CN115932254A

CN115932254A - 一种血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其制备方法及多抗

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Publication number: CN115932254A
Application number: CN202211133695.1A
Authority: CN
Inventors: 司振书; 王凯莉; 刘成; 李玉保; 路建彪; 裴兰英; 曹胜亮
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2022-09-15
Filing date: 2022-09-15
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明涉及检测制剂技术领域，尤其涉及一种血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其制备方法及多抗。本发明的胶体金试纸条实现在无特殊设备的情况下对FAdV‑4进行快速诊断。本发明制备得到的多抗效价大于1：256000，1：5000倍稀释时具有良好的反应性；所制备的胶体金试纸条可检出FAdV‑4含量为10^2.0945EID₅₀的样本，对临床样本的检测与PCR检测的符合率达97.87％，表明建立的胶体金检测方法特异性强，灵敏度较高，可用于家禽FAdV‑4感染的快速诊断。

Description

一种血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其制备方法及多抗

技术领域

本发明涉及检测制剂技术领域，尤其涉及一种血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其制备方法及多抗。

背景技术

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus-4，FAdV-4)可引起心包积液-肝炎综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)。FAdV-4属于禽腺病毒属Ⅰ群禽腺病毒C种，属于无囊膜的双股DNA病毒，呈二十面体对称结构，由DNA、核心蛋白和衣壳蛋白组成。六邻体蛋白是含量最多的衣壳蛋白，包含群、亚群和型特异性抗原决定簇，与致病性关系密切，是禽腺病毒分型的主要依据。Fiber蛋白与penton base相连，分为fiber1和fiber2，与病毒中和、细胞受体结合、组织趋向性和毒力的变化有关，并在介导病毒感染和诱导机体产生中和抗体等方面发挥关键作用。六邻体的L1区域属于高变区，对其PCR之后进行DNA测序，可以区分5个种内的12个血清型。六邻体蛋白是FAdV-4的主要衣壳蛋白，六邻体蛋白的L1、L2和L4由高变区HVR产生，目前确定了7个高变区HVRs1-7，其中4个位于L1、2个位于L2剩下的1个位于L4；型特异性抗原决定簇由L1和L2的HVR编码，位于六邻体表面，负责诱导免疫反应。FAdV-4既可感染鸡也可感染鸭，且其易与新城疫、传染性法氏囊病等疾病发生混合感染，给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失。

目前对于FAdV-4的诊断主要是用分子生物学诊断方法中的聚合酶链反应和血清学检测方法中的ELISA。PCR和ELISA检测，检测耗费时间长且需要昂贵的仪器设备，检测费用高。

胶体金免疫层析技术(Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)以微孔滤膜为载体、用胶体金作为示踪标记物，使待检样品中相应的抗体或抗原在载体的特定部位发生特异性免疫反应从而显色，根据T线和C线是否显色来判定结果。胶体金试纸条特异性强，操作简便，检测时间短，结果直接用颜色显示肉眼可见，不需任何仪器设备，适用于临床大批量样品的监测。

目前尚未有利用胶体金免疫层析技术对血清4型禽腺病毒进行检测的试纸条产品。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明将FAdV-4的hexon-L1在大肠杆菌中进行了原核表达，将表达纯化后的蛋白免疫清洁级新西兰大白兔制备了hexon-L1多克隆抗体，用其作为包被抗体，生物素标记的多抗作为检测抗体建立了检测检测FAdV-4的胶体金试纸条。

本发明提供了一种血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，包括从上到下依次固定于底板上的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸收垫，NC膜上设置有T线和C线；胶体金结合垫上负载有胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体，hexon-L1多克隆抗体由含有血清4型禽腺病毒hexon-L1基因片段的重组质粒表达得到的融合蛋白免疫动物获得；T线内包被有hexon-L1多克隆抗体；C线内包被有羊抗兔IgG抗体。

可选的，胶体金结合垫负载胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的负载量为0.01～0.5μg；优选为浓度为0.1μg；C线内包被羊抗兔IgG抗体的包被量为2～10μL，优选为5μL；T线内包被hexon-L1多克隆抗体的包被量为2～10μL，优选为5μL。

可选的，胶体金结合垫负载胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的浓度为5～20μg/mL，优选为10μg/mL，负载胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的体积为10μL；C线内包被羊抗兔IgG抗体的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL；包被羊抗兔IgG抗体的体积为5μL；T线内包被hexon-L1多克隆抗体的浓度为1～3mg/mL，优选为1.5mg/mL；包被hexon-L1多克隆抗体的体积为5μL。

可选的，胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的制备方法包括：取30nm～50nm胶体金溶液10mL，调整pH至7.8～8.2，加入hexon-L1多克隆抗体，使hexon-L1多克隆抗体的终浓度为5～15μg/mL、优选为10μg/mL，混匀，封闭，经纯化后获得胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体。

可选的，hexon-L1多克隆抗体的制备方法为：

S1、扩增血清4型禽腺病毒hexon-L1基因序列；

S2、将扩增得到的基因片段连接至载体质粒中，获得重组质粒；

S3、将所述重组质粒转化至载体细胞中，诱导表达，获得融合蛋白并进行纯化；

S4、将纯化后的融合蛋白免疫实验动物，获得所述hexon-L1多克隆抗体。

可选的，所扩增的hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；优选的，进行扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

可选的，在S3中，用0.004～0.012mM、优选为0.008mM IPTG进行诱导表达，诱导的时间为3～5小时，优选为4小时。

可选的，S4包括：将纯化的融合蛋白和弗氏完全佐剂1：1乳化，乳化完背部皮下多点注射清洁级新西兰大白兔1mg/只；两周后进行二免，用弗氏不完全佐剂与融合蛋白1：1乳化，1mg/只；间隔两周后三免，融合蛋白与弗氏不完全佐剂1：1乳化，1mg/只；1周后采血分离血清，经纯化后得到所述hexon-L1多克隆抗体。

本发明还涉及该血清4型禽腺病毒胶体金检测卡的制备方法，至少包括以下步骤：

S1、将样品垫裁剪后，浸泡于缓冲液中，烘干；

S2、将胶体金结合垫裁剪后，浸泡于浓度为5～20μg/mL的胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体中，干燥；

S3、将1～3mg/mL的hexon-L1多克隆抗体、0.5～2mg/mL的羊抗兔IgG抗体分别喷涂在NC膜上T线、C线处，干燥；

S4、将样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸收垫按从上到下依次固定于底板上。

本发明还涉及一种hexon-L1多克隆抗体，hexon-L1多克隆抗体由含有血清4型禽腺病毒hexon-L1基因片段的重组质粒表达得到的融合蛋白免疫动物获得；hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明的胶体金试纸条实现在无特殊设备的情况下对FAdV-4进行快速诊断。本发明制备得到的多抗效价大于1：256000，1：5000倍稀释时具有良好的反应性；所制备的胶体金试纸条可检出FAdV-4含量为10^2.0945EID₅₀的样本，新城疫病毒、禽白血病病毒等均不出现特异性条带，对临床样本的检测与PCR检测的符合率达97.87％，表明建立的胶体金检测方法特异性强，灵敏度较高，可用于FAdV-4感染的快速诊断。

附图说明

图1为Hexon-L1基因扩增结果图，M为Marker，1为Hexon-L1基因扩增产物，2为阴性对照；

图2为fiber1和fiber2基因扩增结果，M：Marker；1:fiber1基因扩增产物；2：阴性对照；3：fiber2基因扩增产物；4：阴性对照；

图3为重组质粒pET32a-hexon-L1双酶切鉴定结果，M：DM1000 Marker；1：pET32a-hexon-L1经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后的产物；

图4为重组质粒pET32a-fiber1和pET32a-fiber2双酶切鉴定，M：DM1000 Marker；1：pET32a-fiber1经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后的产物；2：pET32a-fiber2经HindⅢ和EcoR V双酶切后的产物；

图5为hexon-L1 37℃诱导4h后SDS-PAGE电泳图，M：Marker；1：1.2mM诱导；2：1mM诱导；3：0.8mM诱导；4：0.08mM；5：0.008mM诱导；6：pET32a空载体；

图6为fiber1 37℃诱导4h后SDS-PAGE电泳图，1：0.8mM诱导；2：0.08mM诱导；3：0.008mM诱导；4：未加IPTG诱导；M：Marker；5：pET32a空载体；

图7为fiber2 37℃诱导4h后SDS-PAGE电泳图，1：0.8mM诱导；2：0.08mM诱导；3：0.008mM诱导；4：未加IPTG诱导；M：Marker；5：pET32a空载体；

图8为不同温度下hexon-L1蛋白诱导表达实验结果图，M：Marker；1：16℃诱导上清；2：16℃诱导沉淀；3：28℃诱导上清；4：28℃诱导沉淀；5：37℃诱导上清；6：37℃诱导沉淀；7：pET32a空载体；

图9为不同温度下fiber1蛋白诱导表达形式实验结果图，1：16℃0.8mM；2：16℃0.08mM；3：16℃0.008mM；4：Marker；5：28℃0.8mM；6：28℃0.08mM；7：28℃0.008mM；8：37℃0.8mM；9：37℃0.08mM；10：37℃0.008mM；

图10为不同温度下fiber2蛋白诱导表达实验结果图，1：Marker；2：16℃0.8mM；3：16℃0.08mM；4：16℃0.008mM；5：28℃0.8mM；6：28℃0.08mM；7：28℃0.008mM；8：37℃0.8mM；9：37℃0.08mM；10：37℃0.008mM；

图11为hexon-L1纯化蛋白的SDS-PAGE分析结果图，M：Marker；1：未纯化蛋白；2：纯化后蛋白；

图12为fiber1纯化蛋白的SDS-PAGE实验结果图，M：Marker；1：未纯化蛋白；2：纯化后蛋白；

图13为fiber2纯化蛋白的SDS-PAGE实验结果图，M：Marker；1：未纯化蛋白；2：纯化fiber2洗脱液1-2mL；3：纯化fiber2洗脱液；

图14为hexon-L1蛋白Western blot实验结果图，M：Marker；1：纯化蛋白；2：pET32a空载体；

图15为fiber1、fiber2蛋白Western blot实验结果图，M：Marker；1：纯化fiber1蛋白；2：纯化fiber2蛋白；

图16为胶体金试纸条的敏感性实验结果；

图17为胶体金试纸条的特异性实验结果；

图18为胶体金试纸条的重复性实验结果。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例的检测试纸条采用FAdV-4的六邻体蛋白作为抗原制备多克隆抗体，六邻体蛋白是其主要衣壳蛋白，包含群、亚群和型特异性抗原决定簇，与致病性关系密切，是禽腺病毒分型的主要依据。六邻体的L1区域属于高变区，对其PCR之后进行DNA测序，可以区分5个种内的12个血清型。与fiber1、fiber2蛋白等抗原相比，采用六邻体蛋白制备得到的多克隆抗体与抗原的亲和力更好，因此，用该多克隆抗体制备的试纸条检测的灵敏度更高，稳定性更好。进一步的，本发明实施例针对六邻体蛋白的抗原序列也进行了深入的研究，六邻体蛋白中哪些序列都可以引发免疫反应，但研究发现，本发明实施例所选择的抗原序列的免疫效果最好。本发明实施例所所扩增的hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。该片段内的Hexon L1区含有种群特异性抗原决定簇，可能诱导机体产生型特异性抗体，可以鉴别FAdVs不同血清型；且腺病毒潜在的中和活性的抗原决定簇主要在Hexon L1、L2区域。

SEQ ID NO.1的核苷酸序列如下：

gtcctggacatggggtcgacctatttcgacatcaagggaatcctagaccgagggccgtccttcaagccctactgcggcacggcttacaacccgctggctcccaaggagtccatgtttaacaactggtcggagacggcacccgggcagaacgtgtccgcctccggtcagctgtccaacgtctataccaacacgagcacctccaaagacacgacggcggcgcaggtgacgaagatttccggcgtcttccccaatcccaaccagggacccggaagaaatcctctgcgacgggtacaaaacgccaacaccggcgtgctcggtcgcttcgccaagtctcagtacaattacgcttacggtgcctacgtcaagcccgtcgccgccgacggttcccagtccctcacgcagaccccctactggatcatggataacacgggcaccaattacctgggagcggtggccgtcgaggactacaccaacagcctctcgtacccagataccatagtcgtgccgcctcccgaggactacgacgattataacataggcaccacgcgtgcgctcaggcccaactacatcgggttcagggataacttcattaacctgctgtatcacgactccggcgtgtgctcgggcaccctcaactcggagcgttcgggcatgaacgtggtggtcgagctgcccgaccggaataccgag

作为本发明实施例的一种优选的实施方式，该胶体金试纸条包括从上到下依次固定于底板上的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸收垫，NC膜上设置有T线和C线；胶体金结合垫上负载有胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体，所述hexon-L1多克隆抗体由含有血清4型禽腺病毒hexon-L1基因片段的重组质粒表达得到的融合蛋白免疫动物获得；T线内包被有hexon-L1多克隆抗体；C线内包被有羊抗兔IgG抗体。

具体可选择的，胶体金结合垫负载所述胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的负载量为0.01～0.5μg；优选为0.1μg；C线内包被羊抗兔IgG抗体的包被量为2～10μg，优选为5μg；T线内包被hexon-L1多克隆抗体的包被量为5～15μg，优选为7.5μg。进一步优选的，该胶体金试纸条中hexon-L1多克隆抗体的负载量与C线中羊抗兔IgG抗体的质量比为1：50，C线中羊抗兔IgG抗体与T线内hexon-L1多克隆抗体的的质量比为1：1.5。

具体的浓度与负载或包被体积的对应关系可选择：胶体金结合垫负载胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的浓度为5～20μg/mL，优选为10μg/mL，负载胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的体积为10μL；C线内包被羊抗兔IgG抗体的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL；包被羊抗兔IgG抗体的体积为5μL；T线内包被述hexon-L1多克隆抗体的浓度为1～3mg/mL，优选为1.5mg/mL；包被hexon-L1多克隆抗体的体积为5μL。当物质浓度不同时，也可采用其他的负载或包被体积、

作为本发明实施例的一种优选的实施方式，胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的制备方法为：取30nm～50nm胶体金溶液，调整pH至7.8～8.2，加入hexon-L1多克隆抗体，使hexon-L1多克隆抗体的终浓度为5～15μg/mL、优选为10μg/mL，混匀，封闭，经纯化后获得胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体。

作为本发明实施例的一种优选的实施方式，hexon-L1多克隆抗体的制备方法为：

S1、扩增血清4型禽腺病毒hexon-L1基因序列；所扩增的hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

S3、将重组质粒转化至载体细胞中，诱导表达，获得融合蛋白并进行纯化；

S4、将纯化后的融合蛋白免疫实验动物，获得hexon-L1多克隆抗体。

优选的，进行扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

优选的，在S3中，用0.004～0.012mM、优选为0.008mM IPTG进行诱导表达，诱导的时间为3～5小时，优选为4小时。

作为本发明实施例的一种优选的实施方式，S4包括：将纯化的融合蛋白和弗氏完全佐剂1：1乳化，乳化完背部皮下多点注射清洁级新西兰大白兔1mg/只；两周后进行二免，用弗氏不完全佐剂与融合蛋白1：1乳化，1mg/只；间隔两周后三免，融合蛋白与弗氏不完全佐剂1：1乳化，1mg/只；1周后采血分离血清，经纯化后得到所述hexon-L1多克隆抗体。

本发明实施例还涉及该血清4型禽腺病毒胶体金检测卡的制备方法，至少包括以下步骤：

S1、将样品垫裁剪后，浸泡于缓冲液中，烘干；

本发明实施例还涉及该一种hexon-L1多克隆抗体，hexon-L1多克隆抗体由含有血清4型禽腺病毒hexon-L1基因片段的重组质粒表达得到的融合蛋白免疫动物获得；hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明实施例采用诱导、纯化后获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，将多抗用胶体金标记，制备胶体金试纸条。本发明制备得到的多抗效价大于1：256000，1：5000倍稀释时具有良好的反应性；所制备的胶体金试纸条可检出FAdV-4含量为10^2.0945EID₅₀的样本，新城疫病毒、禽白血病病毒等均不出现特异性条带，对临床样本的检测与PCR检测的符合率达97.87％，表明建立的胶体金检测方法特异性强，灵敏度较高，可用于FAdV-4感染的快速诊断。

实施例所用到的生物材料如下：

毒株：FAdV-4山东分离株SD202009、FAdV-4HuB株；血清8型禽腺病毒；禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性贫血病病毒、白血病病毒、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、马立克病毒均由由聊城大学畜禽疫病防控技术研究所分离、鉴定并保存。实施例所用到的其他试剂如下：

质粒pET32a、Premix Taq酶、SolutionⅠ快速连接酶、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌rosetta、小量质粒提取试剂盒、Bam HⅠ和HindⅢ，购于TaKaRa公司；SDS-PAGE电泳相关试剂、氨苄霉素，购于上海碧云天生物技术有限公司；Tween-20、单组分TMB显色液、终止液、0.22μm的PVDF膜购于北京索莱宝科技有限公司；DNA Marker和琼脂糖凝胶回收试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司；蛋白Marker购于Thermo；蛋白酶抑制剂购于Sigma；包涵体蛋白纯化试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；引物片段由北京三博远志生物技术有限责任公司合成；清洁级新西兰大白兔购于济南西岭角养殖繁育中心；40nm的胶体金颗粒、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、样品垫、胶体金结合垫、吸收垫、PVC底板购于武汉金开瑞生物工程有限公司。

上游引物、下游引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

表1

编号	含义	核苷酸序列5'-3'
			SEQ ID NO.2	L1上游引物	ataggatccatggtcctggacatggggtc
SEQ ID NO.3	L1下游引物	cataagcttctcggtattccggtcgggc
			SEQ ID NO.4	fiber1上游引物	attggatccatgtcggccctaatcgcc
SEQ ID NO.5	fiber1下游引物	gacaagcttttaggggcccggagcatt
			SEQ ID NO.6	fiber2上游引物	atagatatcatgctccgggcccct
SEQ ID NO.7	fiber2下游引物	aataagcttttacgggagggaggcc

实施例1

本实施例用于说明融合蛋白的制备：

1、引物设计与合成

根据本实验室测序的血清4型禽腺病毒hexon-L1、fiber1和fiber2基因序列，应用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引入酶切位点，上游引物、下游引物如表1所示。

2、hexon-L1基因的扩增与克隆

以试剂盒提取的FAdV-4 SD202009阳性样本DNA为模板，用2×Taq Master Mix进行PCR扩增。扩增体系为50μL，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。

扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物用凝胶回收试剂盒纯化。将纯化后hexon-L1、fiber1和fiber2的PCR产物和pET32a载体分别用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切，双酶切后的hexon-L1基因片段和pET32a基因片段分别胶收纯化，用SolutionⅠ快速连接酶快速连接后转化至DH5α感受态，经氨苄抗性培养基筛选后，挑取菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定正确的阳性克隆振荡培养后提取质粒，进行双酶切鉴定和测序分析获得pET32a-hexon-L1、pET32a-fiber1和pET32a-fiber2重组质粒。

Hexon-L1、fiber1和fiber2基因扩增大小与预期一致(如图1、图2所示)。将构建好的重组质粒pET32a-hexon-L1、pET32a-fiber1和pET32a-fiber2进行双酶切鉴定(如图3、图4所示)，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果进行分析显示，插入的hexon-L1基因大小为690bp，fiber1基因大小为1296bp，fiber2基因为1440bp，且测序正确，表明这3个基因均已成功连接至pET32a载体上。

3、表达载体的构建与鉴定

将3个重组质粒分别转化至rosetta感受态中，经氨苄抗性培养基筛选后，挑取菌落振荡培养后提取重组质粒pET32a-hexon-L1，进行双酶切鉴定和测序分析。

4、pET32a-hexon-L1、pET32a-fiber1和pET32a-fiber2融合蛋白的诱导表达及可溶性分析

将步骤3中的3个菌液振荡培养7h至OD600 nm为0.6，加入IPTG使其终浓度分别为0.008mM、0.08mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM，在37℃、28℃、16℃分别诱导6h、16h、36h进行诱导表达，比较不同条件下的表达量，确定最佳诱导表达条件，同时设立pET-32a空载体的表达菌作为空白对照。收集各个温度诱导表达的菌液进行离心，弃去培养基后，用PBS重悬，进行超声处理(40％，6次/min)，分别收集上清和沉淀，沉淀用PBS重悬。取超声处理后的上清和沉淀样品100μL，加入上样缓冲液(5×)25μL，100℃煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳。

经SDS-PAGE结果分析可知，重组菌rosetta(pET32a-hexon-L1)在37℃条件下诱导4小时，随着IPTG浓度的升高，蛋白的表达量减少，在0.008mM IPTG诱导下蛋白表达量最高，分子量为44.23kDa，与预期大小相符；重组菌rosetta(pET32a-fiber1)在37℃条件下诱导4小时，随着IPTG浓度的升高，蛋白的表达量几乎一样，分子量为65.45kDa，与预期大小相符；重组菌rosetta(pET32a-fiber2)在37℃条件下诱导4小时，随着IPTG浓度的升高，蛋白的表达量先降低后升高，在0.8mM IPTG诱导下蛋白表达量最高，在分子量为70.51kDa，与预期大小相符；结果如图5、图6、图7所示。

4、pET32a-hexon-L1、pET32a-fiber1和pET32a-fiber2融合蛋白的纯化

取步骤3中的3个菌液按1：100的比例接种于含氨苄霉素的LB液体培养基中培养至OD_600nm为0.6，pET32a-hexon-L1、pET32a-fiber1菌液加入0.008mM IPTG，pET32a-fiber2加入0.8mM IPTG在37℃条件下诱导4h诱导表达，诱导表达后的菌液离心后取沉淀(5500rpm，20min，4℃)，用30mL PBS和300μL蛋白酶抑制剂重悬后超声破碎(40％，6次/min，30min)。取超声破碎后的沉淀用30mL Bingding Buffer重悬，进行SDS-PAGE电泳，结果显示，hexon-L1在44.23kDa处有明显单一条带(如图8所示)；fiber1在65.45kDa处有明显单一条带(如图9所示)；fiber2在70.51kDa处有明显单一条带(如图10所示)，且三个蛋白均主要以包涵体的形式存在于沉淀中。

放4℃冰箱过夜，将过夜后的菌液用0.45μm的滤膜过滤后负载上柱，用BingdingBuffer洗去杂蛋白，然后用Elution Buffer洗脱目的蛋白。将得到的洗脱液分别在6M、4M、2M、1M、0.5M、0.25M和PBS中透析12小时，除去尿素。用亲和层析法纯化了蛋白hexon-L1，SDS-PAGE电泳如图11、图12、图13所示。

实施例2

本实施例用于说明hexon-L1、fiber1和fiber2多克隆抗体的制备与鉴定

1、制备

将实施例1中纯化的蛋白(2.46mg/mL)分别和弗氏完全佐剂1：1乳化，乳化完背部皮下多点注射清洁级新西兰大白兔1mg/只；两周后进行二免，用弗氏不完全佐剂与蛋白1：1乳化，1mg/只；间隔两周后三免，也是蛋白与弗氏不完全佐剂1：1乳化，1mg/只。1周后采血分离血清，分装后冻-80℃保存。

2、Western blot鉴定

取实施例1中纯化后的蛋白和超声破碎后的pET32a沉淀100μL，加入上样缓冲液(5×)25μL，100℃煮沸5min，配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，按顺序加样用80V电压电泳30min，再调至120V电压电泳1h。然后用湿转法将胶转印到PVDF膜上，转印完成后5％脱脂奶常温封闭1h，PBST常温振荡洗涤3次，每次5min。然后使用1：5000倍稀释的兔抗hexon-L1的多克隆抗体作为一抗4℃摇床过夜孵育膜，5％脱脂奶1：5000倍稀释HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗37℃孵育1h，PBS洗涤5次，每次5min，后用ECL显色观察结果。

Western blot分析纯化后重组蛋白均能与FAdV-4阳性血清发生特异性反应，如图14、图15所示，在44.23kDa、65.45kDa和70.51kDa左右的位置有1条特异性条带。

3、间接ELISA检测多抗的效价

取实施例1中纯化的pET32a-hexon-L1、pET32a-fiber1和pET32a-fiber2蛋白用pH9.6的碳酸盐稀释至1μg/mL 4℃过夜包被96孔板，将多抗从10000ng/mL依次二倍稀释至19.5ng/mL，分别加入96孔板，37℃孵育1h，然后将二抗按1：10000稀释，37℃孵育40min，加入显色液作用15min后加终止液，用酶标仪在吸光度450nm处读数。

根据检测结果数据分析，在hexon-L1抗体浓度为39ng/mL时，OD值为0.4595，根据效价与OD值转换公式算出，hexon-L1抗体的效价达到了1:256000；fiber1抗体浓度为78.125ng/mL时，OD值为0.4396，效价为1:128000；fiber2抗体浓度为78.125ng/mL时，OD值为0.4179，效价为1:128000，具体如表2所示。

表2多抗效价检测结果

由表2可知，制备的三个多抗，hexon-L1的效价高于fiber1和fiber2。

实施例3

本实施例用于说明金标抗体(胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体)的制备及检测：

1、金标抗体的制备及纯化

(1)将预先处理干净的磁性搅拌粒子放入锥形瓶中，加入10mL40 nm的胶体金溶液，开启搅拌模式。滴加适量0.2mol/L K₂CO₃溶液调节溶液至pH8.0，混匀后加入实施例1中纯化的多抗，使其终浓度为10μg/mL，持续搅拌30min，使胶体金粒子与抗体充分结合。

(2)加入适量10％BSA溶液封闭未与胶体金粒子结合的抗体，持续搅拌20min，加入适量10％PEG-20000溶液，持续搅拌10min。

(3)将溶液等量分装于洁净的EP管中，然后4℃条件下离心，2000r/min，10min。离心后EP管底部有少量未结合的胶体金粒子，小心的吸取上层溶液至新的洁净EP管中，切勿触及底部沉淀。

(4)4℃条件下离心，9000r/min，30min，离心完全后吸取上清，保留沉淀。每管加入0.01mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液1mL，吹打混匀沉淀，4℃条件下离心，9000r/min，30min。

(5)离心后弃上清液，保留底部沉淀，每管加入0.01mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液1mL，轻柔的混匀沉淀。4℃条件下离心，9000r/min，30min，离心弃上清后留存的沉淀用100μL 0.01mol/L pH8.0的Tris-HCl混匀，4℃避光保存备用。

2、胶体金试纸条的预实验

2.1间接ELISA确定夹心抗体

用pH9.6的碳酸盐将纯化的hexon-L1、fiber1、fiber2蛋白稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96孔板，将多抗用生物素标记后从1000ng/mL依次二倍稀释至15.625ng/mL，分别加入96孔板，37℃孵育1小时，然后将二抗按1：10000稀释，37℃孵育40min，加入显色液作用15min后加终止液，用酶标仪在吸光度450nm处读数。

该三个抗体用生物素标记后用间接检测，结果显示标记后的抗体均可与酶标二抗形成抗原抗体复合物，三种抗体可以夹心检测到抗原，如表3所示。

表3：生物素标记多抗效价检测结果

抗体浓度(ng/mL)	hexon-L1 OD值	fiber1 OD值	fiber2 OD值
				1000	3.0427	2.5786	2.5579
500	2.5664	2.3302	2.3067
				250	2.3142	1.9478	1.9254
125	1.9351	1.1296	1.0987
				62.5	1.1105	0.7689	0.7456
31.25	0.7538	0.5013	0.4862
				15.625	0.4846	0.0678	0.0497
0	0.0359	0.0368	0.0349

由表3可知，在相同OD值下，标记后的抗体hexon-L1用量最少，fiber1和fiber2用量较多，所以后续选用hexon-L1抗体来进行胶体金试纸条的研发。

2.2双抗体夹心法初步配对及样品检测

将多抗用碳酸盐稀释为4μg/mL作为包被抗体，4℃过夜包被，用5％脱脂奶粉封闭两小时，将蛋白从500ng/mL依次二倍稀释至0.78125ng/mL，37℃温育2小时，加入1：1000倍稀释的生物素标记多抗作为检测抗体，37℃温育1小时，加入HRP标记的亲和素，37℃温育1小时，之后加入TMB，37℃温育20min后加入终止液终止反应，用酶标仪在450nm处读数。

检测所用的样本为临床采集的样本，其中，阳性样本1-2为SD202009和HuB SPF鸡胚增殖尿囊液，阳性样本3-5为临床阳性样本SPF鸡胚增殖尿囊液，阳性样本6-7为临床阳性病料组织研磨液；阴性样本1-2为SPF鸡胚尿囊液，阴性样本3-5为临床阴性样本组织研磨液。

经PCR检测后确定为阳性或阴性，然后用做待检阴、阳性样本，检测时，分别用阴、阳性样本原液按上述步骤进行实验。

实验结果如表4和表5所示。根据初步配对结果来看，OD值等于0.2时为蛋白最低检测浓度，双抗体夹心法初步配对表明制备的多抗对蛋白hexon-L1的识别力较好，最低蛋白检出量为31.25ng/mL。样本OD值>1判为阳性，检测结果表明该方法仅识别阳性样本，不识别阴性样本。

表4：蛋白双抗体夹心法检测结果

蛋白(ng/mL)	OD
		250	1.30605
125	0.67475
		62.5	0.36775
31.25	0.2096
		15.625	0.10375
0.78125	0.0905
		0	0.07235

表5：阴、阳性样本双抗体夹心法检测结果

实施例4

本实施例用于说明胶体金试纸条的制备：

1、胶体金与多抗最佳结合pH值的确定

取9管洁净的EP管置于EP管板中，每管加入等量(1mL)实施例3制备的胶体金溶液，其中8管分别加入1μL、3μL、5μL、7μL、9μL、11μL、13μL、15μL的0.2mol/L K₂CO₃溶液调节pH值，剩余1管作为空白对照。充分混匀后各管加入20μL纯化后的hexon-L1蛋白多抗，再次混匀后放入4℃冰箱静置15min。每管再分别加入100μL10％氯化钠溶液，混匀后放入4℃冰箱静置，待其充分反应3小时。用仪器检测OD值在400～700nm范围内的最大吸收波长和吸光值，出现最大吸收峰值所对应的pH即为最佳。

2、最佳抗体用量的确定

取9管洁净的EP管置于EP管板中，每管加入等量(1mL)的已制备好的胶体金溶液，用0.2mol/L K₂CO₃溶液调节至最佳pH值。依次加入等体积的不同浓度(5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL)纯化后的多抗，4℃条件下反应15min。每管再分别加入100μL 10％氯化钠溶液，混匀后放入4℃冰箱静置，待其充分反应3小时。用仪器检测OD值在400～700nm范围内的最大吸收波长和吸光值，出现最大吸收峰值所对应的抗体用量即为最佳。

多抗用40nm的胶体金颗粒在pH＝8.0的条件下标记，且标记好的多抗按浓度10μg/mL浸泡结合垫，效果最好。

3、结合垫、样品垫的预处理

将样品垫裁成18mm宽，浸泡在PBS缓冲液中10min，37℃烘干，2～8℃干燥存放，备用。

4、胶体金结合垫制备及抗体喷涂

将所述胶体金结合垫裁剪后，将浓度为10μg/mL胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体浸泡结合垫10min，冷冻抽干机抽干，2～8℃干燥保存；多克隆抗体制成1.5mg/mL、羊抗兔IgG制成1mg/mL，喷涂在硝酸纤维素(NC)膜上，置37℃烘箱烘干，2～8℃干燥保存。

5、免疫胶体金测试条的组装

将样品垫、胶体金结合垫、NC膜、吸收垫按从上到下依次固定于PVC底板上，裁切成18mm宽的试纸条，装入塑料外壳中，再与于燥剂一起装入铝箔袋内，密封室温贮存。

实验例1

本实验例用于说明实施例4制备得到的胶体金试纸条的敏感性：

将原液浓度为10^5.095EID₅₀的FAdV-4的病毒液分别按照1：0、1：10、1：20、1：40、1：60、1：70、1：80比例稀释，稀释后的样品分别加入胶体金检测卡的加样孔，静置6min观察结果。

实验结果如图16所示(第一排从右到左依次为原比例、1：10、1：20、1：40，第二排从右到左依次为1：60、1：70、1：80、阴性)，试纸条在FAdV-4病毒液稀释1：70后在质控线和检测线均出现红色条带，表明本发明实施例的试纸条具有良好的敏感性。

实验例2

本实验例用于说明实施例4制备得到的胶体金试纸条的特异性：

将实验室保存的传染性喉气管炎病毒、传染性贫血病病毒、白血病病毒等不同禽类病毒样品，离心后取上清液，取胶体金试纸条分别浸入病毒液中，当C线显色时，取出试纸条，静置6min后观察结果。

实验结果如图17所示(试纸条由上到下浸入的病毒液依次为禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性贫血病病毒、白血病病毒、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、马立克病毒、PBS、FAdV-4)，只有浸入FAdV-4病毒液的试纸条T线和C线同时出现红色条带，浸入其他病毒液的试纸条只有C线出现红色，另外，浸入血清8型禽腺病毒也只有C线出现条带，表明本发明实施例的试纸条具有良好的特异性。

实验例3

本实验例用于说明实施例4制备得到的胶体金试纸条的稳定性：

制备不同批次的胶体金试纸条，将FAdV-4的病毒液原液分别加至试纸条上，静置6min后观察T线和C线是否显色。

实验结果如图18所示，不同批次制备的胶体金试纸条在滴加或浸入FAdV-4病毒液原液时，T线和C线均出现红色条带，表明该试纸条的质量稳定。

实验例4

本实验例用于说明实施例4制备得到的胶体金试纸条的临床检测：

胶体金试纸条检测显示47份临床病料，其中34份样品为阳性，13份样品为阴性，PCR检测有33份样品为阳性，14份样品为阴性。与PCR检测结果的符合率为97.87％，表明该试纸条可用于临床样本的检测。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，

所述胶体金试纸条包括从上到下依次固定于底板上的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜上设置有T线和C线；

所述胶体金结合垫上负载有胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体，所述hexon-L1多克隆抗体由含有血清4型禽腺病毒hexon-L1基因片段的重组质粒表达得到的融合蛋白免疫动物获得；

所述T线内包被有hexon-L1多克隆抗体；所述C线内包被有羊抗兔IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，

所述胶体金结合垫负载所述胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的负载量为0.01～0.5μg；优选为0.1μg；

所述C线内包被所述羊抗兔IgG抗体的包被量为2～10μg，优选为5μg；

所述T线内包被hexon-L1多克隆抗体的包被量为5～15μg，优选为7.5μg。

3.根据权利要求2所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，

所述胶体金结合垫负载所述胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的浓度为5～20μg/mL，优选为10μg/mL，负载所述胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的体积为10μL；

所述C线内包被所述羊抗兔IgG抗体的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL；包被所述羊抗兔IgG抗体的体积为5μL；

所述T线内包被所述hexon-L1多克隆抗体的浓度为1～3mg/mL，优选为1.5mg/mL；包被所述hexon-L1多克隆抗体的体积为5μL。

4.根据权利要求2或3所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，所述胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体的制备方法包括：

取30nm～50nm胶体金溶液，调整pH至7.8～8.2，加入hexon-L1多克隆抗体，使hexon-L1多克隆抗体的终浓度为5～15μg/mL、优选为10μg/mL，混匀，封闭，经纯化后获得所述胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，所述hexon-L1多克隆抗体的制备方法为：

S1、扩增血清4型禽腺病毒hexon-L1基因序列；

6.根据权利要求5所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，所扩增的hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

进行扩增采用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求5所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，在S3中，用0.004～0.012mM、优选为0.008mMIPTG进行诱导表达，诱导的时间为3～5小时，优选为4小时。

8.根据权利要求5所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡，其特征在于，S4包括：将纯化的融合蛋白和弗氏完全佐剂1：1乳化，乳化完背部皮下多点注射清洁级新西兰大白兔1mg/只；两周后进行二免，用弗氏不完全佐剂与融合蛋白1：1乳化，1mg/只；间隔两周后三免，融合蛋白与弗氏不完全佐剂1：1乳化，1mg/只；1周后采血分离血清，经纯化后得到所述hexon-L1多克隆抗体。

9.如权利要求1～8任一项所述的血清4型禽腺病毒胶体金检测卡的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

S1、将所述样品垫裁剪后，浸泡于缓冲液中，烘干；

S2、将所述胶体金结合垫裁剪后，浸泡于浓度为5～20μg/mL的胶体金标记的hexon-L1多克隆抗体中，干燥；

S3、将1～3mg/mL的hexon-L1多克隆抗体、0.5～2mg/mL的羊抗兔IgG抗体分别喷涂在所述NC膜上T线、C线处，干燥；

10.一种hexon-L1多克隆抗体，其特征在于，所述hexon-L1多克隆抗体由含有血清4型禽腺病毒hexon-L1基因片段的重组质粒表达得到的融合蛋白免疫动物获得；hexon-L1基因片段的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。