CN115918531B - 提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物技术领域，具体涉及一种提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基及培养方法。所述培养基包含基础培养基和营养补充剂，所述营养补充剂为油菜素内酯、独脚金内酯或者含这两种激素中任一种的营养剂。本实验以新海21为材料研究了这些培养基对离体培养棉花胚珠纤维品质的影响，结果显示，本发明提供的培养基和培养方法可以促进胚珠纤维发育，尤其有利于胚珠离体培养纤维生长发育和纤维干重增增长。
Description
技术领域
本发明属于植物技术领域，具体涉及一种提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基及培养方法。
背景技术
棉花是世界上最天然的纤维作物，被全世界广泛种植，其纤维是纺织工业最重要的原材料。棉花纤维的研究不仅是是一个理论性问题，而且是一个关系到棉花优质高产量的实际性问题。棉花纤维是棉花生产的主产品，提高棉花纤维的产量一直是棉花育种的重要目标。棉花纤维是由胚珠外珠被单细胞分化而来并且大约有30%的胚珠表皮层细胞通过细胞分化、伸长，最终发育单细胞的纤维。棉花纤维离体培养为棉花纤维生长发育的研究提供了实验平台。并且是研究棉花纤维伸长发育的重要途径之一。棉花纤维的伸长发育离不开植物激素的调控。前人已经研究过，不同的植物激素对棉花纤维生长有一定的影响。尹志成等人研究了植物激素对棉花纤维伸长的影响（[1]尹志成. 植物激素对棉花突变体Li-1纤维伸长发育的影响[D]. 湖南农业大学, 2007.），该研究显示激素对于棉花纤维素的影响是非常显著的。
吲哚乙酸和赤霉素等是常用的植物生长调节剂，许多植物离体培养都会添加这两种物质，用来促进植物的生长速度，但是，并这些生长调节剂并非一定呈现正向促进作用，随着用量的不同，可能出现抑制生长的作用，比如，马鑫鑫等人研究了吲哚乙酸、赤霉素和蔗糖在促进花粉萌发和花粉管生长中的作用，结果显示，在一定范围内，花粉萌发率和花粉管生长随着培养基配方组分量的增加而增加，超过一定添加量时，促进作用逐渐减弱，并出现抑制作用（马鑫鑫, 张翔飞, 曾斌,等. 新疆"晚丰"巴旦木花粉萌发及生长最佳培养基配方的筛选研究[J]. 分子植物育种印刷版, 2020, 18(1).），所以，对于不同的植物，需要研发新的配方，基于上述原因，本发明在离体条件下研究油菜素内酯（BR）和独角金内酯（GR24）对棉花纤维生长的影响，以期研发促进棉花纤维生长的新培养基配方。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基。
本发明的第一个目的是提供一种提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述培养基包含基础培养基和营养补充剂，所述营养补充剂为油菜素内酯、独脚金内酯或者含这两种激素中任一种的营养剂。
优选的，上述提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述基础培养基的配方为每升水中添加如下量的物质：KH2PO4272-275mg，CaCl2﹒2H2O 441-443mg，MgSO4﹒7H2O 493-495mg，KNO35055-5075mg，H3BO36-8mg，Na2MoO4﹒2H2O 0.2-0.3mg，KI 0.8-0.9mg，COCl2﹒6H2O0.02-0.03mg，MnSO4﹒H2O 16-18mg，CuSO4﹒5H2O 0.02-0.04mg，FeSO4﹒7H2O 8-10mg，VB11.3-1.5mg，VB30.4-0.6mg，VB60.8-1.0mg，VB8180-185mg，C6H12O624000-26000mg，植物凝胶6-8g。
优选的，上述提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述基础培养基的配方为每升水中添加如下量的物质：KH2PO4272.18mg，CaCl2﹒2H2O 441.06mg，MgSO4﹒7H2O493.00mg，KNO35055.50mg，H3BO36.183mg，Na2MoO4﹒2H2O 0.242mg，KI 0.83mg，COCl2﹒6H2O0.024mg，MnSO4﹒H2O 16.902mg，CuSO4﹒5H2O 0.025mg，FeSO4﹒7H2O 8.627mg，VB11.349mg，VB30.492mg，VB60.822mg，VB8180.16mg，C6H12O624000mg，植物凝胶7g。
优选的，上述提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述营养剂为营养剂1，所述营养剂1为油菜素内酯与乳酸菌CGMCC No.12949菌发酵上清液灭菌干燥物按照质量比1:1的混合物。
优选的，上述提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述乳酸菌CGMCCNo.12949菌发酵上清液灭菌干燥物的制备方法如下：将乳酸菌CGMCC No.12949菌种活化，置于MRS培养基中，28-30℃培养72h，8000r/min离心15min，收集上清，灭菌，冷冻干燥后备用。
优选的，上述提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述营养剂为营养剂2，所述营养剂2为独脚金内酯与短双歧杆菌菌粉灭菌后的菌体物按照质量比1:1的混合物。
优选的，上述提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，所述营养补充剂为油菜素内酯，其在基础培养基中的浓度为5μmol/L；或者，所述营养补充剂为独脚金内酯，其在基础培养基中的浓度为15μmol/L。
本发明的第二个目的是提供一种提高离体培养棉花胚珠纤维品质的方法，包括如下步骤：
需要用的棉花植株的花样提前在田地里标记好，然后把花样从棉花植株上切下来后冷藏备用；
花样剥去苞叶和花瓣、萼片及花蕊，保留至少3mm的花柄，对子房消毒后将子房壁剖开，剥离出胚珠；
胚珠接种在灭菌后的培养基上，32-34℃的暗培养培养30d以上，使胚珠的纤维生长。
本发明的第三个目的是提供一种所述的培养基在提高离体培养棉花胚珠纤维品质中的应用。
优选的，上述培养基在提高离体培养棉花胚珠纤维品质中的应用，所述的培养基用于提高离体培养棉花胚珠的纤维长度和纤维干重。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、应用植物激素等生长调节物质研究离体培养棉花胚珠纤维生长发育的影响，是提高棉花纤维质量和产量的有效方法。已知BR对可以促进棉花植株的生长发育。但有关BR以及乳酸菌CGMCC No.12949菌对离体培棉花胚珠养纤维生长的影响尚未报道，本发明开发了与油菜素内酯复配的营养剂1（油菜素内酯与乳酸菌CGMCC No.12949菌发酵上清液灭菌干燥物按照质量比1:1的混合物），本发明首次发现BR和营养剂1可促进离体培棉花胚珠养纤维生长。
本实验以新海21为材料快速研究了BR、营养剂1 对棉花胚珠离体培养棉花纤维生长发育的影响。还研究了基础培养基对纤维和胚珠成熟/生长的影响，基础培养基培养20天左右纤维生长缓慢，只长胚珠，自然长度下的2/3，胚珠表面纤维铺盖的不均匀，纤维发育的也不好。当有油菜素内酯BR、营养剂1存在时纤维长的更长一些，胚珠表面铺盖的也比较均匀。只有当补充BR、营养剂1的培养基纤维才能生长和成熟。因此我们可以推定BR、营养剂1有利于胚珠发育和纤维生长。
2、植物激素独角金内酯是近期发现的新型植物激素，能刺激寄生植物种子萌发，并具有调控植物生长发育的一系列作用。本研究通过5μmol/L，10μmol/L，15μmol/L，20μmol/L等不同的四种浓度来进行处理并筛选哪个浓度对棉花胚珠离体培养纤维生长的影响最好。
从实验数据可知，胚珠培养与在基础培养基上，胚珠可以以生长和成熟，但纤维生长和发育速度特别慢，培养25天之后基本上不长纤维。基础培养基+5μmol/LGR24，基础培养基+10μmol/LGR24，基础培养基+15μmol/LGR24，基础培养基+20μmol/LGR24处理后可知培养胚珠鲜重/干重和纤维鲜重/干重明显增重，纤维发育的比较其中基础培养基+15μmol/LGR24浓度处理的培养基里培养的胚珠纤维发育的比较均匀，纤维鲜重和干重比其他浓度处理的明显，增重和胚珠成熟纤维发育情况培养第5天到培养第25天最明显。基础培养基+20μmol/LGR24浓度进行处理的培养基里培养的胚珠纤维发育状况跟基础培养基差不多，这说明20μmol/L浓度的独角金内酯并不利于棉花纤维生长的发育。
本发明还开发了与独角金内酯复配的营养剂2，所述营养剂2为独脚金内酯与短双歧杆菌菌粉灭菌后的菌体物按照质量比1:1的混合物，本发明首次发现独角金内酯和营养剂2可促进离体培棉花胚珠养纤维生长。
3、总结：
植物激素油菜素内酯、独角金内酯、营养剂1和营养剂2有助于棉花胚珠离体培养纤维生长发育和纤维长度。基础培养基加了油菜素内酯、独角金内酯、营养剂1和营养剂2之后与不加之前有明显对比，比基础培养基组胚珠纤维发育和纤维生长的比较快，胚珠鲜重、干重明显增重，胚珠覆盖纤维的情况比较均匀。基础培养基里培养的胚珠纤维发育的不太好，而且不明显，纤维覆盖的不均匀。独角金内酯15μmol/L浓度处理以及营养剂2处理的培养基里培养的胚珠纤维发育情况均很好。
附图说明
图1为油菜素内酯实验胚珠培养情况；
图2为独角金内酯体式显微镜下观察到的纤维发育情况。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1植物材料
采用新海21号棉花，由新疆农业大学农学院育种系科研站提供。
1.1.2植物生长调节剂
实验用的植物生长调节剂有油菜素内酯(brassinolide，BR)，独脚金内酯(Monolactone，GR24)。
1.1.3实验仪器
（1）仪器：超净工作台，蒸馏水发生仪器，高压灭菌锅，恒温培养箱，普通冰箱，电子天平，烘箱。
（2）用具：镊子，刀片，玻璃棒，烧杯，手套，口罩，酒精喷壶，酒精棉球，酒精灯，滤纸。
1.1.4培养基配方
基础培养基配方参见下表1，每升水中添加如表1量的物质。接着向培养基中添加不同的激素或营养剂，探讨这些激素或者营养剂对离体培养棉花胚珠纤维品质的影响。向每升水中添加表1所示量的各物质，溶解之后，加入8g的植物凝胶，充分混合，灭菌后得到基础培养基。
表1所用化学试剂
| 试剂名称 | 分子量 | 最终浓度(mg/L) |
| KH2PO4 | 136.09 | 272.18mg/L |
| CaCl2﹒2H2O | 147.01 | 441.06mg/L |
| MgSO4﹒7H2O | 246.47 | 493.00mg/L |
| KNO3 | 101.10 | 5055.50mg/L |
| H3BO3 | 61.83 | 6.183mg/L |
| Na2MoO4﹒2H2O | 241.95 | 0.242mg/L |
| KI | 166 | 0.83mg/L |
| COCl2﹒6H2O | 237.93 | 0.024mg/L |
| MnSO4﹒H2O | 169.02 | 16.902mg/L |
| CuSO4﹒5H2O | 249.69 | 0.025mg/L |
| FeSO4﹒7H2O | 287.56 | 8.627mg/L |
| VB1 | 337.27 | 1.349mg/L |
| VB3 | 123.11 | 0.492mg/L |
| VB6 | 205.64 | 0.822mg/L |
| VB8 | 180.16 | 180.16mg/L |
| C6H12O6（葡萄糖） | 180 | 24000mg/L |
1.2实验方法
1.2.1胚珠培养
需要用的棉花植株的花样提前3天在田地里标记好，然后第三天早上把花样从棉花植株上切下来后迅速放入冰盒中低温保存备用。采回的花样需要在超净工作台上剥去苞叶和花瓣、萼片及花蕊，保留3～5mm的花柄以方便解剖，用体积分数75%酒精对子房消毒10分钟，再用质量分数0.1%HgCl2消毒10分钟，一定要保证子房完全浸泡在HgCl2中，再用灭过菌的无菌水冲洗3次，每次至少3min，每次都用灭菌滤纸吸干。使用灭菌的刀片将子房壁剖开，再用灭菌尖头镊子剥离出胚珠并接种于不同的培养基上。
需要说明的是，培养基分装在100ml三角瓶中，每瓶50ml培养基，pH=5.0，经高压灭菌（121℃灭菌20 min）后备用，然后在放置于32℃的暗培养箱中避光培养35d。每个处理3个重复，每个重复5瓶，每瓶15枚胚珠。测试结果取平均值。
1.2.2实验设计
本发明所使用的植物激素为油菜素内酯（BR）、独角金内酯（GR24）、营养剂1或营养剂2四种植物激素配方。设计基础培养基为对照，基础培养基是不加任何植物激素的基础培养基。
营养剂1为油菜素内酯+乳酸菌CGMCC No.12949菌发酵上清液灭菌干燥物，油菜素内酯与干燥物的质量比为1:1。
所述乳酸菌CGMCC No.12949菌发酵上清液灭菌干燥物的制备方法如下：将乳酸菌CGMCC No.12949菌种活化，置于MRS培养基中，30±1℃培养72h，8000r/min离心15min，收集上清，121℃高压蒸汽灭菌上清，冷冻干燥后得到干燥物，备用。
营养剂2为独角金内酯+菌体物，二者质量比1:1；所述菌体物为短双歧杆菌菌粉（山东康美药业有限公司）灭菌（121℃高压蒸汽灭菌）后的菌体物。
BR培养基：基础培养基中加入油菜素内酯，油菜素内酯终浓度为5μmol/L。
营养剂1培养基：用与油菜素内酯等质量的营养剂1替换BR培养基中的油菜素内酯。
GR24培养基：基础培养基中加入独角金内酯，独角金内酯终浓度为5-15μmol/L。
营养剂2培养基：用与独角金内酯等质量的营养剂2替换GR24培养基中的独角金内酯。
1.2.3胚珠表型测定
1.2.3.1形态测定
借助体式显微镜，从胚珠培养第0天开始每到35天每次随机取9枚胚珠，然后把胚珠用尖头镊子（避免纤维损伤，不完整）小心放在黑色磨皮的硬纸上方便拍照，直接放在体式显微镜下也可以但胚珠数量有限所以避免损伤完整度就放在黑色纸上。然后调好体式显微镜的高度，亮度开始拍照并保存好。不同高度多拍几张备用。
1.2.3.2胚珠重量测定
因为胚珠第0天到第5天纤维生长的不明显从胚珠培养每到5天随机取9枚胚珠进行称重，每组3个，重复3次。由总重的测定，纤维鲜重的测定，纤维干重的测定等三部分组成。
纤维鲜重的测定用尖镊子剥离纤维和胚珠用精度为1mg电子天平称量胚珠纤维鲜重。每组剥离三个胚珠，重复三次。
纤维干重的测定称完鲜重的纤维和胚珠用锡箔纸包好，标记好放在烘干箱里烘干。温度调到100℃烘干时间为40分钟。40分钟后把放入的鲜纤维和胚珠拿出来用精度为1mg电子天平称分别称胚珠纤维干重。
1.2.3.3纤维长度测定
因为胚珠培养第10天之前无法测纤维长度，所以从第10天开始每到5天随机取9枚胚珠，置载玻片上，用高压水将棉纤维冲直，用针小心将叠纤维分离并使其伸展，用有标卡尺测量纤维长度。
2 结果与分析
2.1 油菜素内酯及营养剂1对棉花胚珠离体培养纤维生长对的总重的影响
基础培养基加了浓度为5μmol/L的油菜素内酯，或者添加了与油菜素内酯等质量的营养剂1进行了处理。观察表明开花三天的棉花胚珠作为材料分析纤维长度和测重量最为适合。激素处理表明激素不仅对胚珠表面纤维出现时间有影响，而且伴随着影响纤维的整个生长过程。表2-3中，基础培养基、BR培养基、营养剂1培养基各组的测试值均是3次平行试验的平均值。看表2和表3可知，油菜素内酯(BR)处理的培养基里的胚珠纤维生长的比基础培养基长得好，总重也明显比基础培养基多。第10天之前无法测纤维长度到了第10天发现基础培养基和激素处理后差值不大胚珠培养第15天开始差值明显增大第15天和20天的纤维长度最为明显。基础培养基处理的胚珠平均纤维长度最多可达到30.71mm，激素处理的胚珠平均纤维长度最多可达到32.89mm，营养剂1处理的胚珠平均纤维长度大33.45mm。其中营养剂1的纤维总重和纤维长度显著大于基础培养基处理。
表2油菜素内酯对棉花胚珠离体培养纤维生长的影响
备注：因为胚珠离体培养第10天之前棉花纤维无法测长度，所以表示为“-”。
表3 营养剂1对棉花胚珠离体培养纤维生长的影响
备注：因为胚珠离体培养第10天之前棉花纤维无法测长度，所以表示为“-”。
2.1.2油菜素内酯对棉花胚珠离体培养纤维生长的影响
胚珠离体培养2天后发现胚珠表面上出现了细细的白色线状绒毛。培养第5天后用提示显微镜观察并拍照。图1可见，培养的胚珠有明显的卷曲，色泽正常。与对照组基础培养基相比实验组的胚珠从第5天开始纤维卷曲程度相对较好，生长没有受抑制，而且纤维生长比对照组优越。第10天到第25天最为明显。
2.2独角金内酯及营养剂2对棉花胚珠离体培养纤维生长的影响
2.2.1 独脚金内酯及营养剂2对棉花胚珠离体培养纤维生长最适浓度的筛选
本次实验采用独角金内酯实验组，浓度设置为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L；基础培养基中添加的营养剂2质量设置为与5μmol/L独角金内酯（分子量为298.29）的质量相同、与10μmol/L独角金内酯的质量相同、与15μmol/L独角金内酯的质量相同、与20μmol/L独角金内酯的质量相同。每个处理分别做了25瓶，每瓶培养15个胚珠。表4-5中，基础培养基、GR24培养基、营养剂2培养基各组的测试值均是3次平行试验的平均值。表4、表5可知，胚珠培养到第10天之前只能称总鲜重，无法测其他指标。胚珠培养到第10天随机取样称重发现5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L这三个浓度处理的培养基里的胚珠总鲜重，胚珠鲜重和纤维鲜重比较明显。胚珠培养第15天随机取样称重可知对照组基础培养基里的胚珠虽然总鲜重和胚珠鲜重增重了，但纤维鲜重和纤维干重比激素处理的相对较差。15μmol/L浓度处理里的培养基的胚珠纤维鲜重和纤维干重最为明显。胚珠培养第20、25天随机取样称重发现对照组里的基础培养基纤维长得不好，20μmol/L激素浓度处理的培养基里的胚珠生长过剩，反而纤维长得不好，而浓度为10、15μmol/L激素处理的培养基里的胚珠纤维长的最好，10、15μmol/L浓度处理的培养基里的胚珠纤维鲜重和纤维干重高于其他处理组。胚珠培养30天到35天可发现虽然胚珠鲜重干重和纤维鲜重干重都增重了。最后发现15μmol/L浓度处理的培养基里的干重比5μmol/L和10μmol/L处理的大。15μmol/L浓度处理的培养基里的胚珠第15天到第25天增重的比较明显。最后表明15μmol/L浓度处理的培养基有助于胚珠培养纤维鲜重干重的增重和纤维质量。图2是独角金内酯体式显微镜下观察到的纤维发育情况，K1、K2、K3、K4分别1是基础培养基中添加了终浓度为10μmol/L、15μmol/L、5μmol/L、20μmol/L浓度的独脚金内酯。
表4独角金内酯对棉花离体培养纤维总鲜重数据
表5独角金内酯对棉花离体培养纤维生长纤维鲜重、干重数据
2.3 不同梯度独角金内酯对棉花胚珠离体培养纤维长度的影响
营养剂2以及不同浓度的独角金内酯对棉花纤维长度的影响不同。结果参见表6-7，表6-7中，基础培养基、GR24培养基、营养剂2培养基各组的测试值均是3次平行试验的平均值。因为第10天之前棉纤维长的不长无法测长度所以第10天开始随机取样把棉纤维冲开，用有标卡尺测纤维长度。对照组基础培养基培养的纤维平均长度最长可达到22.62mm，5μmol/L独脚金内酯浓度处理的平均纤维长度最长可达到25.87mm，与5μmol/L独角金内酯的质量相同的营养剂2处理的可达26.91mm，10μmol/L独脚金内酯浓度处理的平均纤维长度最长可达到25.71mm，与10μmol/L独角金内酯的质量相同的营养剂2处理的可达第二批26.83mm，15μmol/L独脚金内酯浓度处理的平均纤维长度最长可达到28.53mm，与15μmol/L独角金内酯的质量相同的营养剂2处理的可达32.57mm，20μmol/L独脚金内酯浓度处理的平均纤维长度最长可达到23.53mm，与20μmol/L独角金内酯的质量相同的营养剂2处理的可达27.52mm。15μmol/L浓度处理的纤维长度比其他浓度处理的优越，但浓度大了15μmol/L纤维生长回收抑制。最后表明15μmol/L浓度处理的培养基里培养的纤维长度最长。
表6 基础培养基与GR24培养基对棉纤维平均长度、纤维平均干重数据对比
表7 基础培养基与营养剂2培养基对棉纤维平均长度、纤维平均干重数据对比
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (4)
1.提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基，其特征在于，所述培养基包含基础培养基和营养补充剂；所述营养补充剂为独脚金内酯，或者含独脚金内酯中的营养剂；
所述基础培养基的配方为每升水中添加如下量的物质：KH2PO4272.18mg， CaCl2﹒2H2O441.06mg， MgSO4﹒7H2O 493.00mg， KNO35055.50mg， H3BO36.183mg， Na2MoO4﹒2H2O0.242mg， KI 0.83mg， CoCl2﹒6H2O 0.024mg， MnSO4﹒H2O 16.902mg， CuSO4﹒5H2O 0.025mg，FeSO4﹒7H2O 8.627mg，VB11.349mg， VB30.492mg， VB60.822mg， VB8180.16mg，C6H12O624000mg，植物凝胶7g；
所述营养剂为独脚金内酯与短双歧杆菌菌粉灭菌后的菌体物按照质量比1:1的混合物，培养基中的独角金内酯浓度为15μmol/L；
所述营养补充剂为独脚金内酯时，其在培养基中的浓度为15μmol/L。
2.一种提高离体培养棉花胚珠纤维品质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
需要用的棉花植株的花样提前在田地里标记好，然后把花样从棉花植株上取下来后冷藏备用；
花样剥去苞叶和花瓣、萼片及花蕊，保留至少3mm的花柄，对子房消毒后将子房壁剖开，剥离出胚珠；
胚珠接种在灭菌后的权利要求1所述的提高离体培养棉花胚珠纤维品质的培养基上，32-34℃的暗培养培养30d以上，使胚珠的纤维生长。
3.根据权利要求1所述的培养基在提高离体培养棉花胚珠纤维品质中的应用。
4.根据权利要求3所述的培养基在提高离体培养棉花胚珠纤维品质中的应用，其特征在于，所述的培养基用于提高离体培养棉花胚珠的纤维长度和纤维干重。
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