CN115927425B

CN115927425B - 一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用

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Publication number: CN115927425B
Application number: CN202210825581.7A
Authority: CN
Inventors: 李英俊; 王瑾婷; 危军伟
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2025-03-25
Anticipated expiration: 2042-07-14
Also published as: CN115927425A

Abstract

本发明公开了一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用，属于基因工程和应用微生物领域。所述嗜热栖热菌基因编辑质粒，包括：5’‑启动子‑重复序列‑间隔序列‑重复序列‑供体DNA‑3’；其中，所述重复序列源自嗜热栖热菌基因组上Ⅰ‑B亚型、Ⅰ‑C亚型或者Ⅲ‑A和Ⅲ‑B亚型CRISPR‑Cas系统；所述间隔序列为靶标片段。本发明公开的基因编辑技术过程简单且具有更高的编辑效率，时间周期短，为嗜热栖热菌基因功能的挖掘和高性能工程菌株的构建提供了工具。本发明构建的嗜热栖热工程菌生产超氧化物歧化酶比酶活可达121‑157U/mg，是对照菌的近2.2倍，显著提高了嗜热栖热菌的活性成分。

Description

一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和应用微生物领域，特别是涉及一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用。

背景技术

嗜热菌是一类生活在高温环境中的微生物，广泛分布在温泉、堆肥、地热区土壤、火山地区以及海底火山地等，它们被认为是工业相关热稳定酶的来源之一。通常，当酶或蛋白质在极高温度展开结构或在特定的高温下具有较长的半衰期时，被认为是热稳定的。嗜热菌体内的嗜热酶可用于催化常温酶难以实现的高温化学反应，该独特性为其在工业中的广泛应用铺平了道路。嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)是研究极端嗜热微生物的模式物种之一，它具备高效的自然转化能力及较短的生长周期。科学家们一直尝试能够最大化地利用这些优点对嗜热栖热菌进行遗传改造，进而获得目的菌株应用于科研、工业领域。

嗜热栖热菌虽然具备高效的自然转化能力及较短的生长周期，但研究人员一直通过传统的同源重组方法对其进行基因组编辑，该方法具有一定的局限性，其高度依赖筛选标记，通常不能实现无痕的基因编辑；同时其获得正确突变体的效率低，最高仅有1％，因此开发嗜热栖热菌适用的高效基因编辑工具十分必要，这将促进对嗜热菌功能机制以及工业应用的研究。早在2004年，研究人员就解析了嗜热栖热菌HB27的完整基因组序列，随后的2006年Godde等人报导了嗜热栖热菌HB27的巨大质粒上存在CRISPR重复序列及cas基因。上述发现被其他研究者证实并展示了CRISPRs和cas基因在嗜热栖热菌HB27的巨大质粒和染色体上的分布。根据注释，巨大质粒pTT27编码有Ⅰ-B、Ⅰ-C、Ⅲ-A和Ⅲ-B亚型CRISPR-Cas系统，以及9个CRISPR簇；染色体编码有2个CRISPR簇。研究人员根据嗜热栖热菌HB27 CRISPR系统Cas蛋白的比对结果，建立系统发育树，将这11个CRISPR簇分为3类，分别对应于不同类型的CRISPR-Cas系统。Ⅱ型CRISPR-Cas9系统作为基因编辑工具已被广泛应用在原核、真核生物中，嗜热栖热菌HB27体内丰富的CRISPR系统也存在被开发成为基因编辑工具的潜能，通过靶向目标基因或者片段，高效地对其引入靶标链断裂，提高对菌株进行遗传改造的效率，能实现对嗜热栖热菌HB27高效的基因缺失、插入及点突变等编辑，为设计和构建嗜热微生物底盘细胞提供技术支撑。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)广泛存在于各类生物体中，是机体内超氧阴离子自由基的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。SOD作为一种抗氧化剂，在化妆品中广泛使用，它已被证明可以缓解紫外线对皮肤的损害、愈合伤口、减少面部皱纹和色素沉着。研究表明，经过生物发酵，嗜热栖热菌能产生热稳定性的超氧化物歧化酶和B族维生素，表现出高效的抗氧化和光保护活性，具有强大的细胞修复功效。也有研究发现，嗜热栖热菌的发酵产物中含有多聚氨基酸、烟酰胺单核苷酸等，发酵液经破壁后提取可以得到含有大量皮肤所需的氨基酸、肽、维生素、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等众多活性成分，具有抗氧化能力，可以有效地清除自由基，抵抗皮肤衰老。其次能刺激皮肤成纤维细胞生长，帮助皮肤修复。还能很好地抑制酪氨酸酶(酪氨酸酶是黑色素生成过程中的一种关键性酶)的活性，减少黑色素的生产，以此达到提亮肤色、美白皮肤的效果。因此，为了获取生物来源的SOD，通过基因基因编辑方式改造嗜热栖热菌具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热栖热菌基因编辑质粒及在生产超氧化物歧化酶中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，分别利用了Ⅰ-B、Ⅰ-C、Ⅲ-A和Ⅲ-B亚型CRISPR-Cas系统构建嗜热栖热工程菌，该工具构建简单，实验周期短，能够对嗜热栖热菌基因组进行高效的基因编辑，并且所构建的嗜热栖热工程菌能够高产超氧化物歧化酶。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种嗜热栖热菌基因编辑质粒，所述编辑质粒包括如下基因结构：5’-启动子-重复序列-间隔序列-重复序列-供体DNA-3’；其中，所述重复序列源自嗜热栖热菌基因组上Ⅰ-B亚型、Ⅰ-C亚型或者Ⅲ-A/B亚型CRISPR-Cas系统；所述间隔序列为靶标片段。

优选的是，源自嗜热栖热菌基因组上Ⅰ-B亚型CRISPR-Cas系统的重复序列(SEQ IDNO：1)为：5’-GTTGCAAACCTCGTTAGCCTCGTAGAGGATTGAAAC-3’；

源自嗜热栖热菌基因组上Ⅰ-C亚型CRISPR-Cas系统的重复序列(SEQ ID NO：2)为：5’-GTTGCACCGG CCCGAAAGGG CCGGTGAGGA TTGAAAC-3’；

源自嗜热栖热菌基因组上Ⅲ-A和Ⅲ-B亚型CRISPR-Cas系统的重复序列(SEQ IDNO：3)为：5’-GTTGCAAGGG ATTGAACCCC GTAAGGGGAT TGCGAC-3’。

优选的是，所述间隔序列为PAM序列紧邻的38-40bp长度的序列。

优选的是，Ⅰ-B亚型和Ⅰ-C亚型的PAM序列为5’-TTC-3’。

优选的是，当靶标位点3’端侧翼序列与crRNA的5’端重复序列不匹配时，Ⅲ-A和Ⅲ-B亚型的Cas蛋白具有DNA切割活性。

优选的是，所述启动子为嗜热栖热菌的组成型启动子。更优选的是启动子为源自嗜热栖热菌的组成型启动子P31，能持续性高表达基因。

所述供体DNA为嗜热栖热菌HB27的基因组DNA序列或者片段。

本发明还提供一种工程菌株，包括所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒。

本发明还提供所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒，或者所述的工程菌株在生产超氧化物歧化酶中的应用。

本发明还提供一种生产超氧化物歧化酶的方法，包括将所述的编辑质粒转入嗜热栖热菌中，敲除嗜热栖热菌crtB基因的同时插入编码SOD的基因(SOD基因序列如SEQ IDNO：4，SOD蛋白序列如SEQ ID NO：5所示)，待多次传代使其成为纯合菌株后，在无抗的培养基中继续传代，使编辑质粒丢失，得到无需添加抗生素即可培养的高产超氧化物歧化酶的嗜热栖热工程菌。然后再通过液体发酵培养所述嗜热栖热工程菌，培养至所述嗜热栖热工程菌的OD₆₀₀为0.8-1.2时结束发酵，获取超氧化物歧化酶。

SOD基因序列(SEQ ID NO：4)：

ATGCCGTACCCGTTCAAGCTTCCTGACCTAGGCTACCCCTACGAGGCCCTCGAGCCCCACATTGACGCCAAGACCATGGAGATCCACCACCAGAAGCACCACGGGGCCTACGTGACGAACCTCAACGCCGCCCTGGAGAAGTACCCCTACCTCCACGGGGTGGAGGTGGAGGTCCTCCTGAGGCACCTCGCCGCCCTTCCCCAGGACATCCAGACCGCCGTGCGCAACAACGGGGGCGGGCACCTGAACCACAGCCTCTTCTGGAGGCTCCTCACCCCCGGGGGGGCCAAGGAGCCCGTGGGGGAGCTGAAGAAGGCCATTGACGAGCAGTTCGGGGGCTTCCAGGCCCTCAAGGAGAAGCTCACCCAGGCGGCCATGGGCCGGTTCGGCTCGGGCTGGGCCTGGCTCGTGAAGGACCCCTTCGGCAAGCTCCACGTCCTCTCCACCCCCAACCAAGACAACCCCGTGATGGAGGGCTTCACCCCCATCGTGGGCATTGACGTCTGGGAGCACGCCTACTACCTCAAGTACCAGAACCGCCGGGCCGATTACCTCCAGGCCATCTGGAACGTCCTCAACTGGGACGTGGCCGAGGAGTTCTTCAAGAAGGCCTGA。

SOD蛋白序列(SEQ ID NO：5)：

Met Pro Tyr Pro Phe Lys Leu Pro Asp Leu Gly Tyr Pro Tyr Glu Ala LeuGlu Pro His Ile Asp Ala Lys Thr Met Glu Ile His His Gln Lys His His Gly AlaTyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Lys Tyr Pro Tyr Leu His Gly Val GluVal Glu Val Leu Leu Arg His Leu Ala Ala Leu Pro Gln Asp Ile Gln Thr Ala ValArg Asn Asn Gly Gly Gly His Leu Asn His Ser Leu Phe Trp Arg Leu Leu Thr ProGly Gly Ala Lys Glu Pro Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Asp Glu Gln Phe GlyGly Phe Gln Ala Leu Lys Glu Lys Leu Thr Gln Ala Ala Met Gly Arg Phe Gly SerGly Trp Ala Trp Leu Val Lys Asp Pro Phe Gly Lys Leu His Val Leu Ser Thr ProAsn Gln Asp Asn Pro Val Met Glu Gly Phe Thr Pro Ile Val Gly Ile Asp Val TrpGlu His Ala Tyr Tyr Leu Lys Tyr Gln Asn Arg Arg Ala Asp Tyr Leu Gln Ala IleTrp Asn Val Leu Asn Trp Asp Val Ala Glu Glu Phe Phe Lys Lys Ala。

优选的是，液体发酵培养时，所用的液体发酵培养基包括以下浓度的组分：8g/L蛋白胨，4g/L酵母提取物，3g/L氯化钠，367mg/L碳酸氢钠，31.34mg/L硫酸镁，0.95mg/L氯化钾，36.75mg/L二水合氯化钙以及150.44mg/L六水合氯化镁，pH值为7.5。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明在进行基因组编辑时，只需要构建一个同时携带启动子、两个重复序列、引导靶向目标位点的spacer序列和供体DNA的编辑质粒，在内源Cas蛋白对靶标DNA链进行干涉之后，供体DNA为细菌提供了同源重组修复模板达到对基因组的编辑。本发明的基因编辑技术过程简单且具有更高的编辑效率，时间周期短，为嗜热栖热菌基因功能的挖掘和高性能工程菌株的构建提供了工具。

(2)本发明在嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)菌株HB27中利用上述基因编辑技术敲除了crtB基因，同时在该基因位点上插入了SOD编码基因，由此增加了嗜热栖热菌体内SOD基因的拷贝数；该基因编辑技术利用嗜热栖热菌内源的Ⅰ-C型CRISPR-Cas系统实现，进而成功构建了嗜热栖热工程菌，通过实验证明，本发明构建的嗜热栖热菌发酵液的超氧化物歧化酶含量显著增加2.2倍，可以作为原料添加到膏霜、乳液、眼部精华素、化妆水以及精华液等化妆品中。

(3)本发明的嗜热栖热菌在高温环境中生长，其产生的超氧化物歧化酶作为嗜热酶，它的稳定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活性。

(4)本发明的嗜热栖热菌发酵过程对反应器冷却系统的要求标准降低，因而减少了能耗。

(5)本发明的嗜热栖热菌发酵温度高，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢对产物的污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明利用嗜热栖热菌内源CRISPR-Cas系统进行基因编辑的原理设计图；

图2为本发明实施例1对嗜热栖热菌HB27基因组csm3基因插入10×His标签的PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例1对嗜热栖热菌HB27基因组csm3基因插入10×His标签的总蛋白western blot结果图；

图4为本发明实施例2利用3套不同的内源CRISPR-Cas系统进行crtB基因敲除的多个单克隆PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；

图5为本发明实施例3对嗜热栖热菌HB27基因组插入SOD基因的基因编辑原理示意图；

图6为本发明实施例3提供的工程菌编码SOD基因插入crtB基因位点的PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明的设计原理，如图1所示，基因编辑质粒能够利用内源CRISPR-Cas系统进行嗜热栖热菌基因组编辑：向导RNA依据间隔序列引导CRISPR-Cas效应蛋白至靶标位点，当识别到正确的PAM序列或侧翼序列后，由CRISPR-Cas系统的核酸酶介导的双链DNA断裂(DSBs)。在细菌体内进行非同源末端接合(NHEJ)和同源定向修复(HDR)时，供体DNA会作为模板以实现精准的基因组编辑。更具体的为：本发明利用内源CRISPR-Cas系统进行嗜热栖热菌基因组编辑，先确定需要编辑的片段，依据PAM序列和侧翼序列选择原间隔序列，即靶标位点；人工合成或通过SOE-PCR扩增得到供体DNA，构建编辑质粒，再将编辑质粒转化至嗜热栖热菌中；挑取单克隆，通过PCR扩增检测靶标位点基因编辑的效率。

以下将以具体的实施例对本发明的技术方案进行更具体的说明。

实施例1利用Ⅲ-A/B亚型CRISPR-Cas系统对嗜热栖热菌HB27的Csm3蛋白进行插入突变

1、编辑质粒的构建

(1)本发明中的编辑质粒是在含有Ⅲ-A/B亚型重复序列的mini-CRISPR质粒的基础上构建而成的。在嗜热栖热菌HB27基因组上选取csm3基因(TT_RS10655)的最后39个碱基作为protospacer，其反向互补序列为5’-CTAAAGGACCACTTCCTCCACCTTGAGCCTTTCCTTTAG-3’，其前面没有TTC-PAM，因而只具有Ⅲ-A/B亚型CRISPR的DNA干涉活性。

基于这个protospacer设计引物：1R-csm3his-F(核苷酸序列：CGACCCTAAAGGACCACTTCCTCCACCTTGAGCCTTTCCTTTAG)和1R-csm3his-R(核苷酸序列：CAACCTAAAGGAAAGGCTCAAGGTGGAGGAAGTGGTCCTTTAGG)，两条引物通过退火生成两端含有粘性末端的间隔序列片段；

(2)人工mini-CRISPR载体pRKP31-AC1经BbsⅠ酶切处理，使用T4 DNA连接酶，将酶切产物与上述间隔序列片段在22℃环境下酶连2h，转化至大肠杆菌DH5α，得到靶向csm3基因的mini-CRISPR载体；

(3)设计两条包含十个组氨酸编码子的SOE-PCR引物：1Rpt-csm3inst-L-R(核酸序列：ATGATGATGGTGATGGTGATGGTGGTGATGAAGGACCACTTCCTCCACCTT)和1Rpt-csm3inst-R-F(核苷酸序列：CATCACCACCATCACCATCACCATCATCATTAGGGGGCCTGGATGCGGGCGAC)。分别带有SalⅠ、NheⅠ酶切位点的两条引物：1Rpt-csm3instL-SalI-F(核酸序列：GTAAGGGGATTGCGACCGCGATGAAGCTCAAGAAGGTGATCC)和csm3inst-R-NheI-R(核苷酸序列：GATGGTGATGGTGATGGTGGTGGCGTAGGCGTTCGGCTCCTT)。用SOE-PCR的方法得到用于同源重组的供体DNA片段；

(4)供体DNA片段和上述mini-CRISPR质粒分别用SalⅠ和NheⅠ酶切，然后使用HieffPlus One Step Cloning Kit连接片段，转化至大肠杆菌DH5α，得到编辑质粒pRKP31-csm3his-Sp1-LR。

2、突变株的筛选

当嗜热栖热菌HB27(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏)的OD₆₀₀值在0.8时，吸取500μL菌液，将1.2ng编辑质粒加至菌液中，65℃180r/min摇床孵育2.5小时后，全部菌液涂布至含30mg/mL卡那霉素的TB固体培养基上。65℃培养箱培养24小时，得到单克隆，通过PCR验证SOD基因片段是否被正确插入基因组中，验证引物为csm10His-exm-F(核酸序列：TCCTCAGGGCCAAGCTCTTCTACAAC)和10His-R(核酸序列：ATGATGATGGTGATGGTGATGGTGGTGATG)，PCR验证产物大小约为943bp。

结果如图2所示，工程菌株基因型为Csm3His-tagged。多次传代得到纯合菌株后，在无抗培养基中传代3次使编辑质粒丢失，得到HB27Csm3-His插入突变菌株，该菌株的培养无需添加抗生素。

3、His标签融合蛋白的检测

收集Ⅲ-A/B亚型系统介导的csm310xHis插入突变株菌体，破碎菌体后使用His一抗进行westernblot实验。

如图3所示，在野生型总蛋白中抗体无法杂交得到27kDa大小的条带，但在插入突变株中能获得清晰的Csm3蛋白条带，带有His标签的阳性对照蛋白也有正确条带。此结果同样证明了10×His标签成功插入csm3基因中。

实施例2比较内源CRISPR-Cas系统对嗜热栖热菌crtB基因的敲除能力

1、构建靶向crtB基因的mini-CRISPR质粒

本发明在嗜热栖热菌HB27基因组上选取crtB基因(TT_RS10425)作为被敲除基因，由于Ⅰ-B和Ⅰ-C型CRISPR-Cas系统的PAM序列是TTC，所以选择TTC之后的38bp序列作为靶标并设计引物：crtBsp23-F(核苷酸序列：AAACCTGACCGACCTCGGCCCCGTGCGGCTCGGGACGGAGGC)和crtBsp23-R(核苷酸序列：CAACGCCTCCGTCCCGAGCCGCACGGGGCCGAGGTCGGTCAG)；选择其5’侧翼序列与Ⅲ-A/B亚型重复序列无法互补的40bp序列作为靶标并设计引物：crtBsp1-F(核苷酸序列：CGACGCTCCGCCTCCGTCCCGAGCCGCACGGGGCCGAGGTCGGT)和crtBsp1-R(核苷酸序列：CAACACCGACCTCGGCCCCGTGCGGCTCGGGACGGAGGCGGAGC)。将正向引物与反向引物等量混合后95℃孵育10min冷却退火，再经过酶连至mini-CRISPR载体上，得到能够靶向crtB基因的质粒。

2、构建敲除crtB基因的供体DNA

crtB基因的敲除过程中要利用到该基因自身的上下游序列作为同源重组模板。当细菌体内的CRISPR-Cas效应复合物根据向导RNA靶向靶标位点，Cas蛋白造成DNA断裂后，供体DNA作为模板用以同源重组修复，得到精准编辑的敲除菌株，原理如图1所示。crtB基因敲除的供体DNA片段引物设计如下：Ⅰ-B和Ⅰ-C型系统上游片段扩增引物为KOcrtB-L-F23(核苷酸序列：GAGGATTGAAACCGCGTCGATAGGCGGCGAGCATGGCC)和3’端引物KOcrtB-L-R(核苷酸序列：CATAGCCTTATAGCCTGAGGACGCGGAGGAGGGCTTTCCAGTC)；Ⅲ-A和Ⅲ-B型系统上游片段扩增引物为5’端引物KOcrtB-L-F1(核苷酸序列：GGGGATTGCGACCGCGTCGATAGGCGGCGAGCATGGCC)和3’端引物KOcrtB-L-R(核苷酸序列：CATAGCCTTATAGCCTGAGGACGCGGAGGAGGGCTTTCCAGTC)；下游片段扩增引物为5’端引物KOcrtB-R-F(核苷酸序列：CAAAGCCCCTTGCCGCTCAAGGCCTGGGAACGGGCCCTC)和3’端引物KOcrtB-R-R(核苷酸序列：GTGATGGTGATGGTGGCTAGGAAGCCCCGGGTCTTCCCG)。利用高保真DNA聚合酶从嗜热栖热菌HB27的基因组DNA上PCR扩增得到上游片段、下游片段。通过以下融合PCR步骤，利用胶回收试剂盒切胶回收最终长度为1400bp的供体DNA片段。

融合PCR连接上游片段与下游片段，上游片段与下游片段各1μL作为模板，其余体系参照DNA聚合酶说明书；反应程序为95℃10min，(95℃15s，8℃15s，72℃90s)28个循环，72℃5min，12℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小是否正确，切胶回收正确条带(1400bp)。

3、构建敲除crtB基因的编辑质粒

利用限制性内切酶SalⅠ和NheⅠ将靶向crtB基因的mini-CRISPR质粒进行酶切，使用无缝克隆试剂盒将供体DNA与mini-CRISPR质粒连接，得到敲除crtB基因的编辑质粒。

4、质粒转化及敲除菌株的获得

当嗜热栖热菌HB27的OD₆₀₀值在0.8时，吸取500μL菌液，将1.2ng编辑质粒加至菌液中，65℃180r/min摇床孵育2.5小时后，全部菌液涂布至含30mg/mL卡那霉素的TB固体培养基上。65℃培养箱培养24小时，得到单克隆，通过PCR验证crtB基因片段是否被敲除，验证引物为crtB-exm-F(核苷酸序列：TTAAAGGCTCGGAAAGGACGGC)和crtB-exm-R(核苷酸序列：GTAGAGGAGGTGGTAGGAGAAGTC)，PCR验证产物大小约为1686bp。

结果如图4所示，Ⅲ-A/B型系统的敲除效率为60％(12/20)，Ⅰ-C系统的敲除效率为95％(19/20)，Ⅰ-B系统的敲除效率为100％(20/20)。多次传代得到纯合菌株后，在无抗培养基中传代3次使编辑质粒丢失，得到敲除菌株HB27△crtB，该菌株的培养无需添加抗生素。

实施例3利用I-C亚型CRISPR-Cas系统获得高产超氧化物歧化酶的嗜热栖热菌

1、构建靶向crtB基因的mini-CRISPR质粒

本发明中的编辑质粒是在含有Ⅰ-C亚型重复序列的mini-CRISPR质粒的基础上构建而成的。在嗜热栖热菌HB27基因组上选取crtB基因(TT_RS10425)作为被敲除基因，由于Ⅰ-C型CRISPR-Cas系统的PAM序列是TTC，所以选择TTC之后的38bp序列作为靶标并设计引物：crtBsp23-F(核酸序列：AAACCTGACCGACCTCGGCCCCGTGCGGCTCGGGACGGAGGC)和crtBsp23-R(核酸序列：CAACGCCTCCGTCCCGAGCCGCACGGGGCCGAGGTCGGTCAG)。将正向引物与反向引物等量混合后进行退火，再经过酶连至mini-CRISPR载体上，得到能够靶向crtB基因的质粒。

2、编码超氧化物歧化酶基因的获得

以嗜热栖热菌HB27的基因组DNA作为模板，利用高保真DNA聚合酶(Vazyme P501-d1)按照说明书扩增编码SOD蛋白基因(TT_RS00960)：使用5’端引物SOD-F(核酸序列：AGGCTATAAGGCTATGGGGATCAGG)和3’端引物SOD-R(核酸序列：GCGGCAAGGGGCTTTGTGAGGAAG)进行PCR扩增，得到编码SOD基因DNA序列(709bp)。

3、构建敲除crtB基因并插入编码SOD基因的供体DNA

crtB基因的敲除过程中要利用到该基因自身的上下游序列作为同源重组模板。当细菌体内的CRISPR-Cas效应复合物根据向导RNA靶向靶标位点，Cas蛋白造成DNA断裂后，供体DNA作为模板用以同源重组修复，得到精准编辑的敲除菌株，原理如图5所示。

crtB基因敲除的供体DNA片段引物设计如下：

上游片段扩增引物为5’端引物KOcrtB-L-F(核苷酸序列：GAGGATTGAAACCGCGTCGATGCTCCTCCGCCACCCCGATCT)和3’端引物KOcrtB-L-R(核苷酸序列：CATAGCCTTATAGCCTGAGGACGCGGAGGAGGGCTTTCCAGTC)；下游片段扩增引物为5’端引物KOcrtB-R-F(核苷酸序列：CAAAGCCCCTTGCCGCTCAAGGCCTGGGAACGGGCCCTC)和3’端引物KOcrtB-R-R(核苷酸序列：GTGATGGTGATGGTGGCTAGGAAGCCCCGGGTCTTCCCG)。利用高保真DNA聚合酶(Vazyme P501-d1)从嗜热栖热菌HB27的基因组DNA上PCR扩增得到上游片段、下游片段。通过以下融合PCR步骤，利用胶回收试剂盒切胶回收最终长度为2058bp的供体DNA片段。

融合PCR第一步先连接上游片段与SOD基因片段，上游片段与SOD基因片段各1μL作为模板，其余体系参照DNA聚合酶说明书；反应程序为95℃10min，(95℃15s，58℃15s，72℃90s)28个循环，72℃5min，12℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小是否正确，切胶回收正确条带。融合PCR第二步再连接已融合片段和下游片段，已融合片段和下游片段各1μL作为模板，其余体系参照DNA聚合酶说明书；反应程序为95℃10min，(95℃15s，56℃15s，72℃2min)28个循环，72℃5min，12℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小是否正确，切胶回收正确条带(2058bp)。

3、构建敲除crtB基因并插入SOD基因的编辑质粒

利用限制性内切酶SalⅠ和NheⅠ将靶向crtB基因的mini-CRISPR质粒进行酶切，使用无缝克隆试剂盒将供体DNA与mini-CRISPR质粒连接，得到敲除crtB基因并插入SOD基因的编辑质粒。

4、质粒转化及工程菌株的获得

当嗜热栖热菌HB27的OD₆₀₀值在0.8时，吸取500μL菌液，将1.2ng编辑质粒加至菌液中，65℃180r/min摇床孵育2.5小时后，全部菌液涂布至含30mg/mL卡那霉素的TB固体培养基上。65℃培养箱培养24小时，得到单克隆，通过PCR验证SOD基因片段是否被正确插入基因组中，验证引物为crtB-exm-F(核苷酸序列：TTAAAGGCTCGGAAAGGACGGC)和SOD-R(核苷酸序列：GCGGCAAGGGGCTTTGTGAGGAAG)，PCR验证产物大小约为1543bp。结果如图6所示，工程菌株基因型为△crtB::TTRS00960。多次传代得到纯合菌株后，在无抗培养基中传代3次使编辑质粒丢失，得到工程菌株HB27△crtB::TTRS00960，该菌株的培养无需添加抗生素。

实施例4利用高产超氧化物歧化酶工程菌株生产超氧化物歧化酶的方法

1、工程菌株嗜热栖热菌HB27△crtB::TTRS00960发酵生产超氧化物歧化酶

(1)培养基的制备

溶剂为单蒸水，溶质及其终浓度分别为：8g/L蛋白胨，4g/L酵母提取物，3g/L氯化钠，367mg/L碳酸氢钠，31.34mg/L硫酸镁，0.95mg/L氯化钾，36.75mg/L二水合氯化钙，150.44mg/L六水合氯化镁。所述培养基的pH值为7.5，115℃灭菌20min。

(2)种子液的制备与摇瓶发酵培养

取工程菌株HB27△crtB::TTRS00960活化后，用液体培养基于65℃、200转/分钟下震荡培养12小时，获得OD₆₀₀为2.5左右的种子液。

取获得的种子液，按照4％的比例接种于液体培养基中，摇瓶培养发酵至OD₆₀₀为0.8左右。

(3)超氧化物歧化酶的检测

收集步骤2的发酵液，5000g离心15分钟，收集菌体；用PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎(为间歇超声，每超声处理1s)后，13000g离心30min，收集上清液，即为含有超氧化物歧化酶的粗酶液。最后检测粗酶液的超氧化物歧化酶活性。

上述超氧化物歧化酶(SOD)酶活检测方法如下：

(1)超氧化物歧化酶1个标准酶活(U)的定义为：37℃时在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50％时，反应体系中的SOD酶活力。

(2)配制如下试剂

PBS缓冲液：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24gKH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至pH7.4，最后加蒸馏水定容至1L。

其余试剂：均来自Biosharp总SOD活性检测试剂盒(WST-1法)(BL903A)。

(3)超氧化物歧化酶酶活检测方法，按Biosharp总SOD活性检测试剂盒(WST-1法)(BL903A)说明书进行。

按照如下公式，计算待测发酵上清液中超氧化物歧化酶的活力：

上述公式中，A为波长在450nm时测定的吸光度读数。

2、对照菌发酵生产超氧化物歧化酶

按照步骤1中的(1)-(3)的方法进行，不同之处在于：将工程菌株HB27△crtB::TTRS00960替换为野生型菌株嗜热栖热菌HB27。

3、结果

表1菌体的OD₆₀₀和发酵液中超氧化物歧化酶活性结果

如图1所示，工程菌株HB27△crtB::TTRS00960生产超氧化物歧化酶的比酶活明显高于野生型对照菌。

实施例5利用高产超氧化物歧化酶工程菌株生产超氧化物歧化酶的方法

(1)培养基的制备

(2)种子液的制备与摇瓶发酵培养

取工程菌株HB27△crtB::TTRS00960活化后用液体培养基于65℃、200转/分钟下震荡培养12小时，获得OD₆₀₀为2.5左右的种子液。

取获得的种子液，按照4％的比例接种于液体培养基中，摇瓶培养发酵至OD₆₀₀为1.0左右。

(3)超氧化物歧化酶的检测

收集步骤2的发酵液，5000g离心15分钟，收集菌体；用PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎(为间歇超声，每超声处理1s)后，13000g离心30min，收集上清液，即为含有超氧化物歧化酶的粗酶液。最后检测粗酶液的超氧化物歧化酶活性(同实施例4)。

2、对照菌发酵生产超氧化物歧化酶

3、结果

表2菌体的OD₆₀₀和发酵液中超氧化物歧化酶活性结果

如表2所示，可以看出，工程菌HB27△crtB::TTRS00960生产超氧化物歧化酶的比酶活明显高于野生型对照菌。

实施例6利用高产超氧化物歧化酶工程菌株生产超氧化物歧化酶的方法

(1)培养基的制备

(2)种子液的制备与摇瓶发酵培养

取获得的种子液，按照4％的比例接种于液体培养基中，摇瓶培养发酵至OD₆₀₀为1.2左右。

(3)超氧化物歧化酶的检测

收集步骤2的发酵液，5000g离心15分钟，收集菌体；用PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎(为间歇超声，每超声处理1s)后，13000g离心30min,收集上清液，即为含有超氧化物歧化酶的粗酶液。最后检测粗酶液的超氧化物歧化酶活性。

2、对照菌发酵生产超氧化物歧化酶

3、结果

表3菌体的OD₆₀₀和发酵液中超氧化物歧化酶活性结果

如表3所示，工程菌HB27△crtB::TTRS00960生产超氧化物歧化酶的比酶活明显高于野生型对照菌。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种嗜热栖热菌基因编辑质粒，其特征在于，所述基因编辑质粒包括如下基因结构：5’-启动子-重复序列-间隔序列-重复序列-供体DNA-3’；其中，所述重复序列源自嗜热栖热菌基因组上Ⅰ-B亚型、Ⅰ-C亚型或者Ⅲ-A/B亚型CRISPR-Cas系统；所述间隔序列为靶标片段；

源自嗜热栖热菌Ⅰ-B亚型基因组上CRISP-Cas系统的重复序列为：5’-GTTGCAAACCTCGTTAGCCTCGTAGAGGATTGAAAC-3’；

源自嗜热栖热菌基因组上Ⅰ-C亚型CRISPR-Cas系统的重复序列为：5’-GTTGCACCGGCCCGAAAGGG CCGGTGAGGA TTGAAAC-3’；

源自嗜热栖热菌基因组上Ⅲ-A和Ⅲ-B亚型CRISPR-Cas系统的重复序列为：5’-GTTGCAAGGG ATTGAACCCC GTAAGGGGAT TGCGAC-3’。

2.如权利要求1所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒，其特征在于，所述间隔序列为PAM序列紧邻的38-40bp长度的序列。

3.如权利要求2所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒，其特征在于，Ⅰ-B亚型和Ⅰ-C亚型的PAM序列为5’-TTC-3’。

4.如权利要求2所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒，其特征在于，当靶标位点3’端侧翼序列与crRNA的5’端重复序列不匹配时，Ⅲ-A和Ⅲ-B亚型的Cas蛋白具有DNA切割活性。

5.如权利要求1所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒，其特征在于，所述启动子为嗜热栖热菌的组成型启动子；所述供体DNA为嗜热栖热菌HB27的基因组DNA序列或者片段。

6.一种工程菌株，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒。

7.如权利要求1-5任一项所述的嗜热栖热菌基因编辑质粒或者权利要求6所述的工程菌株在生产超氧化物歧化酶中的应用。

8.一种生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的基因编辑质粒转入嗜热栖热菌中，敲除嗜热栖热菌crtB基因的同时插入编码SOD的基因，构建嗜热栖热工程菌；然后再通过液体发酵培养所述嗜热栖热工程菌，培养至所述嗜热栖热工程菌的OD₆₀₀为0.8-1.2时结束发酵，获取超氧化物歧化酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，液体发酵培养时，所用的液体发酵培养基包括以下浓度的组分：8g/L蛋白胨，4g/L酵母提取物，3g/L氯化钠，367mg/L碳酸氢钠，31.34mg/L硫酸镁，0.95mg/L氯化钾，36.75mg/L二水合氯化钙以及150.44mg/L六水合氯化镁，pH值为7.5。