CN115960949A - 柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在调控植物生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在调控植物耐盐胁迫中的应用。本发明在柳枝稷中克隆得到PvLBD12基因，将PvLBD12基因在柳枝稷中过表达，获得过表达PvLBD12基因的转基因柳枝稷，并研究了PvLBD12基因在柳枝稷中的表达模式及其在调控植物耐盐性以及生长发育中的作用，经实验证实了PvLBD12基因对柳枝稷的耐盐性以及生长发育具有调控功能。本发明填补了柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在植物耐盐能力调控中无相关报道的空白，为柳枝稷耐盐新品种的选育以及其他牧草抗逆育种提供理论基础和新的方法。

Description

柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在调控植物生长中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在调控植物生长中的应用。

背景技术

土壤盐渍化严重影响作物生长，是制约粮食生产的全球性问题，如何利用盐碱地已经成为全球重要的科学问题，而了解植物应对盐胁迫的机制是解决这一问题的重要前提。我国大约有1亿hm²盐碱地与滩涂地，其中约0.2亿hm²具有被改造为耕作用地的潜力。柳枝稷为禾本科黍属多年生C4植物，根系发达，生物量大，不仅作为能源作物以木质纤维素生产乙醇，还作为生态草在生态环境保护方面发挥重要作用。在黄河三角洲盐碱化边际土地上种植柳枝稷，可以有效降低了土壤pH值和盐分含量，土壤改良效果显著，是有潜力的盐碱地栽培作物。此外，柳枝稷也在水土保持和防风固沙方面发挥了重要作用。因此，适当种植柳枝稷能够改善当地生态环境，为当地提供饲草和生物质能源材料，具有较好的经济效益和生态效益。

侧生器官边界域（lateral organ boundaries domain，LBD）基因是一类植物中所特有的转录因子基因家族，该基因家族成员较多，结构和功能各异。LBD蛋白的特征是含有一个LOB结构域，其N端具有CX2CX6CX3C类锌指结构（具有DNA结合活性），C端具有LX6LX3LX6L类亮氨酸拉链卷曲螺旋基序，以及甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸模块。根据LOB结构域的不同，LBD家族成员主要归为两大类：I类LBD基因的LOB结构域具有完整的类锌指蛋白和类亮氨酸拉链模块，II类LBD基因仅具有类锌指蛋白模块。I类LBD基因主要参与高等植物侧生器官形态建成、植物生长发育；II类LBD基因主要参与植物次生代谢；I类和II类LBD基因都在响应植物逆境胁迫中具有积极作用。通过基因调控提高植物的耐盐性，研究PvLBD12基因在柳枝稷逆境胁迫中的作用机制及代谢通路也可为单子叶植物耐盐种质创新提供新的研究思路。现有研究中未见关于柳枝稷中PvLBD12基因的克隆、表达及其应用，也未见PvLBD12在柳枝稷中对植株耐盐性的调控功能的研究。

发明内容

针对现阶段土壤盐渍化种植作物的问题，本发明从柳枝稷基因组中获得LBD蛋白家族成员69个，而在高盐处理的条件下，PvLBD12基因表现出明显的上调表达。同时，PvLBD12基因也响应干旱、冷、冻等胁迫，具有明显的上调表达。目前尚未报道其他植物中LBD12蛋白在盐胁迫中的调控作用。

一种提高植物耐盐性和增加植物株高的方法，转入并表达柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在调控植物耐盐胁迫中的应用，所述转录因子PvLBD12的氨基序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，所述转录因子PvLBD12CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，过表达柳枝稷PvLBD12基因可以增强植物在盐胁迫条件下的渗透调节、抗氧化损伤的能力。

优选地，过表达柳枝稷PvLBD12基因可以在调控植物体内抗氧化酶活力和调控植物离子吸收。

柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在增加植物株高上的应用。

一种包含柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12的基因的生物材料，所述的生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或转基因细胞系。

上述生物材料在增加植物株高上的应用。

上述柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12或上述生物材料在构建转基因植物或植物遗传育种中的应用。

本发明的另一目的，保护一种过表达上述转录因子PvLBD12的转基因柳枝稷株系。

本发明的有益效果在于：本发明首次在柳枝稷中克隆得到PvLBD12基因，将PvLBD12基因在柳枝稷中过表达，获得过表达PvLBD12基因的转基因柳枝稷，并研究了PvLBD12基因在柳枝稷中的表达模式及其在调控植物耐盐性以及生长发育中的作用，经实验证实了PvLBD12基因对柳枝稷的耐盐性以及生长发育具有调控功能。本发明填补了柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在植物耐盐能力调控中无相关报道的空白，为柳枝稷耐盐新品种的选育以及其他牧草抗逆育种提供理论基础和新的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1柳枝稷与拟南芥侧生器官边界域转录因子家族基因LBD的系统发育分析结果。

图2为本发明实施例1柳枝稷不同组织中PvLBD基因的表达特性分析结果。

图3为本发明实施例1中11个柳枝稷PvLBD基因在ABA、干旱（PEG）、高盐、冷和冻胁迫条件下的表达量分析结果。

图4为本发明实施例2中PvLBD12基因克隆的电泳结果图，其中M代表DNA marker，大小为100-2000bp。

图5为本发明实施例3中不同植物中LBD12基因同源性比对和进化树分析结果。

图6为本发明实施例2中菌液PCR检测重组过表达载体Ubi1301-PvLBD12的农杆菌转化结果图，其中M代表DNA marker，大小为100-2000bp。

图7为本发明实施例3中PvLBD12转基因柳枝稷的获得过程。

图8为本发明实施例3中过表达PvLBD12转基因柳枝稷PCR鉴定结果以及转基因柳枝稷中PvLBD12基因相对表达量分析结果，其中WT代表野生型柳枝稷，OE-1至OE-15分别代表不同的转基因柳枝稷。

图9为本发明实施例4中过表达PvLBD12转基因柳枝稷表型特征，其中WT代表野生型柳枝稷，OE-2，OE-5和OE-6分别代表不同的转基因柳枝稷。

图10为本发明实施例4中过表达PvLBD12转基因柳枝稷在盐胁迫下的表型特征，其中WT代表野生型柳枝稷，OE-2，OE-5和OE-6分别代表不同的转基因柳枝稷。

图11为本发明实施例4中过表达PvLBD12转基因柳枝稷在盐胁迫下丙二醛（MDA）和脯氨酸（proline）含量分析结果，其中WT代表野生型柳枝稷，OE-2，OE-5和OE-6分别代表不同的转基因柳枝稷。

图12为本发明实施例4中过表达PvLBD12转基因柳枝稷在盐胁迫下ROS清除酶CAT（过氧化氢酶）和SOD（超氧化物歧化酶）活性，其中WT代表野生型柳枝稷，OE-2，OE-5和OE-6分别代表不同的转基因柳枝稷。

图13为本发明实施例4中过表达PvLBD12转基因柳枝稷在盐胁迫条件下体内Na⁺和K⁺离子含量分析结果，其中WT代表野生型柳枝稷，OE-2，OE-5和OE-6分别代表不同的转基因柳枝稷。

具体实施方式

本发明从柳枝稷“Alamo”中克隆得到柳枝稷PvLBD12基因，构建PvLBD12基因的过表达载体并进行遗传转化，获得过表达PvLBD12转基因柳枝稷。利用野生型柳枝稷“Alamo”和过表达PvLBD12转基因柳枝稷分析了PvLBD12基因在盐胁迫中的调控作用。经实验证实PvLBD12基因对柳枝稷耐盐能力的提高发挥促进作用，对渗透调节物质脯氨酸的生物合成起正调控作用，对降低活性氧积累的超氧化物歧化酶和氧化氢酶的酶活起正调控作用，对脂质过氧化产物丙二醛的生成起负调控作用，同时具有调控植物生长发育的作用。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1柳枝稷侧生器官边界域转录因子家族成员生物信息学分析

柳枝稷侧生器官边界域转录因子家族基因的生物信息学分析及在逆境胁迫中的表达量测定，具体包括以下步骤：

1、柳枝稷侧生器官边界域转录因子家族基因的生物信息学分析

（1）在拟南芥数据库（http://phytozome.jgi.doe.gov）下载侧生器官边界域转录因子AtLBD家族基因，共获得43个拟南芥AtLBD基因。在柳枝稷基因组数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Pvirgatum_v5_1）中，采用AtLBD氨基酸序列进行BLAST分析，得出柳枝稷中69个PvLBD基因家族成员。

（2）采用SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI保守域搜索（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具对69个PvLBD基因家族成员序列进行验证。通过MEGA 5.1构建柳枝稷和拟南芥侧生器官边界域转录因子LBD基因系统进化树，结果如图1所示。利用柳枝稷在线基因表达图谱(PviGEAs)（http://switchgrassgenomics.noble.org/）检索得到PvLBD基因完整的表达数据库，利用HemI软件绘制热图，结果如图2所示。

2、柳枝稷侧生器官边界域转录因子家族基因在逆境胁迫中的表达量测定

（1）以E2时期柳枝稷“Alamo”为材料，对其施加高盐、PEG、ABA、冷和冻等胁迫，收集处理后的柳枝稷叶片，于-80°C冰箱中保存。

（2）取约100 mg上述处理的柳枝稷叶片，在液氮中研磨成粉末，按照Trizol法提取柳枝稷总RNA，经琼脂糖凝胶电泳验证，获得了28S和18S完整的高质量RNA，并且用Nanodrop2000测定RNA浓度和纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8-2.0之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀均>2.0，证明所得到的RNA质量好，可用于cDNA的合成。

（3）以上述RNA样品为模板，按照PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）试剂盒中的说明书进行反转录操作，反转录后产物即为cDNA。

（4）利用Primer 5.0和NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线工具设计荧光定量引物，以反转录获得的cDNA为模板，检测PvLBD基因在不同胁迫中的表达水平，qRT-PCR的分析结果如图3所示，PvLBD12基因（Pavir.JI3923(Pvirgatum v1.1)）响应高盐、PEG、ABA、冷和冻等胁迫，在逆境胁迫条件下表达量显著升高。

实施例2柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12基因的克隆

柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12基因的克隆包括以下步骤：

1、柳枝稷PvLBD12基因克隆引物的设计及基因克隆

（1）按照Trizol法提取柳枝稷总RNA，利用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagentKit反转录试剂盒合成cDNA。

（2）根据柳枝稷全基因组数据库中PvLBD12（Pavir.JI3923(Pvirgatum v1.1)/Pavir.8KG176800(Pvirgatum v5.1)）基因的CDS序列，利用Primer5.0和NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线工具设计引物，引物序列如下（酶切位点加下划线，根据基因序列及载体上的多克隆位点确定）：

正向引物：5'-TCCCCCCGGGATGGCCGGCAGCAGCAGCAGCAGTA -3' （含酶切位点XmaⅠ）；

反向引物：5'- CGGGGTACCTCACGCCCAGAGGGACTCTTTCTTG -3'（含酶切位点Kpn I）；

引物送上海生工生物合成。

（3）以反转录得到的柳枝稷cDNA为模板，利用PvLBD12基因的克隆引物对PvLBD12基因编码区进行PCR扩增，PCR选用Takara高保真PCR酶PrimeSTAR Max反应体系，体系总体积20 µL，包括：10 µL PrimeSTAR Max，8 µL ddH₂O，10 µM的正反向引物各1 0µL，模板cDNA1 µL。PCR反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72℃10 min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测特异性，PvLBD12基因的扩增条带如图4所示。

2、PvLBD12基因克隆载体的构建及基因测序

（1）上述具有清晰条带的琼脂糖凝胶，利用TaKaRa的胶回收试剂盒按照说明书回收PvLBD12基因片段，并利用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计测定回收DNA片段的纯度和浓度。

（2）通过TaKaRa的连接试剂盒按照说明书与pMD19-T载体连接，连接体系如下：0.3pmol目的片段（根据浓度换算成体积），1 µL pMD19-T载体，5 µL solution I，ddH₂O补至10µL，混匀，置于金属浴中16 ℃反应1 h。

（3）将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻弹3-5下，冰浴30 min，将感受态细胞在水浴锅中42℃热激40 s，迅速转入冰中静置2 min。

（4）在转化后的感受态细胞中加入750 µL LB液体培养基，置于摇床上，37℃条件下，220 rpm振荡培养1 h。取200 µL菌液均匀涂布至含100 mg/L氨苄霉素的LB固体培养基平板上，置于培养箱中，37℃条件下倒置培养12 h。

（5）用无菌枪头挑取单菌落10~20个，分别加入到2 mL LB液体培养基中（含100mg/L氨苄霉素），37℃，220 rpm震荡培养12 h。分别取1 µL菌液，按照上述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，并经琼脂糖凝胶电泳检验扩增的特异性。将PCR鉴定含有目的片段的菌液各取1 mL，送上海生工测序（测序采用通用引物M13，单向测序）。

3、PvLBD12基因的序列和结构分析及功能预测

（1）测序得到的PvLBD12基因的CDS序列大小为582 bp（PvLBD12基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），共编码193个氨基酸（PvLBD12的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示）。在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线分析氨基酸序列的保守结构域，结果如图5所示，发现其具有一个LOB结构域，与其他植物中已报道的侧生器官边界域转录因子LBD家族成员的氨基酸保守结构域相同。

（2）利用ExPASy在线数据库（http://expasy.org/）分析PvLBD12蛋白的等电点和分子量，发现PvLBD12蛋白分子量为20792.65d，理论等电点为8.18。利用CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/）在线软件进行蛋白质的亚细胞定位预测，发现PvLBD12定位于细胞核中。

（3）根据PvLBD12氨基酸序列，在Phytozome网站上在线查找高粱、玉米、水稻、谷子、拟南芥、蒺藜苜蓿等植物相应的基因序列，导入MEGA 5.0软件进行系统发育树的构建，结果如图5所示，发现柳枝稷PvLBD12基因与玉米和谷子的同源性最高。

实施例3 PvLBD12基因过表达载体的构建及转基因柳枝稷的获得

本实施例提供柳枝稷PvLBD12基因过表达载体的构建及转基因柳枝稷的获得方法，具体包括如下步骤：

1、PvLBD12基因植物过表达载体的构建

（1）将上述测序正确的含有PvLBD12基因的pMD19T重组质粒的大肠杆菌菌液用TaKaRa质粒小量提取试剂盒提取质粒，并用NanoDrop2000测定质粒浓度。

（2）由于基因克隆上下游引物分别带有Xma I和Kpn I的酶切识别位点，因此选择这两个酶对测序正确的质粒样品及植物过表达载体Ubi1301分别进行双酶切，酶切体系如下：质粒DNA 1 µg（需根据浓度换算成体积），1 µL Xma I，1 µL Kpn I，5 µLCutsmart，ddH₂O补至50 µL，混匀，置于37℃水浴锅反应1 h。酶切结果根据琼脂糖凝胶电泳验证。

（3）利用TaKaRa胶回收试剂盒根据说明书回收酶切的目的基因片段和Ubi1301载体片段，并用NanoDrop2000测定浓度。利用T4 DNA连接酶将目的基因和目的载体片段进行连接，反应体系如下：目的基因：载体片段=10：1，T4 DNA连接酶1 µL，Buffer 2 µL，用ddH₂O补至20 µL，混匀，16℃连接2 h以上。

（4）参照实施例2中的步骤3将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并进行培养。参照实施例2中的方法进行菌液PCR鉴定，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

（5）选择菌液PCR为阳性的大肠杆菌菌液，各取1 mL，送上海生工测序，将测序结果正确的菌液提取质粒，获得构建成功的重组质粒Ubi1301-PvLBD12。

2、农杆菌介导的柳枝稷遗传转化和转基因柳枝稷的获得

（1）将重组质粒Ubi1301-PvLBD12轻轻加入到EHA105感受态细胞中央，轻弹3-5下，冰浴30 min，液氮中速冻2 min，将感受态细胞在37℃水浴锅中热激5 min，迅速转入冰中静置2 min。

（2）在转化后的感受态细胞中加入750 µL YEP液体培养基，置于摇床上，28℃条件下，220 rpm振荡培养2-4 h。

（3）取200 µL菌液涂布在含有100 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEP平板上，28℃避光倒置培养2-3天，挑取单菌落进行菌落PCR检测，结果如图6所示，检测结果呈阳性，表明重组质粒Ubi1301-PvLBD12已成功导入农杆菌，保存农杆菌菌液于-80℃冰箱中。

（4）将农杆菌单斑接种于20 mL YEP液体培养基（含有100 mg/L卡纳霉素和50 mg/L利福平）中，28℃震荡培养至OD600在0.8-1.0之间。3000 rpm离心10 min，弃上清，加入10mL继代液体培养液（4.428 g/L MS，30 g/L蔗糖，5 mg/L 2-4D，1 mg/L 6BA，2g/L 脯氨酸，pH为5.4）重悬菌株至OD600至0.8-1.0之间，加入乙酰丁香酮（AS）至100 μM，28℃条件下放置30 min，备用。

（5）选取大小为2 × 2 mm²的来自同一颗柳枝稷种子诱导的愈伤组织，将其转入50 mL无菌离心管中，约5 mL。向离心管中加入10 mL的3%麦芽糖溶液（含有300 μM的谷氨酰胺（Gln），将离心管置于冰中20 min。

（6）弃去麦芽糖溶液，向离心管中加入10 mL制备好的农杆菌溶液（含有100 μM的AS和300 μM的Gln）。将装有农杆菌的离心管放入真空泵中，-0.8 MPa抽真空10 min，28℃条件下，80rpm缓震侵染30 min。

（7）弃去菌液，将侵染后的愈伤组织放置于3层无菌滤纸上干燥处理2 h。最后将愈伤组织放置于含有500 μL的继代液体培养基（含有300 μM的Gln及100 μM的AS）的2层无菌滤纸上，26℃条件下暗培养2天。

（8）将共培养后的愈伤组织2 × 2 mm²大小转入继代培养基（4.428 g/L MS，30g/L蔗糖，5mg/L 2-4D，1 mg/L 6BA，2g/L脯氨酸，4 g/L凝胶，250 mg/L特美汀，pH为5.8）中恢复培养1周。

（9）将愈伤组织放置MP1筛选培养基（4.428 g/L MS，30 g/L蔗糖，5 mg/L 2-4D，1mg/L 6BA，2g/L脯氨酸，4 g/L凝胶，20 mg/L潮霉素，150 mg/L 特美汀，pH为5.8）中，25±2℃暗培养两周。

（10）将愈伤组织放置于MP2筛选培养基（4.428 g/L MS，30 g/L蔗糖，5 mg/L 2-4D，1 mg/L 6BA，2g/L脯氨酸，4 g/L凝胶，50 mg/L潮霉素，150 mg/L特美汀，pH为5.8）中，25±2℃暗培养两周。

（11）将抗性愈伤组织转入分化培养基（4.428 g/L MS，30 g/L蔗糖，0.2mg/LNAA，1mg/L 6BA，0.05mg/L GA，4 g/L凝胶，20mg/L潮霉素，150 mg/L特美汀，pH为5.8）中，在25±2℃，光周期16 h/黑暗8 h条件下进行再生芽诱导。

（12）如图7所示，将分化苗移栽到MS培养基（4.428 g/L MS，30 g/L蔗糖，4 g/L凝胶，50 mg/L潮霉素，150 mg/L特美汀，pH为5.8）中生根，进一步筛选抗性再生苗。

（13）生根培养4周后，根长至1 cm以上可进行移栽。首先去掉培养瓶盖，在培养室炼苗1-2天后移栽到装有营养土的花盆中，最后转移到温室。

（14）对转化后获得的抗性柳枝稷植株进行PCR验证，鉴定转基因阳性植株。采用CTAB法提取抗性柳枝稷植株的全基因组DNA，用载体上的启动子序列和PvLBD12基因序列设计引物，引物序列为：Ubi1301-F: 5’-TGATGGCCCTGCCTTCATACGCT-3’;PvLBD12-R: 5’-TCACGCCCAGAGGGACTCTTTCTTG-3’，以抗性苗的DNA为模板进行PCR扩增，结果如图8所示，共获得15株转基因柳枝稷阳性苗。

（15）按照Trizol法提取PCR鉴定为阳性的转基因柳枝稷植株的RNA，利用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒合成的cDNA作为模板，设计PvLBD12基因特异引物进行qRT-PCR分析。

引物序列为：PvLBD12-F: 5’-CAATCGCCATCGCAACAAC-3’; PvLBD12-R: 5’-CTGATGATGAGCGGCACTAC-3’，

内参引物序列为：PvUbiquitin-F: 5’-CAGCGAGGGCTCAATAATTCCA-3’;PvUbiquitin-R: 5’-TCTGGCGGACTACAATATCCA-3’。检测PvLBD12基因在不同植株中的表达水平，qRT-PCR的分析结果如图8所示，转基因阳性苗中PvLBD12基因的表达量都高于野生型柳枝稷。

实施例4转基因柳枝稷的表型及耐盐性功能分析

本实施例提供PvLBD12基因在柳枝稷中的生物学功能验证，具体包括如下步骤：

1、转基因柳枝稷的生长发育表型分析

转基因T0代柳枝稷移栽至温室培养。柳枝稷的发育时期分为5个营养生长时期（E1，E2、E3、E4、E5）和3个生殖生长时期（R1、R2、R3）。在营养生长时期（E4时期）观察野生型与转基因柳枝稷的表型，结果如图9所示，转基因柳枝稷的株高高于对照野生型柳枝稷，并通过测定野生型与转基因柳枝稷的株高进一步证明转基因柳枝稷的株高显著高于对照野生型。

2、转基因柳枝稷的耐盐性分析

（1）整株植株水培盐胁迫处理

选择E2时期野生型和过表达PvLBD12转基因柳枝稷为试验材料，在水培装置中进行盐胁迫处理，盐胁迫处理的NaCl浓度分别为0 mM和300 mM,观察处理7天后野生型和转基因柳枝稷的生长情况并拍照记录，结果如图10所示，在300 mM NaCl处理下，转基因柳枝稷的叶片黄化程度显著低于野生型柳枝稷。

（2）生理指标丙二醛和脯氨酸测定

丙二醛含量测定：采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法进行丙二醛含量的测定。选取柳枝稷第3节节间的叶片，剪取叶片同一部位0.5 g。用植物组织破碎仪将样品研磨至粉末状，加入5 mL 10%TCA溶液，4000 rpm离心10 min。在2 mL上清液中加入2 mLTBA，沸水浴15min。冷却至室温，4000 rpm离心10 min，取上清，分别测定波长450 nm、532 nm和600 nm下的吸光度值，计算丙二醛含量。结果如图11所示，在300 mM NaCl处理下，转基因柳枝稷叶片中的丙二醛含量显著低于野生型柳枝稷。

脯氨酸含量测定：采用酸性茚三酮法进行脯氨酸含量的测定。选取柳枝稷第3节节间的叶片，剪取同一部位叶片0.5 g，剪碎后加入5 mL 3%磺基水杨酸，沸水浴10 min。冷却至室温，在2 mL上清中，依次加入2 mL冰乙酸和3 mL茚三酮，沸水浴45 min。冷却至室温后，加入5 mL甲苯萃取，吸取3 mL上清液，测定波长520 nm下的吸光光度值，计算脯氨酸含量。结果如图11所示，在300 mM NaCl处理下，转基因柳枝稷叶片中的脯氨酸含量显著高于野生型柳枝稷。

（3）抗氧化酶的酶活测定

取约0.2 g新鲜叶片，将叶片放在100 mM磷酸盐缓冲液（pH为7.4）中研磨，4 ℃条件下，1000 g离心15 min。参照SOD和CAT提取试剂盒的方法测定SOD和CAT的酶活。结果如图12所示，在盐胁迫条件下，转基因柳枝稷叶和根中的SOD和CAT的酶活高于野生型。

（4）柳枝稷体内Na⁺和K⁺离子含量的测定

分别将盐处理后的柳枝稷地上部分和地下部分放入牛皮纸袋中，65℃烘箱中放置3 d。将烘干的样品粉碎成粉末并过筛，称取约0.05 g样品，加入8 mL超纯水，沸水浴20min，室温5000 rpm离心5 min，将上清转入至50 mL离心管，重复2次。过滤上清液，并加入超纯水，定容至50 mL。用火焰分光光度计分别测定Na⁺和K⁺浓度，记录数值。根据绘制的标准曲线，分别计算Na⁺和K⁺的含量。结果如图13所示，在盐胁迫条件下，转基因柳枝稷地上和地下部位中的Na⁺含量显著低于野生型，K⁺含量显著高于野生型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高植物耐盐性和增加植物株高的方法，其特征在于，转入并表达柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在调控植物耐盐胁迫中的应用，其特征在于，所述转录因子PvLBD12的氨基序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述转录因子PvLBD12的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，过表达柳枝稷PvLBD12基因可以增强植物在盐胁迫条件下的渗透调节、抗氧化损伤的能力。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，过表达柳枝稷PvLBD12基因可以在调控植物体内抗氧化酶活力和调控植物离子吸收。

6.柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12在增加植物株高上的应用。

7.一种包含柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12的基因的生物材料，其特征在于，所述的生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或转基因细胞系。

8.权利要求5所述的生物材料在增加植物株高上的应用。

9.权利要求1所述柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12或权利要求7所述的生物材料在构建转基因植物或植物遗传育种中的应用。

10.一种过表达权利要求1所述的柳枝稷侧生器官边界域转录因子PvLBD12的转基因柳枝稷株系。

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