CN115786133A - 一株热焦曲霉菌株clh-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法 - Google Patents
一株热焦曲霉菌株clh-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115786133A CN115786133A CN202211228897.4A CN202211228897A CN115786133A CN 115786133 A CN115786133 A CN 115786133A CN 202211228897 A CN202211228897 A CN 202211228897A CN 115786133 A CN115786133 A CN 115786133A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- aspergillus
- clh
- strain
- oxoglycyrrhetinic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明一株热焦曲霉菌株CLH‑22及其用途、发酵剂和制备3‑氧代甘草次酸的方法，属于微生物与生物技术领域。本发明提供一株热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH‑22，其保藏编号为：CGMCC No.40213。本发明还提供该菌株CLH‑22在制备3‑氧代甘草次酸方面的用途以及基于该菌株的发酵剂和制备3‑氧代甘草次酸的方法。本发明的菌株CLH‑22，具有底物特异性强，转化效率高，无副产物生成的特点，在常规条件下制备3‑O‑GA产率为94.6％，为目前最高水平。本发明填补了国内3‑O‑GA产品的生产空缺，为制备3‑O‑GA提供了一种简单有效的方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物与生物技术领域，具体涉及一株热焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)菌株CLH-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法。
背景技术
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是一种重要的传统的药用植物，主要分布于中国、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和蒙古等国家。据史料记载，甘草入药已有四千年的历史，可谓之“朝中国老，药中甘草”。甘草不仅有清热解毒、补脾益气、润肺止咳、调和诸药等功效，还能用于咽喉肿痛、脾胃虚寒、消化性溃疡等症状；在临床上被广泛用于治疗呼吸、消化、生殖、心血管和内分泌系统等各种疾病。
甘草酸(Glycyrrhizic acid，GL)是传统植物甘草中的重要五环三萜类化合物之一，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、保肝护肝、抗免疫反应等药理活性。由于甘草酸结构上含有两个极性较强的葡萄糖醛酸基，即甘草酸苷元结构上C3位以β-1,2糖苷键和β-1,3糖苷键相连，使其不易透过细胞膜发挥药理作用，口服利用率低，因而甘草酸分子不是发挥药效的最佳形式。甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)作为甘草中另外一种重要的五环三萜成分，可由甘草酸水解结构上两分子葡萄糖醛酸基制得。在酶法绿色生产甘草次酸的工艺中，常以β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)水解甘草酸C3位上两分子葡萄糖醛酸基来实现向甘草次酸的转化。甘草次酸具有与甘草酸类似的药理活性，如抗炎、保肝、抗病毒、抗肿瘤、抗利尿等。但长期服用该药可能会引起类醛固酮增多症，且高浓度时易对正常细胞产生毒性，限制了其在临床上的应用。
为此，以甘草次酸作为前体化合物，开发低毒性和高药效的新型甘草次酸衍生物类药物，成为了研究热点之一。酮基化作为一种重要的结构修饰方法，通常可将羟基氧化为羰基实现基团转化，在天然产物的改性方面有着重要的应用，如五环三萜类化合物3-氧代熊果酸比熊果酸对人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)的活性强3.7倍；另外，3-氧代齐墩果酸在体外能显著抑制不同组织的癌细胞的生长，包括人口腔表皮癌细胞(KB)、高转移性小鼠黑色素瘤细胞(B16-BL6)、人结直肠腺癌细胞(HCT-8)、人肺腺癌细胞(A549)、人纤维肉瘤细胞(HT-1080)、人前列腺癌细胞(PC-3M)、人肾癌细胞(Ketr-3)和人肝癌细胞(Bel-7402)等。
3-氧代甘草次酸(3-oxoglycyrrhetic acid，3-O-GA)，又称3-酮基甘草次酸或3-羰基甘草次酸，也是一种甘草来源的重要五环三萜类化合物，有研究表明对甘草次酸的3位进行羰基化可能作为神经保护活性的必需基团，对神经保护起着重要的作用。尽管3-氧代甘草次酸可从植物甘草中极少量提取，但由于甘草的种植易受环境影响且含量很低，未能形成规模化生产。化学合成法虽能够实现毫克级的甘草次酸到3-氧代甘草次酸的转化，但往往存在工艺条件苛刻，需要消耗大量的有机试剂，易造成环境污染等问题，大大限制了3-氧代甘草次酸的批量生产。而生物催化法具有条件温和、过程环保、成本低、能够制备大量的药用前体等优点，成为了极具发展前景的3-氧代甘草次酸生产方式。其中，通过生物催化法由甘草酸制备3-氧代甘草次酸的转化形式如图1所示。
目前，国内未见报道能够特异性转化甘草次酸为3-氧代甘草次酸的菌株或基因信息，在3-氧代甘草次酸的规模化生产方面尚处于空白阶段。国内学者于2015年报道利用丝状真菌短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)对甘草次酸进行微生物转化的研究，通过采用大孔吸附树脂、硅胶柱色谱和半制备液相色谱等手段经提取和分离纯化，获得了6个甘草次酸的转化产物，发现短刺小克银汉霉对甘草次酸具有羟基化作用，同时也能将C-3位羟基氧化为酮基，但转化率低于1.2％，难以满足规模化3-氧代甘草次酸生物转化的要求。
国外研究者曾于2009年报道一株亚麻镰孢(Fusarium lini)能够转化甘草次酸为3-氧代甘草次酸，试验表明后者具有脂氧合酶抗性(IC50＝144.2μM)，而脂氧合酶与植物自身的防卫密切相关，参与抗菌物质的合成和植物抗过敏反应等。另外，该研究还提供了3-氧代甘草次酸的核磁鉴定数据，但至今为止，仍未见该菌株任何转化效率和相关基因信息报道。因此，严重限制了3-氧代甘草次酸的进一步药理活性研究，阻碍了甘草类活性组分的规模化生产。
本领域亟需筛选一株能够转化甘草次酸为3-氧代甘草次酸的新菌株，为后续3-氧代甘草次酸的药效研究和工业化生产奠定基础。
发明内容
本发明基于本领域客观存在的难题和需求，提供一株分离得到的热焦曲霉菌株(Aspergillus calidoustus)CLH-22，该菌株可用于制备3-氧代甘草次酸，且制备得率高，填补了国内行业空缺，并为3-氧代甘草次酸的工业化生产奠定了重要基础。
本发明的技术方案如下：
一株热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.40213。
保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22在制备3-氧代甘草次酸方面的用途。
所制备的3-氧代甘草次酸的纯度为93.24％-99.85％。
所述制备3-氧代甘草次酸的产率为94.6％。
一种制备3-氧代甘草次酸的发酵剂，包括发酵活性成分，其特征在于，所述发酵活性成分包括：保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22。
所述的一种制备3-氧代甘草次酸的发酵剂还包括：辅料。
一种制备3-氧代甘草次酸的方法，其特征在于，包括：采用保藏编号为CGMCCNo.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22对底物进行发酵。
所述底物浓度为1-4g/L；
优选地，所述底物选自：甘草酸或甘草次酸。
所述的一种制备3-氧代甘草次酸的方法还包括：对发酵的产物进行纯化；
优选地，纯化后产物的纯度为93.24％-99.85％；
优选地，所述产物指3-氧代甘草次酸。
所述发酵指：将热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22接种于培养基中培养；
所述接种指：将菌株CLH-22接种于筛选培养基得到一级种子液培养，和/或，将一级种子液接种于扩繁培养基得到二级种子液培养，和/或，再将二级种子液接种于发酵产酶培养基中分别培养；
优选地，一级种子液在扩繁培养基中的接种量为1％；二级种子液在发酵产酶培养基中的接种量为2％；
优选地，所述培养指：30℃恒温培养48h。
本发明提供一株热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22，其保藏号为：CGMCC No.40213。
用于制备3-氧代甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包括/是权利要求1所述的热焦曲霉CLH-22。
所述制品还包括用于制备3-氧代甘草次酸的常规成分和/或用于培养所述的热焦曲霉CLH-22的培养基成分。
一种制备3-氧代甘草次酸的制品的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的热焦曲霉CLH-22作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一；和/或
在标有制备3-氧代甘草次酸用途的包装盒内放置有权利要求1所述的热焦曲霉CLH-22。
一种制备3-氧代甘草次酸的方法，其特征在于，在制备3-氧代甘草次酸的过程中添加和/或使用权利要求1所述的热焦曲霉CLH-22。
用于制备3-氧代甘草次酸的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的热焦曲霉CLH-22。
用于制备3-氧代甘草次酸的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分是权利要求1所述的热焦曲霉CLH-22。
所述菌剂，还包括用于制备菌剂的常规成分。
所述的热焦曲霉CLH-22在制备3-氧代甘草次酸方面的应用。
本发明从新疆塔城地区的甘草废渣土壤中分离得到一株真菌，经ITS测序、18SrRNA测序、序列比对和菌体形态学鉴定，确定该菌株为热焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)，其被命名为热焦曲霉CLH-22。
本发明首次获得一株能够发酵获得3-氧代甘草次酸(3-O-GA)的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22，并首次验证得到最高产率的3-氧代甘草次酸。本发明对上述热焦曲霉CLH-22在制备3-氧代甘草次酸(3-O-GA)的效果方面进行了验证，发现该菌株可先将甘草酸或其盐转化为甘草次酸(GA)，再转化为3-氧代甘草次酸，且后者在转化过程中无副产物产生，在常规条件下制备3-氧代甘草次酸产率为94.6％，为现有最高技术水平。
本发明的热焦曲霉CLH-22的保藏信息如下：
菌株保藏名称：CLH-22
保藏号：CGMCC No.40213
分类命名：热焦曲霉
拉丁名：Aspergillus calidoustus
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年6月16日。
附图说明
图1是热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)CLH-22转化甘草酸单铵盐制备3-氧代甘草次酸的转化示意图。
图2是实验例1的热焦曲霉CLH-22在PDA平板的生长形态，其中，A为平板正面，B为平板反面。
图3是实验例2的热焦曲霉CLH-22转化甘草酸单铵盐生成3-氧代甘草次酸的高效液相色谱分析图，其中，A：甘草酸(转化前)；B：甘草次酸的标准品；C：转化后。
图4是实验例3的半制备液相纯化获得纯化3-氧代甘草次酸的高效液相色谱分析图。
图5是实验例3的热焦曲霉CLH-22转化甘草酸单铵盐生成3-氧代甘草次酸的液相色谱-质谱联用分析图，其中，A为甘草次酸的质谱图，B为3-氧代甘草次酸的质谱图。
图6是实验例3的经半制备液相纯化后获得3-氧代甘草次酸的700M核磁共振1H谱分析图。
图7是实验例3的经半制备液相纯化后获得3-氧代甘草次酸的700M核磁共振13C谱分析图。
具体实施方式
以下通过具体实施例和实验例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例和实验例仅作为对本发明的解释和说明，而不能作为限制本发明的保护范围。如无特殊说明，下述实验例中所使用的实验方法均为常规方法；所使用试剂或材料等，均可从商业途径获得。
实验例2中使用的甘草酸单铵盐的纯度为74.3％，均购自图木舒克市昆神植物提取有限责任公司。
以下为实验例中使用到的培养基：
筛选培养基：甘草酸单铵盐2g/L，NH4Cl 3g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，自然pH，于121℃灭菌15min；若配置固体培养基，即筛选平板，则在上述成分基础上，添加20g/L琼脂粉。
扩繁培养基：甘草酸单铵盐2g/L，一水葡萄糖1g/L，NH4Cl 3g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，自然pH，于115℃灭菌15min。
发酵产酶培养基：甘草酸单铵盐4g/L，NH4Cl 3g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH5.5，于121℃灭菌15min。
PDA培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将马铃薯去皮后，切成小块后，称取200g马铃薯小块，加入900mL纯化水，加热煮沸30min，用纱布过滤，弃去滤渣，再向滤液加入20g葡萄糖和20g琼脂粉，溶解后补水至1L，自然pH，于115℃灭菌20min。
GA反应缓冲液：称取1g纯度为99％的甘草次酸，4.1g乙酸钠，加入950mL去离子水中，用乙酸调pH至5.5，再用去离子水定容至1L，即得1g/L GA反应缓冲液。
本发明中3-氧代甘草次酸(3-O-GA)的产率定为：
第1组实施例、本发明的菌株CLH-22
本组实施例提供一株热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.40213。
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、发酵保藏编号为CGMCCNo.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22的行为均落入本发明的保护范围。
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂。
第2组实施例、本发明菌株CLH-22的用途
本组实施例提供保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)菌株CLH-22在制备3-氧代甘草次酸方面的用途。
在具体的实施例中，所制备的3-氧代甘草次酸的纯度为93.24％-99.85％。
在另一些实施例中，所述制备3-氧代甘草次酸的产率为94.6％。
第3组实施例、本发明的发酵剂
本组实施例提供一种制备3-氧代甘草次酸的发酵剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述发酵剂包括发酵活性成分，所述发酵活性成分包括：保藏编号为CGMCCNo.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22。
在进一步的事实中，所述的一种制备3-氧代甘草次酸的发酵剂还包括：辅料。
在更具体的实施例中，所述辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合菌剂制备、生产、加工工艺领域的常规技术手段(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、液体剂等。
第4组实施例、本发明的制备3-氧代甘草次酸的方法
本组实施例提供一种制备3-氧代甘草次酸的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述方法包括：采用保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)菌株CLH-22对底物进行发酵。
在具体的实施例中，所述底物浓度为1-4g/L；
优选地，所述底物选自：甘草酸或甘草次酸。
在进一步的实施例中，所述的一种制备3-氧代甘草次酸的方法还包括：对发酵的产物进行纯化；
优选地，纯化后产物的纯度为93.24％-99.85％；
优选地，所述产物指3-氧代甘草次酸。
在一些实施例中，所述发酵指：将热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22接种于培养基中培养；
所述接种指：将菌株CLH-22接种于筛选培养基得到一级种子液培养，和/或，将一级种子液接种于扩繁培养基得到二级种子液培养，和/或，再将二级种子液接种于发酵产酶培养基中分别培养；
优选地，一级种子液在扩繁培养基中的接种量为1％；二级种子液在发酵产酶培养基中的接种量为2％；
优选地，所述培养指：30℃恒温培养48h。
实验例1、菌株的分离、纯化和筛选
从新疆的甘草废渣堆及其附近植物根系土壤中采集土样，称取土样10g，放入30mL无菌水中，充分振荡20min，使样品充分分散，静置10min。在无菌环境下，吸取上清液1mL，再用无菌水进行梯度稀释，分别制成10-1至10-6倍浓度的稀释液。取500μL的各浓度稀释液，均匀涂布于筛选平板上，正放30min后，倒置于30℃恒温培养箱培养。每隔12h观察筛选平板上菌体的生长情况，2-7d后，将新生长的菌落进一步划线分离以获得纯种菌株。
从筛选平板挑取各纯种菌株到筛选培养基，置于30℃200rpm恒温振荡培养箱中进行培养3-5d。取发酵培养液100μL，加到900μL甲醇中，充分混匀，经0.22μm有机滤膜过滤处理后，通过高效液相色谱进行分析，初步筛选具有水解甘草酸和氧化甘草次酸功能的菌株，从中获得一株真菌，并命名为CLH-22。
对菌株CLH-22进行PDA平板培养，观察其在富营养培养基中的生长形态，结果如图2所示。
对菌株CLH-22的ITS和18S rRNA序列进行测序，其核苷酸序列分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。将该上述序列进行BLAST序列比对，CLH-22菌的ITS序列长度584bp，与曲霉属(Aspergillus)有96％-100％同源性，18S rRNA序列长度1683bp，与曲霉属有98％-100％同源性。结合其菌落形态学分析，鉴定为热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)，并命名为CLH-22。将CLH-22菌株送至菌种保藏中心进行保藏，该菌株的保藏信息如下：
菌株保藏名称：CLH-22
保藏号：CGMCC No.40213
分类命名：热焦曲霉
拉丁名：Aspergillus calidoustus
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年6月16日。
实验例2、热焦曲霉CLH-22的产酶培养与底物转化
将热焦曲霉CLH-22接种于筛选培养基中，作为一级种子液，于30℃恒温振荡培养箱中培养48h。以体积比1％的接种量，转接一级种子液至扩繁培养基，作为二级种子液，于30℃恒温振荡培养箱中培养48h。以体积比2％的接种量，转接二级种子液至发酵产酶培养基中，于30℃恒温振荡培养箱中培养，每隔12h进行一次取样，采用高效液相色谱检测甘草酸单铵盐的消耗量、甘草次酸和3-氧代甘草次酸的生成量，结果如图3所示。其中，高效液相色谱检测方法：流动相为甲醇:0.6％乙酸＝84:16，流速采用0.8mL/min，色谱柱为Kromasil100-3.5-C18，检测波长为254nm。其中，底物甘草酸的出峰时间为3.175min，甘草次酸标准品的出峰时间为9.414min，而终产物3-氧代甘草次酸的出峰时间为9.703min。结果表明，发酵48h后能够同时检测到甘草次酸和3-氧代甘草次酸的产生，但转化过程中甘草次酸积累量很低；84h后，甘草酸单铵盐转化完毕，3-氧代甘草次酸无明显增加。经计算，产物3-氧代甘草次酸的产率为94.6％。
根据上述检测结果，体外验证热焦曲霉CLH-22直接转化甘草次酸为3-氧代甘草次酸的能力。
取4mL发酵液，12000rpm离心10min，弃去上清，收集菌体沉淀于同一根离心管，再用无菌水清洗两遍菌体，12000rpm离心5min，弃去上清。加入适量混合好的Glass bead破碎珠和Zarconia/Silica破碎珠，向离心管中加入1mL的1g/L GA反应缓冲液(GA纯度99％)。采用珠打破碎仪进行菌体破碎，菌体破碎后，将离心管放置于30℃、200rpm的恒温振荡培养箱反应24h。采用高效液相色谱进行检测，结果表明热焦曲霉CLH-22粗酶液在体外能够直接转化GA为3-氧代甘草次酸，且无任何副产物产生，与前述结果一致。结合产酶培养和体外验证，表明热焦曲霉CLH-22中不仅存在能够水解GL产生GA的β-葡萄糖醛酸苷酶，而且存在能够使GA转化为为3-氧代甘草次酸的C3位羟基氧化酶。在两种酶的协同作用下，能够实现从GL到3-氧代甘草次酸的高效转化。
实验例3、3-氧代甘草次酸的纯品制备与鉴定方法
根据实验例2所述发酵方法，将转化完毕后的1L发酵培养基，12000rpm离心15min，弃去上清液。向沉淀部分加100mL乙醇，于50℃水浴锅中搅拌20min，充分溶解后，趁热过滤，保留滤液部分。向滤液部分加入提前预冷的100mL纯化水，搅拌10min，再常温静置1h，此时可以观察到有较多固体析出。以8000rpm离心10min，收集滤饼部分后，采用真空旋蒸仪进行干燥2h，以挥发残留乙醇，获得一次纯化产品。进一步将一次纯化产品放入-80℃低温冷冻，再进行真空冷冻干燥获得粗产品。采用高效液相色谱检测粗产品的纯度。经计算，粗产品中3-氧代甘草次酸的纯度为93.24％。
采用半制备液相进一步纯化产物，方法如下：
取上述获得的粗产品100mg，加入21.5mL甲醇和3.5mL浓度为0.6％的乙酸，搅拌30min，充分溶解后，采用半制备液相色谱进行进一步纯化，获得纯化样液。其中，流动相配比为甲醇：0.6％乙酸＝84:16，流速采用5mL/min，检测波长为254nm。对半制备液相色谱纯化后的样液，采用真空旋蒸仪进行干燥2h，以挥发甲醇和乙酸，获得二次纯化产品。进一步将二次纯化产品放入-80℃低温冷冻，再进行真空冷冻干燥获得纯化产品。采用高效液相色谱检测纯化产品的纯度，结果如图4所示。经计算，二次纯化3-氧代甘草次酸的纯度为99.85％。
对二次纯化得到的高纯度3-氧代甘草次酸进行液相色谱-质谱联用分析，结果如图5所示。图5A质谱结果显示，甘草次酸实测的(M-H)-为469.3323。图5B质谱结果显示，预测3-氧代甘草次酸的(M-H)-为467.3167，被检测化合物实测的(M-H)-为467.3168，即被检测化合物分子量与3-氧代甘草次酸的预测分子量相符，确定二次纯化产品产品的分子量和3-氧代甘草次酸一致。
采用Bruker Ascend 700M核磁共振波谱仪进行结构鉴定，方法如下：
取15mg二次纯化得到的高纯度3-氧代甘草次酸溶于1mL氘代氯仿中，分别进行Bruker Ascend 700M核磁共振1H谱和13C谱分析，1H谱结果如图6所示，13C谱结果如图7所示。对甘草次酸的氢谱化学位移进行预测，3-OH形成的化学位移为4.77ppm，而本发明中1H谱结果显示，被预测化合物3位没有检测到3-OH形成的化学位移。分别对甘草次酸和3-氧代甘草次酸的碳谱化学位移进行预测，3C形成的化学位移分别为78.6ppm、217.0ppm，而本发明中13C谱结果显示，仅存在217.309ppm的特征化学位移，而没有甘草次酸形成的3位特征化学位移。因此，综合高效液相色谱、质谱和核磁共振分析，确定本发明所纯化得到的化合物为3-氧代甘草次酸。
Claims (10)
1.一株热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.40213。
2.保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22在制备3-氧代甘草次酸方面的用途。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)菌株CLH-22在制备3-氧代甘草次酸方面的用途，其特征在于，所制备的3-氧代甘草次酸的纯度为93.24％-99.85％。
4.根据权利要求2或3所述的保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergilluscalidoustus)菌株CLH-22在制备3-氧代甘草次酸方面的用途，其特征在于，所述制备3-氧代甘草次酸的产率为94.6％。
5.一种制备3-氧代甘草次酸的发酵剂，包括发酵活性成分，其特征在于，所述发酵活性成分包括：保藏编号为CGMCC No.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22。
6.根据权利要求5所述的一种制备3-氧代甘草次酸的发酵剂，其特征在于，还包括：辅料。
7.一种制备3-氧代甘草次酸的方法，其特征在于，包括：采用保藏编号为CGMCCNo.40213的热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22对底物进行发酵。
8.根据权利要求7所述的一种制备3-氧代甘草次酸的方法，其特征在于，所述底物浓度为1-4g/L；
和/或，所述底物选自：甘草酸或甘草次酸。
9.根据权利要求7所述的一种制备3-氧代甘草次酸的方法，其特征在于，还包括：对发酵的产物进行纯化；
和/或，纯化后产物的纯度为93.24％-99.85％；
和/或，所述产物指3-氧代甘草次酸。
10.根据权利要求7或9所述的一种制备3-氧代甘草次酸的方法，其特征在于，所述发酵指：将热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)菌株CLH-22接种于培养基中培养；
所述接种指：将菌株CLH-22接种于筛选培养基得到一级种子液培养，和/或，将一级种子液接种于扩繁培养基得到二级种子液培养，和/或，再将二级种子液接种于发酵产酶培养基中分别培养；
和/或，一级种子液在扩繁培养基中的接种量为1％；二级种子液在发酵产酶培养基中的接种量为2％；
和/或，所述培养指：30℃恒温培养48h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211228897.4A CN115786133A (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 一株热焦曲霉菌株clh-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211228897.4A CN115786133A (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 一株热焦曲霉菌株clh-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115786133A true CN115786133A (zh) | 2023-03-14 |
Family
ID=85432656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211228897.4A Pending CN115786133A (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 一株热焦曲霉菌株clh-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115786133A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0297944A1 (fr) * | 1987-06-16 | 1989-01-04 | Pernod-Ricard | Production d'une enzyme du type beta-glucuronidase, hydrolyse de la glycyrrhizine et production d'acide 18 beta-glycyrrhétinique |
| CN102643756A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-08-22 | 黑龙江大学 | 一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌 |
| US20190159461A1 (en) * | 2017-11-29 | 2019-05-30 | Oil Crops Research Institute, Chinese Academy Of Agricultural Sciences | Leclercia adcarboxglata biocontrol strain efficiently inhibiting production of aflatoxins by aspergillus flavus and application thereof |
| US20200063166A1 (en) * | 2017-03-13 | 2020-02-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Zinc binuclear cluster transcriptional regulator-deficient strain |
| CN112920251A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-08 | 新疆维吾尔自治区药物研究所 | 甘草次酸衍生物及制备方法和在制备神经保护药物的应用 |
-
2022
- 2022-10-08 CN CN202211228897.4A patent/CN115786133A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0297944A1 (fr) * | 1987-06-16 | 1989-01-04 | Pernod-Ricard | Production d'une enzyme du type beta-glucuronidase, hydrolyse de la glycyrrhizine et production d'acide 18 beta-glycyrrhétinique |
| CN102643756A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-08-22 | 黑龙江大学 | 一株发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌 |
| US20200063166A1 (en) * | 2017-03-13 | 2020-02-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Zinc binuclear cluster transcriptional regulator-deficient strain |
| US20190159461A1 (en) * | 2017-11-29 | 2019-05-30 | Oil Crops Research Institute, Chinese Academy Of Agricultural Sciences | Leclercia adcarboxglata biocontrol strain efficiently inhibiting production of aflatoxins by aspergillus flavus and application thereof |
| CN112920251A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-08 | 新疆维吾尔自治区药物研究所 | 甘草次酸衍生物及制备方法和在制备神经保护药物的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 赵文俊等: "甘草次酸生物合成菌株的筛选与发酵条件优化", 中国食品学报, vol. 20, no. 05, 31 May 2020 (2020-05-31), pages 113 - 119 * |
| 郭立纯等: "产单葡萄糖醛酸甘草次酸菌株的筛选及发酵条件的优化", 食品工业科技, no. 16, 15 August 2017 (2017-08-15), pages 88 - 94 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105331668B (zh) | 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 | |
| CN106047713B (zh) | 一株嗜松篮状菌菌株Li-93及其应用 | |
| CN103352062A (zh) | 一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法 | |
| CN106011213B (zh) | 一种生物转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 | |
| CN103908486A (zh) | 一种富含绞股蓝皂苷的绞股蓝提取物的制备方法 | |
| CN116426391B (zh) | 一株出芽短梗霉Aureobasidium pullulans P1及其应用 | |
| CN101928671B (zh) | 一种链格孢属菌及其发酵人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg3的方法 | |
| CN106047978B (zh) | 一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷ck的方法 | |
| CN102363796B (zh) | 一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法 | |
| CN117247842B (zh) | 一种转化人参皂苷Rb1的间座壳属真菌X-Z-5及其应用 | |
| CN115786133A (zh) | 一株热焦曲霉菌株clh-22及其用途、发酵剂和制备3-氧代甘草次酸的方法 | |
| CN112575050A (zh) | 一种生物法转化制备薯蓣皂素的方法 | |
| CN103484375A (zh) | 一株能生物合成睾内酯的尖孢镰刀菌及合成方法 | |
| CN109609581A (zh) | 一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 | |
| CN101671714A (zh) | 稀有人参皂甙ih-901的制备方法 | |
| CN111485012A (zh) | 一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法 | |
| CN101508965B (zh) | 一种链霉菌发酵三七皂苷制备20(S)-人参皂苷Rh1的方法 | |
| CN103865803B (zh) | β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备京尼平和白藜芦醇中的应用 | |
| CN100436392C (zh) | 利用虎杖产白藜芦醇内生菌培养提取白藜芦醇的方法 | |
| CN116103209B (zh) | 一株肠杆菌clh-46及其制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的用途、产品和方法 | |
| US20250002966A1 (en) | Aureobasidium pullulans p1 and method for preparing rare ginsenoside | |
| CN102071241B (zh) | 一种利用球形节杆菌进行强心苷苷元类化合物c16,17位脱氢的方法 | |
| CN116121081B (zh) | 一株三七根际真菌及运用其制备稀有人参皂苷ck的方法 | |
| CN103865804A (zh) | β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用 | |
| CN115323027B (zh) | 一种生物活性次级代谢产物的制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |