞系(573±401SFU)(图44B)，IL-23过度表达下IFNγ产生显著增加3.9倍(2,247±580SFU)(p＝0.0284，史都登氏t检验)(n＝3)。
实例21：X-C模体趋化因子配体1(XCL1)的表达
细胞因子XCL1也称为淋巴细胞趋化因子，结合于在抗原交叉呈递DC上选择性表达的趋化因子受体XCR1。XCL1的表达具有充当佐剂用于皮内疫苗施用的潜能。
XCL1的表达
产生编码人类XCL1的人类密码子优化序列(GenScript)并且克隆至pVAX1质粒的BamHI和XhoI限制位点中。通过ELISA表征XCL1的短暂表达和分泌。在此实例中使用的XCL1的序列在SEQ ID NO:15中示出。
XCL1分泌的定量
如实例18中所述，将NCI-H460和A549细胞用编码密码子优化XCL1的pVAX1转染。在转染二十四小时之后，从细胞去除上清液并且通过ELISA分析分泌的XCL1的存在。根据制造商说明书(R&D Systems，#DXCL10)分析上清液的XCL1分泌。NCI-H460和A549细胞系分别短暂表达418和144和纳克/106个细胞/24小时的XCL1(图45)。
实例22：间皮素(MSLN)的表达
MSLN在许多肺腺癌的表面上表达并且表达与不良预后相关。MSLN为一种具有吸引力的靶向的TAA，因为对MSLN的抗原特异性免疫反应可预测患有由若干不同原发性肿瘤，包括卵巢、肺和黑色素瘤引起的脑癌转移的患者的存活。尽管MSLN在许多患者肿瘤中表达，但肺癌细胞系仅一小部分子集表达MSLN。在实例22中，在不天然表达MSLN的示例性疫苗细胞系中基因上引入MSLN的表达，以拓宽对NSCLC患者可能重要的TAA的覆盖范围。
MSLN的表达
产生密码子优化人类MSLN序列，其中ADAM17裂解位点被柔性连接子替换以促进MSLN保留在细胞膜中(GenScript)。将密码子优化序列克隆至pVAX1的BamHI和XhoI限制位点中。在此实例中使用的MSLN的序列为SEQ ID NO:17。
MSLN表达的定量
如实例18中所述，完成编码MSLN的质粒的转染。为测定MSLN的细胞表面表达，将被转染的细胞和未被修饰的亲本对照用PE结合的大鼠抗人类MSLN抗体(R&D Systems，FAB32652P)进行表面染色。于BD LSRFortessa上获取流式细胞术数据并且使用FlowJo软件分析。在未被转染的未被修饰的亲本细胞系上检测到MSLN的最低表达(各细胞系n＝3)(图46)。MSLN在34.7±2.2％的被转染NCI-H520细胞(n＝3)(图46A)、41.4±0.7％的被转染LK-2细胞(n＝3)(图46B)、34.6±0.7％的被转染A549细胞(n＝3)(图46C)和48.5±1.3％的经转染NCI-H460细胞(n＝3)(图46D)上表达。
MSLN特异性IFNγ反应
通过IFNγELISpot表征对过度表达的MSLN抗原的免疫反应。为在此分析中检测MSLN特异性反应，产生长15个氨基酸的11个氨基酸重叠的肽以覆盖天然蛋白质MSLN蛋白并且如实例8中所述用于刺激PBMC。IFNγ对LK-2中过度表达的MSLN蛋白作出反应(240SFU)(图46E)。
实例23：北九州(Kita-Kyushu)肺癌抗原1(CT83)的表达
CT83由40％非小细胞肺癌组织和31％1期NSCLC表达。相较于正常组织，CT83在肺肿瘤中高度表达。CT83的表达还通常与不良预后相关。在实例23中，在不天然表达CT83的示例性疫苗细胞系中基因上引入CT83的表达，以拓宽对一些NSCLC患者可能相关的TAA的覆盖范围。
CT83的表达
产生人类CT83的密码子优化序列并且与密码子优化MSLN同框克隆(实例17)。使用SEQ ID NO:21。MSLN和CT83编码序列由P2A裂解位点分隔开并且克隆至pVAX1的BamHI和XhoI限制位点中。
CT83表达的表征
通过蛋白质印迹法确定pVAX1-MSLN-CT83对CT83的表达。如实例18中所述完成转染。通过添加100μL 1x
LDS样品缓冲液(Invitrogen，#NP0007)使经转染细胞溶解并且在室温下培育5分钟。将细胞溶解产物转移至埃彭道夫管(Eppendorf tube)并且声波处理5分钟以减少粘度。将样品在70℃下加热10分钟并且接着装载至4-12％
Bis-Tris凝胶上。BLUelf预染色蛋白质梯度(FroggaBio，PM008-0500)作为蛋白质大小确定标准而包括。使用1x MES SDS操作缓冲液(Invitrogen，NP0002)，将凝胶在还原条件下在200伏下电泳约1小时。接着在还原条件下使用
转移缓冲液(Invitrogen，NP0006)加20％甲醇将蛋白质转移至硝化纤维。在30伏下进行印迹法1小时。在印迹法之后，在室温下在震荡(100rpm)下将膜用5％Blotto(ChemCruz，DC2324)在Tris缓冲生理食盐水加Tween(TBST：10mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、0.1％Tween 20)中阻断1小时。接着在4℃下用TBST-5％Blotto中4μg/mL的初级抗体抗CT83兔多克隆(Sigma，HPA004773)探测印迹。次日，将印迹用TBST洗涤5次并且接着在室温下在震荡下用TBST-5％Blotto中1:5,000稀释的抗兔IgG HRP结合抗体(Southern Biotech，4030-05)探测1小时。将印迹用TBST洗涤5次并且通过添加1步UltraTMB印迹溶液(Pierce，#37574)来显影(图47)。
实例24：免疫抑制因子表达减少的A549和NCI-H460中免疫刺激因子的表达
VME中免疫抑制抑制因子的减少可以增强细胞免疫反应。在免疫抑制因子的产生减少的情况下，VME中免疫刺激因子的表达应进一步增强疫苗引发稳固免疫反应的能力。
在此实例中，三种免疫抑制因子的表达减少的A549和NCI-H460组分疫苗细胞系被修饰以分泌GM-CSF，表达膜结合的CD40L，和/或分泌功能性异二聚体IL-12 p70细胞因子。实例16中描述GM-CSF在活体外增加IFNγ反应的能力。皮肤中GM-CSF的活体内表达增强DC活化、成熟和DC促进具更强功能性的偏向Th1的免疫反应的能力。实例15和实例17中分别描述膜结合的CD40L和IL-12 p70在单独表达时的免疫刺激功能。实例5中描述用于shRNA介导的减弱TGFβ1和TGFβ2分泌和测定所得到的分泌含量的方法。实例12和实例13中分别描述用于ZFN介导的CD47和CD276敲除和测定所得到的细胞表面表达量的方法。
在一些实例中，具有三种减少的免疫抑制因子的组分疫苗细胞系被修饰以分泌GM-CSF和表达膜结合的CD40L。在一些实例中，具有三种减少的免疫抑制因子的组分疫苗细胞系被修饰以分泌GM-CSF，表达膜结合的CD40L，和分泌功能性IL-12 p70细胞因子。本文中描述用于定量膜结合的CD40L的表达的方法。
A549和NCI-H460的GM-CSF分泌
疫苗组分细胞系A549和NCI-H460被表达天然人类GM-CSF的慢病毒颗粒转导。未被修饰的亲本、未被修饰的细胞系充当对照。在以100μg/mL进行抗生素选择以富集稳定表达GM-CSF的细胞之后，通过ELISA分析细胞的GM-CSF分泌。在此实例中使用的GM-CSF的序列在SEQ ID NO:6中示出。
分泌的GM-CSF的定量
被GM-CSF转导和未被修饰的亲本细胞以8.33×104个细胞/孔涂铺于24孔中，于常规生长培养基(含有10％FBS的RPMI)中涂铺。在涂铺二十四小时之后，将粘附细胞充分洗涤以去除FBS并且在RPMI+5％CTS中继续培养。在替换培养基四十八小时之后，收获细胞培养上清液，并且储存于-70℃下，直到根据制造商说明书(人类GM-CSF Quantikine ELISA试剂盒#DGM00，R&D Systems)完成GM-CSF分泌分析。ELISA分析中人类GM-CSF的定量下限小于3.0pg/mL或0.018纳克/106个细胞/24小时。未被修饰的亲本细胞系的GM-CSF分泌低于ELISA分析的定量下限。
分泌的IL-12 p70的定量
被IL-12转导和未被修饰的亲本细胞以8.33×104个细胞/孔涂铺于24孔中，于常规生长培养基(含有10％FBS的RPMI)中涂铺。在涂铺二十四小时之后，将粘附细胞充分洗涤以去除FBS并且在RPMI+5％CTS中继续培养。在替换培养基四十八小时之后，收获细胞培养上清液，并且储存于-70℃下，直到根据制造商说明书(BioLegend，人类IL-12 p40 LEGENDMAX ELISA试剂盒#430707和人类IL-12 p70 LEGEND MAX ELISA试剂盒#431707)完成p40和p70的IL-12分泌分析。人类IL-12 p40的定量下限为9.5pg/mL或0.057纳克/106个细胞/24小时。人类IL-12 p70的定量下限为1.2pg/mL或0.007纳克/106个细胞/24小时。未被修饰的亲本细胞系的IL-12分泌低于ELISA分析的定量下限。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549和NCI-H460细胞系的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L的表达
A549细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少86％(n＝2)(图48A)(表32)，和TGFβ2减少>89％(n＝2)(图48B)(表32)，使得CD47的表达减少99.9％(图48C)(表33)，分泌2,656±69纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图48D)(表34)，并且膜结合的CD40L表达增加38倍(图48E)(表34)。NCI-H460细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少>95％(n＝2)(图49A)(表32)，和TGFβ2减少93％(n＝2)(图49B)(表32)，使得CD47的表达减少99.9％(图49C)(表33)，分泌940±19纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图49D)(表35)，并且膜结合的CD40L表达增加5倍(图49E)(表34)。
表32.分泌GM-CSF和表达膜结合的CD40L的CD47 KO细胞系中的TGFβ1和TGFβ2分泌
表33.分泌GM-CSF和表达膜结合的CD40L的TGFβ1和TGFβ2 KD细胞系中的CD47 KO或CD276 KO
表34.TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO和TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L的表达
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549和NCI-H460细胞系的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L的表达
A549细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少>98％(n＝2)(图50A)(表35)，和TGFβ2减少>89％(n＝2)(图50B)(表35)，使得CD276的表达减少93.5％(图50C)(表33)，分泌1,704±60纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图50D)(表34)，并且膜结合的CD40L表达增加40倍(图50E)(表34)。NCI-H460细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少93％(n＝2)(图51A)(表32)，和TGFβ2减少89％(n＝2)(图51B)(表32)，使得CD276的表达减少99.1％(图51C)(表33)，分泌943±13纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图51D)(表34)，并且膜结合的CD40L表达增加7倍(图51D)(表34)。
表35.分泌GM-CSF和表达膜结合的CD40L的CD276 KO细胞系中的TGFβ1和TGFβ2分泌
TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO和TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549细胞系的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L表达增加细胞免疫反应
使用IFNγELISpot评估A549细胞系中TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L的表达和TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L表达对细胞免疫反应的作用。如实例9中所述，使用来源于两个HLA-A02健康供体(n＝3/供体)的细胞完成IFNγELISpot。相较于未被修饰的亲本A549细胞系(1,793±215SFU)(n＝6)，TGFβ1TGFβ2 KD CD47 KO(3,213±287)(n＝6)(p＝0.0357)和TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO(3,207±663)(n＝6)(p＝0.0143)的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L表达使IFNγ反应显著增加(图52A)。使用单向ANOVA和霍尔姆-斯达克多重比较检验确定统计显著性。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549和NCI-H460细胞系的GM-CSF分泌和膜结合的CD40L的表达增加DC成熟
如实例15中所述，通过流式细胞术测定iDC的成熟。在此实例中，将来源于三个HLA-A02供体的iDC与未被修饰的亲本A549或未被修饰的亲本NCI-H460细胞系或者分泌GM-CSF并且表达膜结合的CD40L的被修饰的A549或NCI-H460 TGFβ1和TGFβ2 KD CD276 KO共培养。相较于与未被修饰的亲本A549细胞系共培养的DC(53±3％)，在与被修饰的A549共培养的DC上DC成熟标记物CD83的表达显著增加(71±2％)(p＝0.0015)(图52B)。类似地，相较于与未被修饰的亲本H460(ATCC HTB-177)细胞系共培养的DC(52±3％)，在与被修饰的NCI-H460共培养的DC上CD83显著增加(71±5％)(p＝0.0126)(图52C)。使用单向ANOVA和霍尔姆-斯达克多重比较检验确定统计显著性。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549和NCI-H460疫苗组分细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12分泌
A549细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少84％(n＝2)(图53A)(表36)，和TGFβ2减少>89％(n＝2)(图53B)(表36)，使得CD47的表达减少99.9％(图53C)(表33)，分泌2,295±60纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图53D)(表37)，膜结合的CD40L表达增加56倍(图53E)(表37)，和分泌300±24纳克/106个细胞/24小时的IL-12p70(图53F)(表37)。
表36.分泌GM-CSF、表达膜结合的CD40L和分泌IL-12的TGFβ1和TGFβKD、CD47KO细胞系中的TGFβ1和TGFβ2分泌
表37.TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO 和TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12分泌
NCI-H460细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少>95％(n＝2)(图54A)(表36)，和TGFβ2减少86％(n＝2)(图54B)(表36)，使得CD47的表达减少>99.9％(图54C)(表33)，分泌1,586±24纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图54C)(表37)，膜结合的CD40L表达增加9倍(图54E)(表36)，和分泌434±15纳克/106个细胞/24小时的IL-12p70(图54F)(表36)。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549(ATCC CCL-185)和NCI-H460(ATCC HTB-177)细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L表达和IL-12分泌增加TAA特异性IFNγ反应
使用IFNγELISpot评估TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO A549和TGFβ1 TGFβ2 KD CD47KO NCI-H460细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12分泌对针对抗原的IFNγ反应的作用。如实例9中所述，使用来源于两个HLA-A02健康供体(n＝3/供体)的细胞完成IFNγELISpot。相较于未被修饰的亲本细胞系(382±96SFU)(n＝6)，A549 TGFβ1 TGFβ2 KDCD47 KO细胞(1,586±887SFU)(n＝6)使针对TAA MAGE A3、存活素、PRAME、Muc1、STEAP1、Her2和TERT的总IFNγ反应增加(p＝0.5887)(图55A)。类似地，相对于未被修饰的亲本细胞系(262±105SFU)(n＝6)，由NCI-H460 TGFβ1 TGFβ2 KD CD47 KO细胞系(1702±682SFU)(n＝6)引发的总抗原特异性IFNγ反应增加(p＝0.1385)(图55B)。对特异性抗原的反应呈图例中所指示的次序。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549和NCI-H460疫苗组分细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12分泌
A549细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少96％(n＝2)(图56A)(表38)，和TGFβ2减少>89％(n＝2)(图56B)(表38)，使得CD276的表达减少98.9％(图56C)(表33)，分泌1,113±51纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图56D)(表37)，膜结合的CD40L表达增加36倍(图56E)(表37)，和分泌263±24纳克/106个细胞/24小时的IL-12p70(图56F)(表37)。
NCI-H460细胞系被修饰使得TGFβ1分泌减少>95％(n＝2)(图57A)(表38)，和TGFβ2减少78％(n＝2)(图57B)(表38)，使得CD276的表达减少98.2％(图57C)(表33)，分泌1,234±24纳克/106个细胞/24小时的GM-CSF(图57D)(表37)，膜结合的CD40L表达增加16倍(图57E)(表37)，和分泌312±50纳克/106个细胞/24小时的IL-12p70(图57F)(表37)。
表38.CD276表达减少的被修饰以表达CD40L、GM-CSF和IL-12p70的细胞系内的TGFβ1和TGFβ2分泌
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549和NCI-H460细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12分泌增加DC成熟
如实例15中所述，通过流式细胞术测定组分疫苗细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12的分泌对DC成熟的作用。具体来说，将来源于三个HLA-A02供体的iDC与未被修饰的亲本A549(ATCC CCL-185)或NCI-H460(ATCC HTB-177)细胞系或者分泌GM-CSF、表达膜结合的CD40L和分泌IL-12的被修饰的TGFβ1和TGFβ2 KD CD276 KO A549(ATCCCCL-185)或NCI-H460(ATCC HTB-177)共培养。相较于与未被修饰的亲本A549(ATCC CCL-185)细胞系共培养的DC(53±3％)，在与被修饰的A549(ATCC CCL-185)细胞系共培养的DC上DC成熟标记物CD83的表达显著增加(71±3％)(p＝0.0014)(图58A)。类似地，相较于与未被修饰的亲本H460(ATCC HTB-177)细胞系共培养的DC(52±3％)，在与被修饰的NCI-H460(69±4％)细胞系共培养的DC上CD83显著增加(p＝0.0077)(图58B)。使用单向ANOVA和霍尔姆-斯达克多重比较检验确定统计显著性。
TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549(ATCC CCL-185)和NCI-H460(ATCC HTB-177)细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L表达和IL-12分泌增加TAA特异性IFNγ反应
使用IFNγELISpot评估TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO A549和TGFβ1 TGFβ2 KDCD276 KO NCI-H460细胞系的GM-CSF分泌、膜结合的CD40L的表达和IL-12分泌对针对抗原的IFNγ反应的作用。如实例9中所述，使用来源于两个HLA-A02健康供体(n＝3/供体)的细胞完成IFNγELISpot。相较于未被修饰的亲本细胞系(421±149SFU)(n＝6)，A549TGFβ1TGFβ2 KD CD47 KO细胞(1,408±738SFU)(n＝6)使针对抗原MAGE A3、存活素、PRAME、Muc1、STEAP1、Her2和TERT的总IFNγ反应显著增加(p＝0.1385)(图58C)。类似地，相对于未被修饰的亲本细胞系(262±105SFU)(n＝6)，由NCI-H460TGFβ1 TGFβ2 KD CD276 KO细胞系(1725±735SFU)(n＝6)引发的总抗原特异性IFNγ反应增加(p＝0.1385)(图58D)。对特异性抗原的反应呈图例中所指示的次序。
实例25：HLA错配引起免疫原性增加
免疫细胞通过产生免疫反应而对“非自身”蛋白质起反应。在HLA错配的情况下，免疫反应是针对不在受试者细胞上表达的HLA蛋白质并且此反应可以通过干扰素γ的产生来测量。干扰素γ是与Th1 T细胞反应的产生有关的关键细胞因子并且Th1 T细胞是抗癌反应的必需介体。不同于干细胞或器官移植中，通过充当增强T细胞对在肿瘤疫苗内表达的TAA的引发作用的佐剂，HLA错配免疫反应在增加全细胞肿瘤疫苗的免疫原性中发挥高度有益的作用。
根据本公开的各种实施例，包含最终疫苗产物的细胞系混合物以包括疫苗与患者之间的在两个最具免疫原性HLA基因座HLA-A和HLA-B处的HLA错配的设计在疫苗部位产生有益发炎反应，使得疫苗吸收和DC呈递增加并且活化较大数目的T细胞，因此最终增加由癌症疫苗混合物引发的肿瘤反应性T细胞的广度、量值和免疫原性。通过包括被选择成具有HLA类型的错配和被选择成表达关键TAA的多种细胞系，疫苗能够有效引发广泛而有效的抗癌反应以及由HLA错配产生的其它辅助作用。
在一个实例中，根据本公开的疫苗组合物包括多种细胞系，该等细胞系被选择成确保TAA的广度以及最具免疫原性HLA蛋白质(HLA-A和HLA-B)的多样性，以刺激针对肿瘤的最大有效免疫反应。包括HLA错配可加强免疫反应，帮助引起通过ELISpot和流式细胞术可测量的总抗TAA干扰素γ产生增加。根据各种实施例，可遵循以下特征和选择标准：
因为HLA基因具有遗传性，所以在来自不同种族的受试者当中HLA错配程度增加。因此，在一些实施例中，细胞系选择程序可以包括获得来自全世界库的细胞以设计包括HLA等位基因多样性的混合物。
已鉴别HLA-C、HLA-DRB1和HLA-DPB1的差别可能具有较小免疫原性，因此在一些实施例中，疫苗组合物的细胞系可被选择成确保高度免疫原性HLA-A和HLA-B等位基因中的至少2者的错配。
根据一些实施例，增加所选细胞系之间的错配HLA-A和HLA B基因座的数目可引起接受疫苗的所有患者中更大程度的错配以确保通过干扰素γELISpot可测量的辅助作用。
将树突状细胞与癌细胞系一起培育以允许抗原吸收和DC成熟。接着将DC与来自供体的PBMC共培养，用相同细胞系或细胞系混合物再刺激，细胞系被选择成在其HLA亚型上具有异质性并且建立与供体PBMC HLA类型的错配。将细胞涂铺在ELISpot盘上并且活化。通过如实例6中所述，计数干扰素γ斑点/孔来测量肿瘤特异性T细胞。
如图59中所示，包括在多种HLA分子中与供体具有较大程度的HLA错配的肺癌细胞系的组合可以引起抗肿瘤T细胞反应增加。归因于HLA错配的免疫反应充当增强总体反应的佐剂。这些数据表明，包括多种细胞系以确保全肿瘤癌症疫苗混合物与受体之间在多种I类和II类HLA分子上广泛程度的HLA错配可以产生增加的同种异体反应。
实例26：非小细胞肺癌(NSCLC)疫苗的制备
肿瘤和肿瘤细胞系是高度异质的。肿瘤内的亚群表达具有不同生物学潜能和不同抗原谱的不同表型。在全肿瘤细胞疫苗后面的驱动目的之一是将多种肿瘤细胞呈递至免疫系统。通过进行此操作，产生针对多种TAA的免疫反应，绕过与抗原流失相关的问题，抗原丢失可引起抗原逃逸(或免疫复发)和患者复发(Keenan BP等人,《肿瘤学研讨会(SeminOncol.)》2012；39:276-86)。首先在用抗独特型单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤中观察到抗原逃逸(Meeker T等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med.)》1985；312:1658-65)并且从此之后在诸如CAR-T疗法的其它免疫疗法治疗中观察(Majzner RG等人,《癌症探索(CancerDiscov.)》2018；8:1219-26)。
NSCLC TAA的表达
通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对二十四种TAA的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值(FPKM)超过0.5，那么细胞系对TAA的表达视为阳性。总体来说，六个组分细胞系表达二十四种所鉴别的TAA中的二十三种，mRNA含量>0.5FPKM(图60)。具体来说，一种细胞系表达五种TAA，两种细胞系表达四种TAA，三种细胞系表达四种TAA，三种细胞系表达五种TAA，并且八种细胞系表达六种TAA。由单个细胞系表达的TAA的最小数目为十二(NCI-H520)并且由单个细胞表达的TAA的最大数目为十八(DMS 53)。由A549、NCI-H520、NCI-H460、DMS 53、LK-2、NCI-H23构成的示例性6细胞系单位剂量可以靶向的抗原数目高于该等各个细胞系。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强TAA的阵列，如本文所述，一种细胞系(LK-2)也经CT83和间皮素的基因转导(图65)。在六种细胞系中的两个中CT83 mRNA以低水平内源性表达，并且六个组分细胞系中的一个内源性表达间皮素。
因为需要维持TAA的最大异质性，所以使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
累积地，本发明疫苗中的细胞表达更多的已显示在抗肿瘤免疫中重要的TAA。本发明NSCLC疫苗中使用表39中的细胞系。
表39.NSCLC疫苗细胞系和组织学
shRNA下调TGF-β分泌
减弱TGFβ1和TGFβ2，并且如实例5中所述测定所得分泌含量。在混合物A中的亲本细胞系中，NCI-H460和A549分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2，而LK-2分泌TGFβ2但不分泌TGFβ1。在混合物B中的亲本细胞系中，NCI-H23分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2，并且LK-2分泌TGFβ2但不分泌TGFβ1。DMS 53分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2，但TGFβ1分泌低。
除DMS 53以外，组分细胞系都被TGFβ1 shRNA和TGFβ2 shRNA转导以减弱两种分子的分泌。因为用TGFβ1和TGFβ2 shRNA修饰的多次尝试不成功，所以DMS 53仅由TGFβ2 shRNA进行基因修饰。因为在此细胞系中TGFβ2的分泌含量已较低，所以选择TGFβ1减弱以继续前进。这些细胞用纯系名称DK4描述。其余细胞系被TGFβ1和TGFβ2 shRNA双重修饰。这些细胞用纯系名称DK6描述。
表40示出相较于野生型细胞系，被基因修饰的组分细胞系中的TGF-β分泌。TGFβ1减少的范围是59％至90％。TGFβ2减少的范围是42％至97％。
表40.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；ND＝无法检测到；NA＝不适用
基于8×106各组分细胞系的注射剂量，混合物A和B中的总TGF-β分泌展示在表41中。还显示混合物中野生型细胞中的分泌。混合物A显示TGFβ1每24小时每注射剂量9679pg的总分泌和TGFβ2每24小时每注射剂量5600pg。混合物B显示TGFβ1每24小时每注射剂量8220pg的总分泌和TGFβ2每24小时每注射剂量14163pg。
贝拉金普(Belagenpumatucel-L)具有每24小时每注射剂量18,813pg的总TGFβ2分泌(Nemunaitis,J.等人JCO.(2006)24:29,4721-4730)(Fakhrai,H 2010)。尽管相较于贝拉金普中的2.5×107个细胞，NSCLC疫苗中4.8×107个细胞的较高注射细胞数目，但NSCLC疫苗中的总TGFβ2分泌(每24小时每注射剂量19,763pg)大致相当于贝拉金普中的TGFβ2分泌。
表41.NSCLC疫苗混合物中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
NSCLC疫苗中的总TGFβ1分泌(每24小时每注射剂量17,899pg)为贝拉金普中估计TGFβ1分泌的31％。
CD276表达
所有组分细胞系都表达CD276并且通过如实例13中和本文中所述用ZFN电穿孔来敲除CD276表达。除仅TGFβ2减弱的DMS 53(称为DK4)以外，组分细胞系先前经shRNA基因修饰以减弱TGFβ1和TGFβ2的表达(称为DK6)。因为需要维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔的细胞。实际上，细胞经受多轮通过FACS的细胞分选。CD276表达的减少描述于表42中。还通过蛋白质印迹分析使用(数据未示出)证实敲除细胞中蛋白质表达的缺乏。这些数据说明CD276的基因编辑引起所有六个组分细胞系中超过99％的CD276阴性细胞。
表42.CD276表达的减少
GM-CSF分泌
如本文和实例24所述，组分细胞系被GM-CSF转导。结果在表43中示出。
表43.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于8×106各组分细胞系的注射剂量，混合物A的总GM-CSF分泌为每24小时每注射剂量33,760ng。混合物B的总GM-CSF分泌为每24小时每注射剂量19,856ng。因此，每次注射的总分泌为每24小时43,616ng。
CD40L表达
如本文所述并且通过实例15中所述的方法，组分细胞系被CD40L载体转导。如实例15中所述，通过流式细胞术，利用抗CD40L单克隆抗体评估CD40L表达。图74中所示的结果证明所有六种细胞系中显著的CD40L膜表达。
IL-12表达
组分细胞系被IL-12载体转导并且所得IL-12p70表达如实例24中和本文中所述来测定，结果在表44中示出。
表44.组分细胞系中的IL-12分泌
基于8×106各组分细胞系的注射剂量，混合物A的总IL-12分泌为每24小时每注射剂量6880ng。混合物B的总IL-12分泌为每24小时每注射剂量5760ng。因此，每次注射的总IL-12分泌为每24小时12,640ng。
LK-2细胞系稳定表达间皮素和CT83
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对于抗肿瘤免疫重要的那些TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF和膜结合的CD40L的LK-2细胞系也被表达CT83和间皮素抗原的慢病毒颗粒转导。CT83和间皮素抗原由P2A裂解位点(SEQ ID NO:21)连接。
通过流式细胞术表征膜结合之间皮素和CT83的表达。根据制造商说明书，将未被修饰的亲本和被修饰的细胞在细胞外用抗间皮素-PE(R&D Systems FAB32652P)染色。将未被修饰的亲本和被修饰的细胞在细胞内用抗CT83(Abcam，ab121219)染色，接着山羊抗兔Alex488(Invitrogen，A-11034)染色。自针对CT83与间皮素染色的未被修饰的细胞的MFI减去未染色的未被修饰的亲本细胞的MFI。自针对CT83与间皮素被修饰的细胞的MFI减去被修饰的亲本细胞的MFI。表达增加百分比计算为：(1-(背景减去的被修饰的MFI/背景减去的未被修饰的MFI))×100)。被修饰的细胞系(934,985MFI)中CT83表达比亲本细胞系(323,878MFI)增加3倍。被修饰的细胞系(123,128MFI)对间皮素的表达比亲本细胞系(1443MFI)增加85倍(图65A)。
如实例8中所述，通过自体DC与CD14-PBMC共培养，接着ELISpot来测定IFNγ对CT83和间皮素抗原的反应。在NSCLC-疫苗B的情况下评估IFNγ对由被修饰的LK-2细胞系表达的CT83和间皮素抗原的反应。具体来说，将5×105个被修饰的DMS 53、NCI-H23和LK-2细胞(1.5×106个总被修饰细胞)与来自3个HLA不同的供体(n＝3/供体)的1.5×106个iDC共培养。在IFNγELISpot分析中将在第6天从与mDC的共培养物分离的CD14-PBMC用CT83和间皮素肽池(15聚体，跨越天然蛋白质序列的重叠11个氨基酸)刺激24小时，接着检测IFNγSFU。检测针对CT83(205±158SFU)(n＝9)和间皮素(3449±889SFU)(n＝9)的IFNγ产生(图65B)。
相较于各个组分细胞系，疫苗混合物引发更强和更广泛的细胞免疫反应
如实例8和9中所述，通过IFNγELISpot测量相较于NSCLC疫苗混合物诱导针对各个细胞系的IFNγ反应的能力，各个NSCLC疫苗组分细胞系诱导针对自身的IFNγ反应的能力。图62中的数据证明对于6种细胞系中的4个，混合物(NSCLC-A和NSCLC-B)引发的免疫反应比各个组分细胞系更强。
接着测量由疫苗混合物诱导的针对相关TAA的免疫反应。将正常供体PBMC与各个组分细胞系或与NSCLC-A或NSCLC-B混合物共培养6天，接着用负载含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池的自体DC刺激。接着在IFNγELISpot分析中分析细胞的IFNγ分泌。图63中所示的数据证明NSCLC疫苗组分细胞系中的每一个能够诱导TAA特异性IFNγ反应。更重要地，相较于各个组分细胞系，两种NSCLC疫苗混合物诱导更强的针对更多TAA的IFNγ反应，这表明疫苗混合物能够诱导更广泛的免疫反应。
实例27：非小细胞肺癌(NSLC)疫苗
基于本公开和本文提供的数据，以下实例提供用于NSCLC的全细胞疫苗，其由下表45中所示的六个肺癌细胞系构成。细胞系代表两种腺癌(A549和NCI-H23)、两种鳞状细胞癌(NCI-H520和LK-2)、一种大细胞癌(NCI-H460)和一种小细胞肺癌(SCLC)(DMS 53)。细胞系已划分成两个分组：疫苗混合物A和疫苗混合物B(即，NSCLC-A和NSCLC-B)。混合物A被设计成在上臂中皮内施用并且混合物B被设计成在大腿中皮内施用。混合物A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表45.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。已通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除CD276的基因。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、间皮素和CT83的基因。
六个已建立的肺癌细胞系中的五个是获自美国菌种保存中心(American TypeCulture Collection，ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))并且一个是获自日本生物资源研究中心细胞库(JCRB，密苏里州堪萨斯市(Kansas City,MO))。
实例28：贝拉金普与NSCLC疫苗的比较
贝拉金普的临床研究结果在同行评审杂志中公开并且包括NSCLC中的两个II期试验(Nemunaitis J等人,《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)》2006；24:4721-30；NemunaitisJ等人,《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》2009；16:620-4)和III期试验(Giaccone G等人,《欧洲癌症杂志(Eur J Cancer.)》2015；51:2321-9)。
贝拉金普是一种疫苗，其中使用TGFβ2反义质粒下调四种同种异体NSCLC肿瘤细胞系中的TGFβ2分泌。然而，贝拉金普并未解决TGFβ1分泌的问题。近期研究显示，TGFβ1是免疫系统中表达的主要同功型。TGFβ1以高亲和力结合于TGFβRII受体，而TGFβ2仅在TGFβRIII辅助受体(也称为β蛋白聚糖)存在下以高亲和力结合。NSCLC中β蛋白聚糖下调，此使得TGFβ1成为主要TGFβ同功型。
在其它修饰和改善当中，关于TGFβ1和TGFβ2的分泌，实例27中所述的NSCLC疫苗引入相对于贝拉金普的巨大改善。NSCLC疫苗中较低TGFβ2分泌含量是重要的，但甚至更显著的是降低的TGFβ1含量。本发明NSCLC疫苗还引入以下改善：shRNA的慢病毒转导的使用正用以减弱TGFβ2和TGFβ1的表达，提供表达与稳定性上相对于反义的重大改善；使用锌指核酸酶电穿孔敲除CD276的表达；使用慢病毒转导诱导免疫刺激分子GM-CSF、IL-12和CD40L的表达；使用SCLC细胞系，注意到近期观察结果，即NSCLC肿瘤含有大量SCLC组分并且该组分造成抗药性、癌转移和复发；以及使用无血清培养基配制物。
如上所述，鉴别出可能在NSCLC患者中产生相关抗肿瘤免疫反应的二十四种TAA。图61A中展示NSCLC疫苗和贝拉金普中这些二十四种抗原的mRNA表达。图61中的数据示为对应的贝拉金普和NSCLC疫苗细胞系组分中各抗原的Log10 FPKM+14mRNA表达的和。FPKM mRNA值调整为14.0，以顾及负基础值(-13.00FPKM)，从而允许添加具有正值的mRNA含量。在573个NSCLC患者样品中确定由NSCLC疫苗细胞组分表达的二十三种优先NSCLC TAA的表达。在2020年2月23日与2020年7月2日之间自以下可公开获得的数据库下载NSCLC患者数据：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami,E.等人《癌症发现(Cancer Discovery.)》2012.；Gao,J.等人《科学信号(Sci Signal.)》2013.)(图78C)。HUGO基因命名委员会(HGNC)基因符号包括在搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。
NSCLC疫苗可能靶向由573个患者肿瘤样品表达的21种TAA的中位数(图61B)并且贝拉金普靶向17种TAA的中位数(图61C)。在所有573个患者中NSCLC疫苗和贝拉金普均具有诱导针对至少五种抗原的抗肿瘤反应的潜能。NSCLC疫苗可对572个患者(99.8％)至少17种抗原、565个患者(98.6％)中至少18种抗原、538个患者(93.9％)中至少19种抗原、438个患者(76.4％)中至少20种抗原、290个患者(50.6％)中至少21种抗原、183个患者(31.9％)中至少22种抗原和73个患者(12.7％)中至少23种抗原诱导抗肿瘤反应。相比之下，贝拉金普仅能对572个患者(99.8％)中至少14种抗原、558个患者(97.4％)中至少15种抗原、525个患者(91.6％)中至少16种抗原、351个患者(61.3％)中至少17种抗原、233个患者(40.7％)中至少18种抗原和126个患者(22.0％)中至少19种抗原诱导抗肿瘤反应。以上分析包括在NSCLC患者中优先诱导和抗肿瘤反应的抗原并且不考虑组分细胞系表达的其它和可能临床上相关的抗原。
本文所述的NSCLC疫苗中包括的六种细胞系被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。因此，可使用示例性六细胞系组合物靶向的TAA数目和抗原表达量高于贝拉金普。如早先所描述，为进一步增强抗原广度，一种细胞系(LK-2)也经CT83(SEQID NO:19、SEQ ID NO:20)和间皮素(SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18)的基因转导，CT83和间皮素系在六个组分细胞系中的任一个中mRNA以低水平内源性表达的两种TAA。
本实例证明，相较于贝拉金普，在包含两种混合物的NSCLC疫苗中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加抗原广度和细胞免疫反应量值，各混合物由三种细胞系组分构成，总共6个组分细胞系。
贝拉金普细胞系中TGFβ2分泌的减少
贝拉金普混合物的细胞系组分NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1和Rh2被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒表达特异性靶向TGFβ2(SEQ ID NO:24)的shRNA并且如实例5中所述测定被修饰的细胞系中所得TGFβ2含量。被修饰的细胞中的TGFβ2分泌含量低于NCI-H520和SK-LU-1的ELISA分析定量下限并且MDD(42.0皮克/106个细胞/24小时用于估计相对于亲本细胞系的减少百分比。相较于亲本未被修饰的细胞系，NCI-H460中TGFβ2分泌减少84％，NCI-H520中减少≥99％，SK-LU-1中减少≥84％，并且Rh2中减少74％。NSCLC混合物A和混合物B的TGFβ1和TGFβ2含量的减少描述于表41中。NSCLC疫苗如实例27中所述制备。
针对NSCLC疫苗-A、NSCLC疫苗-B和贝拉金普的抗原特异性和肿瘤细胞特异性IFNγ产生
如实例8中所述，在自身DC和PBMC共培养之后，通过IFNγELISpot测定针对抗原和亲本未被修饰的细胞的细胞免疫反应，修改如下所述。
调整自身DC和PBMC共培养物以模拟贝拉金普和NSCLC疫苗的活体内施用。贝拉金普施用单个部位并且NSCLC疫苗-A和NSCLC疫苗-B施用两个单独注射部位。在表示贝拉金普的自身DC和PBMC共培养物中，将3.75×105个NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1、Rh2被修饰的细胞、1.5×106个总被修饰的细胞与1.5×106个iDC共培养。NSCLC疫苗-A，将5.00×105个被修饰的NCI-H460、NCI-H520、A549细胞、1.5×106个总被修饰的细胞与1.5×106个iDC共培养。对于NSCLC疫苗-B，5.0×105个被修饰的DMS 53、NCI-H23和LK-2细胞、1.5×106个总被修饰的细胞与1.5×106个iDC共培养。在共培养之后，通过IFNγELISpot测定针对亲本肿瘤细胞系和抗原的细胞免疫反应。在单独孔中用未被修饰的NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1或Rh2(n＝4/细胞系/供体)刺激来自贝拉金普共培养物的CD14-PBMC。在单独孔中用NCI-H460、NCI-H520或A549(n＝4/细胞系/供体)刺激来自NSCLC疫苗-A混合物的CD14-PBMC。在单独孔中用DMS 53、LK-2或NCI-H23(n＝4/细胞系/供体)刺激来自NSCLC疫苗-B混合物的CD14-PBMC。使用自相同贝拉金普、NSCLC疫苗-A和NSCLC疫苗-B共培养物分离的CD14-PBMC(n＝4/供体/抗原)测定抗原特异性反应。测定针对包含贝拉金普疫苗、NSCLC疫苗-A和NSCLC疫苗-B的亲本未被修饰的细胞系和对示例性肿瘤相关抗原(TAA)、肿瘤特异性抗原(TSA)和癌症/睾丸抗原(CTA)的IFNγ产生反应。
相较于单一混合物免疫疗法方法中4个组分细胞系中TGFβ2的减少，2混合物方法中6个组分细胞系中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加细胞免疫反应
在来源于8个HLA不同的健康供体的CD14-PBMC和DC共培养之后，测定由贝拉金普、混合物A和混合物B诱导的针对亲本肿瘤细胞和抗原的IFNγ反应。将与负载有被修饰的贝拉金普NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1、Rh2组分细胞系的DC共培养的PBMC用亲本未被修饰的NCI-H460、NCI-H520、SK-LU-1、Rh2细胞(n＝4/供体/细胞系)刺激。将与负载有混合物A的DC共培养的PBMC用亲本未被修饰的NCI-H460、NCI-H520、A549细胞(n＝4/供体/细胞系)刺激。将与负载有混合物B的DC共培养的PBMC用亲本未被修饰的DMS53、NCI-H23和LK-2细胞(n＝4/供体/细胞系)刺激。各供体变量的复制样品(n＝4)的平均SFU报告为±SEM。相较于贝拉金普(1,850±764SFU)(n＝8)(p＝0.0148，曼-惠特尼U检验)(图66A)，NSCLC疫苗单位剂量引发显著更稳固的肿瘤细胞特异性IFNγ反应(7,613±1,763SFU)(n＝8)。图67A中示出对贝拉金普、NSCLC疫苗混合物A、NSCLC疫苗混合物B和NSCLC疫苗单位剂量的供体特异性IFNγ反应。
表46展示随供体而变的对混合物A和混合物B的IFNγ反应的分布，突出增加细胞系组分的细胞系数目和递送部位能够达到比4种细胞系的单一组合物更广泛的群体。
表46.IFNγ反应
NSCLC疫苗混合物A和混合物B还诱导对与NSCLC和其它实体肿瘤适应症相关的示例性抗原组更稳固的抗原特异性IFNγ反应。将与负载有贝拉金普、NSCLC疫苗混合物A或NSCLC疫苗混合物B的DC共培养的PBMC用含有广泛范围的HLA单纯型的已知抗原特异性T细胞抗原决定基的肽池刺激(n＝4/供体/抗原)。在表47和图67B中各抗原和供体(n＝4)的复制样品的平均SFU报告为±SEM。在8个供体中，相对于贝拉金普(392±157SFU)，NSCLC疫苗单位剂量显著增加抗原特异性IFNγ产生的平均量值和广度(6,576±2,147SFU)(n＝8)(p＝0.0002，曼-惠特尼U检验)(图66B)。
表47.抗原特异性IFNγ产生的平均量值
实例29：多形性胶质母细胞瘤(GBM)癌症疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种GBM相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物GBM疫苗-A由也被修饰以表达modPSMA的细胞系LN-229、细胞系GB-1和也被修饰以表达modTERT的细胞系SF-126构成。第二混合物GBM疫苗-B由细胞系DBTRG-05MG、也被修饰以表达modMAGEA1、hCMV pp65和EGFRvIII的细胞系KNS 60和细胞系DMS 53构成。6种组分细胞系总体来说表达至少二十二种可提供抗GBM肿瘤反应的抗原。
多形性胶质母细胞瘤疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出十七种疫苗组分细胞系，用于可能包括在GBM疫苗中。应用其它选择标准以将十七种候选细胞系缩小至八种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性GBM相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、GBM特异性CSC标记物的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、GBM组织学和分子亚型(可获得时)和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子的甲基化状态(可获得时)。
GBM肿瘤富含表达各种CSC标记物的异质CSC群体(表2)。在2020年2月23日与2020年7月2日之间从以下可公开获得的数据库下载的患者肿瘤样品数据中证实十三种GBM相关CSC标记物ABCG2、ALDH1A1、BMI-1、FUT4、CD44、CD49f、CD90、PROM1、CXCR4、Musashi-1、Nestin、MYC和SOX2的表达：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami,E.等人《癌症研究》2012.；Gao,J.等人《科学信号》2013.)(图68C)。HUGO基因命名委员会(HGNC)基因符号包括在搜索中并且针对各CSC标记物下载mRNA表达。
通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA和CSC标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA或CSC标记物下载mRNA表达。如果RNA-seq值(FPKM)超过一，那么细胞系对TAA或CSC标记物的表达视为阳性。基于上述选择标准，鉴别出十七种GBM疫苗候选组分中的八种，用于进一步评估：DBTRG-05MG、LN-229、A-172、YKG-1、U-251MG、GB-1、KNS 60和SF-126。八种候选组分细胞系表达七种至十种CSC标记物(图68B)和十一种至十四种TAA(图68A)。如本文所述，包括CSC样细胞系DMS 53作为6种细胞系之一。
如实例9中所述，针对三个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估未被修饰的GBM组分细胞系候选物的免疫原性。供体HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*02:01B*35:01和A*31:01B*35:03；供体2，A*01:01B*30:01和A*02:01B*12:02，供体3，A*02:01B*15:07和A24:02B*18:01。LN-229(5,039±637SFU)和DBTRG-05MG(6,094±734SFU)比A-172(808±152SFU)、YKG-1(576±154)、U-251MG(2,314±434)、GB-1(908±284SFU)、KNS-60(2,177±415SFU)和SF-126(1,716±332SFU)免疫原性大。(图69A)如在本文中进一步描述，选择LN-229包括在疫苗混合物A中并且选择DBTRG-05MG包括在疫苗混合物B中。
在三种组分细胞系的八种不同组合中评估DBTRG-05MG和LN-229的免疫原性，四种组合含有DBTRG-05MG并且四种组合含有LN-229(图69C)。如实例8中所述，使用上述相同三个健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对八种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。检测所有八种混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应。相较于针对单个细胞系组分所检测的IFNγ反应，针对各个混合物组分细胞系的反应显著减少。在所有八种评估的组合中，DBTRG-05MG和LN-229保持最大免疫原性(图69B)。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对GBM抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如IL13Rα2，以及已知对GBM和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。如本文中所示，为进一步增强TAA阵列，LN-229被编码modPSMA的基因转导，SF-126被编码modTERT的基因转导，并且KNS-60被编码modMAGEA1、hCMVpp65和跨越EGFR的267个氨基酸的框内缺失，产生EGFR突变形式EGFRvIII的14氨基序列的基因转导，如本文所述。
TERT、PSMA和MAGEA1在六种组分细胞系中的一种中内源性表达，并且活化突变EGFRvIII和GBM相关病毒抗原hCMVpp65在一种或多种细胞系中以>1.0FPKM非内源性地表达，如下所述(图70)。如本文所述，通过流式细胞术检测SF-126对被转导的抗原modTERT的表达(SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36)(图71A)，LN-229对modPSMA的表达(SEQ ID NO:37；SEQID NO:38)(图71B)，KNS 60对modMAGEA1的表达(SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40)(图71C)，KNS 60对EGFRvIII的表达(SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40)(图71D)和KNS 60对hCMVpp65的表达(SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40)(图71E)。如本文所述，还通过RT-PCR检测KNS 60对EGFRvIII和hCMV pp65的表达(图71F)。在相同慢病毒转移载体中编码MAGEA1、EGFRvIII和hCMVpp65的基因，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开。本文描述针对被转导的抗原的IFNγ产生。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中代表性TAA的mRNA表达在图70A中示出。本发明疫苗高度表达所有鉴别的二十二种通常靶向并且可能临床上相关的用于诱导GBM抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在GBM肿瘤中并且一些还可以诱导针对GBM和其它实体肿瘤的免疫反应。使用相同方法和170个用于证实上述GBM CSC标记物的表达的患者样品，在170个GBM患者样品中测定二十二种优先GBM TAA的表达。100％样品表达十八种优先GBM TAA，97.2％样品表达19种TAA，79.4％样品表达20种TAA，32.9％样品表达21种TAA，并且1.8％样品表达22种TAA(图70B)。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表48中鉴别出的细胞系以包含本发明GBM疫苗。
表48.胶质母细胞瘤疫苗细胞系和组织学
CD276表达
LN-229、GB-1、SF-126、KNS-60和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。DBTRG-05MG经表达对CD276减弱具有特异性的shRNA(shCD276，ccggtgctggagaaagatcaaacagctcgagctgtttgatctttctccagcatttttt(SEQ ID NO:71)的慢病毒颗粒转导。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。
通过在第1天(在辐照之前)和第3天(辐照之后48小时)用PEα-人类CD276(BioLegend，纯系DCN.70)细胞外染色被修饰和亲本细胞系来测定CD276的表达。辐照并未影响CD276表达量并且报告第1天MFI值。未染色细胞和同型对照PEα-小鼠IgG1(BioLegend，纯系MOPC-21)染色的亲本细胞和CD276 KO细胞充当对照。自针对亲本和被修饰的细胞系报告的值减去同型对照的MFI。CD276表达的减少百分比表示为：(1-(CD276KO细胞系的MFI/亲本的MFI))×100)。MFI相对于100,000个细胞正规化。表49中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用shRNA或ZFN对CD276进行基因编辑引起超过58.5％的CD276阴性细胞。
表49.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
以100Gy对细胞系进行X射线辐照，接着以2种细胞密度(5.0e5和7.5e5)一式两份地涂铺在6孔盘中。第二天，将细胞用PBS洗涤并且培养基变成分泌分析培养基(基础培养基+5％CTS)。在48小时之后，收集培养基用于ELISA。使用Luna细胞计数器(LogosBiosystems)对每孔的细胞数目计数。记录总细胞计数和活细胞计数。如通过ELISA测定的培养基中的细胞因子的分泌相对于记录的总细胞计数正规化。
根据制造商说明书(人类TGFβ1Quantikine ELISA，R&D Systems，#SB100B)通过ELISA测定TGFβ1分泌。针对各上清液样品，将四种稀释液一式两份地涂铺。如果ELISA分析结果低于LLD，那么通过从分析中回收的细胞数目和检测下限15.4pg/mL估计相对于亲本细胞系的减少百分比。如果>2个样品或稀释液中检测到TGFβ1，那么报告n个样品操作的阳性值的平均值。
根据制造商说明书(人类TGFβ2Quantikine ELISA，R&D Systems，#SB250)通过ELISA测定TGFβ2分泌。针对各上清液样品，将四种稀释液一式两份地涂铺。如果ELISA分析结果低于LLD，那么通过从分析中回收的细胞数目和检测下限7.0pg/mL估计相对于亲本细胞系的减少百分比。如果>2个样品或稀释液中检测到TGFβ2，那么报告n个样品操作的阳性值的平均值。
根据制造商说明书(GM-CSF Quantikine ELISA，R&D Systems，#SGM00)通过ELISA测定GM-CSF分泌。针对各上清液样品，将四种稀释液一式两份地涂铺。如果ELISA分析结果低于LLD，那么通过从分析中回收的细胞数目和检测下限3.0pg/mL估计相对于亲本细胞系的增加百分比。如果>2个样品或稀释液中检测到GM-CSF，那么报告n个样品操作的阳性值的平均值。
根据制造商说明书(LEGEND MAX人类IL-12(p70)ELISA，Biolegend#431707)通过ELISA测定IL-12分泌。针对各上清液样品，将四种稀释液一式两份地涂铺。如果ELISA分析结果低于LLD，那么通过从分析中回收的细胞数目和检测下限1.2pg/mL估计增加百分比。如果>2个样品或稀释液中检测到IL-12，那么报告n个样品操作的阳性值的平均值。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如上所述测定所得含量。在GBM疫苗-A中的亲本细胞系中，LN-229、GB-1和SF-126分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。在GBM疫苗-B中的亲本细胞系中，DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。实例5中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上所述测定所得含量。
GBM来源的五种组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌。编码TGFβ1shRNA的慢病毒颗粒也编码用于在不同启动子控制下表达膜结合的CD40L的基因。这允许同时减少TGFβ1和表达膜结合的CD40L。随后SF-126和KNS 60被编码TGFβ2 shRNA和GM-CSF的慢病毒颗粒(SEQ ID NO:6)转导。这允许在两种细胞系中同时减少TGFβ2和表达GM-CSF。
DBTRG-05MG和GB-1仅由TGFβ1 shRNA进行基因修饰。TGFβ1和TGFβ2促进细胞增殖和存活。在一些细胞系中，如一些肿瘤中，TGFβ信号传导的减少可诱导生长阻滞并且导致细胞死亡。在诸如GBM的神经元细胞中，TGFβ信号传导的丧失也与细胞死亡相关。选择TGFβ1减弱用于修饰，因为认为其为一种相对于TGFβ2更有效的免疫抑制因子并且保留一些TGFβ信号传导可能是这些细胞系增殖和存活必要的。LN-229以可检测但低的含量分泌TGFβ2，并且不用TGFβ2 shRNA修饰。这些细胞用纯系名称DK2描述。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌而不减少TGFβ1的分泌。这些细胞用纯系名称DK4描述。其余细胞系用TGFβ1 shRNA和TGFβ2 shRNA双重修饰。这些细胞用纯系名称DK6描述。
表50展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。基因修饰引起TGFβ1分泌减少49％至80％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少51％至99％。经TGFβ1 shRNA修饰的DBTRG-05MG分泌的TGFβ2比未被修饰的亲本细胞系少。在多个独立实验中证实被修饰的细胞系对TGFβ2的较低分泌。在其它组分细胞系中未观察到TGFβ1减弱之后TGFβ2的较低分泌。
表50.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的GBM疫苗-A和GBM疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表51中示出。GBM疫苗-A的TGFβ1分泌减少75％，并且TGFβ2减少62％皮克/剂量/24小时。GBM疫苗-B的TGFβ1分泌减少51％，并且TGFβ2减少74％皮克/剂量/24小时。
表51.GBM疫苗-A和GBM疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
两种GBM组分细胞系KNS 60和SF-126被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒含有TGFβ2 shRNA与在不同启动子控制下表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)。这允许同时减少TGFβ2分泌和表达GM-CSF。DBTRG-05MG、LN-229和GB-1细胞系被慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例24中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表52中示出并且在下文描述。
在所有被修饰的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，GM-CSF的分泌增加至少19,000倍。在GBM疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系，LN-229的GM-CSF的分泌增加303,000倍(≤0.002纳克/106个细胞/24小时)，相较于亲本细胞系，GB-1的GM-CSF的分泌增加409,000倍(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，并且相较于亲本细胞系，SF-126的GM-CSF的分泌增加19,000倍(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)。在GBM疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.002纳克/106个细胞/24小时)，DBTRG-05MG的GM-CSF的分泌增加1,209,500倍，相较于亲本细胞系，KNS 60(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)的GM-CSF的分泌增加109,667倍，并且相较于亲本细胞系，DMS 53(≤0.004纳克/106个细胞/24小时)的GM-CSF的分泌增加39,450倍。
表52.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，GBM疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量537ng。GBM疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量1,454ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时1,991ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L的载体。本文中描述检测五种GBM细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述用于修饰DMS 53以表达CD40L的方法。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。
如实例15中所述，通过流式细胞术，利用抗CD40L单克隆抗体评估CD40L表达。在第1天(在辐照之前)和第3天(在辐照之后)测定CD40L表达。辐照并未影响表达量并且报告第1天CD40L表达。如果同型对照MFI的减去产生负值，那么使用1.0的MFI计算相对于未被修饰的细胞系，被修饰的组分细胞系对CD40L的表达的增加倍数。图72中所示和下文所述的结果证明在所有六种细胞GBM疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
图72展示GBM疫苗组分细胞系对膜结合的CD40L的表达。在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少172倍。在GBM疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，LN-229对CD40L的表达增加11,628倍(11,628MFI)，相较于亲本细胞系(19MFI)，GB-1对CD40L的表达增加233倍(4,464MFI)，并且相较于亲本细胞系(32MFI)，SF-126对CD40L的表达增加172倍(5,526)。在GBM疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，DBTRG-05MG对CD40L的表达增加20,510倍，相较于亲本细胞系(0MFI)，KNS60对CD40L的表达增加5,599倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表53中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少45,000倍。在GBM疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，LN-229的IL-12的分泌增加81,000倍，相较于亲本细胞系(≤0.0002纳克/106个细胞/24小时)，GB-1的IL-12的分泌增加50,000倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，SF-126的IL-12的分泌增加45,000倍。在GBM疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，DBTRG-05MG对IL-12的表达增加133,560倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，KNS 60对IL-12的表达增加116,000倍。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表53.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，GBM疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量69ng。GBM疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量125ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时194ng。
LN-229细胞系稳定表达modPSMA
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对GBM抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的LN-229细胞系也被表达modPSMA抗原(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)的慢病毒颗粒转导。
通过流式细胞术表征modPSMA的表达。未被修饰的亲本和被修饰的细胞在细胞内用0.06微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(AbCam ab268061，纯系FOLH1/3734)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色。自抗PSMA染色的细胞的MFI减去同型对照染色亲本和被修饰的细胞的MFI。MFI相对于100,000个事件正规化。抗原表达增加倍数计算为：(减去背景的被修饰的MFI/减去背景的亲本MFI)。被修饰的细胞系(533,577MFI)中PSMA的表达比亲本细胞系(14,008MFI)增加38倍(图71B)。
KNS60细胞系稳定表达modMAGEA1、EGFRvIII、hCMV-pp65
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的KNS 60细胞系也被表达modMAGEA1、hCMV pp65和EGFRvIII抗原的慢病毒颗粒转导。modMAGEA1、hCMV pp65和EGFRvIII抗原由弗林蛋白酶裂解位点连接(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40)。
通过流式细胞术表征modMAGEA1、hCMV pp65和EGFRvIII的表达。未被修饰的亲本和被修饰的细胞在细胞内染色以如下检测各抗原的表达。为检测modMAGEA1，首先将细胞用小鼠IgG1抗MAGEA1抗体(SC-71539，纯系3F256)染色(0.03微克/检验)，接着用AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色(0.125微克/检验)。为检测hCMVpp65，首先将细胞用小鼠IgG1抗pp65抗体(AbCam ab31624，纯系1-L-11)染色(0.06微克/检验)，接着用AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色(0.125微克/检验)。为检测EGFRvIII，首先将细胞用小鼠IgG1抗EGFRvIII抗体(Novus NBP2-50599，纯系DH8.3)染色(0.06微克/检验)，接着用AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色(0.125微克/检验)。自针对MAGEA1、hCMV pp65或EGFRvIII染色的细胞的MFI减去同型对照染色细胞的MFI。MFI相对于100,000个事件正规化。抗原表达增加倍数计算为：(减去背景的被修饰的MFI/减去背景的亲本MFI)。
还通过RT-PCR证实hCMVpp65和EGFRvIII的表达(图81F)。1.0-3.0×106个细胞用于RNA分离。根据制造商说明书，使用Direct-zolTM RNAMiniPrep试剂盒(ZYMO RESEARCH，目录号：R2051)分离RNA。使用NanoDropTM OneC(Thermo ScientificTM，目录号13-400-519)进行RNA定量。对于逆转录，根据制造商说明书，使用qScript cDNA SuperMix(Quantabio，目录号：95048-025)将1μg RNA逆转录成cDNA。在完成cDNA合成之后，将反应稀释两次并且使用2μL cDNA用于扩增。对于hCMVpp65，正向引物被设计成在转基因中的1925-1945碱基对(bp)位置(CGGACTGCTGTGTCCTAAGAG(SEQ ID NO:118))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的2414-2435bp位置(GCTGTCCTCGTCTGTATCTTCC(SEQ ID NO:119))处粘接并且得到511bp产物。对于EGFRvIII，正向引物被设计成在转基因中的839-858bp位置(TGTGAAGGTGCTGGAATACG(SEQ ID NO:120))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的1252-1271bp位置(GCCGGTAAAGTAGGTGTGCT(SEQ ID NO:121))处粘接并且得到433bp产物。粘接成变异体1、外显子1(TGTCTAGGGGAAGGGTGTGG(SEQ ID NO:122)和外显子4(TGCCCCAGACTGACCAAATAC(SEQ ID NO:123))的β-微管蛋白引物用作对照。检测hCMVpp65、EGFRvIII和β-微管蛋白的PCR如下完成：初始变性，98℃30秒，接着25个如下循环：在98℃下变性5至10秒，在58℃下粘接10至30秒，和在72℃下延伸30秒。在25个循环之后，完成在72℃下最终延伸2分钟，并且反应保持在10℃下，直到通过凝胶电泳检测PCR产物。在完成PCR之后，以1X浓度添加Lel负载染料紫色(6X)(New England BioLabs,#B7024S)。接着PCR产物与8μL exACT Gene 100bp梯度(Fisher BioReagents，#BP2573100)一起在2％琼脂糖凝胶(
LE琼脂糖，#50004)上跑动以估计条带尺寸。在条带适当分开之后，使用ChemiDoc成像系统(BioRAD，#17001401)使凝胶成像。对于利用β-微管蛋白基因进行相对定量，使用Image Lab软件v6.0(BioRAD)。
被修饰的细胞系(140,342MFI)中modMAGEA1的表达比亲本细胞系(3,460MFI)增加41倍(图71C)。被修饰的细胞系(9,545MFI)中hCMVpp65的表达比亲本细胞系(0MFI)增加9,545倍。自pp65染色的亲本KNS 60的MFI减去同型对照的MFI得到负值。使用1MFI计算被修饰的细胞系中pp65表达的增加倍数(图71E)。被修饰的细胞系(4,925MFI)对EGFRvIII的表达比亲本细胞系(1,053MFI)增加5倍(图71D)。
SF-126细胞系稳定表达modTERT
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的SF-126细胞系也被表达modTERT抗原(SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36)的慢病毒颗粒转导。
通过流式细胞术表征modTERT的表达。未被修饰的亲本和被修饰的细胞在细胞内用抗兔IgG1抗TERT抗体(AbCam ab32020，纯系Y182)(0.03微克/检验)染色，接着用AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(Biolegend#406414)(0.125微克/检验)染色。MFI相对于100,000个事件正规化。自针对亲本和被修饰的细胞染色的细胞的MFI减去同型对照染色的亲本和被修饰的细胞的MFI。抗原表达增加倍数计算为：(减去背景的被修饰的MFI/减去背景的亲本MFI)。被修饰的细胞系(281,904MFI)中modTERT的表达比亲本细胞系(10,578MFI)增加27倍(图71A)。
GBM-疫苗B中对MAGEA1、EGFRvIII和hCMVpp65的免疫反应
在GBM-疫苗B的情况下评估对MAGEA1、EGFRvIII和hCMVpp65抗原的IFNγ反应。具体来说，将5×105个被修饰的DMS 53、DBTRG-05MG和KNS 60细胞系共1.5×106个总被修饰的细胞与来自八个HLA不同的供体的1.5×106个iDC(n＝4/供体)共培养。八个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表54中示出。MHC I类不同供体中产生免疫反应的能力证明GBM疫苗可能在不同患者群体中引发CD8+T细胞反应，并且类别不限于具体MHC等位基因。在IFNγELISpot分析中，在第6天，从与DC的共培养物分离CD14-PBMC，并且用肽池(跨越天然蛋白质序列的重叠11个氨基酸的15聚体或跨越天然蛋白质序列的重叠9个氨基酸的15聚体)刺激24小时，接着检测产生IFNγ的细胞。肽的来源如下：EGFRvIII，重叠9个氨基酸的15聚体，购自Scientific Custom Peptide Service，MAGE A1(JPT，PM-MAGEA1和hCMV pp65(JPT，PM-PP65-1)。相较于未被修饰的GBM疫苗-B(225±64SFU)，在被修饰的GBM疫苗-B(1,323±442SFU)下对MAGEA1的IFNγ反应显著增加(p＝0.005，曼-惠特尼U检验)(n＝8)(图71I)。相较于未被修饰的GBM疫苗-B(165±93SFU)，在被修饰的GBM疫苗-B(855±231SFU)下EGFRvIII特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.049，曼-惠特尼U检验)(图71J)。相较于未被修饰的GBM疫苗-B(814±229SFU)，在被修饰的GBM疫苗-B(5,283±1,434SFU)下hCMV pp65特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.001，曼-惠特尼U检验)(图71K)。
GBM-疫苗A中对PSMA和TERT的免疫反应
在GBM-疫苗A的情况下评估对PSMA和TERT的IFNγ反应。具体来说，将5×105个被修饰的LN-229、GB-1和SF-126细胞系共1.5×106个被修饰的细胞与来自8个HLA不同的供体的1.5×106个iDC(n＝4/供体)共培养(表54)并且如上所述通过ELISpot测定IFNγ反应。PSMA肽，跨越天然抗原长度的重叠9个氨基酸的15聚体，购自Thermo Scientific CustomPeptide Service。覆盖全长天然抗原的TERT肽是购自JPT(PM-TERT)。相较于亲本未被修饰的GBM疫苗-A(231±102SFU)，在被修饰的GBM疫苗-A(1,284±258SFU)下TERT特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(n＝8)(图71G)。相较于亲本未被修饰的GBM疫苗-A(154±22SFU)，在被修饰的GBM疫苗-A(1,210±348SFU)下PSMA特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.028，曼-惠特尼U检验)(n＝8)(图71H)。
表54.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*03:01 | *18:01*38:01 | *07:01*12:03 |
| 2 | *03:01*25:01 | *07:02*18:01 | *07:02*12:03 |
| 3 | *02:01*24:02 | *08:01*44:02 | *05:01*07:01 |
| 4 | *02:01*03:01 | *08:01*51:01 | *07:01*14:02 |
| 5 | *02:05*31:01 | *27:25*50:01 | *07:01*07:02 |
| 6 | *23:01*24:02 | *35:03*55:01 | *27:25*50:01 |
| 7 | *30:02*30:04 | *15:10*58:02 | *03:04*06:02 |
| 8 | *03:01*32:01 | *07:02*15:17 | *07:01*07:02 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量各个组分细胞系和两种GBM疫苗混合物诱导针对相关GBM抗原的IFNγ产生的能力。将来自八个HLA不同的健康供体(表54)的PBMC与GBM-A或GBM-B混合物共培养6天，接着用负载含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池的自体DC刺激。用于刺激CD14-PBMC的肽的来源如下。对于PSMA、WT1和EGFRvIII，重叠9个氨基酸的15聚体的常规肽文库是从Pierce定购。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽池来源如下：TERT(JPT，PM-TERT)、MAGEA1(JPT，PM-MAGEA1)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、WT1(HER2(JPT，PM-ERB_ECD)、STEAP(PM-STEAP1)、MUC1(JPT，PM-MUC1)和hCMVpp65(JPT，PM-PP65-1)。接着在IFNγELISpot分析中分析细胞的IFNγ分泌。
大约60-70％发达国家人口为hCMV阳性(Hyun等人《免疫学前沿(Front.Immunol.)》2017)并且健康供体的hCMV状态未知。GBM疫苗中的hCMVpp65抗原有可能加强健康供体PBMC中预先存在的记忆反应并且未引发重新反应。出于此原因，对hCMV的反应与其它九种优先TAA分开显示并且不包括于图73、图74或表55中所示的TAA反应中。图71J中示出当用亲本对照或GBM疫苗刺激时供体PBMC中对hCMVpp65抗原的反应。相较于亲本对照，在八个供体中的七个中，在GBM疫苗下对pp65的IFNγ反应显著增加。具体来说，相较于亲本未被修饰的GBM疫苗-A(814±229SFU)，在被修饰的GBM疫苗-A(5,283±1,434SFU)的情况下KNS 60对hCMV pp65的表达显著增加pp65特异性IFNγ反应(p＝0.001，曼-惠特尼U检验)。
图73证明，相较于未被修饰的亲本对照(2,769±691SFU)，在八个HLA不同的供体中GBM疫苗能够诱导显著更稳固的抗原特异性IFNγ反应(17,316±4,171SFU)(p＝0.004，曼-惠特尼U检验)(n＝8)(图73A)。GBM疫苗-A和GBM疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应显著更大。具体来说，相较于未被修饰的对照(1,718±556SFU)，GBM疫苗-A引发7,716±2,308SFU(p＝0.038，曼-惠特尼U检验)(图73B)。对于GBM疫苗-A，排除hCMV(n＝9种抗原)，一个供体对四种抗原作出反应，三个供体对七种抗原作出反应，一个供体对八种抗原作出反应，并且三个供体对九种抗原作出反应。相较于亲本对照(1,051±365SFU)，GBM疫苗-B引发9,601±2,413SFU(p<0.001，曼-惠特尼U检验)(图73C)。对于GBM疫苗-B，排除hCMV(n＝9种抗原)，两个供体对七种抗原作出反应，三个供体对八种抗原作出反应，并且三个供体对九种抗原作出反应。在八个供体中的七个中GBM疫苗(疫苗-A和疫苗-B)诱导针对所有九种非病毒抗原的IFNγ产生(图74)(表55)。
表55.对未被修饰和被修饰的GBM疫苗组分的IFNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表56中示出用于多形性胶质母细胞瘤的包含来源于ATCC或JCRB的六种癌细胞系(LN-229(ATCC，CRL-2611)、GB-1(JCRB，IFO50489)、SF-126(JCRB，IFO50286)、DBTRG-05MG(ATCC，CRL-2020)、KNS 60(JCRB，IFO50357)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种胶质母细胞瘤细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53，ATCC CRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表56.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。已通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(LN-229)、modTERT(SF-126)、modMAGEA1(KNS 60)、EGFRvIII(KNS 60)和hCMVpp65(KNS 60)的基因。
实例30：结肠直肠癌(CRC)疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种CRC相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物CRC疫苗-A由细胞系HCT-15、也被修饰以表达modPSMA的细胞系HuTu-80和细胞系LS411N构成。第二混合物CRC疫苗-B由也被修饰以表达modTBXT、modWT1和KRAS突变G12D和G12V的细胞系HCT-116、细胞系RKO和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十种可提供抗CRC肿瘤反应的抗原。
结肠直肠疫苗组分的鉴别
使用初始细胞系选择标准鉴别出十六种疫苗组分细胞系，用于可能包括在CRC疫苗中。应用其它选择标准以将十六种候选细胞系缩小至八种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性CRC相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、CRC相关的CSC标记物ALDH1、c-myc、CD44、CD133、Nanog、Musashi-1、EpCAM、Lgr-5和SALL4的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、微卫星不稳定性和CRC组织学亚型。
CSC在结肠直肠癌的癌转移和复发中起关键作用(表2)。在2019年10月1日与2020年10月20日之间从以下可公开获得的数据库下载的患者肿瘤样品数据中证实CRC肿瘤表达九种CRC相关CSC标记物：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami,E.等人《癌症研究》2012.；Gao,J.等人《科学信号》2013.)(图75C)。HUGO基因命名委员会(HGNC)基因符号包括在搜索中并且针对各CSC标记物下载由RSEM正规化的mRNA丰度。在1,534个患者样品中，592个样品具有可供用于上述十种CSC标记物的mRNA表达数据。如果Log10(RSEM+1)>0，那么认为样品对于CRC CSC标记物的表达呈阳性。在592个样品内，0.8％表达8种CSC标记物(n＝5)，43.9％表达9种CSC标记物(n＝260)并且55.2％表达10种CSC标记物。
通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA和CSC标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA或CSC标记物下载mRNA表达。如果RNA-seq值(FPKM)超过一，那么细胞系对TAA或CSC标记物的表达视为阳性。基于上述选择标准，鉴别出十六种CRC疫苗候选组分中的九种，用于进一步评估：HCT-15、SW1463、RKO、HuTu80、HCT-116、LoVo、T84、LS411N和SW48。九种候选组分细胞系表达四种至八种CSC标记物(图75B)和七种至十二种TAA(图75A)。如本文所述，CSC样细胞系DMS 53作为6种细胞系之一包括并且表达十五种CRC TAA。
如实例9中所述，针对两个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估未被修饰的CRC组分细胞系候选物的免疫原性。供体1的HLA-A和HLA-B等位基因为A*02:01B*40:01和A*30:01B*57:01。供体2的HLA-A和HLA-B等位基因是A*24:02B*18:01和A*02:01B*15:07。HCT-15(2,375±774SFU)和LoVo(1,758±311SFU)比SW1463(170±90SFU)、RKO(280±102)、HuTu80(80±47)、HCT-116(981±433SFU)、T84(406±185SFU)、LS411N(496±213)和SW48(636±289SFU)免疫原性大(图76A)。如在本文中进一步描述，选择HCT-15和LoVo包括在疫苗混合物A或疫苗混合物B中。
在三种组分细胞系的八种不同组合中评估HCT-15和LoVo的免疫原性，四种组合含有HCT-15并且四种组合含有LoVo(图76C)。如实例8中所述，使用上述相同两个供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对八种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。检测所有八种混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应(图76B)。
如实例8和9中所述，通过IFNγELISpot测量相较于可能CRC疫苗混合物诱导针对各个细胞系的IFNγ反应的能力，各个CRC疫苗组分细胞系诱导针对自身的IFNγ反应的能力。图77中的数据证明混合物CRC-A、CRC-B、CRC-C、CRC-D、CRC-E、CRC-F、CRC-G和CRC-H(图76C)在一些状况下倾向于或为比各个组分细胞系显著更好的抗肿瘤免疫刺激剂，并且表明通过一次施用超过一种细胞系增加反应广度。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对CRC抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如CEA，以及已知对CRC和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。如本文中所示，为进一步增强TAA阵列，HuTu80被编码modPSMA的基因转导，并且HCT-116也被修饰以表达modTBXT、modWT1和分别跨越KRAS突变G12D和G12V，产生KRAS的活化突变形式的28个氨基酸，如本文所述。KRAS突变在大约35％至45％的CRC患者中出现。KRAS G12V和G12D是CRC患者中多个KRAS突变中最频繁出现的。
如下所述，PSMA在六种组分细胞系中的一种中以>1.0FPKM内源性表达。TBXT和WT1未在六种组分细胞系中的任一种中以>1.0FPKM内源性表达(图78A)。六种组分细胞系中的任一种未内源性表达KRAS突变G12D和G12V。使用cBioPortal测定KRAS突变的内源性表达。细胞系数据集用HGNC基因符号(KRAS)来搜索并且各细胞系在“突变”数据集内搜索。HCT-15和HCT-116内源性表达也在CRC肿瘤中经常表达的KRAS G13D突变。
本发明疫苗中代表性TAA的mRNA表达在图78A中示出。本发明疫苗高度表达所有鉴别的二十种通常靶向并且可能临床上相关的用于诱导GBM抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在CRC肿瘤中并且一些也可以诱导针对CRC和其它实体肿瘤的免疫反应。利用如上所述的可以利用的所有TAA的表达数据，在365个CRC患者样品中测定二十种优先CRC TAA的RNA丰度，以确定CSC标记物表达患者样品。100％样品表达优先CRC TAA中的十四种，94.5％样品表达15种TAA，65.8％样品表达16种TAA，42.2％样品表达17种TAA，25.8％样品表达18种TAA，11.5％样品表达19种TAA，并且1.4％样品表达20种TAA(图78B)。365个CRC患者肿瘤样品中的21.1％(n＝77)表达KRAS G12D(n＝40)或G12V(n＝37)突变。365个CRC患者肿瘤样品中的7.7％(n＝28)表达由两种组分细胞系内源性表达的KRAS G13D突变。因此，本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中该等细胞系的组合表达至少14种与意图接受该组合物的CRC癌症受试者的子集的癌症相关的TAA。
如本文所述，通过流式细胞术检测HuTu80对被转导的抗原modPSMA(SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38)的表达(图79A)和HCT-116对modTBXT(SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50)(图79B)和modWT1(SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50)的表达(图79C)。如本文中的实例29中所述，通过RT-PCR检测编码KRAS G12D(SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50)(图89D)和G12V(SEQ IDNO:49；SEQ ID NO:50)(图79D)的基因。将编码modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V的基因亚克隆至相同慢病毒转移载体中，由弗林蛋白酶裂解位点SEQ ID:X)分隔开。本文描述针对被转导的抗原的IFNγ产生。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表57中鉴别出的细胞系以包含本发明CRC疫苗。
表57.CRC疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
HCT-15、HuTu-80、LS411N、HCT-116、RKO和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受多轮FACS细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表58中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过99.6％的CD276阴性细胞。
表58.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如实例29中所述测定所得含量。CRC疫苗-A中的所有亲本细胞系分泌可测量含量的TGFβ1并且HuTu80也分泌可测量含量的TGFβ2。在CRC疫苗-B中的亲本细胞系中，HCT-116和RKO分泌可测量含量的TGFβ1。实例5中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上所述测定所得含量。
如实例29中所述，CRC来源的五种组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌并且增加膜结合的CD40L的表达。这些细胞用纯系名称DK2描述。随后HuTu80被编码TGFβ2 shRNA和GM-CSF(SEQ ID NO:6)的慢病毒颗粒转导(实例29)。这些细胞用纯系名称DK6描述。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌而不减少TGFβ1的分泌。这些细胞用纯系名称DK4描述。其余细胞系用TGFβ1 shRNA和TGFβ2 shRNA双重修饰。
表59展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。如果仅在ELISA分析中16个复制操作中的1个中检测到TGFβ1或TGFβ2分泌，那么报告的值无平均值的标准误差。基因修饰引起TGFβ1分泌减少至少49％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少51％。
表59.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的CRC疫苗-A和CRC疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表60中示出。CRC疫苗-A的TGFβ1分泌减少82％，并且TGFβ2减少95％皮克/剂量/24小时。CRC疫苗-B的TGFβ1分泌减少59％，并且TGFβ2减少49％皮克/剂量/24小时。
表60.CRC疫苗-A和CRC疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
HuTu80细胞系被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒含有TGFβ2 shRNA与在不同启动子控制下表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)。HCT-15、LS411N、HCT-116和RKO细胞系被慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例24中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表61中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少9,182倍。在CRC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.002纳克/106个细胞/24小时)，HCT-15的GM-CSF的分泌增加29,500倍，相较于亲本细胞系(≤0.011纳克/106个细胞/24小时)，HuTu80的GM-CSF的分泌增加9,182倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.004纳克/106个细胞/24小时)，LS411N的GM-CSF的分泌增加36,250倍。在CRC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，HCT-116的GM-CSF的分泌增加114,000倍，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，RKO的GM-CSF的分泌增加43,667倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.004纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53的GM-CSF的分泌增加39,450倍。
表61.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，CRC疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量154ng。CRC疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量316ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时470ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L。实例29中描述检测五种CRC细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述用于修饰DMS 53以表达CD40L的方法。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图80中所示和下文所述的结果证明在所有六种细胞CRC疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
图80展示CRC疫苗组分细胞系对膜结合的CD40L的表达。在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少669倍。在CRC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，HCT-15对CD40L的表达增加669倍(669MFI)，相较于亲本细胞系(5MFI)，HuTu80对CD40L的表达增加1,178倍(5,890MFI)，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，LS411N对CD40L的表达增加4,703倍(4,703)。在CRC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，HCT-116对CD40L的表达增加21,549倍，相较于亲本细胞系(0MFI)，RKO对CD40L的表达增加7,107倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表52中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少10,200倍。在CRC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，HCT-15的IL-12的分泌增加27,000倍，相较于亲本细胞系(≤0.005纳克/106个细胞/24小时)，HuTu80的IL-12的分泌增加10,200倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.002纳克/106个细胞/24小时)，LS411N的IL-12的分泌增加13,000倍。在CRC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，HCT-116对IL-12的表达增加186,000倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，RKO对IL-12的表达增加43,000倍。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表52.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，CRC疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量52ng。CRC疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量115ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时167ng。
HuTu80细胞系稳定表达modPSMA
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对CRC抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的HuTu80细胞系也被表达modPSMA抗原的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征modPSMA的表达。将被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2的分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12(抗原未被修饰)的细胞系和被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2的分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L、IL-12和modPSMA的细胞系在细胞内用0.06微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(AbCam ab268061，纯系FOLH1/3734)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色。自PSMA染色的细胞的MFI减去同型对照染色的PSMA未修饰和PSMA修饰的细胞的MFI。MFI相对于100,000个事件正规化。抗原表达增加倍数计算为：(减去背景的被修饰的MFI/减去背景的亲本MFI)。被修饰的细胞系(756,908MFI)中modPSMA的表达比PSMA未修饰的细胞系(82,993MFI)增加9.1倍(图79A)。
HCT-116细胞系稳定表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的HCT-116细胞系也被表达modTBXT、modWT1、KRAS G12V和KRAS G12D抗原的慢病毒颗粒转导。抗原未修饰的亲本和抗原修饰的细胞在细胞内染色以如下检测各抗原的表达。为检测modTBXT，首先将细胞用兔IgG1抗TBXT抗体(Abcamab209665，纯系EPR18113)(0.06微克/检验)染色，接着用AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(Biolegend#406414)(0.125微克/检验)染色。为检测modWT1，首先将细胞用兔IgG1抗WT1抗体(AbCam ab89901，纯系CAN-R9)(0.06微克/检验)染色，接着用AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(Biolegend#406414)(0.125微克/检验)染色。自针对TBXT或WT1染色的细胞的MFI减去同型对照染色细胞的MFI。MFI相对于100,000个事件正规化。抗原表达增加倍数计算为：(减去背景的被修饰的MFI/减去背景的亲本MFI)。被修饰的细胞系(356,691MFI)中modTBXT的表达比未被修饰的细胞系(0MFI)增加356,691倍(图79B)。自TBXT染色的未被修饰的HCT-116细胞系的MFI减去同型对照的MFI得到负值。使用1MFI计算被修饰的细胞系中TBXT表达的增加倍数。被修饰的细胞系(362,698MFI)对modWT1的表达比未被修饰的细胞系(5,235MFI)增加69.3倍(图79C)。
如实例29和本文中所述，使用RT-PCR测定HCT-116对KRAS G12D和KRAS G12V的表达。对于KRAS G12D，正向引物被设计成在转基因中的2786-2807碱基对(bp)位置(GAAGCCCTTCAGCTGTAGATGG(SEQ ID NO:124))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的2966-2984bp位置(CTGAATTGTCAGGGCGCTC(SEQ ID NO:125))处粘接并且得到199bp产物。对于KRAS G12V，正向引物被设计成在转基因中的2861-2882bp位置(CATGCACCAGAGGAACATGACC(SEQ ID NO:126))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的3071-3094bp位置(GAGTTGGATGGTCAGGGCAGAT(SEQ ID NO:127))处粘接并且得到238bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。分别在199bp和238bp预期尺寸下检测到KRASG12D和KRAS G12V的基因产物(图79D)。相对于亲本对照，KRAS G12D mRNA增加3,127倍并且KRAS G12V mRNA增加4,095倍(图79E)。
CRC-疫苗A中对PSMA的免疫反应
如实例29中所述，在四个HLA不同的供体(n＝4/供体)(表63供体1、3、5和6)中评估在CRC-疫苗A的情况下对PSMA的IFNγ反应，并且如下所述，通过ELISpot测定IFNγ反应。PSMA肽，跨越天然抗原序列的重叠9个氨基酸的15聚体，购自Thermo Scientific CustomPeptide Service。相较于亲本未被修饰的CRC疫苗-A(350±260SFU)，在被修饰的CRC疫苗-A(1,832±627SFU)下PSMA特异性IFNγ反应增加(n＝4)(图79F)。
CRC-疫苗B中对TBXT、WT1和KRAS突变的免疫反应
如实例29中所述，在四个HLA不同的供体(n＝4/供体)(表63供体1、3、5和6)中评估在CRC-疫苗B的情况下对TBXT、WT1、KRAS G12D和KRAS G12V抗原的IFNγ反应。肽的来源如下：TBXT(JPT，PM-BRAC)、WT1(JPT，PM-WT1)、KRAS G12D和KRAS G12V，重叠9个氨基酸的15聚体，购自Thermo Scientific Custom Peptide Service。相较于未被修饰的CRC疫苗-B(154±111SFU)，在被修饰的CRC疫苗-B(511±203SFU)下对TBXT的IFNγ反应增加(n＝4)(图79G)。相较于未被修饰的CRC疫苗-B(208±208SFU)，在被修饰的CRC疫苗-B(1,278±303SFU)下WT1特异性FNγ反应显著增加(p＝0.027，史都登氏T检验)(图79H)。相较于未被修饰的CRC疫苗-B(153±153SFU)，在被修饰的CRC疫苗-B(1,716±420SFU)下KRAS G12D特异性FNγ反应显著增加(p＝0.013，史都登氏T检验)(图79I)。相较于未被修饰的CRC疫苗-B(254±525SFU)，在被修饰的CRC疫苗-B(2,047±420SFU)下KRAS G12V特异性FNγ反应显著增加(p＝0.018，史都登氏T检验)(图79J)。
表63.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*03:01 | *08:01*51:01 | *07:01*14:02 |
| 2 | *30:02*30:04 | *15:10*58:02 | *03:04*06:02 |
| 3 | *01:01*30:01 | *08:01*13:02 | *06:02*07:01 |
| 4 | *03:01*25:01 | *17:02*18:01 | *07:02*12:03 |
| 5 | *02:05*29:02 | *15:01*44:03 | *03:04*16:01 |
| 6 | *02:01*03:01 | *18:01*31:08 | *07:01*12:03 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
如实例29中所述，使用来自六个HLA不同的健康供体的PBMC测量各个组分细胞系和两种CRC疫苗混合物诱导针对相关CRC抗原的IFNγ产生的能力(表63)。PSMA、WT1、TBXT、KRAS G12D和KRAS G12V的肽来源如上所述。其余抗原的肽来源如下：存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、PRAME(Miltenyi Biotech，130-097-286)、STEAP(PM-STEAP1)、TERT(JPT，PM-TERT)MUC1(JPT，PM-MUC1)和CEACAM(CEA)(JPT，PM-CEA)。接着在IFNγELISpot分析中分析细胞的IFNγ分泌。
图81证明，相较于未被修饰的亲本对照(6,470±3,361SFU)，在六个HLA不同的供体中CRC疫苗能够诱导显著更稳固的抗原特异性IFNγ反应(30,480±9,980SFU)(p＝0.009，曼-惠特尼U检验)(n＝8)(图81A)。CRC疫苗-A和CRC疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应显著更大。总体来说，相较于未被修饰的对照(3,665±1,849SFU)，CRC疫苗-A引发12,080±3,569SFU(p＝0.041，曼-惠特尼U检验)(图81B)。对于CRC疫苗-A，一个供体对五种抗原作出反应，一个供体对九种抗原作出反应，两个供体对十种抗原作出反应，并且两个供体对十一种抗原作出反应。相较于亲本对照(2,805±1,549SFU)，CRC疫苗-B(n＝11种抗原)引发15,417±4,127SFU(p＝0.004，曼-惠特尼U检验)(图81C)。对于CRC疫苗-B(n＝11种抗原)，一个供体对九种抗原作出反应，两个供体对十种抗原作出反应，并且三个供体对十一种抗原作出反应。在六个供体中的两个中CRC疫苗(疫苗-A和疫苗-B)诱导针对十种抗原的IFNγ产生并且在六个供体中的四个中诱导针对所有十一种抗原的IFNγ产生(图82)(表64)。因此，本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系(例如单位剂量的六种细胞系)，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物4.7倍的特异性针对至少十种在CRC患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。CRC疫苗A使针对至少五种TAA的IFNγ反应增加4.1倍并且CRC疫苗-B使针对至少九种TAA的IFNγ反应增加5.5倍。
相较于由各个被修饰的CRC细胞系组分诱导的反应，由CRC疫苗-A和CRC疫苗-B诱导的针对TAA的IFNγ反应更稳固。具体来说，CRC疫苗-A相关的针对十一种所分析抗原的反应(18,910±8,852SFU)超过由被修饰的HCT-15(11,255±6,354SFU)、HuTu80(7,332±2,814SFU)和LS411N(8,277±3,187SFU)诱导的反应。类似地，CRC疫苗-B相关的针对十一种所分析抗原的反应(17,635±6,056SFU)超过由被修饰的HCT-116(11,984±5,085SFU)和RKO(10,740±5,216SFU)(图83)诱导的反应。
表64.I由未被修饰和被修饰的CRC疫苗诱导的针对TAA的FNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表65中示出用于结肠直肠癌的包含来源于ATCC的六种癌细胞系(HCT-15(ATCC，CCL-225)、HuTu80(ATCC，HTB-40)、LS411N(ATCC，CRL-2159)、HCT-116(ATCC，CCL-247)、RKO(ATCC，CRL-2577)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种结肠直肠细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53，ATCC CRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表65.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除CD276的基因。通过慢病毒载体转导来添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(HuTu80)、modTBXT(HCT-116)、modWT1(HCT-116)、KRAS G12D(HCT-116)和KRAS G12V(HCT-116)的基因。
本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少两种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物CRC疫苗-A被修饰以增加一种TAAmodPSMA的表达，并且第二组合物CRC疫苗-B被修饰以表达四种TAA，modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V。单位剂量的六种癌细胞系表达CRC患者肿瘤中的至少十五种TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分4.7倍的IFNγ反应。
实例31：前列腺癌(PCa)疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种PCa相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物PCa疫苗-A由也被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2的细胞系PC3、细胞系NEC8和细胞系NTERA-2cl-D1构成。第二混合物PCa疫苗-B由也被修饰以表达modPSMA的细胞系DU145、细胞系LNCaP和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十二种可提供抗PCa肿瘤反应的抗原。
PCa疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出十六种疫苗组分细胞系，用于可能包括在PCa疫苗中。应用其它选择标准以将十四种候选细胞系缩小至六种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性PCa相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、细胞系来源于原发性肿瘤还是转移部位和组织学亚型。
通过来源于广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)和欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)的关于NCCIT、NEC8和NTERA-2cl-D1的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值超过一(CCLE，FPKM)或零(EMBL-EBI，TPM)，那么细胞系对TAA的表达视为阳性。基于上述选择标准，鉴别出十四种PCa疫苗候选组分中的六种，用于进一步评估：PC3、DU145、LNCaP、NCCIT、NEC8和NTERA-2cl-D1。六种候选组分细胞系表达十二至十九种TAA(图84)。如本文所述，CSC样细胞系DMS 53作为6种细胞系的一包括并且表达十六种PCa TAA。
如实例9中所述，针对四个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估未被修饰的PCa各个组分细胞系候选物的免疫原性。供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*02:01B*35:01和A*31:01B*35:03；供体2，A*02:02B*15:03和A*30:02B*57:03；供体3，A*02:01B*40:01和A*30:01B*57:01；供体4，A*24:02B*18:01和A*02:01B*15:07。PC3(3,409±672SFU)和DU145(1,497±231SFU)比LNCaP(428±204SFU)、NCCIT(25±11SFU)、NEC8(80±47SFU)和NTERA-2cl-D1(188±93SFU)免疫原性大(图86A)。NCCIT的免疫原性较差，因此无法进一步分析。如在本文中进一步描述，选择PC3和DU145分别包括在疫苗混合物A和疫苗混合物B中。
在三种组分细胞系的两种不同组合中评估五种所选PCa细胞系和CSC细胞系DMS53的免疫原性(图86C)。如实例8中所述，在五个HLA不同的健康供体中(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对两种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*02:01B*08:01和A*03:01B*51:01；供体2，A*30:02B*18:01和A*30:04B*58:02；供体3，A*02:01B*18:01和A*25:01B*27:05；供体4，A*03:01B*07:02和A*25:01B*18:01；供体5，A*02:01B*07:02和A*33:01B*14:02。检测混合物和各混合物中针对各细胞系组分的IFNγ反应。(图86B)。
如实例8和9中所述，还通过IFNγELISpot测量相较于可能PCa疫苗混合物诱导针对各个细胞系的IFNγ反应的能力，各个PCa疫苗组分细胞系诱导针对自身的IFNγ反应的能力。相较于单独细胞系的反应(283±101SFU)，对PCa-A中NEC8细胞系的IFNγ反应(1,963±863SFU)显著增加(曼-惠特尼U检验，p＝0.032)。类似地，相较于单独细胞系的反应(283±101SFU)，对PCa-A中NTERA-2cl-D1细胞系的IFNγ反应(630±280SFU)显著增加(曼-惠特尼U检验，p＝0.032)。相较于单独细胞系的反应(139±111SFU)，对PCa-B中LNCaP细胞系的IFNγ反应(624±254SFU)显著增加(曼-惠特尼U检验，p＝0.032)。图86D中的数据证明混合物PCa-A和PCa-B在一些状况下倾向于或为比各个组分细胞系显著更好的抗肿瘤免疫刺激剂，并且表明通过施用具有不同HLA超型的多种细胞系增加反应的广度和量值。具体来说，PCa-A细胞系是以下HLA超型：PC3、A01 A24和B07；NTERA-2cl-D1、A01、B08和B44.NEC8的HLA类型不可用。PCa-B细胞系是以下HLA超型：DU145、A03、B44和B58；LNCaP、A01、A02 B08、B44；DMS 53、A03、B08和B07。以上数据证明，构成混合物的细胞系的HLA错配可以提高对各个细胞系组分的免疫反应。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对PCa抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如PSA或PAP，以及已知对PCa和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。如本文所示，为进一步增强TAA阵列，DU145被编码modPSMA的基因转导并且PC3被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2。PSMA在六种组分细胞系中的三种中以>1.0FPKM或>0TPM内源性表达。TBXT和MAGEC2在六种组分细胞系中的两种中以>1.0FPKM或>0TPM内源性表达(图84)。
如实例29中和本文中所述，通过流式细胞术或RT-PCR检测PC3对被转导的抗原modTBXT(图87A)和modMAGEC2(图87B)的表达(SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46)和DU145对modPSMA的表达(SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38)(图87C)。编码modTBXT和modMAGEC2的基因在相同慢病毒转移载体中编码，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中二十二种代表性TAA的mRNA表达在图84中示出。NCCIT为图84中唯一不包括在本发明疫苗中的细胞系。本发明疫苗高度表达所有鉴别的二十二种通常靶向并且可能临床上相关的用于诱导PCa抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在PCa肿瘤中并且一些也可以诱导针对PCa和其它实体肿瘤的免疫反应。利用如实例29中所述的可以利用的所有TAA的表达数据，在460个PCa患者样品中测定二十二种优先PCa TAA的RNA丰度(图85A)。100％样品表达十八种优先PCa TAA，99.3％样品表达19种TAA，75.4％样品表达20种TAA，21.1％样品表达21种TAA，1.5％样品表达22种TAA(图85B)。本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中该等细胞系的组合表达至少18种与意图接受该组合物的PCa癌症受试者的子集的癌症相关的TAA。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表66中鉴别出的细胞系以包含本发明PCa疫苗。
表66.PCa疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU145、LNCaP和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表67中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过98.7％的CD276阴性细胞。
表67.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如实例29中所述测定所得含量。PCa疫苗-A中的PC3和NEC8亲本细胞系分泌可测量含量的TGFβ1。PC3也分泌可测量含量的TGFβ2。NEC8分泌相对低含量的TGFβ1并且不分泌可测量含量的TGFβ2。NTERA-2cl-D1不分泌可测量含量的TGFβ1或TGFβ2。在PCa疫苗-B中的亲本细胞系中，DU145分泌可测量但相对低含量的TGFβ1和TGFβ2，并且LNCaP不分泌可测量含量的TGFβ1或TGFβ2。实例26中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上所述测定所得含量。
如实例29中所述，PC3组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌并且增加膜结合的CD40L的表达，并且随后被编码TGFβ2 shRNA和GM-CSF的慢病毒颗粒(SEQ IDNO:6)转导实例29。这些细胞用纯系名称DK6描述。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌而不减少TGFβ1的分泌。这些细胞用纯系名称DK4描述。其余细胞系用TGFβ1 shRNA或TGFβ2 shRNA修饰。
表68展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。如果仅在ELISA分析中16个复制操作中的1个中检测到TGFβ1或TGFβ2分泌，那么报告的值无平均值的标准误差。基因修饰引起TGFβ1分泌减少82％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少51％。
表68.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的PCa疫苗-A和PCa疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表69中示出。PCa疫苗-A的TGFβ1分泌减少52％皮克/剂量/24小时，并且TGFβ2减少87％皮克/剂量/24小时。PCa疫苗-B的TGFβ2分泌减少26％皮克/剂量/24小时。
表69.PCa疫苗-A和PCa疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
PC3细胞系被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒含有TGFβ2 shRNA与在不同启动子控制下表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)。NEC8、NTERA-2cl-D1、DU145和LNCaP细胞系被慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例24中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表70中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少68倍。在PCa疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，PC3的GM-CSF的分泌增加67,987倍，相较于亲本细胞系(≤0.002纳克/106个细胞/24小时)，NEC-8的GM-CSF的分泌增加128,543倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.059纳克/106个细胞/24小时)，NTERA-2cl-D1的GM-CSF的分泌增加68倍。在PCa疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，DU145的GM-CSF的分泌增加119,645倍，相较于亲本细胞系(≤0.012纳克/106个细胞/24小时)，LNCaP的GM-CSF的分泌增加10,151倍，并且相较于亲本细胞系(≤004纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53的GM-CSF的分泌增加39,450倍。
表70.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，PCa疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量200ng。PCa疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量334ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时534ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L的载体。实例29中描述检测五种PCa细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述用于修饰DMS 53以表达CD40L的方法。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图88中所示和下文所述的结果证明在所有六种细胞PCa疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
图88中示出PCa疫苗细胞系对膜结合的CD40L的表达。在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少9,019倍。在PCa疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，PC3对CD40L的表达增加9,019倍(9,019MFI)，相较于亲本细胞系(0MFI)，NEC8对CD40L的表达增加11,571倍(11,571MFI)，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，NTERA-2cl-D1对CD40L的表达增加15,609倍(15,609MFI)。在PCa疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，DU145对CD40L的表达增加18,699倍，相较于亲本细胞系(0MFI)，LNCaP对CD40L的表达增加30,243倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表71中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少507倍。在PCa疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，PC3的IL-12的分泌增加42,727倍，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，NEC8的IL-12的分泌增加30,769倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.024纳克/106个细胞/24小时)，NTERA-2cl-D1的IL-12的分泌增加507倍。在PCa疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，DU145对IL-12的表达增加13,178倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.005纳克/106个细胞/24小时)，LNCaP对IL-12的表达增加3,901倍。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表71.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，PCa疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量40ng。PCa疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量19ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时59ng。
PC3细胞系稳定表达modTBXT和modMAGEC2
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的PC3细胞系也被表达modTBXT和modMAGEC2抗原的慢病毒颗粒转导。编码modTBXT和modMAGEC2抗原的基因由弗林蛋白酶裂解位点连接(SEQID NO:45、SEQ ID NO:46)。
通过流式细胞术表征PC3对modTBXT的表达。为检测modTBXT，首先将细胞在细胞内用兔IgG1抗TBXT抗体(Abcam ab209665，纯系EPR18113)(0.06微克/检验)染色，接着用AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(Biolegend#4406414)(0.125微克/检验)染色。被修饰的细胞系(1,209,613MFI)中modTBXT的表达比未被修饰的细胞系(0MFI)增加1,209,613倍(图87A)。如实例29和本文中所述，使用RT-PCR测定PC3对modMAGEC2的表达。正向引物被设计成在转基因中的604-631碱基对(bp)位置(GATCACTTCTGCGTGTTCGCTAACACAG(SEQ ID NO:128))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的1072-1094bp位置(CTCATCACGCTCAGGCTCTCGCT(SEQ ID NO:129))处粘接并且得到491bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物和所得产物。在预期尺寸下检测到MAGEC2的基因产物(图97B)。相对于亲本对照，modMAGEC2 mRNA增加3,914倍(图87B)。
DU145细胞系稳定表达modPSMA
被修饰以减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的DU145细胞系也被表达modPSMA抗原的慢病毒颗粒(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)转导。通过流式细胞术表征modPSMA的表达。抗原未修饰的亲本和抗原修饰的细胞在细胞内用0.06微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(AbCam ab268061，纯系FOLH1/3734)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色。被修饰的细胞系(249,632MFI)中modPSMA的表达比亲本细胞系(42,196MFI)增加6倍(图87C)。
PCa疫苗-A中对TBXT和MAGEC2的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体中，在被修饰的PCa疫苗-A的情况下，评估对TBXT和MAGEC2抗原的IFNγ反应。七个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表72中示出。通过ELISpot，使用跨越天然TBXT抗原全长重叠11个氨基酸的15聚体肽(JPT，PM-BRAC)，测定对TBXT的IFNγ反应。相较于未被修饰的PCa疫苗-A(73±70SFU)，在被修饰的PCa疫苗-B(605±615SFU)下对TBXT的IFNγ反应显著增加(p＝0.033，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图87D)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对MAGEC2的IFNγ反应。相较于未被修饰的PCa疫苗-B(SFU)，在被修饰的PCa疫苗-B(697±536SFU)下对MAGEC2的IFNγ反应显著增加(p＝0.018，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图87E)。
PCa-疫苗B中对PSMA的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体中，在PCa-疫苗B的情况下，评估对PSMA抗原的IFNγ反应(表72)。如实例29中所述通过ELISpot测定IFNγ反应。PSMA肽，跨越天然抗原序列的重叠9个氨基酸的15聚体，购自Thermo ScientificCustom Peptide Service。相较于亲本未被修饰的PCa疫苗-A(327±33SFU)，在被修饰的PCa疫苗-B(1,580±847SFU)下PSMA特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图87F)。
表72.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*03:01 | *08:01*51:01 | *07:01*14:02 |
| 2 | *30:02*30:01 | *15:10*58:02 | *03:04*06:02 |
| 3 | *03:01*32:01 | *07:02*15:17 | *07:01*07:02 |
| 4 | *03:01*25:01 | *07:02*18:01 | *07:02*12:03 |
| 5 | *02:01*33:01 | *07:02*14:02 | *07:02*08:02 |
| 6 | *01:01*30:01 | *08:01*13:02 | *06:02*07:01 |
| 7 | *26:01*68:02 | *08:01*15:03 | *03:04*12:03 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量两种PCa疫苗混合物诱导针对相关PCa抗原的IFNγ产生的能力。将来自七个HLA不同的健康供体(表72)的PBMC与PCA疫苗-A或PCa疫苗-B混合物共培养6天，接着用负载有含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池的自身DC刺激。在上文描述刺激CD14-PBMC以检测对TBXT、MAGEC2和PSMA的IFNγ反应的肽。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽池来源如下：TERT(JPT，PM-TERT)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、HER2(JPT，PM-ERB_ECD)、STEAP(PM-STEAP1)、MUC1(JPT，PM-MUC1)、PAP(JPT，PM-PAP)和PSA(JPT，PM-PSA)。接着在IFNγELISpot分析中分析细胞的IFNγ分泌
图89证明，相较于未被修饰的亲本对照(3,259±1,046SFU)，在七个HLA不同的供体中PCa疫苗能够诱导显著更稳固的针对十种PCa的抗原特异性IFNγ反应(19,982±5,480SFU)(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图89A)。在七个供体中的一个中，单位剂量的PCa疫苗-A和PCa疫苗-B引发针对八种抗原的IFNγ反应，并且在七个供体中的六个中，引发对十种抗原的IFNγ反应。PCa疫苗-A和PCa疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应显著更大。对于PCa疫苗-A，一个供体对三种抗原作出反应，一个供体对八种抗原作出反应，一个供体对九种抗原作出反应，并且四个供体对十种抗原作出反应。具体来说，相较于未被修饰的对照(1,430±911SFU)，PCa疫苗-A引发9,412±6,170SFU(p＝0.026，曼-惠特尼U检验)(图89B)。对于PCa疫苗-B，一个供体对六种抗原作出反应，三个供体对九种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。相较于亲本对照(1,830±371SFU)，PCa疫苗-B引发10,570±2,913SFU(p＝0.004，曼-惠特尼U检验)(图89C)。在七个供体中的一个中PCA疫苗(疫苗-A和疫苗-B)诱导针对九种抗原的IFNγ产生并且在七个供体中的六个中诱导针对所有十种抗原的IFNγ产生(图90)(表73)。以上描述两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，单位剂量的六种细胞系，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物6.1倍的特异性针对至少八种在PCA患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。PCA疫苗-A使对至少三种TAA的IFNγ反应增加6.6倍并且PCA疫苗-B使对至少六种TAA的IFNγ反应增加5.8倍。
如实例8和9中所述，对于四个HLA不同的供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot测量各个被修饰的PCa疫苗组分细胞系诱导针对匹配的未被修饰的细胞系组分的IFNγ反应的能力(表73供体1、2、4和5)。检测混合物和各混合物中的各被修饰的细胞系组分的针对亲本未被修饰的细胞系的IFNγ反应。相较于各个被修饰的细胞系，PCa疫苗-A和PCa疫苗-B倾向于使IFNγ产生增加，但此倾向并未达到统计显著性，可能因为用于进行所有比较的曼惠特尼U检验的供体数目低(n＝4)(图91A)。
在PCa疫苗-A与各个被修饰的细胞系组分之间，IFNγ产生存在显著差异(p＝0.036，克鲁斯卡尔沃利斯检验(Kruskal Wallis test))。具体来说，PCa疫苗-A诱导的IFNγ产生(5,685±2,060SFU)比被修饰的NTERA-2cl-D1(253±136)(p＝0.019)组分细胞系显著更大，但NEC8(1,151±735SFU)(p＝0.307)和PC3组分细胞系(1,898±947SFU)(p＝0.621)未如此(事后邓恩检验(post-hoc Dunn's test)用于多重比较)(图91B)。在PCa疫苗-B与各个被修饰的细胞系组分之间，IFNγ产生也存在显著差异(p＝0.006，克鲁斯卡尔沃利斯检验)。具体来说，PCa疫苗-B诱导的IFNγ产生(5,686±1,866SFU)比被修饰的LNCaP(240±122SFU)(p＝0.043)和DMS 53(222±113)(p＝0.028)组分细胞系显著更大，但DU145组分细胞系(1,943±1,291SFU)(p＝0.704)未如此(事后邓恩检验用于多重比较)。(图91C)。
对于构成PCa疫苗-A和PCa疫苗-B的各个被修饰的细胞系，测定上文所描述的相同四个供体针对十种PCa抗原的抗原特异性反应(表73供体1、2、4和5)。相较于由各个被修饰的PCa细胞系组分诱导的反应，由PCa疫苗-A和PCa疫苗-B诱导的针对TAA的IFNγ反应更稳固。具体来说，针对十种所分析抗原的PCa疫苗-A相关反应(9,412±6,170SFU)超过由被修饰的PC3(2,357±1,076SFU)、NEC8(3,491±1,196SFU)和NTERA-2cl-D1(1,381±429SFUSFU)诱导的反应。相较于各个被修饰的细胞系，PCa疫苗-A倾向于增加IFNγ产生，但此倾向于并未达到统计显著性，可能因为供体数目低(n＝4)(图100D)。PCa疫苗-B诱导的针对十种所分析抗原的反应(12,067±6,694SFU)显著不同于各个组分细胞系(p＝0.047，克鲁斯卡尔沃利斯检验)。具体来说，PCa疫苗-B抗原特异性反应比被修饰的DU145(2,064±1,604SFU)诱导的反应显著更大(p＝0.0345)，但LNCaP(1,419±189SFU)(p＝0.113)或DMS 53(2,615±1,044SFU)(p＝0.544)未如此(事后邓恩检验用于多重比较)(图91E)。总体来说，上述数据证明包含治疗有效量的三种癌细胞系的组合物诱导的针对未被修饰的亲本细胞系和PCa抗原的IFNγ反应比单个细胞系组合物更稳固。
表73.对未被修饰和被修饰的PCa疫苗组分的IFNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表74中示出用于前列腺癌的包含来源于ATCC或JCRB的六种癌细胞系(PC-3(ATCC，CRL-1435)、NEC-8(JCRB，JCRB0250)、NTERA-2cl-D1(ATCC，CRL-1973)、DU145(ATCC，HTB-81)、LNCaP(ATCC，CRL-2023)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种前列腺癌和睾丸癌细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53，ATCC CRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表74.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modTBXT(PC3)、modMAGEC2(PC3)和modPSMA(DU145)的基因。
因此，本实例提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少一种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物PCa疫苗-A被修饰以增加两种TAAmodTBXT和modMAGEC2的表达。第二组合物PCa疫苗-B被修饰以表达一种TAAmodPSMA。单位剂量的六种癌细胞系表达至少18种与意图接受该组合物的PCa癌症受试者的子集的癌症相关的TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分6.1倍的IFNγ反应。
实例32：膀胱癌(UBC)疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种UBC相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物UBC疫苗-A由也被修饰以表达modPSMA和modCripto1(modTDGF1)的细胞系J82、细胞系HT-1376和细胞系TCCSUP构成。第二混合物UBC疫苗-B由也被修饰以表达modWT1和modFOLR1(modFBP)的细胞系SCaBER、细胞系UM-UC-3和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十四种可提供抗UBC肿瘤反应的抗原。
UBC疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出二十六种疫苗组分细胞系用于可能包括在UBC疫苗中。应用其它选择标准以将二十六种细胞系缩小至八种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性UBC相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、UBC相关的CSC样标记物YAP1、ALDH1A、CD44、CEACAM6和Oct4的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、膀胱癌的部位和阶段和组织学亚型。
CSC在膀胱癌的癌转移、治疗抗性和复发中起关键作用(表2)。通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA和UBC特异性CSC样标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值超过一，那么细胞系对TAA或CSC标记物的表达视为阳性。选择标准鉴别出八种候选UBC疫苗组分用于进一步评估：UM-UC-3、J82、T24、HT-1376、HT-1197、TCCSUP、SCaBER和RT-4.八种候选组分细胞系表达九种至十七种TAA(图92A)和两种或三种CSC标记物(图92B)。如本文所述，CSC样细胞系DMS 53作为六种疫苗细胞系的一包括并且表达十五种UBC TAA和三种UBC CSC样标记物。
如实例9中所述，针对三个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估八种未被修饰的UBC疫苗组分候选物的免疫原性。供体1的HLA-A和HLA-B等位基因为A*02:01B*35:02和A*02:01B*49:01。供体2的HLA-A和HLA-B等位基因为A*32:01B*27:05和A*68:05B*39:08。供体3的HLA-A等位基因为A*01:01和A*03:01。HLA-B分型不可以用于供体3。J82(5,420±577SFU)、TCCSUP(3,504±702SFU)和SCaBER(2,903±654SFU)比UM-UC-3(1,022±284SFU)、T24(1,492±211SFU)、HT-1376(922±230SFU)、HT-1197(63±63SFU)和RT-4(13±13SFU)免疫原性大(图93A)。
在三种组分细胞系的八种不同组合中评估J82和TCCSUP的免疫原性，四种组合含有J82并且四种组合含有TCCSUP(图93C)。如实例8中所述，使用三个健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对八种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。供体1的HLA-A和HLA-B等位基因为A*01:01B*08:01和A*02:01B*15:01。供体2的HLA-A和HLA-B等位基因为A*03:01B*15:01和A*24:02B*07:02。HLA-分型仅可以用于供体3的一种HLA-A等位基因，其为A*02:01。供体3HLA-B等位基因为B*15:01和B*51:01。检测所有八种混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应。相较于针对单个细胞系组分所检测的IFNγ反应，针对各个混合物组分细胞系的反应显著减少(图93B)。在所有八种评估的组合中，TCCSUP保持最大免疫原性。单独和在三种细胞系组分混合物中HT-1197免疫原性差，因此不包括于UBC疫苗中。当在三种细胞系组分混合物中评估时J82、T24和SCaBER的免疫原性类似。在这三种细胞系中，T24内源性表达最小数目的TAA(九种TAA>1.0FPKM)(图92A)并且从UBC疫苗排除。选择J82和SCaBER，通过如上所述进行慢病毒转导来表达UBC抗原，并且置于单独疫苗混合物中以减轻当在相同疫苗混合物中递送时抗原竞争的任何可能性。如上文和本文中进一步描述，选择TCCSUP和J82包括在疫苗混合物A中并且选择SCaBER包括在疫苗混合物B中。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对UBC抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如Cripto1或DEPDC1，以及已知对UBC和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。如本文所示，为进一步增强TAA阵列，J82被修饰以表达modPSMA和modCripto1(TDGF1)并且SCaBER被修饰以表达modWT1和modFOLR1(FBP)。Cripto1(TDGF1)未在六种组分细胞系中的任一种中以>1.0FPKM内源性表达。PSMA、FOLR1(FBP)和WT1由六种组分细胞系中的任一种以>1.0FPKM内源性表达(图94A)。
如实例29中和本文中所述，通过流式细胞术或RT-PCR检测J82对被转导的抗原modPSMA(图95A)和modCripto1(modTDGF1)(图95B)的表达(SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54)和SCaBER对modWT1(图95C)和modFOLR1(modFBP)(图94D)的表达(SEQ ID NO:51；SEQ IDNO:52)。modPSMA和Cripto1(TDGF1)抗原在相同慢病毒转移载体中编码，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开(SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54)。在相同慢病毒转移载体中编码modWT1和modFOLR1(FBP)，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开(SEQ ID NO:52)。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中二十四种代表性UBC TAA的内源性mRNA表达在图94A中示出。在引入上述抗原之后，本发明疫苗表达所有鉴别的二十四种通常靶向并且可能临床上相关的能够诱导UBC抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在UBC肿瘤中并且一些也可以诱导针对UBC和其它实体肿瘤的免疫反应。如实例29中所述，利用可以利用的mRNA表达数据，在407个UBC患者样品中测定二十四种优先UBC TAA的RNA丰度(图94B)。100％样品表达优先UBC TAA中的十五种，99.3％样品表达16种TAA，96.8％样品表达17种TAA，90.7％样品表达18种TAA，80.3％样品表达19种TAA，68.6％样品表达20种TAA，56.3％样品表达21种TAA，41.3％样品表达22种TAA，27.5％样品表达23种TAA并且9.1％样品表达24种TAA(图94C)。因此，本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中该等细胞系的组合，即单位剂量的六种细胞系包含表达至少15种与意图接受该组合物的UBC癌症受试者的子集相关的TAA。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表75中鉴别出的细胞系以包含本发明UBC疫苗。
表75.膀胱疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表76中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过99.8％的CD276阴性细胞。
表76.CD276表达的减少
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如实例29中所述测定所得含量。UBC疫苗-A中的J82、HT-1376和TCCSUP亲本细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。J82分泌低含量的TGFβ1并且未被修饰成减少TGFβ1分泌。UBC疫苗-B的SCaBER和UM-UC-3组分细胞系分泌可测量含量的TGFβ1。SCaBER也分泌可测量含量的TGFβ2。实例26中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上文和本文中所述测定所得含量。
如实例29中所述，HT-1376、TCCSUP、SCaBER组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌，同时被转基因转导以增加膜结合的CD40L的表达。如实例29中所述，HT-1376、TCCSUP、SCaBER也被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。这些细胞用纯系名称DK6描述。如实例29中所述，UM-UC-3细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌并且同时增加膜结合的CD40L的表达。被修饰以减少TGFβ1的分泌而非TGFβ2的分泌的这些细胞用纯系名称DK2描述。如实例29中所述，J82被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌。被修饰以减少TGFβ2而非TGFβ1的分泌的J82和DMS 53细胞用纯系名称DK4描述。
表77展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。基因修饰引起TGFβ1分泌减少至少78％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少51％。
表77.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的UBC疫苗-A和UBC疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表78中示出。UBC疫苗-A的TGFβ1分泌减少93％皮克/剂量/24小时，并且TGFβ2减少95％皮克/剂量/24小时。UBC疫苗-B的TGFβ1分泌减少64％皮克/剂量/24小时，并且TGFβ2减少81％皮克/剂量/24小时。
表78.UBC疫苗-A和UBC疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
如上所述，HT-1376、TCCSUP、SCaBER和J82细胞系被慢病毒颗粒转导，该等慢病毒颗粒含有TGFβ2 shRNA与表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)。UM-UC-3细胞系被慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例24中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表79中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少2,700倍。UBC疫苗-A组分细胞系使GM-CSF的表达增加的倍数如下：相对于未被修饰的细胞系(≤0.010纳克/106个细胞/24小时)，J82增加2,700倍；相对于未被修饰的细胞系(≤0.030纳克/106个细胞/24小时)，HT-1376增加6,500倍；相对于未被修饰的细胞系(≤0.012纳克/106个细胞/24小时)，TCCSUP增加2,500倍。UBC疫苗-B组分细胞系使GM-CSF的表达增加的倍数如下：相对于未被修饰的细胞系(≤0.009纳克/106个细胞/24小时)，SCaBER增加12,556倍；相对于未被修饰的细胞系(≤0.008纳克/106个细胞/24小时)，UM-UC-3增加15,500倍；相对于未被修饰的细胞系(≤0.004纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53增加39,450倍。
表79.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，UBC疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量127ng。UBC疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量198ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时325ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L的载体。实例29中描述检测五种UBC细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述表达膜结合的CD40L的DMS 53修饰。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图96中所示和下文所述的结果证明在所有六种UBC疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少851倍。在UBC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，J82对CD40L的表达增加37,196倍(37,196MFI)，相较于亲本细胞系(44MFI)，HT-1376对CD40L的表达增加851倍(37,444MFI)，并且相较于亲本细胞系(188MFI)，TCCSUP对CD40L的表达增加1,062倍(199,687MFI)。在UBC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，SCaBER对CD40L的表达(13,772MFI)增加13,772倍，相较于亲本细胞系(0MFI)，UM-UC-3对CD40L的表达(11,301MFI)增加11,301倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表80中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少1,400倍。在UBC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.004纳克/106个细胞/24小时)，J82的IL-12的分泌增加3,500倍，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，HT-1376的IL-12的分泌增加609,000倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.005纳克/106个细胞/24小时)，TCCSUP的IL-12的分泌增加1,400倍。在UBC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.004纳克/106个细胞/24小时)，SCaBER对IL-12的表达增加6,750倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，UM-UC-3对IL-12的表达增加6,000。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表80.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，UBC疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量316ng。UBC疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量23ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时339ng。
J82细胞系稳定表达modPSMA和modCripto1(modTDGF1)
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的J82细胞系也被表达modPSMA和modCripto1抗原的慢病毒颗粒转导。编码modPSMA和modCripto1抗原的基因由弗林蛋白酶裂解位点连接(SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54)。
通过流式细胞术表征J82对modPSMA的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(Abcam，ab268061)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(BioLegend#405322)染色。被修饰的细胞系(249,632MFI)中modPSMA的表达比亲本细胞系(16,481MFI)增加60倍(图95A)。还通过流式细胞术表征J82对modCripto1的表达。首先将细胞在细胞内用兔IgG抗Cripto1抗体(Abcam，ab108391)(0.03微克/检验)染色，接着用AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)(0.125微克/检验)染色。被修饰的细胞系(3,330,400MFI)中modCripto1的表达比未被修饰的细胞系(13,042MFI)增加255倍(图94B)。
SCaBER细胞系稳定表达modWT1和modFOLR1(modFBP)
被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的SCaBER细胞系也被表达modWT1和modFOLR1抗原(SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征SCaBER对modWT1的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗兔IgG1抗WT1抗体(Abcam，ab89901)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(4,121,028MFI)对modWT1的表达比未被修饰的细胞系(46,012MFI)增加90倍(图94C)。如实例29和本文中所述，通过RT-PCR测定SCaBER对modFOLR1的表达。正向引物被设计成在转基因中的56-76bp位置(GAGAAGTGCAGACCAGAATCG(SEQ ID NO:130))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的588-609bp位置(TCTGCTGTAGTTGGACACCTTG(SEQ ID NO:131))处粘接，得到554bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。在预期尺寸下检测到modFOLR1的基因产物(图95D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加249,810倍。
UBC疫苗-A中对PSMA和Cripto1(TDGF1)的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在UBC疫苗-A的情况下对PSMA和Cripto1的IFNγ反应。七个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表81中示出。如实例29中所述通过ELISpot测定IFNγ反应。
相较于亲本未被修饰的UBC疫苗-A(450±179SFU，在被修饰的UBC疫苗-A下PSMA特异性IFNγ反应增加(757±278SFU)(图95E)。通过ELISpot，使用跨越天然Cripto1抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对Cripto1的IFNγ反应。相较于未被修饰的UBC疫苗-A(67±47SFU)，在被修饰的UBC疫苗-A下针对Cripto1的IFNγ反应显著增加(420±132SFU)(p＝0.023，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图95F)。
UBC疫苗-B中对WT1和FOLR1(FBP)的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在UBC疫苗-B的情况下对WT1和FOLR1的IFNγ反应(表81)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白质全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对WT1和FOLR1的IFNγ反应。相较于未被修饰的UBC疫苗-B(65±23SFU)，UBC疫苗-B使WT1特异性IFNγ反应显著增加(654±268SFU)(p＝0.017，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图95G)。相较于未被修饰的UBC疫苗-B(95±51SFU)，UBC疫苗-B使FOLR1特异性IFNγ反应显著增加(643±244SFU)(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图95H)。
表81.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*11:01 | *07:02*37:02 | *06:02*07:02 |
| 2 | *03:01*03:01 | *07:02*18:01 | *07:02*12:03 |
| 3 | *02:01*02:01 | *15:01*51:01 | *02:02*03:04 |
| 4 | *01:01*30:01 | *08:01*13:02 | *06:02*07:02 |
| 5 | *02:01*30:02 | *14:02*13:02 | *08:02*18:02 |
| 6 | *03:01*32:01 | *07:02*15:17 | *07:01*07:02 |
| 7 | *02:01*25:01 | *18:01*27:05 | *02:02*12:03 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量UBC疫苗-A和UBC疫苗-B诱导针对十种UBC抗原的IFNγ产生的能力。将来自七个HLA不同的健康供体(表81)的PBMC与负载有UBC疫苗-A或UBC疫苗-B的自身DC共培养6天，接着用含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池刺激。在上文描述用于刺激CD14-PBMC以检测针对PSMA、Cripto1、WT1和FOLR1的IFNγ反应的肽。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽来源的肽池如下：存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、MUC1(JPT，PM-MUC1)、MAGEA1(JPT，PM-MAGEA1)、MAGEA3(JPT，PM-MAGEA3)、TERT(JPT，PM-TERT)和STEAP1(PM-STEAP1)。
图97证明，在七个HLA不同的供体中UBC疫苗能够诱导针对十种UBC抗原的抗原特异性IFNγ反应，其相较于未被修饰的亲本对照(2,986±813SFU)稳固4.3倍(12,706±3,223SFU)(p＝0.007，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图97A)(表82)。在两个供体中单位剂量的UBC疫苗-A和UBC疫苗-B引发针对八种抗原的IFNγ反应，在一个供体中引发针对九种抗原的IFNγ反应，并且在四个供体中引发针对十种抗原的IFNγ反应(图98)。UBC疫苗-A和UBC疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应分别增加2.5倍和7.9倍。具体来说，相较于未被修饰的对照(2,027±573SFU)，UBC疫苗-A引发5,140±1,422SFU(图97B)。对于UBC疫苗-A，一个供体对四种抗原作出反应，一个供体对六种抗原作出反应，一个供体对七种抗原作出反应，一个供体对七种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。相较于亲本对照(959±331SFU)，UBC疫苗-B引发7,565±1,933SFU(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(图97C)。对于UBC疫苗-B，一个供体对四种抗原作出反应，一个供体对八种抗原作出反应，一个供体对九种抗原作出反应，并且四个供体对十种抗原作出反应。以上描述两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，单位剂量的六种细胞系，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物4.3倍的特异性针对至少八种在UBC患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。UBC疫苗-A使对至少四种TAA的IFNγ反应增加2.5倍并且UBC疫苗-B使对至少四种TAA的IFNγ反应增加7.9倍。
表82.对未被修饰和被修饰的UBC疫苗组分的IFNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表83中示出用于膀胱癌的包含来源于ATCC的六种癌细胞系(J82(ATCC，HTB-1)、HT-1376(ATCC，CRL-1472)、TCCSUP(ATCC，HTB-5)、SCaBER(ATCC，HTB-3)、UM-UC-3(ATCC，CRL-1749)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种膀胱癌细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53，ATCC CRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表83.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(J82)、modCripto1(modTDGF1)(J82)、modWT1(SCaBER)和modFOLR1(modFBP)(SCaBER)的基因。
因此，本实例提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少两种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物UBC疫苗-A被修饰以增加两种TAA modPSMA和modCripto1(modTDGF1)的表达。第二组合物UBC疫苗-B被修饰以表达两种TAAmodWT1和modFOLR1(modFBP)。单位剂量的六种癌细胞系表达至少15种与意图接受该组合物的膀胱癌受试者的子集的癌症相关的TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分4.3倍的IFNγ反应。
实例33：卵巢癌疫苗(OC)的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种OC相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物OC疫苗-A由细胞系OVTOKO、也被修饰以表达modTERT的细胞系MCAS和也被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10的细胞系TOV-112D构成。第二混合物OC疫苗-B由也被修饰以表达modWT1和modFOLR1(modFBP)的细胞系TOV-21G、也被修饰以表达modBORIS的细胞系ES-2和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十种可提供抗OC肿瘤反应的抗原。
OC疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出三十六种疫苗组分细胞系用于可能包括在OC疫苗中。应用本文所述的其它选择标准以将三十六种细胞系缩小至十种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性OC相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、OC相关的CSC样标记物ALDH1A、EPCAM、CD44、CD133、CD117、内皮糖蛋白、Oct4、NANOG和SAL4的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、细胞系来源于原发性肿瘤还是转移部位和卵巢组织学亚型。
CSC在卵巢癌的癌转移、治疗抗性和复发中起关键作用(表2)。通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA和CSC样标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA或CSC标记物下载mRNA表达。如果RNA-seq值超过一，那么细胞系对TAA或CSC标记物的表达视为阳性。选择标准鉴别出十种候选OC疫苗组分用于进一步评估：OVCAR-3、KURAMOCHI、MCAS、TYK-nu、OVSAHO、OVTOKO、TOV-21G、ES-2、OVMANA和TOV-112D。十种候选组分细胞系表达六种至十四种TAA(图99A)和两种至五种CSC样标记物(图99B)。如本文所述，CSC样细胞系DMS 53作为六种疫苗细胞系之一包括并且表达十二种OC TAA和五种OC CSC样标记物。
如实例9中所述，针对三个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估十种未被修饰的OC疫苗组分候选物的免疫原性。三个供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*02:01B*35:01和A*31:01B*35:03；供体2，A*01:01B*07:02和A*30:01B*12:02；供体3，A*02:01B*15:07和A*24:02B*18:01。KURAMOCHI(1,896±421SFU)、OVTOKO(2,124±591SFU)和TOV-21G(1,559±273SFU)比OVCAR-3(54±24SFU)、MCAS(420±218SFU)、TYK-nu(339±109SFU)、OVSAHO(404±163SFU)、ES-2(215±117SFU)、OVMANA(46±29)和TOV-112D(89±62)(图100A)免疫原性大。
在三种组分细胞系的十一种不同组合中评估KURAMOCHI、OVTOKO和TOV-21G的免疫原性，三种组合含有KURAMOCHI，四种组合含有OVTOKO并且四种组合含有TOV-21G(图100C)。归因于在本文所述的实验完成之前证实的由JCRB指出的低温保存后活力较差，OVMANA(JCRB，JCRB1045)不包括于十一种混合物中。如实例8中所述，针对三个健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对十一种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*02:01B*07:02和A*23:01B*14:02；供体2，A*32:01B*27:05和A*68:05B*39:08；供体3，A*02:02B*15:03和A*30:02B*57:03。检测所有十一种混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应。相较于针对单个细胞系所检测的反应，针对大部分混合物组分细胞系的IFNγ反应类似或显著增加。在所有评估的十一种组合中，KURAMOCHI、OVTOKO和TOV-21G保持最大免疫原性(图100B)。由于基于基因修饰之后的生长形态而可能存在大规模制造问题，故KURAMOCHI未被选择用于包括在最终OC疫苗中。如在本文中进一步描述，选择OVTOKO和TOV-21G分别包括在疫苗混合物A和疫苗混合物B中。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对OC抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如FOLR1或FSHR，以及已知对OC和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。
如本文所示，为进一步增强TAA阵列，MCAS被修饰以表达modTERT，TOV-112D被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10，TOV-21G被修饰以表达modWT1和modFOLR1(modFBP)并且ES-2被修饰以表达modBORIS。FSHR、MAGEA10、WT1、FOLR1和BORIS未在六种组分细胞系中以>1.0FPKM内源性表达。TERT藉六种组分细胞系中的两种以>1.0FPKM内源性表达(图101A)。
如实例29中和本文中所述，通过流式细胞术或RT-PCR检测MCAS对被转导的抗原modTERT的表达(图102A)(SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36)，TOV-112D对modFSHR(图112B)和modMAGEA10(图102C)的表达(SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:44)，TOV-21G对modWT1(图102D)和modFOLR1(modFBP)(图102E)的表达(SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52)和ES-2对modBORIS(图102F)的表达(SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60)。在相同慢病毒转移载体中编码modFSHR和modMAGEA10，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开。也在相同慢病毒转移载体中编码modWT1和modFOLR1，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中二十种代表性OC TAA的内源性mRNA表达在图101A中示出。在引入上述抗原之后，本发明疫苗表达所有鉴别的二十种通常靶向并且可能临床上相关的能够诱导OC抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在OC肿瘤中，诸如FOLR1(FBP)或FSHR，并且一些也可以诱导针对OC和其它实体肿瘤的免疫反应，诸如TERT。如实例29中所述，利用可以利用的mRNA表达数据，在307个OC患者样品中测定二十种优先OC TAA的RNA丰度(图101B)。100％样品表达优先OC TAA中的十五种，98.0％样品表达16种TAA，79.8％样品表达17种TAA，43.3％样品表达18种TAA，16.6％样品表达19种TAA，并且3.9％样品表达20种TAA(图101C)。因此，本实例提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中细胞系的组合，单位剂量的六种癌细胞系，包含表达至少15种与意图接受该组合物的OC癌症受试者的子集相关的TAA的细胞。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表84中鉴别出的细胞系来构成本发明OC疫苗。
表84.卵巢疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表85中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过98.1％的CD276阴性细胞。
表85.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和/或TGFβ2分泌含量并且如实例29中所述测定所得含量。OC疫苗-A中的OVTOKO、MCAS和TOV-112D亲本细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。OC疫苗-B的TOV-21G和ES-2组分细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。实例5中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上文和本文中所述测定所得含量。
如实例29中所述，MCAS、TOV-112D和ES-2组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌，同时被转基因转导以增加膜结合的CD40L的表达。如实例29中所述，MCAS、TOV-112D和ES-2也被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。这些细胞用纯系名称DK6描述。如实例29中所述，OVTOKO和TOV-21G细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌并且同时增加膜结合的CD40L的表达。被修饰以减少TGFβ1的分泌而非TGFβ2的分泌的这些细胞用纯系名称DK2描述。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌。被修饰以减少TGFβ2而非TGFβ1的分泌的J82和DMS 53细胞用纯系名称DK4描述。
用TGFβ1 shRNA修饰TOV-21G最初使TGFβ1分泌减少，但在进一步基因修饰之后，可能经由代偿机制来维持细胞增殖和存活，TGFβ1分泌增加。经TGFβ2 shRNA转导使得ES-2细胞系的TGFβ2分泌减少19％。如实例9中所述，在五个HLA不同的供体中，OC疫苗-B组分细胞系TOV-21G和ES-2的免疫原性与未被修饰的对照的免疫原性相比较。供体1-3的HLA-A和HLA-B等位基因描述于表74中。其它两个供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体7，A*03:01B*07:02和A*25:01B*18:01；和供体8，A*30:02B*15:10和A*30:04B*58:02。数据表明，TOV-21G OC疫苗B组分细胞系(4,390±517SFU)比未被修饰的TOV-21G(349±121SFU)免疫原性大(图103A)。数据进一步表明，OC疫苗B组分细胞系ES-2(1,505±394SFU)比未被修饰的ES-2(238±100SFU)免疫原性大(p＝0.016，曼-惠特尼U)(图103B)。上述数据表明经由多个修饰获得免疫学益处。
表86展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。如果仅在ELISA分析中16个复制操作中的1个中检测到TGFβ1或TGFβ2分泌，那么报告的值无平均值的标准误差。基因修饰引起TGFβ1分泌减少至少70％(排除TOV-21G)。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少19％。
表86.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用。
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的OC疫苗-A和OC疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表87中示出。OC疫苗-A的TGFβ1分泌减少85％皮克/剂量/24小时，并且TGFβ2减少94％皮克/剂量/24小时。OC疫苗-A的TGFβ1分泌减少31％皮克/剂量/24小时，OC疫苗-B的TGFβ2减少23％皮克/剂量/24小时。
表87.OC疫苗-A和OC疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
如上所述，MCAS、TOV-112D和ES-2细胞系被含有TGFβ2 shRNA和表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)的慢病毒颗粒转导。OVTOKO和TOV-21G细胞系被慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例26中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表87中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少656倍。在OC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，OVTOKO的GM-CSF的分泌增加656倍，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，MCAS的GM-CSF的分泌增加13,280倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.014纳克/106个细胞/24小时)，TOV-112D的GM-CSF的分泌增加1,875倍。在OC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，TOV-21G的GM-CSF的分泌增加426,660倍，相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，ES-2的GM-CSF的分泌增加22,047倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.003纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53的GM-CSF的分泌增加49,313倍。
表88.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，OC疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量36ng。OC疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量802ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时838ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L。实例29中描述检测五种OC细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述表达膜结合的CD40L的DMS 53修饰。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图104中所示和下文所述的结果证明在所有六种OC疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少288倍。在OC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，OVTOKO对CD40L的表达增加18,046倍(13,661MFI)，相较于亲本细胞系(17MFI)，MCAS对CD40L的表达增加1,068倍(18,150MFI)，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，TOV-112D对CD40L的表达增加288倍(288MFI)。随后TOV-112D进行分选以富集膜结合的CD40L的表达。在分选之后，相较于亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加728倍。使膜结合的CD40L的表达增加288倍的TOV-112D组分细胞系用于产生本文所述的并且在图104中示出。在OC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，TOV-21G对CD40L的表达增加18,874倍，相较于亲本细胞系(0MFI)，ES-2对CD40L的表达(2,823MFI)增加2,823倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达(88,261MFI)增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表89中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少1,739倍。在OC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0014纳克/106个细胞/24小时)，OVTOKO的IL-12的分泌增加35倍，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，MCAS的IL-12的分泌增加11倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.006纳克/106个细胞/24小时)，TOV-112D的IL-12的分泌增加1,739倍。在与被修饰的细胞系的IL-12分泌分开的实验中，测定未被修饰的TOV-112D细胞系对IL-12的表达。在OC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，TOV-21G对IL-12的表达增加137倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.001纳克/106个细胞/24小时)，ES-2对IL-12的表达增加43倍。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表89.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，OC疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量29ng。OC疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量32ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时61ng。
MCAS细胞系稳定表达modTERT
如上所述，本文所述的疫苗组分中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的MCAS细胞系也被表达modTERT抗原(SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征MCAS对modTERT的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗兔IgG抗TERT(Abcam ab32020)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(1,558,528MFI)中modTERT的表达比未被修饰的细胞系(227,724MFI)增加6.8倍(图102A)。
TOV-112D细胞系对modFSHR和modMAGEA10的稳定表达
被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的TOV-112D细胞系也被表达modFSHR和modMAGEA10抗原(SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44)的慢病毒颗粒转导。流式细胞术测定TOV-112D对modFSHR的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗小鼠IgG1抗FSHR抗体(Novus Biologicals，NBP2-36489)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(Biolegend#405322)染色。被修饰的细胞系(86,796MFI)中modFSHR的表达比未被修饰的细胞系(13,249MFI)增加6.6倍(图102B)。如实例29和本文中所述，通过RT-PCR测定TOV-112D对modMAGEA10的表达。正向引物被设计成在转基因中的24-50bp位置(ATGCATGCCCGAAGAGGACCTGCAGAG(SEQ ID NO:132))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的637-659bp位置(GCTCTGCACATCGGACAGCAT(SEQ ID NO:133))处粘接，得到634bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。在预期尺寸下检测到modMAGEA10的基因产物(图102D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加141,476倍。
TOV-21G细胞系稳定表达modWT1和modFOLR1(modFBP)
被修饰以减少TGFβ1分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的TOV-21G细胞系也被表达modWT1和modFOLR1抗原(SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征TOV-21G对modWT1的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗兔IgG1抗WT1抗体(Abcam，ab89901)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(687,582MFI)对modWT1的表达比未被修饰的细胞系(140,770MFI)增加4.9倍(图102C)。
如实例29和本文中所述，通过RT-PCR测定TOV-21G对modFOLR1的表达。正向引物被设计成在转基因中的56-76bp位置(GAGAAGTGCAGACCAGAATCG(SEQ ID NO:130))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的588-609bp位置(TCTGCTGTAGTTGGACACCTTG(SEQ ID NO:131))处粘接，得到554bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。在预期尺寸下检测到modFOLR1的基因产物(图102E)，并且相对于亲本对照，mRNA增加170,855倍。
ES-2细胞系稳定表达modBORIS
被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的ES-2细胞系也被表达modBORIS抗原(SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60)的慢病毒颗粒转导。如实例29和本文中所述，通过RT-PCR测定ES-2对modBORIS的表达。正向引物被设计成在转基因中的1119-1138bp位置(TTCCAGTGCTGCCAGTGTAG(SEQ ID NO:134))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的1559-1578bp位置(AGCACTTGTTGCAGCTCAGA(SEQ ID NO:135))处粘接，得到460bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。在预期尺寸下检测到modBORIS的基因产物(图102F)，并且相对于亲本对照，mRNA增加4,196倍。
OC疫苗-A中对TERT的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在OC疫苗-A的情况下对TERT的IFNγ反应。七个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表90中示出。如实例29中所述通过ELISpot测定IFNγ反应。通过ELISpot，使用跨越天然TERT抗原全长重叠11个氨基酸的15聚体肽(JPT，PM-TERT)，测定对TERT的IFNγ反应。相较于未被修饰的OC疫苗-A(707±314SFU)，在被修饰的OC疫苗-A(1047±313SFU)下对TERT的IFNγ反应增加，但未达到统计显著性(n＝7)(图102G)。
OC疫苗-A中对FSHR和MAGEA10的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在OC疫苗-A的情况下对FSHR和MAGEA10的IFNγ反应。七个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表90中示出。如实例29中所述通过ELISpot测定IFNγ反应。通过ELISpot，使用跨越天然FSHR抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom PeptideService)，测定对FSHR的IFNγ反应。相较于亲本未被修饰的OC疫苗-A(709±482SFU)，由被修饰的OC疫苗-A(3,379±1,923SFU)诱导的FSHR特异性IFNγ反应增加，但未达到统计显著性(n＝7)(图102H)。通过ELISpot，使用跨越天然MAGEA10抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对MAGEA10的IFNγ反应。相较于未被修饰的OC疫苗-A(630±156SFU)，在被修饰的OC疫苗-A(893±495SFU)下对MAGEA10的IFNγ反应增加，但未达到统计显著性(n＝7)(图102I)。
OC疫苗-B中对WT1和FOLR1(FBP)的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在OC疫苗-B的情况下对WT1和FOLR1的IFNγ反应(表90)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白质全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对WT1和FOLR1(FBP)的IFNγ反应。相较于未被修饰的OC疫苗-B(132±74SFU)，OC疫苗-B使WT1特异性IFNγ反应增加(516±241SFU)(n＝7)，但未达到统计显著性(n＝7)(图102K)。相较于未被修饰的OC疫苗-B(168±65SFU)，OC疫苗-B使FOLR1(FBP)特异性IFNγ反应增加(467±175SFU)，但未达到统计显著性(n＝7)(图102J)。
OC疫苗-B中对BORIS的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在七个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在OC疫苗-B的情况下对BORIS的IFNγ反应(表90)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白质全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定针对BORIS的IFNγ反应。相较于未被修饰的OC疫苗-B(121±65SFU)，OC疫苗-B使BORIS特异性IFNγ反应显著增加(2,234±1,011SFU)(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(n＝7)(图102L)。
表90.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*24:02 | *08:01*44:02 | *05:01*07:01 |
| 2 | *02:01*25:01 | *18:01*27:05 | *02:02*12:03 |
| 3 | *02:01*33:01 | *07:02*14:02 | *07:02*08:02 |
| 4 | *02:01*02:01 | *15:01*51:01 | *02:02*03:04 |
| 5 | *01:01*30:01 | *08:01*13:02 | *06:02*07:01 |
| 6 | *02:01*03:01 | *07:02*44:03 | *07:02*16:01 |
| 7 | *29:02*31:01 | *40:01*55:01 | *03:04*16:01 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量OC疫苗-A和OC疫苗-B诱导针对十种OC抗原的IFNγ反应的能力。将来自七个HLA不同的健康供体(表90)的PBMC与负载有OC疫苗-A或OC疫苗-B的自身DC共培养6天，接着用含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池刺激。在上文描述用于刺激CD14-PBMC以检测针对TERT、FSHR、MAGEA10、WT1、FOLR1和BORIS的IFNγ反应的肽。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽的肽池来源如下：MSLN(GeneScript常规文库)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、PRAME(JPT，PM-OIP4)和STEAP1(PM-STEAP1)。
图105证明，在七个HLA不同的供体中OC疫苗能够诱导针对十种OC抗原的抗原特异性IFNγ反应，其相较于未被修饰的亲本对照(7,495±2,317)稳固3.3倍(24,942±10,138SFU)(n＝7)(图105A)(表91)。在一个供体中单位剂量的OC疫苗-A和OC疫苗-B引发针对七种抗原的IFNγ反应，在两个供体中引发针对九种抗原的IFNγ反应，并且在四个供体中引发针对十种抗原的IFNγ反应(图106)。OC疫苗-A和OC疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应分别增加2.2倍和6.1倍。具体来说，相较于未被修饰的对照(5,385±1,892SFU)，OC疫苗-A引发12,116±5,813SFU(图105B)。对于OC疫苗-A，一个供体对六种抗原作出反应，两个供体对七种抗原作出反应，两个供体对八种抗原作出反应，一个供体对七种抗原作出反应，并且两个供体对十种抗原作出反应。相较于亲本对照(2,110±529SFU)，OC疫苗-B引发12,826±4,780SFU(p＝0.011，曼-惠特尼U检验)(图105C)。对于OC疫苗-A，一个供体对六种抗原作出反应，一个供体对七种抗原作出反应，两个供体对八种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。因此，本实例提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，单位剂量的六种细胞系，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物3.3倍的特异性针对至少七种在OC患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。OC疫苗-A使对至少六种TAA的IFNγ反应增加2.2倍并且OC疫苗-B使对至少六种TAA的IFNγ反应增加6.1倍。
表91.对未被修饰和被修饰的OC疫苗组分的IFNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表92中示出用于卵巢癌的包含来源于ATCC或JCRB的六种癌细胞系(OVTOKO(JCRB，JCRB1048)、MCAS(JCRB，JCRB0240)、TOV-112D(ATCC，CRL-11731)、TOV-21G(ATCC，CRL-11730)、ES-2(ATCC，CRL-1978)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种卵巢癌细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表92.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modTERT(MCAS)、modFSHR(TOV-112D)、modMAGEA10(TOV-112D)、modWT1(TOV-21G)、modFOLR1(modFBP)(TOV-21G)和modBORIS(ES-2)的基因。
本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少一种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物OC疫苗-A被修饰以增加三种TAA modhTERT、modFSHR和modMAGEA10的表达。第二组合物OC疫苗-B被修饰以表达三种TAA modWT1、modFOLR1(modFBP)和modBORIS。单位剂量的六种癌细胞系表达至少15种与意图接受该组合物的卵巢癌受试者的子集的癌症相关的TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分2.2倍的IFNγ反应。
实例34：鳞状细胞头颈癌(SCCHN)癌症疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种HN相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物HN疫苗-A由也被修饰以表达modPSMA的细胞系HSC-4、也被修饰以表达modPRAME和modTBXT的细胞系HO-1-N-1、和细胞系DETROIT 562构成。第二混合物HN疫苗-B由也被修饰以表达HPV16和HPV18 E6/E7的细胞系KON、细胞系OSC-20和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十种和至少二十四种可提供抗HN肿瘤反应的非病毒抗原。
HN疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出三十五种疫苗组分细胞系用于可能包括在HN疫苗中。应用本文所述的其它选择标准以将三十五种细胞系缩小至六种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性HN相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、相关CSC样标记物CD44、cMET、ABCG2、LRG5、ALDH1和BMI-1的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、HN癌症的主要部位和阶段和细胞系来源于的部位(原发性或转移性)。
CSC在头颈癌的癌转移、治疗抗性和复发中起关键作用(表2)。通过来源于广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)和欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)的RNA表达数据(OSC-20、HO-1-N-1和KON)确定候选组分细胞系对TAA和CSC样标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值超过一(CCLE，FPKM)或零(EMBL-EBI，TPM)，那么细胞系对TAA或CSC样标记物的表达视为阳性。选择标准鉴别出六种候选HN疫苗组分用于进一步评估：DETROIT562、SCC-9、HSC-4、OSC-20、HO-1-N-1和KON。六种候选组分细胞系表达九种至十七种TAA(图107A)和四种至六种CSC样标记物(图107B)。如本文所述，CSC样细胞系DMS53作为六种疫苗细胞系的一包括并且表达十五种HN TAA和三种HN CSC样标记物。
如实例9中所述，针对三个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估六种未被修饰的HN疫苗组分候选物的免疫原性。三个供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*01:01B*08:01和A*02:01B*15:01；供体2，A*03:01B*15:01和A*24:02B*07:02；供体3，A*01:01B*07:02和A*30:01B*12:02。KON(1,645±215SFU)和HSC-4(1,124±394SFU)比DETROIT 562(372±132SFU)、SCC-9(0±0SFU)、OSC-20(985±265SFU)和HO-1-N-1(486±137SFU)(图109A)具有免疫原性。SCC-9的免疫原性较差，无法进行进一步分析。如在本文中进一步描述，选择HSC-4和KON分别包括在疫苗混合物A和疫苗混合物B中。
在三种组分细胞系的两种不同组合中评估五种所选HN细胞系和CSC样细胞系DMS53的免疫原性(图109C)。如实例8中所述，在五个HLA不同的健康供体中(n＝4/供体)(表99，供体1-3、5和6)，通过IFNγELISpot，测定针对两种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。检测混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应(图109B)。如实例8和9中所述，还通过IFNγELISpot测量相较于可能HN疫苗混合物诱导针对各个细胞系的IFNγ反应的能力，各个HN疫苗组分细胞系诱导针对自身的IFNγ反应的能力。除HSC-4以外，相较于对单独细胞系的反应，针对疫苗混合物中所包括的各HN细胞系的IFNγ反应倾向于增加(图109D)。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对HN抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如NUF2或PSMA，以及已知对HN和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。另外，六种细胞系之一也被修饰以表达HPV16和18病毒抗原E6和E7，因为约25-50％HNC为HPV驱动的并且高危病毒株HPV16和HPV18影响全世界大部分(约85％)HPV+HNC病例。病毒肿瘤蛋白E6和E7代表免疫疗法的良好目标，因为肿瘤细胞不断表达其并且其为维持HPV+癌细胞的转型状态所必需的。如本文所示，为进一步增强TAA和HPV病毒抗原的阵列，HSC-4被修饰以表达modPSMA，HO-1-N-1被修饰以表达modPRAME和modTBXT，并且KON被修饰以表达HPV16和HPV18 E6/E7。TBXT在六种组分细胞系中不以>1.0FPKM或>0TPM内源性表达。根据ATCC或JCRB提供的产品信息，HN疫苗组分细胞系不表达HPV16 E6/E7或HPV18 E6/E7。HPV 16或18病毒抗原的表达数据无法在CCLE或EMBL中获得。PSMA由六种组分细胞系中的一种以>1.0FPKM或>0TPM内源性表达。PRAME未由六种组分细胞系中的两种以>1.0FPKM或>0TPM内源性表达。(图107A)。
如实例29中和本文中所述，通过流式细胞术或RT-PCR检测HSC-4对被转导的抗原modPSMA(图110A)的表达(SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38)，HO-1-N-1对modPRAME(图110B)和TBXT(图120C)的表达(SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:66)，和KON对HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7(图110D)的表达(SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:68)。在相同慢病毒转移载体中编码modPRAME和modTBXT抗原，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开(SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66)。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中二十种代表性HN TAA的内源性mRNA表达在图107A中示出。SCC-9为图107中唯一不包括在本发明疫苗中的细胞系。在引入上述抗原之后，本发明疫苗表达所有鉴别的二十种通常靶向并且可能临床上相关的能够诱导HN抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在HN肿瘤中并且一些也可以诱导针对HN和其它实体肿瘤的免疫反应。如实例29中所述，利用可以利用的mRNA表达数据，在515个HN患者样品中测定二十四种优先HNTAA的RNA丰度(图108A)。100％样品表达优先TAA中的十四种，97.5％样品表达15种TAA，89.5％样品表达16种TAA，79.8％样品表达17种TAA，61.0％样品表达18种TAA，35.1％样品表达19种TAA，并且10.9％样品表达20种TAA(图108B)。本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中该等细胞系的组合，即单位剂量的六种细胞系包含表达至少14种与意图接受该组合物的HN癌症受试者的子集相关的TAA。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表93中鉴别出的细胞系来构成本发明HN疫苗。
表93.头颈疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-2和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表94中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过98.9％的CD276阴性细胞。
表94.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如实例29中所述测定所得含量。HN疫苗-A中的HSC-4、HO-1-N-1和DETROIT 562亲本细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。HN疫苗-B的KON和OSC-2组分细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。OSC-2分泌低含量的TGFβ1并且未被修饰成减少TGFβ1分泌。实例26中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上文和本文中所述测定所得含量。
如实例29中所述，HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562和组分KON细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌并且同时增加膜结合的CD40L的表达。如实例29中所述，HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562和KON也被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。这些细胞用纯系名称DK6描述。HSC-4用TGFβ1shRNA修饰最初减少TGFβ1的分泌。随后HSC-4用TGFβ2 shRNA修饰减少TGFβ2的分泌，但产生与亲本细胞系类似的TGFβ1分泌含量(表95)。TGFβ1和TGFβ2促进细胞增殖和存活并且保留一些TGFβ信号传导可能是一些细胞系增殖和存活所必需的。如实例9中所述，在五个HLA不同的供体(表99，供体1-3、5和6)中评估各个未被修饰和被修饰的HN细胞疫苗细胞系组分的免疫原性。尽管分泌与未被修饰的细胞系类似的TGFβ1含量，但被修饰的HSC-4细胞系保持比未被修饰的细胞系(400±183SFU)更大免疫原性(1,108±628SFU)(图109E)。在HSC-4细胞系中在TGFβ2减少之后TGFβ1分泌增加可能是一种代偿存活机制。如实例29中所述，OSC-20被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。随后OSC-20被慢病毒颗粒转导以增加膜结合的CD40L的表达。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌。被修饰以减少TGFβ2而非TGFβ1的分泌的OCS-20和DMS 53细胞用纯系名称DK4描述。
表95展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。基因修饰引起TGFβ1分泌减少至少79％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少51％。
表95.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的HN疫苗-A和HN疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表96中示出。HN疫苗-A的TGFβ1分泌减少61％，并且TGFβ2减少93％皮克/剂量/24小时。HN疫苗-B的TGFβ1分泌减少67％，并且TGFβ2减少75％皮克/剂量/24小时。
表96.HN疫苗-A和HN疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
如上所述，HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562和KON细胞系被含有TGFβ2 shRNA和表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)的慢病毒颗粒转导。如实例26中和本文中其它地方所述，DMS53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表96中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少9,578倍。在HN疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0042纳克/106个细胞/24小时)，HSC-4的GM-CSF的分泌增加53,794倍，相较于亲本细胞系(≤0.0039纳克/106个细胞/24小时)，HO-1-N-1的GM-CSF的分泌增加13,703倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0038纳克/106个细胞/24小时)，DETROIT 562的GM-CSF的分泌增加13,235倍。在HN疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0047纳克/106个细胞/24小时)，KON的GM-CSF的分泌增加14,867倍，相较于亲本细胞系(≤0.0039纳克/106个细胞/24小时)，OSC-2的GM-CSF的分泌增加9,578倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0032纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53的GM-CSF的分泌增加49,313倍。
表97.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，HN疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量165ng。HN疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量133ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时298ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L的载体。实例29中描述检测五种HN细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述表达膜结合的CD40L的DMS 53修饰。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图111中所示和下文所述的结果证明在所有六种HN疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少2,144倍。在HN疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，HSC-4对CD40L的表达增加18,046倍(18,046MFI)，相较于亲本细胞系(0MFI)，HO-1-N-1对CD40L的表达增加9,796倍(9,796MFI)，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DETROIT 562对CD40L的表达增加18,374倍(18,374MFI)。在HN疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，KON对CD40L的表达增加15,603倍，相较于亲本细胞系(19MFI)，OSC-20对CD40L的表达(40,738MFI)增加2,144倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表98中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少11,274倍。在HN疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0017纳克/106个细胞/24小时)，HSC-4的IL-12的分泌增加148,017倍，相较于亲本细胞系(≤0.0016纳克/106个细胞/24小时)，HO-1-N-1的IL-12的分泌增加33,271倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0015纳克/106个细胞/24小时)，DETROIT 562的IL-12的分泌增加21,272倍。在HN疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0019纳克/106个细胞/24小时)，KON对IL-12的表达增加11,274倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0016纳克/106个细胞/24小时)，OSC-2对IL-12的表达增加22,641倍。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表98.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，HN疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量167ng。HN疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量29ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时196ng。
HSC-4细胞系稳定表达modPSMA
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的HSC-4细胞系也被表达modPSMA抗原(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)的慢病毒颗粒转导。
通过流式细胞术表征HSC-4对modPSMA的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(Abcam，ab268061)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(BioLegend#405322)染色。被修饰的细胞系(4,473,981MFI)中modPSMA的表达比亲本细胞系(174,545MFI)增加25倍(图110A)。
HO-1-N-1细胞系稳定表达modPRAME和modTBXT
被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的HO-1-N-1细胞系也被表达modPRAME和modTBXT抗原(SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征HO-1-N-1对modPRAME的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.015微克/检验抗小鼠IgG1抗PRAME抗体(Thermo Scientific，MA5-31909)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(BioLegend#405322)染色。被修饰的细胞系(290,436MFI)中modPRAME的表达比未被修饰的细胞系(10,846MFI)增加27倍(图110B)。还通过流式细胞术表征HO-1-N-1对modTBXT的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.06微克/检验兔抗TBXT抗体(Abcam，ab209665)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(3,338,324MFI)中modTBXT的表达比未被修饰的细胞系(0MFI)增加3,338,324倍(图110C)。
KON细胞系稳定表达HPV16 E6/E7 HPV18 E6/E7
被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的KON细胞系也被表达HPV16和HPV18 E6和E7抗原(SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68)的慢病毒颗粒转导。如实例29中和本文中所述，通过RT-PCR测定KON对HPV16和HPV18 E6/E7的表达。检测HPV16 E6的正向引物被设计成在转基因中的33-54bp位置(CCCTCAAGAGAGGCCCAGAAAG(SEQ ID NO:136))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的160-182bp位置(TACACGATGCACAGGTCCCGGAA(SEQ ID NO:137))处粘接，得到150bp产物。在预期尺寸下检测到HPV16 E6的基因产物(图110D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加8,422倍。检测HPV16 E7的正向引物被设计成在转基因中的1-21bp位置(CACGGCGATACCCCTACACTG(SEQ ID NO:138))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的228-250bp位置(CCATCAGCAGATCTTCCAGGGTT(SEQ ID NO:139))处粘接，得到250bp产物。在预期尺寸下检测到HPV16 E7的基因产物(图110D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加7,816倍。检测HPV18 E6的正向引物被设计成在转基因中的59-81bp位置(TGAACACCAGCCTGCAGGACATC(SEQ ID NO:140))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的287-312bp位置(GCATCTGATGAGCAGGTTGTACAGGC(SEQ ID NO:141))处粘接，得到254bp产物。在预期尺寸下检测到HPV18 E6的基因产物(图110D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加1,224倍。检测HPV18E7的正向引物被设计成在转基因中的74-97bp位置(TGTGCCATGAGCAGCTGTCCGACT(SEQ IDNO:142))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的232-254bp位置(AAGGCTCTCAGGTCGTCGGCAGA(SEQ ID NO:143))处粘接，得到181bp产物。在预期尺寸下检测到HPV18 E7的基因产物(图110D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加1,684倍。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。
HN疫苗-A中对PSMA的免疫反应
如实例32中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在HN疫苗-A的情况下对PSMA的IFNγ反应。七个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表99中示出。如实例29中所述通过ELISpot测定IFNγ反应。相较于亲本未被修饰的HN疫苗-A(637±369SFU，在被修饰的HN疫苗-A(1,433±479SFU)下PSMA特异性IFNγ反应增加(图110E)。
HN疫苗-A中对PRAME和TBXT的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在HN-疫苗A的情况下对PRAME和FOLR1的IFNγ反应(表99)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白质PRAME全长重叠11个氨基酸的15聚体肽(JPT，PM-OIP4)，测定对modPRAME的IFNγ反应。相较于未被修饰的HN疫苗-A(375±314SFU)，HN疫苗-A(687±333SFU)增加modPRAME特异性IFNγ反应(图110F)。通过ELISpot，使用跨越天然TBXT抗原全长重叠11个氨基酸的15聚体肽(JPT，PM-BRAC)，测定对TBXT的IFNγ反应。相较于未被修饰的HN疫苗-A(559±289SFU)，HN疫苗-A(1,071±455SFU)增加modTBXT特异性IFNγ反应(图110G)。
HN疫苗-B中对HPV16和HPV18E6/E7的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在HN-疫苗B的情况下对引入至KON细胞系中的HPV16和HPV18 E6/E7抗原的IFNγ反应(表99)。不筛选可从中获得免疫细胞以完成这些研究的健康供体的HPV16和HPV18，并且如果供体是HPV16或HPV18阳性，那么对HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7抗原的反应可能是加强的记忆反应，而非重新引发。
通过ELISpot，使用跨越HPV16和HPV18 E6/E7抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对HPV16和HPV18 E6/E7抗原的IFNγ反应。相较于未被修饰的HN疫苗-B(1,845±878SFU)，在被修饰的HN疫苗-B下对HPV16E6/E7的平均IFNγ反应类似(1,974±537SFU)(图110H)。相较于未被修饰的HN疫苗-B，用HN疫苗-B引发的六个供体中的两个(供体2和供体6)中HPV16 E6/E7反应减少(图110I)。在其它四个供体中在HN疫苗-B下HPV16 E6/E7反应增加。供体2和供体6可能为HPV16阳性，并且在与由HN疫苗-B表达的HPV16 E6/E7的活体外共培养分析的情况下连续刺激诱导T细胞耗乏，由此在ELISpot分析中当用肽时减少IFNγ产生。在HPV16或HPV18阳性患者中HN疫苗不应诱导T细胞耗乏，因为在活体外和活体内诱导免疫反应的机制存在差异。相较于未被修饰的HN疫苗-B(822±342SFU)，被修饰的HN疫苗-B使对HPV18 E6/E7的平均IFNγ反应增加(2,195±757SFU)(图110J)。相较于未被修饰的HN疫苗-B，当用HN疫苗-B引发时，供体6中的HPV18 E6/E7反应减少，但在其它五个供体中增加(图110K)。
表99.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*02:01 | *15:01*51:01 | *02:02*03:04 |
| 2 | *02:01*03:01 | *07:02*49:01 | *07:01*07:02 |
| 3 | *03:01*32:01 | *07:02*15:17 | *07:01*07:02 |
| 4 | *01:01*30:01 | *08:01*13:02 | *06:02*07:02 |
| 5 | *02:01*30:02 | *14:02*13:02 | *08:02*18:02 |
| 6 | *30:02*30:04 | *15:10*58:02 | *03:04*06:02 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量HN疫苗-A和HN疫苗-B诱导针对十种HN抗原的IFNγ产生的能力。将来自六个HLA不同的健康供体(表99)的PBMC与负载有HN疫苗-A或HN疫苗-B的自身DC共培养6天，接着用含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池刺激。在上文描述用于刺激CD14-PBMC以检测针对PSMA、PRAME、TBXT、HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7的IFNγ反应的肽。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽的肽池来源如下：存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、MUC1(JPT，PM-MUC1)和STEAP1(PM-STEAP1)。
图112证明，在六个HLA不同的供体中HN疫苗能够诱导针对十种HN抗原的抗原特异性IFNγ反应，其相较于未被修饰的亲本对照(11,537±5,281)稳固1.6倍(18,901±3,963SFU)(图109A)(表100)。相较于未被修饰的亲本对照组(6,568±3,112SFU)，HN疫苗还使针对非病毒抗原的IFNγ反应增加1.6倍(10,331±2,342SFU)(图112D)。在一个供体中单位剂量的HN疫苗-A和HN疫苗-B引发针对九种抗原的IFNγ反应，并且在五个供体中引发针对十种抗原的IFNγ反应(图113A和113B，上图)。在一个供体中单位剂量的HN疫苗-A和HN疫苗-B引发针对五种非病毒抗原的IFNγ反应，并且在五个供体中引发针对六种非病毒抗原的IFNγ反应(图113A和113B，下图)(表101)。HN疫苗-A和HN疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，对于所有抗原，抗原特异性反应分别增加1.7倍和1.6倍。
HN疫苗-A和HN疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，非病毒抗原特异性反应分别增加1.5倍和1.6倍。具体来说，对于所有抗原，相较于未被修饰的对照(5,848±3,222SFU)，HN疫苗-A引发9,843±2,539SFU和(图112B)(表100)，并且相较于未被修饰的对照(3,547±1,990SFU)，对非病毒抗原为5,441±1,694SFU(图112E)(表101)。对于HN疫苗-A，一个供体对七种抗原作出反应，两个供体对九种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。在一个供体中HN疫苗-A引发对四种非病毒抗原的IFNγ反应，在两个供体中引发对五种非病毒抗原的IFNγ反应，并且在三个供体中引发对六种非病毒抗原的IFNγ反应。相较于未被修饰的对照(5,688±2,472SFU)，HN疫苗-B引发9,058±1,715SFU和(图112C)(表100)，并且相较于未被修饰的对照(3,022±1,333SFU)，对非病毒抗原为4,890±932SFU(图112F)(表101)。对于HN疫苗-B，一个供体对六种抗原作出反应，一个供体对七种抗原作出反应，并且两个供体对九种抗原作出反应并且两个供体对十种抗原作出反应。在一个供体中HN疫苗-A引发对三种非病毒抗原的IFNγ反应，在一个供体中引发对四种非病毒抗原的IFNγ反应，在两个供体中引发对五种非病毒抗原的IFNγ反应并且在两个供体中引发对六种非病毒抗原的IFNγ反应。
上文描述两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，单位剂量的六种细胞系，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物1.6倍的特异性针对至少九种在HN患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。HN疫苗-A使对至少七种TAA的IFNγ反应增加1.7倍并且HN疫苗-B使对至少六种TAA的IFNγ反应增加1.6倍。
表100.对未被修饰和被修饰的HN疫苗组分的IFNγ反应
表101.由未被修饰和被修饰的HN疫苗组分引起的对非病毒抗原的IFNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表101A中示出用于头颈癌的包含来源于ATCC或JCRB的六种癌细胞系(HSC-4(JCRB，JCRB0624)、HO-1-N-1(JCRB，JCRB0831)、DETROIT 562(ATCC，CCL-138)、KON(JCRB，JCRB0194)、OSC-20(JCRB，JCRB0197)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种头颈癌细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS53，ATCC CRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表101A.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(HSC-4)、modPRAME(HO-1-N-1)、modTBXT(HO-1-N-1)、HPV16 E6和E7(KON)和HPV18 E6和E7(KON)的基因。
本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少两种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物HN疫苗-A被修饰以增加三种TAAmodPSMA、modPRAME和modTBXT的表达。第二组合物HN疫苗-B被修饰以表达四种病毒肿瘤相关抗原HPV16 E6和E7以及HPV18 E6和E7。单位剂量的六种癌细胞系表达至少14种与意图接受该组合物的头颈癌受试者的子集的癌症相关的非病毒TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分1.6倍的IFNγ反应。
实例35：胃癌疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种GCA相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物GCA疫苗-A由也被修饰以表达modPSMA和modLYK6的细胞系MKN-1、细胞系MKN-45和细胞系MKN-74构成。第二混合物GCA疫苗-B由细胞系OCUM-1、也被修饰以表达modWT1和modCLDN18(紧密连接蛋白18)的细胞系Fu97、和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十种可提供抗GCA肿瘤反应的抗原。
GCA疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出三十六种疫苗组分细胞系用于可能包括在GCA疫苗中。应用本文所述的其它选择标准以将三十六种细胞系缩小至七种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性GCA相关抗原的表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、GCA相关CSC样标记物ABCB1、ABCG2、ALDH1A、CD133、CD164、FUT4、LGR5、CD44、MUC1和DLL4的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、从中获得细胞系的癌症阶段和部位、和组织学亚型。
CSC在胃癌的癌转移、治疗抗性和复发中起关键作用(表2)。通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA和GCA特异性CSC样标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值超过一，那么细胞系对TAA或CSC样标记物的表达视为阳性。选择标准鉴别出七种候选GCA疫苗组分用于进一步评估：RERF-GC-1B、MKN-74、MKN-45、OCUM-1、MKN-1、Fu97和NCI-N87。七种候选组分细胞系表达十种至十四种TAA(图114A)和两种至六种CSC标记物(图114B)。如本文所述，CSC样细胞系DMS 53作为六种疫苗细胞系的一包括并且表达十四种GCATAA和七种GCACSC样标记物。
如实例9中所述，使用三个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估七种未被修饰的GCA疫苗组分候选物的免疫原性。供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*01:01B*08:01和A*02:01B*15:01；供体2，A*01:01B*08:01和A*02:01B*57:03；和供体3，A*02:01B*40:01和A*30:01B*57:01。MKN-1(5,417±152SFU)和OCUM-1(1,123±258SFU)比RERF-GC-1B(120±56SFU)、MKN-74(241±107SFU)、MKN-45(0±0SFU)、Fu97(578±209SFU)和NCI-N87(0±0SFU)(图115A)免疫原性大。
在三种组分细胞系的八种不同组合中评估MKN-1和OCUM-1的免疫原性，四种组合含有MKN-1并且四种组合含有OCUM-1(图115C)。如实例8中所述，使用三个健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对八种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*02:06B*15:01和A*34:02B*51:01；供体2，A*03:01B*07:02和A*24:02B*15:09；和供体3，A*02:01B*40:01和A*30:01B*57:01。检测所有八种混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应。相较于针对单个细胞系组分所检测的IFNγ反应，对于大多数细胞系，针对各个混合物组分细胞系的反应显著增加(图115B)。在所有八种评估的组合中，MKN-1保持最大免疫原性。如上文和本文中进一步描述，选择MKN-1包括在疫苗混合物A中并且选择OCUM-1包括在疫苗混合物B中。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对GCA抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如LY6K或MUC1，以及已知对GCA和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。如本文所示，为进一步增强TAA阵列，MKN-1被修饰以表达modPSMA和modLY6K，并且Fu97被修饰以表达modWT1和modCLDN18。PSMA、CLDN18和WT1由六种组分细胞系中的一种内源性表达并且LY6K由六种组分细胞系中的两种以>1.0FPKM内源性表达(图116A)。
如实例29中和本文中所述，通过流式细胞术检测MKN-1对被转导的抗原modPSMA(图117A)和modLY6K(图117B)的表达(SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58)和Fu97对modWT1(图114C)和modCLDN18(图114D)的表达(SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56)。在相同慢病毒转移载体中编码modPSMA和modLY6K抗原，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开。在相同慢病毒转移载体中编码modWT1和modCLDN18，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中二十种代表性GCA TAA的内源性mRNA表达在图116A中示出。在引入上述抗原之后，本发明疫苗表达所有鉴别的二十种通常靶向并且可能临床上相关的能够诱导GCA抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在GCA肿瘤中并且一些也可以诱导针对GCA和其它实体肿瘤的免疫反应。如实例29中所述，利用可以利用的mRNA表达数据，在371个GCA患者样品中测定二十种优先GCA TAA的RNA丰度(图116B)。100％样品表达优先GCATAA中的十一种，99.5％样品表达12种TAA，98.9％样品表达13种TAA，94.9％样品表达14种TAA，83.0％样品表达15种TAA，67.1％样品表达16种TAA，43.4％样品表达17种TAA，24.5％样品表达18种TAA，8.6％样品表达19种TAA并且0.3％样品表达20种TAA(图116C)。本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中该等细胞系的组合，即单位剂量的六种细胞系包含表达至少11种与意图接受该组合物的GCA癌症受试者的子集相关的TAA。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表102中鉴别出的细胞系来构成本发明GCA疫苗。
表102.胃疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、FU97和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表103中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过83.3％的CD276阴性细胞。
表103.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如实例26中所述测定所得含量。GCA疫苗-A中的MKN-1、MKN-45和MKN-74细胞系分泌可测量含量的TGFβ1。MKN-1也分泌可测量含量的TGFβ2。GCA疫苗-B的Fu97和DMS 53组分细胞系分泌可测量含量的TGFβ1。DMS 53也分泌可测量含量的TGFβ2。OCUM-1不分泌可测量含量TGFβ1或TGFβ2。实例26中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上文和本文中所述测定所得含量。
如实例29中所述，MKN-1组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌，同时被转基因转导以增加膜结合的CD40L的表达。如实例29中所述，MKN-1也被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。这些细胞用纯系名称DK6描述。如实例29中所述，MKN-45、MKN-74和Fu97细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌并且同时增加膜结合的CD40L的表达。被修饰以减少TGFβ1的分泌而非TGFβ2的分泌的这些细胞用纯系名称DK2描述。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌。被修饰以减少TGFβ2而非TGFβ1的分泌的DMS 53细胞用纯系名称DK4描述。OCUM-1未被修饰成减少TGFβ1或TGFβ2分泌，因为亲本株不分泌可检测含量的TGFβ1或TGFβ2。
表104展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。基因修饰引起TGFβ1分泌减少至少72％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少51％。
表104.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的GCA疫苗-A和GCA疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表105中示出。GCA疫苗-A的TGFβ1分泌减少89％，并且TGFβ2减少98％皮克/剂量/24小时。GCA疫苗-B的TGFβ1分泌减少54％，并且TGFβ2减少49％皮克/剂量/24小时。
表105.GCA疫苗-A和GCA疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
如上所述，MKN-1细胞系被含有TGFβ2 shRNA和表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)的慢病毒颗粒转导。MKN-45、MKN-74、OCUM-1和Fu97细胞系慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例26中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表106中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少3,941倍。在GCA疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0028纳克/106个细胞/24小时)，MKN-1的GM-CSF的分泌增加46,419倍，相较于亲本细胞系(≤0.0051纳克/106个细胞/24小时)，MKN-45的GM-CSF的分泌增加3,941倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0027纳克/106个细胞/24小时)，MKN-74的GM-CSF的分泌增加242,155倍。在GCA疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0043纳克/106个细胞/24小时)，OCUM-1的GM-CSF的分泌增加7,866倍，相较于亲本细胞系(≤0.0046纳克/106个细胞/24小时)，Fu97的GM-CSF的分泌增加193,248倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0032纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53的GM-CSF的分泌增加49,313倍。
表106.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，GCA疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量407ng。GCA疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量543ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时950ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L的载体。实例29中描述检测五种GCA细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述表达膜结合的CD40L的DMS 53修饰。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图118中所示和下文所述的结果证明在所有六种GCA疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少374倍。在GCA疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，MKN-1对CD40L的表达(15,941MFI)增加15,941倍，相较于亲本细胞系(9MFI)，MKN-45对CD40L的表达(3,397MFI)增加374倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，MKN-74对CD40L的表达(4,914MFI)增加4,914倍。在GCA疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，OCUM-1对CD40L的表达(3,741MFI)增加3,741倍，相较于亲本细胞系(17MFI)，FU97对CD40L的表达(26,449MFI)增加1,569倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，MKN-1、MKN-45、MKN-74和Fu97组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表107中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少1,715倍。在GCA疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0011纳克/106个细胞/24小时)，MKN-1的IL-12的分泌增加53,185倍，相较于亲本细胞系(≤0.0021纳克/106个细胞/24小时)，MKN-45的IL-12的分泌增加1,715倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0011纳克/106个细胞/24小时)，MKN-74的IL-12的分泌增加56,743倍。在GCA疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0037纳克/106个细胞/24小时)，FU97对IL-12的表达增加13,078倍。OCUM-1和DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表107.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，GCA疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量63ng。GCA疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量24ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时87ng。
MKN-1细胞系稳定表达modPSMA和modLY6K
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ1和TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的MKN-1细胞系也被表达modPSMA和modLY6K抗原的慢病毒颗粒转导。来源于CCLE的RNA表达数据表明MKN-1内源性表达LYK6(图116A)，但在未被修饰的MKN-1细胞，通过流式细胞术未检测到LYK6蛋白(图117B)。编码modPSMA和modLY6K抗原(SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58)的基因由弗林蛋白酶裂解位点连接。
通过流式细胞术表征MKN-1对modPSMA的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(Abcam，ab268061)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(BioLegend#405322)染色。被修饰的细胞系(697,744MFI)中modPSMA的表达比亲本细胞系(46,955MFI)增加15倍(图117A)。还通过流式细胞术表征MKN-1对modLY6K的表达。首先将细胞在细胞内用兔IgG抗LY6K抗体(Abcam，ab246486)(0.03微克/检验)染色，接着用AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)(0.125微克/检验)染色。被修饰的细胞系(2,890,315MFI)中modLY6K的表达比未被修饰的细胞系(0MFI)增加2,890,315倍(图117B)。
Fu97细胞系稳定表达modWT1和modCLDN18
被修饰以减少TGFβ1分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的Fu97细胞系也被表达modWT1和modCLDN18抗原(SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征Fu97对modWT1的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗兔IgG1抗WT1抗体(Abcam，ab89901)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(7,418,365MFI)对modWT1的表达比未被修饰的细胞系(129,611MFI)增加57倍(图117C)。通过流式细胞术表征Fu97对modCLDN18的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗兔IgG1抗CLDN18抗体(Abcam，ab203563)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(3,168,563MFI)对modCLDN18的表达比未被修饰的细胞系(558,211MFI)增加5.7倍(图117D)。
GCA疫苗-A中对PSMA和LY6K的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在GCA疫苗-A的情况下对PSMA和LY6K的IFNγ反应。六个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表108中示出。如实例29中所述通过ELISpot测定IFNγ反应。
相较于亲本未被修饰的GCA疫苗-A(137±82SFU，在被修饰的GCA疫苗-A下PSMA特异性IFNγ反应增加(2,413±829SFU)(图117E)。通过ELISpot，使用跨越天然LY6K抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对LY6K的IFNγ反应。相较于未被修饰的GCA疫苗-A(63±30SFU)，在被修饰的GCA疫苗-A(1,598±639SFU)下对LY6K的IFNγ反应显著增加(p＝0.002，曼-惠特尼U检验)(n＝6)(图117F)。
GCA疫苗-B中对WT1和CLDN18的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在GCA-疫苗B的情况下对WT1和CLDN18的IFNγ反应(表108)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白质全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定对WT1和CLDN18的IFNγ反应。相较于未被修饰的GCA疫苗-B(37±22SFU)，在GCA疫苗-B(686±330SFU)下WT1特异性IFNγ反应增加(n＝6)(图117G)。相较于未被修饰的GCA疫苗-B(113±65SFU)，GCA疫苗-B(1,682±773SFU)使CLDN18特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.026，曼-惠特尼U检验)(n＝6)(图117H)。
表108.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *02:01*02:01 | *15:01*51:01 | *02:02*03:04 |
| 2 | *01:01*32:01 | *08:01*14:01 | *07:01*08:01 |
| 3 | *03:01*25:01 | *07:02*18:01 | *07:02*12:03 |
| 4 | *02:01*30:02 | *14:02*57:02 | *08:02*18:02 |
| 5 | *02:01*33:01 | *07:02*14:02 | *07:02*08:02 |
| 6 | *01:01*32:01 | *35:01*40:06 | *04:01*15:02 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量GCA疫苗-A和GCA疫苗-B诱导针对十种GCA抗原的IFNγ产生的能力。将来自七个HLA不同的健康供体(表108)的PBMC与负载有GCA疫苗-A或GCA疫苗-B的自身DC共培养6天，接着用含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池刺激。在上文描述用于刺激CD14-PBMC以检测针对PSMA、LY6K、WT1和CLDN18的IFNγ反应的肽。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽大肽池来源如下：MSLN(GenScript常规肽文库)、MAGEA3(JPT，PM-MAGEA3)、CEA(JPT，PM-CEA)、存活素(thinkpeptides，7769_001-011)、STEAP1(PM-STEAP1)和MUC1(JPT，PM-MUC1)。
图119证明，在六个HLA不同的供体中GCA疫苗能够诱导针对十种GCA抗原的抗原特异性IFNγ反应，其相较于未被修饰的亲本对照(1,879±463SFU)稳固17.5倍(32,898±13,617SFU)(p＝0.009，曼-惠特尼U检验)(n＝6)(图119A)(表109)。在两个供体中单位剂量的GCA疫苗-A和GCA疫苗-B引发针对八种抗原的IFNγ反应，在一个供体中引发针对九种抗原的IFNγ反应，并且在四个供体中引发针对十种抗原的IFNγ反应(图120)。GCA疫苗-A和GCA疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应分别增加17.4倍和17.7倍。具体来说，相较于未被修饰的对照(1,055±518SFU)，GCA疫苗-A引发18,332±6,823SFU(p＝0.004，曼-惠特尼U检验)(图119B)。对于GCA疫苗-A，一个供体对五种抗原作出反应，两个供体对九种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。相较于亲本对照(823±287SFU)，GCA疫苗-B引发14,566±7,499SFU(p＝0.015，曼-惠特尼U检验)(图119C)。对于GCA疫苗-B，一个供体对五种抗原作出反应，两个供体对九种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。以上描述两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种细胞系，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物17.5倍的特异性针对至少八种在GCA患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。GCA疫苗-A使对至少五种TAA的IFNγ反应增加17.4并且GCA疫苗-B使对至少五种TAA的IFNγ反应增加17.7。
表109.对未被修饰和被修饰的GCA疫苗组分的IFNγ反应
基于本公开和本文提供的数据，表110中示出用于胃癌的包含来源于ATCC或JCRB的六种癌细胞系(MKN-1(JCRB，JCRB0252)、MKN-45(JCRB，JCRB0254)、MKN-74(JCRB，JCRB0255)、OCUM-1(JCRB，JCRB0192)、Fu97(JCRB，JCRB1074)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种胃癌细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53，ATCCCRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表110.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modPSMA(MKN-1)、modLY6K(MKN-1)、modWT1(Fu97)和modCLDN18(Fu97)的基因。
本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少一种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物GCA疫苗-A被修饰以增加两种TAA modPSMA和modLY6K的表达。第二组合物GCA疫苗-B被修饰以表达两种TAA modWT1和modCLDN18。单位剂量的六种癌细胞系表达至少11种与意图接受该组合物的胃癌受试者的子集的癌症相关的TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分17.5倍的IFNγ反应。
实例36：乳腺癌(BRCA)疫苗的制备
本实例证明，在两种混合物的疫苗组合物中TGFβ1、TGFβ2和CD276表达的减少同时GM-CSF、CD40L和IL-12的过度表达显著增加HLA不同的群体中针对至少10种BRC相关抗原的细胞免疫反应的量值，各混合物由三种细胞系构成，总共6种细胞系。如本文所述，第一混合物BRC疫苗-A由也被修饰以表达modPSMA的细胞系CAMA-1、也被修饰以表达modTERT的细胞系AU565、和细胞系HS-578T构成。第二混合物BRC疫苗-B由细胞系MCF-7、也被修饰以表达modTBXT和modBORIS的细胞系T47D、和细胞系DMS 53构成。六种组分细胞系总体来说表达至少二十二种可提供抗BRC肿瘤反应的抗原。
BRC疫苗组分的鉴别
初始细胞系选择标准鉴别出二十九种疫苗组分细胞系用于可能包括在BRC疫苗中。应用本文所述的其它选择标准以将二十九种细胞系缩小至七种细胞系，用于在免疫原性分析中进一步评估。这些标准包括：内源性BRC相关抗原的表达、三阴性乳腺癌中富含的抗原的内源性表达、缺乏诸如IL-10或IDO1的其它免疫抑制因子的表达、BRC相关的CSC样标记物ABCG2、ALDH1A、BMI1、CD133、CD44、ITGA6、CD90、c-myc、CXCR1、CXCR4、EPCAM、KLF4、MUC1、NANOG、SAL4和SOX2的表达、从中获得细胞系的患者的种族和年龄、乳腺癌的部位和阶段、分子亚型和组织学亚型。
CSC在乳腺癌的癌转移、治疗抗性和复发中起关键作用(表2)。通过源自广泛研究所癌细胞系百科全书(CCLE)的RNA表达数据确定候选组分细胞系对TAA和BRC特异性CSC样标记物的表达。HGNC基因符号包括在CCLE搜索中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值超过一，那么细胞系对TAA或CSC标记物的表达视为阳性。选择标准鉴别出七种候选BRC疫苗组分用于进一步评估：BT20、HS-578T、AU565、ZR751、MCF-7、CAMA-1和T47D。七种候选组分细胞系表达七种至十一种TAA(图121A)和六种至九种CSC标记物(图121B)。如本文所述，CSC样细胞系DMS 53作为六种疫苗细胞系的一包括并且表达十五种BRC TAA和三种BRCCSC样标记物。
如实例9中所述，使用三个HLA不同的健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot评估七种未被修饰的BRC疫苗组分候选物的免疫原性。供体1的HLA-A和HLA-B等位基因为A*02:01B*57:03和A*01:01B*08:01。供体2的HLA-A和HLA-B等位基因为A*30:01B*57:01和A*02:01B*40:01。供体3的HLA-A等位基因为A*01:01和A*02:01。HLA-B分型不可以用于供体3。分别在五个HLA不同的供体(表117，供体2-6)中评估T47D的免疫原性。MCF-7(2,314±448SFU)和CAMA-1(990±223SFU)比AU565(274±87SFU)、ZR751(292±133SFU)、BT20(524±192SFU)、HS-578T(281±81SFU)(图122A)和T47D(491±202SFU)(图122C)免疫原性大。
在三种组分细胞系的八种不同组合中评估MCF-7和CAMA-1的免疫原性，四种组合含有MCF-7并且四种组合含有CAMA-1(图122D)。如实例8中所述，使用三个健康供体(n＝4/供体)，通过IFNγELISpot，测定针对八种可能疫苗混合物内的三种组分细胞系的IFNγ反应。供体的HLA-A和HLA-B等位基因如下：供体1，A*01:01B*08:01和A*02:01B*15:01；供体2，A*03:01B*15:01和A*24:02B*07:02；供体3，A*01:01B*30:01和A*02:01B*12:02。在相同五个HLA不同的供体中，还评估包括T47D、MCF-7和DMS 53T47D的三种组分细胞系的一个额外混合物组合(图122C)(表117，供体2-6)。检测所有九种混合物和针对各混合物中的各细胞系组分的IFNγ反应。
在所有八种评估的组合中，MCF-7和CAMA-1保持最大免疫原性。除了CAMA-1和ZR751，对各个混合物组分细胞系的反应类似。在三种组分细胞系的组合中对CAMA-1的IFNγ反应略微减少。在三种细胞系组分的组合中对ZR751的IFNγ反应亦略微减少，并且因此ZR751不包括于BRC疫苗中(图122B-C)。三阴性乳腺癌占乳腺癌大约15％。出于此原因，一种三阴性乳腺癌细胞系包括在组合物疫苗中，占BRC疫苗的单位剂量的17％。当在三种细胞系组分的混合物中评估时三阴性乳腺癌细胞系BT20和HS-578T的免疫原性类似。在这两个细胞系中，HS-578T内源性表达的TAA(十一种TAA>1.0FPKM)比BT20(九种TAA>1.0FPKM)多(图121A)并且选择用于包括在BRC疫苗中。如上文和本文中进一步描述，选择CAMA-1包括在疫苗混合物A中并且选择MCF-7包括在疫苗混合物B中。
本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对BRC抗肿瘤反应特别重要的TAA，诸如乳房珠蛋白A(SCGB2A2)和MUC1，三阴性乳腺癌中富含的TAA，诸如TBXT和NY-ESO-1，以及已知对BRC和其它实体肿瘤的目标重要的TAA，诸如TERT。如本文所示，为进一步增强TAA阵列，CAMA-1被修饰以表达modPSMA，AU565被修饰以表达modTERT，并且T47D也被修饰以表达modTBXT和modBORIS。
TBXT和BORIS在六种组分细胞系中的任一种中不以>1.0FPKM内源性表达。TERT和PSMA由六种组分细胞系中的一种以>1.0FPKM内源性表达(图123A)。
如实例29中和本文中所述，通过流式细胞术或RT-PCR检测CAMA-1对被转导的抗原modPSMA(图124A)的表达(SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38)，AU565对modTERT(图124B)的表达(SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36)，和T47D对modTBXT(图124C)和modBORIS(图124D)的表达(SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:42)。在相同慢病毒转移载体中编码modTBXT和modBORIS抗原，由弗林蛋白酶裂解位点分隔开(SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42)。
因为需要维持抗原与包含各细胞系的纯系亚群的最大异质性，所以已使用抗生素选择和流式细胞术并且不经由限制稀释亚克隆来建立本发明疫苗中所利用的被基因修饰的细胞系。
本发明疫苗中二十二种代表性BRC TAA的内源性mRNA表达在图123A中示出。在引入上述抗原之后，本发明疫苗表达所有鉴别的二十二种通常靶向并且可能临床上相关的能够诱导BRC抗肿瘤反应的TAA。已知这些TAA中的一些主要富集在BRC肿瘤中并且一些也可以诱导针对BRC和其它实体肿瘤的免疫反应。如实例29中所述，利用可以利用的mRNA表达数据，在1082个BRC患者样品中测定二十二种优先BRC TAA的RNA丰度(图123B)。100％样品表达优先BRC TAA中的十五种，99.9％样品表达16种TAA，99.3％样品表达17种TAA，95.1％样品表达18种TAA，79.9％样品表达19种TAA，47.6％样品表达20种TAA，17.1％样品表达21种TAA并且3.4％样品表达22种TAA(图123C)。本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，其中该等细胞系的组合，即单位剂量的六种细胞系包含表达至少15种与意图接受该组合物的BRC癌症受试者的子集相关的TAA。基于本文中所呈现的表达和免疫原性数据，选择表111中鉴别出的细胞系来构成本发明GBM疫苗。
表111.乳腺癌疫苗细胞系和组织学
CD276表达的减少
CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS 53组分细胞系表达CD276并且如实例13中和本文中其它地方所述，通过用ZFN电穿孔来敲除表达。因为希望维持尽可能多的肿瘤异质性，所以不通过限制稀释法克隆被电穿孔和shRNA修饰的细胞。实际上，如实例13中所述，细胞经受通过FACS的多轮细胞分选。如实例29中所述测定CD276的表达。表112中描述CD276表达的减少。这些数据显示在所有六种疫苗组分细胞系中用ZFN对CD276进行基因编辑引起超过95.2％的CD276阴性细胞。
表112.CD276表达的减少
TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析
如实例29中所述完成TGFβ1、TGFβ2、GM-CSF和IL-12的细胞因子分泌分析。
shRNA下调TGF-β分泌
在敲除CD276之后，使用shRNA减少TGFβ1和TGFβ2分泌含量并且如实例29中所述测定所得含量。BRC疫苗-A中的AU565和HS-578T亲本细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。CAMA-1分泌可检测含量的TGFβ2，但不分泌TGFβ1。BRC疫苗-B的MCF-7组分细胞系分泌可测量含量的TGFβ1和TGFβ2。T47D不分泌可测量含量的TGFβ1或TGFβ2，因此不被修饰成减少TGFβ1或TGFβ2的分泌。实例26中描述DMS 53细胞系使TGFβ2分泌减少并且如上文和本文中所述测定所得含量。
如实例29中所述，HS-578T和MCF-7组分细胞系被TGFβ1 shRNA转导以减少TGFβ1的分泌，同时被转基因转导以增加膜结合的CD40L的表达。如实例29中所述，HS-578T和MCF-7也被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。这些细胞用纯系名称DK6描述。如实例29中所述，HS-578T、MCF-7、CAMA-1和AU565细胞系被编码TGFβ2 shRNA的慢病毒颗粒转导以减少TGFβ2的分泌，并且同时增加GM-CSF的表达(SEQ ID NO:6)。如实例26中所述，DMS 53用shRNA修饰以减少TGFβ2的分泌。被修饰以减少TGFβ2而非TGFβ1的分泌的细胞系用纯系名称DK4描述。
表113展示相较于未被修饰的亲本细胞系，被基因修饰的组分细胞系中TGFβ1和/或TGFβ2分泌的减少百分比。如果仅在ELISA分析中16个复制操作中的1个中检测到TGFβ1或TGFβ2分泌，那么报告的值无平均值的标准误差。基因修饰引起TGFβ1分泌减少至少44％。TGFβ2的基因修饰引起TGFβ2分泌减少至少51％。
表113.组分细胞系中的TGF-β分泌(皮克/106个细胞/24小时)
DK6：TGFβ1/TGFβ2双重减弱；DK4：TGFβ2单一减弱；DK2：TGFβ1单一减弱；*＝使用LLD估计，未检测到；NA＝不适用
基于5×105各组分细胞系的剂量，被修饰的BRC疫苗-A和BRC疫苗-B和对应的未被修饰的亲本细胞系的总TGFβ1和TGFβ2分泌在表114中示出。BRC疫苗-A的TGFβ1分泌减少49％，并且TGFβ2减少87％皮克/剂量/24小时。BRC疫苗-B的TGFβ1分泌减少67％，并且TGFβ2减少71％皮克/剂量/24小时。
表114.BRC疫苗-A和BRC疫苗-B中的总TGF-β分泌(皮克/剂量/24小时)
GM-CSF分泌
如上所述，HS-578T、MCF-7、CAMA-1和AU565细胞系被含有TGFβ2 shRNA和表达GM-CSF的基因(SEQ ID NO:6)的慢病毒颗粒转导。T47D细胞系被慢病毒颗粒转导以仅表达GM-CSF(SEQ ID NO:7)。如实例26中和本文中其它地方所述，DMS 53被修饰以分泌GM-CSF。结果在表115中示出并且在下文描述。
相较于未被修饰的亲本细胞系，在所有被修饰的组分细胞系中GM-CSF的分泌增加至少15,714倍。在BRC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0039纳克/106个细胞/24小时)，CAMA-1的GM-CSF的分泌增加36,990倍，相较于亲本细胞系(≤0.0042纳克/106个细胞/24小时)，AU565的GM-CSF的分泌增加15,714倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0064纳克/106个细胞/24小时)，HS-578T的GM-CSF的分泌增加21,061倍。在BRC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0118纳克/106个细胞/24小时)，MCF-7的GM-CSF的分泌增加25,528倍，相较于亲本细胞系(≤0.0063纳克/106个细胞/24小时)，T47D的GM-CSF的分泌增加33,920倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0032纳克/106个细胞/24小时)，DMS 53的GM-CSF的分泌增加49,313倍。
表115.组分细胞系中的GM-CSF分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，BRC疫苗-A的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量174ng。BRC疫苗-B的总GM-CSF分泌为每24小时每剂量336ng。因此，每剂量的总GM-CSF分泌为每24小时510ng。
膜结合的CD40L(CD154)表达
如上所述，组分细胞系被慢病毒颗粒转导以表达膜结合的CD40L的载体。实例29中描述检测五种BRC细胞系组分对CD40L的表达的方法。实例15中描述表达膜结合的CD40L的DMS 53修饰。下文描述所有六种疫苗组分细胞系的膜结合的CD40L的评估。图125中所示和下文所述的结果证明在所有六种BRC疫苗组分细胞系中CD40L膜表达基本上增加。
在所有组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，膜结合的CD40L的表达增加至少3,417倍。在BRC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，CAMA-1对CD40L的表达增加3,417倍(3,417MFI)，相较于亲本细胞系(0MFI)，AU565对CD40L的表达增加6,527倍(6,527MFI)，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，HS-578T对CD40L的表达增加6,560倍(6,560MFI)。在BR-BT疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(0MFI)，MCF-7对CD40L的表达(5,986MFI)增加5,986倍，相较于亲本细胞系(0MFI)，T47D对CD40L的表达(45,071MFI)增加45,071倍，并且相较于亲本细胞系(0MFI)，DMS 53对CD40L的表达增加88,261倍。
IL-12表达
如实例17中所述，组分细胞系被IL-12载体转导，并且如上文和本文中所述测定所得IL-12p70表达。结果在表116中示出并且在下文描述。
在所有被修饰以分泌IL-12p70的组分细胞系中，相较于未被修饰的亲本细胞系，IL-12的分泌增加至少4,034倍。在BRC疫苗-A组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0016纳克/106个细胞/24小时)，CAMA-1的IL-12的分泌增加39,490倍，相较于亲本细胞系(≤0.0017纳克/106个细胞/24小时)，AU565的IL-12的分泌增加14,793倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.0026纳克/106个细胞/24小时)，HS-578T的IL-12的分泌增加19,141倍。在BRC疫苗-B组分细胞系中，相较于亲本细胞系(≤0.0047纳克/106个细胞/24小时)，MCF-7对IL-12的表达增加4,034倍，并且相较于亲本细胞系(≤0.002纳克/106个细胞/24小时)，T47D对IL-12的表达增加43,655倍。DMS 53未被修饰成分泌IL-12。
表116.组分细胞系中的IL-12分泌
基于5×105各组分细胞系的剂量，BRC疫苗-A的总IL-12分泌为每24小时每剂量69ng。BRC疫苗-B的总IL-12分泌为每24小时每剂量53ng。因此，每剂量的总IL-12分泌为每24小时122ng。
CAMA-1细胞系稳定表达modPSMA
如上所述，本文所述的疫苗中的细胞被选择成表达广泛TAA阵列，包括已知对抗肿瘤免疫重要的TAA。为进一步增强抗原阵列，被修饰以减少TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的CAMA-1细胞系也被表达modPSMA抗原(SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征CAMA1对modPSMA的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗小鼠IgG1抗PSMA抗体(Abcam，ab268061)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的山羊抗小鼠IgG1抗体(BioLegend#405322)染色。被修饰的细胞系(77,718MFI)中modPSMA的表达比亲本细胞系(4,269MFI)增加17倍(图124A)。
AU565细胞系稳定表达modTERT
被修饰以减少TGFβ2分泌、减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的AU565细胞系也被表达modTERT抗原(SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征AU565对modTERT的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.03微克/检验抗小鼠IgG1抗TERT抗体(Abcam，ab32020)染色，接着用0.125微克/检验驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(957,873MFI)中modTERT的表达比未被修饰的细胞系(30,743MFI)增加31倍(图124B)。
T47D细胞系稳定表达modTBXT和modBORIS
被修饰以减少CD276表达和表达GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的T47D细胞系也被表达modTBXT和modBORIS抗原(SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42)的慢病毒颗粒转导。通过流式细胞术表征T47D对modTBXT的表达。未被修饰和抗原修饰的细胞在细胞内用0.06微克/检验抗兔IgG1抗TBXT抗体(Abcam，ab209665)染色，接着用0.125微克/检验AF647结合的驴抗兔IgG1抗体(BioLegend#406414)染色。被修饰的细胞系(147,610MFI)中modTBXT的表达比未被修饰的细胞系(0MFI)增加147,610倍(图124C)。如实例29和本文中所述，通过RT-PCR测定SCaBER对BORIS的表达。正向引物被设计成在转基因中的1119-1138bp位置(TTCCAGTGCTGCCAGTGTAG(SEQ ID NO:134))处粘接并且反向引物被设计成在转基因中的1159-1178bp位置(AGCACTTGTTGCAGCTCAGA(SEQ ID NO:135))处粘接，得到460bp产物。实例29中描述β-微管蛋白的对照引物。在预期尺寸下检测到modBORIS的基因产物(图124D)，并且相对于亲本对照，mRNA增加2,198倍。
BRC疫苗-A中对PSMA的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在BRC疫苗-A的情况下对PSMA的IFNγ反应。六个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表117中示出。如实例29中所述，通过ELISpot，使用跨越天然PSMA抗原全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific Custom Peptide Service)，测定IFNγ反应。相较于亲本未被修饰的BRC疫苗-A(393±210SFU)，在被修饰的BRC疫苗-A(4,166±1,647SFU)下PSMA特异性IFNγ反应显著增加(p＝0.041，曼-惠特尼U检验)(n＝6)(图124E)。
BRC疫苗-A中对TERT的免疫反应
如实例29中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在BRC疫苗-A的情况下对TERT的IFNγ反应。六个供体每一个的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因在表117中示出。通过ELISpot，使用跨越天然TERT抗原全长重叠11个氨基酸的15聚体肽(JPT，PM-TERT)，测定IFNγ反应。相较于未被修饰的BRC疫苗-A(1,670±918)SFU，在被修饰的BRC疫苗-A(3,807±927SFU)下对TERT的IFNγ反应增加(图124F)。
BRC疫苗-B中对TBXT和BORIS的免疫反应
如实例32中和本文中所述，在六个HLA不同的供体(n＝4/供体)中，评估在BRC疫苗-B的情况下对TBXT和BORIS的IFNγ反应(表117)。通过ELISpot，使用跨越天然抗原全长重叠11个氨基酸的15聚体肽(JPT，PM-BRAC)，测定针对TBXT的IFNγ反应。通过ELISpot，使用跨越天然抗原蛋白质全长重叠9个氨基酸的15聚体肽(购自Thermo Scientific CustomPeptide Service)，测定针对BORIS的IFNγ反应。
相较于未被修饰的BRC疫苗-B(930±496SFU)，BRC疫苗-B使TBXT特异性IFNγ反应增加(1,102±366SFU)(n＝6)(图124G)。相较于未被修饰的BRC疫苗-B(1,757±661SFU)，BRC疫苗-B使BORIS特异性IFNγ反应增加(3,054±1,155SFU)(n＝6)(图124H)。
表117.健康供体MHC-I特征
| 供体# | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| 1 | *03:01*07:02 | *07:02*35:01 | *04:01*07:02 |
| 2 | *02:01*03:01 | *27:05*27:05 | *01:02*01:02 |
| 3 | *02:01*33:01 | *07:02*14:02 | *07:02*08:02 |
| 4 | *02:01*02:01 | *15:01*44:02 | *03:04*14:02 |
| 5 | *24:02*02:01 | *08:01*51:01 | *14:02*03:04 |
| 6 | *01:01*02:01 | *35:01*50:01 | *04:01*06:02 |
混合物诱导针对相关TAA的免疫反应
通过ELISpot测量BRC疫苗-A和BRC疫苗-B诱导针对十种BRC抗原的IFNγ产生的能力。将来自六个HLA不同的健康供体(表117)的PBMC与负载有BRC疫苗-A或BRC疫苗-B的自身DC共培养6天，接着用含有已知的MHC-I限制性抗原决定基的TAA特异性肽池刺激。在上文描述用于刺激CD14-PBMC以检测针对PSMA、TERT、TBXT和BORIS的IFNγ反应的肽。额外的重叠11个氨基酸的15聚体肽的肽池来源如下：STEAP1(PM-STEAP1)、PRAME(JPT，PM-OIP4)、SCGB2A2(乳房珠蛋白-A)(JPT，PM-MamA)、存活素(hinkpeptides，7769_001-011)、MUC1(JPT，PM-MUC1)和MMP11(JPT，PM-MMP11)。
图126证明，在六个HLA不同的供体中BRC疫苗能够诱导针对十种BRC抗原的抗原特异性IFNγ反应，其相较于未被修饰的亲本对照(20,183±7,978)稳固2.2倍(45,370±9,212SFU)(n＝6)(图136A)(表118)。在两个供体中单位剂量的BRC疫苗-A和BRC疫苗-B引发针对九种抗原的IFNγ反应，并且在四个供体中引发针对十种抗原的IFNγ反应(图127)。分别相较于未被修饰的对照1,380±697SFU和1,601±810SFU，BRC疫苗使对PRAME的IFNγ反应增加2.2倍(3,049±1,079SFU)和对TBXT的IFNγ反应增加1.7倍(3,049±1,079SFU)，在乳腺癌的三阴性分子子集富含该两种抗原。BRC疫苗-A和BRC疫苗-B独立地证明，相较于亲本对照，抗原特异性反应分别增加2.6倍和1.4倍。具体来说，相较于未被修饰的对照(9,197±3,433SFU)，BRC疫苗-A显著增加抗原特异性反应23,944±3,971SFU(p＝0.026，曼-惠特尼U检验)(图127B)。对于BRC疫苗-A，两个供体对九种抗原作出反应并且四个供体对十种抗原作出反应。相较于亲本对照(11,975±4,510SFU)，BRC疫苗-B引发17,032±3,861SFU(n＝6)(图127C)。对于BRC疫苗-B，一个供体对五种抗原作出反应，两个供体对九种抗原作出反应，并且三个供体对十种抗原作出反应。上文描述两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种细胞系，其中该单位剂量能够引发超过未被修饰的组合物2.2倍的特异性针对至少九种在BRC患者肿瘤中表达的TAA的免疫反应。BRC疫苗-A使对至少九种TAA的IFNγ反应增加2.6倍并且BRC疫苗-B使对至少五种TAA的IFNγ反应增加1.4倍。
表118.对未被修饰和被修饰的BRC疫苗组分的IFNγ反应
混合物增加对TAA的IFNγ反应的广度和量值
如实例9中所述，通过IFNγELISpot，在供体2-6中评估相较于单个组分细胞系，如实例8中所述，BRC疫苗-A和BRC疫苗-B引发IFNγ产生的更大抗原广度和量值的能力(表117)。BRC疫苗-A(图128A)和BRC疫苗-B(图128B)诱导更稳固的对乳腺癌抗原的反应。重要地，相较于单个组分细胞系，BRC疫苗-A和BRC疫苗-B诱导对更大数目的抗原的IFNγ反应。在五个供体的此子集中，在两个供体中BRC疫苗-A诱导对九种抗原的IFNγ反应并且在三个供体中诱导对十种抗原的IFNγ反应。在一个供体中单独CAMA-1诱导对四种抗原的IFNγ反应，在两个供体中诱导对六种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对八种抗原的IFNγ反应，并且在一个供体中诱导对十种抗原的IFNγ反应。在一个供体中单独AU565诱导对两种抗原的IFNγ反应，在两个供体中诱导对六种抗原的IFNγ反应，在1个供体中诱导对九种抗原的IFNγ反应，并且在一个供体中诱导对十种抗原的IFNγ反应。在一个供体中单独HS-578T诱导对零种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对三种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对五种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对九种抗原的IFNγ反应，并且在一个供体中诱导对十种抗原的IFNγ反应(图128C)。在五个供体的此子集中，在一个供体中BRC疫苗-B诱导对五种抗原的IFNγ反应，在两个供体中诱导对九种抗原的IFNγ反应，并且在两个供体中诱导对十种抗原的IFNγ反应。在一个供体中单独MCF-7诱导对三种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对五种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对七种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对八种抗原的IFNγ反应，并且在一个供体中诱导对十种抗原的IFNγ反应。在一个供体中单独T47D诱导对零种抗原的IFNγ反应，在一个供体中诱导对五种抗原的IFNγ反应，在两个供体中诱导对七种抗原的IFNγ反应，并且在一个供体中诱导对九种抗原的IFNγ反应(图128D)。
基于本公开和本文提供的数据，表119中示出用于乳腺癌的包含来源于ATCC的六种癌细胞系(CAMA-1(ATCC，HTB-21)、AU565(ATCC，CRL-2351)、HS-578T(ATCC，HTB-126)、MCF-7(ATCC，HTB-22)、T47D(ATCC，HTB-133)和DMS 53(ATCC，CRL-2062))的全细胞疫苗。细胞系代表五种乳腺癌细胞系和一种小细胞肺癌(SCLC)细胞系(DMS 53，ATCC CRL-2062)。细胞系已划分成两个分组：疫苗-A和疫苗-B。疫苗-A被设计成在上臂中皮内施用并且疫苗-B被设计成在大腿中皮内施用。疫苗A和B一起构成单位剂量的癌症疫苗。
表119.细胞系命名和修饰
在上表中指示的情况下，已使用利用慢病毒载体进行shRNA转导，减弱免疫抑制因子转型生长因子-β1(TGFβ1)和转型生长因子-β2(TGFβ2)的基因。CD276的基因通过使用锌指核酸酶(ZFN)进行电穿孔来敲除，或使用利用慢病毒载体进行shRNA转导来减弱。通过慢病毒载体转导添加颗粒球巨噬细胞-群落刺激因子(GM-CSF)、IL-12、CD40L、modTERT(AU565)、modPSMA(CAMA-1)、modTBXT(T47D)和modBORIS(T47D)的基因。
本文提供两种组合物，各包含治疗有效量的三种癌细胞系，即单位剂量的六种癌细胞系，该等癌细胞系被修饰以减少至少一种免疫抑制因子的表达和表达至少两种免疫刺激因子。一种组合物BRC疫苗-A被修饰以增加两种TAA modTERT和modPSMA的表达。第二组合物BRC疫苗-B被修饰以表达两种TAAmodTBXT和modBORIS。单位剂量的六种癌细胞系表达至少15种与意图接受该组合物的乳腺癌受试者的子集的癌症相关的TAA并且诱导超过未被修饰的组合物组分2.2倍的IFNγ反应。
实例37：GBM疫苗组分细胞系适应无异种培养基中的生长
适应过程概述
将GBM疫苗组合物的五种组分细胞系(DBTRG-05MG、LN-229、GB1、KNS-60和SF-126)直接在无异种、无血清和缺乏非人类要素的培养基中培养(A1D、A2D)或相继适应(A1W、A2W)在该培养基中生长。对于各细胞系，测试两种培养基配制物。常规培养基由补充有10％FBS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、MEM-NEAA(仅在DMEM中使用非必需氨基酸)和抗生素的RPMI(DBTRG-05MG，LN-229)或DMEM(GB1、KNS-60、SF-126)组成(表120)。无异种培养基含有15％无异种替代品(XFR)替换FBS，并且抗生素浓度与常规培养基不同(A1-XFR培养基：基于RPMI或DMEM的培养基，与表121中所示的抗生素一起配制；A2-XFR培养基：基于RPMI或DMEM的培养基，与表122中所示的抗生素一起配制)。值得注意地，添加至培养基配制物中用于选择转基因的抗生素与培养基中存在的蛋白质结合。由于无异种培养基中与含FBS的培养基相比蛋白质浓度较低，所以将抗生素浓度降低以分别在A1-XFR和A2-XFR培养基中测试两种不同浓度。针对在2种培养基配制物A1-XFR和A2-XFR以及两种适应条件(比较直接涂铺(A1D、A2D)与连续脱离(sequential weaning)(A1W、A2W))中的生长，筛选五种GBM疫苗组分细胞系中每一种。
为证实适应无异种培养基配制物，监测细胞形态和增殖。终止显示在锥虫蓝染色时无活性的非粘附漂浮细胞的培养条件。收获与在含FBS的培养基中的对照具有类似形态的在无异种培养基中稳定生长并且进行抗生素选择至少3周的细胞系，并且分析被修饰的基因的表达。
表120：用于选择插入的转基因的基础培养基(含有FBS)抗生素浓度
表121：用于选择插入的转基因的A1-XFR培养基抗生素浓度
表122：用于选择插入的转基因的A2-XFR培养基抗生素浓度
在无异种培养基中生长的细胞系中的转基因表达的分析
针对在2种培养基配制物A1-XFR和A2-XFR以及两种适应条件(比较直接涂铺(A1D)与连续脱离(A1W、A2W))中的生长，筛选五种GBM疫苗组分细胞系中的每一种。针对转基因的表达，分析显示稳定细胞生长、最小细胞死亡和形态与在FBS中生长的细胞相当的条件。
为获得分泌的细胞因子的可再现测量，进行分泌分析。将细胞于无异种培养基中以0.75×106和0.5×106个细胞/孔一式两份地接种于用玻璃连结蛋白涂布的6孔盘中。在24小时后，培养基替换为新鲜的无异种培养基。再过48小时后，收获上清液，用于通过ELISA进行分析。同时，收获细胞，用于通过流式细胞术评估CD40L表达。简单来说，在收获之后，将细胞用藻红素结合的抗人类CD40L(纯系TRAP1)染色。通过流式细胞术，使用LSR Fortessa流式细胞仪分析经标记的细胞。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量分泌的细胞因子。简单来说，对于各样品，对上清液进行二-四倍稀释。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)(R&DSystems)测定TGFβ1和TGFβ2含量。TGFβ1和TGFβ2分泌以皮克/106个细胞/24小时为单位报告。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，分别利用来自R&D Systems和Biolegend的试剂盒来测定GM-CSF和IL-12含量。GM-CSF和IL-12分泌含量以纳克/106个细胞/24小时为单位报告。
在适应无异种培养基之后各个细胞系中的转基因表达的结果
用于适应过程的DBTRG-05MG细胞被修饰以减少TGFβ1表达和表达CD40L和IL-12。当在4-6周过程中脱离在100％A1-XFR培养基中生长时细胞增殖稳定，但与在含FBS的培养基中生长的未被修饰的亲本细胞的38.3小时相比，倍增时间增加至586.8小时(表123)。直接涂铺在A1-XFR培养基中可导致增殖停滞和细胞死亡。对适应在A1-XFR培养基中生长的被修饰的DBTRG-05MG细胞的分析显示，表达CD40L，并且检测到IL-12的分泌并且定量为196.5纳克/106/24小时，而与在FBS中生长的未被修饰的亲本DBTRG-05MG细胞相比TGFβ1的分泌减少88％。未被修饰的DBTR-05MG细胞不表达CD40L或产生IL-12。
用于适应过程的LN-229细胞被修饰以减少TGFβ1表达和过度表达CD40L、GM-CSF和IL-12。当直接涂铺在100％A1-XFR培养基中时细胞增殖稳定，其中与在含FBS的培养基中生长的未被修饰的亲本细胞的34.5小时相比，倍增时间为59.7小时(表123)。当在4-6周过程中脱离在100％A2-XFR培养基中生长时，倍增时间为71小时(表4)。对适应在A1-XFR和A2-XFR培养基中生长的被修饰的LN-229细胞的分析显示，表达CD40L，并且检测到IL-12的分泌并且定量为527纳克/106/24小时(A1D)和603纳克/106/24小时(A2W)，检测到GM-CSF并且定量为2029.8纳克/106/24小时(A1D)和2505.8纳克/106/24小时(A2W)，并且与在FBS中生长的未被修饰的亲本细胞相比TGFβ1含量减少79.2％(A1D)或78.9％(A2W)。未被修饰的LN-229细胞不表达CD40L或产生IL-12或GM-CSF。
用于适应过程的GB1细胞被修饰以减少TGFβ1表达和过度表达CD40L和IL-12。当直接涂铺在100％A1-XFR培养基中时细胞增殖稳定，其中与在含FBS的培养基中生长的未被修饰的亲本细胞的37.9小时相比，倍增时间为144.1小时(表123)。当在4-6周过程中脱离在100％A1-XFR培养基中生长时，倍增时间为597.2小时，并且在A2-XFR培养基中为266.8小时(表4)。对适应在A1-XFR和A2-XFR培养基中生长的被修饰的GB1细胞的分析显示，表达CD40L，并且检测到IL-12的分泌并且定量为117.5纳克/106/24小时(A1D)、76.6纳克/106/24小时(A1W)和72.0纳克/106/24小时(A2W)，并且与在FBS中生长的未被修饰的亲本细胞相比TGFβ1含量减少64.3％(A1D)、74.6％(A1W)和90.8％(A2W)。未被修饰的GB1细胞不表达CD40L或产生IL-12。
用于适应过程的KNS-60细胞被修饰以表达减少含量的TGFβ1和TGFβ2并且过度表达CD40L、GM-CSF和IL-12。当脱离在100％A1-XFR培养基中生长时细胞增殖稳定，其中与在含FBS的培养基中生长的未被修饰的亲本细胞的40.0小时相比，倍增时间为674.2小时(表123)。当在4-6周过程中脱离在100％A2-XFR培养基中生长时，倍增时间为303.8小时(表4)。对适应在A1-XFR和A2-XFR培养基中生长的被修饰的KNS-60细胞的分析显示，表达CD40L，并且检测到IL-12的分泌并且定量为700.0纳克/106/24小时(A1W)和482.2纳克/106/24小时(A2W)，检测到GM-CSF的分泌并且定量为182.5纳克/106/24小时(A1W)和156.9纳克/106/24小时(A2W)，并且与在FBS中生长的未被修饰的亲本细胞相比TGFβ1含量减少83.2％(A1W)和87.7％(A2W)并且TGFβ2含量减少92.6％(A1W)和94.7％(A2W)。未被修饰的KNS-60细胞不表达CD40L或产生IL-12或GM-CSF。
用于适应过程的SF-126细胞被修饰以表达减少含量的TGFβ1和TGFβ2并且过度表达CD40L、GM-CSF和IL-12。当脱离在100％A1-XFR培养基中生长时细胞增殖稳定，其中与在含FBS的培养基中生长的未被修饰的亲本细胞的28.3小时相比，倍增时间为172.1小时(表123)。当在4-6周过程中脱离在100％A2-XFR培养基中生长时，倍增时间为456.6小时(表4)。对适应在A1-XFR和A2-XFR培养基中生长的被修饰的SF-126细胞的分析显示，表达CD40L，并且检测到IL-12的分泌并且定量为671.2纳克/106/24小时(A1W)和684.9纳克/106/24小时(A2W)，检测到GM-CSF的分泌并且定量为51.2纳克/106/24小时(A1W)和39.3纳克/106/24小时(A2W)，并且与在FBS中生长的未被修饰的亲本细胞相比TGFβ1含量减少86.9％(A1W)和91.2％(A2W)并且TGFβ2含量减少80.4％(A1W)和98.8％(A2W)。未被修饰的SF-126细胞不表达CD40L或产生IL-12或GM-CSF。
总之，所有五种被修饰的GBM疫苗组分细胞系都稳定地适应无异种培养基配制物。细胞以稳定速率增殖，维持插入的转基因的表达并且还保留TGFβ1和TGFβ2的减少。
表123：疫苗组分细胞系在含FBS的培养基和无异种培养基中的倍增时间
实例38：NSCLC疫苗组分细胞系适应无异种培养基中的生长
适应过程概述
将NSCLC疫苗组合物的六种组分细胞系(NCI-H23、A549、NCI-H460、DMS 53、LK-2和NCI-H520)相继适应在无异种、无血清和缺乏非人类要素的培养基中生长。对于六种细胞系中的每一种，测试四种无异种培养基配制物。培养基配制物为KSC pH 7.2、KSC pH 6.8、KSRpH 7.2和KSRpH 6.8。还维持细胞在常规培养基中的其它对照条件，该常规培养基由补充有10％FBS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和HEPES的RPMI构成。各无异种培养基配制物由不同基础培养基(KSC或KSR)与作为无异种血清替代品的10％人类血清白蛋白(HSA)构成并且添加抗生素至培养基以维持插入的转基因的表达，如表124中所示。因为无异种培养基的总蛋白含量与含有FBS的培养基的总蛋白含量相当，所以使用选择的抗生素含量与基于FBS的培养基中相同。另外，各培养基配制物在两种氧含量下测试-正常21％氧和低3％氧。为证实适应无异种培养基配制物，观察细胞在测试培养基中增殖的能力。终止基于目测到非粘附漂浮物而显示细胞死亡的条件，该漂浮物在用活力染料染色时无活性。收获具有类似于对照FBS孔的形态、在XF培养基中稳定生长和进行抗生素选择至少3周的细胞，并且分析插入的转基因的表达。
表124用于选择插入的转基因的NSCLC抗生素浓度
在无异种培养基中生长的细胞系中的转基因表达的分析
针对在4种培养基配制物和2种氧含量中生长，筛选六种疫苗组分细胞系中的每一种。针对转基因的表达，分析显示稳定细胞生长、最小细胞死亡和形态与在FBS中生长的细胞相当的条件。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量分泌的细胞因子。简单来说，对于各样品，对上清液进行二-四倍稀释，并且所示数据为所测试的所有条件的平均值，针对稀释因子和细胞计数正规化。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)(R&D Systems)测定TGFβ1和TGFβ2含量。TGFβ1和TGFβ2分泌以皮克/毫升/106个细胞为单位报告。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，分别利用来自R&D Systems和Biolegend的试剂盒来测定GM-CSF和IL-12含量。GM-CSF和IL-12分泌含量以纳克/毫升/106个细胞为单位报告。通过流式细胞术评估CD40L的表达。简单来说，在收获之后，将细胞用藻红素结合的抗人类CD40L(纯系TRAP1)染色。通过流式细胞术，使用LSR Fortessa流式细胞仪分析被标记的细胞。
在适应无异种培养基之后各个细胞系中的转基因表达的结果
NCI-H23细胞显示在处理培养基4(KSRpH 7.2)和5(KSR pH 6.8)中在正常21％氧条件下稳定生长。细胞在其它处理条件下无法增殖。发现表面蛋白质CD40L的表达稳定，并且表达量与在FBS中生长的细胞相当。与FBS相比，发现在无异种培养基配制物中IL-12和GM-CSF的分泌分别增加1.7倍(IL-12培养基4和5)和2.3倍(GM-CSF培养基4和5)。与含FBS的培养基中的细胞相比，发现在XF培养基中TGFβ1和TGFβ2的减少更大，其中在培养基4中TGFβ1的含量小10倍并且在培养基5中小7倍，而在XF培养基中TGFβ2无法检测到。
A549细胞显示在处理培养基4(KSRpH 7.2)和5(KSRpH 6.8)中在正常21％氧下以及在处理培养基5中在低3％氧条件下稳定生长。细胞在其它处理条件下无法增殖。发现表面蛋白质CD40L的表达稳定，并且表达量与在FBS中生长的细胞相当。
发现在无异种培养基4中在正常21％氧下生长，IL-12的分泌与FBS相当，在培养基5中在正常21％氧条件下增加1.6倍，并且在培养基5中在低3％氧条件下减少0.6倍。发现在无异种培养基4中在正常21％氧下生长，GM-CSF的分泌与FBS相当，在培养基5中在正常21％氧条件下增加1.4倍，并且在培养基5中在低3％氧条件下减少0.6倍。与在含FBS的培养基中的细胞相比，发现在XF培养基中TGFβ1和TGFβ2的减少更大，其中在培养基4中在正常21％氧下TGFβ1含量小3.4倍，并且在培养基5中在正常21％氧下小3.1倍，并且在培养基5中在低3％氧下小2倍，而在培养基4中在正常21％氧下TGFβ2减少2.2倍，并且在XF培养基5中在低3％或正常21％氧条件下无法检测到。
NCI-H460细胞显示在处理培养基4(KSRpH 7.2)和5(KSRpH 6.8)中在正常21％氧条件下稳定生长。细胞在其它处理条件下无法增殖。发现表面蛋白质CD40L的表达稳定，并且表达量与在FBS中生长的细胞相当。与FBS相比，发现在无异种培养基配制物中IL-12的分泌增加，在培养基4中3.2倍和在培养基5中1.7倍。在无异种培养基中GM-CSF也增加，在培养基4中3.5倍和在培养基5中1.8倍。与含FBS的培养基中的细胞相比，发现在XF培养基中TGFβ1和TGFβ2的减少更大，其中在XF培养基4和5中TGFβ1含量无法检测到并且在培养基4中TGFβ2减少1.6倍并且在培养基5中减少3.4倍。
DMS 53细胞显示在处理培养基4(KSR pH 7.2)和5(KSR pH 6.8)中在正常21％氧条件下稳定生长。细胞在其它处理条件下无法增殖。发现表面蛋白质CD40L的表达稳定，并且表达量与在FBS中生长的细胞相当。在无异种培养基中GM-CSF分泌也增加，在培养基4中3.5倍和在培养基5中1.8倍。与在含FBS的培养基中的细胞相比，发现在XF培养基4中TGFβ2含量大1.2倍，而在培养基5中减少1.8倍。细胞系不被修饰成过度表达IL-12或TGFβ1含量降低。
LK-2细胞显示在处理培养基4(KSRpH 7.2)和5(KSRpH 6.8)中在正常21％氧条件下稳定生长。细胞在其它处理条件下无法增殖。发现表面蛋白质CD40L的表达稳定，并且表达量与在FBS中生长的细胞相当。在无异种培养基中GM-CSF分泌也增加，在培养基4中2.8倍和在培养基5中3.1倍。与含FBS的培养基中的细胞相比，在无异种培养基中TGFβ1含量无法检测到，并且在培养基4中TGFβ2含量减少6倍和在培养基5中减少2.3倍。细胞系不被修饰成过度表达IL-12。
NCI-H520细胞显示在处理培养基4(KSRpH 7.2)和5(KSRpH 6.8)中在正常21％氧下以及在低3％氧条件下稳定生长。细胞在其它处理条件下无法增殖。发现表面蛋白质CD40L的表达稳定，并且表达量与在FBS中生长的细胞相当。在无异种培养基4和5中在正常21％条件下生长，GM-CSF分泌分别增加1.5和1.3倍。在低3％氧条件下生长的细胞中GM-CSF分泌也增加，在培养基4中2.1倍和在培养基5中2.2倍。在培养基4和5中在正常21％氧下TGFβ1分泌增加10倍，而当细胞在低3％氧下生长时无法检测到。在培养基4和5中在正常21％氧下TGFβ2分泌减少3倍和1.2倍，而当细胞在低3％氧下生长时无法检测到。细胞系不被修饰成过度表达IL-12。
总之，所有六种被修饰的NSCLC疫苗组分细胞系稳定地适应无异种培养基条件。细胞保留TGFβ1和TGFβ2分泌的减少，并且与在FBS中生长的被修饰的细胞相比，发现在无异种配制物中GM-CSF和IL-12的分泌相当或增加。在所有测试条件下，检测到与在FBS中生长的细胞类似的表面蛋白质CD40L的表达量。
实例39：同种异体肿瘤细胞疫苗平台
本实例提供使用多种同种异体肿瘤细胞疫苗治疗和/或预防癌症和/或刺激免疫反应的组合物和方法。鉴于本文提供的传授内容，在一些实施例中，本公开涵盖以下细胞系组合和修饰。还考虑其它实施例(例如如本文所提供的替代细胞系和/或修饰)。
表125.小细胞肺癌疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.DMS114 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 2.NCI-H196 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 3.NCI-H1092 | ND | x | x | x | * | * | ** |
| 4.SBC-5 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 5.NCI-H510A | x | x | x | x | * | * | ** |
| 6.NCI-H889 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 7.NCI-H1341 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 8.NCIH-1876 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 9.NCI-H2029 | ND | x | x | x | * | * | ** |
| 10.NCI-H841 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 11.NCI-H1694 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，小细胞肺癌疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：MAGEA1和DLL3。
表126.肝癌疫苗
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，肝癌疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：CEA(CEACAM5)、MAGEA1、WT1和PSMA(FOLH1)。
表127.肾癌疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.A-498 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 2.A-704 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 3.769-P | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 4.786-O | x | x | x | x | * | * | ** |
| 5.ACHN | x | x | x | x | * | * | ** |
| 6.KMRC-1 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 7.KMRC-2 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 8.VMRC-RCZ | x | x | x | x | * | * | ** |
| 9.VMRC-RCW | x | x | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，肾癌疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：MAGEA1、DLL3、CEA(CEACAM5)和PSMA(FOLH1)
表128.胰腺癌疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.PANC-1 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 4.KP-3 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 5.KP-4 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 7.SUIT-2 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 8.AsPC-1 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 9.PSN1 | x | x | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，胰腺癌疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：PSMA(FOLH1)、BORIS(CTCFL)、DLL3
表129.食道癌疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.TE-10 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 2.TE-6 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 3.TE-4 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 4.EC-GI-10 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 5.OE33 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 6.TE-9 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 7.TT | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 8.TE-11 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 9.OE19 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 10.OE21 | x | x | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，食道癌疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：WT1和PSMA(FOLH1)。
表130.子宫内膜癌疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.SNG-M | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 2.HEC-1-B | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 3.JHUEM-3 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 4.RL95-2 | ND | ND | x | x | * | * | ** |
| 5.MFE-280 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 6.MFE-296 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 7.TEN | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 8.JHUEM-2 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 9.AN3-CA | ND | x | x | x | * | * | ** |
| 10.石川 | x | x | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，子宫内膜癌疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：BORIS(CTCFL)、WT1、PSMA(FOLH1)
表131.黑色素瘤癌症疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.RPMI-7951 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 2.MeWo | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 3.Hs688(A).T | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 4.COLO829 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 5.C32 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 6.A-375 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 7.Hs294T | x | x | x | x | * | * | ** |
| 8.Hs695T | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 9.Hs852T | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 10.A2058 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，黑色素瘤癌症疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：MART-1(MLANA)、TYRP1和PSMA(FOLH1)
表132.间皮瘤癌症疫苗
| 细胞系 | TGFβ1 KD | TGFβ2 KD | CD276 KO | CD40L | GM-CSF | IL-12 | TAAs |
| 1.NCI-H28 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 2.MSTO-211H | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 3.IST-Mes1 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 4.ACC-MESO-1 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 5.NCI-H2052 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 6.NCI-H2452 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| 7.MPP89 | x | x | x | x | * | * | ** |
| 8.IST-Mes2 | x | ND | x | x | * | * | ** |
| DMS53 | ND | x | x | x | x | x | ND |
ND＝未进行
*＝在一些实施例中，一种或多种细胞系将被转导以产生至少15,000纳克GM-CSF/混合物和至少4,000纳克IL-12/混合物
**＝在一些实施例中，间皮瘤癌症疫苗将被修饰以表达以下TAA中的一种或多种：WT1、BORIS(CTCFL)和MAGEA1。
实例40：通过引入非同义突变(NSM)至优先全长肿瘤相关抗原(TAA)中来改善疫苗
诱导的细胞免疫反应的广度和量值
经由诱导抗肿瘤细胞免疫的癌症免疫疗法已变成靶向癌症的一种有前景的方法。许多治疗性癌症疫苗平台靶向在肿瘤细胞中过度表达的肿瘤相关抗原(TAA)，然而，使用这些抗原的癌症疫苗必须足够有效以打破耐受性。在本文中的各种实施例中描述的癌症疫苗被设计成能够引发广泛并且稳固的针对肿瘤的细胞反应。新抗原决定基是由在肿瘤生长期间出现的体细胞突变产生的非自身抗原决定基。具有较高突变负荷的肿瘤类型对检查点抑制剂疗法起反应而与持久临床益处相关。靶向新抗原决定基具有许多优点，因为这些新抗原决定基真正为肿瘤特异性的并且不受胸腺中的中央耐受性影响。编码具有由非同义突变(NSM)产生的新抗原决定基的全长TAA的癌症疫苗可能引发更有效免疫反应并且改善广度和量值。
抗原设计过程
TAA选择和优先化
TAA是自身抗原，其在肿瘤中优先或异常表达，但也可以在正常细胞中以一定水平表达。如本文所述，选择和优先化TAA作为疫苗目标是癌症疫苗研发的关键步骤。多个标准用于TAA评估和选择。首先，鉴别TAA并且分为多个类别，包括：
A.增殖
B.粘附、迁移和转移
C.血管生成
D.癌症干细胞目标
E.未知功能
另外，评估各组中TAA的组织特异性并且确定过度表达各TAA的肿瘤样品的百分比。只要适用，优选使用由IHC测量的蛋白质表达数据。在没有可以利用的表达数据下，收集来自The Human Protein Atlas的表达数据。最后，优先考虑各组中的TAA，并且基于所述标准选择TAA。作为实例，下表133中概述在TAA选择和优先化之后的GBM TAA。
表133：GBM优先TAA
组分肿瘤细胞系的表达概况和用于设计和插入的TAA鉴别
为确定所选优先TAA是否需要在构成疫苗组合物的组分细胞系中过度表达，创建针对各适应症的所有组分细胞系的表达概况以确定是否能够发现所选TAA在这些细胞系中的内源性表达。使用在2019年10月7日至2020年5月20日之间自可公开获得的癌细胞系百科全书(CCLE)数据库下载的RNA-seq数据确定潜在组分细胞系中TAA的表达(www.broadinstitute.org/ccle；Barretina,J等人《自然》.2012.)。HUGO基因命名委员会基因符号输入至CCLE中并且针对各TAA下载mRNA表达。如果RNA-seq值(FPKM)超过0，则TAA表达视为阳性。在优先TAA当中，鉴别出不由任何细胞系表达或仅由构成细胞系治疗组合的一种细胞系表达的TAA用于设计和插入。当抗原由超过一种细胞系表达但其RNA表达量仅在一种细胞系中超过1.0FPKM时，也可以选择其用于设计和插入。多种GBM细胞系的TAA表达概况(热图)的一个实例在图78中示出。
使用图78中的数据测定表66中列出的优先TAA在GBM细胞系中的表达。如图78中所指示，无细胞系展现阳性hTERT或PSMA表达(hTERT和PSMA的RNA-seq值均呈阴性)，而GB49为唯一表达MAGE-A1的细胞系。因此，在所选GBM细胞系中进行hTERT、PSMA和MAGE至A1的设计/增强和过度表达。
抗原设计方法
在选择需要过度表达的TAA之后，为增加抗原特异性细胞免疫反应的广度和量值，利用多阶段设计策略来产生具有在癌症患者中经常出现的非同义突变的被修饰的TAA。
在2020年2月23日与2020年6月2日之间自以下可公开获得的数据库下载患者肿瘤样品数据：cBioPortal(cbioportal.org)(Cerami,E.等人《癌症研究》2012.；Gao,J.等人《科学信号》2013.)。使用“精选的非冗余研究集”数据集，并且其含有176个研究，对来自44,354名癌症患者的46,706个肿瘤样品进行全外显子或转录组测序。表134列出名称、原发性肿瘤的部位、样品数目和所查询176个研究的cBioPortal文献引用。
表134.
针对所关注的抗原，使用HUGO基因命名委员会基因符号查询非冗余数据集。下载目标抗原中发生的错义突变，并且按发生频率分类。使用可公开获得的NetMHCpan 4.0数据库，鉴别出≥2个患者样品中发生的错义突变，并且评估诱导新抗原决定基的潜力(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetMHCpan-4.0)(Jurtz V等人,《免疫学杂志(JImmunol.)》2017)。所包括的HLA超型为HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-A*26:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-B*27:05、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*58:01和HLA-B*15:01。
表135.
| 超型 | 代表 |
| A01 | HLA-A*01:01 |
| A02 | HLA-A*02:01 |
| A03 | HLA-A*03:01 |
| A24 | HLA-A*24:02 |
| A26 | HLA-A*26:01 |
| B07 | HLA-B*07:02 |
| B08 | HLA-B*08:01 |
| B27 | HLA-B*27:05 |
| B39 | HLA-B*39:01 |
| B44 | HLA-B*40:01 |
| B58 | HLA-B*58:01 |
| B62 | HLA-B*15:01 |
将强结合物的阈值设置为建议阈值0.5，这意指预测秩％低于0.5的任何肽都将被标注为强结合物。将弱结合物的阈值设置为建议2.0，这意指预测秩％低于2.0但高于0.5的任何肽均将被标注为弱结合物。
为确定将在≥2个患者样品中出现的NSM引入人类天然抗原中是否会产生新抗原决定基或将弱结合物变为强结合物，首先使用人类天然TAA蛋白序列产生包括强结合物与弱结合物的HLA-A和HLA-B超型限制性9聚体抗原决定基的列表(列表#1)。接着，自人类天然抗原的5'端起始，通过用NSM替换相同位置的天然残基，将各特异性NSM引入人类天然抗原中。用NSM得到的抗原用于产生包括强结合物与弱结合物的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基的新列表(列表#2)。通过比较列表#2与列表#1，计算新抗原决定基(强结合物和弱结合物)和消除的抗原决定基的数目。如果一种特异性NSM的引入产生更多新抗原决定基，那么此NSM将包括在人类天然TAA中。如果一种特异性NSM的引入创建相同数目的新抗原决定基和消除的抗原决定基，但其将更多弱结合物变为强结合物，那么仍决定将此NSM包括在人类天然TAA中。如果两种NSM之间的氨基酸残基少于9个，那么也对每个各个NSM以及两个NSM的组合进行评估。一旦评估完成，就进行序列比对以确定人类天然TAA与具有NSM的人类TAA之间的蛋白质序列一致性。如果序列一致性低于90％，那么仅包括在≥2个患者样品中出现的会产生新抗原决定基或将弱结合物变为强结合物的NSM。
作为实例，使用上述方法设计具有NSM的PSMA。图129示出人类天然PSMA(NCBI基因ID:2346)与所设计的具有NSM的PSMA(modPSMA；SEQ ID NO:38)之间的序列比对。NSM(在huPSMA与modPSMA之间不同的残基)以灰色突出。huPSMA与modPSMA之间的序列一致性为96.4％。
表136中概述huPSMA和modPSMA的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对PSMA鉴别出49种出现≥2次的NSM，27种包括在modPSMA抗原序列中。与天然PSMA相比，modPSMA含有因NSM引入而产生的其它41种新抗原决定基。
表136.天然和设计(mod)PSMA中的抗原决定基
表137中概述人类WT1(NCBI基因ID:7490)和modWT1(SEQ ID NO:81)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对WT1鉴别出46种出现≥2次的NSM，并且28种包括在modWT1抗原序列中。与天然WT1相比，modWT1还含有因NSM引入而产生的其它33种新抗原决定基。
表137.天然和设计(mod)WT1中的抗原决定基
表138中概述人类FSHR(NCBI基因ID:2492)和modFSHR(SEQ ID NO:95)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对FSHR鉴别出70种出现≥2次的NSM，并且26种包括在modFSHR抗原序列中。与天然FSHR相比，modFSHR还含有因NSM引入而产生的47种新抗原决定基。
表138.天然和设计(mod)FSHR中的抗原决定基
表139中概述人类TERT(NCBI基因ID:7015)和modTERT(SEQ ID NO:36)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对TERT鉴别出75种出现≥2次的NSM，并且43种包括在modTERT抗原序列中。与天然TERT相比，modTERT还含有因NSM引入而产生的47种新抗原决定基。
表139.天然和设计(mod)TERT中的抗原决定基
T表140中概述BORIS(NCBI基因ID:140690)和modBORIS(SEQ ID NO:60)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对BORIS鉴别出51种出现≥2次的NSM，并且33种包括在modBORIS抗原序列中。与天然BORIS相比，modBORIS还含有因NSM引入而产生的27种新抗原决定基。
表140.天然和设计(mod)BORIS(CTCFL)中的抗原决定基
表141中概述MSLN(NCBI基因ID:10232)和modMSLN(SEQ ID NO:62)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对MSLN鉴别出23种出现≥2次的NSM，并且13种包括在modMSLN抗原序列中。与天然MSLN相比，modMSLN还含有因NSM引入而产生的23种新抗原决定基。
表141.天然和设计(mod)MSLN中的抗原决定基
表142中概述TBXT(NCBI基因ID:6862)和modTBXT(SEQ ID NO:79)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对TBXT鉴别出44种出现≥2次的NSM，并且16种包括在modTBXT抗原序列中。与天然TBXT相比，modTBXT还含有因NSM引入而产生的34种新抗原决定基。
表142.天然和设计(mod)TBXT中的抗原决定基
表143中概述PRAME(NCBI基因ID:23532)和modPRAME(SEQ ID NO:99)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对PRAME鉴别出27种出现≥2次的NSM，并且20种包括在modPRAME抗原序列中。与天然PRAME相比，modPRAME还含有因NSM引入而产生的35种新抗原决定基。
表143.天然和设计(mod)PRAME中的抗原决定基
表144中概述TDGF1(NCBI基因ID:6997)和modTDGF1(SEQ ID NO:89)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对TDGF1鉴别出9种出现≥2次的NSM，并且7种包括在modTDGF1抗原序列中。与天然TDGF1相比，modTDGF1还含有因NSM引入而产生的11种新抗原决定基。
表144.天然和设计(mod)TDGF1中的抗原决定基
表145中概述FOLR1(NCBI基因ID:2348)和modFOLR1(SEQ ID NO:93)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对FOLR1鉴别出15种出现≥2次的NSM，并且9种包括在modFOLR1抗原序列中。与天然FOLR1相比，modFOLR1还含有因NSM引入而产生的7种新抗原决定基。
表145.天然和设计(mod)FOLR1中的抗原决定基
表146中概述CLDN18(NCBI基因ID:51208)和modCLDN18(SEQ ID NO:110)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对CLDN18鉴别出22种出现≥2次的NSM，并且11种包括在modCLDN18抗原序列中。与天然CLDN18相比，modCLDN18还含有因NSM引入而产生的22种新抗原决定基。
表146.天然和设计(mod)CLDN18中的抗原决定基
表147中概述Ly6K(NCBI基因ID:54742)和modLy6K(SEQ ID NO:112)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对Ly6K鉴别出9种出现≥2次的NSM，并且7种包括在modLy6K抗原序列中。与天然Ly6K相比，modLy6K还含有因NSM引入而产生的6种新抗原决定基。
表147.天然和设计(mod)Ly6K中的抗原决定基
表148中概述MAGEA10(NCBI基因ID:4109)和modMAGEA10(SEQ ID NO:97)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对MAGEA10鉴别出38种出现≥2次的NSM，并且13种包括在modMAGEA10抗原序列中。与天然MAGEA10相比，modMAGEA10还含有因NSM引入而产生的29种新抗原决定基。
表148.天然和设计(mod)MAGEA10中的抗原决定基
表149中概述MAGEC2(NCBI基因ID:51438)和modMAGEC2(SEQ ID NO:87)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对MAGEC2鉴别出45种出现≥2次的NSM，并且8种包括在modMAGEC2抗原序列中。与天然MAGEC2相比，modMAGEC2还含有因NSM引入而产生的14种新抗原决定基。
表149.天然和设计(mod)MAGEC2中的抗原决定基
表150中概述FAP(NCBI基因ID:2191)和modFAP(SEQ ID NO:115)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对FAP鉴别出59种出现≥2次的NSM，并且25种包括在modFAP抗原序列中。与天然FAP相比，modFAP还含有因NSM引入而产生的22种新抗原决定基。
表150.天然和设计(mod)FAP中的抗原决定基
表151中概述MAGEA1(NCBI基因ID:4100)和modMAGEA1(SEQ ID NO:73)的HLA-A和HLA-B超型限制性抗原决定基。针对MAGEA1鉴别出16种出现≥2次的NSM，并且10种包括在modMAGEA1抗原序列中。与天然MAGEA1相比，modMAGEA1还含有因NSM引入而产生的7种新抗原决定基。
表151.天然和设计(mod)MAGEA1中的抗原决定基
表152.设计(mod)抗原的天然序列
| TAA名称 | NCBI基因符号(基因ID) |
| TERT | TERT(7015) |
| PSMA(FOLH1) | FOLH1(2346) |
| MAGEA1 | MAGEA1(4100) |
| TBXT | TBXT(6862) |
| BORIS | CTCFL(140690) |
| FSHR | FSHR(2492) |
| MAGEA10 | MAGEA10(4109) |
| MAGEC2 | MAGEC2(51438) |
| WT1 | WT1(7490) |
| FBP | FOLR1(2348) |
| TDGF1 | TDGF1(6997) |
| 紧密连接蛋白18 | CLDN18(51208) |
| LY6K | LY6K(54742) |
| 间皮素 | MSLN(10232) |
| FAP | FAP(2191) |
| PRAME | PRAME(23532) |
下表描述GBM中示例性TAA组合的HLA-A和HLA-B超型的预测抗原决定基。PSMA(SEQID NO:70)、modPSMA(SEQ ID NO:38)、天然TERT(基因ID 7015)、modTERT(SEQ ID NO:36)、天然MAGEA1(基因ID 4100)和modMAGEA1(SEQ ID NO:73)的预测抗原决定基由HLA-A和HLA-B超型指示。表153证明设计抗原的组合产生总共82种新抗原决定基：modPSMA产生41种新抗原决定基，modTERT产生34种新抗原决定基并且modMAGEA1产生7种新抗原决定基。图130A展示在可自美国四个主要人种和种族普查类别的国家骨髓供体计划数据库(LMaiers,M.等人,(2007))中的供体获得的28,034个高分辨率HLA等位基因和单纯型频率数据子集中HLA-A和HLA-B超型对的频率。根据Lundt等人(2004)，HLA-A和HLA-B超型被分配给在各种族亚组中HLA-A和HLA-B单纯型对之前第25百分位中出现的HLA-A和HLA-B等位基因对(图130B)。若HLAA或B单纯型均未分类为超型，则其不包括在分析内(离群值)。在2020年3月15日自可公开获得的数据库下载HLA-A和HLA-B对的数据https://bioinformatics.bethematchclini cal.org/hla-resources/haplotype-frequencies/high-resolution-hla-alleles-and- haplotypes-in-the-us-population/。如果根据Lundt等人，数据集中的HLA-A或HLA-B等位基因不属于HLA-A和HLA-B超型，那么从数据子集中排除其(图130C)。
表153.
在例示性实施例中，表154中提供存在于疫苗组合物的细胞系中并且通过GBM中的设计诱导的新抗原决定基。
表154.
图131示出存在于疫苗组合物的细胞系中并且通过GBM中的设计产生的新抗原决定基的数目，该等新抗原决定基由本文实例29中所述的群体子集内的表达HLA-A和HLA-B超型对的供体所识别。在四个种族亚群中识别出的新抗原决定基的中位数为20。
图132描绘由四种不同mRNA免疫疗法靶向的新抗原决定基的数目。一种mRNA免疫疗法靶向总共34种新抗原决定基并且其它三种mRNA疗法靶向总共20种新抗原决定基。人类表达两对HLA-A和HLA-B等位基因。在疫苗组合物的细胞系中存在并且由GBM中的设计产生的新抗原决定基中，在HLA-A3 HLA-B7和HLA-A1 HLA-B-8超型中表达HLA-A和HLA-B等位基因对的示例性患者将识别的新抗原决定基数目为四十三。疫苗组合物GBM中存在的二十种优先TAA中由所有HLA-A和HLA-B超型对识别的抗原决定基数目在1,500至2,000范围内。
实例41：临床方案
以下实例提供示例性临床方案。
剂型：如本文所公开的实施例中所述，疫苗组合物呈含有六个小瓶的包装提供至临床位点，各小瓶包含治疗有效量的来自癌细胞系的细胞，(因此总共六种细胞系)。细胞系中的三种构成混合物A并且其它三种细胞系构成混合物B，因此产生三个混合物A小瓶和三个混合物B小瓶。在施用时，自冷冻机中取出小瓶并且室温下解冻约5至约15分钟。两个混合物A小瓶的内含物用针头和注射器取出并且注射到第三个混合物A小瓶中。类似地，两个混合物B小瓶的内含物用针头和注射器取出并且注射到第三个混合物B小瓶中。
投药途径：在混合之后，将0.3mL混合物A吸取至注射器中并且呈皮内注射液施用上臂中。类似并且同时，将0.3mL混合物B吸取至注射器中并且呈皮内注射液施用大腿中。施用剂量为各细胞系约8×106(或任选的1×107)，在各注射部位的总剂量为约2.4×107(或任选的3×107)个细胞。施用多剂，并且在左右臂和左右大腿之间交替施用。如本文所述，0.3mL注射体积可分为3×0.1mL或2×0.15mL。
在一个实施例中，混合物A和混合物B包含如表45、56、65、74、83、92、101、110、119中所阐述的被修饰的细胞系。如本文所述，根据一些实施例，该临床方案可以用于其它适应症和使用细胞系组合的其它混合物。
给药方案：在各种实施例中，三个队列将接受疫苗与诸如派姆单抗的检查点抑制剂(CPI)的组合施用。在这些队列中，疫苗将在21天周期内施用以匹配CPI的施用。前四剂将每21天施用(直到第63天)并且接着其它三剂每42天施用(直到第189天)。继续自治疗中受益的患者将被允许继续以42天时间间隔(直到第399天)并且接着以84天时间间隔接受与CPI组合的其它五剂疫苗。
在第四队列中，疫苗将与德瓦鲁单抗组合施用。疫苗将在14天、21天或28天周期内施用以匹配德瓦鲁单抗的施用。例如，前三剂将每14天施用(直到第28天)并且接着其它四剂每42天施用(直到第196天)。继续自治疗中受益的患者将被允许继续以42天时间间隔(直到第406天)并且接着以84天时间间隔接受与德瓦鲁单抗组合的其它五剂疫苗。作为另一实例，前三剂将每28天施用。
在研究产品每次施用之前，所有患者将接受50毫克/天(或100毫克/天)口服剂量的环磷酰胺，历时七天。
已描述多个实施例。然而，应了解，在不背离本公开的精神和范围下，可进行各种修改。因此，其它实施例在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> Neuvogen, Inc.
<120> 肿瘤细胞疫苗
<130> 33193/54907
<150> US 62/943,055
<151> 2019-12-03
<160> 143
<170> 3.5版PatentIn
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc ctcgtggtga agaggatagt 360
caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420
gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480
ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540
cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600
ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660
caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720
gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780
ctctga 786
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
atgatcgaaa cctacaacca gacctcacca cgaagtgccg ccaccggact gcctattagt 60
atgaaaatct ttatgtacct gctgacagtg ttcctgatca cccagatgat cggctccgcc 120
ctgtttgccg tgtacctgca ccggagactg gacaagatcg aggatgagcg gaacctgcac 180
gaggacttcg tgtttatgaa gaccatccag cggtgcaaca caggcgagag aagcctgtcc 240
ctgctgaatt gtgaggagat caagagccag ttcgagggct ttgtgaagga catcatgctg 300
aacaaggagg agacaaagaa ggagaacagc ttcgagatgc ccagaggcga ggaggattcc 360
cagatcgccg cccacgtgat ctctgaggcc agctccaaga ccacaagcgt gctgcagtgg 420
gccgagaagg gctactatac catgtctaac aatctggtga cactggagaa cggcaagcag 480
ctgaccgtga agaggcaggg cctgtactat atctatgccc aggtgacatt ctgcagcaat 540
cgcgaggcct ctagccaggc cccctttatc gccagcctgt gcctgaagag ccctggcagg 600
ttcgagcgca tcctgctgag agccgccaac acccactcct ctgccaagcc atgcggacag 660
cagtcaatcc acctgggagg cgtgttcgag ctgcagccag gagcaagcgt gttcgtgaat 720
gtgactgacc catcacaggt gtctcacggc actggattca catcatttgg actgctgaaa 780
ctgtga 786
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Pro Arg Gly Glu Glu Asp Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 4
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
atggctcagc atggggctat gggggccttc agggctctgt gcggactggc tctgctgtgc 60
gctctgtcac tggggcagag accaacagga ggaccaggat gcggacctgg caggctgctg 120
ctgggcaccg gcacagacgc aaggtgctgt agagtgcaca ccacaaggtg ctgtcgcgac 180
taccctggcg aggagtgctg ttctgagtgg gattgcatgt gcgtgcagcc agagtttcac 240
tgtggcgatc cctgctgtac cacatgccgc caccacccat gtccacctgg acagggagtg 300
cagtctcagg gcaagttcag ctttggcttc cagtgcatcg actgtgcaag cggcaccttt 360
tccggaggac acgagggaca ctgcaagccc tggaccgatt gtacacagtt tggcttcctg 420
accgtgttcc ctggcaacaa gacacacaat gccgtgtgcg tgcctggctc cccaccagca 480
gagcccctgg gctggctgac cgtggtgctg ctggccgtgg cagcatgcgt gctgctgctg 540
acaagcgccc agctgggact gcacatctgg cagctgcggt cccagtgtat gtggccaaga 600
gagacccagc tgctgctgga ggtgcctcca tccacagagg acgcccggtc ttgccagttc 660
cccgaagagg agagggggga aagaagtgcc gaagaaaagg gaaggctggg agacctgtgg 720
gtg 723
<210> 5
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 6
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
ccagtccagg agtga 435
<210> 7
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
atgtggctgc agtctctgct gctgctgggc accgtcgcct gttctatttc cgcacccgct 60
cgctcccctt ctccctcaac tcagccttgg gagcacgtga acgccatcca ggaggcccgg 120
agactgctga atctgtcccg ggacaccgcc gccgagatga acgagacagt ggaagtgatc 180
tctgagatgt tcgatctgca ggagcccacc tgcctgcaga caaggctgga gctgtacaag 240
cagggcctgc gcggctctct gaccaagctg aagggcccac tgacaatgat ggccagccac 300
tataagcagc actgcccccc tacccccgag acaagctgtg ccacccagat catcacattc 360
gagtccttta aggagaacct gaaggacttt ctgctggtca ttccatttga ttgttgggag 420
cccgtgcagg agtga 435
<210> 8
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130 135 140
<210> 9
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
atgtgccatc agcaactggt tatatcttgg ttcagtctcg tctttctcgc gtcacccttg 60
gtcgctatct gggagcttaa aaaagatgtc tacgtcgttg aacttgattg gtaccctgat 120
gctccggggg aaatggtggt tttgacttgc gatacgccag aagaggatgg cataacgtgg 180
acactggacc agtcttcaga ggttctcggg tctggtaaga cactcactat acaggtgaag 240
gagtttggtg acgcaggaca atatacttgc cataaaggcg gcgaggtgct ctcccatagc 300
cttctgctcc ttcataaaaa agaggacggg atatggtcaa ctgacattct gaaggatcag 360
aaagaaccga agaacaaaac tttcctcaga tgcgaggcaa agaactattc aggccgcttt 420
acttgctggt ggctcactac catcagcact gacctcactt tcagcgtcaa gagcagtaga 480
ggctcaagtg acccacaagg ggttacatgc ggggccgcta cgttgtctgc cgagcgagtc 540
aggggagata ataaggaata tgagtatagc gttgaatgcc aagaagattc agcctgccca 600
gccgcagaag agagtcttcc catagaagtt atggtggacg cagttcataa actgaagtat 660
gagaactata catcttcctt ctttattcgc gatatcataa agcctgatcc tccgaaaaac 720
ttgcaactca agccgttgaa gaatagccga caggtcgagg tctcttggga gtatccagat 780
acgtggtcta ccccgcactc ctatttcagt ctcaccttct gtgtgcaggt gcaggggaaa 840
agtaagcggg aaaaaaagga ccgggtattt actgataaga cctccgctac agtgatttgt 900
agaaagaacg cctctatcag cgtgagagcc caggatagat attattctag tagttggtct 960
gagtgggcct ccgtcccttg ttccggaagc ggagccacga acttctctct gttaaagcaa 1020
gcaggagatg ttgaagaaaa ccccgggcct atgtgtccag cgcgcagcct cctccttgtg 1080
gctaccctgg tcctcctgga ccacctcagt ttggcccgaa acctgccggt cgctacaccc 1140
gatcctggaa tgtttccctg ccttcatcac agccagaatc tgctgagggc agtcagtaac 1200
atgctgcaga aggcgcggca aactctggag ttctatccat gtacctccga ggaaattgat 1260
cacgaggaca ttactaagga taaaacaagt acagtagaag cctgtttgcc tcttgagctc 1320
actaaaaatg agtcatgctt gaacagtcga gagacgagtt ttatcactaa cggttcatgc 1380
ttggcgtcca ggaagacaag ctttatgatg gcgctctgcc tgtcttctat atatgaagac 1440
cttaaaatgt accaagttga gtttaagacc atgaacgcca aacttttgat ggaccccaag 1500
aggcagatct tccttgatca gaatatgttg gcggtgatcg atgaacttat gcaagctttg 1560
aacttcaaca gtgagacagt gcctcagaaa agttccttgg aggaaccgga cttctataag 1620
accaagatca aactgtgcat tttgctgcat gcatttagaa ttcgagccgt tacaatcgac 1680
cgggtgatgt catatttgaa tgcatcataa 1710
<210> 10
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
325 330 335
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Cys
340 345 350
Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu Asp His
355 360 365
Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met
370 375 380
Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn
385 390 395 400
Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser
405 410 415
Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val
420 425 430
Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn
435 440 445
Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg
450 455 460
Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp
465 470 475 480
Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu
485 490 495
Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val
500 505 510
Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro
515 520 525
Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys
530 535 540
Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp
545 550 555 560
Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
565
<210> 11
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
atgtatagga tgcagctgct gtcatgtatc gcactgtccc tggcactggt gactaactct 60
aactgggtga atgtgatctc cgacctgaag aagatcgagg acctgatcca gtctatgcac 120
atcgatgcca ccctgtacac agagtccgac gtgcacccct cttgcaaggt gaccgccatg 180
aagtgtttcc tgctggagct gcaggtcatc agcctggaga gcggcgacgc atccatccac 240
gataccgtgg agaacctgat catcctggcc aacaatagcc tgagctccaa cggcaatgtg 300
acagagtccg gctgcaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaatatcaa agagttcctg 360
cagtcattcg tccatatcgt ccagatgttt atcaatacca gt 402
<210> 12
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
20 25 30
Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu
35 40 45
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
50 55 60
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
65 70 75 80
Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
85 90 95
Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
100 105 110
Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln
115 120 125
Met Phe Ile Asn Thr Ser
130
<210> 13
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
atgtgccatc agcagctggt cattagttgg tttagcctgg tctttctggc ctcacccctg 60
gtcgcaatct gggaactgaa gaaggacgtg tacgtggtgg agctggactg gtatccagat 120
gcaccaggag agatggtggt gctgacctgc gacacacctg aggaggatgg catcacctgg 180
acactggatc agagctccga ggtgctgggc agcggcaaga ccctgacaat ccaggtgaag 240
gagttcggcg acgccggcca gtacacatgt cacaagggcg gcgaggtgct gtcccactct 300
ctgctgctgc tgcacaagaa ggaggacggc atctggtcca cagacatcct gaaggatcag 360
aaggagccaa agaacaagac cttcctgcgg tgcgaggcca agaattatag cggccggttc 420
acctgttggt ggctgaccac aatctccacc gatctgacat tttctgtgaa gtctagcagg 480
ggctcctctg acccccaggg agtgacatgc ggagcagcca ccctgagcgc cgagcgggtg 540
agaggcgata acaaggagta cgagtattct gtggagtgcc aggaggacag cgcctgtcca 600
gcagcagagg agtccctgcc tatcgaagtg atggtggatg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaattata caagctcctt ctttatcagg gacatcatca agccagatcc ccctaagaac 720
ctgcagctga agcccctgaa gaatagccgc caggtggagg tgtcctggga gtaccctgac 780
acctggtcca caccacactc ttatttcagc ctgacctttt gcgtgcaggt gcagggcaag 840
agcaagaggg agaagaagga ccgcgtgttc accgataaga catccgccac cgtgatctgt 900
cggaagaacg ccagcatctc cgtgagggcc caggatcgct actattctag ctcctggagc 960
gagtgggcct ccgtgccatg ctctggagga ggaggcagcg gcggaggagg ctccggaggc 1020
ggcggctctg gcggcggcgg ctccctgggc tctcgggccg tgatgctgct gctgctgctg 1080
ccctggaccg cacagggaag agccgtgcca ggaggctcta gcccagcatg gacacagtgc 1140
cagcagctgt cccagaagct gtgcaccctg gcatggtctg cccaccctct ggtgggccac 1200
atggacctga gagaggaggg cgatgaggag accacaaacg acgtgcctca catccagtgc 1260
ggcgacggct gtgatccaca gggcctgagg gacaattctc agttctgtct gcagcgcatc 1320
caccagggcc tgatcttcta cgagaagctg ctgggcagcg atatctttac aggagagccc 1380
agcctgctgc ctgactcccc agtgggacag ctgcacgcct ctctgctggg cctgagccag 1440
ctgctgcagc cagagggaca ccactgggag acccagcaga tcccttctct gagcccatcc 1500
cagccttggc agcggctgct gctgcggttc aagatcctga gaagcctgca ggcattcgtc 1560
gcagtcgcag ccagggtgtt cgcccacgga gccgctactc tgagccca 1608
<210> 14
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gly Ser Arg
340 345 350
Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr Ala Gln Gly Arg Ala
355 360 365
Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln Leu Ser
370 375 380
Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val Gly His
385 390 395 400
Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp Val Pro
405 410 415
His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg Asp Asn
420 425 430
Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe Tyr Glu
435 440 445
Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu Leu Pro
450 455 460
Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln
465 470 475 480
Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile Pro Ser
485 490 495
Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe Lys Ile
500 505 510
Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val Phe Ala
515 520 525
His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
530 535
<210> 15
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
atgaggctgc tgattctggc actgctgggc atctgctctc tgaccgctta catcgtggaa 60
ggagtcggct ctgaagtctc tgacaagcgc acatgcgtgt ctctgaccac acagcgcctg 120
cccgtgagcc ggatcaagac ctacacaatc accgagggca gcctgagagc cgtgatcttc 180
atcacaaaga ggggcctgaa ggtgtgcgcc gaccctcagg caacctgggt gcgggacgtg 240
gtgagaagca tggataggaa gtccaacacc cggaacaata tgatccagac aaaacccaca 300
ggaacccagc agagcactaa tacagccgtg acactgaccg gg 342
<210> 16
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala
1 5 10 15
Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys
20 25 30
Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr
35 40 45
Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg
50 55 60
Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val
65 70 75 80
Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln
85 90 95
Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu
100 105 110
Thr Gly
<210> 17
<211> 1899
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
atggctctgc ctaccgcaag acccctgctg ggctcctgtg ggactcctgc tctgggatca 60
ctgctgtttc tgctgttttc actgggctgg gtgcagcctt cccgcaccct ggcaggagag 120
acaggacagg aggcagcacc actggacggc gtgctggcca acccccctaa tatcagctcc 180
ctgtctcctc ggcagctgct gggcttccca tgtgcagagg tgagcggact gtccaccgag 240
agggtgcgcg agctggcagt ggccctggca cagaagaacg tgaagctgag cacagagcag 300
ctgaggtgcc tggcacacag gctgtccgag ccaccagagg acctggatgc actgccactg 360
gacctgctgc tgttcctgaa cccagatgcc ttttccggcc cccaggcctg taccaggttc 420
ttttctcgca tcacaaaggc caatgtggat ctgctgccca gaggcgcacc tgagaggcag 480
agactgctgc cagccgccct ggcatgctgg ggcgtgaggg gctctctgct gagcgaggca 540
gacgtgcgcg ccctgggagg actggcctgt gatctgccag gccgctttgt ggcagagagc 600
gccgaggtgc tgctgccacg gctggtgtcc tgccctggcc cactggacca ggatcagcag 660
gaggcagccc gggccgccct gcagggcggc ggccctccct acggcccccc ttccacctgg 720
tctgtgagca caatggacgc actgagagga ctgctgcctg tgctgggaca gccaatcatc 780
aggtctatcc cccagggcat cgtggcagca tggaggcagc ggagcagccg ggaccccagc 840
tggcggcagc ctgagagaac catcctgcgg cctagattcc ggagagaggt ggagaagaca 900
gcctgtccat ctggcaagaa ggccagagag atcgacgaga gcctgatctt ttacaagaag 960
tgggagctgg aggcctgcgt ggacgccgcc ctgctggcta cccagatgga cagggtgaat 1020
gccatcccct tcacctacga gcagctggac gtgctgaagc acaagctgga tgagctgtac 1080
ccacagggct atcccgagtc cgtgatccag cacctgggct acctgtttct gaagatgtcc 1140
cccgaggata tcagaaagtg gaacgtgacc tctctggaga cactgaaggc cctgctggag 1200
gtcaataagg gccacgagat gagccctcag gtggccaccc tgatcgaccg gttcgtgaag 1260
ggcagaggcc agctggacaa ggatacactg gataccctga cagcctttta ccccggctac 1320
ctgtgctccc tgtctcctga ggagctgtcc tctgtgccac ccagctccat ctgggccgtg 1380
cggccacagg acctggatac ctgcgacccc cggcagctgg acgtgctgta ccctaaggcc 1440
aggctggcct tccagaacat gaatggctct gagtatttcg tgaagatcca gagctttctg 1500
ggaggagcac ctaccgagga cctgaaggcc ctgagccagc agaacgtgag catggacctg 1560
gccaccttta tgaagctgcg cacagatgcc gtgctgccac tgaccgtggc agaggtgcag 1620
aagctgctgg gacctcacgt ggagggcctg aaggcagagg agaggcacag gccagtgcgg 1680
gactggattc tgcggcagag acaggacgat ctggataccc tgggactggg actgcaggga 1740
ggcatcccaa atggaggcag cacatccggc tctggcaagc caggctccgg agagggctct 1800
accaagggaa tgcaggaggc cctgagcggc acaccttgcc tgctgggacc tggacctgtg 1860
ctgactgtgc tggctctgct gctggcatct actctggct 1899
<210> 18
<211> 633
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln
20 25 30
Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu
35 40 45
Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu
65 70 75 80
Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu
85 90 95
Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro
100 105 110
Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro
115 120 125
Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile
130 135 140
Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu
165 170 175
Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu
180 185 190
Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu
195 200 205
Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg
210 215 220
Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp
225 230 235 240
Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly
245 250 255
Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg
260 265 270
Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile
275 280 285
Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser
290 295 300
Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys
305 310 315 320
Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met
325 330 335
Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu
340 345 350
Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val
355 360 365
Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu
385 390 395 400
Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp
405 410 415
Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr
420 425 430
Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu
435 440 445
Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp
450 455 460
Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala
465 470 475 480
Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile
485 490 495
Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser
500 505 510
Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr
515 520 525
Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly
530 535 540
Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg
545 550 555 560
Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu
565 570 575
Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly
580 585 590
Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Met Gln Glu Ala Leu
595 600 605
Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu
610 615 620
Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala
625 630
<210> 19
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
atgaactttt acctgctgct ggcatcctca atcctgtgcg ccctgatcgt gttttggaaa 60
taccgacgct ttcagagaaa tactggcgag atgagcagca acagcaccgc cctggccctg 120
gtgcggccct ctagctccgg cctgatcaac tctaatacag acaacaatct ggccgtgtac 180
gacctgtctc gggatatcct gaacaatttc cctcacagca tcgcccggca gaagagaatc 240
ctggtgaacc tgagcatggt ggagaataag ctggtggagc tggaacatac actgctgagt 300
aagggcttta ggggggcttc accacatcgc aagtcaaca 339
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Met Asn Phe Tyr Leu Leu Leu Ala Ser Ser Ile Leu Cys Ala Leu Ile
1 5 10 15
Val Phe Trp Lys Tyr Arg Arg Phe Gln Arg Asn Thr Gly Glu Met Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Val Arg Pro Ser Ser Ser Gly Leu
35 40 45
Ile Asn Ser Asn Thr Asp Asn Asn Leu Ala Val Tyr Asp Leu Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Leu Asn Asn Phe Pro His Ser Ile Ala Arg Gln Lys Arg Ile
65 70 75 80
Leu Val Asn Leu Ser Met Val Glu Asn Lys Leu Val Glu Leu Glu His
85 90 95
Thr Leu Leu Ser Lys Gly Phe Arg Gly Ala Ser Pro His Arg Lys Ser
100 105 110
Thr
<210> 21
<211> 2301
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
atgaatttct acctgctgct ggcatcttca atcctgtgcg ccctgatcgt cttttggaag 60
tatcgccgct ttcagaggaa cactggcgag atgagcagca acagcaccgc cctggccctg 120
gtgcggcctt ctagctccgg cctgatcaac tctaatacag acaacaatct ggccgtgtat 180
gacctgtccc gggatatcct gaacaatttc ccacactcta tcgccaggca gaagcgcatc 240
ctggtgaacc tgagcatggt ggagaataag ctggtggagc tggagcacac cctgctgagc 300
aagggcttcc ggggagcatc cccacacaga aagtctaccg gcagcggcgc cacaaacttt 360
tctctgctga agcaggcagg cgacgtggag gagaatcctg gaccagccct gccaaccgcc 420
agacccctgc tgggcagctg tggcacaccc gccctgggct ctctgctgtt cctgctgttt 480
agcctgggat gggtgcagcc atcaaggacc ctggcaggag agacaggaca ggaggcagca 540
cccctggatg gcgtgctggc caacccccct aatatctcta gcctgagccc aagacagctg 600
ctgggcttcc catgtgcaga ggtgtccgga ctgtctaccg agagggtgcg cgagctggca 660
gtggccctgg cacagaagaa tgtgaagctg tctacagagc agctgaggtg cctggcacac 720
agactgagcg agccaccaga ggacctggat gcactgcctc tggacctgct gctgttcctg 780
aaccccgatg cctttagcgg acctcaggcc tgcacccggt tcttttccag aatcacaaag 840
gccaatgtgg atctgctgcc taggggcgca ccagagaggc agagactgct gccagccgcc 900
ctggcctgct ggggcgtgag gggcagcctg ctgtccgagg cagacgtgcg cgccctggga 960
ggactggcct gtgatctgcc aggccgcttt gtggcagagt ctgccgaggt gctgctgcct 1020
aggctggtga gctgcccagg acctctggac caggatcagc aggaggcagc ccgggccgcc 1080
ctgcagggcg gcggccctcc atacggcccc ccttccacct ggtccgtgtc tacaatggac 1140
gcactgagag gactgctgcc agtgctggga cagccaatca tcaggagcat cccccagggc 1200
atcgtggcag catggaggca gcggagcagc cgggacccct cctggaggca gccagagagg 1260
accatcctgc ggccaagatt ccggagagag gtggagaaga cagcatgtcc atccggcaag 1320
aaggcccgcg agatcgacga gtctctgatc ttttacaaga agtgggagct ggaggcctgc 1380
gtggacgccg ccctgctggc tacccagatg gaccgggtga acgccatccc cttcacctac 1440
gagcagctgg acgtgctgaa gcacaagctg gatgagctgt acccccaggg ctatcctgag 1500
tccgtgatcc agcacctggg ctacctgttt ctgaagatga gccccgagga tatccggaag 1560
tggaacgtga cctccctgga gacactgaag gccctgctgg aggtcaataa gggccacgag 1620
atgagccctc aggtggccac cctgatcgac aggttcgtga agggccgcgg ccagctggac 1680
aaggatacac tggataccct gacagccttt taccctggct acctgtgcag cctgtcccca 1740
gaggagctga gctccgtgcc accctctagc atctgggccg tgcggcccca ggacctggat 1800
acctgcgacc ctagacagct ggatgtgctg tacccaaagg ccaggctggc cttccagaac 1860
atgaatggct ctgagtattt cgtgaagatc cagagctttc tgggaggagc accaaccgag 1920
gacctgaagg ccctgtccca gcagaacgtg tctatggacc tggccacctt tatgaagctg 1980
agaacagatg ccgtgctgcc tctgaccgtg gcagaggtgc agaagctgct gggaccacac 2040
gtggagggcc tgaaggcaga ggagaggcac aggcctgtga gggactggat tctgcggcag 2100
agacaggacg atctggatac cctgggactg ggactgcagg gaggcatccc caatggcggc 2160
tctacaagcg gctccggcaa gcctggctct ggagagggca gcaccaaggg aatgcaggag 2220
gccctgagcg gcacaccctg tctgctggga cctggacccg tgctgactgt gctggctctg 2280
ctgctggctt caaccctggc a 2301
<210> 22
<211> 767
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Met Asn Phe Tyr Leu Leu Leu Ala Ser Ser Ile Leu Cys Ala Leu Ile
1 5 10 15
Val Phe Trp Lys Tyr Arg Arg Phe Gln Arg Asn Thr Gly Glu Met Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Ala Leu Ala Leu Val Arg Pro Ser Ser Ser Gly Leu
35 40 45
Ile Asn Ser Asn Thr Asp Asn Asn Leu Ala Val Tyr Asp Leu Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Leu Asn Asn Phe Pro His Ser Ile Ala Arg Gln Lys Arg Ile
65 70 75 80
Leu Val Asn Leu Ser Met Val Glu Asn Lys Leu Val Glu Leu Glu His
85 90 95
Thr Leu Leu Ser Lys Gly Phe Arg Gly Ala Ser Pro His Arg Lys Ser
100 105 110
Thr Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
115 120 125
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu
130 135 140
Gly Ser Cys Gly Thr Pro Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe
145 150 155 160
Ser Leu Gly Trp Val Gln Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly
165 170 175
Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile
180 185 190
Ser Ser Leu Ser Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val
195 200 205
Ser Gly Leu Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala
210 215 220
Gln Lys Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His
225 230 235 240
Arg Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu
245 250 255
Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr
260 265 270
Arg Phe Phe Ser Arg Ile Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg
275 280 285
Gly Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp
290 295 300
Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly
305 310 315 320
Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu
325 330 335
Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp
340 345 350
Gln Gln Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr
355 360 365
Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly
370 375 380
Leu Leu Pro Val Leu Gly Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly
385 390 395 400
Ile Val Ala Ala Trp Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg
405 410 415
Gln Pro Glu Arg Thr Ile Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu
420 425 430
Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser
435 440 445
Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala
450 455 460
Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr
465 470 475 480
Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln
485 490 495
Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys
500 505 510
Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr
515 520 525
Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln
530 535 540
Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp
545 550 555 560
Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp
580 585 590
Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp
595 600 605
Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser
610 615 620
Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu
625 630 635 640
Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr
645 650 655
Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu
660 665 670
Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu
675 680 685
Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp
690 695 700
Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Gly
705 710 715 720
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
725 730 735
Gly Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly
740 745 750
Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala
755 760 765
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
tacagctgca aggacaacca g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
aatctgatat agctcaatcc g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
tttccaccat tagcacgcgg g 21
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
ggcagccctg gcatgggtgt gcatgtgggt gcagcc 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
cacacaggaa actacacttg tgaagtaaca gaatta 36
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
ccagtcacct ctgaacatga actgacatgt caggctgagg gct 43
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
gcttgctcag gatctgcccg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
gcactaccag agctaactca 20
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
ctcgccagcc ccccgagcca gggggaggtg ccgcccgg 38
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
agctcaccag tcccccagaa gactatcctg agcccgagga agtc 44
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
tactcctctc ggaggccctg gcccttaccc agacctgggc gggt 44
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
cctaatggct tccctggatg cagagaaggc ccaaggacaa aag 43
<210> 35
<211> 3402
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
atgcctagag cacctagatg tagagctgtg cggagcctgc tgcggagcca ctatagagaa 60
gttctgcccc tggccacctt cgtgcgtaga cttggacctc aaggatggcg gctggtgcag 120
agaggcgatc ctgctgcttt tagagccctg gtggcccagt gtctcgtgtg cgttccatgg 180
gatgctagac ctccaccagc tgctcccagc ttcagacagg tgtcctgcct gaaagaactg 240
gtggccagag tgctgcagcg gctgtgtgaa aggggcgcca aaaatgtgct ggccttcggc 300
tttgccctgc tggatgaagc tagaggcgga cctcctgagg cctttacaac aagcgtgcgg 360
agctacctgc ctaacaccgt gacagatgcc ctgagaggat ctggcgcttg gggactgctg 420
ctgagaagag tgggagatga cgtgctggtg catctgctgg cccactgtgc tctgtttgtg 480
ctggtggctc ctagctgcgc ctaccaagtt tgcggccctc tgctgtatca gctgggcgct 540
gctacacagg ctagaccacc tccacatgcc agcggaccta gaagaaggct gggctgcgaa 600
agagcctgga accactctgt tagagaagcc ggcgtgccac tgggattgcc tgcacctggt 660
gctcggagaa gagatggcag cgcctctaga tctctgcctc tgcctaagag gcccagaaga 720
ggcgcagcac ctgagcctga gagaacccct atcggccaag gatcttgggc ccatcctggc 780
agaacaagag gccctagcga tagaggcttc tgcgtggtgt ctcctgccag acctgccgag 840
gaagctacat ctcttgacgg cgccctgagc ggcacaagac actctcatcc atctgtgggc 900
tgccagcacc atgccggacc tccatctaca agcagaccac ctagaccttg ggacacccct 960
tgtcctccag tgtacgccga gacaaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaagagcag 1020
ctgaggccta gcttcctgct gagctttctg aggccaagcc tgacaggcgc cagacggctg 1080
ctggaaacaa tcttcctggg cagcagaccc tggatgcctg gcacacttag aaggctgcct 1140
agactgcccc agcggtactg gcaaatgagg cccctgtttc tggaactgct gggcaaccac 1200
gctcagtgcc cttatggcgt gctgctgaaa acccactgtc cactgagagc cgtggttact 1260
ccagctgctg gcgtgtgtgc cagagagaag ccacagggat ctgtggtggc ccctgaggaa 1320
gaggacaccg atcctagaag gctcgtgcag ctgctgaggc agcatagctc tccatggcag 1380
gtctacggat tcgtgcgggc ctgtctgcat agactggttc cacctggact gtggggctcc 1440
agacacaacg agcggcggtt tctgcggaac accaagaagt tcatcagcct gggaaagcac 1500
gccaagctga gcctgcaaga gctgacctgg aagatgagcg tgtgggattg tgcttggctg 1560
cggagaagtc ctggcgtggg atgtgttcct gccgccgaac acagactgcg ggaagagatc 1620
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgtcc gtgtacgtgg tcgaactgct gcggtccctg 1680
ttctgcgtga ccgagacaac cttccagaag aaccggctgt tcttctaccg gaagtccgtg 1740
tggtccaagc tgcagagcat cggcatccgg cagcatctga agagagtgca gctgagagag 1800
ctgctcgaag ccgaagttcg gcagcacaga aaagccagac tggccctgct gaccagcagg 1860
ctgagattca tccccaagca cgatggcctg cggcctattg tgaacatgga ctacgttgtg 1920
ggcgccagaa ccttccaccg ggaaaagaga gccgagcggc tgacctctag agtgaaggcc 1980
ctgtttagcg tgctgaacta cgagcgggcc agaaggccat ctctgctggg agcctttgtg 2040
ctcggcctgg acgatattca tagagcctgg cggacattcg tgctgagagt cagagcccag 2100
gatagccctc ctgagctgta cttcgtgaag gccgatgtga tgggcgccta caacacaatc 2160
cctcaggacc ggctgaccga gatcattgcc agcatcatca agccccagaa catgtactgt 2220
gtgcggagat acgccgtggt gcagaaagcc acacatggcc acgtgcgcaa ggccttcaag 2280
agccatgtgt ctaccctgac cgacctgcag ccttacatga gacagttcgt ggcctatctg 2340
caagagacaa gccctctgag ggacgccgtg atcatcgaac agagcagcag cctgaatgag 2400
gccagctccg gcctgtttga cgtgttcctc agattcatgt gccaccacgc cgtgcggatc 2460
agaggcaaga gctacatcca gtgccagggc attccacagg gctccatcct gagcacactg 2520
ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggaa aacaagctgt tcgccggcat tcggcgcgac 2580
ggactgcttc ttagactggt ggacgacttc ctgctcgtga cccctcatct gacccacgcc 2640
aagacctttc tgaaaacact cgtgcggggc gtgcccgagt atggctgtgt ggtcaatctg 2700
agaaagaccg tggtcaactt ccccgtcgag gatgaagccc tcggcggcac agcttttgtg 2760
cagatgcctg ctcacggact gttcccttgg tgctccctgc tgctggacac tagaaccctg 2820
gaagtgcaga gcgactacag cagctatgcc cggacctcta tcagagccag cctgaccttc 2880
aaccggggct ttaaggccgg cagaaacatg cggagaaagc tgtttggagt gctgcggctg 2940
aagtgccaca gcctgttcct cgacctgcaa gtgaacagcc tgcagaccgt gtgcaccaat 3000
atctacaaga ttctgctgct gcaagcctac cggttccacg cctgtgttct gcagctgccc 3060
ttccaccagc aagtgtggaa gaaccctaca ttcttcctgc ggatcatcag cgacaccgcc 3120
agcctgtgtt acagcatcct gaaggccaag aacgccggca tgtctctggg agctaaaggc 3180
gctgcaggac ccctgccttt tgaagctgtt cagtggctgt gtcaccaggc ctttctgctg 3240
aagctgaccc ggcacagagt gacatatgtg cccctgctgg gctccctgag aacagctcag 3300
atgcagctgt ccagaaagct gccaggcaca accctgacag ccctggaagc tgctgctaac 3360
cctgctctgc ccagcgactt caagaccatc ctggactgat ga 3402
<210> 36
<211> 1132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Glu Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala His Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Leu Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Asp Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Ile Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Asp Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Cys Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Phe Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Leu Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Leu Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Val Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Val Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu His Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Trp Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Leu
545 550 555 560
Phe Cys Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Lys Ala Arg Leu Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys His Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe His Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Ser Leu Leu Gly Ala Phe Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Ser Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Ala Asp Val Met Gly Ala Tyr Asn Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Ile Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Met Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Thr His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Ile Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Ile Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Lys Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Ser Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Ile Ile Ser Asp
1025 1030 1035
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Phe Glu
1055 1060 1065
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gln Met Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
Thr Ile Leu Asp
1130
<210> 37
<211> 2256
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
atgtggaatc tgctgcacga gacagatagc gccgtggcta ccgttagaag gcccagatgg 60
ctttgtgctg gcgctctggt tctggctggc ggcttttttc tgctgggctt cctgttcggc 120
tggttcatca agagcagcaa cgaggccacc aacatcaccc ctaagcacaa catgaaggcc 180
tttctggacg agctgaaggc cgagaatatc aagaagttcc tgtacaactt cacgcacatc 240
cctcacctgg ccggcaccga gcagaatttt cagctggcca agcagatcca gagccagtgg 300
aaagagttcg gcctggactc tgtggaactg gcccactacg atgtgctgct gagctacccc 360
aacaagacac accccaacta catcagcatc atcaacgagg acggcaacga gatcttcaac 420
accagcctgt tcgagcctcc acctcctggc tacgagaacg tgtccgatat cgtgcctcca 480
ttcagcgctt tcagcccaca gcggatgcct gagggctacc tggtgtacgt gaactacgcc 540
agaaccgagg acttcttcaa gctggaatgg gacatgaaga tcagctgcag cggcaagatc 600
gtgatcgccc ggtacagaaa ggtgttccgc gagaacaaag tgaagaacgc ccagctggca 660
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tcttaccccg acggctggaa ttttcctggc ggcggagtgc agcggcggaa catccttaat 780
cttaacggcg ctggcgaccc tctgacacct ggctatcctg ccaatgagta cgcctacaga 840
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tgggtgttcg gaggaatcga ccctcaatct ggcgccgctg tggtgtatga gatcgtgcgg 1200
tctttcggca ccctgaagaa agaaggatgg cggcccagac ggaccatcct gtttgcctct 1260
tgggacgccg aggaatttgg cctgctggga tctacagagt gggccgaaga gaacagcaga 1320
ctgctgcaag aaagaggcgt ggcctacatc aacgccgaca gcagcatcga gggcaactac 1380
accctgcgga tcgattgcac ccctctgatg tacagcctgg tgcacaacct gaccaaagag 1440
ctgaagtccc ctgacgaggg ctttgagggc aagagcctgt acaagagctg gaccaagaag 1500
tccccatctc ctgagttcag cggcatgccc agaatctcta agctggaaag cggcaacaac 1560
ttcgaggtgt tcttccagcg gctgggaatc gcctctggaa tcgccagata caccaagaac 1620
tgggagacaa acaagttctc cggctatccc ctgtaccaca gcgtgtacga gacatacgag 1680
ctggtggaaa agttctacga ccccatgttc aagtaccacc tgacagtggc ccaagtgcgc 1740
ggaggcatgg tgttcgaact ggccaatagc atcgtgctgc ccttcaactg cagagactac 1800
gccgtggtgc tgcggaagta cgccgacaag atctacagca tcagcatgaa gcacccgcaa 1860
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ctgaggatga tgaacgacca gctgatgttc ctggaacggg ccttcatcaa ccctctggga 2040
ctgcccgaca gacccttcta caggcacgtg atctgtgccc ctagcagcca caacaaatac 2100
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gccgctgccg aaacactgtc tgaggtggcc tgatga 2256
<210> 38
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Val Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr His Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Arg Met Pro Glu Gly Tyr Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Trp Asp Met
180 185 190
Lys Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Arg Lys Val
195 200 205
Phe Arg Glu Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Phe Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Arg
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg His Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val Arg Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Lys Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val Tyr Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Ile
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Lys Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Glu Ser Gly Asn Asn Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Ile Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asn Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Lys Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asn Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Cys Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Asn Val Asn
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 39
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
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ggcacactgg aagaggtgcc aacagccggc tctaccgatc ctcctcaatc tcctcaaggc 180
gccagcgcct ttcctaccac catcaacttc acccggcaga gacagcctag cgagggctct 240
agctctcacg aggaaaaggg ccctagcacc agctgcatcc tggaaagcct gttccgggcc 300
gtgatcacaa agaaagtggc cgacctcgtg ggcttcctgc tgctgaagta cagagccaga 360
gaacccgtga ccaaggccga gatgctggaa agcgtgatca agaactacaa gcactgcttc 420
agcgagatct tcggcaaggc cagcgagtct ctgcagctcg tgtttggcat cgacgtgaaa 480
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<213> 智人
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Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp
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Gly
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Ser Tyr Ala Ser Arg Asp Thr Tyr Lys Leu Lys Arg His Met Arg Thr
820 825 830
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gtgatcctgg acatcagcag aaccagaatc cactctctgc ccagctacgg cctggaaaac 720
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ctggtggccc tgatggaagc cagcctgaca taccctagcc actgctgcgc ctttgccaac 840
tggcggagac agatctctga gctgcacccc atctgcaaca agagcatcct gcggcaagag 900
gtggactaca tgacacaggc cagaggccag agattcagcc tggccgagga taacgagagc 960
agctacagca gaggcttcga catgacctac accgagttcg actacgacct gtgcaacaag 1020
gtggtggacg tgacatgcag ccccaagcct gatgccttca atccctgcga ggacatcatg 1080
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ggctccacct acatcctggt gccactgagc catctggccc agaacagagg ccggaagaga 2100
agaagcccca gggctcccaa gagacagaga tgcatgcccg aagaggacct gcagagccag 2160
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<210> 44
<211> 1070
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
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Gly Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys
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Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Gln Val Ile Gln Lys Gly
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Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn
65 70 75 80
Asn Val Leu Glu Val Ile Glu Ala His Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys
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Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asn
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Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro
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Tyr Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala His Ser Glu Ser Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
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Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
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<213> 智人
<400> 50
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 52
Met Asp Phe Leu Leu Leu Gln Asn Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu
1 5 10 15
Pro Ala Ser Gln His Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln
20 25 30
Pro Glu Gln Gln Gly Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu
35 40 45
Gly Ala Ala Glu Ala Ser Ala Glu Cys Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg
50 55 60
Gly Ala Ser Gly Ser Glu Pro His Gln Met Gly Ser Asp Val His Asp
65 70 75 80
Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp
100 105 110
Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
115 120 125
Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe
130 135 140
Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Lys Gln
145 150 155 160
Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Phe Gly Gln Phe Thr Gly Thr
165 170 175
Val Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
195 200 205
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile Arg Asn Gln Gly Phe Ser Thr
210 215 220
Val Thr Phe Asp Gly Met Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His
225 230 235 240
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly
245 250 255
Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
260 265 270
Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Asn Gln Ala Leu
275 280 285
Leu Leu Arg Met Pro Phe Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser
290 295 300
Gln Leu Glu Cys Met Ile Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
305 310 315 320
Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Ala Gly
325 330 335
Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Met Pro
340 345 350
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg
355 360 365
Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val
370 375 380
Gly Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys His Pro Phe Met Cys Ala Tyr
385 390 395 400
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Lys Met His
405 410 415
Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Leu Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp
420 425 430
Cys Glu Arg Arg Phe Ser Cys Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Lys Thr Ile Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys
485 490 495
Lys Phe Ala Arg Ser Asn Glu Leu Val His His His Asn Met His Gln
500 505 510
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515 520 525
Ser Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
530 535 540
Ala Val Val Gly Glu Val Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu
545 550 555 560
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Lys Lys Pro Asp
565 570 575
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala
580 585 590
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asn Val Ser Tyr
595 600 605
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Thr Pro Ala Cys
610 615 620
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
625 630 635 640
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Leu
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Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
660 665 670
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
675 680 685
Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
690 695 700
Pro Phe His Phe Tyr Phe His Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Lys Ile
705 710 715 720
Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
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Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Lys Gly Asn Pro Asn Glu Glu
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Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
755 760 765
Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu
770 775 780
Ser
785
<210> 53
<211> 2838
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
atgtggaatc tgctgcacga gacagatagc gccgtggcta ccgttagaag gcccagatgg 60
ctttgtgctg gcgctctggt tctggctggc ggcttttttc tgctgggctt cctgttcggc 120
tggttcatca agagcagcaa cgaggccacc aacatcaccc ctaagcacaa catgaaggcc 180
tttctggacg agctgaaggc cgagaatatc aagaagttcc tgtacaactt cacgcacatc 240
cctcacctgg ccggcaccga gcagaatttt cagctggcca agcagatcca gagccagtgg 300
aaagagttcg gcctggactc tgtggaactg gcccactacg atgtgctgct gagctacccc 360
aacaagacac accccaacta catcagcatc atcaacgagg acggcaacga gatcttcaac 420
accagcctgt tcgagcctcc acctcctggc tacgagaacg tgtccgatat cgtgcctcca 480
ttcagcgctt tcagcccaca gcggatgcct gagggctacc tggtgtacgt gaactacgcc 540
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cacggaattg ccgaggctgt gggcctgcct tctattcctg tgcaccctgt gcggtactac 900
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tctttcggca ccctgaagaa agaaggatgg cggcccagac ggaccatcct gtttgcctct 1260
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ctgctgcaag aaagaggcgt ggcctacatc aacgccgaca gcagcatcga gggcaactac 1380
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ttcgaggtgt tcttccagcg gctgggaatc gcctctggaa tcgccagata caccaagaac 1620
tgggagacaa acaagttctc cggctatccc ctgtaccaca gcgtgtacga gacatacgag 1680
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ggaggcatgg tgttcgaact ggccaatagc atcgtgctgc ccttcaactg cagagactac 1800
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ctgaggatga tgaacgacca gctgatgttc ctggaacggg ccttcatcaa ccctctggga 2040
ctgcccgaca gacccttcta caggcacgtg atctgtgccc ctagcagcca caacaaatac 2100
gccggcgaga gcttccccgg catctacgat gccctgttcg acatcgagag caacgtgaac 2160
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gccgctgccg aaacactgtc tgaagtggcc agaggccgga agagaagatc cgactgcaga 2280
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<210> 54
<211> 944
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Val Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr His Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
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100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
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145 150 155 160
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Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Trp Asp Met
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Lys Ile Ser Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Arg Lys Val
195 200 205
Phe Arg Glu Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
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Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Phe Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Arg
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Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
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Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg His Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val Arg Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
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Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
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Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
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370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val Tyr Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
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Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
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500 505 510
Ser Lys Leu Glu Ser Gly Asn Asn Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
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Gly Ile Ala Ser Gly Ile Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
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Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
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580 585 590
Leu Pro Phe Asn Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
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Lys Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
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690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Asn Val Asn
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Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
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740 745 750
Arg Lys Arg Arg Ser Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser
755 760 765
Val Ile Trp Ile Met Ala Ile Ser Lys Ala Phe Glu Leu Arg Leu Val
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Pro Lys Lys Cys Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys
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Thr Thr Phe Met Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
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<210> 55
<211> 2373
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
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caggacctgt acaacaaccc tgtgaccgcc gtgttcaact accaaggcct gtggcacagc 1740
tgcatgagag agagcagcgg cttcaccgag tgcagaggct acttcaccct gctggaactg 1800
cctgccatgc tgcaggctgt gcaggccctt atgatcgtgg gaattgtgct gggagccatc 1860
ggcctgctgg tgtccatttt cgccctgaag tgcatccgga tcggcagcat ggaagatagc 1920
gccaaggcca acatgaccct gaccagcggc atcatgttca tcgtgtccgg cctgtgcgcc 1980
attgctggcg tgtccgtgtt tgccaatatg ctcgtgacca acttctggct gagcaccgcc 2040
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gccgctctgt ttgtcggatg ggttgcaggc ggactgacac tgattggcgg cgtgatgatg 2160
tgtatcgcct gcagaggact ggcccctgag gaaacaaact acaaggccgt gtactaccac 2220
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<210> 56
<211> 789
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Met Asp Phe Leu Leu Leu Gln Asn Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu
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Val Thr Phe Asp Gly Met Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His
225 230 235 240
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly
245 250 255
Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
260 265 270
Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Asn Gln Ala Leu
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Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Ala Gly
325 330 335
Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Met Pro
340 345 350
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg
355 360 365
Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val
370 375 380
Gly Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys His Pro Phe Met Cys Ala Tyr
385 390 395 400
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Lys Met His
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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705 710 715 720
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
725 730 735
Val Tyr Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
740 745 750
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
755 760 765
Tyr Asp Gly Gly Ala His Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
770 775 780
Lys His Asp Tyr Val
785
<210> 57
<211> 2769
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
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<212> PRT
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<213> 智人
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<213> 智人
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Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu
340 345 350
Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val
355 360 365
Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu
385 390 395 400
Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Ala Pro Arg Arg Pro Leu
405 410 415
Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln
420 425 430
Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr
435 440 445
Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser
450 455 460
Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln
465 470 475 480
Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn
485 490 495
Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Phe Phe Leu Gly Gly Ala Pro
500 505 510
Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu
515 520 525
Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val
530 535 540
Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala
545 550 555 560
Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln
565 570 575
Asp Asp Leu Asp Thr Leu Glu Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn
580 585 590
Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Val Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr
595 600 605
Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
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Leu Ala Ser Thr Leu Ala
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<210> 63
<211> 2947
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
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Asn Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Ser Tyr Pro Lys Ala Gly
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Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
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Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
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Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys
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Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp
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<211> 1617
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
atgcaccaga aacggaccgc catgtttcag gaccctcaag agaggcccag aaagctgcct 60
cacctgtgta ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tcctgcggag agaggtgtac gatttcgcct tccgggacct gtgcatcgtg 180
tacagagatg gcaaccccta cgccgtgtgc aacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtacc gctactactg ctacagcgtg tacggcacca cactggaaca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatccggtgc atcaactgcc agaaacctct gtgccccgag 360
gaaaagcagc ggcacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg ccggtggacc 420
ggcagatgca tgagctgttg tcggagcagc cggaccagaa gagagacaca gctgagaggc 480
cggaagagaa gaagccacgg cgatacccct acactgcacg agtacatgct ggacctgcag 540
cctgagacaa ccgacctgta ctgctacgag cagctgaacg acagcagcga ggaagaggac 600
gagattgacg gacctgccgg acaggccgaa cctgatagag cccactacaa tatcgtgacc 660
ttctgctgca agtgcaacag caccctgaga ctgtgcgtgc agagcaccca cgtggacatc 720
agaaccctgg aagatctgct gatgggcacc ctgggaatcg tgtgccctat ctgcagccag 780
aagcctagag gcagaaagcg gagaagcgcc agattcgacg accccaccag aaggccttac 840
aagctgcctg atctgtgcac tgaactgaac accagcctgc aggacatcga gattacctgt 900
gtgtattgca agaccgtgct ggaactgacc gaggtgttcg agtttgcctt taaggacctg 960
ttcgtggtgt accgggacag cattcctcac gccgcctgcc acaagtgcat cgacttctac 1020
agccggatca gagagctgcg gcactacagc gattctgtgt acggggacac cctggaaaag 1080
ctgaccaaca ccggcctgta caacctgctc atcagatgcc tgcggtgtca gaagcccctg 1140
aatcctgccg agaagctgag acacctgaac gagaagcgga gattccacaa tatcgccggc 1200
cactacagag gccagtgcca cagctgttgc aaccgggcca gacaagagag actgcagaga 1260
aggcgggaaa cccaagtgcg gggcagaaag agaagatctc acggccctaa ggccacactg 1320
caggatatcg tgctgcacct ggaacctcag aacgagatcc ccgtggatct gctgtgccat 1380
gagcagctgt ccgactccaa agaggaaaac gacgaaatcg acggcgtgaa ccaccagcat 1440
ctgcctgcca gaagggccga accacagaga cacaccatgc tgtgcatgtg ttgcaagtgc 1500
gaggcccgga ttgagctggt ggtggaaagc tctgccgacg acctgagagc cttccagcag 1560
ctgttcctga acaccctgag cttcgtgtgt ccttggtgcg ccagccagca gtgataa 1617
<210> 68
<211> 537
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asn Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Arg Gly
145 150 155 160
Arg Lys Arg Arg Ser His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met
165 170 175
Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu
180 185 190
Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln
195 200 205
Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys
210 215 220
Cys Asn Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile
225 230 235 240
Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro
245 250 255
Ile Cys Ser Gln Lys Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ala Arg Phe
260 265 270
Asp Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu
275 280 285
Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val Tyr Cys Lys
290 295 300
Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu
305 310 315 320
Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His Lys Cys
325 330 335
Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser Asp Ser
340 345 350
Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn
355 360 365
Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn Pro Ala Glu
370 375 380
Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly
385 390 395 400
His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu
405 410 415
Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Arg Gly Arg Lys Arg Arg
420 425 430
Ser His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
435 440 445
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
450 455 460
Asp Ser Lys Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
465 470 475 480
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
485 490 495
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
500 505 510
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
515 520 525
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
530 535
<210> 69
<211> 2253
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
atgtggaatc tccttcacga aaccgactcg gctgtggcca ccgcgcgccg cccgcgctgg 60
ctgtgcgctg gggcgctggt gctggcgggt ggcttctttc tcctcggctt cctcttcggg 120
tggtttataa aatcctccaa tgaagctact aacattactc caaagcataa tatgaaagca 180
tttttggatg aattgaaagc tgagaacatc aagaagttct tatataattt tacacagata 240
ccacatttag caggaacaga acaaaacttt cagcttgcaa agcaaattca atcccagtgg 300
aaagaatttg gcctggattc tgttgagcta gcacattatg atgtcctgtt gtcctaccca 360
aataagactc atcccaacta catctcaata attaatgaag atggaaatga gattttcaac 420
acatcattat ttgaaccacc tcctccagga tatgaaaatg tttcggatat tgtaccacct 480
ttcagtgctt tctctcctca aggaatgcca gagggcgatc tagtgtatgt taactatgca 540
cgaactgaag acttctttaa attggaacgg gacatgaaaa tcaattgctc tgggaaaatt 600
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ggggccaaag gagtcattct ctactccgac cctgctgact actttgctcc tggggtgaag 720
tcctatccag atggttggaa tcttcctgga ggtggtgtcc agcgtggaaa tatcctaaat 780
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gatgcacaga agctcctaga aaaaatgggt ggctcagcac caccagatag cagctggaga 960
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aaagtcaaga tgcacatcca ctctaccaat gaagtgacaa gaatttacaa tgtgataggt 1080
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ctgaaaagcc ctgatgaagg ctttgaaggc aaatctcttt atgaaagttg gactaaaaaa 1500
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tttgaggtgt tcttccaacg acttggaatt gcttcaggca gagcacggta tactaaaaat 1620
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ggagggatgg tgtttgagct agccaattcc atagtgctcc cttttgattg tcgagattat 1800
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gaaatgaaga catacagtgt atcatttgat tcactttttt ctgcagtaaa gaattttaca 1920
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ttaagaatga tgaatgatca actcatgttt ctggaaagag catttattga tccattaggg 2040
ttaccagaca ggccttttta taggcatgtc atctatgctc caagcagcca caacaagtat 2100
gcaggggagt cattcccagg aatttatgat gctctgtttg atattgaaag caaagtggac 2160
ccttccaagg cctggggaga agtgaagaga cagatttatg ttgcagcctt cacagtgcag 2220
gcagctgcag agactttgag tgaagtagcc taa 2253
<210> 70
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 71
<211> 58
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
ccggtgctgg agaaagatca aacagctcga gctgtttgat ctttctccag catttttt 58
<210> 72
<211> 927
<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
atgtctctcg aacagagaag cctgcactgc aagcccgagg aagctctgga agctcagcaa 60
gaggctctgg gccttgtgtg tgttcaggcc gctgccagca gcttttctcc tctggtgctg 120
ggcacactgg aagaggtgcc aacagccggc tctaccgatc ctcctcaatc tcctcaaggc 180
gccagcgcct ttcctaccac catcaacttc acccggcaga gacagcctag cgagggctct 240
agctctcacg aggaaaaggg ccctagcacc agctgcatcc tggaaagcct gttccgggcc 300
gtgatcacaa agaaagtggc cgacctcgtg ggcttcctgc tgctgaagta cagagccaga 360
gaacccgtga ccaaggccga gatgctggaa agcgtgatca agaactacaa gcactgcttc 420
agcgagatct tcggcaaggc cagcgagtct ctgcagctcg tgtttggcat cgacgtgaaa 480
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ggcctgctgg gcgacaatca gattatgctg aaaaccggct tcctgatcat cgtgctggtc 600
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agatacgaat ttctgtgggg ccctagagca ctggccgaga caagctatgt gaaggtgctg 840
gaatacgtca tcaaggtgtc cgccagagtg tgcttcttct tcccatctct gcgggaagcc 900
gctctgcgcg aagaggaaga aggcgtc 927
<210> 73
<211> 309
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Met Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu
1 5 10 15
Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Ala
20 25 30
Ser Ser Phe Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr
35 40 45
Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe
50 55 60
Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser
65 70 75 80
Ser Ser His Glu Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser
85 90 95
Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe
100 105 110
Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met
115 120 125
Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Ser Glu Ile Phe
130 135 140
Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys
145 150 155 160
Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Phe Val Thr Cys Leu Gly
165 170 175
Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Leu Lys Thr
180 185 190
Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Ser His
195 200 205
Ala Pro Lys Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr
210 215 220
Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr
225 230 235 240
Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp
245 250 255
Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala
260 265 270
Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala
275 280 285
Arg Val Cys Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu
290 295 300
Glu Glu Glu Gly Val
305
<210> 74
<211> 42
<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
ctggaagaga aaaagggcaa ctacgtggtc accgaccact gc 42
<210> 75
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Cys
1 5 10
<210> 76
<211> 1680
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
gagtctagag gcagacggtg ccctgagatg attagcgtgc tgggccctat ctctggccac 60
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acagtgtccg gactggcttg gaccagacag cagaaccagt ggaaagaacc cgacgtgtac 540
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catgaactcg tgtgcagcat ggaaaacacc cgggccacca agatgcaagt gatcggcgac 660
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atgcacgtga ccctgggctc cgatgtggaa gaggacctga ccatgaccag aaatccccag 780
cctttcatgc ggcctcacga gagaaatggc ttcaccgtgc tgtgccccaa gaacatgatc 840
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cagtacagcg agcacccaac ctttaccagc cagtacagaa tccagggcaa gctggaatat 1140
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tttacctggc ctccttggca ggctggcatt ctggctagaa acctggtgcc tatggtggcc 1500
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<210> 77
<211> 560
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly Pro
1 5 10 15
Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr Pro
20 25 30
Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val Arg
35 40 45
Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn Pro
85 90 95
Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr Val
100 105 110
Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val His
115 120 125
His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val Ala
130 135 140
Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg Leu
145 150 155 160
Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys Glu
165 170 175
Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp Val
180 185 190
Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met Glu
195 200 205
Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val Lys
210 215 220
Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu Phe
225 230 235 240
Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met Thr
245 250 255
Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr
260 265 270
Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser His
275 280 285
Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu Leu
290 295 300
Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu Met
305 310 315 320
Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr Val
325 330 335
Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp Ile
340 345 350
Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe
355 360 365
Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr Trp
370 375 380
Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp Thr
385 390 395 400
Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys Thr
405 410 415
Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser Ala
420 425 430
Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ser Gly
435 440 445
Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro Glu
450 455 460
Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala Val
465 470 475 480
Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val
485 490 495
Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe
500 505 510
Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly
515 520 525
Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln Asp
530 535 540
Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg Gly
545 550 555 560
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<211> 1305
<212> DNA
<213> 智人
<400> 78
atgtctagcc ctggaacaga gtctgccggc aagagcctgc agtacagagt ggaccatctg 60
ctgagcgccg tggaaaatga actgcaggcc ggaagcgaga agggcgatcc tacagagcac 120
gagctgagag tcggcctgga agagtctgag ctgtggctgc ggttcaaaga actgaccaac 180
gagatgatcg tgaccaagaa cggcagacgg atgttccccg tgctgaaagt gaacgtgtcc 240
ggactggacc ccaacgccat gtacagcttt ctgctggact tcgtggtggc cgacaaccac 300
agatggaaat acgtgaacgg cgagtgggtg ccaggcggaa aacctcaact gcaagcccct 360
agctgcgtgt acattcaccc tgacagcccc aatttcggcg cccactggat gaaggcccct 420
gtgtccttca gcaaagtgaa gctgaccaac aagctgaacg gcggaggcca gatcatgctg 480
aacagcctgc acaaatacga gcccagaatc cacatcgtca gagtcggcgg accccagaga 540
atgatcacca gccactgctt ccccgagaca cagtttatcg ccgtgaccgc ctaccagaac 600
gaggaaatca ccacactgaa gatcaagtac aaccccttcg ccaaggcctt cctggacgcc 660
aaagagcgga gcgaccacaa agagatgatc aaagagcccg gcgacagcca gcagccaggc 720
tattctcaat ggggatggct gctgccaggc accagcacat tgtgccctcc agccaatcct 780
cacagccagt ttggaggcgc cctgagcctg tctagcaccc acagctacga cagatacccc 840
acactgcgga gccacagaag cagcccctat ccttctcctt acgctcaccg gaacaacagc 900
cccacctaca gcgataatag ccccgcctgt ctgagcatgc tgcagtccca cgataactgg 960
tccagcctga gaatgcctgc tcacccttcc atgctgcccg tgtctcacaa tgcctctcca 1020
cctaccagca gctctcagta ccctagcctt tggagcgtgt ccaatggcgc cgtgacactg 1080
ggatctcagg cagccgctgt gtctaatgga ctgggagccc agttcttcag aggcagccct 1140
gctcactaca cccctctgac acatcctgtg tctgccccta gcagcagcgg cttccctatg 1200
tataagggcg ctgccgccgc taccgacatc gtggattctc agtatgatgc cgccgcacag 1260
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<210> 79
<211> 435
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg
1 5 10 15
Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu His Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu
35 40 45
Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val
50 55 60
Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Val
85 90 95
Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly
100 105 110
Gly Lys Pro Gln Leu Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser
130 135 140
Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu
145 150 155 160
Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly
165 170 175
Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe
180 185 190
Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Thr Leu Lys Ile
195 200 205
Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser
210 215 220
Asp His Lys Glu Met Ile Lys Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly
225 230 235 240
Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro
245 250 255
Pro Ala Asn Pro His Ser Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ser Ser
260 265 270
Thr His Ser Tyr Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser
275 280 285
Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser
290 295 300
Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp
305 310 315 320
Ser Ser Leu Arg Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His
325 330 335
Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser
340 345 350
Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Leu Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr
370 375 380
Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Phe Pro Met
385 390 395 400
Tyr Lys Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp
405 410 415
Ala Ala Ala Gln Gly His Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro
420 425 430
Pro Ser Met
435
<210> 80
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
gacttcctgc tgctgcagaa ccctgcctct acctgtgtgc ctgaaccagc ctctcagcac 60
accctgagat ctggccctgg atgtctccag cagcctgaac agcagggcgt tagagatcct 120
ggcggaatct gggccaaact gggagctgcc gaagcctctg ccgaatgtct gcagggcaga 180
agaagcagag gcgccagcgg atctgaacct caccagatgg gaagcgacgt gcacgacctg 240
aatgctctgt tgcctgccgt gccatctctt ggcggaggcg gaggatgtgc tttgcctgtt 300
tctggtgctg cccagtgggc tcccgtgctg gattttgctc ctcctggcgc ttctgcctat 360
ggctctcttg gaggacctgc tcctccacca gctccacctc caccgccgcc tccaccacct 420
cacagcttta tcaagcaaga gccctcctgg ggcggagccg agcctcacga aaaacagtgt 480
ctgagcgcct tcaccgtgca ctttttcggc cagtttaccg gcaccgtggg cgcctgtaga 540
tacggccctt ttggaccacc accacctagc caggcttcta gcggacaggc cagaatgttc 600
cccaacgctc cttacctgcc tagctgcctg gaaagccagc ctaccatcag aaaccagggc 660
ttcagcaccg tgaccttcga cggcatgcct agctatggcc acacaccatc tcaccacgcc 720
gctcagttcc ccaatcacag cttcaagcac gaggacccta tgggccagca gggatctctg 780
ggagagcagc agtatagcgt gccacctcct gtgtacggct gtcacacccc taccgatagc 840
tgcacaggca atcaggctct gctgctgagg atgcctttca gcagcgacaa cctgtaccag 900
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ggcgtggccg ctggatctag cagctccgtg aaatggacag ccggccagag caatcactcc 1020
accggctacg agagcgacaa tcacaccatg cctatcctgt gtggggccca gtaccggatt 1080
cacacacacg gcgtgttcag gggcattcag gatgtgcgaa gagtgcctgg cgtggcccct 1140
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ggctgcaaca agcggtactt caagctgagc cacctgaaga tgcacagccg gaagcacaca 1260
ggcgagaagc tgtaccagtg cgacttcaag gactgcgagc ggagattcag ctgcagcgac 1320
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aacgagctgg tgcatcacca caacatgcac cagaggaaca tgaccaaact gcagctggtg 1560
ctg 1563
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<211> 521
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Asp Phe Leu Leu Leu Gln Asn Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu Pro
1 5 10 15
Ala Ser Gln His Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro
20 25 30
Glu Gln Gln Gly Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu Gly
35 40 45
Ala Ala Glu Ala Ser Ala Glu Cys Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly
50 55 60
Ala Ser Gly Ser Glu Pro His Gln Met Gly Ser Asp Val His Asp Leu
65 70 75 80
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
85 90 95
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
100 105 110
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
115 120 125
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
130 135 140
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Lys Gln Cys
145 150 155 160
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Phe Gly Gln Phe Thr Gly Thr Val
165 170 175
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
180 185 190
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
195 200 205
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile Arg Asn Gln Gly Phe Ser Thr Val
210 215 220
Thr Phe Asp Gly Met Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
225 230 235 240
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
245 250 255
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
260 265 270
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Asn Gln Ala Leu Leu
275 280 285
Leu Arg Met Pro Phe Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
290 295 300
Leu Glu Cys Met Ile Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
305 310 315 320
Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Ala Gly Gln
325 330 335
Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Met Pro Ile
340 345 350
Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly
355 360 365
Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Gly
370 375 380
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys His Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro
385 390 395 400
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Lys Met His Ser
405 410 415
Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Leu Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys
420 425 430
Glu Arg Arg Phe Ser Cys Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
435 440 445
His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Thr Phe
450 455 460
Ser Trp Ser Asn His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys
465 470 475 480
Thr Ile Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys
485 490 495
Phe Ala Arg Ser Asn Glu Leu Val His His His Asn Met His Gln Arg
500 505 510
Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Val Leu
515 520
<210> 82
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
accgagtaca agctggtggt tgttggagcc gatggcgtgg gaaagagcgc cctgacaatt 60
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<213> 智人
<400> 83
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Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val
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<210> 84
<211> 84
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
acagagtata agctcgtggt cgtgggcgct gtcggagtgg gaaaatctgc cctgaccatc 60
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<211> 28
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<213> 智人
<400> 85
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
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20 25
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<211> 1116
<212> DNA
<213> 智人
<400> 86
cctcctgtgc ctggcgtgcc cttcagaaac gtggacaacg atagcctgac cagcgtggaa 60
ctggaagatt gggtcgacgc ccagcatcct accgacgagg aagaggaaga agccagctct 120
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<213> 智人
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Pro Pro Val Pro Gly Val Pro Phe Arg Asn Val Asp Asn Asp Ser Leu
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Thr Ser Val Glu Leu Glu Asp Trp Val Asp Ala Gln His Pro Thr Asp
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Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Thr Ser Ser Ser Leu Ile Leu Gly Gly
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Pro Glu Glu Glu Glu Val Pro Ser Gly Val Ile Pro Asn Leu Thr Glu
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Ser Ile Pro Ser Ser Pro Pro Gln Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ser Gln
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Ser Pro Leu Ser Ser Cys Cys Ser Ser Phe Leu Trp Ser Ser Phe Ser
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Glu Glu Ser Ser Ser Gln Lys Gly Glu Asp Thr Gly Thr Cys Gln Gly
115 120 125
Leu Pro Asp Ser Glu Ser Ser Phe Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Lys Val
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Ala Lys Leu Val Glu Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Glu Ala Glu Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Glu Ala Glu Met Leu Met Ile Val Ile Lys Tyr Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Val Ile Leu Lys Arg Ala Arg Glu Phe Met Glu Leu Leu Phe
180 185 190
Gly Leu Ala Leu Ile Glu Val Gly Pro Asp His Phe Cys Val Phe Ala
195 200 205
Asn Thr Val Gly Leu Thr Asp Glu Gly Ser Asp Asp Glu Gly Met Pro
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Glu Asn Ser Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile Phe Ile Lys Gly
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Asn Cys Ala Ser Glu Glu Val Ile Trp Glu Val Leu Asn Ala Val Gly
245 250 255
Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Val Tyr Gly Lys Pro Arg Glu Leu
260 265 270
Leu Thr Asn Val Trp Val Gln Gly His Tyr Leu Glu Tyr Trp Glu Val
275 280 285
Pro His Ser Ser Pro Leu Tyr Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala
290 295 300
His Ser Glu Ser Ile Lys Lys Lys Val Leu Glu Phe Leu Ala Lys Leu
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Lys Asp Val Glu Glu Arg Val Gln Ala Thr Ile Asp Thr Ala Asp Asp
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<212> DNA
<213> 智人
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gactgcagaa agatggcccg gttcagctac tccgtgatct ggatcatggc catctccaag 60
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<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile Met
1 5 10 15
Ala Ile Ser Lys Ala Phe Glu Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Gly His
20 25 30
Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Trp Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp Asp
35 40 45
Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser Gln
50 55 60
Arg Val Pro Pro Met Glu Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg Thr
65 70 75 80
Cys Cys Leu Asn Gly Arg Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala Cys
85 90 95
Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys Glu
100 105 110
Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys Ser
115 120 125
Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Arg Ala Phe
130 135 140
Leu Pro Val Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met Leu
165 170 175
Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
180 185
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<211> 2268
<212> DNA
<213> 智人
<400> 90
ggatccgcca ccatgtggaa tctgctgcac gagacagata gcgccgtggc taccgttaga 60
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ttcacgcaca tccctcacct ggccggcacc gagcagaatt ttcagctggc caagcagatc 300
cagagccagt ggaaagagtt cggcctggac tctgtggaac tggcccacta cgatgtgctg 360
ctgagctacc ccaacaagac acaccccaac tacatcagca tcatcaacga ggacggcaac 420
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cctggcgtga agtcttaccc cgacggctgg aattttcctg gcggcggagt gcagcggcgg 780
aacatcctta atcttaacgg cgctggcgac cctctgacac ctggctatcc tgccaatgag 840
tacgcctaca gacacggaat tgccgaggct gtgggcctgc cttctattcc tgtgcaccct 900
gtgcggtact acgacgccca gaaactgctg gaaaagatgg gcggaagcgc ccctcctgac 960
tcttcttgga gaggctctct gaaggtgccc tacaatgtcg gcccaggctt caccggcaac 1020
ttcagcaccc agaaagtgaa aatgcacatc cacagcacca acgaagtgac ccggatctac 1080
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cacagagaca gctgggtgtt cggaggaatc gaccctcaat ctggcgccgc tgtggtgtat 1200
gagatcgtgc ggtctttcgg caccctgaag aaagaaggat ggcggcccag acggaccatc 1260
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gagggcaact acaccctgcg gatcgattgc acccctctga tgtacagcct ggtgcacaac 1440
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agcggcaaca acttcgaggt gttcttccag cggctgggaa tcgcctctgg aatcgccaga 1620
tacaccaaga actgggagac aaacaagttc tccggctatc ccctgtacca cagcgtgtac 1680
gagacatacg agctggtgga aaagttctac gaccccatgt tcaagtacca cctgacagtg 1740
gcccaagtgc gcggaggcat ggtgttcgaa ctggccaata gcatcgtgct gcccttcaac 1800
tgcagagact acgccgtggt gctgcggaag tacgccgaca agatctacag catcagcatg 1860
aagcacccgc aagagatgaa gacctacagc gtgtccttcg actccctgtt cttcgccgtg 1920
aagaacttca ccaagatcgc cagcaagttc agcgagcggc tgcaggactt cgacaagagc 1980
aaccctatcg tgctgaggat gatgaacgac cagctgatgt tcctggaacg ggccttcatc 2040
aaccctctgg gactgcccga cagacccttc tacaggcacg tgatctgtgc ccctagcagc 2100
cacaacaaat acgccggcga gagcttcccc ggcatctacg atgccctgtt cgacatcgag 2160
agcaacgtga accctagcaa ggcctggggc gaagtgaaga gacagatcta cgtggccgca 2220
ttcacagtgc aggccgctgc cgaaacactg tctgaagtgg ccagaggc 2268
<210> 91
<211> 1566
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
atggactttc tgctgctgca gaaccctgcc agcacctgtg ttccagaacc tgcctctcag 60
cacaccctga gatctggccc tggatgtctc cagcagcctg aacagcaggg cgttagagat 120
cctggcggaa tctgggccaa actgggagcc gctgaagcct ctgccgaatg tctgcagggc 180
agaagaagca gaggcgccag cggatctgaa cctcaccaga tgggaagcga cgtgcacgac 240
ctgaatgctc tgctgcctgc cgtgccatct cttggcggag gcggaggatg tgctttgcct 300
gtttctggtg ctgcccagtg ggctcccgtg ctggattttg ctcctcctgg cgcttctgcc 360
tatggctctc ttggaggacc tgctcctcca ccagctccac ctccaccgcc gcctccacca 420
cctcacagct ttatcaagca agagccctcc tggggcggag ccgagcctca cgaaaaacag 480
tgtctgagcg ccttcaccgt gcactttttc ggccagttta ccggcacagt gggcgcctgt 540
agatacggcc cttttggacc accaccacct agccaggcta gctctggaca ggccagaatg 600
ttccccaacg ctccctacct gcctagctgc ctggaaagcc agcctaccat cagaaaccag 660
ggcttcagca ccgtgacctt cgacggcatg cctagctatg gccacacacc atctcaccac 720
gccgctcagt tccccaatca cagcttcaag cacgaggacc ctatgggcca gcagggatct 780
ctgggagagc agcagtatag cgtgccacct cctgtgtacg gctgtcacac ccctaccgat 840
agctgcacag gcaatcaggc cctgctgctg aggatgccct tcagcagcga caacctgtac 900
cagatgacaa gccagctgga atgcatgatc tggaaccaga tgaacctggg cgccacactg 960
aaaggcgtgg ccgctggatc tagcagcagc gtgaaatgga cagccggcca gagcaatcac 1020
tccaccggct acgagtccga caaccacacc atgcctattc tgtgcggagc ccagtacaga 1080
atccacacac acggcgtgtt ccggggcatt caggatgtgc gaagagtgcc tggcgtggcc 1140
cctacacttg tgggatctgc ctctgagaca agcgagaagc accccttcat gtgcgcctat 1200
cctggctgca acaagcggta cttcaagctg agccacctga agatgcacag ccggaagcac 1260
acaggcgaga agctgtacca gtgcgacttc aaggactgcg agcggagatt cagctgcagc 1320
gaccagctga agagacacca gagaaggcac accggcgtga agcccttcca gtgcaagacc 1380
tgccagcgga cctttagctg gtccaaccac ctgaaaaccc acacaagaac ccacaccggc 1440
aagaccatcg agaagccttt cagctgtaga tggcccagct gccagaagaa gttcgcccgg 1500
tctaacgagc tggtgcatca ccacaacatg caccagagga acatgaccaa actgcagctg 1560
gtgctg 1566
<210> 92
<211> 768
<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
gcccagagaa tgaccacaca gttgctgctg ctcctcgtgt gggttgccgt tgtgggagaa 60
gtgcagacca gaatcgcctg ggccagaacc gagctgctga acgtgtgcat gaacgccaag 120
caccacaaga agaagcccga tcctgaggac aagctgcacg agcagtgtcg gccttggaga 180
aagaacgcct gctgtagcac caacaccagc caagaggccc acaagaacgt gtcctacctg 240
taccggttca actggaacca ctgcggcgag atgacacccg cctgcaagag acacttcatc 300
caggatacct gcctgtacga gtgcagcccc aatctcggcc cctggattca gcaagtggac 360
cagagctggc ggaaagaact ggtcctgaat gtgcccctgt gcaaagagga ttgcgagcag 420
tggtgggaag attgcagaac cagctacaca tgcaagagca actggcacaa aggctggaac 480
tggaccagcg gcttcaacaa gtgtgccgtg ggagctgcct gtcagccttt ccacttctac 540
tttcacacac ccaccgtgct gtgcaacaag atctggaccc acagctacaa ggtgtccaac 600
tacagcagag gcagcggccg gtgtatccag atgtggttcg atcccgccaa gggcaacccc 660
aatgaggaag tggccagatt ctacgccgct gccatgtctg gtgcaggacc ttgggctgct 720
tggccctttc tgctttcact ggccctgatg ctgctgtggc tgctgagc 768
<210> 93
<211> 256
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val Ala
1 5 10 15
Val Val Gly Glu Val Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu
20 25 30
Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Lys Lys Pro Asp Pro
35 40 45
Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys
50 55 60
Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asn Val Ser Tyr Leu
65 70 75 80
Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Thr Pro Ala Cys Lys
85 90 95
Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu
100 105 110
Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Leu Val
115 120 125
Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp
130 135 140
Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn
145 150 155 160
Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro
165 170 175
Phe His Phe Tyr Phe His Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Lys Ile Trp
180 185 190
Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys
195 200 205
Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Lys Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val
210 215 220
Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala Ala
225 230 235 240
Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu Ser
245 250 255
<210> 94
<211> 2085
<212> DNA
<213> 智人
<400> 94
atggctctgc tgctggtttc tctgctggcc ctgctgtctc tcggctctgg atgtcaccac 60
agaatctgcc actgcagcaa ccgggtgttc ctgtgccaga aaagcaaagt gaccgagatc 120
ctgagcgacc tgcagcggaa tgccatcgag ctgagattcg tgctgaccaa gctgcaagtg 180
atccagaagg gcgccttcag cggcttcggc gacctggaaa agatcgagat cagccagaac 240
aacgtgctgg aagtgatcga ggcccacgtg ttcagcaacc tgcctaagct gcacgagatc 300
agaatcgaga aggccaacaa cctgctgtac atcaaccccg aggccttcca gaacttcccc 360
aacctgcagt acctgctgat ctccaacacc ggcatcaaac atctgcccga cgtgcacaag 420
atccacagcc tgcagaaggt gctgctggac atccaggaca acatcaacat ccacacaatc 480
gagcggaact acttcctggg cctgagcttc gagagcgtga tcctgtggct gaacaagaac 540
ggcatccaag agatccacaa ctgcgccttc aatggcaccc agctggacga gctgaacctg 600
tccgacaaca acaatctgga agaactgccc aacgacgtgt tccacagagc cagcggacct 660
gtgatcctgg acatcagcag aaccagaatc cactctctgc ccagctacgg cctggaaaac 720
ctgaagaagc tgcgggccag aagcacctac aatctgaaaa agctgcctac gctggaaacc 780
ctggtggccc tgatggaagc cagcctgaca taccctagcc actgctgcgc ctttgccaac 840
tggcggagac agatctctga gctgcacccc atctgcaaca agagcatcct gcggcaagag 900
gtggactaca tgacacaggc cagaggccag agattcagcc tggccgagga taacgagagc 960
agctacagca gaggcttcga catgacctac accgagttcg actacgacct gtgcaacaag 1020
gtggtggacg tgacatgcag ccccaagcct gatgccttca atccctgcga ggacatcatg 1080
ggctacaaca tcctgagagt gctgatctgg ttcatcagca tcctggccat caccgagaac 1140
atcatcgtgc tggtcatcct gaccaccagc cagtacaagc tgaccgtgcc tatgttcctg 1200
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gtggacattc acaccaagag ccagtaccac aactacgcca tcgactggca gacaggcgcc 1320
ggatgtgatg ccgccggatt ctttacagtg ttcgccagcg agctgtccgt gtacaccctg 1380
acagctatca ccctggaacg gtggcacacc atcacacacg ctatgcagct ggactgcaaa 1440
gtgcacctga gacacagcgc ctccgtgatg gttatgggct ggatcttcgc cttcgctgcc 1500
gctctgttcc ccatctttgg catcagctcc tacatgaagg tgtccatcta tctgcccatg 1560
gacatcgaca gccctctgag ccagctgtac gtgatgagtc tgctggtgct gaatgtgctg 1620
gcctttgtgg tcatctgcgg ctgctacatc tatatctacc tgacagtgcg gaaccccaac 1680
atcgtgtcca gctccagcga cacccggatc gctaagagaa tggccatgct gatcttcacc 1740
gactttctgt gcatggcccc tatcagcctg ttcgccatta gcgctagcct gaaggtgccc 1800
ctgatcaccg tgtccaaggc caagattctg ctggtcctgt tctaccccat caacagctgc 1860
gccaatcctt tcctgtacgc catcttcacc aagaacttca ggcggaactt cttcatcctg 1920
ctgagcaagc ggggctgtta caagatgcag gcccagatct accggaccga gacactgtcc 1980
accgtgcaca acacacaccc cagaaacggc cactgtagca gcgcccctag agtgacaaat 2040
ggctccacct acatcctggt gccactgagc catctggccc agaac 2085
<210> 95
<211> 695
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Met Ala Leu Leu Leu Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Gly Ser
1 5 10 15
Gly Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys
20 25 30
Gln Lys Ser Lys Val Thr Glu Ile Leu Ser Asp Leu Gln Arg Asn Ala
35 40 45
Ile Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Gln Val Ile Gln Lys Gly
50 55 60
Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn
65 70 75 80
Asn Val Leu Glu Val Ile Glu Ala His Val Phe Ser Asn Leu Pro Lys
85 90 95
Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asn
100 105 110
Pro Glu Ala Phe Gln Asn Phe Pro Asn Leu Gln Tyr Leu Leu Ile Ser
115 120 125
Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Asp Val His Lys Ile His Ser Leu
130 135 140
Gln Lys Val Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr Ile
145 150 155 160
Glu Arg Asn Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Phe Glu Ser Val Ile Leu Trp
165 170 175
Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly
180 185 190
Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu
195 200 205
Leu Pro Asn Asp Val Phe His Arg Ala Ser Gly Pro Val Ile Leu Asp
210 215 220
Ile Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn
225 230 235 240
Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro
245 250 255
Thr Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro
260 265 270
Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu Leu
275 280 285
His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Val Asp Tyr Met
290 295 300
Thr Gln Ala Arg Gly Gln Arg Phe Ser Leu Ala Glu Asp Asn Glu Ser
305 310 315 320
Ser Tyr Ser Arg Gly Phe Asp Met Thr Tyr Thr Glu Phe Asp Tyr Asp
325 330 335
Leu Cys Asn Lys Val Val Asp Val Thr Cys Ser Pro Lys Pro Asp Ala
340 345 350
Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Val Leu
355 360 365
Ile Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Glu Asn Ile Ile Val Leu
370 375 380
Val Ile Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Val Pro Met Phe Leu
385 390 395 400
Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu
405 410 415
Leu Ile Ala Ser Val Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr
420 425 430
Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe
435 440 445
Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr
450 455 460
Leu Glu Arg Trp His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Asp Cys Lys
465 470 475 480
Val His Leu Arg His Ser Ala Ser Val Met Val Met Gly Trp Ile Phe
485 490 495
Ala Phe Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met
500 505 510
Lys Val Ser Ile Tyr Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln
515 520 525
Leu Tyr Val Met Ser Leu Leu Val Leu Asn Val Leu Ala Phe Val Val
530 535 540
Ile Cys Gly Cys Tyr Ile Tyr Ile Tyr Leu Thr Val Arg Asn Pro Asn
545 550 555 560
Ile Val Ser Ser Ser Ser Asp Thr Arg Ile Ala Lys Arg Met Ala Met
565 570 575
Leu Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Leu Phe Ala
580 585 590
Ile Ser Ala Ser Leu Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Ser Lys Ala Lys
595 600 605
Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe
610 615 620
Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Asn Phe Arg Arg Asn Phe Phe Ile Leu
625 630 635 640
Leu Ser Lys Arg Gly Cys Tyr Lys Met Gln Ala Gln Ile Tyr Arg Thr
645 650 655
Glu Thr Leu Ser Thr Val His Asn Thr His Pro Arg Asn Gly His Cys
660 665 670
Ser Ser Ala Pro Arg Val Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Ile Leu Val Pro
675 680 685
Leu Ser His Leu Ala Gln Asn
690 695
<210> 96
<211> 1104
<212> DNA
<213> 智人
<400> 96
cccagggctc ccaagagaca gagatgcatg cccgaagagg acctgcagag ccagagcgaa 60
acacagggac tcgaaggtgc tcaggctcct ctggccgtgg aagaagatgc cagcagctct 120
accagcacct ccagcagctt ccctagcagc tttccattca gctcctctag ctctagcagc 180
agctgttacc ctctgatccc cagcacaccc gagaaggtgt tcgccgacga cgagacacct 240
aatccactgc agtctgccca gatcgcctgc agcagtacac tggtggttgc tagcctgcct 300
ctggaccagt ctgatgaggg aagcagcagc cagaaagagg aaagccctag cacactccag 360
gtgctgcccg atagcgagag cctgcctaga agcgagatct acaagaaaat gaccgacctg 420
gtgcagttcc tcctgttcaa gtaccagatg aaggaaccca tcaccaaggc cgaaatcctg 480
gaaagcgtga tcagaaacta cgaggaccac tttccactgc tgttcagcga ggccagcgag 540
tgcatgctgc tcgtgtttag catcgacgtg aagaaggtgg accccaccgg ccacagcttt 600
gtgctggtta caagcctggg actgacctac gacggcatgc tgtccgatgt gcagagcatg 660
cctaagaccg gcatcctgat cctgattctg agcatcgtgt tcatcgaggg ctactgcacc 720
cctgaggaag tgatttggga agccctgaac atgatgggcc tgtacgatgg catggaacac 780
ctgatctacg gcgagcccag aaaactgctg acccaggact gggtgcaaga gaactacctg 840
gaataccggc agatgcccgg cagcgatcct gccagatatg agtttctgtg gggccctaga 900
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gacccaatca gcttcccact ttggtacgaa gaggccctga aggacgagga agagagagcc 1020
caggatagaa tcgccaccac cgacgacaca acagccatgg cctctgcctc ttctagcgcc 1080
accggcagct ttagctaccc cgag 1104
<210> 97
<211> 368
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Pro Arg Ala Pro Lys Arg Gln Arg Cys Met Pro Glu Glu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Ser Gln Ser Glu Thr Gln Gly Leu Glu Gly Ala Gln Ala Pro Leu Ala
20 25 30
Val Glu Glu Asp Ala Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Phe Pro
35 40 45
Ser Ser Phe Pro Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Tyr Pro
50 55 60
Leu Ile Pro Ser Thr Pro Glu Lys Val Phe Ala Asp Asp Glu Thr Pro
65 70 75 80
Asn Pro Leu Gln Ser Ala Gln Ile Ala Cys Ser Ser Thr Leu Val Val
85 90 95
Ala Ser Leu Pro Leu Asp Gln Ser Asp Glu Gly Ser Ser Ser Gln Lys
100 105 110
Glu Glu Ser Pro Ser Thr Leu Gln Val Leu Pro Asp Ser Glu Ser Leu
115 120 125
Pro Arg Ser Glu Ile Tyr Lys Lys Met Thr Asp Leu Val Gln Phe Leu
130 135 140
Leu Phe Lys Tyr Gln Met Lys Glu Pro Ile Thr Lys Ala Glu Ile Leu
145 150 155 160
Glu Ser Val Ile Arg Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu Phe Ser
165 170 175
Glu Ala Ser Glu Cys Met Leu Leu Val Phe Ser Ile Asp Val Lys Lys
180 185 190
Val Asp Pro Thr Gly His Ser Phe Val Leu Val Thr Ser Leu Gly Leu
195 200 205
Thr Tyr Asp Gly Met Leu Ser Asp Val Gln Ser Met Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Ile Leu Ile Leu Ile Leu Ser Ile Val Phe Ile Glu Gly Tyr Cys Thr
225 230 235 240
Pro Glu Glu Val Ile Trp Glu Ala Leu Asn Met Met Gly Leu Tyr Asp
245 250 255
Gly Met Glu His Leu Ile Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln
260 265 270
Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Met Pro Gly Ser
275 280 285
Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala His Ala Glu
290 295 300
Ile Arg Lys Met Ser Leu Leu Lys Phe Leu Ala Lys Val Asn Gly Ser
305 310 315 320
Asp Pro Ile Ser Phe Pro Leu Trp Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Asp Glu
325 330 335
Glu Glu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Ala Thr Thr Asp Asp Thr Thr Ala
340 345 350
Met Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Pro Glu
355 360 365
<210> 98
<211> 1527
<212> DNA
<213> 智人
<400> 98
atggaaagaa gaaggctctg gggcagcatc cagagccggt acatcagcat gagcgtgtgg 60
acaagccctc ggagactggt ggaactggct ggacagagcc tgctgaagga tgaggccctg 120
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ttcgacggca gacacagcca gacactgaaa gccatggtgc aggcctggcc tttcacctgt 240
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gccagcctgt acagctttcc tgagcctgaa gccgctcagc ccatgaccaa gaaaagaaag 480
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cagaagaaga acgtcctgca cctgtgctgc aagaagctga agatctttgc catgcctatg 660
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acctgtacct ggaagctgcc cacactggcc aagttcttta gctacctggg ccagatgatc 780
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cacctgtctc agagcccatc tgtgtcccag ctgagcgtgc tgtctctgtc tggcgtgatg 1080
ctgaccgatg tgtcccctga acctctgcag gcactgctga aaaaggccag cgccactctg 1140
caggacctgg tgtttgatga gtgcggcatc atggacgacc agctgtttgc cctgctgcca 1200
agcctgagcc actgtagcca actgaccaca ctgagcttct acggcaacag catctacatc 1260
tctgccctgc agagcctcct gcagcacctg atcggactga gcaatctgac ccacgtgctg 1320
tacccagtgc tgctcgagag ctacgaggac atccacgtga ccctgcacca agagagactg 1380
gcctatctgc atgcccggct gagagaactg ctgtgcgaac tgggcagacc cagcatggtt 1440
tggctgagcg ctaatctgtg ccctcactgc ggcgacagaa ccttctacga ccccaagctg 1500
atcatgtgcc cctgcttcat gcccaac 1527
<210> 99
<211> 509
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg
50 55 60
His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys
65 70 75 80
Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr
85 90 95
Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val
100 105 110
Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Leu Lys Asn Ser
115 120 125
His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr
130 135 140
Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu
165 170 175
Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe
180 185 190
Ser Tyr Leu Thr Glu Lys Val Lys Gln Lys Lys Asn Val Leu His Leu
195 200 205
Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys
210 215 220
Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Phe Ser Tyr Leu
245 250 255
Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala
260 265 270
Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Gln Phe
275 280 285
Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val
305 310 315 320
Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Leu Glu
325 330 335
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
355 360 365
Leu Gln Ala Leu Leu Lys Lys Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
370 375 380
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Met Asp Asp Gln Leu Phe Ala Leu Leu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
405 410 415
Ser Ile Tyr Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
420 425 430
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Leu Leu Glu Ser Tyr
435 440 445
Glu Asp Ile His Val Thr Leu His Gln Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
450 455 460
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
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Trp Leu Ser Ala Asn Leu Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
485 490 495
Asp Pro Lys Leu Ile Met Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
500 505
<210> 100
<211> 1302
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
tctagccctg gcacagagag cgccggaaag tccctgcagt acagagtgga tcatctgctg 60
agcgccgtgg aaaacgaact gcaggccgga tctgagaagg gcgatcctac agagcacgag 120
ctgagagtcg gcctggaaga gtctgagctg tggctgcggt tcaaagaact gaccaacgag 180
atgatcgtca ccaagaacgg cagacggatg ttccccgtgc tgaaagtgaa cgtgtccgga 240
ctggacccca acgccatgta tagctttctg ctggacttcg tggtggccga caaccacaga 300
tggaaatacg tgaacggcga gtgggtgcca ggcggaaaac ctcaactgca agcccctagc 360
tgcgtgtaca ttcaccctga cagccccaat ttcggcgccc actggatgaa ggcccctgtg 420
tcctttagca aagtcaagct gaccaacaag ctgaacggcg gaggccagat catgctgaac 480
tccctgcaca aatacgagcc cagaatccac atcgtcagag tcggcggacc ccagagaatg 540
atcaccagcc actgcttccc cgagacacag tttatcgccg tgaccgccta ccagaacgag 600
gaaatcacaa ccctgaagat caagtacaac cccttcgcca aggccttcct ggacgccaaa 660
gagcggagcg accacaaaga aatgatcaaa gagcccggcg actcccagca gccaggctat 720
tctcaatggg gatggctgct gccaggcacc agcacattgt gccctccagc caatcctcac 780
agccagtttg gaggcgctct gtccctgagc agcacacaca gctacgacag ataccccaca 840
ctgcggagcc acagaagcag cccctatcct tctccttacg ctcaccggaa caacagcccc 900
acctacagcg ataatagccc cgcctgtctg agcatgctgc agtcccacga taattggagc 960
agcctgcgga tgcctgctca cccttctatg ctgcccgtgt ctcacaacgc ctctccacct 1020
acaagcagct ctcagtaccc cagcctttgg agcgtgtcca atggcgctgt gacactggga 1080
tctcaggccg ctgctgtgtc taatggactg ggagcccagt tcttcagagg cagccctgct 1140
cactacaccc ctctgacaca tcctgtgtca gccccttcta gcagcggctt ccctatgtac 1200
aaaggcgccg ctgccgccac cgatatcgtg gattctcagt acgatgccgc cgctcagggc 1260
cacctgattg catcttggac acctgtgtct ccaccttcca tg 1302
<210> 101
<211> 474
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
atgcaccaga aacggaccgc catgtttcag gaccctcaag agaggcccag aaagctgcct 60
cacctgtgta ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tcctgcggag agaggtgtac gatttcgcct tccgggacct gtgcatcgtg 180
tacagagatg gcaaccccta cgccgtgtgc aacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtacc gctactactg ctacagcgtg tacggcacca cactggaaca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatccggtgc atcaactgcc agaaacctct gtgccccgag 360
gaaaagcagc ggcacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg ccggtggacc 420
ggcagatgca tgagctgttg tcggagcagc cggaccagaa gagagacaca gctg 474
<210> 102
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro His Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asn Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg Tyr Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 103
<211> 291
<212> DNA
<213> 智人
<400> 103
cacggcgata cccctacact gcacgagtac atgctggacc tgcagcctga gacaaccgac 60
ctgtactgct acgagcagct gaacgacagc agcgaggaag aggacgagat tgacggacct 120
gccggacagg ccgaacctga tagagcccac tacaatatcg tgaccttctg ctgcaagtgc 180
aacagcaccc tgagactgtg cgtgcagagc acccacgtgg acatcagaac cctggaagat 240
ctgctgatgg gcaccctggg aatcgtgtgc cctatctgca gccagaagcc t 291
<210> 104
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu
20 25 30
Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg
35 40 45
Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asn Ser Thr Leu
50 55 60
Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys
85 90 95
Pro
<210> 105
<211> 471
<212> DNA
<213> 智人
<400> 105
gccagattcg acgaccccac cagaaggcct tacaagctgc ctgatctgtg cactgaactg 60
aacaccagcc tgcaggacat cgagattacc tgtgtgtatt gcaagaccgt gctggaactg 120
accgaggtgt tcgagtttgc ctttaaggac ctgttcgtgg tgtaccggga cagcattcct 180
cacgccgcct gccacaagtg catcgacttc tacagccgga tcagagagct gcggcactac 240
agcgattctg tgtacgggga caccctggaa aagctgacca acaccggcct gtacaacctg 300
ctcatcagat gcctgcggtg tcagaagccc ctgaatcctg ccgagaagct gagacacctg 360
aacgagaagc ggagattcca caatatcgcc ggccactaca gaggccagtg ccacagctgt 420
tgcaaccggg ccagacaaga gagactgcag agaaggcggg aaacccaagt g 471
<210> 106
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Ala Arg Phe Asp Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu
1 5 10 15
Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val
20 25 30
Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe
35 40 45
Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys
50 55 60
His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr
65 70 75 80
Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly
85 90 95
Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn
100 105 110
Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn
115 120 125
Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala
130 135 140
Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
145 150 155
<210> 107
<211> 312
<212> DNA
<213> 智人
<400> 107
cacggcccta aggccacact gcaggatatc gtgctgcacc tggaacctca gaacgagatc 60
cccgtggatc tgctgtgcca tgagcagctg tccgactcca aagaggaaaa cgacgaaatc 120
gacggcgtga accaccagca tctgcctgcc agaagggccg aaccacagag acacaccatg 180
ctgtgcatgt gttgcaagtg cgaggcccgg attgagctgg tggtggaaag ctctgccgac 240
gacctgagag ccttccagca gctgttcctg aacaccctga gcttcgtgtg tccttggtgc 300
gccagccagc ag 312
<210> 108
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp
20 25 30
Ser Lys Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu
35 40 45
Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys
50 55 60
Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp
65 70 75 80
Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val
85 90 95
Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
100
<210> 109
<211> 780
<212> DNA
<213> 智人
<400> 109
gccgtgacag cctgtcagag cctgggcttt gtggtgtccc tgatcgagat cgtgggcatc 60
attgccgcta cctgcatgga ccagtggtct acccaggacc tgtacaacaa ccctgtgacc 120
gccgtgttca actaccaagg cctgtggcac agctgcatga gagagagcag cggcttcacc 180
gagtgcagag gctacttcac cctgctggaa ctgcctgcca tgctgcaggc tgtgcaggcc 240
cttatgatcg tgggaattgt gctgggagcc atcggcctgc tggtgtccat tttcgccctg 300
aagtgcatcc ggatcggcag catggaagat agcgccaagg ccaacatgac cctgaccagc 360
ggcatcatgt tcatcgtgtc cggcctgtgc gccattgctg gcgtgtccgt gtttgccaat 420
atgctcgtga ccaacttctg gctgagcacc gccaacatgt acaccggcat gggcgagatg 480
gtgcagaccg tgcagacacg gtacacattt ggcgccgctc tgtttgtcgg atgggttgca 540
ggcggactga cactgattgg cggcgtgatg atgtgtatcg cctgcagagg actggcccct 600
gaggaaacaa actacaaggc cgtgtactac cacgcctccg gacacagcgt ggcatacaaa 660
cctggcggct ttaaggccag caccggcttc ggcagcaaca ccaagaacaa gaagatctac 720
gacggcggag cacacaccga ggatgaggtg cagagctacc ccagcaagca cgactacgtg 780
<210> 110
<211> 260
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Ala Val Thr Ala Cys Gln Ser Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile Glu
1 5 10 15
Ile Val Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln
20 25 30
Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu
35 40 45
Trp His Ser Cys Met Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly
50 55 60
Tyr Phe Thr Leu Leu Glu Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Gln Ala
65 70 75 80
Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser
85 90 95
Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala
100 105 110
Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser Gly
115 120 125
Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val Thr
130 135 140
Asn Phe Trp Leu Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Glu Met
145 150 155 160
Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val
165 170 175
Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met Cys
180 185 190
Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe
210 215 220
Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr
225 230 235 240
Asp Gly Gly Ala His Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser Lys
245 250 255
His Asp Tyr Val
260
<210> 111
<211> 492
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
gctctgctgg cactgctgct ggtggtggct ttgcctagag tgtggaccga cgccaatctg 60
acagtgcggc agagagatcc tgaggacagc cagagaaccg acgacggcga taacagagtg 120
tggtgccacg tgtgcgagcg cgagaatacc ttcgagtgtc agaaccccag acggtgcaag 180
tggaccgagc cttactgtgt gatcgccgcc gtgaaaatct tcccacggtt cttcatggtg 240
gtcaagcagt gcagcgctgg ctgtgccgct atggaaagac ccaagcctga ggaaaagcgg 300
ttcctgctcg aggaacccat gctgttcttc tacctgaagt gctgcaaaat ctgctactgc 360
aacctggaag gccctcctat caacagcagc gtcctgaaag aatatgccgg cagcatgggc 420
gagtcttgtg gtggactgtg gctggccatt ctgctgctgc ttgcctctat tgccgcctct 480
ctgagcctga gc 492
<210> 112
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Pro Arg Val Trp Thr
1 5 10 15
Asp Ala Asn Leu Thr Val Arg Gln Arg Asp Pro Glu Asp Ser Gln Arg
20 25 30
Thr Asp Asp Gly Asp Asn Arg Val Trp Cys His Val Cys Glu Arg Glu
35 40 45
Asn Thr Phe Glu Cys Gln Asn Pro Arg Arg Cys Lys Trp Thr Glu Pro
50 55 60
Tyr Cys Val Ile Ala Ala Val Lys Ile Phe Pro Arg Phe Phe Met Val
65 70 75 80
Val Lys Gln Cys Ser Ala Gly Cys Ala Ala Met Glu Arg Pro Lys Pro
85 90 95
Glu Glu Lys Arg Phe Leu Leu Glu Glu Pro Met Leu Phe Phe Tyr Leu
100 105 110
Lys Cys Cys Lys Ile Cys Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn
115 120 125
Ser Ser Val Leu Lys Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys Gly
130 135 140
Gly Leu Trp Leu Ala Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Ser
145 150 155 160
Leu Ser Leu Ser
<210> 113
<211> 1986
<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
gccgccaccg agatcagcgt gctgagcgag cagttcacca agatcaaaga attgaagctg 60
atgctcgaga aggggctgaa gaaagaagag aaggacggcg tctgccgcga gaagaatcac 120
agaagcccta gcgagctgga agcccagaga acatctggcg ccttccagga cagcatcctg 180
gaagaagagg tggaactggt tctggcccct ctggaagaga gcaagaagta catcctgaca 240
ctgcagaccg tgcacttcac ctctgaagcc gtgcagctcc aggacatgag cctgctgtct 300
atccagcagc aagagggcgt gcaggttgtg gttcagcaac ctggacctgg actgctctgg 360
ctgcaagagg gacctagaca gtccctgcag cagtgtgtgg ccatcagcat ccagcaagag 420
ctgtatagcc ctcaagagat ggaagtgctg cagtttcacg ccctcgaaga gaacgtgatg 480
gtggccatcg aggacagcaa gctggctgtg tctctggccg aaacaaccgg cctgatcaag 540
ctggaagagg aacaagagaa gaaccagctg ctggccgaga aaacaaaaaa gcaactgttc 600
ttcgtggaaa ccatgagcgg cgacgagaga agcgacgaga tcgtgctgac agtgtccaac 660
agcaacgtgg aagaacaaga ggaccagcct accgcctgtc aggccgatgc cgagaaagcc 720
aagtttacca agaaccagag aaagaccaag ggcgccaagg gcaccttcca ctgcaacgtg 780
tgcatgttca ccagcagccg gatgagcagc ttcaactgcc acatgaagac ccacaccagc 840
gagaagcccc atctgtgtca cctgtgcctg aaaaccttcc ggacagtgac actgctgtgg 900
aactatgtga acacccacac aggcacccgg ccttacaagt gcaacgactg caacatggcc 960
ttcgtgacca gcggagaact cgtgcggcac agaagataca agcacaccca cgagaaaccc 1020
ttcaagtgca gcatgtgcaa atacgcatcc atggaagcct ccaagctgaa gtgccacgtg 1080
cgctctcaca caggcgagca ccctttccag tgctgtcagt gtagctacgc cagccgggac 1140
acctataagc tgaagcggca catgagaacc cactctggcg aaaagcccta cgagtgccac 1200
atctgccaca ccagattcac ccagagcggc accatgaaga ttcacatcct gcagaaacac 1260
ggcaagaacg tgcccaagta ccagtgtcct cactgcgcca ccattatcgc cagaaagtcc 1320
gacctgcggg tgcacatgag gaatctgcac gcctattctg ccgccgagct gaaatgcaga 1380
tactgcagcg ccgtgttcca caagagatac gccctgatcc agcaccagaa aacccacaag 1440
aacgagaagc ggtttaagtg caagcactgc agctacgcct gcaagcaaga gcgccacatg 1500
atcgcccaca tccacacaca caccggggag aagcctttta cctgcctgag ctgcaacaag 1560
tgcttccggc agaaacagct gctcaacgcc cacttcagaa agtaccacga cgccaacttc 1620
atccccaccg tgtacaagtg ctccaagtgc ggcaagggct tcagccggtg gatcaatctg 1680
caccggcacc tggaaaagtg cgagtctggc gaagccaagt ctgccgcctc tggcaagggc 1740
agaagaaccc ggaagagaaa gcagaccatc ctgaaagagg ccaccaagag ccagaaagaa 1800
gccgccaagc gctggaaaga ggctgccaac ggcgacgaag ctgctgccga agaagccagc 1860
acaacaaagg gcgaacagtt ccccgaagag atgttccctg tggcctgcag agaaaccaca 1920
gccagagtga agcaagaggt cgaccagggc gtgacctgcg agatgctgct gaacaccatg 1980
gacaag 1986
<210> 114
<211> 2280
<212> DNA
<213> 智人
<400> 114
atgaagaccc tggtcaagat cgtgtttggc gtggccacat ctgccgtgct ggctctgctg 60
gtcatgtgca ttgtgctgca ccccagcaga gtgcacaaca gcgaagagaa caccatgcgg 120
gccctgacac tgaaggacat cctgaacgtg accttcagct acaagatatt cttccccaac 180
tggatctccg gccaagagta cctgcaccag agcgccgaca acaacatcgt gctgtacaac 240
atcgagacag gccagagcta caccatcatg agcaaccgga ccatgaagtc cgtgaacgcc 300
agcaactacg gactgagccc cgattggcag ttcgtgtacc tggaaagcga ctacagcaag 360
ctgtggcggt acagctacac cgccacctac tacatctacg acctgagcaa cggcgagttc 420
gtgaagggca acgagctgcc ccatcctatc cagtacctgt gttggagccc tgtgggctcc 480
aagctggcct acgtgtacca gaacaacatc tacctgaagc agcggcctgg cgaccctcca 540
ttccagatca ccttcaacgg cagagagaac aagatcttta acggcatccc cgactgggtg 600
tacgaggaag agatgctggc caccaaatac gccctgtggt ggtcccctaa cggcaagttt 660
ctggcctatg ccgacttcaa cgacacagac atccccgtga tcgcctacag ctactacggc 720
aatgagcagt accccaggac catcaacatc agctacccca aagccggcgc taagaaccct 780
gtcgtgcgga tcttcatcat cgacaccacc tatcctgtgt acgtgggccc tcaagaggtg 840
ccagtgcctg ccatgattgc cagcagcgac tactacttca gctggctgac ctgggtcacc 900
gacgagcgag tttgtctgca gtggctgaag cgggtgcaga acatcagcgt gctgagcatc 960
tgcgacttca gaaaggactg gcagacatgg gactgcccca acacacagca gcacatcgag 1020
gaaagcagaa ccggctgggc tggcggcttc tttgtgtcta cccctgtgtt cagctacgac 1080
gccatcctgt actataagat cttcagcgac aaggacggct acaagcacat ccactacatc 1140
aagtacaccg tcgagaacgt gatccagatt accagcggca agtgggaagc catcaatatc 1200
ttcagagtga tccagtacag cctgttctac agcagcaacg agttcgagga ataccccggc 1260
agacggaaca tctacagaat cagcatcggc agctacccgc ctagcaagaa atgcgtgacc 1320
tgccacctga gaaaagagcg gtgccagtac tacacagcca gcttctccaa ctacgccaag 1380
tactacgccc tcgtgtgtta cggccctggc atccctatca gcacactgca cgatggcaga 1440
accgaccaag agatcaagat cctggaagaa aacaaagagc tggaaaacgc cctgaagaac 1500
atccagctgc ctaaagagga aatcaagaag ctggaagtcg acgagatcac cctgtggtac 1560
aagatgatcc tgcctcctca gttcgaccgg tccaagaagt accctctgct gatccaggtg 1620
tacggcggac cttgttctca gtctgtgcgc tccgtgttcg ccgtgaattg gatcagctat 1680
ctggccagca aagaaggcat ggttatcgcc ctggtggacg gcagaggcac agcttttcaa 1740
ggcgacaagc tgctgtacgc cgtgtatcag aaactgggcg tgtacgaagt ggaagatcag 1800
atcaccgccg tgcggaagtt catcgagatg ggcttcatcg acgagaagcg gatcgccatc 1860
tggggctggt cttacggcgg ctatattagc tctctggccc tggcctctgg caccggcctg 1920
tttaagtgtg gaattgccgt ggctcccgtg tccagctggg agtactatac cagcgtgtac 1980
accgagcggt tcatgggcct gcctaccaag gacgacaacc tggaacacta caagaactct 2040
accgtgatgg ccagagccga gtacttccgg aacgtggact acctgctgat tcacggcacc 2100
gccgacgaca acgtgcactt ccaaaacagc gcccagatcg ctaaggccct cgtgaatgcc 2160
caggtggact ttcaggccat gtggtacagc gaccagaacc acggactgtc tggcctgagc 2220
accaaccacc tgtacaccca catgacccac tttctgaaac agtgcttcag cctgagcgac 2280
<210> 115
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Met Lys Thr Leu Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu His Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Val Thr Phe Ser Tyr Lys Ile Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Met Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Trp Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Lys Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro His Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Asp Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asn Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Ser Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Val Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Ile Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Lys Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Asn Thr Gln
325 330 335
Gln His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Tyr Thr Val
370 375 380
Glu Asn Val Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Ile Gln Tyr Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Gln Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Ile Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Thr Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 116
<211> 780
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
gccgtcacag cctgtcagag cctgggcttt gtggtgtccc tgatcgagat cgtgggcatc 60
attgccgcta cctgcatgga ccagtggtct acccaggacc tgtataacaa ccccgtgacc 120
gccgtgttca actaccaagg cctgtggcac agctgcatga gagagagcag cggcttcacc 180
gagtgcaggg gctactttac cctgctggaa ctgccagcca tgctgcaggc tgtgcaggcc 240
cttatgatcg tgggaattgt gctgggcgcc atcggcctgc tggtgtctat ttttgccctg 300
aagtgcatcc ggatcggcag catggaagat agcgccaagg ccaacatgac cctgacctcc 360
ggcatcatgt tcatcgtgtc cggcctgtgt gccattgcag gcgtgtccgt gtttgccaat 420
atgctcgtga ccaacttctg gctgtccacc gccaacatgt acaccggcat gggcgagatg 480
gtgcagaccg tgcagacacg gtacacattt ggcgccgctc tgtttgtcgg atgggttgca 540
ggcggactga ctctgattgg cggcgtgatg atgtgtatcg cctgcagagg actggcccct 600
gaggaaacaa actacaaggc cgtgtactac cacgccagcg gacacagcgt ggcatacaaa 660
ccaggcggct ttaaggccag cacaggcttc ggcagcaaca ccaagaacaa gaagatctac 720
gacggcggag cccataccga ggatgaggtg cagagctacc ctagcaagca cgactacgtg 780
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
tgcccaccag tgccaccact 20
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
cggactgctg tgtcctaaga g 21
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
gctgtcctcg tctgtatctt cc 22
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
tgtgaaggtg ctggaatacg 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
gccggtaaag taggtgtgct 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
tgtctagggg aagggtgtgg 20
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
tgccccagac tgaccaaata c 21
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
gaagcccttc agctgtagat gg 22
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
ctgaattgtc agggcgctc 19
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
catgcaccag aggaacatga cc 22
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
gagttggatg gtcagggcag at 22
<210> 128
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
gatcacttct gcgtgttcgc taacacag 28
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
ctcatcacgc tcaggctctc gct 23
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
gagaagtgca gaccagaatc g 21
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
tctgctgtag ttggacacct tg 22
<210> 132
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
atgcatgccc gaagaggacc tgcagag 27
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
gctctgcaca tcggacagca t 21
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
ttccagtgct gccagtgtag 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
agcacttgtt gcagctcaga 20
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
ccctcaagag aggcccagaa ag 22
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
tacacgatgc acaggtcccg gaa 23
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
cacggcgata cccctacact g 21
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
ccatcagcag atcttccagg gtt 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
tgaacaccag cctgcaggac atc 23
<210> 141
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
gcatctgatg agcaggttgt acaggc 26
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
tgtgccatga gcagctgtcc gact 24
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 143
aaggctctca ggtcgtcggc aga 23
Claims (299)
1.一种组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中所述组合物能够引发特异性针对所述至少5种TAA的免疫反应。
2.一种组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少10种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中所述组合物能够引发特异性针对所述至少10种TAA的免疫反应。
3.一种组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少15种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中所述组合物能够引发特异性针对所述至少15种TAA的免疫反应。
4.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或所述细胞系的所述组合被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达。
5.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少15种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或所述细胞系的所述组合被修饰以表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍数。
7.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或所述细胞系的所述组合被修饰以抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。
8.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含表达至少5种与意图接受所述组合物的受试者的癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的细胞，并且其中各细胞系或所述细胞系的所述组合被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。
9.根据权利要求1以及4至8中任一项所述的组合物，其中各细胞系或所述细胞系的所述组合包含表达5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种与意图接受所述组合物的所述受试者的所述癌症相关的TAA的细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含2种、3种、4种、5种或6种癌细胞系。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中各细胞系或所述细胞系的组合被修饰以表达或增加表达1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种免疫刺激因子。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中各细胞系或所述细胞系的组合被修饰以抑制或减少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种免疫抑制因子的表达。
13.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含被修饰以表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达的细胞。
14.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中所述细胞系中的至少1种被修饰以减弱或敲除CD276、TGFβ1和TGFβ2中的一种或多种。
15.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中所述至少1种免疫刺激因子增加树突状细胞成熟。
16.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍或25倍或更高倍数。
17.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1.5倍。
18.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1.5倍。
19.一种组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1.7倍。
20.一种组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，并且其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加至少2.0倍。
21.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
22.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
23.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的免疫原性组合物，其中各细胞系或所述细胞系的组合被修饰以(i)表达3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种TAA的表达。
25.根据权利要求21至23中任一项所述的组合物，其中相较于包含未被修饰的癌细胞系的组合物，所述组合物能够刺激IFNγ产生增加至少1倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍或2倍。
26.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少1种癌细胞系，其中所述细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
27.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
28.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
29.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含4种、5种或6种癌细胞系。
31.根据权利要求21至29中任一项所述的免疫原性组合物，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种TAA的表达。
32.根据权利要求26至29中任一项所述的免疫原性组合物，其中各细胞系或所述细胞系的组合被修饰以(i)表达3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种TAA的表达。
33.一种免疫原性组合物，其包含治疗有效量的至少3种癌细胞系，其中各细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)表达CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LYK6K、FAP、PRAME、HPV16/18E6/E7或它们的突变型式中的一种或多种或增加所述因子表达。
34.根据权利要求33所述的免疫原性组合物，其中所述突变型式包含：
(i)选自由以下组成的群组的被修饰型式：modTERT、modPSMA、modMAGEA1、modTBXT、modBORIS、modFSHR、modMAGEA10、modMAGEC2、modWT1、modKRAS、modFBP、modTDGF1、mod紧密连接蛋白18、modLY6K、modFAP和modPRAME；或
(ii)选自由以下组成的群组的融合蛋白：modCT83-MSLN、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65、modTBXT-modBORIS、modFSHR-modMAGEA10、modTBXT-modMAGEC2、modTBXT-modWT1、modTBXT-modWT1-KRAS、modWT1-modFBP、modPSMA-modTDGF1、modWT1-mod紧密连接蛋白18、modPSMA-modLY6K、modFAP-mod紧密连接蛋白18和modPRAME-modTBXT。
35.根据权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述突变型式包含：
(i)选自由以下组成的群组的被修饰型式：mod间皮素(SEQ ID NO:62)、modTERT(SEQID NO:36)、modPSMA(SEQ ID NO:38)、modMAGEA1(SEQ ID NO:73)、modTBXT(SEQ ID NO:79)、modBORIS(SEQ ID NO:60)、modFSHR(SEQ ID NO:95)、modMAGEA10(SEQ ID NO:97)、modMAGEC2(SEQ ID NO:87)、modWT1(SEQ ID NO:81)、KRAS G12D(SEQ ID NO:83)or KRASG12V(SEQ ID NO:85)、modFBP(SEQ ID NO:93)、modTDGF1(SEQ ID NO:89)、mod紧密连接蛋白18(SEQ ID NO:110)、modLYK6K(SEQ ID NO:112)、modFAP(SEQ ID NO:115)和modPRAME(SEQ ID NO:99)；或
(ii)选自由以下组成的群组的融合蛋白：CT83-MSLN(SEQ ID NO:22)、modMAGEA1-EGFRvIII-pp65(SEQ ID NO:40)、modTBXT-modBORIS(SEQ ID NO:42)、modFSHR-modMAGEA10(SEQ ID NO:44)、modTBXT-modMAGEC2(SEQ ID NO:46)、modTBXT-modWT1(SEQ ID NO:48)、modTBXT-modWT1(KRAS)(SEQ ID NO:50)、modWT1-modFBP(SEQ ID NO:52)、modPSMA-modTDGF1(SEQ ID NO:54)、modWT1-mod紧密连接蛋白18(SEQ ID NO:56)、modPSMA-modLY6K(SEQ ID NO:58)和modPRAME-modTBXT(SEQ ID NO:66)。
36.一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中所述癌干细胞系被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达。
37.一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中所述癌干细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。
38.一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中所述细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)增加所述癌干细胞系不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述至少1种TAA选自由以下组成的群组：TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LY6K、FAP、PRAME、HPV16/18E6/E7和FAP或它们的突变型式。
40.一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中所述癌干细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加所述癌干细胞系不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
41.一种组合物，其包含治疗有效量的癌干细胞系，其中所述癌干细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加所述癌干细胞系不表达或表达极低的至少2种肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的组合物，其中所述癌干细胞系选自由以下组成的群组：JHOM-2B、OVCAR-3、OV56、JHOS-4、JHOC-5、OVCAR-4、JHOS-2、EFO-21、CFPAC-1、Capan-1、Panc 02.13、SUIT-2、Panc 03.27、SK-MEL-28、RVH-421、Hs 895.T、Hs 940.T、SK-MEL-1、Hs 936.T、SH-4、COLO 800、UACC-62、NCI-H2066、NCI-H1963、NCI-H209、NCI-H889、COR-L47、NCI-H1092、NCI-H1436、COR-L95、COR-L279、NCI-H1048、NCI-H69、DMS 53、HuH-6、Li7、SNU-182、JHH-7、SK-HEP-1、Hep 3B2.1-7、SNU-1066、SNU-1041、SNU-1076、BICR 18、CAL-33、YD-8、CAL-29、KMBC-2、253J、253J-BV、SW780、SW1710、VM-CUB-1、BC-3C、KNS-81、TM-31、NMC-G1、GB-1、SNU-201、DBTRG-05MG、YKG-1、ECC10、RERF-GC-1B、TGBC-11-TKB、SNU-620、GSU、KE-39、HuG1-N、NUGC-4、SNU-16、OCUM-1、C2BBe1、Caco-2、SNU-1033、SW1463、COLO 201、GP2d、LoVo、SW403、CL-14、HCC2157、HCC38、HCC1954、HCC1143、HCC1806、HCC1599、MDA-MB-415、CAL-51、KO52、SKNO-1、Kasumi-1、Kasumi-6、MHH-CALL-3、MHH-CALL-2、JVM-2、HNT-34、HOS、OUMS-27、T1-73、Hs 870.T、Hs 706.T、SJSA-1、RD-ES、U2OS、SaOS-2、SK-ES-1、MKN-45、HSC-3、HSC-4、DETROIT 562和SCC-9。
43.一种组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中所述细胞系DMS53被修饰以(i)减弱TGFβ2，(ii)敲除CD276，和(iii)上调GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12的表达。
44.一种组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中所述细胞系DMS53被修饰以(i)减弱TGFβ2，(ii)敲除CD276，和(iii)上调GM-CSF和膜结合的CD40L的表达。
45.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中所述组合物刺激特异性针对由所述细胞系DMS 53表达的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应。
46.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中所述细胞系中的至少1种包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中所述细胞系中的至少1种是小细胞肺癌细胞系DMS 53并且包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达或者抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达的细胞。
47.一种组合物，其包含治疗有效量的至少2种癌细胞系，其中至少1种细胞系包含被修饰以表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达的细胞，并且其中1种细胞系是小细胞肺癌细胞系DMS 53。
48.一种组合物，其包含治疗有效量的小细胞肺癌细胞系DMS 53，其中所述细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，并且(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达。
49.一种组合物，其包含治疗有效量的3种癌细胞系，其中各细胞系所包含的细胞被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，并且(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，并且其中所述细胞系中的1种是小细胞肺癌细胞系DMS 53。
50.根据权利要求1至44和46至49中任一项所述的组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。
51.根据权利要求4至49中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够引发受试者中的免疫反应。
52.根据权利要求1至29和31至49中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种癌细胞系。
53.根据权利要求4、6、13至17、21、25、26、36至48中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含被修饰以表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫刺激因子或增加其表达的细胞系。
54.根据权利要求5、6、13至17、21、25、26、36至48中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含抑制或减少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种免疫抑制因子的表达的修饰。
55.根据权利要求26至30、40和41中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表达2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种TAA或增加其表达的修饰。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述TAA中的一种或多种的氨基酸序列已被修饰以包括突变和/或新抗原决定基。
57.根据权利要求1至3和51中任一项所述的组合物，其中所述免疫反应是先天性免疫反应、适应性免疫反应、细胞免疫反应和/或体液反应。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述免疫反应是适应性免疫反应。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述适应性免疫反应包含选自由CD4+T细胞、CD8+T细胞、γ-δT细胞、自然杀手T细胞和B细胞组成的群组的抗原特异性细胞的产生。
60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述抗原特异性CD4+T细胞包含记忆细胞、T辅助1型细胞、T辅助9型细胞、T辅助17型细胞、T辅助22型细胞和T滤泡性辅助细胞。
61.根据权利要求59所述的组合物，其中所述抗原特异性CD8+T细胞包含记忆细胞和细胞毒性T淋巴细胞。
62.根据权利要求59所述的组合物，其中所述抗原特异性B细胞包含记忆细胞、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E和免疫球蛋白A。
63.根据权利要求1和4至62中任一项所述的组合物，其中各细胞系或所述细胞系的组合表达至少10种TAA。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述TAA也在意图接受所述组合物的受试者的癌症中表达。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述治疗有效量包含大约8×106个细胞的各细胞系。
66.根据权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述治疗有效量包含大约1×107个细胞的各细胞系。
67.根据权利要求1至64中任一项所述的组合物，其中所述治疗有效量包含大约1.0×106-6.0×107个细胞的各细胞系。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的组合物，其中所述治疗有效量包含大约相同数目细胞的各细胞系。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的组合物，其中所述细胞系是遗传异质性同种异体、遗传同质性同种异体、遗传异质性异种、遗传同质性异种或同种异体与异种的组合。
70.根据权利要求1至68中任一项所述的组合物，其中所述细胞系来自起源于以下的实体肿瘤的亲本细胞系：肺、前列腺、睪丸、乳房、结肠、膀胱、胃肠道系统、脑、脊髓、泌尿道、结肠、直肠、胃、头颈部、肝脏、肾脏、中枢神经系统、内分泌系统、间皮、卵巢、子宫内膜、胰腺、食道、神经内分泌系统、子宫或皮肤。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述亲本细胞系包含选自由以下组成的群组的细胞：鳞状细胞、癌细胞、腺癌细胞、腺鳞细胞、大细胞细胞、小细胞细胞、肉瘤细胞、透明细胞癌细胞、癌肉瘤细胞、混合间皮细胞和畸胎癌细胞。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述肉瘤细胞包含骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、间皮瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤、星形细胞瘤、粘液肉瘤、间叶或混合间皮。
73.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是非小细胞肺癌细胞系或小细胞肺癌细胞系。
74.根据权利要求73所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23。
75.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是小细胞肺癌细胞系。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53和NCI-H1694。
77.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是前列腺癌细胞系或睪丸癌细胞系。
78.根据权利要求77所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：PC3、DU-145、LNCAP、NEC8和NTERA-2cl-D1。
79.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是结肠直肠癌细胞系。
80.根据权利要求79所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116和LS411N。
81.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是乳腺癌或三阴性乳腺癌细胞系。
82.根据权利要求81所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7和T-47D。
83.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是膀胱或泌尿道癌细胞系。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376和SCaBER。
85.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是头颈癌细胞系。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1和OSC-20。
87.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是胃(gastric/stomach)癌细胞系。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1和MKN1。
89.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是肝癌或肝细胞癌(HCC)细胞系。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6和HuH-7。
91.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是神经胶母细胞瘤癌细胞系。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60。
93.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是卵巢癌细胞系。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO和MCAS。
95.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是食道癌细胞系。
96.根据权利要求95所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19和OE21。
97.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是肾或肾细胞癌癌细胞系。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ和VMRC-RCW。
99.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是胰腺癌细胞系。
100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN11。
101.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是子宫内膜癌细胞系。
102.根据权利要求101所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA和石川(Ishikawa)。
103.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是皮肤或黑色素瘤癌细胞系。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs 695T、Hs 852T和A2058。
105.根据权利要求1至69中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种细胞系是间皮瘤癌细胞系。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中所述细胞系选自由以下组成的群组：NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89和IST-Mes2。
107.根据权利要求77至106中任一项所述的组合物，其还包含癌干细胞系。
108.根据权利要求77至106中任一项所述的组合物，其还包含细胞系DMS 53。
109.根据权利要求4、5、7、8、13至20、22、23、27至29、33至35和108中任一项所述的组合物，其中所述细胞系中的1种属于与所述其它细胞系中的至少1种不同的癌症。
110.根据权利要求4、5、7、8、13至20、22、23、27至29、33至35和108中任一项所述的组合物，其中至少3种细胞系各自为相同类型癌症。
111.根据权利要求4、5、7、8、13至20、22、23、27至29、33至35和108中任一项所述的组合物，其中至少3种细胞系各自为不同细胞组织学类型或分子亚型。
112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述细胞组织学类型选自由以下组成的群组：鳞状、癌瘤、腺癌、大细胞、小细胞和肉瘤。
113.根据权利要求4、5、8、13-42、46-49和53中任一项所述的组合物，其中增加所述至少1种免疫刺激因子的表达的所述修饰包含使用编码所述至少1种免疫刺激因子的慢病毒载体。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述至少1种免疫刺激因子以相较于未被修饰的细胞系高至少2.0倍的水平表达。
115.根据权利要求114所述的组合物，其中所述至少1种免疫刺激因子选自由以下组成的群组：GM-CSF、膜结合的CD40L、GITR、IL-15、IL-23和IL-12。
116.根据权利要求115所述的组合物，其中所述免疫刺激因子是GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-12。
117.根据权利要求115所述的组合物，其中所述免疫刺激因子是GM-CSF、膜结合的CD40L和IL-15。
118.根据权利要求116或117的组合物，其中所述GM-CSF包含SEQ ID NO:8。
119.根据权利要求116或117的组合物，其中所述膜结合的CD40L包含SEQ ID NO:3。
120.根据权利要求116所述的组合物，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:10。
121.根据权利要求54所述的组合物，其中抑制或减少所述至少1种免疫抑制因子的表达的所述修饰包含所述至少1种免疫抑制因子的敲除或减弱。
122.根据权利要求121所述的组合物，其中所述至少1种免疫抑制因子的表达减少至少大约5％、10％、15％、20％、25％或30％。
123.根据权利要求122所述的组合物，其中所述修饰为减弱。
124.根据权利要求20、27、28、32、33、34、35、41、43、44和54中任一项所述的组合物，其中抑制或减少所述至少1种免疫抑制因子的表达的所述修饰包含减弱所述至少1种免疫抑制因子的表达与敲除不同免疫抑制因子的表达的组合。
125.根据权利要求122所述的组合物，其中所述至少1种免疫抑制因子选自由以下组成的群组：CD276、CD47、CTLA4、HLA-E、HLA-G、IDO1、IL-10、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。
126.根据权利要求125所述的组合物，其中所述至少1种免疫抑制因子选自由以下组成的群组：CD276、HLA-E、HLA-G、TGFβ1和TGFβ2。
127.根据权利要求126所述的组合物，其中所述免疫抑制因子是TGFβ1、TGFβ2和CD276。
128.根据权利要求126所述的组合物，其中所述免疫抑制因子是TGFβ2和CD276。
129.根据权利要求126所述的组合物，其中所述免疫抑制因子是TGFβ1和CD276。
130.根据权利要求125、126或127中任一项所述的组合物，其中使用包含SEQ ID NO:25的短发夹RNA减弱TGFβ1。
131.根据权利要求125、126、127或128中任一项所述的组合物，其中使用包含SEQ IDNO:24的短发夹RNA减弱TGFβ2。
132.根据权利要求125至128中任一项所述的组合物，其中使用靶向包含SEQ ID NO:26的CD276基因组DNA序列的锌指核酸酶对敲除CD276。
133.根据权利要求1至132中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表达异质HLA超型的细胞系，并且其中呈现至少2种不同HLA-A和至少2种HLA-B超型。
134.根据权利要求133所述的组合物，其中所述组合物表达HLA-A24、HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B27和HLA-B44超型中的主要组织相容性复合体分子。
135.根据权利要求133所述的组合物，其中所述组合物表达HLA-A24、HLA-A03、HLA-A01、HLA-B07、HLA-B27和HLA-B44超型中的主要组织相容性复合体分子。
136.根据权利要求133所述的组合物，其中所述组合物表达HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08和HLA-B44超型。
137.根据权利要求1至136中任一项所述的组合物，其中所述细胞系是遗传同质性细胞系。
138.根据权利要求1至136中任一项所述的组合物，其中所述细胞系是遗传异质性细胞系。
139.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
140.一种刺激受试者中特异性针对至少5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种或更多种肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
141.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的2种或更多种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
142.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的2种或更多种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含细胞系的不同组合。
143.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的2种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述组合物各自包含3种不同细胞系。
144.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含抗原特异性或疫苗特异性免疫球蛋白G抗体的产生增加。
145.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A、IL-20、IL-22、TNFα、IFNγ、CCL5或CXCL10中的一种或多种的产生增加。
146.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含IFNγ的产生增加。
147.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素和CD107a的产生增加。
148.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含调节T细胞、单核单核球衍生的抑制细胞和多形核衍生的抑制细胞的含量减少。
149.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含循环肿瘤细胞(CTC)、嗜中性粒细胞与淋巴细胞的比率(NLR)和血小板与淋巴细胞的比率(PLR)的水平降低。
150.根据权利要求139至143中任一项所述的方法，其中所述免疫反应包含肿瘤微环境中免疫浸润的变化。
151.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
152.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的2种或更多种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含细胞系的不同组合。
153.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的2种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述组合物各自包含3种不同细胞系。
154.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且还包含向所述受试者施用治疗有效量的化学治疗剂。
155.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且还包含向所述受试者施用治疗有效量的环磷酰胺。
156.根据权利要求155所述的方法，其中环磷酰胺的所述治疗有效量包含50毫克/天，持续1-10天，接着施用所述治疗有效量的所述组合物。
157.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且还包含向所述受试者施用治疗有效量的检查点抑制剂。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的群组：CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9和2B4的抑制剂。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的群组：派姆单抗(pembrolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、西利单抗(cetrelimab)、多斯利单抗(dostarlimab)、赛咪单抗(cemiplimab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、坎立珠单抗(camrelizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和纳武单抗(nivolumab)。
160.根据权利要求139至159中任一项所述的方法，其还包含向所述受试者施用被分离的肿瘤相关抗原(TAA)。
161.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且还包含向所述受试者施用一种或多种选自由以下组成的群组的抑制剂：ALK、PARP、VEGFRs、EGFR、FGFR1-3、HIF1α、PDGFR1-2、c-Met、c-KIT、Her2、Her3、AR、PR、RET、EPHB4、STAT3、Ras、HDAC1-11、mTOR和CXCR4的抑制剂。
162.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且还包含向所述受试者施用治疗有效量的放射线疗法。
163.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且还包含向所述患者施用癌症治疗手术。
164.一种同时治疗受试者的两种或更多种癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
165.一种制备根据权利要求1至138中任一项所述的疫苗组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)选择表达至少5种、10种、15种或20种或更多种TAA的一种或多种癌细胞系；以及
(b)修饰(a)的所述一种或多种癌细胞系中的每一种，其中所述细胞系或所述细胞系的组合所包含的细胞被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种TAA的表达。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述细胞系或所述细胞系的组合包含另外被修饰以抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达的细胞。
167.根据权利要求165所述的方法，其中所述修饰步骤包含将一种或多种载体引入所述细胞系中的一种或多种中。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述一种或多种载体是慢病毒载体。
169.根据权利要求166所述的方法，其还包含使所述被修饰的细胞系适应无异种培养基的步骤。
170.根据权利要求166所述的方法，其还包含辐照所述细胞系的步骤。
171.根据权利要求166所述的方法，其还包含使所述细胞适应冷冻保存培养基的步骤。
172.根据权利要求139至165中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物通过选自由以下组成的群组的途径施用于所述受试者：肠胃外、经肠、口服、肌肉内、皮内、皮下、瘤内、结节内、鼻内、经皮、吸入、粘膜和局部。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述途径是皮内。
174.根据权利要求139至165中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物施用于所述受试者上选自由手臂、大腿和背部组成的群组的施用部位。
175.根据权利要求141至143中任一项所述的方法，其中所述组合物皮内施用于所述受试者上的不同施用部位上。
176.根据权利要求174所述的方法，其中所述组合物通过用位于从所述施用部位的表面5°与15°之间的角度下的注射器注射而皮内施用。
177.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的第一剂量和治疗有效量的后续剂量的一种或多种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种组合物在第一年施用1-24次、在第二年施用1-16次和在第三年施用1-14次。
178.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述最初四剂每21天施用，直到第63天，并且接着每42天施用另外三剂，直到第189天。
179.根据权利要求178所述的方法，其还包含以42天时间间隔施用另外五剂，直到第399天，并且接着随后至少以两个84天时间间隔施用。
180.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含向所述受试者施用第一剂量和后续剂量的治疗有效量的两种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述最初四剂每14天施用，直到第42天，并且接着每42天施用另外三剂，直到第168天。
181.根据权利要求180所述的方法，其还包含以42天时间间隔施用另外五剂，直到第378天，并且接着随后至少以两个84天时间间隔施用。
182.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的两种组合物，其中各组合物包含至少2种癌细胞系，所述癌细胞系被修饰以(i)表达至少1种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少1种免疫抑制因子的表达，和(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种肿瘤相关抗原(TAA)的表达，其中一种组合物施用于所述受试者的上半身，并且另一组合物施用于所述受试者的下半身。
183.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含向所述受试者施用第一剂量和后续剂量的治疗有效量的两种组合物，其中各组合物包含至少2种癌细胞系，所述癌细胞系被修饰以(i)表达GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L中的一种或多种或增加其表达，(ii)抑制或减少TGFβ1、TGFβ2和CD276中的一种或多种的表达，和(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种TAA的表达，其中一种组合物施用于所述受试者的上半身，并且另一组合物施用于所述受试者的下半身。
184.根据权利要求177至183中任一项所述的方法，其中所述方法还包含向所述受试者施用一种或多种治疗剂或治疗。
185.根据权利要求177至183中任一项所述的方法，其中所述受试者避免用其它疫苗或治疗剂治疗。
186.根据权利要求184所述的方法，其中所述治疗剂或治疗选自由以下组成的群组：放射线疗法、化学疗法、手术、小分子抑制剂和检查点抑制剂。
187.根据权利要求184所述的方法，其中所述治疗剂是环磷酰胺。
188.根据权利要求186所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自由以下组成的群组：CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、BTLA、SIGLEC9和2B4的抑制剂。
189.根据权利要求188所述的方法，其中所述检查点抑制剂是派姆单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、西利单抗、多斯利单抗、赛咪单抗、斯巴达珠单抗、坎立珠单抗、德瓦鲁单抗或纳武单抗。
190.根据权利要求184所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂或治疗在所述第一剂量和/或所述后续剂量的至少1次施用之前施用。
191.根据权利要求184所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂或治疗在所述组合物的每次施用之前、同时或之后施用。
192.根据权利要求184所述的方法，其中第一治疗剂在所述第一剂量之前施用，并且其中第二治疗剂与所述第一剂量和所述后续剂量同时施用。
193.一种刺激受试者中的免疫反应的方法，其包含：
a.向所述受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，其中所述两种组合物在不同部位同时施用，并且在施用所述第一剂量之后向所述受试者施用后续剂量的所述两种组合物，其中所述两种组合物在不同部位同时施用；以及
b.任选地，在施用(a)的所述第一剂量之前向所述受试者施用治疗有效剂量的环磷酰胺1-10天，和任选地在施用(a)的所述后续剂量之前施用治疗有效剂量的环磷酰胺1-10天；
c.任选地，(i)与(a)的每个剂量同时，或(ii)在(a)的所述第一剂量之后每一周、两周、三周或四周，向所述受试者施用检查点抑制剂。
194.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含：
a.向所述受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且在施用所述第一剂量之后向所述受试者施用后续剂量的所述两种组合物，其中所述两种组合物在不同部位同时施用；
b.任选地，在施用(a)的所述第一剂量之前向所述受试者施用环磷酰胺1-10天，和任选地在施用(a)的所述后续剂量之前施用环磷酰胺1-10天；
c.任选地，(i)与(a)的每个剂量同时，或(ii)在(a)的所述第一剂量之后每一周、两周、三周或四周，向所述受试者施用检查点抑制剂。
195.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含：
a.向所述受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且在施用所述第一剂量之后向所述受试者施用后续剂量的所述两种组合物，其中所述两种组合物在不同部位同时施用，并且其中所述后续剂量在施用所述第一剂量之后3周、6周、9周、15周、21周和27周施用；
b.在施用(a)的所述第一剂量和所述后续剂量之前每日向所述受试者施用环磷酰胺7天；
c.在(a)的所述第一剂量之后3周、6周、9周、12周、15周、18周、21周、24周和27周向所述受试者施用检查点抑制剂。
196.根据权利要求195所述的方法，其中环磷酰胺口服施用并且所述检查点抑制剂是派姆单抗并且静脉内施用。
197.根据权利要求195所述的方法，其中环磷酰胺以50mg的剂量口服施用并且所述检查点抑制剂是派姆单抗并且以200mg的剂量静脉内施用。
198.一种治疗受试者的癌症的方法，其包含：
a.向所述受试者施用第一剂量的治疗有效量的两种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物，并且在施用所述第一剂量之后向所述受试者施用后续剂量的所述两种组合物，其中所述两种组合物在不同部位同时施用，并且其中所述后续剂量在施用所述第一剂量之后2周、4周、6周、12周、18周和24周施用；
b.在施用(a)的所述第一剂量和所述后续剂量之前每日向所述受试者施用环磷酰胺7天；以及
c.在(a)的所述第一剂量之后2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周和30周向所述受试者施用检查点抑制剂。
199.根据权利要求198所述的方法，其中环磷酰胺以50mg的剂量口服施用并且所述检查点抑制剂是德瓦鲁单抗并且以10mg/kg的剂量静脉内施用。
200.根据权利要求177至199中任一项所述的方法，其还包含以下步骤：在施用所述组合物之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天和在施用所述组合物之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天禁止施用大麻碱。
201.根据权利要求151至200中任一项所述的方法，其中所述受试者罹患选自由以下组成的群组的癌症：肺癌、前列腺癌、乳腺癌、食道癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肾癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤和间皮瘤。
202.根据权利要求201所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
203.根据权利要求201所述的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
204.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
205.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
206.根据权利要求205所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
207.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是食道癌。
208.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。
209.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌。
210.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是胃癌。
211.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是头颈癌。
212.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是肝癌。
213.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是肾癌。
214.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是神经胶质瘤。
215.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是神经胶质肉瘤。
216.根据权利要求214所述的方法，其中所述神经胶质瘤是星形细胞瘤。
217.根据权利要求216所述的方法，其中所述星形细胞瘤是多形性神经胶母细胞瘤(GBM)。
218.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是子宫内膜癌。
219.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
220.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
221.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
222.根据权利要求201所述的方法，其中所述癌症是间皮瘤。
223.一种试剂盒，其包含一种或多种根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
224.一种试剂盒，其包含至少1个小瓶，所述小瓶包含根据权利要求1至138中任一项所述的组合物。
225.一种试剂盒，其包含第一小瓶中的第一疫苗组合物和第二小瓶中的第二疫苗组合物，其中所述第一疫苗组合物和所述第二疫苗组合物各包含至少2种癌细胞系，所述癌细胞系被修饰以表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达。
226.一种试剂盒，其包含6个小瓶，其中所述小瓶各含有包含癌细胞系的组合物，并且其中所述6个小瓶中的至少4个包含如下癌细胞系，所述癌细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和/或(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)增加1种细胞系或所述细胞系的所述组合不表达或表达极低的至少1种TAA的表达，其中所述小瓶中的至少4个含有不同组合物。
227.根据权利要求223至226中任一项所述的试剂盒，其还包含使用说明书。
228.根据权利要求223至226中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于治疗癌症。
229.一种用于治疗癌症的药剂的单位剂量，所述药剂包含不同癌细胞系的6种组合物，其中至少4种组合物所包含的细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，和(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达。
230.根据权利要求229所述的单位剂量，其中所述细胞系包含：
(a)选自由NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23组成的群组的非小细胞肺癌细胞系和/或小细胞肺癌细胞系；
(b)DMS 53和选自由DMS 114、NCI-H196、NCI-H1092、SBC-5、NCI-H510A、NCI-H889、NCI-H1341、NCIH-1876、NCI-H2029、NCI-H841、DMS 53和NCI-H1694组成的群组的五种小细胞肺癌细胞系；
(c)DMS 53和前列腺癌细胞系或睪丸癌细胞系PC3、DU-145、LNCAP、NEC8和NTERA-2cl-D1；
(d)DMS 53和结肠直肠癌细胞系HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116和LS411N；
(e)DMS 53和乳腺癌或三阴性乳腺癌细胞系Hs 578T、AU565、CAMA-1、MCF-7和T-47D；
(f)DMS 53和膀胱或泌尿道癌细胞系UM-UC-3、J82、TCCSUP、HT-1376和SCaBER；
(g)DMS 53和头或颈部癌细胞系HSC-4、Detroit 562、KON、HO-1-N-1和OSC-20；
(h)DMS 53和胃或胃癌细胞系Fu97、MKN74、MKN45、OCUM-1和MKN1；
(i)DMS 53和选自由Hep-G2、JHH-2、JHH-4、JHH-5、JHH-6、Li7、HLF、HuH-1、HuH-6和HuH-7组成的群组的五种肝癌或肝细胞癌(HCC)细胞系；
(j)DMS 53和神经胶母细胞瘤癌细胞系DBTRG-05MG、LN-229、SF-126、GB-1和KNS-60；
(k)DMS 53和选自由TOV-112D、ES-2、TOV-21G、OVTOKO和MCAS组成的群组的卵巢癌细胞系；
(l)DMS 53和选自由TE-10、TE-6、TE-4、EC-GI-10、OE33、TE-9、TT、TE-11、OE19和OE21组成的群组的五种食道癌细胞系；
(m)DMS 53和选自由A-498、A-704、769-P、786-O、ACHN、KMRC-1、KMRC-2、VMRC-RCZ和VMRC-RCW组成的群组的五种肾癌或肾细胞癌癌细胞系；
(n)DMS 53和胰腺癌细胞系PANC-1、KP-3、KP-4、SUIT-2和PSN11；
(o)DMS 53和选自由SNG-M、HEC-1-B、JHUEM-3、RL95-2、MFE-280、MFE-296、TEN、JHUEM-2、AN3-CA和石川组成的群组的五种子宫内膜癌细胞系；
(p)DMS 53和选自由RPMI-7951、MeWo、Hs 688(A).T、COLO 829、C32、A-375、Hs 294T、Hs695T、Hs 852T和A2058组成的群组的五种皮肤或黑色素瘤癌细胞系；或
(q)DMS 53和选自由NCI-H28、MSTO-211H、IST-Mes1、ACC-MESO-1、NCI-H2052、NCI-H2452、MPP 89和IST-Mes2组成的群组的五种间皮瘤癌细胞系。
231.一种用于治疗癌症的药剂的单位剂量，所述药剂包含不同癌细胞系的6种组合物，其中各细胞系被修饰以(i)表达至少2种免疫刺激因子或增加其表达，(ii)抑制或减少至少2种免疫抑制因子的表达，和/或(iii)表达所述癌细胞系不表达或表达极低的至少1种TAA或增加其表达。
232.根据权利要求229至231中任一项所述的单位剂量，其中混合各包含3种细胞系的两种组合物。
233.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
234.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCIH520和A549；其中
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
其中所述治疗有效量为各细胞系大约1.0×107个细胞或大约6×107个细胞。
235.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23，其中
(a)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(b)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达，和(iii)表达MSLN和CT83；并且
(c)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
236.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中
(a)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(b)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达，和(iii)表达MSLN和CT83；并且
(c)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；其中所述治疗有效量为各细胞系大约1.0×107个细胞或大约6×107个细胞。
237.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系LN-229、GB-1和SF-126，其中
(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT。
238.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53，其中：
(a)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(b)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；
和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65。
239.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系HCT-15、RKO和HuTu-80，其中：
(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA。
240.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系HCT-116、LS411N和DMS 53，其中：
(a)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；
(b)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
241.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：
(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；
(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；
和(ii)减少CD276的表达。
242.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：
(a)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
243.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系J82、HT-1376和TCCSUP，其中：
(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
244.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：
(a)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(b)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
245.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：
(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；
(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10。
246.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：
(a)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(b)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
247.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1和DETROIT 562，其中：
(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且
(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
248.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系KON、OSC-20和DMS 53，其中：
(a)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；
(b)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
249.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系MKN-1、MKN-45和MKN-74，其中：
(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；
(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达。
250.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中：
(a)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；
(b)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
251.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系CAMA-1、AU565和HS-578T，其中：
(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且
(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
252.一种疫苗组合物，其包含治疗有效量的癌细胞系MCF-7、T47D和DMS 53，其中：
(a)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且
(c)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
253.根据权利要求237至251中任一项所述的疫苗组合物，其中所述治疗有效量为各细胞系大约1.0×107个细胞或大约6×107个细胞。
254.一种组合物，其包含第一混合物和第二混合物；其中所述第一混合物包含治疗有效量的至少2种被辐照的癌细胞系，所述癌细胞系被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
其中所述第二混合物包含细胞系DMS 53，所述细胞系被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达，和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
255.根据权利要求254所述的组合物，其中所述第一混合物和/或所述第二混合物包含一种或多种被修饰以表达以下或增加以下表达的细胞系：CT83、MSLN、TERT、PSMA、MAGEA1、EGFRvIII、hCMV pp65、TBXT、BORIS、FSHR、MAGEA10、MAGEC2、WT1、KRAS、FBP、TDGF1、紧密连接蛋白18、LYK6K、PRAME、HPV16/18E6/E7或它们的突变型式。
256.一种刺激人类受试者中的特异性针对与非小细胞肺癌(NSCLC)相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且
(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
257.一种治疗人类受试者的非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且
(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
258.一种刺激人类受试者中的特异性针对与神经胶母细胞瘤相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126；其中：
(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53；其中：
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
259.一种治疗人类受试者的神经胶母细胞瘤的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126；其中：
(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53；其中：
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
260.一种刺激人类受试者中的特异性针对与结肠直肠癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-15、RKO和HuTu-80，其中：
(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-116、LS411N和DMS 53；其中：
(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；
(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
261.一种治疗人类受试者的结肠直肠癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-15、RKO和HuTu-80，其中：
(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HCT-116、LS411N和DMS 53；其中：
(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；
(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达，
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
262.一种刺激人类受试者中的特异性针对与前列腺癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：
(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；
(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：
(d)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
263.一种治疗人类受试者的前列腺癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1，其中：
(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；
(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：
(d)DU 145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
264.一种刺激人类受试者中的特异性针对与膀胱癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系J82、HT-1376和TCCSUP，其中：
(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：
(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
265.一种治疗人类受试者的膀胱癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系J82、HT-1376和TCCSUP，其中：
(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：
(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
266.一种刺激人类受试者中的特异性针对与卵巢癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：
(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；
(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：
(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
267.一种治疗人类受试者的卵巢癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D，其中：
(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；
(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：
(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
268.一种刺激人类受试者中的特异性针对与头颈癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中：
(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且
(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系KON、OSC-20和DMS 53，其中：
(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；
(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
269.一种治疗人类受试者的卵巢癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562，其中：
(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；并且
(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系KON、OSC-20和DMS 53，其中：
(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；
(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
270.一种刺激人类受试者中的特异性针对与胃癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MKN-1、MKN-45和MKN-74；其中：
(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；
(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和
(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中
(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；
(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
271.一种治疗人类受试者的胃癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MKN-1、MKN-45和MKN-74；其中
(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；
(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和
(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中
(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；
(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
272.一种刺激人类受试者中的特异性针对与乳腺癌相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS 53，其中：
(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且
(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MCF-7、T47D和DMS 53，其中：
(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
273.一种治疗人类受试者的乳腺癌的方法，其包含施用(i)治疗有效量的第一疫苗组合物，所述第一疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系CAMA-1、AU565和HS-578T，其中
(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且
(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
和(ii)治疗有效量的第二疫苗组合物，所述第二疫苗组合物包含治疗有效量的癌细胞系MCF-7、T47D和DMS 53，其中：
(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
其中所述第一疫苗组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二疫苗组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
274.一种刺激人类受试者中的特异性针对与NSCLC相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含：
a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；
b.在(a)中的所述一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中所述第一组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
并且所述第二组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且
(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；
c.在(a)中的所述一周之后，经由注射以200mg的剂量进一步施用第一剂量的包含派姆单抗的组合物；
d.在(b)中所述第一剂量施用之后3周、6周、9周、15周、21周和27周，进一步施用后续剂量的所述第一组合物和所述第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；
e.在(c)中所述第一剂量之后3周、6周、9周、12周、15周、18周、21周、24周和27周以200mg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的所述包含派姆单抗的组合物；
其中所述第一组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
275.一种刺激人类受试者中的特异性针对与癌症相关的肿瘤相关抗原(TAA)的免疫反应的方法，其包含：
a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；
b.在(a)中的所述一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中所述第一组合物选自由根据权利要求246、248、250、252、254、256、258或260所述的组合物组成的群组；
并且所述第二组合物选自由根据权利要求247、249、251、253、255、257、259或261所述的组合物组成的群组；
c.在(a)中的所述一周之后，经由注射以200mg的剂量进一步施用第一剂量的包含派姆单抗的组合物；
d.在(b)中所述第一剂量施用之后3周、6周、9周、15周、21周和27周，进一步施用后续剂量的所述第一组合物和所述第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；
e.在(c)中所述第一剂量之后3周、6周、9周、12周、15周、18周、21周、24周和27周以200mg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的所述包含派姆单抗的组合物；
其中所述第一组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
276.一种刺激人类受试者中的特异性针对与NSCLC相关的TAA的免疫反应的方法，其包含：
a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；
b.在(a)中的所述一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中所述第一组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系NCI-H460、NCI-H520和A549；其中
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；并且
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
并且所述第二组合物包含治疗有效量的肺癌细胞系DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且
(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；
c.在(a)中的所述一周之后，以10mg/kg的剂量经由注射进一步施用第一剂量的包含德瓦鲁单抗的组合物；
d.在(b)中所述第一剂量施用之后2、4、10、16、22和28周，进一步施用后续剂量的所述第一组合物和所述第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；
e.在(c)中所述第一剂量之后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30周以10mg/kg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的所述包含德瓦鲁单抗的组合物；
其中所述第一组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
277.一种刺激人类受试者中的特异性针对与NSCLC相关的TAA的免疫反应的方法，其包含：
a.每日以50毫克/天的剂量口服施用环磷酰胺，历时一周；
b.在(a)中的所述一周之后，进一步施用第一剂量的包含第一组合物和第二组合物的疫苗，其中所述第一组合物选自由根据权利要求246、248、250、252、254、256、258或260所述的组合物组成的群组；
并且所述第二组合物选自由根据权利要求247、249、251、253、255、257、259或261所述的组合物组成的群组；
c.在(a)中的所述一周之后，以10mg/kg的剂量经由注射进一步施用第一剂量的包含德瓦鲁单抗的组合物；
d.在(b)中所述第一剂量施用之后2、4、10、16、22和28周，进一步施用后续剂量的所述第一组合物和所述第二组合物，并且其中口服施用50mg环磷酰胺，历时7天，直到各后续剂量；
e.在(c)中所述第一剂量之后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30周以10mg/kg的剂量进一步静脉内施用后续剂量的所述包含德瓦鲁单抗的组合物；
其中所述第一组合物皮内施用至所述受试者的手臂中，并且所述第二组合物皮内施用至所述受试者的大腿中。
278.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含肺癌细胞系NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23的细胞，并且其中：
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且
(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
279.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53的细胞，其中：
(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65。
280.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N和DMS 53的细胞，其中：
(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；
(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
281.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP和DMS 53的细胞，其中：
(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；
(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；
(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；
(d)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
282.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3和DMS 53的细胞，其中：
(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
283.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2和DMS 53的细胞，其中：
(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；
(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；
(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
284.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20和DMS 53的细胞，其中：
(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；
(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；
(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
285.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含近似癌细胞系MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97和DMS 53的细胞，其中：
(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；
(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；
(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
286.一种试剂盒，其包含六个小瓶，其中各小瓶包含癌细胞系CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS 53的细胞，其中：
(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且
(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
287.一种肺癌疫苗的单位剂量，所述肺癌疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的肺癌细胞系NCI-H460、NCIH520、A549、DMS 53、LK-2和NCI-H23；其中：
(a)NCI-H460被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(b)NCI-H520被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(c)A549被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)LK-2被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；(iii)表达MSLN和CT83；并且
(f)NCI-H23被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达。
288.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系LN-229、GB-1、SF-126、DBTRG-05MG、KNS 60和DMS 53，其中：
(a)LN-229被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)GB-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)SF-126被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modhTERT；
(d)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；
(e)DBTRG-05MG被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)KNS 60被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modMAGEA1、EGFRvIII和hCMV pp65。
289.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系HCT-15、RKO、HuTu-80、HCT-116、LS411N和DMS 53，其中：
(a)HCT-15被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)RKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)HuTu-80被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(d)HCT-116被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT、modWT1、KRAS G12D和KRAS G12V；
(e)LS411N被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
290.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系PC3、NEC8、NTERA-2cl-D1、DU-145、LNCaP和DMS 53，其中：
(a)PC3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modMAGEC2；
(b)NEC8被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；
(c)NTERA-2cl-D1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；
(d)DU-145被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(e)LNCaP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
291.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系J82、HT-1376、TCCSUP、SCaBER、UM-UC-3和DMS 53，其中：
(a)J82被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HT-1376被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(c)TCCSUP被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)SCaBER被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)UM-UC-3被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
292.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系OVTOKO、MCAS、TOV-112D、TOV-21G、ES-2和DMS 53，其中：
(a)OVTOKO被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(b)MCAS被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；
(c)TOV-112D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modFSHR和modMAGEA10；
(d)TOV-21G被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modFOLR1；
(e)ES2被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
293.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系HSC-4、HO-1-N-1、DETROIT 562、KON、OSC-20和DMS 53，其中：
(a)HSC-4被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)HO-1-N-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPRAME和modTBXT；
(c)DETROIT 562被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)KON被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达HPV16 E6和E7和HPV18 E6和E7；
(e)OSC-20被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
294.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系MKN-1、MKN-45、MKN-74、OCUM-1、Fu97和DMS 53，其中：
(a)MKN-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA和modLYK6；
(b)MKN-45被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(c)MKN-74被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；
(d)OCUM-1被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少CD276的表达；
(e)Fu97被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modWT1和modCLDN18；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
295.一种癌症疫苗的单位剂量，所述癌症疫苗包含六种组合物，其中各组合物包含大约1.0×107个细胞的癌细胞系CAMA-1、AU565、HS-578T、MCF-7、T47D和DMS 53，其中：
(a)CAMA-1被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modPSMA；
(b)AU565被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；(ii)减少TGFβ2和CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTERT；并且
(c)HS-578T被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(d)MCF-7被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ1、TGFβ2和CD276的表达；
(e)T47D被修饰以(i)增加GM-CSF、IL-12和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少CD276的表达；和(iii)被修饰以表达modTBXT和modBORIS；并且
(f)DMS 53被修饰以(i)增加GM-CSF和膜结合的CD40L的表达；和(ii)减少TGFβ2和CD276的表达。
296.根据权利要求235、236、238、240、242、244、246、248、250或252中任一项所述的组合物，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。
297.根据权利要求287至295中任一项所述的单位剂量，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。
298.根据权利要求278至286中任一项所述的试剂盒，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。
299.根据权利要求256至277中任一项所述的方法，其中DMS 53进一步被修饰以提高IL-12的表达。
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