CN115698269A

CN115698269A - 高表达ffar4的脂肪细胞及其使用

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Publication number: CN115698269A
Application number: CN202180038283.7A
Authority: CN
Inventors: 武井义则; 平泽明
Original assignee: Numt Corp; Toho University
Current assignee: Numt Corp; Toho University
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2023-02-03
Also published as: WO2021241659A1; JP7411180B2; US20230210945A1; EP4155388A1; JPWO2021241659A1; EP4155388B1; EP4155388A4

Abstract

本发明提供一种用于各种疾病的治疗和/或预防的新方法，比如与年龄有关的糖耐量受损、认知能力受损。本发明涉及用于治疗和/或预防各种疾病、特别是伴随衰老的糖耐量受损以及伴随衰老的认知能力受损的、使FFAR4高表达的脂肪细胞、含有该细胞的移植用组合物、以及、使用该移植用组合物来治疗和/或预防各种疾病的方法。进而，本发明涉及使FFAR4高表达的转基因小鼠。

Description

高表达FFAR4的脂肪细胞及其使用

技术领域

本发明涉及在各种疾病的治疗和/或预防中有用的高表达FFAR4的脂肪细胞、以及、含有该细胞的移植用组合物、使用该移植用组合物来治疗和/或预防动物以及人的各种疾病的方法。作为本发明中的目标疾病，例如为与年龄有关的糖耐量受损以及认知功能的受损。

背景技术

已知随着年龄增长，糖耐量受损，老年人容易成为餐后2小时的血糖值超过140mg/dL的状态(餐后高血糖)，糖尿病罹患风险增大。认为预防老年人的糖尿病在于控制餐后血糖值的上升，换言之，认为改善伴随衰老的糖耐量受损的治疗方法是有效的，担心已有的糖尿病治疗药具有低血糖等副作用，当下并未确立安全的治疗方法。

G蛋白偶联受体(GPCR)是具有7次穿透细胞膜的特征性分子结构的受体，针对高血压、心律不齐、心绞痛、哮喘、消化性溃疡等大多数疾病的治疗药的目标分子属于该基因家族。因此，GPCR作为药物发现目标分子备受注意。GPCR从细胞外通过特定配体激活，将其信息传递给细胞内的G蛋白而产生生理活性。认为GPCR的上述特征性分子结构通过与特定配体结合而结构发生很大变化，引起G蛋白的激活。

发现作为GPCR之一的FFAR4(在确定名称之前称为GPR120。与作为NP_859529登录在GenBank中的氨基酸序列相同。)，是以作为能量来源重要的营养素的游离脂肪酸(特别是作为必需脂肪酸的称为DHA、EPA的ω-3脂肪酸)为配体激活细胞内信息传递的游离脂肪酸受体，作为其生理功能，在游离脂肪酸刺激下促进肠道分泌胰高血糖素样肽GLP-1的机制得以明确(Hirasawa,A.et al.Nat.Med.11,90-94,2005(非专利文献1))。另外，FFAR4通过组合使用了荧光配体和流式细胞仪的配体和受体的相互作用分析方法，已确认FFAR4与长链脂肪酸相互作用(Sun,Q et al.Mol.Pharmacol.78,804-810,2010(非专利文献2))。进而，在FFAR4的敲除小鼠中，表现出脂肪细胞的肥大和脂肪组织重量的增加、体重的增加、脂肪肝、糖耐量异常的表型，认为该现象是由脂肪组织的分化受到抑制和脂肪酸合成减少引起的(Ichimura,A.et al.Nature 483,350-354,2012(非专利文献3))。如此，FFAR4作为脂肪酸的传感器已被证明与饮食性的肥胖密切相关，对于饮食性肥胖，期待展开以FFAR4为目标的向预防·治疗药的应用(Hara,T.et al.Rev Physiol Biochem Pharmacol.164,77-116,2013.；Milligan,G.et al.Trends Pharmacol Sci.38,809-821,2017.(非专利文献4、5))。

迄今为止，展开以FFAR4为目标的向预防·治疗药的应用，倾向于寻找具有FFAR4激动剂活性的化合物，正在进行寻找对糖尿病、肥胖症、高脂血症的治疗和/或预防有用的具有FFAR4激动剂活性的化合物的研究(日本特开2012-520240号公报(专利文献1)、日本特开2008-001690号公报(专利文献2)、国际公开第2005/083070号(专利文献3))。另外，尽管已经制作了导入有编码FFAR4的基因的细胞，但用于配体的筛选、活性的分析(日本特开2016-214135号公报(专利文献4)、日本特表2012-520240号公报(专利文献1)、日本特开2008-001690号公报(专利文献2))，并未尝试将导入有编码FFAR4的基因的细胞用于治疗。另外，即便是这样的分析目的，脂肪细胞中的FFAR4分析使用将小鼠来源的培养细胞3T3-L1诱导分化成脂肪细胞后的细胞进行，结果该方法使用在添加有FFAR4的激动剂基础上的诱导分化、siRNA等所致的FFAR4表达抑制等，目前尚不知使FFAR4在脂肪细胞中高表达(过表达)的例子。

国际公开第2003/106663号(专利文献5)公开了使用导入有外源基因的脂肪细胞的离体(ex vivo)基因治疗方法。但是，在该发明中，被移植的脂肪细胞在活体内像生产工厂一样生产由导入的外源基因编码的蛋白质(胰岛素、称为GLP-1的激素)，向细胞外分泌，没有想过移植表达穿透细胞膜的受体的脂肪细胞。

在国际公开第2005/083070号(专利文献3)的说明书中，记载有与用于使包含“GT01多肽”的血糖值降低的组合物有关的发明。但是，该发明中的“GT01多肽”是指分布在肠内分泌细胞或肠内分泌细胞株表面、通过其配体的结合将用于分泌GLP-1的信号向细胞内传递的G蛋白偶联受体，并不打算在脂肪细胞表面表达。需要说明的是，并无FFAR4在脂肪细胞中促进GLP-1分泌的报告存在。另外，在专利文献3中，虽然言及作为基因治疗组合物的ex vivo处理，但并未公开具体的基因导入技术，当然，完全没有提及对脂肪细胞乃至脂肪干细胞或脂肪前体细胞导入基因。

另外，从年轻人到老年人各个年龄段都要求认知功能的维持、改善，特别是记忆力、思考力、判断力等的维持、改善在日常生活中非常重要，与防止老年人伴随衰老的认知功能降低、延长健康寿命、抑制生活质量的降低有关。

迄今为止，提出了有关用于维持或改善认知功能的组合物的各种方案。例如在对中链脂肪酸甘油三酯、乳铁蛋白、乳铁蛋白降解产物、二十二碳六烯酸、白霉干酪或其粉碎物、特定的氨基酸、脂多糖等各种化合物、天然物等各种组合物进行研究。但是，尚无将FFAR4乃至表达FFAR4的脂肪细胞和认知功能建立关联的报告。

另外，还已知将间充质干细胞用于治疗或改善受损的脑功能的再生医疗(日本特开2019-137681号公报(专利文献6))。但是，这是利用间充质干细胞分化成神经细胞等细胞的性质，并未示出FFAR4和认知功能的关联性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-520240号公报

专利文献2：日本特开2008-001690号公报

专利文献3：国际公开第2005/083070号

专利文献4：日本特开2016-214135号公报

专利文献5：国际公开第2003/106663号

专利文献6：日本特开2019-137681号公报

非专利文献

非专利文献1：Hirasawa,A.et al.Nat.Med.11,90-94,2005

非专利文献2：Sun Q et al.Mol.Pharmacol.78,804-810,2010

非专利文献3：Ichimura,A.et al.Nature 483,350-354,2012

非专利文献4：Hara,T.et al.Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.164,77-116,2013

非专利文献5：Milligan,G.et al.Trend Pharmacol.Sci.38,809-821,2017

发明内容

本发明提供一种用于改善乃至治疗以伴随衰老的糖耐量受损以及认知功能受损为代表的各种疾病的新方法。

本发明人等发现通过将高表达FFAR4的脂肪细胞、即导入编码FFAR4的基因而对其进行修饰以表达FFAR4的脂肪细胞移植给高龄动物，改善因高龄而受损的糖耐量。这意味着能够得到对FFAR4进行高表达的脂肪细胞会改善随着老化受损的糖耐量的治疗方法。

另外，还发现通过将高表达FFAR4的脂肪细胞移植给高龄动物，改善与年龄有关的认知能力的受损。关于FFAR4和认知能力的关系，迄今为止没有相关报告的论文，该结果完全在意料之外。

如此，将高表达FFAR4的脂肪细胞移植给高龄动物，不仅有可能用于治疗乃至预防伴随衰老的动物和人的糖耐量受损、认知能力受损，还有可能用于治疗乃至预防各种疾病。

另外，本发明涉及含有高表达FFAR4的脂肪细胞的移植用组合物，进而，本发明涉及包含将含有高表达FFAR4的脂肪细胞的移植用组合物移植给人、动物的、各种疾病的治疗和/或预防、特别是伴随衰老的糖耐量受损的预防或改善、以及伴随衰老的认知能力受损的预防或改善的方法。

另外，根据一个方式，本发明涉及将从人、动物采集的脂肪组织来源干细胞通过基因修饰使其进行FFAR4的高表达而诱导分化成脂肪细胞后进行自体移植的方法。

本发明的具体的方式如以下所例示。

(1)一种脂肪细胞，其是被导入有编码FFAR4的基因并修饰成表达FFAR4的脂肪细胞。

(2)就项目(1)所述的脂肪细胞而言，前述脂肪细胞是通过向脂肪组织来源的脂肪干细胞或脂肪前体细胞导入FFAR4基因而强制表达FFAR4之后进行诱导分化得到的细胞。

(3)就项目(2)所述的脂肪细胞而言，前述脂肪细胞通过包含以下工序的方法来制造，

a制成嵌合基因的工序，前述嵌合基因是将人FFAR4 cDNA(NM_181745)配置在适当的启动子序列的下游的基因；

b将前述嵌合基因嵌入到病毒等中并导入到脂肪干细胞或脂肪前体细胞的工序；以及

c使被导入前述嵌合基因的脂肪干细胞或脂肪前体细胞分化成脂肪细胞的工序。

(4)就项目(1)所述的脂肪细胞而言，前述脂肪细胞是从已导入编码FFAR4的基因的转基因小鼠的脂肪组织分离出的细胞。

(5)就项目(1)所述的脂肪细胞而言，用于各种疾病的治疗和/或预防。

(6)就项目(5)所述的脂肪细胞而言，前述疾病是伴随衰老的糖耐量受损。

(7)就项目(5)所述的脂肪细胞而言，前述疾病是伴随衰老的认知能力受损。

(8)一种项目(2)所述的脂肪细胞的制造方法，其包含：

(9)就项目(8)所述的方法而言，前述启动子序列是aP2基因启动子序列。

(10)一种移植用组合物，其含有项目(1)所述的脂肪细胞，用于疾病的治疗和/或预防。

(11)就项目(10)所述的移植用组合物而言，前述疾病是伴随衰老的糖耐量受损。

(12)就项目(10)所述的移植用组合物而言，前述疾病是伴随衰老的认知能力受损。

(13)一种治疗和/或预防疾病的方法，其包括将项目(10)所述的移植用组合物移植给人。

(14)就项目(13)所述的方法而言，前述移植用组合物含有使从前述人采集的脂肪干细胞或脂肪前体细胞通过基因导入而强制表达FFAR4之后诱导分化成脂肪细胞的脂肪细胞。

(15)一种治疗和/或预防疾病的方法，其包括将项目(10)所述的移植用组合物移植给动物(其中除外人)。

(16)就项目(15)所述的方法而言，前述移植用组合物含有使从前述动物采集的脂肪干细胞或脂肪前体细胞通过基因导入而强制表达FFAR4之后诱导分化成脂肪细胞的脂肪细胞。

(17)一种转基因小鼠，其具有已导入编码FFAR4的基因而使FFAR4强制表达的脂肪组织。

(18)就项目(17)所述的转基因小鼠而言，前述转基因小鼠通过含有以下工序的方法来制造，

a制成嵌合基因的工序，前述嵌合基因是将人FFAR4 cDNA(NM_181745)配置在适当的启动子序列的下游的基因；以及

b将前述嵌合基因导入到小鼠受精卵的工序。

(19)就项目(18)所述的转基因小鼠而言，前述工序a中的启动子序列是小鼠aP2基因启动子序列。

附图说明

图1示出用于制作在脂肪组织过表达FFAR4的转基因小鼠的质粒。人FFAR4基因的表达通过在脂肪组织表达的蛋白质aP2的启动子来控制。为此，人FFAR4的表达限于脂肪组织。

图2示出利用RT-PCR法对已制作的转基因(FFAR4-TG)小鼠的各脏器中人FFAR4基因的表达进行比较。在皮下脂肪(SAT)、内脏脂肪(PAT)的白色脂肪组织可见强表达，另一方面，在褐色脂肪细胞(BAT)等其他脏器为低表达。

图3是表示将FFAR4-TG小鼠的体重增加与正常小鼠加以比较的结果的图。高脂肪饮食(HFD)和正常饮食(ND)均未见显著的体重变化。

图4是表示将FFAR4-TG小鼠的每日食物摄取量与正常小鼠加以比较的结果的图。

图5是表示将16周龄(4月龄)FFAR4-TG小鼠的糖耐量与16周龄野生型小鼠加以比较的结果的图。

图6是表示将60周龄(15月龄)FFAR4-TG小鼠的糖耐量与60周龄野生型小鼠加以比较的结果的图。野生型小鼠随着年龄增长而糖耐量恶化，60周龄野生型小鼠与16周龄野生型小鼠相比血糖值更急剧上升，下降更缓慢。在60周龄FFAR4-TG小鼠中，示出与16周龄野生型小鼠大致相同的糖耐量，未见伴随衰老的糖耐量的恶化。

图7是对移植了FFAR4-TG小鼠的细胞的野生型小鼠、移植了野生型小鼠细胞的小鼠、以及未进行细胞移植的野生型小鼠中的糖耐量进行比较的图。移植了FFAR4-TG小鼠的细胞的野生型小鼠的糖耐量，与对照小鼠相比大幅改善。

图8是将图7的折线图的下部的面积图形化得到的图。

图9是表示新物质探索试验的概要的图。首先，让小鼠自由探索，使其学习已配置的物质(图中用圆示出)(上段)。(已学习的物质成为“已知物质”。)经过6小时之后，将已知物质的一方变更为新物质(图中用菱形示出)，接着，使小鼠再次探索。测定此时的总探索时间和对新物质的探索时间。

图10示出野生型小鼠和FFAR4-TG小鼠的新物质探索试验结果。

图11示出移植了FFAR4-TG小鼠的细胞的野生型小鼠、移植了野生型小鼠细胞的小鼠、以及未进行细胞移植的野生型小鼠的新物质探索试验结果。

图12示出将感染FFAR4病毒随后诱导分化的脂肪干细胞进行皮下移植的小鼠的糖耐量试验结果。

图13示出图12的图的曲线下面积。

图14示出将感染FFAR4病毒随后诱导分化的脂肪干细胞进行皮下移植的小鼠的新物质探索试验结果。

具体实施方式

本发明提供一种对各种疾病的治疗和/或预防有用的高表达FFAR4的脂肪细胞以及使用前述细胞的各种疾病的治疗和/或预防方法。本发明中的高表达FFAR4的脂肪细胞，是导入有编码FFAR4的基因进行修饰以表达FFAR4的脂肪细胞，例如，包含在通过向脂肪组织来源的脂肪干细胞或脂肪前体细胞导入FFAR4基因而强制表达FFAR4之后进行诱导分化得到的细胞、从已导入编码FFAR4的基因的转基因小鼠的脂肪组织分离出的细胞。

以下，对本发明的实施方式进行具体说明，但下述的说明是为了容易理解本发明，所以本发明的范围不限于下述的实施方式，本领域技术人员适当置换下述实施方式的构成的其他实施方式也包含在本发明的范围内。

1.用语的说明

对本说明书中频繁使用的以下用语进行定义，对其构成进行具体说明。需要说明的是，只要没有特别说明，本项所述的以下的定义在本发明的其他实施方式中通用。

在本说明书中，“脂肪组织”是构成生物的活体的结缔组织的一种，主要存在于皮下。脂肪组织主要含有成熟脂肪细胞，具有下述功能：储存能量，保护身体不受来自外界的物理冲击、温度变化所带来的影响，分泌激素、细胞因子等。在本说明书中，“脂肪组织”有时会记为“脂肪”。

在本说明书中，“干细胞”是指具有分化成各种细胞的能力以及自我更新能力的细胞。

在本说明书中，“脂肪干细胞”是脂肪组织来源的体性干细胞，是指满足下述的定义(1)～(4)的细胞。

脂肪干细胞的定义

(1)来源于脂肪组织。

(2)在标准培养基的培养条件下对塑料示出粘附性。

(3)在流式细胞仪中CD90、CD73以及CD105呈阳性。

(4)在流式细胞仪中CD31以及CD45呈阴性。

本发明中的脂肪干细胞至少具有分化成脂肪细胞的能力。

在本发明中，代替“脂肪干细胞”，可以使用能分化成脂肪细胞的“脂肪前体细胞”。

本发明中的“FFAR4”是G蛋白偶联受体之一，被证实在大肠、脂肪组织、肺等中有表达。氨基酸序列作为NP_859529登录在GenBank中。

2.被修饰成表达FFAR4的脂肪细胞

本发明中的“高表达FFAR4的脂肪细胞”，是修饰成从人工导入的基因表达FFAR4的脂肪细胞，是与未进行基因导入的正常脂肪细胞相比更不断高表达FFAR4的脂肪细胞。高表达的程度例如是标准表达数的1.3～50000倍，特别是1.3～100倍。

本发明中的高表达FFAR4的脂肪细胞，可以通过在向脂肪组织来源的脂肪干细胞或脂肪前体细胞导入FFAR4基因之后使其诱导分化来制造。

例如，可以通过含有下述工序的方法来制造，

在这里，用语“启动子”被定义成为了启动基因的特异性转录所必需的通过细胞的合成机制或被导入的合成机制所识别的DNA序列，其功能是对位于多核苷酸序列(可多种)的上游的1种以上的多核苷酸的转录进行控制，由不限于DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录启动位点、转录因子结合位点、还包含阻遏物和激活蛋白质结合位点以及通过直接或间接起作用而对来自启动子的转录量进行调节的任意其他DNA序列的存在而在结构上鉴定的核酸片段。

作为“适当的启动子序列”，只要上述基因能以可操作的方式连接，也可以使用任何启动子序列。另外，“以可操作的方式连接”定义为启动子相对于控制RNA聚合酶的启动以及基因的表达的核酸存在于正确的位置以及方向。

另外，就“启动子”而言，并不认为只要为控制目标多核苷酸序列的表达而使用的特定启动子能在被靶向的细胞中指导其多核苷酸的表达，就是重要的。因此，在人细胞被靶向的情况下，多核苷酸序列编码領域例如可以与能在人细胞中表达的启动子相邻近配置或在该启动子的支配下配置。一般而言，这样的启动子可以包括人启动子或病毒启动子。

在各实施方式中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒末端重复序列、β-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目标编码序列的高水平表达。只要表达水平足以满足既定目的，当实现目标编码序列的表达时，也同样可以考虑使用在本领域公知的其他病毒启动子或哺乳动物细胞启动子或噬菌体启动子。通过使用具有公知特性的启动子，可以优化转染后或转化后的目标蛋白质的表达的水平以及模式。

作为前述的启动子序列，可以举出aP2基因启动子序列。

作为将嵌合基因导入到脂肪干细胞或脂肪前体细胞的方法，可以使用基于病毒载体或非病毒载体的基因导入方法。

“载体”在本说明书中是指能递送到宿主细胞中并任选表达1种以上的目标多核苷酸的构建物。作为载体的例子，并不仅限于此，可以举出病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒(cosmids)或噬菌体载体、与阳离子性缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、在脂质体中封装的DNA或RNA表达载体以及生产细胞等特定的真核细胞。载体可以稳定且自我复制。关于可使用的载体的种类，没有限制。载体可以是适合使被嵌入到几个异源生物中的多核苷酸、基因构建物或表达载体扩增而获得的克隆载体。作为合适的载体，可以举出原核生物的表达载体(例如，pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物)、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、噬菌体以及穿梭载体(例如，pSA3以及pAT28)以及病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒以及逆转录病毒以及慢病毒)以及非病毒载体、例如以pSilencer 4.1-CMV(Ambion(注册商标)、Life Technologies Corp.、Carslbad、CA、US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hygpHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL以及pKSV-10、pBPV-l、pML2d以及pTDT1为基础的真核生物的表达载体。

另外，作为制造由人工导入的基因来表达FFAR4的脂肪细胞的方法，例如可以举出在使从人或动物采集的脂肪干细胞或脂肪前体细胞通过基因导入而强制表达FFAR4之后使其分化成脂肪细胞的方法、制作已导入编码FFAR4的基因的转基因小鼠而得到脂肪细胞的方法。

FFAR4的表达程度，例如可以通过使用了抗FFAR4抗体的免疫学方法(Western印迹法等)或其mRNA的定量分析方法(RT-PCR等)进行测定。

基于本发明的被修饰成表达FFAR4的脂肪细胞，被用于治疗和/或预防各种疾病，特别是用于治疗和/或预防伴随衰老的糖耐量受损、伴随衰老的认知能力受损。

3.转基因小鼠

已导入编码FFAR4的基因的转基因小鼠，可以通过包含下述工序的方法来制作：

b将前述嵌合基因导入到小鼠受精卵的工序。

作为前述的启动子序列，使用与上述相同的序列，例如可以举出aP2基因启动子序列。

另外，作为将嵌合基因导入到受精卵的方法，可以使用与将上述的嵌合基因导入到脂肪干细胞或脂肪前体细胞的方法相同的方法。

在本发明的方法中，成为治疗或预防对象的疾病，主要是伴随衰老的糖耐量受损以及认知能力受损，但并不限于这些。

另外，在本说明书中，“治疗”是指改善患者或被试验者的疾病的症状或延缓症状的进展，“预防”是指提前防止患者或被试验者的疾病的发病。“患者或被试验者”主要指人，但可以是除人以外的动物。作为除人以外的动物，例如可以举出狗、猫、牛、马、猪、山羊、绵羊、猴子(食蟹猴、恒河猴、普通狨猴、日本猕猴)、雪貂、兔子、啮齿类(小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠)等哺乳动物，鸡、鹌鹑等鸟类，但并不限于这些。

4.移植用组合物

含有高表达FFAR4的脂肪细胞的移植用组合物，在适当的介质中被调整成细胞浓度例如为0.2×10⁷～2×10⁷/ml，直接或与更有效的介质、优选含有胶原等细胞外基质的溶液等混合，注入到人或动物的皮下组织、脂肪组织内，优选注入到皮下组织内。

作为可使用的介质，只要是药学上可接受的任意介质，即可施用于患者或被试验者的液体，就没有特别限定。作为药学上可接受的介质，例如可以举出注射用水、生理盐水、培养基、5％葡萄糖溶液、透明质酸溶液、林格氏液、乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、碳酸氢盐林格氏液、BICANATE(注册商标)注射液、氨基酸溶液、起始液(1号液)、脱水补充液(2号液)、维持输液(3号液)，术后恢复液(4号液)、Plasma-Lyte A(注册商标)等，但并不限于这些。

本发明的移植用组合物，可以含有能施用于患者或被试验者的添加剂且能对前述移植用组合物的保存稳定性、等渗性、吸收性以及/或粘性等进行调整的添加剂。作为上述添加剂，例如可以举出乳化剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、抗氧化剂、螯合剂、增稠剂、胶凝剂、pH调节剂等，但并不限于这些。作为前述增稠剂，例如可以举出HES、葡聚糖、甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素等，但并不限于这些。关于前述添加剂的浓度，只要在给病人或受试者使用时是安全的，就可以任意设定。

本发明的移植用组合物，可以含有能施用于患者或被试验者的任意成分。作为上述成分，例如可以举出盐类、多糖类(例如，羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖等)、蛋白质(例如白蛋白等)、二甲基亚砜(DMSO)、氨基酸、培养基成分等，但并不限于这些。

本发明的移植用组合物的pH可以为中性附近的pH、例如pH5.5以上、pH6.0以上、pH6.5以上或pH7.0以上，另外，可以为pH10.5以下、pH9.5以下、pH8.5以下或pH8.0以下，但并不限于这些。

本发明的移植用组合物的细胞浓度，因给药方法、以及患者或被试验者的年龄、体重、症状等而异，但可以为能对患者或被试验者给药的任意的细胞浓度。对前述细胞浓度的下限没有特别限定，但例如为1.0×10⁵个/mL以上、2.0×10⁵个/mL以上、4.0×10⁵个/mL以上、6.0×10⁵个/mL以上、8.0×10⁵个/mL以上、1.0×10⁶个/mL以上、2.0×10⁶个/mL以上、4.0×10⁶个/mL以上、6.0×10⁶个/mL以上、8.0×10⁶个/mL以上或1.0×10⁷个/mL以上。对前述细胞浓度的上限没有特别限定，但例如为1.0×10¹⁰个/mL以下，1.0×10⁹个/mL以下，8.0×10⁸个/mL以下，6.0×10⁸个/mL以下，4.0×10⁸个/mL以下，2.0×10⁸个/mL以下或1.0×10⁸个/mL以下。

高表达FFAR4的脂肪细胞的给药量大约为10²～10¹⁰cells/个体，在对人施药的情况下，大约为2×10⁵～2×10⁸cells/个体。

关于本发明的移植用组合物的施药频率，在对患者或被试验者施药的情况下，是能对疾病获得治愈效果的频率。具体的施药频率可以根据施药形式、施药方法、以及患者或被试验者的年龄、体重、症状等适当决定，但例如为每5年1次、每1年1次、每6个月1次、每3个月1次、每8周1次、每6周1次、每4周1次、每3周1次、每2周1次、每1周1次、每1周2次、每1周3次、每1周4次、每1周5次、每1周6次或每1周7次。特别优选每1年1次、每6个月1次、每3个月1次、每8周1次、每6周1次、每4周1次。

关于本发明的移植用组合物的施药期，是在对患者或被试验者施药的情况下能够获得治疗或预防效果的时期。具体的施药期可以根据施药形式、施药方法、以及患者或被试验者的年龄、体重、症状等适当决定，但本发明的移植用组合物可以长时间施药，例如施药期可以是十年单位、数年单位。但是，本发明的移植用组合物确认到施药1次效果会持续至少6～8周左右，所以也可以单次施药进行治疗，并非需要多次施药。

实施例

通过以下的实施例进一步详细说明本发明，本发明并不限于这些例子。

实施例1

FFAR4-TG小鼠的糖耐量试验以及新物质探索试验

1.FFAR4-TG小鼠的制作

这项工作委托给了Transgenics公司。制成将在N端具有FLAG标签序列的人FFAR4cDNA(NM_181745)配置在小鼠aP2基因启动子序列的下游的嵌合基因。进而，在人FFAR4cDNA的下游配置多聚腺苷酸化信号。人FFAR4 cDNA如以前报告的那样通过PCR法获得(1)。将该嵌合基因通过显微注射法施用于C57BL/6小鼠受精卵。得到的小鼠被允许随意进食正常饮食，并以12小时的明暗周期进行饲育。

图1示出用于制作FFAR4-TG小鼠的质粒。人FFAR4基因的表达通过在脂肪组织表达的蛋白质aP2的启动子来控制。因此，人FFAR4的表达限于脂肪组织。

用RT-PCR法对已制作的转基因(FFAR4-TG)小鼠的各脏器中人FFAR4基因的表达进行比较。在皮下脂肪(SAT)、内脏脂肪(PAT)的白色脂肪组织中可见强表达，另一方面，在褐色脂肪细胞(BAT)等其他脏器中为低表达。(图2)

2.糖耐量试验方法

用剃须刀刮伤绝食24小时的小鼠的尾部以得到末梢血，使用One Touch Ultra(LifeScan公司)测定血糖浓度，作为空腹血糖浓度。然后，腹腔施药葡萄糖，每1g体重给药1.5mg。分别在15、30、60、90、120分钟后采血，以同样的方法测定血糖浓度。

3.新物质探索试验方法

新物质探索试验通过修改以往论文中记载的方法进行(2-4)。让小鼠在三天内自由搜索一个空地，时间为5分钟。第四天，两个相同的物质被放置在空地上，让它们自由探索10分钟。每只小鼠被送回饲育其的笼子，自由活动6小时之后，用小鼠不知道的新物质取代两个物质中的一个，再次让小鼠自由探索10分钟。对探索每个物质的时间进行测定。

具体而言，首先，使小鼠自由探索并使其学习已知的物质(图9的上半部分)。6小时后，用新物质取代其中一个已知物质，并使小鼠再次探索(图9的下半部分)。然后测定此时的总探索时间和对新物质的探索时间。(图10)

在新物质探索试验中测定野生型和FFAR4-TG小鼠对新物质的认知、记忆能力。

参考

Hirasawa,A.et al.Free fatty acids regulate gut incretin glucagon-likepeptide-1secretion through GPR120.Nat Med Jan；11(1)90-94(2005)

Akkerman,S.et al.Object recognition testing:methodologicalconsiderations on exploration and discrimination measures.Behav Brain Res232,335-347(2012).

Antunes,M.&Biala,G.The novel object recognition memory:neurobiology,test procedure,and its modifications.Cogn Process 13,93-110(2012).

Leger,M.et al.Object recognition test in mice.Nat Protoc 8,2531-2537(2013).

[结果]

1.FFAR4-TG小鼠的体重增加

对FFAR4-TG小鼠的体重增加与正常小鼠进行比较。高脂肪饮食(HFD)、正常饮食(ND)的均未见显著的体重变化。(图3)

2.FFAR4-TG小鼠的食物摄取量

对FFAR4-TG小鼠的每日食物摄取量与正常小鼠进行比较。两者之间未见差异。(图4)

3.FFAR4-TG小鼠的糖耐量

对16周龄(4月龄)FFAR4-TG小鼠的糖耐量与16周龄野生型小鼠进行比较。两者之间未见显著差异。(图5)

对60周龄(15月龄)FFAR4-TG小鼠的糖耐量与60周龄野生型小鼠进行比较。野生型小鼠因为高龄而糖耐量恶化，60周龄野生型小鼠与16周龄野生型小鼠相比血糖值更急剧上升，减轻也更缓慢。与此相对，60周龄FFAR4-TG小鼠示出与16周龄野生型小鼠大致相同的糖耐量，未见伴随衰老的糖耐量的恶化。

(图6)

4.FFAR4-TG小鼠中的新物质探索试验

4月龄野生型小鼠对新物质的探索时间长于对已知物质的探索时间，70％左右的时间都用于探索新物质。这表示4月龄野生型小鼠在6小时后仍能记住已知物质。另一方面，15月龄野生型小鼠会因高龄而认知能力受损，6小时后不记得已知物质，所以双方对物质的探索时间大致相同，对新物质的探索时间降低约50％。与此相对，示出FFAR4-TG小鼠即便是15月龄也会记住已知物质，对新物质的探索时间未减少。示出FFAR4-TG小鼠的认知能力即便是高龄也得以维持。(图10)

实施例2

FFAR4高表达脂肪细胞移植小鼠的糖耐量试验以及新物质探索试验

1.细胞移植

分别从16月龄的野生型C57BL/6小鼠和FFAR4-TG小鼠采集皮下脂肪组织，除去组织内的结缔组织、淋巴结。在将组织切碎后，在37度下进行1小时的Accumax(Funakoshi)酶处理，对通过100μm径的网眼后的细胞分散液进行离心，得到沉淀。用PBS将沉淀清洗3次，在含有153mM NH₄Cl、10mM NaHCO₃、0.1mM EDTA的溶液中悬浮，室温放置10分钟。用PBS进一步将细胞清洗2次后，用含有10％fetal bovine serum(胎牛血清)、2mM I-L-Alanyl(丙氨酰)-L-glutamate(谷氨酸)(Nakarai,Japan)、1％penicillin(青霉素)/streptomycin(链霉素)的DMEM/F12培养基培养六小时，将粘附的细胞进一步培养5天。在开始培养的第6天将培养基置换成含有2％fetal bovine serum、2mM I-L-Alanyl-L-glutamate(Nakarai,Japan)、0.5mM IBMX、5μM dexamethasone(地塞美松)、10μM insulin(胰岛素)、200μMindomethacin(吲哚美辛)和1％penicillin/streptomycin的DMEM/F12，进一步培养2天。使用accutase(Funakoshi)回收细胞，在Matrigel(基质胶)中悬浮，以2×10⁶cells/mouse对15月龄小鼠进行皮下注射。

2.FFAR4高表达脂肪细胞移植小鼠的糖耐量试验

从16月龄FFAR4-TG小鼠、野生型小鼠的脂肪组织分离干细胞并进行培养。进行2天的向脂肪细胞的诱导分化。然后，将细胞悬浮于基质胶中，以每只2×10⁶个细胞移植到15月龄野生型小鼠的皮下。移植8周后测定糖耐量。

移植了野生型小鼠细胞的小鼠的糖耐量与未进行细胞移植的同龄野生型小鼠相比没有变化。移植了FFAR4-TG小鼠的细胞的野生型小鼠的糖耐量与对照小鼠相比大幅改善。(图7)

图8的棒图是将图7的折线图的曲线下面积(AUC)图形化得到的图。

图7以及图8的结果示出高表达FFAR4的脂肪细胞的移植能够预防乃至改善伴随衰老的糖耐量的受损。

3.FFAR4高表达脂肪细胞移植小鼠的新物质探索试验

对于高龄野生型小鼠，以与实施例1的3.相同的手法进行FFAR4-TG小鼠来源细胞或野生型小鼠来源的细胞的细胞移植，对细胞移植小鼠进行新物质探索试验。

即便对高龄野生型小鼠移植野生型小鼠来源的细胞，对新物质的探索时间为50％左右，与未进行细胞移植的高龄正常小鼠为同等程度，未见认知能力的改善。但是，对高龄野生型小鼠移植FFAR4-TG小鼠来源细胞之后，得到示出认知能力改善的结果。(图11)

以上的结果示出通过FFAR4高表达脂肪细胞的移植，可以预防乃至改善伴随衰老的认知能力受损。

实施例3

感染FFAR4病毒并诱导分化的脂肪干细胞移植小鼠的糖耐量试验以及新物质探索试验

从VectorBuilder公司购得编码FFAR4基因的腺相关病毒(FFAR4病毒)和其mock病毒。从Charles River公司购得16月龄大的雄性C57BL/6小鼠。

将从16月龄大的雄性C57BL/6小鼠皮下脂肪得到的脂肪组织来源干细胞培养5天后，使其分别感染mock病毒、FFAR4病毒。1天后将培养基更换成诱导分化培养基，培养2天。回收细胞，将1×10⁶个细胞移植到新准备的16月龄大的雄性C57BL/6小鼠皮下。6周后进行新物质探索试验，8周后进行糖耐量试验。

将糖耐量试验结果示于图12、图13。另外，将新物质探索试验结果示于图14。在移植了感染FFAR4病毒的细胞的小鼠中，新物质探索试验、糖耐量试验均见有显著意义的改善。

产业上的可利用性

本发明可以期待高表达FFAR4的脂肪细胞可用于各种疾病的治疗乃至预防，特别是可以用于治疗乃至预防伴随衰老的糖耐量受损以及认知能力受损。

Claims

1.一种脂肪细胞，其特征在于，

导入有编码FFAR4的基因并修饰成表达FFAR4。

2.如权利要求1所述的脂肪细胞，其特征在于，

所述脂肪细胞是通过对脂肪组织来源的脂肪干细胞或脂肪前体细胞导入FFAR4基因而强制表达FFAR4之后使其诱导分化得到的细胞。

3.如权利要求2所述的脂肪细胞，其特征在于，

所述脂肪细胞通过含有以下工序的方法来制造：

a制成嵌合基因的工序，所述嵌合基因是在适当的启动子序列的下游配置有人FFAR4cDNA的基因，所述人FFAR4 cDNA的登录号为NM_181745；

b将所述嵌合基因嵌入到病毒等中并导入到脂肪干细胞或脂肪前体细胞的工序；以及

c使被导入所述嵌合基因的脂肪干细胞或脂肪前体细胞分化成脂肪细胞的工序。

4.如权利要求1所述的脂肪细胞，其特征在于，

所述脂肪细胞是从已导入编码FFAR4的基因的转基因小鼠的脂肪组织分离出的细胞。

5.如权利要求1所述的脂肪细胞，其特征在于，

用于治疗和/或预防各种疾病。

6.如权利要求5所述的脂肪细胞，其特征在于，

所述疾病是伴随衰老的糖耐量受损。

7.如权利要求5所述的脂肪细胞，其特征在于，

所述疾病是伴随衰老的认知能力受损。

8.一种权利要求2所述的脂肪细胞的制造方法，其特征在于，包含：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述启动子序列是aP2基因启动子序列。

10.一种移植用组合物，其特征在于，

含有权利要求1所述的脂肪细胞，用于治疗和/或预防疾病。

11.如权利要求10所述的移植用组合物，其特征在于，

所述疾病是伴随衰老的糖耐量受损。

12.如权利要求10所述的移植用组合物，其特征在于，

所述疾病是伴随衰老的认知能力受损。

13.一种治疗和/或预防疾病的方法，其特征在于，包含：

将权利要求10所述的移植用组合物移植给人。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，

所述移植用组合物含有在使从所述人采集的脂肪干细胞或脂肪前体细胞通过基因导入而强制表达FFAR4之后诱导分化成脂肪细胞的脂肪细胞。

15.一种治疗和/或预防疾病的方法，其特征在于，包含：

将权利要求10所述的移植用组合物移植给除人之外的动物。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，

所述移植用组合物含有在使从所述动物采集的脂肪干细胞或脂肪前体细胞通过基因导入而强制表达FFAR4之后诱导分化成脂肪细胞的脂肪细胞。

17.一种转基因小鼠，其特征在于，

具有已导入编码FFAR4的基因而使FFAR4强制表达的脂肪组织。

18.如权利要求17所述的转基因小鼠，其特征在于，

所述转基因小鼠通过包含以下工序的方法来制造：

a制成嵌合基因的工序，所述嵌合基因是在适当的启动子序列的下游配置有人FFAR4cDNA的基因，所述人FFAR4 cDNA的登录号为NM_181745；以及b将所述嵌合基因导入到小鼠受精卵的工序。

19.如权利要求18所述的转基因小鼠，其特征在于，

所述工序a中的启动子序列是小鼠aP2基因启动子序列。