CN115992182A - 一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，包括dsRNA的浸泡递送和靶标基因的抑制效率检测两个部分，具体为：通过靶标基因的筛选验证，dsRNA的合成，不同浓度下dsRNA的预蛹浸泡以及靶基因抑制效率检测。本发明不仅摸索出了三叶斑潜蝇中预蛹浸泡dsRNA的最佳浓度，而且系统和全面建立了三叶斑潜蝇预蛹浸泡dsRNA的RNA干扰(RNAi)体系，这将在斑潜蝇基因功能研究及基于RNAi的斑潜蝇防控技术研究具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法。
背景技术
三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii(Burgess)隶属双翅目Diptera、潜蝇科Agromyzidae，是一种园艺蔬菜上危害严重的世界性害虫，同时也是我国重要的外来入侵有害生物(Spencer，1973；Wan&Yang，2016)。近些年随着设施农业的发展，斑潜蝇类的害虫危害严重趋势愈显，如今已经逐渐成为园艺及蔬菜生产上的重要害虫。目前防控三叶斑潜蝇常用策略还是施用化学农药，但农药的不合理使用已经导致三叶斑潜蝇抗药性的产生，而抗药性和其它因素一起导致三叶斑潜蝇与其近缘种竞争取代格局的变化，给三叶斑潜蝇的防治带来挑战。
RNA干扰(RNAi)表现出一种高度特异的特点，可以通过促进同源RNA转录物的降解来抑制目的基因在转录后水平上的表达。RNAi是研究靶标基因功能的重要方法，同时由于摄入的双链RNA(dsRNA)可能具有杀虫的特性，RNAi也可用于害虫防治。而在确定目标基因后，选择一种方便合适的方法将dsRNA传递到昆虫体内是非常重要的。
几丁质合成酶(Chitin synthase，Chs)是昆虫几丁质代谢中的关键合成酶，在昆虫的生长发育中起着重要的作用，也是开发新型杀虫剂的理想潜在靶标蛋白。探究Chs在三叶斑潜蝇中的作用及开发RNAi的三叶斑潜蝇新型防控策略来说具有重要的理论意义。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法。
本发明以三叶斑潜蝇为对象，选择生长发育关键的Chs基因为靶标基因进行研究，采用预蛹期浸泡RNAi的方法来探究其在三叶斑潜蝇生长发育中的功能。建立了三叶斑潜蝇浸泡法RNAi体系，包括dsRNA的浸泡递送以及靶标基因的抑制效率检测两个部分。
技术方案：本发明提供一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)dsRNA的浸泡递送：通过靶标基因的获得、dsRNA的合成，然后使用不同浓度的dsRNA+核酸转染试剂浸泡预蛹；
2)靶标基因的抑制效率检测：在浸泡dsRNA后，待其化蛹，并用qRT-PCR法测定蛹中目的基因的表达情况。
其中，步骤1)中的所述靶标基因的获得是通过将以实验室前期克隆获得的靶标基因几丁质合成酶基因部分序列作为模板进行PCR扩增，回收纯化、克隆和测序即得，其中几丁质合成酶基因部分序列为SEQ ID NO.1。
一种三叶斑潜蝇几丁质合成酶基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
其中，步骤1)中所述PCR扩增的引物对如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示(表1)。扩增条件为(Touch-down程序)：94℃预变性3min，94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸30sec，每一个循环降低退火温度1℃，共19个循环，然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
其中，步骤1)中所述dsRNA的合成是是将得到的靶基因与转录试剂混合孵育得到dsRNA，再利用核酸酶消化靶标基因中的DNA和ssRNA，沉淀纯化获得dsRNA，dsRNA的合成引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示(表1)。扩增条件为(Touch-down程序)：94℃预变性3min，94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸30sec，每一个循环降低退火温度1℃，共19个循环，然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
其中，步骤1)中所述dsRNA浓度为300～900ng/μL。
其中，步骤2)中所述qRT-PCR法中采用的引物对如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示(表1)。
其中，步骤2)中所述qRT-PCR的反应体系如下：iTaqTMUniversal
Greensupermix、引物对、cDNA模板、ddH2O。
其中，步骤2)中所述qRT-PCR的反应程序为：94℃3min，94℃30sec，59℃30sec，40个循环，反应结束后读取Ct值。
其中，步骤2)中qRT-PCR法中还包括内参基因引物对如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示(表1)。
有益效果：本发明涉及的RNAi方法能在三叶斑潜蝇中显著的降低靶标基因的表达，确定了浸泡dsRNA后RNAi效率最佳条件，从分子层面为研究昆虫基因功能研究以及开发基于RNAi的防控新技术具有十分重要的意义。
附图说明
图1实施例和对比例所述预蛹浸泡dsRNA后蛹中核酸分布图(A)白光；(B)UV光；注：红、黄、白箭头分别表示染料清洗前、清洗后和未加入染料的处理；
图2实施例和对比例所述不同dsRNA浓度浸泡预蛹后RNAi效率检测结果图。
具体实施方式
实施例
一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，具体步骤如下：
(1)基于目的基因的序列，通过在线网站(http：//sidirect2.rnai.jp/)来查找目的基因序列中的siRNA，通过预测的siRNA的数目，dsRNA引物的设计选择siRNA较多的区域。通过Primer Premier 5软件，选择扩增序列长度约为400bp的区域，在选择的引物序列5’端添加用于转录的T7序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，作为dsRNA引物序列用于后续实验；
(2)以靶标基因几丁质合成酶基因(Chs)序列(SEQ ID NO：1所示)作为模板，对目的基因序列进行PCR扩增，并对其产物依次进行，回收纯化、克隆和测序。扩增条件为(Touch-down程序)：94℃预变性3min，94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸30sec，每一个循环降低退火温度1℃，共19个循环，然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min；
(3)dsRNA的合成按照
Kit的说明书进行：将步骤(2)中扩增产物与
Kit中的转录试剂混合均匀，在37℃下孵育2-4h，以核酸酶来消化DNA和ssRNA，从而得到进一步沉淀纯化的dsRNA，将其稀释后进行电泳和浓度检测，最后置于-80℃超低温冰箱储存以备后续实验的使用；
(4)选择刚离开叶片的末龄幼虫(预蛹)为实验虫态，将其挑入培养皿中，分别使用300ng/μL的dsRNA-Chs+1％RT、600ng/μL的dsRNA-Chs+1％RT和900ng/μL的dsRNA-Chs+1％RT浸泡预蛹，浸泡10s后分别将多余的dsRNA移除，将预蛹挑置含有湿润滤纸的培养皿中，待预蛹化蛹后用于后续实验。
(5)每个处理包含10只预蛹，每个处理重复3次，使用GFP基因为对照。在检测浸泡dsRNA的递送效率实验中，使用核酸染料对dsRNA进行染色，通过凝胶成像系统观察化蛹后蛹中的荧光情况；
(6)在检测沉默效率实验中，在浸泡dsRNA后，待其化蛹48h后，并用qRT-PCR法测定蛹中目的基因的表达情况，每次处理重复3次。
qRT-PCR方法为，反应体系如下：10μL的iTaqTMUniversal
Green supermix(2×)，上下游引物(10μM)各1μl，2μL的不同处理下的cDNA模板，6μL的ddH2O。qPCR程序为：94℃3min，94℃30sec，59℃30sec，40个循环，反应结束后读取Ct值。作各目的基因和内参基因的熔解曲线及标准曲线，然后使用2-ΔΔCt法进行相对表达量分析。Actin作为参考基因。利用one-way ANOVA进行差异显著性分析，然后利用Tukey’s法进行多重比较，数据由SPSS软件分析处理。对于方差分析，数据转换符合方差齐性检验，当P＜0.05时，差异被认为具有统计学意义。
表1.研究中使用的引物序列
对比例1
一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，具体步骤如下：
(1)基于目的基因的序列，通过在线网站(http：//sidirect2.rnai.jp/)来查找目的基因序列中的siRNA，通过预测的siRNA的数目，dsRNA引物的设计选择siRNA较多的区域。通过Primer Premier 5软件，选择扩增序列长度约为400bp的区域，在选择的引物序列5’端添加用于转录的T7序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，作为dsRNA引物序列用于后续实验；
(2)以靶标基因几丁质合成酶基因(Chs)中间片段cDNA作为模板，对目的基因序列进行PCR扩增，并对其产物依次进行，回收纯化、克隆和测序。扩增条件为(Touch-down程序)：94℃预变性3min，94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸30sec，每一个循环降低退火温度1℃，共19个循环，然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min；
(3)dsRNA的合成按照
Kit的说明书进行：将步骤(2)中扩增产物与
Kit中的转录试剂混合均匀，在37℃下孵育2-4h，以核酸酶来消化DNA和ssRNA，从而得到进一步沉淀纯化的dsRNA，将其稀释后进行电泳和浓度检测，最后置于-80℃超低温冰箱储存以备后续实验的使用；
(4)选择刚离开叶片的末龄幼虫(预蛹)为实验虫态，将其挑入培养皿中，使用600ng/μL的dsRNA-GFP+1％RT浸泡预蛹，浸泡后10s后将多余的dsRNA移除，将预蛹挑置含有湿润滤纸的培养皿中，待预蛹化蛹后用于后续实验。
(5)每个处理包含10只预蛹，每个处理重复3次，使用GFP基因为对照。在检测浸泡dsRNA的递送效率实验中，使用核酸染料对dsRNA进行染色，通过凝胶成像系统观察化蛹后蛹中的荧光情况；
(6)在检测沉默效率实验中，在浸泡dsRNA后，待其化蛹48h后，并用qRT-PCR法测定蛹中目的基因的表达情况，每次处理重复3次。
图1预蛹浸泡dsRNA后蛹中核酸分布图(A)白光，(B)UV光；图2为不同dsRNA浓度浸泡预蛹后RNAi效率检测结果图。
本发明采用预蛹期浸泡dsRNA的方法，通过对不同浓度的dsRNA与核酸转染试剂孵育，滴加到三叶斑潜蝇的预蛹上，10s后待预蛹附着dsRNA后，将其转入培养皿中，待其化蛹后通过qPCR来检测其干扰效率。本发明设置了三个靶基因Chs的dsRNA浓度(300、600、900ng/μL)和一个对照组dsGFP。结果显示，与dsGFP对照组相比，Chs基因在含有600和900ng/uL dsRNA的处理下的表达存在显著差异，分别为对照组表达量的56.04％和56.86％(F3，8＝7.214，P＜0.05)。然而，比较300ng/uL处理组与dsGFP对照时，Chs基因的表达没有显著差异。因此最终确定最佳干扰效率条件为：预蛹期浸泡600ng/μL的dsRNA+1％RT于10s后对其靶基因干扰效率最高。
Claims (9)
1.一种三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)dsRNA的浸泡递送：通过靶标基因的获得、dsRNA的合成，然后使用不同浓度的dsRNA+核酸转染试剂浸泡预蛹；
2)靶标基因的抑制效率检测：在浸泡dsRNA后，待其化蛹，并用qRT-PCR法测定蛹中目的基因的表达情况。
2.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤1)中的所述靶标基因的获得是通过将靶标基因几丁质合成酶部分基因序列作为模板进行PCR扩增，回收纯化、克隆和测序即得，其中几丁质合成酶部分基因序列为SEQID NO.1。
3.根据权利要求2所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤1)中所述靶标基因PCR扩增的引物对如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤1)中所述dsRNA的合成是将得到的靶基因与转录试剂混合孵育得到dsRNA，再利用核酸酶消化靶标基因中的DNA和ssRNA，沉淀纯化获得dsRNA，dsRNA的合成引物对如SEQID NO：4和SEQ ID NO：5所示。
5.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤1)中所述dsRNA浓度为300～900ng/μL。
6.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤2)中所述qRT-PCR法中采用的引物对如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
7.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤2)中所述qRT-PCR的反应体系如下：iTaqTMUniversal
Green supermix、引物对、cDNA模板、ddH2O。
8.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤2)中所述qRT-PCR的反应程序为：94℃3min，94℃30sec，59℃30sec，40个循环，反应结束后读取Ct值。
9.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇预蛹期浸泡dsRNA抑制靶标基因表达的方法，其特征在于，步骤2)中qRT-PCR法中还包括内参基因引物对如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
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| Title |
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| RAJAN KATOCH 等: "RNAi for Insect Control: Current Perspective and Future Challenges", APPL BIOCHEM BIOTECHNOL, vol. 171, 1 August 2013 (2013-08-01), pages 847 - 873, XP055240595, DOI: 10.1007/s12010-013-0399-4 * |
| 李晨雨 等: "RNAi技术在昆虫防控研究中的应用和发展前景", 现代农药, vol. 20, no. 1, 28 February 2021 (2021-02-28), pages 1 - 6 * |
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