CN115960902A - 基于CRISPR-Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用，涉及支原体核酸检测技术领域。本发明提供了能够用于制备检测多种支原体的crRNA的4对引物，采用这4对引物制备的crRNA混合所构建的CRISPR‑Cas12a系统，能够进行1拷贝基因组/反应体系或2CFU/mL浓度的支原体检测。根据耐用性分析结果显示，本发明能够检测到10⁶个MSC细胞中2CFU/mL浓度的支原体，因此，可以有效的替代药典使用的培养法和DNA染色法检测支原体；具有操作简单，用时短，特异性强，灵敏度高和覆盖度广等优点，是目前较为高效的支原体检测方法。

Description

基于CRISPR-Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及 其应用

技术领域

本发明涉及支原体核酸检测技术领域，特别涉及基于CRISPR-Cas系统的用于检测多种支原体的引物对、crRNA及其应用。

背景技术

支原体是一类缺乏细胞壁，形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。支原体能引起各种动植物疾病；例如，肺炎支原体是呼吸道感染和肺炎的主要原因，溶脲脲原体和人型支原体能引起泌尿生殖道感染，螺原体能感染昆虫。支原体污染也是细胞培养的巨大威胁，容易使细胞代谢受阻，表面结构损伤，融合力降低等，进而对宿主的治疗性蛋白产生影响。据德国DSMZ细胞库研究学者调查数据显示，约有1/4的细胞受到支原体污染的影响。在生物制药行业中，支原体污染的影响几乎是毁灭性的。

考虑到生物制品的安全性、纯度和生产效力，支原体污染检测是生物制品质量控制过程中重要一环。各国监管部门也建立了相应的监管机制，中国药典通则3301对生物制品各生产环节做出了明确的规定。欧盟药典2.6.2指出，主细胞库、工作细胞库及病毒种子批和对照细胞使用培养法和细胞指示法对支原体进行检测；一些病毒的收获液和疫苗产品要进行培养法检测支原体污染。美国药典通则63指出，支原体污染检测是确保生物制品及其生产所用材料可靠性的一项必要的质量控制要求，日本药典的G3部分指出，生物制品用细胞基质要进行支原体检测。

目前监测支原体污染的主要方法是培养法和指示细胞法，这两类方法的监测周期长，工作量大。随着生物制品种类的不断增加，特别是以基因治疗、细胞治疗或者组织工程为基础的前沿治疗性药物的出现，细胞培养法和指示细胞检测方法的缺点更加明显。与生物大分子生物制品相比，大部分治疗性产品无法灭菌，有效期短且批产量较低，需要更加短的检测周期。因此，在很多国家的药典中都加入了快速放行的支原体污染检测方法。例如，欧盟药典和日本药典中指出核酸扩增技术(Nucleic acid amplification techniques，NAT)技术或者其他经过适当验证过的技术能够替代培养法和指示细胞法，并对NAT技术检测的灵敏度及特异性做了明确的规定：当拟替代培养法检测支原体时，NAT检测的灵敏度应达到10CFU/mL；当拟替代DNA染色法时，NAT检测的灵敏度应达到100CFU/mL。美国药典规定NAT技术能够代替培养法和指示细胞法用来对支原体进行检测。中国药典也指出除了采用培养法和指示细胞法对支原体进行检测之外，也可以采用经过国家药品检定机构认可的其他方法。

CRISPR-Cas(Clustered ReguLarly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPRs)系统是细菌与病毒斗争中进化出的一套自我保卫的系统。目前，CRISPR-Cas系统在体外诊断(IVD)中得到了广泛的利用，比较常见的有CRISPR-Cas12、CRISPR-Cas13和CRISPR-Cas14等蛋白家族。CRISPR-Cas12a蛋白是一种由crRNA引导的靶向DNA的核酸酶，其能够结合并切割对应的DNA链。当CRISPR-Cas12a蛋白与crRNA互补的含有PAM区域的靶向DNA结合时，其顺式的DNA酶活性被激活，对靶向DNA进行切割，同时还能够完全降解附近的线性或者环状单链DNA分子。

发明内容

本发明基于CRISPR-Cas12a蛋白的功能特点，设计了一套能够用于高效靶向检测生物制品中的多种支原体23s rRNA基因的方法，包括用于制备crRNA的引物和相应的crRNA，以及利用crRNA检测生物制品中多种支原体污染的方法和检测试剂盒。基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a蛋白检测这两种技术的特异性和信号放大作用，本发明相当于对待检测目标进行了两次确认和两次信号放大，显著提高了检测的特异性，灵敏度和覆盖度。本发明提供的技术可以结合DNA Barcoding技术实现对污染支原体的鉴定；还可以运用侧向流检测技术，实现支原体可视化检测；操作简单，降低了仪器要求及成本，是一种高效的支原体鉴定及检测的方法。具体通过以下技术实现。

一种用于制备检测多种支原体的crRNA的引物，包括引物对F1、引物对F2、引物对F3和引物对F4；

所述引物对F1的正向引物序列(如SEQ ID NO.1所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattatagtcagtacggctagg-3’；

所述引物对F1的反向引物序列(如SEQ ID NO.2所示)为：

5’-cctagccgtactgactataatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’；

所述引物对F2的正向引物序列(如SEQ ID NO.3所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgtattcagtacgcctagg-3’；

所述引物对F2的反向引物序列(如SEQ ID NO.4所示)为：

5’-cctaggcgtactgaatacaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’；

所述引物对F3的正向引物序列(如SEQ ID NO.5所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgagatcagtaccccgagg-3’；

所述引物对F3的反向引物序列(如SEQ ID NO.6所示)为：

5’-cctcggggtactgatctcaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’；

所述引物对F4的正向引物序列(如SEQ ID NO.7所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgcattcagtacccctagg-3’；

所述引物对F4的反向引物序列(如SEQ ID NO.8所示)为：

5’-cctaggggtactgaatgcaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’。

本发明提供了一种用于检测多种支原体的crRNA的制备方法，包括以下步骤：

S1、采用上述引物，即采用所述引物对F1、F2、F3、F4，合成所述crRNA的体外转录模板；

S2、以步骤S1制备的所述体外转录模板为模板，进行体外转录，再回收所述crRNA。

一般而言，上述步骤S1、S2的合成体外转录模板和体外转录的方法可以采用本领域的常规方法、试剂和反应条件参数进行。例如，步骤S1可以使用市售的DNA回收试剂盒，通过将反应产物过收集柱，按照试剂盒的说明书进行重复若干次的离心、洗涤，收集模板；步骤S2可以使用市售的体外转录试剂盒，按照试剂盒的说明书进行反应，过收集柱、离心分离纯化，完成体外转录，最后再使用市售的RNA回收试剂盒按照试剂盒的说明书进行常规操作，同样通过过收集柱、离心分离纯化、洗脱等步骤，将crRNA分离回收。

优选地，步骤S1中，转录反应体系为：无核酸水30μL、10μM所述引物对F1、F2、F3、F4的正向引物各5μL、10μM所述引物对F1、F2、F3、F4的反向引物各5μL、5×退火缓冲液10μL；转录反应程序是以0.1℃/s的速率由95℃开始降温至25℃。上述反应体系和反应程序可以在扩增仪中进行，随着扩增仪中温度缓慢下降，能够保证转录反应的高效进行，获得尽可能多的体外转录模板。

本发明还提供了一种用于检测多种支原体的CRISPR-Cas12a系统，包括采用上述方法制备获得的crRNA。

优选地，上述系统还包括Cas12a蛋白、单链DNA信号分子、10×缓冲液、RNasin和无核酸水。Cas12a蛋白、单链DNA信号分子、10×缓冲液、RNasin和无核酸水都是CRISPR-Cas12a技术中常用的试剂原料，均可以通过市售途径购买获得。只要采用本发明提供的crRNA进行CRISPR-Cas12a处理和检测，采用市售任意的Cas12a蛋白、单链DNA信号分子、10×缓冲液、RNasin和无核酸水，对于生物制品中的多种支原体都能获得非常好的检测效果。

本发明还提供了一种检测多种支原体的方法，具体包括以下步骤：

P1、对待测样本进行预处理，并提取待测样本的基因组；

P2、以步骤P1制备的待测样本的基因组为模板进行扩增，回收扩增产物；

P3、以步骤P2回收的扩增产物为模板，将上述CRISPR-Cas12a系统的各组分进行混合，采用荧光法或侧向流法进行检测，进行结果判定。

一般而言，步骤P1-P3同样采用本领域的常规方法和常规试剂盒完成相应操作。例如，步骤P1对待测样本使用常规的离心、分离等方式进行预处理，以便控制待测样本工作液中的细胞的密度，制备完后可以直接使用，也可以低温保存备用；提取基因组也可以使用市售常用的试剂盒按试剂盒说明书进行操作。步骤P2的扩增则可以同样适用常规的试剂盒进行处理，当然也可以自行设计引物，配置试剂或调整试验参数，并通过大量试验筛选出扩增效果最好的引物、试剂和试验参数。步骤P3中，检测的方法可以选用荧光检测法或侧向流检测法，也可以选用本领域的其他常用检测方法。

优选地，上述检测方法的步骤P2中，扩增所使用的扩增正向引物的序列如下：

5’-ggtagagcactgaatatggaatggc-3’(如SEQ ID NO.9所示)；

5’-ggtaaagctactgaatgtatgatggc-3’(如SEQ ID NO.10所示)；

5’-ggtagagcactgaatgtatgatggc-3’(如SEQ ID NO.11所示)；

与上述扩增正向引物对应地，使用的扩增反向引物均相同，序列如下：

5’-ctcgacwagtgagctrttacgcac-3’(如SEQ ID NO.12所示)。

本发明对用于待测样本基因组扩增的引物进行了特殊设计，通过大量的对比实验，从大量的引物中选择获得了上述三组引物。在扩增体系中同时采用这三组引物，能够实现更多种类支原体的高效检测。

优选地，上述检测方法的步骤P3中，结果判定的方法具体为：当采用荧光法检测时，如果检测样本有荧光增长曲线且荧光值＞15cfu(该阈值基于中国药典中的曲线法确定)，则判定待测样本为支原体阳性，否则为阴性。当阈值低于15cfu时，检测结果容易出现假阳性。

当采用侧向流法检测时，如果反应3min后的试纸条检测线区域有亮带，则判定待测样本为支原体阳性，否则为阴性。

本发明还提供了一种用于检测多种支原体的试剂盒，含有上述的用于制备检测多种支原体的crRNA的引物，或含有上述的crRNA，或含有上述的CRISPR-Cas12a系统。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、本发明提供的引物对、crRNA和相应的检测样本中多种支原体的方法，在支原体23s rRNA基因扩增片段的内部设计了全新的CRISPR-Cas12a蛋白crRNA靶向位点，对待测样本进行扩增信号放大之后利用CRISPR-Cas12a蛋白检测系统又进行了一轮信号放大，与普通的PCR检测技术以及药典中的培养法和DNA染色法相比，具有用时短，操作简单，价格便宜，特异性强，灵敏度高等优点；

2、本发明提供的方法相比于荧光定量PCR检测法，虽然也有PCR过程，但是其只进行了35个循环，循环过程中没有荧光读值阶段，加上后续荧光法检测阶段共用时70min左右，用时更短，灵敏度远高于荧光定量法检测的灵敏度。

3、本发明在检测支原体过程中，使用PCR技术对支原体片段进行扩增时，较RPA扩增而言对引物的要求更低，碱基错配的容错能力强，扩增效率高，能够实现高灵敏度和高覆盖度的支原体检测；

4、本法能够和DNA barcoding(DNA条形码)技术结合，较LAMP扩增而言，本法能够实现污染支原体的鉴别；只需要一对扩增引物，引物覆盖率更高，检测范围更广。

附图说明

图1为使用细菌对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min内的结果。图中，编号1为阳性对照样品，2-12分别为丙酮丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、炎链球菌(S.pneumoniae)、酸乳杆菌(L.acidophilus)、大肠杆菌(E.coli)、黄色葡萄球菌(S.aureus)、生孢梭菌(C.sporogenes)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、草分枝杆菌(M.phle)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、藤黄微球菌(M.luteus)样品和阴性对照(NTC)；

图2为使用细菌对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min时的结果。图中，编号1-12的含义与图1相同；

图3为使用真菌对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min内的结果。1为阳性对照样品，2-4分别为黑曲霉(A.niger)、白色念珠菌(C.albicans)样品和阴性对照(NTC)；

图4为使用真菌对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min时的结果；图中，编号1-4的含义与图3相同；

图5为使用生物制品生产常用细胞对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min内的结果；图中，编号1为阳性对照，编号2-12分别为Hi-5、sf9、A9、293、CHO-K1、MSC、vero、MDBK、PK-15、Walker-256这几种生物制品生产中常用的细胞系样品和阴性对照(NTC)；

图6为使用生物制品生产常用细胞对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min时的结果；图中，编号1-12的含义与图5相同；

图7-16为本发明的灵敏度验证结果。图7-16分别为检测1、5、10、10²、10³、10⁴和10⁵拷贝/反应的M.orale、M.hyorhinis、M.synoviae、M.salivarium、M.fermentans、M.arginini、M.pneumoniae、A.laidlawii、S.citri、M.gallisepticum这10种支原体的荧光变化；

图17为本发明的药典可替代性验证结果；图中，编号1-10分别为2CFU/mL浓度的M.orale、M.hyorhinis、M.synoviae、M.fermentans、M.arginini、M.pneumoniae、A.laidlawii、S.citri、M.gallisepticum这9种支原体，以及阴性对照40min内的荧光检测结果；

图18为本发明的药典可替代性验证结果；图中，编号1-10分别为2CFU/mL浓度的M.orale、M.hyorhinis、M.synoviae、M.fermentans、M.arginini、M.pneumoniae、A.laidlawii、S.citri、M.gallisepticum这9种支原体，以及阴性对照5min时的荧光检测结果；

图19为本发明的耐用性分析。图中，编号1-10分别为2CFU/ml浓度的M.orale、M.hyorhinis、M.synoviae、M.fermentans、M.arginini、M.pneumoniae、A.laidlawii、S.citri、M.gallisepticum与10⁶拷贝数的MSC细胞混合样品，以及单独MSC细胞样品的40min内的荧光动力学检测结果；

图20为本发明的耐用性分析。图中，编号1-10分别为2CFU/ml浓度的M.orale、M.hyorhinis、M.synoviae、M.fermentans、M.arginini、M.pneumoniae、A.laidlawii、S.citri、M.gallisepticum与10⁶MSC细胞混合样品，以及单独MSC细胞样品的5min时的荧光检测结果；

图21为本发明使用侧向流技术检测支原体结果。图中，编号1-10分别为2CFU/ml浓度的M.orale、M.hyorhinis、M.synoviae、M.fermentans、M.arginini、M.pneumoniae、A.laidlawii、S.citri、M.gallisepticum与10⁶MSC细胞混合样品和单独MSC细胞样品的3min时的检测结果。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下具体实施方式中，除非作特殊说明，否则所采用的试剂和设备都可以通过常规市场购买。为了验证本发明技术方案的效果，使用多种MB支原体标准品(欧洲药典中规定的指示检测的支原体)作为阳性对照。

实施例1：待测样品、阳性对照和阴性对照的预处理，提取待测样品的基因组DNA

1、待测样品(采购自MB公司)的预处理

将待测样品离心，收集沉淀后使用，或者直接使用，或着-80℃保存备用。

2、阳性对照和阴性对照的预处理

阳性对照：在MB支原体标准品中加入200拷贝的口腔支原体的基因组和200拷贝的肺炎支原体的基因组的混合物，采用与待测样品相同的方法进行处理。

阴性对照：1mL含10％ FBS的MEM基础培养基，处理方式和待测样品相同。

3、待测样本基因组的提取(相关试剂和试剂盒均采购自康为生物公司)

使用康为生物公司提供的DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书的要求提取待测样本基因组，并溶于100μL RNA-free water中。

实施例2：cr-RNA的制备

1、用于制备cr-RNA的引物的设计

利用MEGA5.0软件，通过对常见的21种支原体和其他革兰氏阳性菌(药典指示)的16s rRNA-23s rRNA基因的比对，根据支原体间的保守性和支原体与其他革兰氏阳性菌的差异，在支原体基因序列特异性的区域设计多对引物，经筛选得到四个特异性和灵敏度均最优的crRNA，并设计出合成该crRNA的4个引物对F1、F2、F3、F4，所述引物对F1、F2、F3、F4的正向和反向引物序列分别为：

所述引物对F1的正向引物序列(如SEQ ID NO.1所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattatagtcagtacggctagg-3’；

所述引物对F1的反向引物序列(如SEQ ID NO.2所示)为：

5’-cctagccgtactgactataatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’；

所述引物对F2的正向引物序列(如SEQ ID NO.3所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgtattcagtacgcctagg-3’；

所述引物对F2的反向引物序列(如SEQ ID NO.4所示)为：

5’-cctaggcgtactgaatacaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’；

所述引物对F3的正向引物序列(如SEQ ID NO.5所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgagatcagtaccccgagg-3’；

所述引物对F3的反向引物序列(如SEQ ID NO.6所示)为：

5’-cctcggggtactgatctcaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’；

所述引物对F4的正向引物序列(如SEQ ID NO.7所示)为：

5’-taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgcattcagtacccctagg-3’；

所述引物对F4的反向引物序列(如SEQ ID NO.8所示)为：

5’-cctaggggtactgaatgcaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta-3’。

2、体外转录模板的合成

选用上述引物对F1、F2、F3、F4，配制如下表1的反应体系。

表1合成体外转录模板的反应体系

Nuclease-free water	30μL
		引物对F1/F2/F3/F4的正向引物(10μM)	5μL
引物对F1/F2/F3/F4的反向引物(10μM)	5μL
		5×退火缓冲液	10μL
Total	50μL

转录反应程序是在PCR仪中以0.1℃/s的速率由95℃开始降温至25℃。

3、使用DNA回收试剂盒(NEB，D4033)回收体外转录模板

(1)加入5倍体积的DNA binding buffer至反应产物中，混匀混合液；

(2)将上述溶液加入到Zymo-Spin^TMColμMn2收集柱中，8000g离心30s；加入200μL的DNA wash buffer，9000g离心30s，再重复一次；弃滤液；将收集柱重新放入离心机中，12000g离心3min；

(3)加入20μL RNA-free water(无RNA水)至收集柱中，室温孵育2min后，9000g离心2min，收集模板。

4、使用体外转录试剂盒(NEB，E2050S)进行体外转录

选用收集的体外转录模板为反应模板，配制如下表2的反应体系。

表2体外转录反应体系

Nuclease-free water	10μL
		NTP Buffer Mix	10μL
Template DNA(模板DNA)	8μL
		T7 RNA Polymerase Mix	2μL
Total	30μL

混合均匀后短暂离心，37℃孵育5h后加入45μL的nuclease-free water(无核酸水)，随后加入2μL的Dnase I(DNA水解酶)充分混匀置于37℃孵育20min，制得转录产物。

5、使用RNA回收试剂盒(NEB，T2040L)回收cr-RNA

(1)加入2倍体积的RNA Cleanup Binding Buffer至转录产物中，混匀混合液；加入等体积的无水乙醇至上述溶液中，轻轻混匀，不需要涡旋，静置1-2min；

(2)将上述溶液加入收集柱中，8000g离心1min；弃滤液，加入500μL的RNA CleanupWash Buffer 9000g离心1min(重复一次)；弃滤液，将柱子重新放入离心机中，12000g离心3min；

(3)加入50μL RNA-free water至收集柱中，9000g离心2min收集crRNA，采用四组引物对F1、F2、F3、F4最终制备的crRNA序列如SEQ ID NO.13-16所示。

引物对F1最终制备的crRNA序列(如SEQ ID NO.13所示)为：

uaauuucuacuaaguguagauauuauagucaguacggcuagg

所述引物对F1的反向引物序列(如SEQ ID NO.14所示)为：

uaauuucuacuaaguguagauauuguauucaguacgccuagg

所述引物对F2的正向引物序列(如SEQ ID NO.15所示)为：

uaauuucuacuaaguguagauauugagaucaguaccccgagg

所述引物对F2的反向引物序列(如SEQ ID NO.16所示)为：

uaauuucuacuaaguguagauauugcauucaguaccccuagg；

上述SEQ ID NO.13-16中，U代表尿嘧啶，在提交的电子序列表中按照WIPO标准要求用T代替了U。

实施例3：待测样本基因组的PCR扩增

1、PCR扩增的引物设计

利用MEGA5.0软件，对常见的21中支原体和其他革兰氏阳性菌(药典指示)的16srRNA-23s rRNA基因的比对，根据支原体间的保守性和支原体与其他革兰氏阳性菌的差异，在支原体基因序列特异性的区域设计多条引物，经筛选得到一组特异性和灵敏度均最优的扩增引物对，其正向引物序列分别为：

5’-ggtagagcactgaatatggaatggc-3’(如SEQ ID NO.10所示)；

5’-ggtaaagctactgaatgtatgatggc-3’(如SEQ ID NO.11所示)；

5’-ggtagagcactgaatgtatgatggc-3’(如SEQ ID NO.12所示)；

其扩增引物对的扩增反向引物序列如下为：

5’-ctcgacwagtgagctrttacgcac-3’(如SEQ ID NO.13所示)

2、扩增反应过程

采用Champagne Taq DNA Polymerase(诺唯赞)试剂盒，并使用上述三组扩增引物对，配置如下表3所示的PCR扩增反应体系。

表3合成体外转录模板的反应体系

Nuclease-free water	9.1μL
		10×PCR缓冲液	2.5μL
Template DNA	10μL
		正向引物(10μM)	三种正向引物各0.4μL
反向引物(10μM)	1.2μL
		DNA聚合酶	0.5μL
Total	25μL

PCR扩增反应程序如下表4所示。

表4 PCR扩增反应程序

收集PCR扩增反应产物。

实施例4：基于CRISPR-Cas12a系统的多种支原体的检测和结果判定本实施例使用药典指示的三种革兰氏阳性菌等多种细菌(丙酮丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、炎链球菌(S.pneumoniae)、酸乳杆菌(L.acidophilus)、大肠杆菌(E.coli)、黄色葡萄球菌(S.aureus)、生孢梭菌(C.sporogenes)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、草分枝杆菌(M.phle)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、藤黄微球菌(M.luteus))，真菌(黑曲霉(A.niger)和白色念珠菌(C.albicans))及生物制品常用的细胞系(Hi-5、sf9、A9、293、CHO-K1、MSC、vero、MDBK、PK-15、Walker-256细胞系)，分别采用荧光法和侧向流法对本发明检测的特异性进行验证。

1、荧光法检测

荧光法检测反应体系如下表5所示：

表5荧光法检测反应体系

Nuclease-free water	32.5μL
		NEBbuffe2.1r(NEB，B6002V)	6μL
RNase inhibitor(TaKaRa，2311A)	0.5μL
		crRNA(2μM)	2μL
2FAM-ssDNA-Biotin(5μM)	2μL
		模板	15μL
Cas12a蛋白(吐露港生物，32108-01)	2μL
		Total	60μL

使用多功能酶标仪(赛默飞，Varioskan LUX)进行荧光检测。模式为动力学检测，温度为38℃，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm。

图1、2分别为使用细菌对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min内和40min时的结果。从图1、2可以看到，编号1的阳性对照的荧光强度曲线快速上升，第20min左右就已经达到最高值400多，随后至40min时基本不变；而编号2-12的荧光强度曲线在0-40min内基本重合，均基本为水平直线，荧光强度始终趋近于0。这说明采用本发明的crRNA，支原体阳性对照的检测结果相对于常见的细菌而言具有显著的特异性。

图3、4分别为使用2种常见的真菌对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min内和40min时的结果。从图3、4可以看到，编号1的阳性对照的荧光强度曲线快速上升，第20min左右就已经达到最高值400多，随后至40min时基本不变；而编号2-4的荧光强度曲线在0-40min内完全重合，均基本为水平直线，且荧光强度始终趋近于0。这说明采用本发明的crRNA，支原体阳性对照的检测结果相对于常见的2种真菌而言具有显著的特异性。

图5、6所示分别为使用10种常用的细胞系对本发明的检测特异性进行荧光法验证的40min内和40min时的结果；从图5、6可以看到，编号1的阳性对照的荧光强度曲线快速上升，第20min左右就已经达到最高值400多，随后至40min时基本不变；而编号2-12的荧光强度曲线在0-40min内完全重合，均基本为水平直线，且荧光强度始终趋近于0。这说明采用本发明的crRNA，支原体阳性对照的检测结果相对于常见的10种细胞系而言具有显著的特异性。

如图7-16所示，可以看到在0-40min的范围内，1拷贝/反应的10种支原体的荧光强度均快速上升，且最终荧光强度都达到400以上。这说明，本发明提供的crRNA对1拷贝的支原体同样具有非常好的灵敏度。

从图17、18可以看到，相比于阴性对照，采用本发明提供的crRNA，对于2CFU/mL浓度的9种常见支原体，在40min内的荧光强度显著上升并达到最高值400多，在5min时的荧光强度也明显高于阴性对照，这说明本发明的方法对支原体检测表现出非常显著的特异性，能够有效替代药典中的标准方法。

从图19、20可以看到，相比于单独MSC细胞样品，即使将2CFU/mL浓度的9种常见支原体与10⁶MSC细胞进行混合，也能发现其在40min内的荧光强度显著升高，在第5min时就已经达到了非常高的荧光强度。这说明本发明的方法具有很高的耐用性，适用于高浓度细胞与支原体混合的样品的检测。同时具有非常高的灵敏度。

2、侧向流法检测

侧向流法检测反应体系如下表6所示：

表6侧向流法检测反应体系

将上述反应体系放入38℃恒温箱中进行反应，10min后将Cas12专用核酸检测试纸条(博徕斯，M20801-F007)放入上述反应体系中，3min后观察结果并拍照。

从图21可以看到，当采用侧向流法检测MSC细胞制品中的支原体污染时，相比于单独MSC细胞样品(检测线不显红色)，即使将2CFU/mL浓度的9种支原体与10⁶MSC细胞进行混合，也能在3min时获得非常好的检测结果(检测线显红色)。这说明将本发明提供的crRNA用于侧向流法检测支原体污染，能够检测到10⁶个MSC细胞中2CFU/ml浓度的支原体，在对细胞与支原体混合的样品中也具有非常好的检测效果，满足药典中对支原体检测替代法的要求。

综上所述，基于上述检测结果，以及对与NCBI数据库和Silva数据库高相似度比对和搜索，能够科学合理地预测本发明同样能够对140余种支原体进行有效的检测，其中包含各国药典规定的支原体种类及常见污染细胞的支原体种类。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于制备检测多种支原体的crRNA的引物，其特征在于，包括引物对F1、引物对F2、引物对F3和引物对F4；所述引物对F1的正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQID NO.2所示；所述引物对F2的正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；所述引物对F3的正向引物如SEQ ID NO.5所示，反向引物如SEQ ID NO.6所示；所述引物对F4的正向引物如SEQ ID NO.7所示，反向引物如SEQ ID NO.8所示。

2.一种用于检测多种支原体的crRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、采用权利要求1所述的引物，即采用所述引物对F1、F2、F3、F4合成所述crRNA的体外转录模板；

S2、以步骤S1制备的所述体外转录模板为模板，进行体外转录，再回收产物，即所述crRNA。

3.根据权利要求2所述的crRNA的制备方法，其特征在于，步骤S1中，转录反应体系为：无核酸水30μL、10μM所述引物对F1、F2、F3、F4的正向引物各5μL、10μM所述引物对F1、F2、F3、F4的反向引物各5μL、5×退火缓冲液10μL；转录反应程序是以0.1℃/s的速率由95℃开始降温至25℃。

4.一种用于检测多种支原体的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，包括采用权利要求2或3所述的制备方法制备的crRNA。

5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas12a系统，其特征在于，还包括Cas12a蛋白、单链DNA信号分子、10×缓冲液、RNasin和无核酸水。

6.一种检测多种支原体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

P1、对待测样本进行预处理，并提取待测样本的基因组；

P2、以步骤P1制备的待测样本的基因组为模板进行扩增，回收扩增产物；

P3、以步骤P2回收的扩增产物为模板，将权利要求4或5所述的CRISPR-Cas12a系统的各组分进行混合，进行检测和结果判定。

7.根据权利要求6所述的检测多种支原体的方法，其特征在于，步骤P2中，扩增所使用的扩增正向引物的序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，所述扩增反向引物的序列均如SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求6所述的检测多种支原体的方法，其特征在于，步骤P3中，结果判定的方法具体为：当采用荧光法检测时，如果检测样本有荧光增长曲线且荧光值＞15cfu，则判定待测样本为支原体阳性，否则为阴性；

当采用侧向流法检测时，如果反应3min后的试纸条检测线区域有亮带，则判定待测样本为支原体阳性，否则为阴性。

9.一种用于检测多种支原体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物，或含有采用权利要求2或3所述的制备方法制备的crRNA，或含有权利要求4或5所述的CRISPR-Cas12a系统。

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