CN115969839A - 金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用，属于医药技术领域。对于用肌球蛋白重链‑α肽引起的大鼠和小鼠自身免疫性心肌炎，注射金合欢素水溶性前药或口服金和欢素能够显著抑制免疫性心肌炎症，改善左心室功能；这种功效是通过金合欢素抑制心脏特异性自身反应性CD4+T淋巴细胞活化、增殖和Th17细胞分化，降低CD4+T细胞线粒体复合物II活性，从而抑制CD4+T细胞中的线粒体呼吸和线粒体活性氧簇产生，抑制心肌炎症反应应答和心肌YAP/TAZ表达，并抑制后续迟发性心肌纤维化。实验结果表明金合欢素和金合欢素水溶性前药能够用于治疗和/或预防人类免疫性心肌炎，具有开发为临床防治免疫性心肌炎药物的潜能。

Description

金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药 物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用。

背景技术

免疫性心肌炎是一种多态性的、多由于感染引起的免疫介导的心脏肌肉炎症。心肌炎是一种以心肌细胞坏死和炎性细胞浸润为特征的自身免疫性炎症性疾病，是青少年猝死的常见原因，通常可发展为扩张性心力衰竭，导致不良预后。

对免疫性心肌炎在临床没有特殊治疗，通常是支持性常规治疗，包括皮质类固醇治疗、心脏药物如β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、低盐饮食、利尿治疗以治疗液体过载、抗生素治疗预防细菌感染等。最近的研究表明，心脏特异性自身反应性CD4+T细胞在心肌炎发病机制中起着重要作用，其中反应性效应CD4+T是导致心肌损伤和扩张性心衰进展的主要驱动因素，如产生IL-17的Th17细胞。效应CD4+T细胞通过促进病毒复制、细胞因子分泌、髓细胞浸润和心肌纤维化而加剧心肌炎。因此，靶向抑制CD4+T细胞活化可能对开发新型心肌炎治疗方法至关重要。

大多数情况下，免疫性心肌炎会自发消退，但在易感人群中，免疫性心肌炎会发展到慢性阶段最终导致病理性心脏重塑。病理重塑包括组织纤维化、肥大和心肌细胞凋亡并导致收缩力受损的扩张性心衰。

金合欢素广泛存在于多种天然植物中，具有抗氧化、抗炎和抗增殖的作用。研究还表明，金合欢素改构后形成的水溶性前药在比格犬、小鼠和大鼠体内均可直接转化为金合欢素发挥药理效应。这样不但直接有效提高金合欢素在体内的利用率，还使得金和欢素能够临床注射给药用于救治急症病人(参见Water-soluble acacetin prodrug conferssignificant cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.ScientificReports.DOI:10.1038/srep36435.以及Synthesis of ahighly water-soluble acacetinprodrug for treating experimental atrial fibrillation in beagle dogs CN115337300A.Scientific Reports.DOI:10.1038/srep25743)。中国专利CN112423726A公开的“保护细胞免受氧化和线粒体应激影响的组合物”中虽然涉及金合欢素这一组分，组合物治疗的疾病涉及与炎症性皮肤病相关的皮肤状况，但是金合欢素及其水溶性前药对于免疫性心肌炎的治疗作用和机制均未见到有相关的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用，为防治免疫性心肌炎提供新的治疗药物。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用。

优选地，所述免疫性心肌炎为由不同感染或非感染性疾病引起的免疫反应所致的心肌炎。

进一步优选地，所述感染由病毒、细菌或霉菌引起。

优选地，所述非感染性疾病由全身性自身免疫疾病、疫苗或药物引起。

优选地，所述免疫性心肌炎的症状包括左心室压降低、左心室肥大、左心室扩张、左心室收缩功能降低、左心室舒张功能降低或心衰。

优选地，金合欢素抑制心肌炎免疫应答的靶点包括CD4+T细胞的线粒体能量代谢。

优选地，金合欢素通过降低线粒体复合物II活性，抑制CD4+T细胞中的线粒体呼吸功能、能量代谢和免疫应答反应，抑制CD4+T淋巴细胞活化、增殖和Th17细胞分化，进而抑制YAP、TAZ或MST1活力和表达，抑制心脏炎性反应、纤维化和心功能损害，改善扩张性心衰的心脏重塑和心室扩张来防治免疫性心肌炎。

进一步优选地，金合欢素抑制CD4+T细胞的线粒体能量代谢的方式为：通过降低线粒体呼吸储备，从而限制T细胞激活能量。

优选地，金合欢素抑制CD4+T细胞活化与抑制CD4+T细胞线粒体ROS生成和线粒体膜电位有关。

优选地，金合欢素抑制CD4+T细胞活化、增殖和Th17细胞分化与降低细胞周期、电子运输和脂肪酸β氧化相关基因表达，从而影响CD4+T细胞的细胞周期、线粒体呼吸和脂质代谢。

优选地，小鼠口服灌胃金合欢素或金合欢素水溶性前药的剂量为5～100mg/kg。

优选地，金合欢素通过抑制迟发性炎症介质的激活和释放来防治免疫性心肌炎。

优选地，所述药物的给药方式为皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服或喷雾吸入。

优选地，所述免疫性心肌炎的动物模型由皮下注射心肌特异性α-MHC诱导形成。

优选地，所述金合欢素水溶性前药为脂溶性分子金合欢素经改构后形成，金合欢素水溶性前药通过在体内转化为金合欢素发挥药理效应。

本发明还公开了金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎并发症药物中的应用。

本发明还公开了一种防治免疫性心肌炎的药物，以金合欢素或金合欢素水溶性前药作为主要成分。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用，通过皮下注射α-MHC诱导形成大鼠和小鼠心脏免疫性炎症模型，给予模型动物金合欢素水溶性前药皮下注射或口服灌胃金和欢素并观察疗效，发现金和欢素限制免疫性心肌炎、抑制心肌重朔、改善受损的心脏功能。通过实验明确了金合欢素治疗免疫学心肌炎的关键机制：通过影响心脏特异性CD4+T细胞线粒体复合物II活性来抑制CD4+T细胞线粒体呼吸和能量代谢功能，从而抑制CD4+T细胞活化，细胞周期和Th17细胞分化。抑制心肌免疫应答和炎性反应，限制免疫性心肌炎，下调心肌纤维化相关蛋白YAP、TAZ和MST1表达，抑制心肌重朔、左心室肥厚和扩张，从而起到改善受损的心脏功能的治疗效果，能够为防治免疫性心肌炎提供新治疗策略，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为金合欢素和金合欢素水溶性前药的化学结构图；

图2为金合欢素前药改善免疫性心肌炎大鼠心功能损害实验结果图；其中，A：给药方案：在第0天和第7天皮下注射α-MHC乳剂，并在实验第0天至第21天皮下注射不同剂量金合欢素前药或溶媒，B：大鼠血流动力学指标检测结果，b1为左心室内压，b2为左心室最大收缩速率，b3为心电图，C：不同实验组心率均值(n＝6-7)，D：不同实验组平均血压均值，E：不同实验组左心室收缩压均值，F：不同实验组左心室收缩最大速率(n＝6-7)均值，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析进行分析；

图3为在另一批免疫性心肌炎大鼠模型，金合欢素前药改善心肌炎大鼠心功能受损的实验结果图；其中，A：在第0天和第7天皮下注射α-MHC，并在实验第0天至第21天皮下注射生理盐水(心肌炎溶媒组)或金合欢素前药组(10mg/kg，b.i.d.)大鼠代表性超声心动图，B：对照组、心肌炎溶媒组和心肌炎金和欢素治疗组大鼠左心室超声心动图射血分数均值(n＝15)，C：不同实验组大鼠左心室超声心动图左心室轴缩短率均值，D：不同实验组心脏指数均值(n＝15)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析进行分析；

图4为金和欢素前药抑制免疫性心肌炎大鼠心肌炎性反应和心肌纤维化的实验结果图；其中，A：用于分析大鼠心室切片炎症评分的代表性HE染色图像(比例尺＝50μm)，B：大鼠心肌组织炎症评分均值(n＝9-10)，C：大鼠心室切片Masson染色代表性图像(比例尺＝50μm)，显示心肌纤维化程度，D：大鼠心肌定量分析心肌纤维化面积百分比均值(n＝10-11)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析进行分析，然后进行Tukey检验；

图5为金和欢素前药抑制心肌炎大鼠心肌炎性相关蛋白激活的实验结果图；其中，A：各组大鼠心肌TNF-α蛋白激活结果，a1为蛋白印迹，a2为相对TNF-α水平(n＝5-6)，B：各组大鼠心肌TLR4蛋白激活结果，b1为蛋白印迹，b2为相对TLR4水平(n＝4)，C：各组大鼠心肌NK-κB蛋白激活结果，c1为蛋白印迹，c2为相对NK-κB水平(n＝4-6)，D：各组大鼠心肌IFN-γ蛋白激活结果，d1为蛋白印迹，d2为相对IFN-γ水平(n＝4)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析进行分析，然后进行Tukey检验；

图6为金和欢素抑制心肌炎大鼠心肌纤维化蛋白激活的实验结果图；其中，A：对照、心肌炎模型(溶媒)和心肌炎金和欢素(10mg/kg)治疗的大鼠心肌YAP蛋白激活实验结果，a1为YAP蛋白和GAPDH代表印迹，a2为相对YAP水平(n＝4)，B：不同实验组大鼠心肌TAZ蛋白激活实验结果，b1为TAZ代表蛋白印迹，b2为相对TAZ水平(n＝4)，C：不同实验组大鼠心肌MST1蛋白激活实验结果，c1为MST1代表蛋白印迹，c2为相对MST1水平(n＝6)，D：不同实验组大鼠心肌胞浆和细胞核蛋白激活实验结果，d1为TAZ，GAPDH，Histone代表蛋白印迹，d2为相对肌胞浆TAZ水平(n＝4)，d3为相对细胞核TAZ水平(n＝4)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析进行分析，然后进行Tukey检验；

图7为金合欢素减轻心肌炎小鼠的心肌损伤的实验结果图；其中，A：给药方案：在第0天和第7天皮下注射α-MHC，并在实验第0天至第21天口服灌胃金合欢素(100mg/kg/天)或溶媒，B：对照组小鼠、心肌炎溶媒组小鼠和心肌炎金合欢素治疗小鼠代表性超声心动图图像，C：超声心动图测量的小鼠左心室各项指标，c1为EF的百分值(n＝5-7)，c2为FS的百分值(n＝5-7)，D：对照小鼠、心肌炎溶媒组小鼠和心肌炎金合欢素治疗小鼠代表性心脏图像(比例尺＝5mm)，E：HW/BW比值(n＝11-12)，F：用于分析小鼠心室切片炎症评分的代表性HE染色图像(比例尺＝50μm)，G：小鼠心肌组织炎症评分均值(n＝11-12)，H：小鼠心室切片Masson染色代表性图像(比例尺＝50μm)，I：小鼠心肌定量纤维化面积百分比均值(n＝11)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析进行分析，然后进行Tukey检验或Kruskal-Wallis的Dunn多重比较检验*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图8为金合欢素降低心肌炎小鼠的炎性细胞因子或活化的炎性免疫相关细胞图；其中，A：从左到右，从上到下分别为对照组小鼠、心肌炎溶媒组小鼠和金合欢素心肌炎小鼠心室组织中Il1b、Il6、Tnf、Ccl3、Ccl5、Ifng、Il17a、Il17f基因表达均值(相对于GAPDH，n＝5-6)，B：CD4+T细胞相关指标，b1为代表性CD4+T细胞流式图(n＝5-12)，b2为小鼠脾脏细胞中效应CD4+T淋巴细胞(n＝5-7)百分值，b3为小鼠脾脏细胞中

CD4+T百分值，C：Th17细胞相关指标，c1为Th17细胞流式图(n＝5-7)，c2为小鼠脾脏细胞中Th17细胞百分值，D：巨噬细胞相关指标，d1为巨噬细胞流式图，d2为小鼠脾脏细胞中巨噬细胞百分值，E：Ly6C单核细胞相关指标，e1为Ly6C单核细胞流式图，e2为Ly6C单核细胞百分值，F：中性粒细胞相关指标，f1为中性粒细胞流式图，f2为中性粒细胞百分值，数据为平均值±标准差，并采用单向方差分析，然后进行Tukey检验分析*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图9为金合欢素体外抑制T细胞活化、增殖和Th17细胞分化的实验结果图；其中，A：不同浓度金合欢素持续孵育后细胞CD44；a1为细胞流式图，a2为增殖百分值，B：不同浓度金合欢素持续孵育后细胞CD25，b1为细胞流式图，b2为增殖百分值，C：不同浓度金合欢素持续孵育后细胞CFSE，c1为细胞流式图，c2为增殖百分值，D：不同浓度金合欢素持续孵育后细胞Th17(表达IL-17A)，d1为细胞流式图，d2为增殖百分值，测定是在没有或存在不同浓度金合欢素孵育72小时，在体外用抗CD3/CD28激活的

CD4+T细胞进行(n＝3)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析，然后进行Tukey检验分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001或****P<0.0001vs.溶媒(0μM金合欢素)；

图10为用RNA-seq揭示金合欢素孵育CD4+T细胞的转录变化结构图；其中，A：在0(溶媒)，5或10μM金合欢素(acacdtin)孵育72小时，用抗CD3/CD28孵育激活的

CD4+T细胞总基因表达的主成分分析(PCA)图，B和C：基因表达差异的火山图(5vs.0μM金合欢素)(B)和(10μM vs.0μM金合欢素)(C)，点的颜色对应于(-log10 q.值)的大小，并且标记(-log10q.value)前20位的基因，D和E：使用GSEA算法的分子特征数据库(MSigDB)中的c2(c2.cp.v7.5.1.symbols.gmt)分析5vs.0μM金合欢素(D)和10vs.0μM金合欢素(E)，F：线粒体呼吸电子传递途径(5vs.0μM金合欢素)，f1为GSEA图，f2为基因表达热图，G：DNA复制，g1为GSEA图，g2为基因表达热图，H：脂肪酸生物氧化途径(10μM vs.溶媒(0μM金合欢素)，h1为GSEA图谱，h2为基因表达热图；

图11为金合欢素抑制CD4+T细胞线粒体呼吸速率、ROS产生和膜电位的实验结果图；其中，A：细胞在用0、5或10μM金合欢素孵育48小时后，测定抗CD3/CD28抗体激活的

CD4+T细胞耗氧率(OCRs)，a1为细胞耗氧率，a2为基础呼吸，a3为最大呼吸，a4为储备呼吸能力，a5为ATP产生，B：金合欢素对mROS产生的影响，b1为加载MitoSOX的细胞线粒体ROS流式细胞图，b2为细胞线粒体ROS水平均值，C：金合欢素对线粒体膜电位的影响，c1为加载JC-1的细胞流式细胞图，c2为细胞线粒体膜电位均值，D：加载mitoTracker细胞结果，d1为细胞流式图，d2为细胞线粒体质量水平均值(n＝3-4)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析，然后进行Tukey检验分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图12为分子对接分析金合欢素与线粒体复合物II的相互作用结果图；其中，A：由Autodock Vina计算的金合欢素与线粒体复合物II的三种最低结合构象，分别用黄色、紫色和青色表示，B：金合欢素(红色)与线粒体复合物II(蓝色)的氨基酸残基位点结合，C：在用抗CD3/CD28抗体激活的

CD4+T细胞检测复合物II活性，并用5或10μM金合欢素孵育48h(n＝5)，D：在没有或存在高度特异性的线粒体复合物II抑制剂Atpenin A5(1或2μM)孵育72h，用抗CD3/CD28抗体活化的

CD4+T细胞，测定CD44细胞和CFSE细胞的流式细胞图和百分值(n＝4)，d1为CD44细胞流式细胞图，d2为CD44细胞百分值，d3为CFSE细胞的流式细胞图，d4为CFSE细胞百分值，E：在用抗CD3/CD28活化的

CD4+T细胞测定CD44细胞和CFSE细胞的流式细胞图和百分比值，并在5或10μM金合欢素(Acacetin)存在和有或无DES处理72h(n＝4)，e1为CD44细胞流式细胞图，e2为CFSE细胞流式细胞图，e3为CD44细胞百分比值，e4为CFSE细胞百分比值，数据表示为平均值±标准差，并用单向ANOVA进行分析，然后进行Tukey检验(C和D)或双向ANOVA，然后进行Bonferroni检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图13为金合欢素治疗性口服灌胃给药改善心肌炎小鼠扩张性心衰进展的实验结果图；其中，A：动物实验方案：在第0天和第7天皮下注射α-MHC，并在实验第7天至第21天给予金合欢素(100mg/kg/天)或溶媒。B：对照组小鼠、心肌炎溶媒小鼠和心肌炎金合欢素治疗小鼠超声心动图分析的左心室各项指标的平均值(n＝8-10)，b1为EF％，b2为FS％，b3为LVESD，b4为LVEDD，C：不同实验组小鼠代表性心脏图像(比例尺＝5mm)，D：HW/BW比值均值，E：不同实验组小鼠心肌切片Masson染色(比例尺＝50μm)代表性图像，F：不同实验组小鼠左心室纤维化百分值(n＝8-10)，数据表示为平均值±标准差，并用单向方差分析和Tukey检验进行分析*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明采用金合欢素水溶性前药和口服金和欢素治疗免疫性心肌炎，由于金合欢素水溶性前药在体内可以转化为金合欢素，因此在对给予金合欢素水溶性前药后的的模型的相关疗效进行评估的同时，阐明体内转化形成的金合欢素在治疗免疫性心肌炎的作用机制。

1.研究材料和实验动物分组

1)免疫性心肌炎药物制备：金合欢素和水溶性金合欢素前药的结构如图1所示，在比格犬、小鼠和大鼠体内可直接转化为金合欢素。参照文献(文献：Water-solubleacacetin prodrug confers significant cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.Scientific Reports.DOI:10.1038/srep36435，以及Synthesis ofa highly water-soluble acacetin prodrug for treating experimental atrialfibrillation in beagle dogs.Scientific Reports.DOI:10.1038/srep25743)将金合欢素水溶性前药溶解于无菌生理盐水中，配制成40mg/mL浓度的注射液。

2)实验动物：实验用Lewis雄性大鼠(200～220g)和7周龄雄性BALB/c小鼠进行不同参数检测，动物从SPF生物技术有限公司(北京)购买获得，并在同济医学院的SPF设施中进行维护。动物实验方案经华中科技大学同济医学院动物护理委员会批准。实验程序遵循欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令的指南。

3)自身免疫性心肌炎模型：心脏特异性α-肌球蛋白重链肽(α-MHC)是最常用的建立自身免疫性心肌炎模型的试剂。将2mgα-MHC(上海GL生化公司)溶解在盐水中，并以1:1的比例与完全弗氏佐剂乳化。在Lewis大鼠，实验第0天和第7天，皮下注射1mL上述α-MHC乳剂到Lewis大鼠体内，建立免疫性大鼠心肌炎模型。而在BALB/c小鼠，实验第0天和第7天，皮下注射0.2mL上述α-MHC乳剂到小鼠体内，建立免疫性小鼠心肌炎模型。

4)实验分组：实验动物分为对照组、心肌炎模型组(溶媒组)和心肌炎药物治疗组。

在Lewis大鼠心肌炎模型，研究注射金合欢素水溶性前药对免疫性心肌炎的治疗作用，用直接心室内插管检测大鼠血流动力学变化，用超声心动图(echocardiography)检测心功能，并检测心肌组织学炎性反应、纤维化以及心肌组织炎性及纤维化相关蛋白的变化。在心肌炎模型组和心肌炎药物治疗组的Lewis大鼠，药物治疗组大鼠皮下注射不同剂量(5，10或20mg/kg，b.i.d.)金和欢素前药(简称金合欢素)3周，以观察金合欢素治疗免疫性大鼠心肌炎效果；而对照组和心肌炎模型组大鼠皮下注射等容量生理盐水。

在BALB/c小鼠心肌炎模型，研究口服金合欢素对免疫性心肌炎治疗作用，用超声心动图检测心功能、组织学方法检测心肌炎性反应和纤维化状况，用生物化学方法检测心肌免疫炎性反应相关基因以及相关免疫细胞变化。在心肌炎模型组和心肌炎药物治疗组的BALB/c小鼠进行心肌炎造模的基础上，心肌炎药物治疗组小鼠用金和欢素与羟丙基-β-环糊精的悬浮液灌胃(100mg/kg/天)2周或3周，而对照组和心肌炎模型组小鼠灌胃等容量羟丙基-α-环糊精溶液。

5)大鼠血流动力学指标检测：用戊巴比妥(30mg/kg腹膜内注射)将各组Lewis大鼠麻醉并固定，然后气管插管、人工通气。用温度控制系统将大鼠体温维持在37℃。将充满0.5％肝素生理盐溶液连接压力换能器的聚乙烯导管(0.8mm外径)，插入大鼠左侧颈总动脉，测量动脉血压后，引入左心室以测量收缩功能(例如左心室收缩压LVSP，LV+dP/dT)血流动力学指标，这些生理指标以及体表心电图ECG用成都仪器厂多道电生理记录仪(RM6240E)记录。

6)超声心动图：使用Vevo 1100超声系统(Visual Sonics，多伦多，加拿大)进行超声心动图检查，以评估用1.5％异氟烷麻醉的大鼠或小鼠的心脏功能，获得心室中短轴和胸骨旁长轴的二维视图分析。使用Vevo LAB软件分析大鼠或小鼠心脏功能EF％和FS％。

7)组织病理学检测：超声心动图测定后，动物在麻醉状态下，分离取出心脏。将各组大鼠或小鼠的心室组织固定在4％福尔马林中，并用石蜡包埋，制作左心室切片。传统苏木精/伊红染色(HE)和Masson三色染色分别用于确定心肌炎症和纤维化状况。使用0～4级方法对炎症进行评分。通过Image Pro Plus软件测量心肌纤维化，作为切片上蓝色染色面积的比例。采用两个独立人员评估切片，对切片进行编码以限制潜在的偏差。

8)蛋白质印迹分析：对大鼠心肌不同蛋白的蛋白质印迹分析，用冰冷的RIPA缓冲液将得到的大鼠缺血区域心脏组织样品匀浆化。使用Bio-Rad蛋白测定(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)，确定蛋白浓度。将50μg蛋白与样品缓冲液混合，并通过加热至95℃保持5min进行变性。蛋白在10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至硝酸纤维素膜。

将硝酸纤维素膜首先用5％脱脂奶在0.1％含吐温的Tris-缓冲盐水(TTBS)中的溶液封闭2小时，然后用第一抗体在4℃探测过夜。TTBS洗涤3次以后，将硝酸纤维素膜与第二抗体在TTBS中一起在室温温育2小时。将硝酸纤维素膜再用TTBS洗涤3次，然后使用化学发光检测系统(ECL，GE Healthcare)在X-射线胶片上显影。为了排除蛋白负载的差异，以探测持家蛋白GAPDH作为内参。通过定量扫描光密度计图像软件(Image J)，测量靶印迹的强度。将金合欢素组中的靶印迹强度相对于媒介物组中的相同印迹进行比较，并将靶蛋白印迹的相对强度用于定量和统计分析。

9)T淋巴细胞分离和培养：采用

CD4+T细胞分离试剂盒(加拿大温哥华STEMCELL)，从正常小鼠的脾脏和淋巴结中分离

CD4+T细胞，并用预涂有抗小鼠CD3或CD28(均为5μg/mL，Biolegend，San Diego，CA，USA)的平板培养2～4小时。

CD4+T细胞在含有10％ FBS(加拿大温哥华Sciencell)、2mM L-谷氨酰胺(美国纽约Gibco)、0.1mM非必需氨基酸(美国Gibco)、1％青霉素/链霉素(Servicebio，中国武汉)和55μMβ-巯基乙醇(美国纽约吉博)的IMDM培养基中孵育。对于Th17细胞分化，向培养基中加入50ng/mL IL-6、2.5ng/mL TGF-β、5μg/mL抗IFN-γ和5μg/mL抗IL-4(Biolegend，SanDiego，CA，USA)。在不存在或存在琥珀酸二甲酯(DES，5mM)和线粒体复合物II抑制剂Atpenin A5(1和2μM)的情况下，用二甲亚砜(DMSO)溶解金和欢素，并在培养开始时将其添加到培养基中。在培养的第二天或第三天通过流式细胞术检测荧光。

流式细胞术：流式细胞术用于通过用不同抗体或荧光孵育或染色来分析细胞群。在染色之前，将单细胞悬浮液与抗CD16/32抗体(Biolegend，San Diego，CA，USA)孵育，以阻断与Fc受体的非特异性结合。将细胞在4℃下孵育30分钟以进行表面染色。对于细胞内细胞因子染色，在表面染色之前，将细胞与刺激/阻断混合物孵育4小时，并在用固定/渗透试剂盒处理后进行细胞因子染色。

使用以下抗体：FITC抗CD45、APC-Cy7抗CD11b、Brilliant Violet 421抗Ly6C、PE抗CD44、PE抗F4/80、APC抗Ly6G、APC抗CD62L、APC抗-CD25、PE抗IL-17A和Zombie AquaFixable Viability Kit(Biolegend，San Diego，CA，USA)。

对于CFSE染色，细胞在孵育前用1.25μM CFSE(Biolegend，San Diego，CA，USA)孵育10分钟。对于线粒体活性氧(mROS)测定，将培养的细胞与5μM MitoSOX(Invitrogen，Carlsbad，USA)孵育30分钟，将培养的细胞与5μM mitoTracker(Invitrogen，Carlsbad，USA)孵育30分钟。通过流式细胞术测量荧光。

实时定量PCR(RT-qPCR)：使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，USA)提取小鼠心肌组织总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒(Vazyme，中国南京)逆转录1000ng RNA以生成cDNA。实时定量PCR过程中用到的引物的序列参见表1，使用2-ΔΔCT方法进行数据分析。在Bio-Rad CFX CONNECT检测系统中，使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国南京)对扩增的特异性cDNA进行定量。

表1用于RT-qPCR的引物序列

RNA序列分析：根据制造商的方案，在第3天使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，USA)从培养的CD4+T细胞中分离总RNA。使用TruSeqTM RNA样品制备试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备文库。使用SuperScript双链cDNA合成试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，然后使用Illumina HiSeqxten/NovaSeq 6000进行测序。

使用Hisat2检查原始和修剪Fastq读数的质量。使用Stringtie工具修剪原始数据。R包“DESeq2”用于分析两组之间差异表达的基因。折叠变化绝对值>1.5和调整后p值<0.05的基因被认为是差异表达的。R包“clusterProfile”用于使用分子签名数据库(MSigDB)中的c2(c2.cp.v7.5.1.symbols.gmt)实现GSEA算法，以分析两组之间的路径变化。所有测序数据均可通过NCBI GEO数据库获取，登录号为(GSE221244，安全令牌：ghmniomnlnlndet)

分子对接：从PUBCHEM数据库中获得金和欢素化合物名称、分子量和三维(3D)结构。从蛋白质数据库(复合物I:5XTD，复合物II:3AEF，复合物III:5XTE，复合物IV:5Z62，复合物V:6J5J)获得复合物I-V的3D结构。随后，使用AutoDock-Vina软件制备分子对接所需的配体和蛋白质(http://vina.scripps.edu/)。最后，利用AutoDock工具和PyMOL对对接结果进行分析。通过亲和性(kcal/mol)值评估金和欢素和复合物I-V的结合能力。

10)海马线粒体呼吸速率测定：线粒体呼吸速率通过线粒体压力测试试剂盒和海马生物科学XF24细胞外通量分析仪(购自美国加利福尼亚圣克拉拉市)进行评估。将细胞接种到海马XF24孔培养板(每孔500000个细胞)中。然后将测定培养基(补充有10mM葡萄糖、1mM丙酮酸盐、2mM谷氨酰胺和5mM HEPES)在37℃的无CO₂培养箱中稳定1小时。基线测量后，依次加入寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A以检测耗氧率。

2.实验结果

1)金和欢素前药改善免疫性心肌炎大鼠的心脏功能障碍：在用心脏特异性α-MHC皮下注射建立的心肌炎大鼠模型(图2中A)，研究了金和欢素前药(5，10或20mg/kg，s.c.,b.i.d.)对心肌炎的保护作用。大鼠血流动力学指标检测结果如图2中B显示，代表性心肌炎大鼠左心室收缩压(LVSP)和左心室收缩速率(LV+dP/dT_max)显著降低，心电图(ECG)ST段显著抬高，然而在应用金和欢素10mg/kg的心肌炎大鼠中，降低的左心室收缩压和左心室收缩速率，以及抬高的心电图ST段得到显著改善。在心肌炎溶媒组大鼠的检测结果中，心率(HR，图2中C)和平均血压(MAP，图2中D)降低，LVSP(图2中E)和LV+dP/dT_max(图2中F)严重受损(n＝6-7，P<0.01)，金和欢素剂量依赖性地增加降低的心率和平均血压，提升受损的心脏功能(即增加LVSP和LV+dP/dT_max)(n＝6-7，P<0.05或P<0.01)，说明金和欢素能显著改善免疫性心肌炎引起的心率和血压降低和心功能损害。

2)在另一组心肌炎大鼠，采用超声心动图分析不同实验组大鼠心脏功能(图3中A)，心肌炎溶媒组大鼠左心室射血分数百分数(EF％)(图3中B)和左心室短轴缩短率百分数(FS％)(图3中C)显著降低(n＝15，P<0.01)，而心脏指数显著增加(图3中D)(n＝15，P<0.01)；然而，在皮下注射给予金和欢素前药(10mg/kg，s.c.，b.i.d.)的心肌炎大鼠，降低的左心室射血分数百分数和左心室短轴缩短率百分数，增加的心脏指数也得到改善(P<0.05)。这些结果进一步证明金和欢素显著改善免疫性心肌炎心脏功能。

3)金和欢素前药改善心肌炎大鼠心肌损伤：HE染色显示心肌炎大鼠心肌有显著炎性细胞浸润(图4中A)，这种心肌炎炎性细胞浸润严重程度(图4中B，n＝10，P<0.01)，在用10mg/kg治疗的心肌炎大鼠心肌得到显著改善(图4中B，n＝9)。Masson染色揭示心肌炎大鼠心肌显著纤维化(图4中C)，用10mg/kg治疗的心肌炎大鼠心肌纤维化得到显著改善(图4中D，n＝9，P<0.01)。这些结果说明金合欢素改善心肌炎心脏功能损害可能与抗炎和抑制心肌纤维化有关。

4)金和欢素前药改善心肌炎大鼠心肌损伤的分子机制：图5显示炎性相关蛋白TNF-α，TLR4，NF-κB，IFN-γ在心肌的表达，心肌炎大鼠心肌TNF-α(图5中A)，TLR4(图5中B)，NF-κB(图5中C)，IFN-γ(图5中D)显著升高(n＝4-6，P<0.01)，升高的炎性相关蛋白被金合欢素(5，10和20mg/kg)浓度依赖性的降低(P<0.05或P<0.01)。这些结果说明心肌炎炎性细胞浸润与这些炎性相关蛋白表达增加有关，金合欢素显著下调这些炎性蛋白的表达。

已经证明YAP/TAZ作为细胞微环境的结构和机械特征的传感器，在组织纤维化过程中被异常激活；此外，MST1激活参与心肌纤维化、过度炎症反应和心肌细胞死亡。因此，我们测定了心肌组织YAP，TAZ和MIST1的蛋白表达。图6显示YAP，TAZ和MIST1在心肌炎心肌显著增加(n＝4-6，P<0.01vs.对照)，在金合欢素(10mg/kg)治疗的心肌炎大鼠心肌，升高的YAP(图6中A)，TAZ(图6中B)和MIST1(图6中C)被显著逆转(P<0.01或P<0.05vs.溶媒)。另外，通过分别测定细胞浆和细胞核TAZ，发现心肌炎心肌细胞核TAZ增加更明显(图6中D)，说明心肌炎心肌更多细胞浆TAZ转移到细胞核。这些结果说明心肌炎心肌纤维化与YAP，TAZ和MIST1激活有关。

5)金和欢素改善心肌炎小鼠心脏功能障碍和心脏损伤：为进一步研究口服金合欢素是否有治疗免疫性心肌炎作用，在皮下注射α-MHC建立心肌炎小鼠模型，我们给予小鼠金和欢素口服灌胃研究其心肌炎的潜在保护作用和作用机制。

从第0天到第21天实验期间，对接受药物治疗的心肌炎小鼠灌胃给予金和欢素(100mg/kg/天)，而对照组和心肌炎模型组灌胃等容量溶媒(图7中A)。在实验结束时(第21天)，用超声心动图评估麻醉小鼠心脏功能(图7中B)。在心肌炎溶媒组中观察到小鼠左心室射血分数(EF％)和左心室短轴缩缩短分数(FS％)显著降低(n＝5-7，P<0.05vs.对照组)，而在金合欢素治疗组小鼠EF％和FS％的降低得到了逆转(n＝7，P<0.05vs.溶媒)(图7中C)。这些结果表明，金和欢素口服显著改善心肌炎小鼠的心脏功能障碍。

超声心动图分析后，在动物麻醉状态下分离出心脏。心肌炎溶媒组动物的心脏体积明显大于对照组或用金合欢素治疗的动物心脏体积(图7中D)。在用溶媒的心肌炎小鼠，心脏重量与体重(HW/BW)的比值增加(n＝11-12，P<0.01vs.对照组)，而在口服金合欢素治疗的心肌炎小鼠则没有增加(n＝12，P<0.001vs.溶媒)(图7中E)。

在用HE(图7中F)或Masson(图7中H)染色的小鼠心脏心室切片，心肌炎溶媒组小鼠心肌的炎性损伤和纤维化区域增加，而在用金合欢素治疗的心肌炎小鼠，心肌炎性损伤和纤维化得到明显改善。心肌炎溶媒组小鼠心肌炎性评分显著增加(n＝11-12，P<0.001vs对照)(图7中G)，心肌纤维化百分比面积也增加(n＝11-12，P<0.0001vs.对照)(图7中I)，但在口服金合欢素治疗的心肌炎动物显著降低(P＝0.05或P<0.01vs.心肌炎溶媒)。这些结果表明，金合欢素口服也显著改善心肌炎小鼠的心肌损伤和纤维化。

7)金合欢素抑制小鼠自身免疫性心肌炎的免疫应答反应：图8中A显示，在心肌炎溶媒组小鼠的心室组织，促炎细胞因子Il1b、Il6和Tnf以及趋化因子Ccl3和Ccl5 mRNA水平显著升高，然而这些增加在用金合欢素治疗的心肌炎小鼠被逆转。心脏特异性CD4+T细胞和Th17细胞效应细胞因子Ifng、Il17a和Il17f mRNA水平在用溶媒组心肌炎小鼠心肌组织上调，而在口服灌胃金合欢素的心肌炎小鼠心肌组织降低。这些结果表明，金合欢素抑制心肌炎小鼠心肌炎性因子的产生。

为了确认金合欢素对心肌炎小鼠的保护是否与效应CD4+T和Th17细胞介导的免疫反应参与有关，我们从不同实验组动物中分离脾脏细胞，并用流式细胞术分析效应CD4+T细胞(CD62L-CD44+NCD4+细胞)、

(幼稚)CD4+T细胞(CD62 L+CD44-CD4+细胞、Th17细胞、髓细胞(例如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)等。在应用溶媒的心肌炎小鼠，效应CD4+T细胞的比例增加，而在用金合欢素治疗的心肌炎小鼠，这一比例相反。在使用溶媒的心肌炎小鼠，

CD4+T细胞没有改变，而在使用金合欢素的心肌炎小鼠增加(图8中B)。

在用溶媒的心肌炎小鼠，脾脏Th17细胞的百分比显著增加，而在口服金合欢素的心肌炎小鼠，增加的百分值显著逆转(图8中C)。此外，金合欢素治疗显著降低心肌炎小鼠巨噬细胞比例的增加(图8中D)，但不降低Ly6C高炎性单核细胞(图8中E，P＝0.07)和中性粒细胞(图8中F，P＝ns)百分值。这些结果表明，金合欢素对心肌炎小鼠的保护作用与抑制心肌炎小鼠CD4+T细胞活化和Th17细胞分化有关。

8)金合欢素在体外抑制CD4+T细胞活化、增殖和Th17细胞分化：在从正常小鼠脾脏分离的

CD4+T细胞，测定了金合欢素对CD4+T淋巴细胞活化、增殖和Th17分化的影响。5和10μM金合欢素显著降低表达CD44和CD25(T细胞活化标记物)细胞的百分比值(图9中A和图9中B)。

此外，金合欢素浓度依赖地抑制T细胞增殖(图9中C)。重要的是，金合欢素抑制Th17细胞分化(图9中D，IL-7A+细胞)。这些结果表明，金合欢素直接抑制CD4+T细胞活化、增殖和Th17细胞分化。

9)RNA-seq揭示金合欢素影响CD4+T细胞转录特征：通过分析转录组谱，采用RNA-seq来检测金合欢素对用5或10μM金合欢素对CD4+T细胞作用和潜在机制。主成分分析(PCA)显示，用5μM和10μM金合欢素处理的细胞，其空间距离很近，但在没有金合欢素处理的细胞距离很远，表明金合欢素可引起CD4+T细胞转录组显著改变(图10中A)。

在有5或10μM金合欢素存在的细胞，分析基因表达差异性。在金合欢素5μM处理的细胞，有157个基因上调，158个基因下调(图10中B)。而在金合欢素10μM的细胞，有428个基因上调，336个基因下调(图9中C)，火山图显示20个具有最小调整P值的基因。

随后，用GSEA算法分析潜在作用途径的变化。GSEA分析显示，用金合欢素5或10μM处理的细胞，诱导细胞周期相关途径减少，例如APC/C介导的细胞周期蛋白降解、姐妹染色单体分离和DNA合成(图10中D和10中E)，这与细胞增殖的抑制一致(图10中C)。此外，金合欢素5μM导致线粒体呼吸相关途径显著减少，例如呼吸系统的电子运输和线粒体中的电子运输链氧化磷酸化OXPHOS系统(图10中D)。

金合欢素10μM引起脂质代谢相关途径显著减少，如胆固醇生物合成和脂肪酸β氧化，以及线粒体、蛋白酶体和PPAR信号通路中电子运输链氧化磷酸化系统减少(图10中E)。GSEA和基因表达热图还显示，金合欢素降低与细胞周期、电子运输和脂肪酸β氧化相关基因表达(图10中F～图10中H)。这些结果表明，金合欢素主要影响CD4+T细胞的细胞周期、线粒体呼吸和脂质代谢。

10)金合欢素降低T细胞线粒体呼吸：先前的研究表明，线粒体呼吸在T细胞活化、增殖和分化中起着关键作用，线粒体呼吸减少会阻碍脂质代谢并影响DNA和核酸合成。GSEA分析和基因表达热图显示，金合欢素5μM引起线粒体呼吸途径的广泛抑制(图10中F)。这表明，金合欢素首先干扰线粒体功能，从而影响T细胞脂质代谢和细胞周期。基因表达热图显示，大多数下调基因是电子运输链复合物I、II、III、IV和V的亚基，它们介导线粒体呼吸和氧化磷酸化OXPHOS(图10中D～图10中H)。这些结果表明，金合欢素作用的主要靶点是CD4+T细胞的线粒体能量代谢。

通过使用Seahorse System细胞线粒体应激检测试剂盒测定T细胞的耗氧率(OCR，通过细胞外流量分析测量)，进一步研究金合欢素在调节线粒体呼吸方面的作用。金合欢素(5或10μM)显著抑制线粒体与质子载体FCCP分离后T细胞耗氧率、基础和最大呼吸、储备呼吸能力和ATP产生(图11中A)。这些结果表明，金合欢素主要抑制线粒体呼吸储备，从而限制T细胞激活能量。

11)金合欢素降低CD4+T细胞线粒体ROS产生和线粒体膜电位：一般认为线粒体氧化呼吸链产生的ROS(mROS)促进细胞内信号传导，并增强T细胞活化和增殖。鉴于金合欢素对线粒体呼吸有抑制作用，我们研究了金合欢素对mROS产生的影响。MitoSOX染色显示，金合欢素显著抑制CD4+T细胞mROS水平(图11中B)。

线粒体膜电位MMP维持CD4+T细胞的活化状态，因此我们在负载JC-1荧光的活化CD4+T淋巴细胞测定了金合欢素对线粒体膜电位的影响，发现金合欢素诱导线粒体膜电位显著降低(通过PE/FITC比率的降低来表示)(图11中C)。然而，线粒体呼吸受损并非由于线粒体质量减少，因为mitoTracker染色显示，金合欢素10μM仅轻微降低线粒体质量(图11中D)。这些结果表明，金合欢素抑制CD4+T细胞mROS生成和线粒体膜电位。

12)金合欢素抑制线粒体复合物II活性：CD4+T细胞线粒体质量的轻微变化表明金合欢素可能改变电子运输链的活性。使用PharmMapper(一种著名药效团匹配和潜在靶靶点识别平台)预测和分析了电子运输链上的金合欢素靶点。Autodock Vina是一个计算程序，它有效地预测大分子受体和小分子的非共价结合，以显著提高预测精度，预测结合构象和结合亲和力。PharmMaper分析显示，金合欢素与琥珀酸脱氢酶结合(z-score＝2.562)，后者作为线粒体复合物II发挥作用。使用Autodock Vina将金合欢素与复合物I-V对接表明，与其他复合物相比，复合物II具有最低的结合能量(Kcal/mol＝-9.2)，金合欢素与复合物II前三种结合构象具有较强的稳定均方根误差RMSE，这表明对接结果是可靠的(图12中A)。

对最低结合能下对接构象进一步分析表明，金合欢素可以通过与ASP106和ARG79氨基酸残基的氢键成功地与复合物II结合(图12中B)。线粒体复合物II，也称为琥珀酸脱氢酶，是响应各种内在和外在刺激和异常，而重新编程代谢和呼吸适应的中心载体，复合物II控制mROS和ATP的产生并调节T细胞活化。使用复合物II活性测定试剂盒检测金合欢素对复合物II活性的影响，以确认上述分子对接结果。发现金合欢素以浓度依赖的方式抑制T细胞复合物II活性(图12中C)。

然后，我们通过用复合物II抑制剂Atpenin A5处理CD4+T细胞，来测定复合物II活性对活化和增殖的影响，结果表明，Atpenin A5可降低CD4+T的活化和增殖(图12中D)。

最后，我们用复合物II的膜渗透性原料DES来测试CD4+T细胞的功能，观察是否可以通过增加复合物II底物来恢复线粒体功能。正如所料，应用DES逆转金合欢素对CD44表达和CD4+T细胞增殖的降低(图12中E)。这些结果表明，金合欢素通过影响复合物II活性来抑制CD4+T细胞线粒体功能。

13)金合欢素的治疗给药可阻止扩张性心衰的进展：前面实验通过口服给药观察到金合欢素对心肌炎小鼠的有益作用(图7)。然而，大多数从急性心肌炎进入康复过程的患者会发展为扩张性心衰，伴有心肌纤维化、心室扩张和心脏功能不全，目前临床上没有药物可延缓扩张性心衰的发展。为研究金合欢素是否能延缓和/或阻止扩张性心衰的进展，在另一组实验中，在皮下注射α-MHC后第7天，给予心肌炎小鼠口服灌胃金合欢素(100mg/kg/天)两周。停药三周至实验第42天，用超声心动图评估心脏功能后，处死动物(图13中A)。

超声心动图分析显示，与21天实验的结果相比(图7中C)，口服灌胃溶媒的心肌炎小鼠左心室EF％和FS％进一步降低，扩张性心衰参数，即左心室收缩末期直径(LVEDD)和左心室舒张末期直径(LV EDD)显著增加，这表明扩张性心衰在较长实验期间(42天)发生，并表现出心力衰竭。值得注意的是，在接受金合欢素治疗的心肌炎小鼠，心脏功能不全以及LVEDD和LVEDD的增加被逆转(图13中B)。

超声心动图检测后分离心脏并称重，在心肌炎溶媒组小鼠，心脏大小和HW/BW比率增加，而心肌炎金合欢素组的动物没有增加(图13中C，图13中D)。此外，Masson染色的心室切片显示，在口服溶媒心肌炎小鼠心肌，观察到大面积纤维化，而在口服金合欢素的心肌炎小鼠心肌，纤维化面积显著减少(图13中E，图13中F)。这些结果表明，在心肌炎急性期服用金合欢素可以防止扩张性心衰的进展。

3.实验结论

在本项发明研究中，在用α-MHC皮下注射引起的大鼠免疫性心肌炎和小鼠免疫性心肌炎，我们证明了金合欢素抑制心肌炎免疫应答反应、心脏炎性反应、纤维化和心功能损害，改善扩张性心衰的心脏重塑和心室扩张。

金合欢素对心肌炎的有益作用主要与抑制CD4+T细胞活化、增殖和Th17细胞分化有关。从作用机制上讲，金合欢素通过与线粒体复合物II结合，限制线粒体活性，从而抑制线粒体呼吸、mROS产生和线粒体膜电位MMP，来抑制CD4+T细胞活化、增殖和Th17细胞分化，从而降低与炎性反应和纤维化相关蛋白活化水平。

总的来说，本发明研究首次发现了金合欢素新的药理作用，即金合欢素通过降低CD4+T细胞线粒体复合物II活性，抑制线粒体呼吸、CD4+T细胞线粒体ROS和免疫应答反应，从而降低心肌炎引起的扩张性心衰进展，这表明金合欢素可能是治疗CD4+T细胞介导的免疫性心肌炎有价值的新药物。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述免疫性心肌炎为不同感染或非感染性疾病引起的免疫反应所致的心肌炎。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述免疫性心肌炎的症状包括左心室压降低、左心室肥大、左心室扩张、左心室收缩功能降低、左心室舒张功能降低或心衰。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于：金合欢素抑制心肌炎免疫应答的靶点包括CD4+T细胞的线粒体能量代谢。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于：金合欢素通过降低线粒体复合物II活性，抑制CD4+T细胞中的线粒体呼吸功能、能量代谢和免疫应答反应，抑制CD4+T淋巴细胞活化、增殖和Th17细胞分化，进而抑制YAP、TAZ或MST1活力和表达，抑制心脏炎性反应、纤维化和心功能损害，改善扩张性心衰的心脏重塑和心室扩张来防治免疫性心肌炎。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于：小鼠口服灌胃金合欢素或金合欢素水溶性前药的剂量为5～100mg/kg。

7.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于：金合欢素通过抑制迟发性炎症介质的激活和释放来防治免疫性心肌炎。

8.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于：所述药物的给药方式为皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服或喷雾吸入。

9.金合欢素或金合欢素水溶性前药在制备防治免疫性心肌炎并发症药物中的应用。

10.一种防治免疫性心肌炎的药物，其特征在于，以金合欢素或金合欢素水溶性前药作为主要成分。

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