CN115993455A - Rna结合蛋白nova2作为非小细胞肺癌转移标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了RNA结合蛋白NOVA2作为非小细胞肺癌转移标志物的应用，涉及生物医药技术领域。本发明综合运用转录组测序、生物信息学分析、动物实验和临床样本检验等手段，首次鉴定出一个在NSCLC组织中表达上调，且促进NSCLC转移的标志物，即RNA结合蛋白NOVA2。进一步实验证实，NOVA2通过调控TGF‑β/SMAD介导的EMT而促进NSCLC转移。此外，本发明还发现转录因子ETV4上调了NOVA2的表达。本发明阐明了NOVA2表达上调及其促进TGF‑β/SMAD介导上皮间质转化和NSCLC转移的新机制，丰富了对RNA结合蛋白功能的认识，并为NSCLC转移的预防和治疗提供新的策略和靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及RNA结合蛋白NOVA2作为非小细胞肺癌转移标志物的应用。
背景技术
最新统计显示，肺癌发病率占所有肿瘤的12.5％，并以21％的死亡率高居所有肿瘤第一位。非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常见的病理类型，约占83％，包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌。NSCLC患者的预后较差，其五年生存率仅约15％。转移是癌症患者死亡的主要原因，临床上超过90％的NSCLC患者死亡是由转移引起。针对这一严峻现状，深入探究NSCLC转移的机制，探寻潜在的分子干预靶标，对改善NSCLC患者的预后具有十分重要的意义。
目前，越来越多的研究揭示了EGFR、ALK、ROS1、KRAS和HER2等分子在NSCLC发生发展中的作用及机制，基于以上分子靶点开发的多款靶向药物成功应用于临床，为NSCLC患者带来新的希望和选择。然而，目前临床尚无特异的靶向药物用于NSCLC转移的治疗，其重要原因是缺乏与NSCLC转移相关的特异分子靶点以供下游药物开发与临床研究。因此，筛选NSCLC转移的关键调控因子，揭示其作用机制，为NSCLC转移的临床治疗提供新的干预靶点，是改善NSCLC预后的关键。
RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)是指一类与RNA结合的蛋白质的总称，其在转录后水平参与RNA的剪接加工、修饰、转运和稳定性调节等过程。RBPs在肿瘤转移中的调控作用近年来备受关注，如：Goodarzi等首次揭示了RBPTARBP2在乳腺癌转移中发挥重要作用；最近，Yu等证实RBPRBMS1在转录后水平调控靶标RNA的稳定性而抑制结肠癌转移。然而，RBPs在NSCLC转移中的作用及机制却鲜有报道。
NOVA2(neuro-oncological ventral antigen 2)作为RBP通过识别靶标mRNA的特异YCAY(Y＝C/U)重复序列簇在转录后水平调控靶基因表达。NOVA2最初被认为是一种神经元特异性RBP，Saito等发现NOVA2基因敲除小鼠表现出胼胝体发育不全，以及腹侧运动神经元轴突生长缺陷等特征。Giampietro等发现NOVA2缺失损害Par极性复合体的顶端分布导致内皮细胞极性改变，进而阻碍体内血管腔的形成。然而，NOVA2在人类恶性肿瘤发生发展中的作用却鲜有研究，未见NOVA2调控NSCLC转移的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供RNA结合蛋白NOVA2作为非小细胞肺癌转移标志物的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现RNA结合蛋白NOVA2可以作为非小细胞肺癌转移的生物标志物，NOVA2表达上调促进TGF-β/SMAD介导上皮间质转化(EMT)和NSCLC转移。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种非小细胞癌转移的生物标志物，所述生物标志物为RNA结合蛋白NOVA2。
本发明还提供一种检测上述的生物标志物表达水平的试剂在制备检测非小细胞癌转移的产品中的应用。
本发明还提供一种检测非小细胞癌转移的产品，包括检测上述的生物标志物表达水平的试剂。
进一步地，所述产品为试剂盒或试剂。
本发明还提供一种抑制剂在制备预防和/或治疗非小细胞癌转移的药物中的应用，所述抑制剂为抑制上述的生物标志物表达的物质。
进一步地，所述抑制剂通过降低转录因子ETV4的表达来抑制所述生物标志物的表达。
本发明还提供一种预防和/或治疗非小细胞癌转移的药物，包括抑制上述的生物标志物表达的物质。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明公开了以下技术效果：
本发明综合运用转录组测序、生物信息学分析和临床样本检验等手段，首次鉴定出一个在NSCLC组织中表达上调，且促进NSCLC转移的RBP——NOVA2。进一步实验证实，NOVA2通过调控TGF-β/SMAD介导的EMT而促进NSCLC转移。经生物信息学预测和预实验分析，证实TGF-β/SMAD信号通路关键信号转导因子SMAD4是NOVA2的潜在调控靶标。此外，本发明还发现转录因子ETV4上调了NOVA2的表达。本发明阐明了NOVA2表达上调及其促进TGF-β/SMAD介导EMT和NSCLC转移的新机制，丰富了对RBP功能的认识，并为NSCLC转移的预防和治疗提供新的策略和靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对NSCLC组织及癌旁组织进行转录组测序分析的结果；其中，A：10对NSCLC组织及癌旁组织经转录组测序产生差异表达RBPs集；B：qRT-PCR检测85对NSCLC组织及癌旁组织中相关RBPs mRNA的表达水平；C：将85对NSCLC组织分为非转移(n＝43)和转移(n＝42)两组后，分析相关RBPs mRNA表达水平在两组NSCLC组织中的表达差异(T/N)，T：Tumor，癌组织；N：Normal，癌旁组织；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；D：免疫组化分析NOVA2蛋白在非转移和转移性NSCLC组织中的表达情况；E：TCGA数据库分析NOVA2表达与NSCLC患者预后的关系；
图2为裸鼠转移模型证实过表达NOVA2显著促进NSCLC转移；其中，A：建立NSCLC裸鼠肺癌转移模型的流程示意图；B：尾静脉注射NSCLC稳转细胞(A549)8周后，解剖取完整肺，经Bouin’s染液染色观察肺转移情况，行HE染色分析肺内微转移病理情况；C和D为B图中肺转移灶(C)和肺内微转移灶(D)的统计结果；*P<0.05；**P<0.01；
图3为GSEA富集分析发现NOVA2与EMT基因集(A)以及TGF-β/SMAD基因集(B)显著相关；
图4为过表达NOVA2显著促进TGF-β/SMAD介导的EMT、NSCLC细胞迁移和侵袭；其中，A-B为在A549(A)和H226(B)细胞中检测过表达NOVA2对TGF-β/SMAD介导的EMT相关分子标志物表达的影响；C-D为检测过表达NOVA2对TGF-β/SMAD介导A549(C)和H226(D)细胞迁移能力的影响；E-F为检测过表达NOVA2对TGF-β/SMAD介导A549(E)和H226(F)细胞侵袭能力的影响；**P<0.01；***P<0.001；
图5为NOVA2通过增加SMAD4 mRNA的稳定性而上调其表达；其中，A：NOVA2在SMAD4mRNA3'UTR区有三个潜在作用元件；B：RIP实验证实NOVA2可靶向结合SMAD4 mRNA；C：过表达NOVA2显著上调SMAD4 mRNA和蛋白表达水平；D-E：在A549(D)和H226(E)细胞中过表达NOVA2显著延长SMAD4 mRNA的半衰期；*P<0.05；**P<0.01；
图6为NSCLC中ETV4在转录水平上调NOVA2的表达；其中，A：综合多个肺癌表达谱芯片筛选NSCLC相关的差异表达TFs；B：ETV4在NOVA2启动子区有两个潜在结合位点；TSS，Transcriptional start site，转录起始位点；C：qRT-PCR检测85对NSCLC组织及癌旁组织中ETV4 mRNA的表达情况；D：分析NSCLC组织中ETV4与NOVA2表达间的相关性；E-F：qRT-PCR(E)和Western blot检测(F)瞬时敲降ETV4对NOVA2 mRNA和蛋白表达的影响；***P<0.001；
图7为敲降ETV4显著抑制TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC细胞迁移和侵袭；其中，A-B：在NSCLC细胞A549中敲降ETV4表达(A)，检测其对TGF-β/SMAD介导的EMT相关分子标志物表达的影响(B)；C-D：在NSCLC细胞A549中敲降ETV4表达，检测其对TGF-β/SMAD介导的NSCLC细胞迁移(C)和侵袭(D)能力的影响；**P<0.01；***P<0.001；
图8为NOVA2在转录后水平上调SMAD4表达，进而促进TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC转移的示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，A549和H226购自武汉普诺赛公司，pLVX-IRES-Neo和pLKO.1-puro购自锐博(广州)生物科技有限公司。
实施例1
一、方法
1.NOVA2调控TGF-β/SMAD介导EMT促进NSCLC转移的功能研究
1.1利用转录组测序和临床样本验证筛选NSCLC转移特异相关的RBP——NOVA2。
①样本制备：取10对NSCLC组织及癌旁组织，剪取合适大小组织以TRIZol研磨、裂解并提取RNA。所收集RNA总量需大于10μg，浓度大于100μg/μL；RIN大于7.5，28S/18S大于1.0，纯度要求OD260/280在1.8～2.2区间。
②建立文库、高通量测序：对RNA样本进行富集，按NEB标准建库方式进行建库和质控，上机完成高通量测序。
③数据分析：将高通量测序结果进行数据处理与分析，可得到NSCLC相关的差异表达基因集(上调表达和下调表达)；上述差异表达基因集与RBPs库(ATtRACT)相交可筛选到差异表达的RBPs集。
④在NSCLC组织样本中验证上述RBPs mRNA的表达水平，进一步分析其在转移和非转移NSCLC组织中的表达差异；免疫组化和生存期分析上述RBP在NSCLC组织中的表达情况及其与NSCLC患者预后的关系。
1.2利用RNAi、同源重组、慢病毒载体构建、包装和感染等技术分别构建过表达和敲降NOVA2的NSCLC稳转细胞系(A549和H226)。
①本发明选用pLVX-IRES-Neo(过表达载体)和pLKO.1-puro(敲降载体)质粒构建慢病毒载体。
②通过同源重组技术将NOVA2基因的CDS序列克隆至pLVX-IRES-Neo载体；而通过Thermo Fisher在线工具设计靶向NOVA2的干扰shRNA序列，选择两条评分最高的shRNA序列，合成并将其连入pLKO.1-puro载体。
两条评分最高的shRNA序列如下：
序列1：
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CACCGCTTAACACGCTGGCAAGTTACGAATAACTTGCCAGCGTGTTAAGC；
NM_002516.4_shrna_1360_bottom
AAAAGCTTAACACGCTGGCAAGTTATTCGTAACTTGCCAGCGTGTTAAGC。
序列2：
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CACCGCCGCTCAATACCTCATCAGTCGAAACTGATGAGGTATTGAGCGGC；
NM_002516.4_shrna_1916_bottom
AAAAGCCGCTCAATACCTCATCAGTTTCGACTGATGAGGTATTGAGCGGC。③将上述构建好的载体与相应的病毒包装质粒共转染至293T细胞，于转染后48h收集病毒并感染A549和H226细胞，72h后分别以G418(400μg/mL)和嘌呤霉素(2μg/mL)筛选过表达和敲降NOVA2的NSCLC稳转细胞系。
1.3检测NOVA2对TGF-β/SMAD介导的EMT相关上皮和间质标志物表达的影响。同时检测NOVA2对TGF-β/SMAD介导的NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响。
①将过表达NOVA2的NSCLC稳转细胞系分为两组：NOVA2过表达组(pLVX-NOVA2)和对照组(pLVX-Vector)；将稳定敲降NOVA2的NSCLC细胞系分为两组：NOVA2敲降组(sh-NOVA2)和对照组(sh-NC)。
②以5ng/mL TGF-β1刺激24h诱导上述细胞发生EMT，Western blot检测EMT相关上皮标志物(E-cadherin)和间质标志物(N-cadherin、Snail)的表达情况。
③同时运用Transwell实验技术检测NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。选用24-wellTranswell小室开展Transwell迁移和侵袭实验，其中用作开展侵袭实验的Transwell小室还需要铺一层Matrigel胶(Corning公司)，以迁移或侵袭至Transwell小室膜下的细胞相对数目来评价NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。
1.4建立裸鼠肿瘤转移模型，明确NOVA2对TGF-β/SMAD介导的NSCLC转移的影响。
①以4-6周龄BALB/c裸鼠建立NSCLC转移裸鼠模型，开展NSCLC细胞体内转移能力的研究。
②将NSCLC稳转细胞A549进行如下分组：稳定过表达NOVA2组(pLVX-NOVA2)和对照组(pLVX-Vector)；稳定过敲降NOVA2组(sh-NOVA2)和对照组(sh-NC)。
③将上述各组NSCLC稳转细胞(2×106cells/只)尾静脉注射至BALB/c裸鼠体内，并于次日起每隔5天(1、6、11和16天)腹腔注射TGF-β1(4μg/kg BW)，定期称量体重并利用活体成像监测NSCLC细胞体内转移进展。
④8周后安乐死处死裸鼠，解剖取完整肺组织，统计肺表面转移灶结节数，并对部分肺组织开展石蜡切片，行HE染色观察肺转移病理变化；将部分肿瘤转移的肺组织放入液氮冻存，待提取蛋白质，Western blot检测NOVA2、SMAD4和EMT相关分子标志物(E-cadherin、N-cadherin和Snail)的表达水平。
2.NOVA2在转录后水平调控SMAD4 mRNA的稳定性，进而促进TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC转移的分子机制研究。
2.1研究NOVA2在转录后水平对SMAD4的调控作用。
①在过表达和敲降NOVA2的NSCLC稳转细胞系(A549和H226)中，利用qRT-PCR和Westernblot方法检测NOVA2对SMAD4 mRNA和蛋白表达水平的影响。
②利用RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation，RIP)实验检测NOVA2(蛋白)和SMAD4 mRNA间的相互作用。选用EZ-Magna RIP试剂盒(Millipore公司)在NSCLC细胞系中开展相关RIP实验，待NSCLC细胞生长至合适密度(90％)，裂解细胞并收集产物，将细胞裂解产物和已结合NOVA2或IgG抗体的磁珠进行孵育，提取、纯化RNA，针对SMAD4 mRNA设计特异的RIP-PCR引物(包含NOVA2在SMAD4mRNA3'UTR区的潜在结合序列簇)，qRT-PCR检测NOVA2-RIP产物中SMAD4 mRNA的富集情况。
③利用RNApull-down实验进一步验证NOVA2蛋白和SMAD4 mRNA间的互作关系。选用Pierce TM Magnetic RNA-Protein Pull-down试剂盒(Thermo Fisher公司)在NSCLC细胞系中开展相关实验，体外合成生物素标记的野生型及突变型SMAD4单链寡核苷酸(包含NOVA2在SMAD4 mRNA3'UTR区的潜在结合序列簇)，将其与磁珠孵育，然后将磁珠与NSCLC细胞提取物孵育，提取蛋白，Westernblot检测SMAD4mRNA是否特异结合NOVA2蛋白。
④利用双荧光报告基因(Dual-luciferase report assay)技术检测NOVA2对SMAD4mRNA 3'UTR荧光活性的影响。应用RBPs预测数据库分析发现NOVA2在SMAD4mRNA 3'UTR区有三个潜在结合的序列簇。构建含有NOVA2三个潜在结合序列簇(约500bp)的双荧光报告载体psiCHECK2-SMAD4-3'-UTR-wild type(野生型)，以及含有相应NOVA2结合序列簇突变序列的载体psiCHECK2-SMAD4-3'-UTR-wild type-mutant(突变型)。将上述载体转染至已构建的过表达和敲降NOVA2的NSCLC稳转细胞中，检测NOVA2对SMAD4 mRNA3'UTR荧光活性的影响(具体方法参考文献“Wang S,Tong X,Li C,et al.Quaking 5suppresses TGF-β-induced EMT and cell invasion in lung adenocarcinoma.EMBO Rep.2021；22(6):e52079.”)。
⑤利用mRNA半衰期实验检测NOVA2对SMAD4 mRNA稳定性的影响。在过表达NOVA2和敲降NOVA2的NSCLC稳转细胞系(A549和H226)中，选用放线菌素D(Actinomycin D，ActD)分别处理细胞0、2、4和6h，以抑制RNA的合成过程；提取细胞总RNA，利用qRT-PCR方法检测SMAD4 mRNA随时间的衰减变化情况。
⑥利用免疫共沉淀联合质谱分析(Immunoprecipitation-Mass spectrometry，IP-MS)检测NOVA2募集何种调控RNA代谢的关键分子而提高SMAD4 mRNA的稳定性。构建FLAG-tag的NOVA2表达质粒并转染至NSCLC细胞系，以FLAG抗体捕获细胞裂解液中与NOVA2相互作用的蛋白，行质谱分析，并以Western blot对捕获的互作蛋白进行检测、验证；结合生信方法筛选质谱结果中具有调控RNA代谢功能的重要蛋白开展后续研究。
2.2建立敲降SMAD4的NSCLC稳转细胞系(A549和H226)，检测EMT相关分子标志物、细胞迁移和侵袭能力以及体内转移能力，验证SMAD4在TGF-β/SMAD介导EMT促进NSCLC转移中的重要作用。
①参考研究方法1.2，建立敲降SMAD4的NSCLC稳转细胞系(A549和H226)。
②参考研究方法1.3，利用Western blot、Transwelll迁移和侵袭实验检测敲降SMAD4对TGF-β/SMAD介导的EMT、NSCLC细胞迁移和侵袭能力的影响。
③参考研究方法1.4，建立裸鼠肿瘤转移模型，分析敲降SMAD4对TGF-β/SMAD介导的NSCLC转移的影响。
2.3通过回补实验证实NOVA2通过调控SMAD4的表达而促进TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC转移。
①参考研究方法1.2，在过表达NOVA2的NSCLC稳转细胞系中进一步敲降SMAD4，实验分为以下四组：对照组(Vector+sh-NC)、NOVA2过表达组(sh-NC+NOVA2)、SMAD4敲降组(Vector+sh-SMAD4)和NOVA2过表达&SMAD4敲降组(NOVA2+sh-SMAD4)。
②参考研究方法1.3，利用Westernblot、Transwelll迁移和侵袭实验分析NOVA2调控TGF-β/SMAD介导的EMT，促进NSCLC细胞迁移和侵袭是否依赖于SMAD4。
③参考研究方法1.4，建立裸鼠肿瘤转移模型，分析NOVA2促进TGF-β/SMAD介导的NSCLC转移是否依赖于SMAD4。
3转录因子ETV4在NSCLC中上调NOVA2表达的分子机制研究
3.1研究ETV4在转录水平对NOVA2表达的影响。在NSCLC细胞系(A549和H226)中过表达和敲降ETV4，利用qRT-PCR和Western blot方法检测ETV4对NOVA2 mRNA和蛋白表达的影响。
3.2研究ETV4在转录水平对NOVA2的调控作用。
①利用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)和PCR技术，分析ETV4(蛋白)与NOVA2 DNA启动子间的相互作用。本实验选用
试剂盒(Active Motif公司)在NSCLC细胞系中开展相关ChIP实验。待细胞生长至合适密度(90％)，固定并裂解细胞，将细胞裂解产物(DNA)在超声下破碎至300bp左右，用可开展ChIP实验的ETV4抗体孵育超声产物，针对NOVA2启动子设计特异的ChIP-PCR引物，PCR检测ETV4-ChIP产物中NOVA2的富集情况。
②利用凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)实验进一步验证转录因子ETV4和NOVA2(DNA启动子)间的互作关系。本实验选用LightShiftTM Chemiluminescent EMSA试剂盒(Thermo Fisher公司)在NSCLC细胞系中开展相关EMSA实验，合成生物素标记NOVA2 DNA启动子特异序列的双链寡核苷酸探针及相应未标记生物素的野生型和突变型双链寡核苷酸竞争性探针(包含ETV4在NOVA2启动子区的潜在结合序列)，将其与NSCLC细胞核提取物孵育，通过添加抗ETV4和IgG抗体评估EMSA效果，通过检测是否出现特异性Supershift带(探针DNA-蛋白复合物)判断ETV4和NOVA2DNA的相互作用。
③利用双荧光报告基因(Dual-luciferase report assay)技术检测ETV4对NOVA2DNA启动子荧光活性的影响。利用转录因子预测软件分析ETV4在NOVA2 DNA启动子区域的潜在结合序列，构建含有ETV4结合位点的NOVA2启动子双荧光报告载体pGL3-NOVA2promoter-wildtype(野生型)，以及含有相应ETV4结合位点突变序列的pGL3-NOVA2promoter-mutant(突变型)。将上述载体转染至过表达和敲降ETV4的NSCLC细胞系(A549和H226)，检测改变ETV4表达对NOVA2 DNA启动子荧光活性的影响(具体方法参考文献“Wang S,Tong X,Li C,et al.Quaking 5suppresses TGF-β-induced EMT and cellinvasion in lung adenocarcinoma.EMBO Rep.2021；22(6):e52079”)。
3.3研究ETV4对TGF-β/SMAD介导的EMT、NSCLC细胞迁移和侵袭的影响。
①在NSCLC细胞系(A549和H226)中过表达和敲降ETV4，利用Western blot检测ETV4对TGF-β/SMAD介导的EMT相关上皮和间质标志物表达的影响。
②并利用Transwell迁移和侵袭实验检测NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。
5.统计学分析
本发明中，所有数据均使用SPSS和GraphPad Prism软件进行统计、分析。根据实验分组和数据类型的差异，本发明采用不同的检验方法：对于细胞、动物和临床样本分析中所涉及的两组数据间的比较，采用非配对t检验(双尾)；对于临床样本多因素分析中涉及三组数据间的分析，采用Kruskall-Wallis检验；对于NSCLC临床样本中两组数据相关性的分析，采用Pearson’s correlation检验。使用Kaplan-Meier法计算生存曲线，并以Log-rank检验对其差异进行评估。实验数据以“Means±SEM”表示，以P<0.05认为差异具有统计学意义。
二、结果
1.鉴定出NSCLC中表达上调且与转移特异相关的RBP--NOVA2
本发明对NSCLC组织及癌旁组织(10对)进行转录组测序分析(RNA-seq)，发现NSCLC组织中有3个RBPs表达显著上调，1个RBPs表达显著下调(图1中A)。
其后，本发明在85对NSCLC组织和癌旁组织中对上述4个RBPs进行扩大样本验证，其结果与转录组测序结果一致(图1中B)。令人意外的是，当本发明将NSCLC组织分为转移和非转移两组进行分析时发现，只有NOVA2在发生转移的NSCLC组织中呈差异表达(上调)(图1中C)，提示NOVA2高表达可能参与了NSCLC转移过程。
接下来，本发明检测了NOVA2蛋白在转移和非转移的NSCLC组织中的表达情况，发现NOVA2蛋白在转移的NSCLC组织中呈高表达(图1中D)，而TCGA数据库分析表明NOVA2高表达与NSCLC患者预后不良显著相关(图1中E)。
以上结果表明RBPNOVA2在转移性NSCLC组织中表达上调，其高表达与NSCLC转移和预后显著相关，提示NOVA2可能在NSCLC转移中发挥重要作用。
2.裸鼠转移模型证实过表达NOVA2显著促进NSCLC转移
为了明确NOVA2在NSCLC转移中的作用，本发明构建了NOVA2过表达的NSCLC稳转细胞系，并将其与对照细胞通过尾静脉注射至裸鼠体内，构建NSCLC裸鼠转移模型(图2中A)。结果发现：接种NSCLC细胞8周后，裸鼠肺表面均出现显著可见的肺转移灶结节，但过表达NOVA2组裸鼠肺表面转移灶结节数显著多于对照组(图2中B和C)。将肺组织切片后，行HE染色观察肺组织的病理变化，结果显示过表达NOVA2组裸鼠肺组织形成的微转移灶数量显著多于对照组(图2中B和D)。以上结果表明NOVA2过表达显著促进了NSCLC转移，为后续深入探讨NOVA2促进NSCLC转移的分子机制作了较好铺垫。
3.过表达NOVA2显著促进TGF-β/SMAD介导的EMT、NSCLC细胞迁移和侵袭
为了探寻NOVA2促进NSCLC转移的潜在机制，本发明对前期转录组测序结果(1.1中10对NSCLC组织及癌旁组织)进行基因富集分析(GSEA)分析发现，NOVA2高表达与上皮间质转化(EMT)基因集以及TGF-β/SMAD基因集显著相关(图3中A和B)。为了进一步证实NOVA2是否通过调控TGF-β/SMAD介导的EMT而促进NSCLC转移，本发明开展了以下研究：用TGF-β1(激活TGF-β/SMAD信号通路)处理NOVA2过表达的NSCLC稳转细胞及其对照细胞诱导EMT，检测EMT相关上皮(E-cadherin)和间质(N-caherin和Snail)标志物的表达以及细胞迁移和侵袭能力。结果表明：过表达NOVA2显著促进了TGF-β1诱导上皮标志物E-cadherin的表达下调以及间质标志物N-cadherin和Snail的表达上调(图4中A和B)；同时本发明发现过表达NOVA2促进了TGF-β1诱导NSCLC细胞的迁移和侵袭(图4中C-F)。以上结果表明过表达NOVA2显著促进TGF-β/SMAD介导的EMT、NSCLC细胞迁移和侵袭，提示NOVA2是TGF-β/SMAD介导EMT的重要调控因子。
4.NOVA2通过增加SMAD4 mRNA的稳定性而上调其表达
为了证实NOVA2是否通过转录后调控TGF-β/SMAD信号通路某一关键因子的表达，进而促进TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC转移。本发明利用RBPs预测数据库对TGF-β/SMAD信号通路的关键信号转导因子逐一分析发现，仅SMAD4 mRNA的3'UTR上有三个NOVA2潜在识别、结合的重复序列簇((YCAY)n，Y＝C/U)，提示SMAD4是NOVA2的潜在调控靶标(图5中A)。
接下来，本发明通过RNA-蛋白共沉淀(RIP)实验(方法参考文献“Wang S,Tong X,Li C,et al.Quaking 5suppresses TGF-β-induced EMT and cell invasion in lungadenocarcinoma.EMBORep.2021；22(6):e52079”)证实NSCLC细胞中NOVA2可靶向结合SMAD4mRNA(图5中B)；过表达NOVA2显著上调了SMAD4 mRNA和蛋白表达水平(图5中C)；放线菌素D(ActD)处理发现，过表达NOVA2显著延长了SMAD4 mRNA的半衰期(图5中D和E)。以上结果提示NOVA2通过增加SMAD4mRNA的稳定性而上调其表达，进而促进TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC转移。
5.NSCLC中ETV4在转录水平上调NOVA2的表达
为了证实NOVA2在NSCLC中的表达上调是否是某个表达异常的转录因子所致，本发明对多个肺癌表达谱芯片数据(TCGA、GEO和GSE数据集)进行整合分析，初步鉴定出4个NSCLC相关的差异表达转录因子(TFs)：ETV4、KLF4、TBX3和TFAP2A(图6中A)，而转录位点预测结果表明仅转录因子ETV4在NOVA2启动子上有两个潜在的结合位点(图6中B)。进一步研究发现，ETV4在NSCLC组织中表达显著上调，且ETV4与NOVA2的表达呈显著正相关(图6中C和D)。
此外，在NSCLC细胞A549中敲降ETV4表达显著下调了NOVA2 mRNA和蛋白的表达(图6中E和F)。以上结果提示：高表达的ETV4在转录水平上调NOVA2的表达，是其在NSCLC中表达上调的潜在机制。
6.敲降ETV4显著抑制TGF-β/SMAD介导的EMT、NSCLC细胞迁移和侵袭
本发明已初步证实ETV4在转录水平上调NOVA2的表达。那么，在调控TGF-β/SMAD介导的EMT中，ETV4是否发挥与NOVA2相似的促进作用呢？本发明用TGF-β1处理NSCLC细胞A549诱导EMT，发现敲降ETV4显著抑制了TGF-β1诱导E-cadherin的表达下调以及N-caherin和Snail的表达上调(图7中A和B)。本发明还发现敲降ETV4抑制了TGF-β1诱导NSCLC细胞的迁移和侵袭(图7中C和D)。以上结果表明，ETV4参与对TGF-β/SMAD介导的EMT的调控。
综上所述，本发明证明了RNA结合蛋白(RBP)NOVA2在转录后水平上调了SMAD4表达，进而促进TGF-β/SMAD介导的EMT和NSCLC转移；ETV4在转录水平上调NOVA2的表达(图8)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种非小细胞癌转移的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为RNA结合蛋白NOVA2。
2.一种检测如权利要求1所述的生物标志物表达水平的试剂在制备检测非小细胞癌转移的产品中的应用。
3.一种检测非小细胞癌转移的产品，其特征在于，包括检测如权利要求1所述的生物标志物表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒或试剂。
5.一种抑制剂在制备预防和/或治疗非小细胞癌转移的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为抑制如权利要求1所述的生物标志物表达的物质。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制剂通过降低转录因子ETV4的表达来抑制所述生物标志物的表达。
7.一种预防和/或治疗非小细胞癌转移的药物，其特征在于，包括抑制如权利要求1所述的生物标志物表达的物质。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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