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CN116367734A - 碱性pH下的蛋白质纯化方法 - Google Patents

碱性pH下的蛋白质纯化方法 Download PDF

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CN116367734A
CN116367734A CN202080106539.9A CN202080106539A CN116367734A CN 116367734 A CN116367734 A CN 116367734A CN 202080106539 A CN202080106539 A CN 202080106539A CN 116367734 A CN116367734 A CN 116367734A
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protein
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aqueous suspension
proteins
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C·A·小亨德松
R·M·D·N·拉特纳亚克
I·G·朗宁根
L·达菲克
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Impossible Foods Inc
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Abstract

本公开描述了用于从包括细胞壁的细胞中纯化胞质蛋白的方法，所述方法涉及在8.5至12.0的范围内的碱性pH下的处理。对细胞进行穿孔而不是裂解，由此允许与细胞壁碎片良好分离。穿孔可以涉及碱性耗竭处理、加热至约6℃、使用还原剂、机械处理和其组合。所述方法进一步产生具有最小化的不令人期望的气味和风味的蛋白质产品。

Description

碱性pH下的蛋白质纯化方法
技术领域
本发明涉及用于纯化蛋白质的方法，并且更具体地涉及用于纯化蛋白质的使经纯化的蛋白质中的不令人期望的气味和风味的产生最小化、增强功能性并且增加蛋白质产率的方法。本发明还涉及包含经纯化的蛋白质的食物产品。
以电子方式提交的文本文件的描述
与本申请一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本，文件名：0247WO1SEQ.txt，记录日期：2020年9月14日，文件大小：约49千字节。
背景技术
模仿动物源性食物产品(例如，奶酪或肉)的食物产品的成功可能取决于产生功能性蛋白质，所述功能性蛋白质可以被操纵并且具有低风味，因此蛋白质的来源不容易识别并且不向食物产品提供不可接受的“异味”。常见的蛋白质纯化方法通常包含使用不是食品安全的和/或产生变性蛋白质的化学品的步骤。有用的是具有一种进行蛋白质纯化的方法，所述方法是食物安全的并且在经纯化的蛋白质中产生最少的不令人期望的气味和风味。
发明内容
本文档提供了蛋白质组合物，并且还提供了在整个过程中使用至少约8.5的pH用于从包含真核生物、真菌、原核生物和古细菌细胞在内的微生物细胞纯化蛋白质的方法，所述方法产生了蛋白质组合物。本文档还提供了包含这些蛋白质组合物的食物产品。在一些实施例中，本文所描述的方法是食品安全的、廉价的且可扩展的，同时使经纯化的蛋白质中的不令人期望的气味和风味的产生最小化并且增加蛋白质产率。在本文提供的纯化蛋白质的方法的一些实施例中，其中在纯化过程期间pH小于8.5(例如，8.0或更小)，与在纯化工艺中的一些或全部纯化工艺期间pH大于8.5(例如，9.0或更大)的纯化蛋白质的其它对应方法相比，在所得蛋白质组合物中可能存在增加的异味和/或变味，并且过程产率可能降低。在一些实施例中，本文所描述的组合物可以是食品安全且廉价的，具有最小的不令人期望的气味和风味。可以使用本文所描述的方法纯化总细胞蛋白，例如，从整个细胞中分离或由其产生的蛋白质，包含来自细胞质和细胞核和亚细胞区室(例如，溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、内质网、高尔基体、周质、分泌囊泡、细胞外基质、生物膜、叶绿体和细胞核)的蛋白质(如果适用的话)。在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物可以包括总细胞蛋白，但术语“总”不指示蛋白质组合物中存在每种细胞蛋白。在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物可以基本上由总细胞蛋白组成。
此外，蛋白质组合物中的蛋白质可以是功能性的。如本文所述，功能性蛋白质可以具有以下性质中的一种或多种：非变性；能够在加热时形成凝胶(例如，在约7.0的pH下约25mg/mL至约250mg/mL(例如，约25mg/mL至约50mg/mL、约25mg/mL至约100mg/mL、约25mg/mL至约150mg/mL、约25mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约250mg/mL、约100mg/mL至约250mg/mL、约150mg/mL至约250mg/mL或约200mg/mL至约250mg/mL)的悬浮液在加热至约65℃时热转变成凝胶)；在约50℃与约85℃之间的温育期间的热变性，其中在约85℃下经过约20分钟之后，大于约80％的蛋白质变性，如通过差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光测定法(DSF)测量的；在处于或高于约50mg/mL(5％w/v)的经纯化的蛋白质的溶液或悬浮液中，当在处于或高于约85℃下加热约20分钟时，蛋白质形成独立式凝胶(具有例如，100Pa储能模量)；可以在约pH 5.5与约pH 10.0之间变性和胶凝；当基于非蛋白溶质的浓度计算离子强度(I)时，可以在I低于约0.5M的溶液中变性和胶凝；在约10mg/mL的蛋白质浓度下，粒径分布D10、D50和D90分别小于约0.1μm、1.0μm和5μm；具有酶活性；在约4.0至约8.0的pH范围内乳液活性指数(EAI)大于或等于约50m2/g蛋白质。
在一些实施例中，(w/v)悬浮液可以指每100mL溶液中干固体的量(以克为单位)。
可以存在于蛋白质组合物中的功能性蛋白质的非限制性实例包含具有酶活性的蛋白质，如但不限于半胱氨酸合酶(Met17p，ED 2.5.1.47)、胱硫醚β-合酶(Cys4p，EC4.2.1.22)、己糖激酶、葡萄糖氧化酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和脂肪酶。
酶活性还可以更一般地描述，并且实例可以包含例如氨基酸分解代谢(例如，当没有添加L-半胱氨酸(例如，L-半胱氨酸本身，或以异构体混合物的形式提供)时(例如，添加到pH为7.0的5mL 2％(w/v)悬浮液中)，硫化氢(H2S)在顶部空间中以小于约0.1ppm存在，并且在(例如，在25℃下经过约24小时之后)将L-半胱氨酸添加至25mM最终浓度(例如，添加至5mL 2％(w/v)悬浮液中)之后，H2S以大于或等于约0.2ppm(例如，大于或等于约0.3ppm)存在)、葡萄糖分解代谢(例如，从葡萄糖产生丙酮酸盐、产生葡萄糖-6-磷酸盐、产生乳酸盐、产生D-葡萄糖酸-δ-内酯)、脂质分解代谢(例如，脂质水解)、还原谷胱甘肽二硫化物和分解过氧化氢。例如，可以使用单酶反应(例如，通过己糖激酶从葡萄糖产生葡萄糖-6-磷酸盐)或多酶反应(例如，通过多于一种酶将起始材料转化为最终产物(例如，通过糖酵解的酶从葡萄糖产生丙酮酸盐或通过细胞谷胱甘肽生物合成途径从谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸产生谷胱甘肽))来说明酶活性。
蛋白质组合物可以具有食物活性。如本文所述，具有食物活性的蛋白质可以具有以下性质(基于每克定义)中的一种或多种：能够形成凝胶；能够乳化油和水(水包油、油包水)；能够乳化空气和水(水包空气)。
在说明书和附图中，使用了以下缩写：CS(细胞悬浮液)；RN(细胞洗涤)；LY(裂解物，例如，通过珠粒研磨、均质器、高剪切混合器或微流化器获得)；CN(离心分离液，例如，进行离心旋转以去除固体的上清液)；MF(微滤，例如，使用直径为0.2μm、0.3μm或0.45μm的孔径)；DF(渗滤，例如，使用pH 9.3+/-0.3的水)；UF(超滤，例如，使用5kDa、10kDa、30kDa或50kDa的截留分子量)；PZ(巴氏杀菌，例如，在65℃下持续60秒)；SD(喷雾干燥，例如，入口温度为180℃，出口温度为80℃并且进料为0.27LPM)。
术语“约”是相对于特定值使用的，以解释在测量值时的实验变化。
在一方面，本文档包含一种用于从细胞(例如，多个细胞)纯化蛋白质的方法，所述方法包含裂解所述多个细胞的水性悬浮液以获得细胞裂解物；任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，澄清所述细胞裂解物以获得经澄清的裂解物；将所述经澄清的裂解物过滤以获得经过滤的裂解物；将所述经过滤的裂解物浓缩以获得蛋白质组合物；以及任选地对蛋白质的所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤、澄清步骤和过滤步骤独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品含有少于10重量％的动物产品。在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品含有少于5重量％的动物产品。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或食物产品含有少于1重量％的动物产品。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或食物产品不含有动物产品。
在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品含有少于10重量％的动物源性产品。在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品含有少于5重量％的动物源性产品。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或食物产品含有少于1重量％的动物源性产品。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或食物产品不含有动物源性产品。
在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品含有少于10重量％的动物肉。在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品含有少于5重量％的动物肉。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或食物产品含有少于1重量％的动物肉。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或食物产品不含有动物肉。
在本文所描述的蛋白质组合物或食物产品的一些实施例中，所述蛋白质组合物或食物产品不含或基本上不含乳糖、大肠杆菌(E.coli)、乳清、酪蛋白、动物脂肪、大豆蛋白、坚果蛋白、卵清蛋白、明胶、乳制产品、动物产品、动物源性产品、琼脂、角叉菜胶、豆腐、胆固醇或其两种或更多种。
如本文所使用的，术语“动物产品”是指从动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、两栖动物、爬行动物、昆虫、软体动物、甲壳动物、珊瑚、蛛形纲动物或马蹄蟹)的身体获得或由其产生的材料。实例包含但不限于肉(meat)、脂肪、肉(flesh)、血液、乳、蛋、鱼胶、凝乳酶、毛皮、皮肤、毛发、骨、纤维、软骨、酪蛋白、明胶和蜂蜜。术语“无动物产品”意指组合物不含有任何动物产品。
如本文所使用的，术语“动物源性产品”是指源自动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、两栖动物、爬行动物、昆虫、软体动物、甲壳动物、珊瑚、蛛形纲动物或马蹄蟹)的身体的材料或化合物。实例包含但不限于源自动物肉、脂肪、肉、血液、乳、蛋、鱼胶、凝乳酶、毛皮、皮肤、毛发、骨、纤维、软骨、酪蛋白、明胶和蜂蜜的材料或化合物。动物源性产品的另外的实例包含从动物的身体分离的材料，包含但不限于激素、氨基酸、维生素、有机酸、蛋白质、胶原、染料、脂肪酸、油、甘油、糖、角蛋白和从动物的身体分离的核酸。术语“无动物源性产品”意指组合物不含有任何动物产品。
如本文所使用的，术语“动物肉”是指动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、两栖动物、爬行动物、昆虫、软体动物、甲壳动物、珊瑚、蛛形纲动物或马蹄蟹)的肉。实例包含但不限于肌肉和器官。术语“无动物肉”意指组合物不含有任何动物肉。
如本文所使用的，术语“基本上不含”意指在组合物中存在少于5.0重量％(例如，少于5.0重量％、少于4.0重量％、少于3.0重量％、少于2.5重量％、少于2.0重量％、少于1.5重量％、少于1.0重量％、少于0.5重量％、少于0.1重量％或少于0.01重量％)的参考成分。例如，当如本文所公开的乳制复制品含有少于5.0重量％(例如，少于4.0重量％、少于3.0重量％、少于2.5重量％、少于2.0重量％、少于1.5重量％、少于1.0重量％、少于0.5重量％、少于0.1重量％或少于0.01重量％)的动物产品时，所述乳制复制品基本上不含动物产品。
如本文所使用的，术语“不含”意指在组合物中检测不到任何提及的成分。例如，当本文所公开的蛋白质组合物或食物产品不含有可检测动物产品时，所述蛋白质组合物或食物产品不含动物产品。
如本文所使用的，“细菌源性蛋白质”、“酵母源性蛋白质”、“藻类源性蛋白质”、“真菌源性蛋白质”或“植物源性蛋白质”是指蛋白质的即时生产生物体，并且可以意指在细菌、酵母、藻类、真菌或植物中产生的任何蛋白质，而不管蛋白质是分别在细菌、酵母、藻类、真菌还是植物中天然表达。
术语“不天然表达”可以指在自然界不产生所述蛋白质的生物体中产生的蛋白质。不天然表达的蛋白质的非限制性实例包含在细菌中表达的动物蛋白质、在酵母中表达的植物蛋白质和在藻类中表达的动物蛋白质。
术语“巴氏杀菌”可以意指应用于食品以将具有公共健康意义的最具抗性的微生物降低至在正常分布和储存条件下不可能呈现公共健康风险的水平的任何工艺、处理或其组合。
如本文所使用的，术语“完整的”，当其涉及细胞时，包含穿孔的细胞，但不包含破裂或裂解的细胞。在具有亚细胞区室的细胞中，完整细胞通常保留细胞膜内的亚细胞区室。引起细胞裂解的示例性方法包含机械裂解(例如，珠磨破碎(bead beating)、珠粒研磨、碾磨或旋转器-摇动器式均质器(rotator-shaker homogenizer))、低温粉碎(cryopulverization)、高压细胞破碎(例如，通过弗氏压碎器(French press)或微流化器)、超声处理和氮减压。在一些实施例中，当指定完整细胞时，不进行机械裂解(例如，珠磨破碎、珠粒研磨、碾磨或旋转器-摇动器式均质器)、低温粉碎、高压细胞破碎(例如，通过弗式压碎器或微流化器)、超声处理或氮减压。在一些实施例中，完整细胞可以通过粒径分布来确定。在一些实施例中，与单细胞的悬浮液相比，完整细胞(例如，经历过处理，如本文所描述的处理中的任何处理)的粒径分布可以显著不变。例如，完整酵母细胞的粒径分布中值可以为约3μm。在一些实施例中，完整酵母细胞的粒径分布可能缺乏小于约3μm的峰，这可以指示细胞碎片。
如本文所使用的，关于蛋白质组合物的“低风味”意指所述蛋白质组合物比所述蛋白质组合物的来源(例如，酵母，如果描述了酵母蛋白质组合物的话)具有更少的风味。例如，产生与蛋白质的来源相关联的独特风味的较少的一种或多种风味化合物。在一些实施例中，低风味蛋白质组合物可能几乎不具有其自身的风味。在一些情况下，低风味蛋白质组合物比已知的蛋白质组合物(例如，商业的大豆蛋白分离物)具有更少的风味。具有较少风味可以例如通过受过训练的人类专门小组成员来确定，或者例如通过测量一种或多种通常被理解为赋予风味和/或香味的挥发性化合物来确定。
如本文所使用的，术语“风味化合物”是指赋予如本文所述的蛋白质组合物可例如由受过训练的人类专门小组成员检测的味道和/或香味的化合物。在一些实施例中，风味化合物可以是积极的方面，例如，赋予在蛋白质组合物的使用中预期的风味，例如，暗示肉复制品产品中的动物肉风味的风味化合物。在一些实施例中，风味化合物可以是负面的方面，例如，赋予在蛋白质组合物的使用中不预期的风味，例如，暗示肉复制品产品中的大豆的风味化合物。
术语“香味组(aromaome)”可以意指由普通人类观察者与特定食品、成分或烹饪过程关联的全部香味。香味的非限制性实例是家禽香味组、鸡肉香味组、牛肉香味组、猪肉香味组、海鲜香味组、野味香味组、肉桂香味组、巧克力香味组、油炸香味组和烧烤香味组。
在一方面，本公开包含一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含裂解所述多个细胞的水性悬浮液以获得细胞裂解物；任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，澄清所述细胞裂解物以获得经澄清的裂解物；将所述经澄清的裂解物过滤以获得蛋白质组合物；以及任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
在另一方面，本公开包含一种从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含裂解所述多个细胞的水性悬浮液以获得细胞裂解物；将所述细胞裂解物过滤以获得蛋白质组合物；以及任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，其中步骤a)、b)和c)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
这些和其它实施例可以任选地包含以下中的任何一项。过滤可以包含微滤、超滤、渗滤或其组合。澄清步骤可以通过离心至少于约20％的干固体来进行。多个细胞可以包含微生物细胞。方法可以进一步包含在步骤a)之前，在介于约8.5与约12.0之间的pH下洗涤多个细胞的水性悬浮液。基于干重，蛋白质组合物可以包含至少约35％的大于5kDa的化合物。蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质可以处于约10kDa与约200kDa之间。
在另一方面，本公开包含通过一种方法产生的蛋白质组合物，所述方法包括：裂解多个细胞的水性悬浮液以获得细胞裂解物；将所述细胞裂解物过滤以获得蛋白质组合物；以及任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，其中步骤a)、b)和c)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
这个和其它实施例可以任选地包含以下中的任何一项。过滤可以包含微滤、超滤、渗滤或其组合。过程可以进一步包含在步骤a)之前，在介于约8.5与约12.0之间的pH下洗涤多个细胞的水性悬浮液。蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质可以处于约10kDa与约200kDa之间。蛋白质组合物的缓冲能力可以小于约2.5mmol NaOH/克干固体。当L-半胱氨酸未添加到pH为7.0的5mL的蛋白质组合物的2％(w/v)悬浮液中时，在25℃下经过约24小时之后，可以检测到小于约0.1ppm的量的硫化氢(H2S)。在使5mL的蛋白质组合物的2％(w/v)悬浮液达到约25mM最终浓度的L-半胱氨酸之后，在25℃下经过约24小时，可以检测到至少约0.2ppm的量的硫化氢。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
在一些实施例中，本文提供了用于从多个细胞中纯化多种蛋白质的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及d)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至b)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及d)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至b)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，从所述固体部分中提取蛋白质包括所述固体部分的机械裂解。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成包含可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)用碱处理表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)用碱处理表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)将表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，所述可溶性蛋白是含血红素的蛋白。在一些实施例中，所述方法包括用约5mM至约500mM还原当量的包含还原剂处理所述多个细胞。在一些实施例中，用所述还原剂进行处理包括用约20mM至约80mM还原当量的所述还原剂进行处理。在一些实施例中，所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。在一些实施例中，所述还原剂是食品安全还原剂。在一些实施例中，所述可溶性蛋白具有熔点，并且方法进一步包括：在a)之前，将所述多个细胞加热至比所述可溶性蛋白的所述熔点低约10℃或约5℃的温度。在一些实施例中，所述可溶性蛋白的熔点为至少约60℃。在一些实施例中，所述可溶性蛋白对于所述多个细胞是异源的。
在一些实施例中，本文提供了处理多个细胞(例如，具有细胞壁的多个细胞)的方法。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
本文还提供了细胞的组合物，如本文所述的已经处理过的细胞的组合物。在一些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包含：多个细胞，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包含：多个细胞，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等效于本文所述的那些方法和材料的方法和材料可以用于实践本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目的和优点将根据说明书和附图以及权利要求而变得显而易见。根据专利法的标准惯例，权利要求中的词语“包括”可以由“基本上由…组成”或“由…组成”替代。
附图说明
图1是用于分离和浓缩蛋白质的示例性过程变体的示意图。
图2是用于分离和浓缩蛋白质的示例性过程变体的示意图。所有步骤之后可以是巴氏杀菌(PZ)和/或喷雾干燥(SD)。所有步骤中的过程条件：pH 9.3+/-0.3；温度＜10℃。
图3是示出了高pH过程的产物在加热时产生更坚固的凝胶的图。过程变体A(参见图2)在pH 6.5或pH 9.5下进行。使用混合流变仪测量所得材料的流变性。竖轴以对数标度示出了储能模量(Pa)。横轴示出了温育温度。
图4是示出了从微生物蛋白质分离物和浓缩物中去除小分子使凝胶硬度增加>5X的图；效果与固体去除无关。过程变体B和C(参见图2)在pH 9.3下进行。过程中样品取自离心分离液(“CN”)或裂解物(“LY”)以及相应过程B(“CN/UFO”)或过程C(“LY/UFO”)的最终产物。将每个样品冷冻干燥，然后悬浮于含10％(w/v)的
Figure BDA0004190539340000142
水中。在pH 7.5下测定悬浮液。使用混合流变仪测量所得材料的流变性。竖轴以对数标度示出了储能模量(Pa)。横轴示出了温育温度。
图5是示出了用天然小分子重构蛋白质分离物和浓缩物使凝胶硬度降低>2X的图。过程变体C(参见图2)在pH 9.3下进行。将最终材料冷冻干燥，然后重悬浮于作为过程中样品的含10％(w/v)的
Figure BDA0004190539340000141
水或初始UF渗透液中。在pH 7.5下测定悬浮液。使用混合流变仪测量所得材料的流变性。竖轴以对数标度示出了储能模量(Pa)。横轴示出了温育温度。
图6是示出了在顶部空间中不存在可检测的硫化氢(H2S)以及在将25mM L-半胱氨酸添加到使用过程变体C或过程变体D制备的微生物蛋白质组合物中之后>0.1ppm硫化氢(H2S)的出现的图。用于制备蛋白质组合物的微生物是细菌(大肠杆菌(Escherichiacoli))或真核生物(巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))的代表。
图7是测定在过程变体C期间通过在均质器裂解之后取出过程中样品，最终制备约2％(w/v)的酵母细胞的裂解物的顶部空间中的H2S的结果的照片。上半部分示出了标准品，并且下半部分示出了未添加半胱氨酸的裂解物(左)、添加盐酸吡哆醛的过程变体C(中心)和添加L-半胱氨酸的过程变体C(右)的结果。
图8是血红素B的结构。
图9A是用于处理细胞悬浮液的示例性过程变体的示意图，包含作为初始步骤的碱性耗竭(“AE”)或还原(“RD”)。
图9B是用于分离和浓缩蛋白质的示例性过程变体的示意图，任选地包含作为“进料”的图9的过程的任何产物。
图10是在pH 6.5或pH 9.5下进行的过程变体3(参见图9B)产生的蛋白质组合物的流变学的图。使用混合流变仪测量所得材料的流变性。竖轴以对数标度示出了储能模量(Pa)。横轴示出了温育温度。
图11A是在pH 9.3下进行的过程变体3(参见图9B)产生的蛋白质组合物的流变学的图。过程中样品取自裂解物(“LY”)和过程变体3(“LY/UFO”)的最终产物。将每个样品冷冻干燥，然后悬浮于含10％(w/v)的milliQ水。在pH 7.5下测定悬浮液。
图11B是在pH 9.3下进行的过程变体2(参见图9B)产生的蛋白质组合物的流变学的图。过程中样品取自离心分离液(“CN”)和过程变体2(“CN/UFO”)的最终产物。将每个样品冷冻干燥，然后悬浮于含10％(w/v)的milliQ水。在pH 7.5下测定悬浮液。
图12A是通过鸟枪法质谱法(MS)鉴定的所有蛋白质在从毕赤酵母细胞中提取的总蛋白质中的相对丰度相关性的图，所述毕赤酵母细胞在水中洗涤(“对照”，横轴)或用碱和热处理(“AE_PZ”，竖轴)，如实例中所述。所有轴都是对数标度。
图12B是通过鸟枪法质谱法(MS)鉴定的在来自表达靶蛋白的毕赤酵母细胞的固体中的所有蛋白质(横轴，“AE_PZ_沉淀物”)对由此裂解物制备的经澄清的离心分离液(竖轴，“AE_PZ_上清液”)的相对丰度相关性的图。
图12C是图12B的注释版本，以示出单独离心导致靶蛋白的两倍富集，在级分中蛋白质从53％富集至90％。要注意的是，注释为细胞壁组分的其它蛋白质在经澄清的离心分离液中被释放/富集，这与碱和热处理对细胞壁的损伤一致。
图12D是通过鸟枪法质谱法(MS)鉴定的在表达靶蛋白的毕赤酵母细胞的机械裂解物中的所有蛋白质(横轴)对由此裂解物制备的经澄清的离心分离液(竖轴)的相对丰度相关性的图。
图13是已经用或未用半胱氨酸处理的若干单元操作中释放的靶蛋白的相对量的图。
图14A是未添加还原剂的经洗涤的毕赤酵母细胞(“CW”)的粒径分布的图；将细胞在pH 10.5下用碱性耗竭(“AE”)处理并且随后在60℃下加热(“AE/PZ”)。体积分数(竖轴)相对于以微米为单位的大小(横轴，对数标度)作图。
图14B是添加食品安全还原剂(L-半胱氨酸，50mM)的经洗涤的毕赤酵母细胞(“CW”)的粒径分布的图；随后将细胞在pH 10.5下进行碱性耗竭(“AE”)，然后加热至60℃(“AE/PZ”)。轴如图14A所示。
图14C是如所指示处理的毕赤酵母细胞的光学显微镜的图像，示出了与图14A和14B中所示的粒径分布数据一致的聚集或分散。将细胞在冷水中以100X稀释，然后在可见光下以100X可视化。
图15是过程变体1(图9B)的产物的10％(w/v)悬浮液的弹性模量的图。
图16A是在pH 4和pH 10.5下在蛋白质组合物中检测到的3-甲基-丁醛的量的图。
图16B是在pH 4和pH 10.5下在蛋白质组合物中检测到的3-甲基-丁酸的量的图。
具体实施方式
蛋白质(例如，处于其未变性状态)可以有助于食品复制品产品(如肉和乳制复制品产品)取得成功。然而，现有的商业蛋白质提取工艺可能使此类蛋白质变性。另外，在食品复制品产品中可能具有功能性的许多蛋白质具有相关的颜色或香味，这可能减损或抑制其应用。不希望受任何特定理论的束缚，据信在整个纯化工艺中维持高pH(例如，约8.5至约12.0)有助于获得低风味和/或低色蛋白质组合物。
通常，本文档提供了蛋白质组合物以及用于从细胞中纯化总细胞蛋白的方法和材料，从而产生可用于例如食品复制品(例如，肉和乳制复制品产品或替代品)的蛋白质组合物。在一些实施例中，本文提供的方法产生可以用于任何数量的食物产品中的低风味蛋白质组合物。在一些实施例中，本文提供的方法产生可以用于任何数量的食物产品中的低色蛋白质组合物(例如，具有在肉复制品中引起更大的红色感知的降低的黄色)。在一些实施例中，本文提供的方法产生具有食物活性(如胶凝或乳液稳定化)的蛋白质组合物。
本文还提供了提高蛋白质纯化的速度和/或效率的方法。例如，通过对细胞进行穿孔而不是使细胞裂解，在一些实施例中，亚细胞组分、细胞壁组分和/或核酸可以容易地与胞质蛋白分离。在一些实施例中，经保留的亚细胞组分、细胞壁组分和/或核酸还可以是有价值产品的来源，如核酸调味剂化合物GMP和IMP。作为另一个实例，本文提供的方法可以有助于纯化丰富蛋白(例如，重组产生的蛋白质)，特别是当所述丰富蛋白通常不是由生产细胞分泌时。作为又另一个实例，一些处理(例如，减少、碱性耗竭和/或预先巴氏杀菌)可以在大多数过程变体(包括包含机械裂解的变体和不包含机械裂解的变体)中增加蛋白质回收率。
用于生产蛋白质组合物的方法
在一些实施例中，可以使用本文所述的方法中的任何方法纯化蛋白质组合物。可以从中提取蛋白质的合适的细胞包含但不限于来自真菌、藻类、原核生物和古细菌的细胞。在一些实施例中，合适的细胞可以天然存在于单细胞生物体(包含酵母)或多细胞生物体(包含子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota))中。在一些实施例中，可以从来自例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)或镰孢属(Fusarium)的一种或多种真菌物种中纯化蛋白质组合物。例如，可以从酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或镰孢霉(Fusariumvenenatum)细胞中纯化蛋白质组合物。在一些实施例中，可以从来自例如芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)或甲烷球菌属(Methanococcus)的一种或多种古细菌或细菌物种中纯化蛋白质组合物。例如，可以从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)中纯化蛋白质组合物。在一些实施例中，可以从来自例如小球藻属(Chlorella)、蓝细菌属(Cyanobacteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、眼虫藻属(Euglenid)或螺旋藻属(Spirulina)的一种或多种藻类物种中纯化蛋白质组合物。例如，可以从原始小球藻(Chlorella protothecoides)、钝顶螺旋藻(Arthrospira platensis)、细小裸藻(Euglena gracilis)或发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)中纯化蛋白质组合物。
在一些实施例中，本文所述的蛋白质组合物中的一种或多种蛋白质可以具有作为生物催化剂、食品加工助剂、酶、增味剂、治疗剂或营养品的功能活性。
在一些实施例中，从微生物纯化的蛋白质组合物或蛋白质可以包含一种或多种异源蛋白(例如，来自不同于用于纯化蛋白质或蛋白质组合物的生物体的物种，例如，来自真核生物、动物、植物、藻类、嗜热生物、酵母、细菌、原生生物或古细菌的蛋白质)。在一些实施例中，异源蛋白具有作为生物催化剂、食品加工助剂、酶、增味剂、治疗剂、甜味剂、药物或营养品的功能活性。
在一些实施例中，水溶液可以包含缓冲液。缓冲液可以是浓度为约2mM至约200mM(例如，约2mM至约10mM、约10mM至约20mM、约10mM至约30mM、约20mM至约30mM、约30mM至约40mM、约40mM至约50mM、约50mM至约100mM或约100mM至约200mM)并且pH为约8.5至约12.0(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的任何食品级缓冲液(例如，包含以下的缓冲液：磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、乙酸钠、乙酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙、碳酸氢钠、乳酸钠、乳酸钾、苹果酸钠、苹果酸钾、葡萄糖酸钠和/或葡萄糖酸钾)。
在本文所述的方法的一些实施例中，多个细胞(例如，微生物细胞)可以悬浮于水溶液中。在一些实施例中，可以洗涤所述多个细胞。
可以在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下裂解多个细胞，以获得细胞裂解物。如本文所述，在裂解期间维持高pH可以有助于改善裂解(例如，蛋白质产率)和/或澄清。没有限制性地，水性悬浮液或细胞裂解物可以具有约2％至约25％的干固体(即，在去除所有水之后剩余的质量)。例如，水性悬浮液或细胞裂解物可以具有约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约5％至约25％、约10％至约25％、约15％至约20％、约2％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％或25％的干固体。在一些实施例中，裂解可以是生物化学的，如酶促细胞壁降解，或者裂解可以是化学的，例如，基于表面活性剂的裂解、基于离液的裂解或基于有机溶剂的裂解。另外或可替代地，裂解还可以是机械的，使用例如超声、珠粒研磨、渗透裂解、均质化、手工研磨或通过使细胞经受冻融循环。裂解可以在介于约4℃与约15℃之间(例如，约4℃至约12℃、约5℃至约10℃、约4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃)的温度下进行。
细胞裂解物的纯化可以包含以下中的一个或多个步骤：例如，离心、澄清、沉淀、微滤、超滤、渗滤(例如，使用微滤或超滤膜)、巴氏杀菌和/或喷雾干燥。图1展示了可以采用的不同纯化方案的一些示例性示意图。图2展示了四种具体的纯化方案。在一些实施例中，蛋白质组合物可以是澄清裂解物。在一些实施例中，蛋白质组合物可以是经过滤的(例如，使用一个或多个过滤步骤)裂解物，无论裂解物是否已经澄清。蛋白质组合物可以用于例如食品和食品复制品产品中。
细胞裂解物可以任选地通过去除大量固体来澄清，从而形成经澄清的裂解物。可以使用各种技术来澄清细胞裂解物。例如，细胞裂解物可以通过离心、重力沉降或通过添加硅藻土来澄清。在澄清期间，在一些实施例中，将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。可以将细胞裂解物澄清至小于20％，例如，小于17％、15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的干固体的干固体含量。
可以任选地添加一种或多种絮凝剂至约0.1g/L至约10g/L的最终浓度，以帮助改善澄清步骤期间的固体去除。絮凝剂的非限制性实例包含烷基胺-表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚胺(例如，购自新泽西州弗洛勒姆帕克的巴斯夫公司(BASF，Florham Park，NJ)的
Figure BDA0004190539340000191
或/>
Figure BDA0004190539340000192
)、聚-ε-赖氨酸、石灰、熟石灰、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸铝、铝酸钠、氯化铝、碱式碳酸镁、碳酸钙、氢氧化钙、活化硅酸盐、瓜尔胶、淀粉、单宁、海藻酸钠、聚合硫酸铝、聚合羟基氯化铝、/>
Figure BDA0004190539340000193
和合成聚电解质(例如，/>
Figure BDA0004190539340000194
)。在一些实施例中，添加一种或多种絮凝剂。在一些实施例中，在不添加一种或多种絮凝剂的情况下进行澄清步骤。
在一些实施例中，在去除固体之前，可以任选地使用例如水或者盐或缓冲液的水溶液稀释细胞裂解物，同时将pH维持处于约pH 8.5与12.0之间。例如，细胞裂解物可以用水1∶1进行稀释。在一些实施例中，将一种或多种絮凝剂添加至细胞裂解物中，并且在澄清之前稀释细胞裂解物。在一些实施例中，在澄清之前稀释细胞裂解物，并且在不添加一种或多种絮凝剂的情况下进行澄清步骤。在一些实施例中，将一种或多种絮凝剂添加至细胞裂解物中，并且在澄清之前不稀释细胞裂解物。在一些实施例中，在不将一种或多种絮凝剂添加至细胞裂解物并且在不稀释细胞裂解物的情况下进行澄清步骤。
在一些实施例中，可以过滤细胞裂解物(例如，尚未经历澄清步骤，如本文所述的澄清步骤的细胞裂解物)，以获得经过滤的裂解物。过滤步骤可以进一步减少微粒的量。在过滤期间，在一些实施例中，将pH维持在约8.5至约12.0(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH之间。在过滤期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。可以使用微滤、超滤和/或渗滤来过滤细胞裂解物或经澄清的裂解物。微滤可以使用孔径为约0.2μm至约2.0μm(例如，约0.2μm至约0.3μm、约0.3μm至约0.5μm、约0.5μm至约0.7μm、约0.7μm至约0.9μm、约0.9μm至约1.1μm、约1.0μm至约1.2μm、约1.2μm至约1.4μm、约1.4μm至约1.6μm、约1.6μm至约1.8μm或约1.8μm至约2.0μm)的膜。超滤可以使用截留分子量为约5kDa至约70kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa或约30kDa至约50kDa、约20kDa至约40kDa、约40kDa至约60kDa或约50kDa至约70kDa)的膜。
在一些实施例中，可以过滤经澄清的裂解物，以获得经过滤的裂解物。在一些实施例中，过滤步骤可以减少颗粒的量。在过滤期间，在一些实施例中，将pH维持在约8.5至约12.0(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH之间。在过滤期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。可以使用微滤、超滤和/或渗滤来过滤经澄清的裂解物。微滤可以使用孔径为约0.2μm至约2.0μm(例如，约0.2μm至约0.3μm、约0.3μm至约0.5μm、约0.5μm至约0.7μm、约0.7μm至约0.9μm、约0.9μm至约1.1μm、约1.0μm至约1.2μm、约1.2μm至约1.4μm、约1.4μm至约1.6μm、约1.6μm至约1.8μm或约1.8μm至约2.0μm)的膜。超滤可以使用截留分子量为约5kDa至约70kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa、约30kDa至约50kDa、约20至约40kDa、约40kDa至约60kDa或约50至约70kDa)的膜。
在一些实施例中，可以使经过滤的裂解物经受一个或多个另外的过滤步骤，以获得另一种经过滤的裂解物。可以使用微滤、超滤和/或渗滤来过滤经过滤的裂解物。微滤可以使用孔径为约0.2μm至约2.0μm(例如，约0.2μm至约0.3μm、约0.3μm至约0.5μm、约0.5μm至约0.7μm、约0.7μm至约0.9μm、约0.9μm至约1.1μm、约1.0μm至约1.2μm、约1.2μm至约1.4μm、约1.4lμm至约1.6μm、约1.6μm至约1.8μm或约1.8μm至约2.0μm)的膜。超滤可以使用截留分子量为约5kDa至约70kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa、约30kDa至约50kDa、约20kDa至约40kDa、约40kDa至约60kDa或约50kDa至约70kDa)的膜。例如，可以通过迫使溶液(例如，使用增加的压力或离心)通过具有例如约5kDa至约50kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa或约30kDa至约50kDa)的截留分子量的半透膜来进一步过滤经过滤的裂解物。在一些实施例中，可以在微滤膜上渗滤经过滤的裂解物。在一些实施例中，可以在超滤膜上渗滤经过滤的裂解物。在一些实施例中，可以将经过滤的裂解物(例如，通过微滤和/或超滤过滤的细胞裂解物或经澄清的裂解物)浓缩至至少约10％的干固体(例如，至少约15％或20％的干固体)，然后以恒定体积渗滤至少一个渗滤体积(DV)(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个渗滤体积)。在一些实施例中，可以将经过滤的裂解物(例如，通过微滤和/或超滤过滤的细胞裂解物或经澄清的裂解物)稀释(例如，使用水或者盐或缓冲液的水溶液，同时将pH维持介于约pH 8.5与12.0之间)至约5％的干固体(例如，约6％、7％、8％或9％的干固体)，然后以恒定体积渗滤至少一个渗滤体积(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个渗滤体积)。在一些实施例中，可以将经过滤的裂解物(例如，通过微滤和/或超滤过滤的细胞裂解物或经澄清的裂解物)稀释(例如，使用水或者盐或缓冲液的水溶液，同时将pH维持介于约pH 8.5与12.0之间)至约3％的干固体(例如，约2％或约4％的干固体)，然后渗滤以将经过滤的裂解物浓缩至约15％的干固体(例如，约13％、14％、16％或17％的干固体)。在另外的一个或多个过滤步骤期间，在一些实施例中，将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在另外的一个或多个过滤步骤期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。
可以浓缩细胞裂解物(例如，通过如所描述的用于去除小于期望蛋白质的组分的过滤方法，如超滤，任选地使用渗滤)。在浓缩期间，可以将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在浓缩期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。可以将细胞裂解物浓缩至约2mg/mL至约250mg/mL(例如，10mg/mL至225mg/mL、15mg/mL至200mg/mL、25mg/mL至约225mg/mL、50mg/mL至200mg/mL或50mg/mL至150mg/mL)的蛋白质含量。浓缩可以与过滤步骤同时进行。浓缩可以与过滤步骤分开进行。
可以对经澄清的裂解物进行浓缩(例如，通过如所描述的用于去除小于期望蛋白质的组分的过滤方法，如超滤，任选地使用渗滤)。在浓缩期间，可以将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在浓缩期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。可以将经澄清的裂解物浓缩至约2mg/mL至约250mg/mL(例如，10mg/mL至225mg/mL、15mg/mL至200mg/mL、25mg/mL至约225mg/mL、50mg/mL至200mg/mL或50mg/mL至150mg/mL)的蛋白质含量。浓缩可以与过滤步骤同时进行。浓缩可以与过滤步骤分开进行。
可以对经过滤的裂解物进行浓缩(例如，通过如所描述的用于去除小于期望蛋白质的组分的过滤方法，如超滤，任选地使用渗滤)。在浓缩期间，可以将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在浓缩期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。可以将经过滤的裂解物浓缩至约2mg/mL至约250mg/mL(例如，10mg/mL至225mg/mL、15mg/mL至200mg/mL、25mg/mL至约225mg/mL、50mg/mL至200mg/mL或50mg/mL至150mg/mL)的蛋白质含量。浓缩可以与过滤步骤同时进行。浓缩可以与过滤步骤分开进行。
在一些实施例中，多个细胞(例如，经洗涤的多个细胞和/或细胞的水性悬浮液)可以经历一种或多种处理，例如，在从细胞中纯化蛋白质之前。处理可以包含，例如，细胞壁穿孔、碱性耗竭和/或巴氏杀菌。这些处理可以以任何组合或以任何顺序进行(参见例如图9A用于从穿孔或碱性耗竭开始的一些示例性处理方案)。
不希望受任何特定理论的束缚，据信这些处理(单独地或以任何组合)可能产生更有效和/或持续时间更短的纯化方案。例如，在一些情况下，这些处理(单独地或以任何组合)可能引起所关注的胞质蛋白(例如，重组产生的蛋白)的释放，就像所述胞质蛋白已经被分泌一样，并且任选地处于未修饰的形式(例如，没有分泌信号)。作为另一个实例，本文所述的处理通常不需要细胞壁的渗透稳定化。关于速度，已经令人惊讶地发现，与在超过30分钟内引起约70％释放的商业的原生质体化试剂盒相比，用还原剂进行处理、碱性耗竭和巴氏杀菌的组合在约15-20分钟内引起约100％的靶胞质蛋白(LegH)的释放。在一些实施例中，本文所述的处理是可扩展的。在一些实施例中，本文所述的处理是食品安全的。这些处理的另一个潜在益处是某些物种在固体部分和液体部分中的选择性富集；例如，在一些实施例中，在液体部分和固体部分分离(例如，通过离心)之后，本文所述的处理可能导致以下中的一者或多者：在液体部分中富集胞质蛋白(以及，在一些实施例中，非膜结合细胞壁蛋白，因为不希望受任何特定理论的束缚，这些蛋白质通常通过二硫键附着到细胞壁)(和/或从固体部分中耗竭胞质蛋白)；富集胞质小分子(和/或，在一些实施例中，非膜结合细胞壁小分子)(和/或从固体部分中耗竭胞质小分子)；在固体部分中富集膜结合细胞壁蛋白和/或亚细胞区室蛋白(和/或在液体部分中耗竭膜结合细胞壁蛋白和/或亚细胞区室蛋白)；在固体部分中富集非胞质小分子(和/或在液体部分中耗竭非胞质小分子)；在固体部分中富集核酸(例如，风味前体IMP和GMP的来源)(和/或在液体部分中耗竭核酸)；在固体部分中富集细胞壁组分(和/或在液体部分中耗竭细胞壁组分)；或在固体部分中富集脂质/脂肪(和/或在液体部分中耗竭脂质/脂肪)(例如，与包括细胞的显著裂解(例如，机械裂解)的方法相比)。
通常，当进行这些处理中的一种或多种处理时，细胞的裂解不是必需的(但是与缺乏处理的裂解步骤相比，如果进行裂解步骤，处理可以增加产率)。在一些实施例中，当进行这些处理中的一种或多种处理时，所述方法不包括机械裂解(例如，珠磨破碎、珠粒研磨、碾磨或旋转器-摇动器式均质器)、低温粉碎、高压细胞破碎(例如，通过弗氏压碎器或微流化器)、超声处理、氮减压或其组合。再次不希望受任何理论的束缚，据信当细胞保持完整时，蛋白质纯化的一些典型污染物(如细胞壁物质、亚细胞区室和核酸)被保留在细胞中的程度大于在进行裂解情况下的程度。
可以使用任何适当的方法对多个细胞(具有细胞壁)的细胞壁进行穿孔。通常，细胞壁穿孔产生完整的细胞，而不是细胞的裂解。穿孔方法的非限制性实例包含用还原剂进行处理、用酶进行处理、电穿孔或其组合。
在一些实施例中，细胞壁穿孔包括用还原剂进行处理。不希望受任何特定理论的束缚，据信用还原剂进行处理可以促进细胞壁的弱化、细胞质内容物的释放、驱动絮凝、促进固体去除、保护细胞质靶标在纯化工艺中免于氧化和/或使氧化还原敏感蛋白对热处理(例如，巴氏杀菌)稳定。在一些实施例中，还原剂可以是食品安全还原剂。在一些实施例中，还原剂可以选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。在一些实施例中，用还原剂进行处理包括用约5mM至约500mM(例如，约5mM至约20mM、约5mM至约50mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM、约5mM至约300mM、约5mM至约400mM、约10mM至约20mM、约10mM至约50mM、约10mM至约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约400mM、约10mM至约500mM、约20mM至约500mM、约50mM至约500mM、约100mM至约500mM、约200mM至约500mM、约300mM至约500mM、约400mM至约500mM、约20mM至约80mM、约30mM至约70mM、约40mM至约60mM、约80mM至约120mM、约90mM至约110mM、约50mM或约100mM)还原当量的还原剂进行处理。如本文所使用的，“还原当量”是存在于还原剂分子上的还原单元的数量。例如，半胱氨酸具有单个巯基并且表示单个还原当量。作为另一个实例，二硫苏糖醇(DTT)具有两个巯基并且表示两个还原当量。在大多数情况下，还原当量可以指两个电子的转移，但单个电子还原也是已知的。在细胞壁穿孔期间，在一些实施例中，将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在细胞壁穿孔期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。
在一些实施例中，可以使多个细胞经受碱性耗竭。如本文所使用的，“碱性耗竭”是指用碱处理细胞，直到水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，例如，持续一段时间(例如，至少约3分钟、至少约5分钟或至少约10分钟)。不希望受任何特定理论的束缚，据信细胞(例如，真菌细胞(例如，酵母细胞))通过环境的酸化来响应于碱性环境；然而，细胞具有调节环境pH的有限能力，并且最终进一步的调节将是不可能的。再次不希望受任何特定理论的束缚，据信细胞的碱性耗竭可以通过纯化工艺使pH下降最小化，并且此类pH下降可以沉淀和/或灭活蛋白质。不希望受任何特定理论的束缚，碱性耗竭的另一个潜在益处是细胞壁的弱化和蛋白质释放效率的增加(例如，通过穿孔或通过裂解步骤)。在碱性耗竭期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。
在一些实施例中，可以对多个细胞进行巴氏杀菌(例如，在任何过滤步骤之前，本文也称为“预先巴氏杀菌”或“PZ1”)。例如，在一些实施例中，可以将多个细胞加热至约50℃至约85℃(例如，约50℃至约55℃、约50℃至约60℃、约50℃至约65℃、约50℃至约70℃、约50℃至约75℃、约50℃至约80℃、约55℃至约85℃、约60℃至约85℃、约65℃至约85℃、约70℃至约85℃、约75℃至约85℃、约80℃至约85℃)。不希望受任何特定理论的束缚，据信巴氏杀菌可以具有一种或多种益处，如增加蛋白质从细胞中的释放、对粒径的影响最小、促进固体去除(例如，相对于机械裂解)、杀死生产生物体(例如，用于生物负荷的减少)和/或胞内蛋白质的化学减少。在巴氏杀菌期间，在一些实施例中，将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。
这些处理可以单独地或以任何顺序组合实施。例如，本文所述的一些方法可以包含对细胞壁进行穿孔的步骤、碱性耗竭步骤或巴氏杀菌步骤，而其它两个步骤都不包含。在一些实施例中，本文所述的方法可以包含对细胞壁进行穿孔的步骤，随后是碱性耗竭步骤或巴氏杀菌步骤，然后任选地随后分别是巴氏杀菌步骤或碱性耗竭步骤。在一些实施例中，本文所述的方法可以包含碱性耗竭步骤，随后是对细胞壁进行穿孔的步骤或巴氏杀菌步骤，然后任选地随后分别是巴氏杀菌步骤或对细胞壁进行穿孔的步骤。在一些实施例中，本文所述的方法可以包含巴氏杀菌步骤，随后是对细胞壁进行穿孔的步骤或碱性耗竭步骤，然后任选地随后分别是碱性耗竭步骤或对细胞壁进行穿孔的步骤。
不受任何特定理论的束缚，据信使用本文提供的处理中的一种或多种处理导致细胞壁发生至少部分改变，而细胞总体上保持完整。例如，在一些实施例中，当用本文提供的处理中的任何一种或多种处理处理的多个细胞的10％(w/v)悬浮液在约50℃和pH 10.5下温育约10分钟，然后离心以去除固体，并且上清液用甘露糖苷酶(例如，α甘露糖苷酶)处理时，检测到少于约50gg/mL(例如，少于约40μg/mL、少于约30μg/mL、少于约20μg/mL、少于约15μg/mL或少于约10μg/mL)的甘露糖。作为另一个实例，在一些实施例中，当用本文提供的处理中的任何一种或多种处理处理的多个细胞的10％(w/v)悬浮液在约50℃和pH 12.0下温育时，在所述多个细胞的可溶相中可检测到少于约400μg/mL(例如，少于约300μg/mL、少于约200μg/mL、少于约150μg/mL、少于约100μg/mL或少于约50μg/mL)的β葡聚糖。
因此，在一些实施例中，本文提供了通过使用本文提供的处理中的任何一种或多种处理产生的组合物。在一些实施例中，本文提供了一种组合物，所述组合物包括多个细胞，其中用甘露糖苷酶(例如，α-甘露糖苷酶)处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约50μg/mL、少于约50μg/mL(例如，少于约40μg/mL、少于约30μg/mL、少于约20μg/mL、少于约15μg/mL或少于约10μg/mL)的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，本文提供了一种组合物，所述组合物包括多个细胞，其中在可溶相中可检测到少于约400μg/mL(例如，少于约300μg/mL、少于约200μg/mL、少于约150μg/mL、少于约100μg/mL或少于约50μg/mL)的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟之后制备的。在一些实施例中，所述组合物进一步包括还原剂。在一些实施例中，所述还原剂以约5mM至约500mM(例如，约5mM至约20mM、约5mM至约50mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM、约5mM至约300mM、约5mM至约400mM、约10mM至约20mM、约10mM至约50mM、约10mM至约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约400mM、约10mM至约500mM、约20mM至约500mM、约50mM至约500mM、约100mM至约500mM、约200mM至约500mM、约300mM至约500mM、约400mM至约500mM、约20mM至约80mM、约30mM至约70mM、约40mM至约60mM、约80mM至约120mM、约90mM至约110mM、约50mM或约100mM)还原当量的还原剂的量存在于组合物中。在一些实施例中，所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。在一些实施例中，所述还原剂是食品安全还原剂。在一些实施例中，所述多个细胞中的至少约25重量％的细胞是完整的。在一些实施例中，所述多个细胞中的至少约50重量％的细胞是完整的。在一些实施例中，所述多个细胞中的至少约75重量％的细胞是完整的。在一些实施例中，所述多个细胞的粒径分布中值为约2μm至约4μm(例如，约3μm)。
在一些实施例中，本文提供了处理多个细胞(例如，具有细胞壁的多个细胞)的方法。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中用甘露糖苷酶(例如，α-甘露糖苷酶)处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。在一些实施例中，提供了一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包含：将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
本文还提供了细胞的组合物，如本文所述的已经处理过的细胞的组合物。在一些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包含：多个细胞，其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。在一些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包含：多个细胞，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
这些处理之后可以是本文所述的步骤中的任何步骤，包含但不限于裂解、相分离、过滤、浓缩、巴氏杀菌和/或干燥。在一些实施例中，这些处理之后不是裂解步骤，因为一种或多种处理可能引起胞质蛋白的释放。
上述处理之一之后的后续纯化步骤可以包含以下中的一个或多个步骤：例如离心、相分离、沉淀、微滤、超滤、渗滤(例如，使用微滤或超滤膜)、巴氏杀菌和/或喷雾干燥。图9B展示了可以在多个细胞(例如，用本文所述的处理中的任何一种或多种处理处理的细胞的水性悬浮液)上进行的一些示例性后续纯化步骤。蛋白质组合物可以用于例如食品和食品复制品产品中。
处理后，可以对多个细胞的水性悬浮液进行分离步骤，以将固体部分与液体部分分离(类似于上文所述的澄清)。例如，可以通过离心、深度过滤、重力沉降、微滤或其组合来实现相分离。在一些实施例中，离心包括在至少3k x g(例如，至少约5k x g、至少约10k xg、至少约20k x g或至少约40k x g)的力下离心。在分离期间，在一些实施例中，将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。可以进行分离至液体部分中的干固体含量小于20％，例如，小于17％、15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的干固体。在分离期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。
可以任选地添加一种或多种絮凝剂至约0.1g/L至约10g/L的最终浓度，以帮助改善分离步骤期间的固体去除。在一些实施例中，添加一种或多种絮凝剂。在一些实施例中，在不添加一种或多种絮凝剂的情况下进行分离步骤。
在一些实施例中，在分离步骤之前，可以任选地使用例如水或者盐或缓冲液的水溶液稀释多个细胞的水性悬浮液，同时将pH维持处于约pH 8.5与12.0之间。例如，细胞裂解物可以用水1∶1进行稀释。在一些实施例中，将一种或多种絮凝剂添加至多个细胞的水性悬浮液中，并且在分离固体部分和液体部分之前稀释所述多个细胞的所述水性悬浮液。在一些实施例中，在分离之前稀释多个细胞的水性悬浮液，并且在不添加一种或多种絮凝剂的情况下进行分离步骤。在一些实施例中，将一种或多种絮凝剂添加至多个细胞的水性悬浮液中，并且在分离之前不稀释所述多个细胞的所述水性悬浮液。在一些实施例中，在不将一种或多种絮凝剂添加至所述多个细胞的水性悬浮液中并且不稀释所述多个细胞的水性悬浮液的情况下，进行分离步骤。
如本文所述，在一些实施例中，本文所述的方法可能使来自不同细胞位置的细胞组分(例如，蛋白质和/或核酸)有效分离成液体部分或固体部分。例如，在一些实施例中，液体部分可以包含所述多个细胞的至少30重量％(例如，至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％或至少约90重量％)的胞质蛋白。在一些实施例中，液体部分可以包含所述多个细胞的至少约30重量％(例如，至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％或至少约90重量％)的己糖激酶(例如，作为胞质蛋白含量的指示物)。在一些实施例中，液体部分可以包含所述多个细胞的至少约30重量％(例如，至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％或至少约90重量％)的非膜结合细胞壁蛋白。在一些实施例中，液体部分中的蛋白质可以包含少于约40重量％(例如，少于约35重量％、少于约33重量％、少于约30重量％、少于约25重量％、少于约20重量％、少于约15重量％或少于约10重量％)的膜结合和亚细胞区室蛋白。在一些实施例中，来自液体部分的干固体(例如，重悬于缓冲液或水中)的A260/A280比率可以小于约1.5，通常在脱盐(例如，通过没有核酸酶处理的标准核酸小量制备试剂盒)之后。在一些实施例中，来自固体部分的干固体(例如，重悬于缓冲液或水中)的A260/A280比率可以大于约1.5，通常在脱盐(例如，通过没有核酸酶处理的标准核酸小量制备试剂盒)之后。在一些实施例中，固体部分可以包含所述多个细胞的至少约30重量％(例如，至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％或至少约90重量％)的膜结合和/或亚细胞区室蛋白。在一些实施例中，固体部分可以包含所述多个细胞的至少约30重量％(例如，至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％或至少约90重量％)的总组蛋白。在一些实施例中，固体部分可以包含所述多个细胞的至少约30重量％(例如，至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％或至少约90重量％)的亚铁螯合酶蛋白(例如，作为线粒体蛋白含量的指示物)。
在一些实施例中，本文所述的方法可以产生大部分的完整细胞(例如，其将最终形成固体部分)。例如，本文所述的方法可能使所述多个细胞中的至少约20重量％(例如，至少约25重量％、至少约30重量％、至少约40重量％、至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约75重量％或至少约80重量％)的细胞保持完整。在一些实施例中，完整细胞的粒径分布中值可以为约2μm至约4μm(例如，约3μm)。
在将液体部分与固体部分分离的步骤之后，可以对液体部分进行过滤(例如，在蛋白质组合物的产生中、在富含胞质蛋白的蛋白质组合物的产生中或在可溶性蛋白质的纯化中)，以形成滤液和截留物。可以使用微滤、超滤和/或渗滤来过滤液体部分。微滤可以使用孔径为约0.2μm至约2.0μm(例如，约0.2μm至约0.3μm、约0.3μm至约0.5μm、约0.5μm至约0.7μm、约0.7μm至约0.9μm、约0.9μm至约1.1μm、约1.0μm至约1.2μm、约1.2μm至约1.4μm、约1.4μm至约1.6μm、约1.6μm至约1.8μm或约1.8μm至约2.0μm)的膜。超滤可以使用截留分子量为约5kDa至约70kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa或约30kDa至约50kDa、约20kDa至约40kDa、约40kDa至约60kDa或约50kDa至约70kDa)的膜。超滤可以使用截留分子量为约5kDa至约70kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa、约30kDa至约50kDa、约20kDa至约40kDa、约40kDa至约60kDa或约50kDa至约70kDa)的膜。在一些实施例中，可以通过迫使溶液(例如，使用增加的压力或离心)通过具有例如约5kDa至约50kDa(例如，约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa或约30kDa至约50kDa)的截留分子量的半透膜来过滤液体部分。在一些实施例中，可以在微滤膜上渗滤液体部分。在一些实施例中，可以在超滤膜上渗滤液体部分。在一些实施例中，可以将液体部分浓缩至至少约10％的干固体(例如，至少约15％或20％的干固体)，然后以恒定体积渗滤至少一个渗滤体积(DV)(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个渗滤体积)。在一些实施例中，可以将液体部分稀释(例如，使用水或者盐或缓冲液的水溶液，同时将pH维持介于约pH 8.5与12.0之间)至约5％的干固体(例如，约6％、7％、8％或9％的干固体)，然后以恒定体积渗滤至少一个渗滤体积(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个渗滤体积)。在一些实施例中，可以将液体部分稀释(例如，使用水或者盐或缓冲液的水溶液，同时将pH维持介于约pH 8.5与12.0之间)至约3％的干固体(例如，约2％或约4％的干固体)，然后渗滤至约15％的干固体(例如，约13％、14％、16％或17％的干固体)。在一个或多个过滤步骤期间，在一些实施例中，将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在一个或多个过滤步骤期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。
可以对截留物进行浓缩(例如，通过如所描述的用于去除小于期望蛋白质大小的组分的过滤方法，如超滤，任选地使用渗滤)，以形成蛋白质组合物。在浓缩期间，可以将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。可以将截留物浓缩至蛋白质浓度中约2mg/mL至约250mg/mL(例如，10mg/mL至225mg/mL、15mg/mL至200mg/mL、25mg/mL至约225mg/mL、50mg/mL至200mg/mL或50mg/mL至150mg/mL)的蛋白质含量。浓缩可以与过滤步骤同时进行。浓缩可以与过滤步骤分开进行。在浓缩期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
在一些实施例中，本文提供了用于从多个细胞中纯化多种蛋白质的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包含：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及d)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至b)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及d)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至b)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包含：a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，从所述固体部分中提取蛋白质包括所述固体部分的机械裂解。
在一些实施例中，本文提供了用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成包含可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)用碱处理表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)用碱处理表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；e)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，提供了一种用于从多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包含：a)将表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；d)对所述截留物进行浓缩，以形成包含所述可溶性蛋白的蛋白质组合物；以及e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包含所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。在一些实施例中，所述可溶性蛋白是含血红素的蛋白。在一些实施例中，所述方法包括用约5mM至约500mM还原当量的包含还原剂处理所述多个细胞。在一些实施例中，用所述还原剂进行处理包括用约20mM至约80mM还原当量的所述还原剂进行处理。在一些实施例中，所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。在一些实施例中，所述还原剂是食品安全还原剂。在一些实施例中，所述可溶性蛋白具有熔点，并且方法进一步包括：在a)之前，将所述多个细胞加热至比所述可溶性蛋白的所述熔点低约10℃或约5℃的温度。在一些实施例中，所述可溶性蛋白质的熔点为至少约50℃(例如，至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃或至少约75℃)。在一些实施例中，所述可溶性蛋白对于所述多个细胞是异源的。在一些实施例中，固体部分的一种或多种组分(例如，膜结合蛋白、亚细胞区室蛋白、细胞壁物质、脂质、核酸)可以是感兴趣的。在一些此类实施例中，可以从固体部分中提取组分，例如，通过将固体部分悬浮于水或水性缓冲液中，然后机械破碎固体部分。在一些实施例中，这些方法可以用于产生膜结合和/或亚细胞区室富集的(例如，线粒体蛋白富集的、核蛋白富集的和/或内质网蛋白富集的)蛋白质组合物。在提取期间，可以将pH维持在介于约8.5至约12.0之间(例如，约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0)的pH下。在提取期间，在一些实施例中，将温度维持在约12℃以下(例如，约10℃以下、约8℃以下或约6℃以下)或介于约4℃与约12℃之间(例如，介于约4℃与约10℃之间、约4℃与约8℃之间、约4℃与约6℃之间、约6℃与约12℃之间、约8℃与约12℃之间或约10℃与约12℃之间)。在一些实施例中，本文所述的方法中的任何方法可以用于纯化所关注蛋白质。在一些实施例中，所关注蛋白质在所述多个细胞中大量表达。在一些实施例中，所关注蛋白质在所述多个细胞中重组表达。在一些实施例中，所关注蛋白质对于所述多个细胞是异源的。在一些实施例中，所关注蛋白质是可溶性蛋白。在一些实施例中，所关注蛋白质是含血红素的蛋白(例如，本文所述的含血红素的蛋白中的任何含血红素的蛋白)。所关注蛋白质可以构成如本文所述的蛋白质组合物的任何合适的部分。例如，在一些实施例中，所关注蛋白质可以构成蛋白质组合物中的至少约30干重％(例如，至少约40干重％、至少约50干重％、至少约60干重％、至少约70干重％、至少约80干重％或至少90干重％)的蛋白质。
在一些实施例中，所关注蛋白质是胞质蛋白。在一些此类实施例中，本文所述的方法可以引起液体部分中所关注蛋白质的富集。例如，令人惊讶地发现，用碱性耗竭和预先巴氏杀菌处理多个细胞的水性悬浮液使得靶蛋白(LegH)在液体部分中的相对丰度为约0.9，并且在固体部分中的相对丰度为约0.53(参见例如，图12C)。在一些实施例中，本文所述的方法包括将所述多个细胞加热至比所关注蛋白质的熔点低约10℃至约5℃的温度。不受任何特定理论的束缚，据信此类加热步骤可能引起熔点低于所关注蛋白质的熔点的蛋白质的解折叠和/或聚集，从而在液体部分中富集所关注蛋白。在一些实施例中，本文所述的方法包括将所述多个细胞加热至约60℃。
在一些实施例中，所关注蛋白质是亚细胞区室(例如，线粒体、核和/或内质网)蛋白。在一些实施例中，所关注蛋白质是膜结合蛋白。在一些此类实施例中，本文所述的方法可以引起固体部分中所关注蛋白质的富集。
蛋白质组合物还可以被巴氏杀菌。例如，可以使用热处理、高温短时巴氏杀菌、脉冲电场、高压巴氏杀菌、UV辐射、γ辐射或微滤来对蛋白质组合物进行巴氏杀菌。在一些实施例中，可以在巴氏杀菌期间或之后添加一种或多种抗微生物剂(例如，聚赖氨酸)。
在一些实施例中，无论是否经过巴氏杀菌，蛋白质组合物都可以在温和条件下干燥，例如，喷雾干燥或冷冻干燥等，以确保蛋白质不变性。
在一些实施例中，本文所述的方法中的任何方法中的步骤可以独立地在pH 8.5至12下进行。例如，裂解步骤可以在约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5、约11.0、约11.5或约12.0的pH下进行，而澄清和/或过滤步骤可以各自独立地在不同于裂解步骤的pH的pH下进行，只要澄清和/或过滤步骤的不同pH高于8.5。作为另一个实例，澄清步骤可以在约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5、约11.0、约11.5或约12.0的pH下进行，而裂解和/或过滤步骤可以各自独立地在不同于澄清步骤的pH的pH下进行，只要裂解和/或过滤步骤的不同pH高于8.5。作为另一个实例，过滤步骤可以在约8.5至约9.0、约9.0至约10.0、约9.0至约11.0、约10.0至约11.0、约11.0至约12.0、约9.5至约10.5、约9.5至约11.5、约10.5至约11.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5、约11.0、约11.5或约12.0的pH下进行，而裂解和/或澄清步骤可以各自独立地在不同于过滤步骤的pH的pH下进行，只要裂解和/或澄清步骤的不同pH高于8.5。
不受任何特定理论的束缚，在约8.5至约12.0的pH下进行如本文所公开的步骤可以具有多个益处，例如：一种或多种靶蛋白的稳定化(例如，热稳定化)(例如，特别是如果蛋白质的等电点低于pH 8.5)；氧化还原敏感蛋白的稳定化；过滤期间膜通量的增加；促进固体分离；在等于或低于10℃下的功效；以及食品安全且可广泛获得的试剂的使用。
本文还提供了通过本文所述的方法中的任何方法产生的蛋白质组合物。本文还提供了通过本文所述的方法中的任何方法产生的蛋白质组合物在食品、饮料或补充剂中的用途。在一些实施例中，食品可以是肉复制品。
在一些方面，本文还提供了蛋白质组合物。
在一些实施例中，本文提供的蛋白质组合物(例如，其中在约pH 8.5与约12.0之间进行一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤))可以包括基于干重至少35％(例如，至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的大于500Da(例如，1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、10kDa、30kDa或50kDa)的分子。本领域普通技术人员可以使用多种已知方法(例如，液相色谱-质谱法(LCMS))中的任何方法来确定样品中的大分子(例如，大于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、10kDa、30kDa或50kDa的分子)的总量或特定大分子的量。本领域普通技术人员可以使用多种已知方法(例如，液相色谱-质谱法(LCMS))中的任何方法来确定样品中的小分子(例如，小于30kDa、20kDa、10kDa、5kDa、3kDa、2kDa、1kDa或500Da的分子)的总量或特定小分子的量。在一些实施例中，小分子(例如，小于30kDa、20kDa、10kDa、5kDa、3kDa、1kDa或500Da的分子)的减少可以与过滤步骤(例如，渗滤)同时发生。
应当理解，过滤器(例如，膜材料、孔径)和过滤方法(例如，微滤、超滤或渗滤)的选择可能影响或甚至决定期望组分是存在于给定过滤步骤的截留物中还是滤液中。例如，在一些实施例中，如果大分子是期望组分，则可以选择超滤作为过滤方法，并且期望组分可以是截留物的一部分。在一些实施例中，超滤可以与渗滤组合。
在一些实施例中，与其中相同的一个或多个纯化步骤不在约pH 8.5和约12.0进行的经纯化的蛋白质相比，本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)可以具有减少量的可以贡献缓冲能力的一种或多种小分子或没有一种小分子。成分缓冲能力可能有助于pH漂移，这可能导致异味产生，以及潜在地影响产品组装和调配。例如，蛋白质组合物的缓冲能力可以小于约3.0mmol NaOH/克干固体(例如，小于约2.9mmol、2.8mmol、2.7mmol、2.6mmol、2.5mmol、2.4mmol、2.3mmol、2.2mmol、2.1mmol、2.0mmol、1.9mmol、1.8mmol、1.7mmol、1.6mmol、1.5mmol、1.4mmol、1.3mmol1.2mmol、1.1mmol、1.0mmol、0.5mmol或0.1mmol NaOH/克干固体)。在一些实施例中，渗滤(在例如pH 9.3±0.3下)可以将缓冲能力(例如，从约3.6mmol NaOH/克干固体)降低至小于约3.0mmol NaOH/克干固体(例如，小于约2.9mmol、2.8mmol、2.7mmol、2.6mmol、2.5mmol、2.4mmol、2.3mmol、2.2mmol、2.1mmol、2.0mmol、1.9mmol、1.8mmol、1.7mmol、1.6mmol、1.5mmol、1.4mmol、1.3mmol、1.2mmol、1.1mmol、1.0mmol、0.5mmol或0.1mmolNaOH/克干固体)。缓冲能力可以通过2％(w/v)悬浮液或溶液的pH滴定，即测量将悬浮液或溶液从pH 3.0调节至pH 12.0所需的NaOH的mmol来确定。
在一些实施例中，与其中相同的一个或多个纯化步骤不在约pH 8.5和约12.0进行的经纯化的蛋白质相比，本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)可以形成具有更高储能模量的凝胶。例如，在一些实施例中，凝胶可以由在约7.0的pH下浓度为约25mg/mL至约250mg/mL(例如，约25mg/mL至约50mg/mL、约25mg/mL至约100mg/mL、约25mg/mL至约150mg/mL、约25mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约250mg/mL、约100mg/mL至约250mg/mL、约150mg/mL至约250mg/mL或约200mg/mL至约250mg/mL)的蛋白质组合物形成。在一些实施例中，由本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)以10％(w/v)悬浮液形成的凝胶的储能模量可以大于类似凝胶的储能模量，其中相同的一个或多个纯化步骤不在约pH 8.5和约12.0下进行。在一些实施例中，由本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)以10％(w/v)悬浮液形成的凝胶的储能模量在约95℃下可以具有至少约100Pa的储能模量。在一些实施例中，由一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行的蛋白质组合物以10％(w/v)悬浮液形成的凝胶在约95℃下的储能模量的储能模量可以为一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)不在约pH 8.5与约12.0之间进行的类似凝胶的储能模量的至少约10倍(例如，15倍或20倍)。在一些实施例中，由一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行的蛋白质组合物以10％(w/v)悬浮液形成的经巴氏杀菌(例如，在65℃下，持续30秒)的凝胶在约95℃下的储能模量的储能模量可以为一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)不在约pH 8.5与约12.0之间进行的类似凝胶的储能模量的至少约2倍(例如，3倍、4倍或5倍)。
在一些实施例中，本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)可以是低风味蛋白质组合物。
在一些实施例中，与每个步骤在约6.5的pH下进行的类似方法相比，一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行的蛋白质组合物可以具有更少(例如，更小绝对量或更小浓度)(例如，少至少4/5、少至少9/10、少至少19/20或少至少49/50)的酯。
在一些实施例中，与通过一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)不在约pH 8.5至约12.0之间进行的纯化方法获得的蛋白质组合物相比，一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行的蛋白质组合物可以具有更少(例如，更小绝对量或更小浓度)的可能产生变味或异味的一种或多种风味化合物(例如，半胱氨酸；1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸)。在一些实施例中，与其中相同的一个或多个纯化步骤不在约pH 8.5与12.0下进行的经纯化的蛋白质相比，一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤在约pH 8.5与约12.0之间进行的蛋白质组合物可以在可能产生变味或异味的一种或多种小分子(例如，半胱氨酸；1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸)中具有至少约1.05倍(例如，至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍)的减少。在一些实施例中，倍数减少可以通过将一个或多个步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)不在约pH 8.5与约12.0之间进行的蛋白质组合物中的小分子的量除以相同纯化步骤在约pH 8.5与约12.0之间进行的相同小分子的量来计算。本领域普通技术人员可以使用例如GCMS来确定样品中特定小分子的量。
在一些实施例中，本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，纯化步骤中的两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)包含以低于小组成员可检测的水平的量产生变味或异味的一种或多种小分子(例如，半胱氨酸；1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸)。本领域普通技术人员可以使用例如GCMS来确定样品中特定小分子的量。
在一些实施例中，本文提供的蛋白质组合物(例如，其中一个或多个纯化步骤(例如，两个或更多个、三个或更多个或所有纯化步骤)在约pH 8.5与约12.0之间进行)不具有可检测水平的产生变味或异味的一种或多种小分子(例如，半胱氨酸；1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸)。
在一些实施例中，当以本领域常见的方式(例如，考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250或硝酸银)检测之后，通过还原和变性凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)和密度法测量时，蛋白质组合物中的至少约50％(例如，至少约60％、70％、80％或90％)的多肽介于约10kDa与约200kDa之间。
在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物中的一种或多种蛋白质是功能性的(如上所述)。通常，如本文所述的蛋白质组合物包含多种功能性蛋白。蛋白质组合物可以具有任何适当的另外的性质。在一些实施例中，蛋白质组合物可以稳定水包油乳液。在一些实施例中，蛋白质组合物可以稳定油包水乳液。在一些实施例中，蛋白质组合物可以稳定水包空气乳液(例如，泡沫)。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于各种食物产品，包含例如，蛋白质补充剂(例如，蛋白粉)、膳食替代品或烘焙食品，或者用于替代模拟动物源性食物产品(例如，奶酪复制品、蛋复制品或肉复制品，如碎肉复制品)的食物产品中的动物蛋白质(例如，来自牛、猪、家禽、羔羊或鱼)的全部或一部分。因此，本文还提供了包含本文所描述的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物的食品、饮料或补充剂。在一些实施例中，食品可以是肉复制品。
如本文所述的蛋白质组合物可以具有任何适当的组分。
在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物的蛋白质含量可以包含至少约30干重％(例如，至少约40干重％、至少约50干重％、至少约60干重％、至少约70干重％、至少约80干重％或至少约90干重％)的胞质蛋白。
在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物的蛋白质含量可以包含至少约30干重％(例如，至少约40干重％、至少约50干重％、至少约60干重％、至少约70干重％、至少约80干重％或至少约90干重％)的胞质蛋白和非膜结合细胞壁蛋白的组合。
在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物的蛋白质含量可以包含所关注蛋白质(例如，本文所描述的所关注蛋白质中的任何所关注蛋白质)。在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含至少约30干重％(例如，至少约40干重％、至少约50干重％、至少约60干重％、至少约70干重％、至少约80干重％或至少约90干重％)的所关注蛋白质。
在一些实施例中，多种功能性蛋白可以包含至少10种(例如，至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少75种或至少100种)不同的功能性蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自由AOX1和AOX2组成的组的蛋白质。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种通过选自由以下组成的组的GI编号鉴定的蛋白质：254568470、254567507、254570367、254568544、254573764、254566601、254566257、254567798、254570575、254571387、254571425、254568572、254571679、254569858、254573010、254564691、254571699、254572585、254566127、254570667、254572870、254573696、254565205、254569186、254572668、254571899、254569222、254572359、254573464、254572163、254570957、254573014、254570673、254566987、254567581、254564747、254568562、254566731、254565437、254564519、254571763、254566729、254569372、254571423、254565451、254565973、254573008、254574310、254564587、254568946、254569478、254566861、254565513、254572906、254572796、254573092、254567233、254565959、254570383、254570885、254565519、254574530、254573558、254569654、254573466、254571991、254568780、254565859、254568564、254570088、254564995、254573142、254571407、254569976、254570771、254565455、254565551、254574244、254567716、254572952、254568654、254570661、254566481、254565045、254567189、254570098、254566883、254569212、254574528、254565655、254568196、254572782、254570305、254572856、254568894、254564809、254569780、254565263、254567287、254567754、254565279、254567471、254564667、254568442、254571893、254573996、254572005、254572033、254567027、254569734、254566559、254570993、254566611、254566089、254567714、254571057、254573908、254572676、254570100、254567055、254565475、254567834、254567872、254566327、254574366、254568036、254567738、254565307、254570727、254566301、254565783、254567173、254568492、254565493、254571145、254565699、254567029、254573198、254568642、254568302、254574036、254569716、254571157、254571485、254567788、254573482、254566631、254571293、254569576、254572962、254565129、254569094、254570112、254566447、254570515、254568944、254573180、254573098、254570969、254569500、254564507、254569714、254570072、254573324、254568444、254569156、254568334、254568304、254566885、254571359、254574464、254569852、254569144、254573818、254573050、254572992、254571587、254573470、254565991、254566975、254570022、254569102、254574442、254569298、254572501、254569162、254565713、254565211、254572377、254571575、254574030、254572872、254565431、254569400、254572599、254565725、254569842、254570271、254573426、254574502、254569568、254572822、254568950、254572257、254569700、254573726、254574210、254567569、254569896、254571915、254568132、254567191、254566971、254567243、254566843、254568386、254571131、254572628、254567025、254569344、254571043、254572958、254566489、254566607、254569916、254571179、254569898、254567938、254566619、254566141、254572159、254573164、254573328、254570166、254565545、254570535、254564705、254570393、254566769、254565063、254567203、254573714、254571903、254571639、254564825、254569512、254569682、254574296、254574080、254564849、254570719、254568186、254572093、254573284、254571919、254570821、254565769、254573468、254571883、254570633、254570315、254570527、254567583、254573420、254569866、254569290、254569438、254574316、254566267、254570897、254569696、254566847、254572974、254569386、254568682、254565735、254574242、254568876、254566225、254566479、254569106、254566881、254569226、254565085、254569736、254572157、254565157、254573986、254569320、254570679、254572211、254566063、254568616、254564917、254564915、254568842、254573376、254566487、254565875、254568412、254564663、254565961、254569890、254566293、254568216、254572836、254570523、254568506、254572347、254567662、254567720、254574020、254571733、254571747、254569894、254571377、254566013、254569558、254565617、254566191、254571955、254565721、254567996、254566897、254574140、254571035、254570359、254566893、254568298、254566101、254565989、254568566、254571457、254571393、254571161、254564537、254571649、254570979、254566595、254566417、254569072、254570669、254569122、254567253、254573448、254571343、254572333、254566649、254571369、254573496、254572133、254573886、254569410、254570411、254565705、254573462、254568908、254572495、254569552、254566933、254568102、254569702、254569846、254574136、254569390、254567273、254572371、254569354、254572053、254568006、254565653、254570487、254573510、254564923、254568606、254572503、254569166、254572145、254572531、254568464、254570723、254570485、254567349、254565049、254574132、254564979、254564629、254572309、254565163、254573160、254573452、254565165、254573834、254574102、254568996、254573756、254572015、254568992、254572535、254566143、254572321、254568056、254573266、254566351、254571007、254571463、254570629、254573948、254572884、254567375、254567467、254567928、254572307、254567700、254571783、254573676、254567900、254568714、254564921、254564599、254573602、254573662、254570521、254572814、254571619、254566321、254568896、254566743、254572553、254565607、254565035、254565403、254573760、254566097、254564603、254572956、254564565、254572834、254566317、254564665、254573056、254568582、254564717、254572724、254565955、254568718、254573174、254566999、254569742、254573508、254565095、254569494、254573046、254568148、254574028、254569828、254566605、254569010、254568244、254564675、254569952、254574158、254567143、254566779、254574118、254573866、254570090、254569928、254573178、254574370、254569876、254571543、254570799、254569038、254570373、254567774、254571247、254574144、254571313、254570649、254565795、254572920、254568600、254571879、254567231、254567553、254569782、254566517、254566423、254573664、254565207、254566497、254566087、254571791、254568702、254569082、254569470、254565589、254570561和254574100。可以在ncbi.nlm.nih.gov/protein上的PubMed蛋白质数据库中搜索GI编号例如以检索对应蛋白质的名称和/或序列。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自Pfam家族的蛋白质，所述Pfam家族选自由以下组成的组：Pf00044、Pf02800、Pf02826、Pf00009、Pf03143、Pf03144、Pf00113、Pf03952、Pf00107、Pf08240、Pf00012、Pf06723、Pf00162、Pf00183、Pf02518、Pf00009、Pf00679、Pf03144、Pf03764、Pf00205、Pf02775、Pf02776、Pf00006、Pf00306、Pf02874、Pf01249、Pf00240、Pf01020、Pf11976、Pf00240、Pf01599、Pf11976、Pf00006、Pf00306、Pf02874、Pf00153、Pf00189、Pf07650、Pf00012、Pf06723、Pf01929、Pf00400、Pf00012、Pf06723、Pf00297、Pf01015、Pf01116、Pf00224、Pf02887、Pf03328、Pf00005、Pf03193、Pf00300、Pf00416、Pf01287、Pf01294、Pf00121、Pf00012、Pf06723、Pf01251、Pf00022、Pf00318、Pf00327、Pf00238、Pf00411、Pf01090、Pf00687、Pf00573、Pf00177、Pf00828、Pf01459、Pf00270、Pf00271、Pf00298、Pf03946、Pf01201、Pf00572、Pf00276、Pf00428、Pf00466、Pf00827、Pf00923、Pf01781、Pf01248、Pf00118、Pf00043、Pf00647、Pf00900、Pf01479、Pf08071、Pf00333、Pf03719、Pf01450、Pf07991、Pf01280、Pf01780、Pf00181、Pf03947、Pf03501、Pf00312、Pf08069、Pf00338、Pf00380、Pf00132、Pf00483、Pf12804、Pf00366、Pf00347、Pf00410、Pf00334、Pf00160、Pf01248、Pf00237、Pf00393、Pf03446、Pf00213、Pf00347、Pf00080、Pf01248、Pf01198、Pf00838、Pf01200、Pf00122、Pf00690、Pf00702、Pf08282、Pf12710、Pf00252、Pf00163、Pf01479、Pf00833、Pf01092、Pf01667、Pf00107、Pf08240、Pf01092、Pf01775、Pf01159、Pf01667、Pf01849、Pf00125、Pf02969、Pf00675、Pf05193、Pf00153、Pf00244、Pf00208、Pf02812、Pf01158、Pf00330、Pf00694、Pf00125、Pf00808、Pf02284、Pf00281、Pf00673、Pf00438、Pf02772、Pf02773、Pf00670、Pf02826、Pf05221、Pf00428、Pf00578、Pf08534、Pf10417、Pf01247、Pf02953、Pf09598、Pf04969、Pf01246、Pf00202、Pf01212、Pf00349、Pf03727、Pf01776、Pf03332、Pf08282、Pf00253、Pf00155、Pf00012、Pf06723、Pf01717、Pf08267、Pf00166、Pf00085、Pf00056、Pf02866、Pf00076、Pf00658、Pf00285、Pf00406、Pf05191、Pf00456、Pf02779、Pf02780、Pf00861、Pf00349、Pf03727、Pf00025、Pf00071、Pf01926、Pf04670、Pf08477、Pf05873、Pf00342、Pf00831、Pf00203、Pf01282、Pf00515、Pf07719、Pf01215、Pf01159、Pf05405、Pf00180、Pf02297、Pf00108、Pf00109、Pf02803、Pf01488、Pf03435、Pf05368、Pf02953、Pf00076、Pf00012、Pf06723、Pf00828、Pf00070、Pf01262、Pf02852、Pf07992、Pf12831、Pf00793、Pf11022、Pf00389、Pf00670、Pf02826、Pf05221、Pf00085、Pf02114、Pf01063、Pf01209、Pf02353、Pf08241、Pf08242、Pf08498、Pf12847、Pf03297、Pf00719、Pf00254、Pf00226、Pf00684、Pf01556、Pf00164、Pf00125、Pf00627、Pf01849、Pf00736、Pf01283、Pf01157、Pf00009、Pf03143、Pf03144、Pf05680、Pf00180、Pf04911、Pf00180、Pf01926、Pf06071、Pf00270、Pf00271、Pf00310、Pf00733、Pf00266、Pf01243、Pf10590、Pf00231、Pf00025、Pf00071、Pf00503、Pf01926、Pf04670、Pf08477、Pf09439、Pf01588、Pf01253、Pf00675、Pf02136、Pf00036、Pf00006、Pf00306、Pf02874、Pf00410、Pf01655、Pf00085、Pf01546、Pf00270、Pf00271、Pf04851、Pf00025、Pf00071、Pf00503、Pf01926、Pf08477、Pf09439、Pf00254、Pf00006、Pf00306、Pf02874、Pf04568、Pf00956、Pf00180、Pf00133、Pf01406、Pf08264、Pf09334、Pf00004、Pf00910、Pf01078、Pf02359、Pf02933、Pf05496、Pf05673、Pf06068、Pf07724、Pf07728、Pf00676、Pf12718、Pf01808、Pf02142、Pf02167、Pf11578、Pf00091、Pf03953、Pf01873、Pf02020、Pf00702、Pf01030、Pf00226、Pf00083、Pf07690、Pf00587、Pf02403、Pf02779、Pf02780、Pf01798、Pf08060、Pf08156、Pf00365、Pf00106、Pf01073、Pf01370、Pf07993、Pf08659、Pf00034、Pf00155、Pf01041、Pf01053、Pf00549、Pf01071、Pf08442、Pf00501、Pf11930、Pf03114、Pf10455、Pf01199、Pf00106、Pf00109、Pf01648、Pf02801、Pf00291、Pf00571、Pf01118、Pf02774、Pf08718、Pf01154、Pf08540、Pf00070、Pf07992、Pf00081、Pf02777、Pf00152、Pf01336、Pf01798、Pf08060、Pf08156、Pf10642、Pf00289、Pf00364、Pf00682、Pf02436、Pf02785、Pf02786、Pf07478、Pf00180、Pf09229、Pf01704、Pf00076、Pf00887、Pf00698、Pf01575、Pf03060、Pf08354、Pf05047、Pf00155、Pf01347、Pf00549、Pf02629、Pf00076、Pf08662、Pf00018、Pf00241、Pf07653、Pf00070、Pf01946、Pf07992、Pf01269、Pf00133、Pf08264、Pf09334、Pf00117、Pf00958、Pf02540、Pf03054、Pf06508、Pf07722、Pf02550、Pf00479、Pf02781、Pf00005、Pf03193、Pf12848、Pf00155、Pf00266、Pf01041、Pf01053、Pf01212、Pf02347、Pf03841、Pf00009、Pf03144、Pf09173、Pf00118、Pf01907、Pf00155、Pf00464、Pf04718、Pf00733、Pf00764、Pf03054、Pf06508、Pf10791、Pf00926、Pf04669、Pf01459、Pf00294、Pf01192、Pf04281、Pf00638、Pf01873、Pf01399、Pf00587、Pf02824、Pf03129、Pf07973、Pf01920、Pf00743、Pf07992、Pf00255、Pf00578、Pf08534、Pf03134、Pf02271、Pf00120、Pf03951、Pf00310、Pf01380、Pf09280、Pf01634、Pf08029、Pf09084、Pf00682、Pf00501、Pf00176、Pf00270、Pf00271、Pf00437、Pf00625、Pf00910、Pf05729、Pf00198、Pf00364、Pf02817、Pf00171、Pf00705、Pf02144、Pf02747、Pf01652、Pf00241、Pf00171、Pf03198、Pf07983、Pf03198、Pf07983、Pf04627、Pf01042、Pf00152、Pf01336、Pf00682、Pf08502、Pf01912、Pf00578、Pf08534、Pf10417、Pf00226、Pf01556、Pf01399、Pf09440、Pf00262、Pf00118、Pf00750、Pf03485、Pf05746、Pf00111、Pf00384、Pf09326、Pf10588、Pf01248、Pf00085、Pf00462、Pf00676、Pf02779、Pf00009、Pf00071、Pf02421、Pf08477、Pf05091、Pf00133、Pf08264、Pf09334、Pf10458、Pf01472、Pf01509、Pf08068、Pf00118、Pf01111、Pf00160、Pf00152、Pf01336、Pf00899、Pf02134、Pf09358、Pf10585、Pf00682、Pf04111、Pf00175、Pf00970、Pf08030、Pf03435、Pf00575、Pf07541、Pf00332、Pf01257、Pf00742、Pf03447、Pf01262、Pf05222、Pf00832、Pf12710、Pf01266、Pf01411、Pf02272、Pf07973、Pf00013、Pf01991、Pf06505、Pf00587、Pf03129、Pf01398、Pf11976、Pf09796、Pf00025、Pf00071、Pf04670、Pf08477、Pf01176、Pf00043、Pf00749、Pf03950、Pf02374、Pf06244、Pf02939、Pf00160、Pf00515、Pf07719、Pf00793、Pf00709、Pf00235、Pf02115、Pf00881、Pf11885、Pf02823、Pf00291、Pf10276、Pf00004、Pf00158、Pf06414、Pf07724、Pf07726、Pf07728、Pf01433、Pf00155、Pf00076、Pf00118、Pf01194、Pf00317、Pf02867、Pf03477、Pf03483、Pf03484、Pf00076、Pf12353、Pf02453、Pf05262、Pf00578、Pf08534、Pf01238、Pf01564、Pf01218、Pf00227、Pf110584、Pf00240、Pf00627、Pf11976、Pf00153、Pf00009、Pf00025、Pf00071、Pf04670、Pf08477、Pf09439、Pf00350、Pf01031、Pf02212、Pf00535、Pf00890、Pf02910、Pf00583、Pf00403、Pf12223、Pf02854、Pf12152、Pf00152、Pf00587、Pf01409、Pf00004、Pf01057、Pf01078、Pf06068、Pf07724、Pf07726、Pf07728、Pf00155、Pf00464、Pf01381、Pf08523、Pf12844、Pf00156、Pf00735、Pf01926、Pf03193、Pf00004、Pf01057、Pf01078、Pf05673、Pf06068、Pf07726、Pf07728、Pf00290、Pf00291、Pf01208、Pf01466、Pf03931、Pf08327、Pf09229、Pf00107、Pf08240、Pf03223、Pf12757、Pf09731、Pf00557、Pf01753、Pf02936、Pf01793、Pf00155、Pf00202、Pf00155、Pf00687、Pf00091、Pf03953、Pf08597、Pf00118、Pf00586、Pf01071、Pf02222、Pf02655、Pf02769、Pf02843、Pf02844、Pf08442、Pf00118、Pf00343、Pf03130、Pf00332、Pf00270、Pf00271、Pf00004、Pf05496、Pf06068、Pf06414、Pf01145、Pf00579、Pf00266、Pf01212、Pf01965、Pf00815、Pf01502、Pf01503、Pf00149、Pf00542、Pf00156、Pf03098、Pf00400、Pf03604、Pf00248、Pf00365、Pf04145、Pf00400、Pf00329、Pf01086、Pf00004、Pf00158、Pf02861、Pf07724、Pf07728、Pf10431、Pf00205、Pf02775、Pf02776、Pf00043、Pf02798、Pf01546、Pf00227、Pf10584、Pf00156、Pf00310、Pf00118、Pf01012、Pf01145、Pf00481、Pf00248、Pf00206、Pf10397、Pf01602、Pf08752、Pf00227、Pf10584、Pf00491、Pf00300、Pf05739、Pf00004、Pf03796、Pf06068、Pf00107、Pf08240、Pf00298、Pf03946、Pf01399、Pf04135、Pf00637、Pf03463、Pf03464、Pf03465、Pf02330、Pf08662、Pf01512、Pf10531、Pf10589、Pf10785、Pf12853、Pf00735、Pf03193、Pf04548、Pf00635、Pf00650、Pf03765、Pf02656、Pf04758、Pf00731、Pf02222、Pf02655、Pf07478、Pf00118、Pf00275、Pf00465、Pf01202、Pf01487、Pf01488、Pf01761、Pf08501、Pf07957、Pf04280、Pf01399、Pf08375、Pf05383、Pf00076、Pf05383、Pf00636、Pf01641、Pf03678、Pf00125、Pf00364、Pf02817、Pf00462、Pf00227、Pf10584、Pf00291、Pf00585、Pf01263、Pf01399、Pf05470、Pf00459、Pf01576、Pf05911、Pf12128、Pf12757、Pf01398、Pf00009、Pf01926、Pf03029、Pf08597、Pf11987、Pf00390和Pf03949。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：Adh1、Adh2、Cit2、Eno1、Eno2、Fba1、Hxk1、Hxk2、Icl1、Pdb1、Pdc1、Pfk1、Pgi1、Pgk1、Pyc1、Tal1、Tdh2、Tdh3、Tpi1、Efb1、Eft1、Eft2、Prt1、Rpa0、Tif1，2、Yef3、Hsc82、Hsp60、Hsp82、Hsp104、Kar2、Ssa1、Ssa2、Ssb1、Ssb2、Ssc1、Sse1、Sti1、Ade1、Ade3、Ade5，7、Arg4、Gdh1、Gln1、His4、Ilv5、Lys9、Met6、Pro2、Ser1、Trp5、Act1、Adk1、Ald6、Atp2、Bmh1、Bmh2、Cdc19、Cdc48、Cdc60、Erg20、Gpp1、Gsp1、Ipp1、Lcb1、Mol1、Pab1、Pma1、Psa1、Rnr4、Sam1、Sam2、Sod1、Uba1、YKL056、YLR109和YMR116。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：cspB、cspD、rp1L、rp1U、hag、rpsN、rp1D和yweA。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：hup、ptsH、dpsA、tuf、gapB、rp1X、malE和yhjA。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：uspA、tufa、yqiA、rp1E、lpp、rp1Y、gatB和rp1L。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种通过选自由以下组成的组的SwissProt登录号鉴定的蛋白质：P00575、P06958、P00577、P02996、P04475、P02349、P06139、P09373、P02990、P17547、P22257、P06959、P06977、P11665、P14178、P02997、P00957、P00350、P07813、P23843、P00956、P08324、P08839、P02995、P07650、P03815、P09831、P05055、P00882、P00961、P07118、P09743、P10413、P60422、P02934、P00391、P30148、P04079、P36683、P12283、P06711、P00477、P02351、P0A8N3、P08177、P39184、P02384、P02354、P00968、P06981、P0A6T1、P07395、P08200、P27302、P62593、P03002、P09097、P11604、P16659、P15639、P00824、P02359、P00574、P60438、P00962、P62399、P15254、P07015、P26427、P23721、P00959、P00864、P02352、P03003、P39171、P62707、P39170、P15046、P02392、P17242、P00452、P14926、P00561、P25739、P00490、P02356、P76116、P04805、P00822、P00509、P23304、P07651、P32132、P30136、P17169、P21889、P08398、P61175、P00955、P08202、P08936、P29132、P06996、P04790、P04825、P03948、P02418、P09156、P15288、P32176、P00448、P33136、P08328、P02390、P17963、P22783、P02925、P60723、P02408、P08859、P09169、P13029、P16174、P25716、P04384、P21202、P02999、P30850、P33602、P35340、P05082、P08837、P37797、P02410、P22259、P07459、P10408、P22523、P02358、P09376、P45523、P00353、P06612、P33195、P08312、P24182、P12758、P17579、P00579、P07460、P61889、P25715、P60624、P09625、P23861、P22992、P33633、P07012、P17288、P27430、P60240、P02413、P37689、P32168、P00951、P08330、P18391、P21155、P07016、P13519、P21170、P06998、P02369、P02928、P02361、P11454、P06982、P02420、P77241、P31120、P36546、Q46829、P00954、P39172、P02426、P31216、P45577、P60906、P06138、P19673、P09372、P21513、P10177、P09151、P00891、P60785、P76177、P36938、P61517、P28691、P11457、P02428、P02419、P02416、P46837、P33599、P37747、P00913、P02931、P09546、P06971、P11096、P09157、P00934、P23480、P00960、P77482、P21346、P77349、P02364、P25665、P33138、P02375、P11875、P37095、P39435、P27827、P00479、P27248、P21599、P30867、P02363、P0A8N5、P22106、P04425、P37901、P02411、P02409、P39174、P02432、P39173、P10377、P25532、P31554、P02378、P24249、P30859、P03020、P37191、P37759、P23839、P77645、P33998、P76268、P02930、P24199、P02342、P14177、P07672、P23847、P63020、P08374、P08204、P27298、P02366、P24991、P05380、P17315、P21167、P21165、P23869、P31224、P17114、P76558、P15877、P19935、P07176、P61714、P10378、P24237、P60651、P77395、P17117、P24167、P06715、P37744、P02421、P25553、P24171、P05053、P03026、P08957、P00393、P02430、P27290、P02370、P04287、P23851、P00963、P17577、P39179、P10344、P09832、P07638、P76344、P00946、P38489、P45955、P05838、P75780、P23844、P31979、P00886、P11285、P07912、P25520、P00907、P02422、P18197、P26616、P07671、P52697、P02341、P39311、P33221、P39168、P00837、P22767、P19675、P05793、P62620、P02373、P45390、P00582、P77146、P30958、P24233、P05640、P16921、P07006、P30017、P00496、P31223、P36541、P02372、P76372、P31550、P39182、P11668、P21499、P77718、P10444、P19245、P02371、P08178、P18843、P45578、P21888、P22786、P02367、P23893、P23882、P11648、P51001、P02379、P10121、P05020、P24231、P02427、P60757、P15002、P31663、P19494、P08193、P37051、P02424、P13036、P02429、P00274、P15640、P02414、P36997、P0A6A6、P07004、P02435、P32164、P77310、P27252、P13652、P52643、P02436、P15277、P77804、P31057、P30139、P11028、P80063、P21774、P08622、P04951、P02374、P15716、P03017、P37648、P00923、P04422、P11557、P16456、P07906、P09159、P15048、Q46856、P39377、P14374、P06128、P29464、P60716、P00453、P37192、P76492、P45464、P23887、P00495、P45803、P33363、P30849、P04036、P18274、P28635、P77774、P46853、P25521、P14175、P36658、P39287、P78258、P77348、P30746、P29209、P24186、P26650、P23865、P05459、P15040、P30125、P25528、P30856、P36996、P08186、P02901、P33398、P39831、P18400、P23836、P20752、P29015、P04693、P00859、P02339、P36979、P60560、P0A6T3、P23858、P05825、P09424、P00831、P39330、P15047、P76153、P23853、P04816、P33598、P02998、P27251、P25714、P21892、P37754、P37329、P28909、P37187、P21590、P28302、P09029、P02937、P55741、P25662、P15039、P23863、P27851、P00370、P23932、P02905、P07019、P76002、P75876、P37688、P03025、P78083、P52065、P39406、P77258、P30744、P61316、P77254、P24253、P39811、P07005、P11026、P40874、P36540、P00478、P02437、P75789、P36766、P03844、P37010、P26428、P37190、P24250、P77438、P06984、P27434、P37749、P10384、Q57261、P15770、P00501、P24247、P77734、P12996、P42641、Q47130、P60546、P06129、P24223、P75838、P43675、P28694、P75902、P09375、P76403、P76658、P25529、P25516、P15034、P09200、P10902、P06995、P00547、P29210、P00583、P06613、P0A6W9、P75802、P28904、P31803、P25661、P27511、P30126、P00470、P30177、P17952、P10443、P37665、P36671、P76351、P36950、P09028、P00832、P06999、P23331、P07862、P09170、P40120、P80449、P77486、P14189、P06992、P05054、P75864、P09158、P61949、P62768、P07024、P23929、P75844、P07913、P37666、P00373、P04982、P03842、P76536、P07014、P13035、P36559、P76055、P36539、P09030、P21504、P36767、P39169、P08756、P42617、P32661、P37765、P23827、P04381、P52054、P20082、P09147、P06988、P76367、P46143、P05797、P77150、P06983、P25397、P18133、P75790、P16244、P08956、P37634、P43329、P24229、P06968、P75743、P28242、P18783、P27291、P30138、P45467、P06975、P46885、P39199、P10440、P25745、P40681、P25437、P33648、P37760、P75805、P00894、P77695、P00510、P31222、P09830、P31059、P05826、P76258、P76569、P18198、P46880、P30977、P07001、P45391、P13024、P13009、P33635、P24176、P31142、P17112、P60752、Q93K97、P11458、P08331、P37620、Q46828、P13000、P26615、P33644、P02917、P33918、P25888、P19934、P77338、P13685、P28225、P09997、P40718、P27828、P23830、P08188、P03812、P52647、P37667、Q46918、P00482、P18401、P32052、P03841、P62623、P46889、P27190、P37026、P11666、P39164、P46130、P30860、P37188、P76576、P33921、P31221、P37687、P12281、P76506、P25894、P00893、P03843、P25663、P45571、P77552、P52635、P30137、P76494、P39099、P24201、P20083、P46132、P76034、P39315、P09323、P37163、P07011、P31465、P39321、P05194、P77225、P32691、P37902、P09371、P77484、P23486、P39290、P76008、P32165、P19677、P76270、P45396、P75950、P77247、P75915、P32175、P05828、Q59384、P27306、P05848、P45748、P31133、P39396、P06986、P05796、P10740、P33570、P46473、P28690、P32130、P17993、P39177、P31664、P23911、P43671、P30848、P21338、Q46920、P77392、P61320、P23003、P39202、P45533、P15042、P30010、P02943、P32126、P26282、P46186、P38521、P09053、P00642、P25907、P00562、P17580、P09152、P17994、P76277、P76504、P75947、P37096、P37066、P52049、P02914、Q46933、P22333、P29217、P07020、P15298、P03807、P37631、P33597、P37347、P08367、P07002、P28304、P52061、P39356、P37308、Q46871、P15302、P00363、P75914、Q46948、P22563、P37345、P11056、P05791、P33601、P28633、P08373、P42550、P17113、P77202、P31218、P37175、P32157、P29679、P24178、P29680、P75736、P22188、P45389、P76290、P55139、P21645、P17448、P55253、P37440、P36564、P24245、P76370、P36995、P45799、P33636、P32105、Q46837、P23909、P78067、P21169、P08390、P30748、P16680、P36680、P41407、P76110、P23930、P28692、P16095、P03018、P15977、P21829、P09148、P05021、P23483、P31658、P45847、P39286、P46860、P40191、P37350、O65938、P32680、P12008、P27303、P03817、P46930、P21507、P77499、P76550、P52083、P37346、P33016、P09551、P24251、P25519、P11721、P27292、P00928、P17445、P43672、P33650、P24218、P07604、P39335、P28637、P29745、O69415、P71295、P11603、P76272、P32099、P77455、P45426、P15484、P15028、P08323、P00550、P02918、P30870、P76503、P24183、P36672、P23874、P03818、P02978、P33349、P75783、P33916、Q46863、P27848、P23199、P25533、P36768、P19641、P76423、P18393、P27841、P03019、P45580、P08660、P61887、P39401、P23894、P23884、P33643、P19674、P00811、P08179、P40717、P07085、P18390、P75849、P33031、P37189、P39323、P22938、P10346、P37647、P23089、P76187、P24285、P75823、P37745、P76426、P28861、Q46872、P75958、P02924、P60340、Q47622、P32174、P03033、P32703、P43781、P75949、P15050、P37349、P76316、P25738、P11288、P24203、P10957、P76015、P08203、P37354、P27838、P17109、P34086、P76141、P31220、P27550、P51024、P46131、P28248、P31680、P37606、Q46893、Q46868、P08244、P16528、P20099、P39903、P07003、P77293、P45756、P24213、P21516、P37692、P75745、P32695、P37194、P27829、P76495、P45529、P52124、P75968、P00844、P11027、P52084、P33220、P33362、P77605、P22255、P00926、P26648、P30854、P33129、P32050、P15272、P06149、P32177、P75957、P11349、P77674、P32678、P76036、P30858、P12610、P23870、P36879、P37904、P39347、P18196、P17443、P36929、P31546、P26646、P03004、P31828、P05792、P30178、P33353、P29011、P30855、Q00191、P77561、P76496、P77252、P32721、P08338、P18775、P37330、P33940、P76422、P07676、Q46841、P45535、P30846、P06964、P23282、P39833、P33226、P76017、P52052、P45471、P03021、P23917、P11880、P60472、P36565、P77624、P07762、P28689、P06716、P22256、P45802、Q52280、P75913、P46474、P19635、P09391、P15038、P22997、Q57154、P08577、P75874、P76146、P24181、P22763、P27850、P77239、P37005、Q46814、P37626、P77562、P39835、P76256、P77500、P24205、P06712、P09454、P11257、P75793、P42908、P31475、P76014。可以在uniprot.org上的UniProt蛋白质数据库中搜索SwissProt登录号例如以检索对应蛋白质的名称和/或序列。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含含血红素的蛋白。在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：雄激素珠蛋白(androglobin)、细胞珠蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白、豆血红蛋白、黄素血红蛋白、地狱之门珠蛋白I(Hell′s gate globin I)、肌红蛋白、无脊血红蛋白、β血红蛋白、α血红蛋白、原珠蛋白(protoglobin)、氰基珠蛋白(cyanoglobin)、细胞珠蛋白、组织珠蛋白、神经珠蛋白、血绿蛋白、截短的血红蛋白(例如，HbN或HbO)、截短的2/2珠蛋白、血红蛋白3(例如，Glb3)、细胞色素或过氧化物酶。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含碳水化合物聚合物(例如，β-葡聚糖、糖原、黄原胶、木聚糖、结冷胶、凝胶多糖、琼脂糖、葡聚糖、支链淀粉、磷壁酸、肽聚糖(例如，胞壁质)或核酸聚合物(例如，核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)或基因组DNA)或其它生物聚合物。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以包含异源表达的蛋白质。在一些实施例中，异源表达的蛋白质可以来自不同于宿主细胞的物种，例如来自真核生物、动物、植物、藻类、嗜热生物、酵母、细菌、原生生物或古细菌。在一些实施例中，异源表达的蛋白质可以是本文所描述的蛋白质中的任何蛋白质。在一些实施例中，异源表达的蛋白质可以是含血红素的蛋白。在一些实施例中，异源蛋白质具有作为生物催化剂、食品加工助剂、酶、增味剂、治疗剂、甜味剂、药物、营养品的功能活性。
如本文所述，在纯化工艺期间将pH维持在8.5与12.0之间可以产生具有最少异味或变味的蛋白质组合物，使得蛋白质的来源(例如，从中纯化蛋白质的微生物)不容易鉴定。在一些实施例中，此类蛋白质组合物向食物产品提供最少异味或变味，所述食物产品是所述蛋白质组合物的一部分或向所述食物产品添加所述蛋白质组合物。在一些实施例中，可以使用受过训练的人类小组成员来评估异味和变味的产生。评估可以涉及注视、感觉、咀嚼和/或品尝蛋白质或由蛋白质制成的食物产品，以判断外观、颜色、完整性、质地、风味和口感等。可以在不同颜色的光下(例如，红光或在白光下)为小组成员提供样品。可以给样品分配随机三位数并且在选票位置(ballot position)中旋转以防止偏置。可以要求小组成员以样品设盲法“四分体”格式正确配对两个不同的样品重复品组(例如，A1、A2对B1、B2)。可以要求小组成员以样品设盲法“六分体”格式正确配对两个不同的样品重复品组(例如，A1、A2、A3对B1、B2、B3)。感官判断可以用“接受度”或“喜欢度”来衡量，或者使用特殊术语。例如，可以使用字母等级(A表示优异、B表示良好、C表示差)或数字等级(1＝不喜欢；2＝一般；3＝良好；4＝非常好；5＝优异)。可以使用等级来评定所测试产品的总体可接受性或质量或特定的质量属性，如肉用体型、质地和风味。可以使用特定的感官参照(例如，“烘烤的谷物”对可商购获得的谷类食物，或者“发酵乳”对可商购获得的酸奶)来训练小组成员。可以给予小组成员对每个样品进行评论的机会，并且鼓励小组成员在样品之间用水漱口。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或用此类蛋白质制成的食物产品可以基于嗅觉计读数来评估。在各个实施例中，嗅觉计可以用于评估气味浓度和气味阈值、与参考气体相比的气味超阈值、用于确定欣赏程度的嗜好程度分数或气味的相对强度。在一些实施例中，嗅觉计允许专家小组的训练和自动评估。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以用作生物催化剂。例如，可以将蛋白质组合物中存在的酶的底物添加到组合物中，并且在温育之后，可以分离酶反应的产物。在一些实施例中，可以添加多种底物和辅因子以支持一种或多种所关注产物的产生。在一些实施例中，反应的产物可以是药物、药物中间体、风味化合物、辅因子、经修饰的糖、氨基酸、单体或任何其它所关注化合物。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于蛋白质的体外转录和翻译。在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于蛋白质的体外翻译。添加模板DNA、能量系统和氨基酸可以导致靶蛋白的产生(参见例如最新综述，如微型综述：用于生物制造高价值产品的体外代谢工程(Mini-review：In vitro Metabolic Engineering for Biomanufacturing of High-value Products)，《计算和结构生物技术杂志(Computational and StructuralBiotechnology Journal)》，2017，第15卷，161-167)。在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于使用体外翻译将非天然氨基酸掺入蛋白质中。
在一些实施例中，蛋白质组合物(例如，通过本文所描述的方法产生)可以包括总细胞蛋白。在一些实施例中，蛋白质组合物(例如，通过本文所描述的方法产生)可以包括多种蛋白质。例如，蛋白质组合物可以包括5种或更多种(例如，10种、15种、20种、30种、40种、50种、100种、200种、300种、400种或500种)不同的蛋白质。在一些实施例中，蛋白质组合物中的至少25％(例如，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)的蛋白质是功能性的，如本文所述。
食物产品
本文所描述的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物可以用作一种或多种食物产品或用于一种或多种食物产品。如本文所述的蛋白质组合物可以用于各种食物产品，包含例如蛋白质补充剂(例如，蛋白粉或奶昔)、膳食替代品或烘焙食品，或者用于替代模仿动物源性食物产品(例如，乳制复制品(例如，奶复制品、奶酪复制品)、蛋复制品(例如，蛋清复制品、蛋黄复制品、全蛋复制品或乱蛋复制品)或肉复制品如牛肉复制品、鸡肉复制品、猪肉复制品、鱼复制品、羊肉复制品，所述肉复制品中的任何肉复制品都可以呈碎肉复制品、全切复制品(例如，烤肉复制品、牛排复制品、胸脯肉复制品、翅复制品、大腿复制品、肉片复制品或连骨肉复制品)、器官复制品或香肠复制品的形式))的食物产品中的动物蛋白质(例如，来自牛、猪、家禽、羔羊或鱼)的全部或一部分。在一些实施例中，蛋白质组合物可以用作肉增量剂。
在一些实施例中，如本文所述的蛋白质组合物可以具有最少异味或变味，使得蛋白质的来源(即，从中纯化蛋白质的微生物)不容易鉴定，并且向食物产品提供最少异味或变味。在一些实施例中，可以使用受过训练的人类小组成员来评估异味和变味的产生。评估可以涉及注视、感觉、咀嚼和/或品尝蛋白质或由蛋白质制成的食物产品，以判断外观、颜色、完整性、质地、风味和口感等。可以在不同颜色的光下(例如，红光或在白光下)为小组成员提供样品。可以给样品分配随机三位数并且在选票位置中旋转以防止偏置。感官判断可以用“接受度”或“喜欢度”来衡量，或者使用特殊术语。例如，可以使用字母等级(A表示优异、B表示良好、C表示差)或数字等级(1＝不喜欢；2＝一般；3＝良好；4＝非常好；5＝优异)。可以使用等级来评定所测试产品的总体可接受性或质量或特定的质量属性，如肉用体型、质地和风味。可以给予小组成员对每个样品进行评论的机会，并且鼓励小组成员在样品之间用水漱口。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物或用此类蛋白质制成的食物产品可以基于嗅觉计读数来评估。在各个实施例中，嗅觉计可以用于评估气味浓度和气味阈值、与参考气体相比的气味超阈值、用于确定欣赏程度的嗜好程度分数或气味的相对强度。在一些实施例中，嗅觉计允许专家小组的训练和自动评估。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物可以包括至少约35干重％(例如，至少约40干重％、50干重％、55干重％、60干重％、65干重％、70干重％、75干重％、80干重％、85干重％、90干重％、95干重％或99干重％)的大于约500Da(例如，约1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、10kDa、30kDa或50kDa)的分子。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物可以包括至少约35干重％(例如，至少40干重％、50干重％、55干重％、60干重％、65干重％、70干重％、75干重％、80干重％、85干重％、90干重％、95干重％或99干重％)的介于约500Da(例如，约1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、10kDa、30kDa或50kDa)与约200kDa(例如，300kDa、400kDa或500kDa)之间的分子。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物中的至少约35％(例如，至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的多肽(也称为蛋白质)可以介于约500Da(例如，约1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、10kDa、30kDa或50kDa)与约200kDa(例如，300kDa、400kDa或500kDa)之间。在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物可以排除产生变味或异味的一种或多种小分子(例如，蛋白质组合物可以不包括半胱氨酸；1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸)。本领域普通技术人员可以使用例如GCMS来确定样品中小分子的总量或特定小分子的量。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物可以包括产生变味或异味的分子(例如，半胱氨酸；1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸)。本领域普通技术人员可以使用例如GCMS来确定样品中特定小分子的量。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物的缓冲能力可以小于约3.0mmolNaOH/克干固体(例如，小于约2.9mmol、2.8mmol、2.7mmol、2.6mmol、2.5mmol、2.4mmol、2.3mmol、2.2mmol、2.1mmol、2.0mmol、1.9mmol、1.8mmol、1.7mmol、1.6mmol、1.5mmol、1.4mmol、1.3mmol、1.2mmol、1.1mmol、1.0mmol、0.5mmol或0.1mmol NaOH/克干固体)。缓冲能力可以通过2％(w/v)悬浮液或溶液的pH滴定，即测量将悬浮液或溶液从pH 3.0调节至pH12.0所需的NaOH的mmol来确定。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物可以呈溶液的形式。在一些实施例中，蛋白质组合物可以呈固体的形式(例如，已经冷冻干燥或喷雾干燥的溶液)。在一些实施例中，可以对本文所描述的蛋白质组合物进行巴氏杀菌。例如，可以通过热处理、高温短时巴氏杀菌、脉冲电场、高压巴氏杀菌、UV辐射、γ辐射或微滤来对蛋白质组合物进行巴氏杀菌。在一些实施例中，一种或多种抗微生物剂(例如，聚赖氨酸)可以包含在本文所描述的蛋白质组合物中。
在一些实施例中，本文所描述的蛋白质组合物可以用作生物催化剂。例如，可以将本文所描述的蛋白质组合物中存在的酶的底物添加到组合物中，并且在温育之后，可以分离酶反应的产物。在一些实施例中，可以添加多种底物和辅因子以支持一种或多种所关注产物的产生。在一些实施例中，反应的产物可以是药物、药物中间体、风味化合物、辅因子、经修饰的糖、氨基酸、单体或任何其它所关注化合物。
在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于蛋白质的体外转录和翻译。在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于蛋白质的体外翻译。添加模板DNA、能量系统和氨基酸导致靶蛋白的产生(参见例如最新综述，如微型综述：用于生物制造高价值产品的体外代谢工程，《计算和结构生物技术杂志》，2017，第15卷，161-167)。在一些实施例中，蛋白质组合物可以用于使用体外翻译将非天然氨基酸掺入蛋白质中。
本文还提供了包含本文所描述的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物的食物产品(有时也称为“食品”)、饮料和/或补充剂。本文还提供了本文提供的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物在食物产品、饮料或补充剂中的用途。含有本文所描述的任何蛋白质组合物的食物产品可以用作用于调配各种另外的食物产品的基料，包含肉复制品、汤基料、炖煮基料、快餐食品、肉汤粉、肉汤块、风味包或冷冻食物产品。肉复制品(有时也称为“肉替代品”)可以被调配成例如热狗、汉堡、碎肉、香肠、牛排、肉片、器官(如肝脏、心脏、舌头、肾脏、甜食等)、烤肉、胸脯肉、大腿肉、翅、肉丸、肉卷、培根、肉条、手指、小圆块、肉饼或肉块。
在美国专利第10,039,306号、第9,700,067号和第9,011,949号；美国专利申请公开第US20150305361A1号、第US20170172169A1号、第US20150289541A1号和第US20170188612A1号中描述了示例性食物产品，所述美国专利中的每个美国专利均通过引用整体并入。
在一些实施例中，食物产品可以是蛋白质补充剂。例如，在一些实施例中，如本文所公开的蛋白质组合物可以是蛋白粉的一部分，所述蛋白粉可以用于蛋白质奶昔、冰沙、烘焙等。
在一些实施例中，食物产品可以包含肌肉复制品。在一些实施例中，食物产品可以是肉替代品。在一些实施例中，食物产品可以包含脂肪复制品。在一些实施例中，食物产品可以包含肌肉复制品和脂肪复制品。在一些实施例中，包含肌肉复制品和脂肪复制品的食物产品也可以被称为肉复制品。
在一些实施例中，食物产品可以是乳制复制品。在一些实施例中，食物产品可以是奶酪复制品。在一些实施例中，食物产品可以是奶复制品。在一些实施例中，奶复制品可以用于制备奶酪复制品。
在一些实施例中，食物产品可以是蛋复制品。在一些实施例中，食物产品可以是全蛋复制品(例如，其中蛋黄复制品与蛋清复制品分开)。在一些实施例中，食物产品可以是蛋黄复制品。在一些实施例中，食物产品可以是蛋清复制品。在一些实施例中，食物产品可以是乱蛋复制品(例如，蛋黄复制品和蛋清复制品的混合物)。
食物产品可以包含一种或多种蛋白质(例如，如本文所述的蛋白质组合物、可商购获得的蛋白质、通过本领域已知的任何方法纯化的蛋白质或其组合)。在一些实施例中，食物产品可以包含如本文所述的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物。在一些实施例中，除了可商购获得的蛋白质(例如，大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、酪蛋白、乳清、小麦面筋、豌豆球蛋白或豌豆豆球蛋白)之外，食物产品还可以包含如本文所述的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物。在一些实施例中，除了通过本领域已知的任何方法纯化的一种或多种蛋白质之外，食物产品还可以包含如本文所述的蛋白质组合物中的任何蛋白质组合物。
一种或多种蛋白质(例如，如本文所述的蛋白质组合物、可商购获得的蛋白质、通过本领域己知的任何方法纯化的蛋白质或其组合)可以以食物产品(例如，肉复制品、牛肉类食物产品、鸡肉类食物产品、猪肉类食物产品、鱼类食物产品、牛肉食物产品、鸡肉食物产品、猪肉食物产品或鱼食物产品)的约0.1重量％至约100重量％(例如，约0.1％至约1％、约1％至约5％、约5％至约10％、约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、约10％至约30％、约30％至约50％、约50％至约70％、约70％至约90％、约0.1％至约20％、约20％至约40％、约40％至约60％、约60％至约80％、约80％至约100％、约0.1％至约33％、约33％至约66％、约66％至约100、约0.1％至约50％或约50％至约100％)的量存在。
本文所描述的食物产品中的任何食物产品可以包含铁络合物(例如，叶绿酸亚铁(例如，CAS编号：69138-22-3)、脱镁叶绿酸铁(例如，CAS编号：15664-29-6)、铁盐(例如，硫酸铁(例如，CAS编号7720-78-7、17375-41-6、7782-63-0或10028-22-5中的任一个)、葡萄糖酸铁(例如，CAS编号299-29-6、22830-45-1或699014-53-4中的任一个)、柠檬酸铁(例如，CAS编号3522-50-7、2338-05-8或207399-12-0中的任一个)、EDTA铁(例如，CAS编号：17099-81-9)或血红素部分，如血红素(例如，血红素A(例如，CAS编号：18535-39-2)、血红素B(例如，CAS编号：14875-96-8)、血红素C(例如，CAS编号：26598-29-8)、血红素O(例如，CAS编号：137397-56-9)、血红素I、血红素M、血红素D、血红素S)或含血红素的蛋白)。例如，图8示出了血红素B的结构。
在一些实施例中，血红素部分是与作为含血红素的蛋白的蛋白质或多肽非共价或共价结合的血红素。在一些实施例中，蛋白质或多肽是珠蛋白。在一些实施例中，珠蛋白选自由以下组成的组：雄激素珠蛋白、细胞珠蛋白、珠蛋白E、珠蛋白X、珠蛋白Y、血红蛋白、肌红蛋白、豆血红蛋白、无脊血红蛋白、β血红蛋白、α血红蛋白、原珠蛋白、氰基珠蛋白、细胞珠蛋白、组织珠蛋白、神经珠蛋白、血绿蛋白、截短的血红蛋白、截短的2/μ珠蛋白和血红蛋白3。在一些实施例中，蛋白质或多肽是非动物蛋白质或多肽。在一些实施例中，蛋白质或多肽是植物、真菌、藻类、古细菌或细菌蛋白。在一些实施例中，蛋白质或多肽不在植物、真菌、藻类、古细菌或细菌细胞中天然表达。在一些实施例中，蛋白质或多肽包括与SEQ ID NO.1-27中所示的多肽具有至少50％序列同一性(例如，至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性)的氨基酸序列。
可以用于本文所描述的食物产品中的任何食物产品的含血红素的蛋白可以来自哺乳动物(例如，农场动物，如牛、山羊、绵羊、猪、公牛或兔)、鸟类、植物、藻类、真菌(例如，酵母或丝状真菌)、纤毛虫或细菌。例如，含血红素的蛋白可以来自哺乳动物，如农场动物(例如，牛、山羊、绵羊、猪、公牛或兔)或鸟类(如火鸡或鸡)。含血红素的蛋白可以来自植物，如普通烟草(Nicotiana tabacum)或美花烟草(Nicotiana sylvestris)(烟草)；玉米(Zeamays/corn)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)；豆类，如大豆(Glycine max/soybean)、鹰嘴豆(Cicer arietinum/garbanzo或chick pea)、豌豆(Pisum sativum/pea)变种，如青豆或甜碗豆、普通豆的菜豆变种，如绿豆、黑豆、海军豆、北方豆或斑豆、豇豆(Vignaunguiculata/cow peas)变种、绿豆(Vigna radiata/Mung beans)、羽扇豆(Lupinusalbus/lupin)或苜蓿(Medicago sativa/alfalfa)；油菜(Brassica napus/canola)；加拿大小麦(Triticum sps.)(小麦，包含小麦粒和斯佩耳特小麦(spelt))；陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉花)；稻(Oryza sativa/rice)；菰(Zizania sps.)(野生稻)；葵花(Helianthus annuus/sunflower)；甜菜(Beta vulgaris/sugarbeet)；珍珠粟(Pennisetumglaucum/pearl millet)；藜(Chenopodium sp.)(藜麦)；胡麻(Sesamum sp.)(芝麻)；亚麻(Linum usitatissimum/flax)；或大麦(Hordeum vulgare/barley)。含血红素的蛋白可以从真菌中分离，所述真菌如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、嗜热毁丝霉(Myceliopthera thermophile)、乳酸克鲁维酵母(Kluyvera lactis)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。含血红素的蛋白可以从细菌中分离，所述细菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichen和rmis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、集胞藻(Synechocistis sp.)、超嗜热菌(Aquifexaeolicus)、地狱甲基嗜酸菌(Methylacidiphilum infernorum)或嗜热细菌如嗜热链球菌(Thermophilus)。许多含血红素的蛋白的序列和结构都是已知的。参见例如，Reedy等人，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，2008，第36卷，数据库发行号：D307-D313，以及可在万维网的hemeprotein.info/heme.php上获得的血红素蛋白数据库。
例如，非共生血红蛋白可以来自选自由以下组成的组的植物：大豆、发芽大豆、苜蓿、金亚麻(golden flax)、黑豆、黑眼豌豆、北方豆、鹰嘴豆、月豆(moong bean)、豇豆、斑豆、荚豆(pod pea)、藜麦、芝麻、葵花、小麦粒、斯佩耳特小麦、大麦、野生稻或稻。
本文所描述的可以用于生产食物产品的含血红素的蛋白中的任何含血红素的蛋白可以与含有血红素结合基序的对应野生型含血红素的蛋白或其片段的氨基酸序列具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。例如，含血红素的蛋白可以与包含以下的氨基酸序列具有至少70％序列同一性：非共生血红蛋白，如来自绿豆(SEQ ID NO：1)、大麦(SEQ ID NO：5)、玉米(SEQ ID NO：13)、粳稻(Oryza sativa subsp.japonica)(稻)(SEQ ID NO：14)或拟南芥(SEQ ID NO：15)；地狱之门珠蛋白I，如来自地狱甲基嗜酸菌(SEQ ID NO：2)的地狱之门珠蛋白I；黄素血红蛋白，如来自超嗜热菌(SEQ ID NO：3)的黄素血红蛋白；豆血红蛋白，如来自大豆(SEQ ID NO：4)、豌豆(SEQ ID NO：16)或豇豆(SEQ ID NO：17)的豆血红蛋白；如来自稻瘟病菌(SEQ ID NO：6)或尖孢镰刀菌(SEQ ID NO：7)的血红素依赖性过氧化物酶；来自禾谷镰刀菌(SEQ ID NO：8)的细胞色素c过氧化物酶；来自莫氏衣藻(Chlamydomonas moewusii)(SEQ ID NO：9)、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)(SEQ ID NO：10，I组截短)、大草履虫(Parameciumcaudatum)(SEQ ID NO：11，I组截短)的截短的血红蛋白；来自黑曲霉(Aspergillus niger)(SEQ ID NO：12)的血红蛋白；或哺乳动物肌红蛋白，如家牛(SEQ ID NO：18)肌红蛋白、野猪(SEQ ID NO：19)肌红蛋白、家马(SEQ ID NO：20)肌红蛋白；来自本氏烟(Nicotianabenthamiana)(SEQ ID NO：21)、枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO：22)、谷氨酸棒杆菌(SEQ ID NO：23)、集胞藻属PCC6803(SEQ ID NO：24)、聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7335(SEQ IDNO：25)、普通念珠藻(Nostoc commune)(SEQ ID NO：26)或巨大芽孢杆菌(SEQ ID NO：27)的血红素蛋白。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以通过以下确定。首先，使用来自含有BLASTP 2.0.14版的BLASTZ的独立版本的BLASTZ的BLAST 2序列(B12seq)程序对氨基酸序列进行比对。此BLASTZ的独立版本可以从斐锐律师事务所的网站(例如，fi.com/blast/)或美国政府国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站(ncbi.nlm.nih.gov)获得。在BLASTZ随附的自述文件中可以找到有关如何使用B12seq程序的说明。B12seq使用BLASTP算法进行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨基酸序列，将B12seq的选项设置如下：将-i设置为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(例如，C:\seq1.txt)；将-j设置为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；将-p设置为blastp；将-o设置为任何期望的文件名(例如，C:\output.txt)；并且使所有其它选项保持处于默认设置。例如，可以使用以下命令来生成含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果所述两个经比较的序列共享同源性，则指定的输出文件将把那些同源区域呈现为经比对的序列。如果所述两个经比较的序列不共享同源性，则指定的输出文件将不呈现经比对的序列。对于核酸序列可以遵循类似程序，除了使用blastn之外。
一旦经过比对，就通过对在两个序列中存在相同氨基酸残基的位置的数量进行计数来确定匹配数。通过将匹配数除以全长多肽氨基酸序列的长度，然后将所得值乘以100来确定同一性百分比。应注意，同一性百分比值被四舍五入至最近的十分之一。例如，78.11、78.12、78.13和78.14被向下四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19被向上四舍五入至78.2。还应注意，长度值将始终是整数。
应当理解，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域众所周知的；即，对于许多氨基酸，存在充当氨基酸的密码子的多于一个核苷酸三联体。例如，可以对给定酶的编码序列中的密码子进行修饰，使得在特定物种(例如，细菌或真菌)中获得最佳表达，使用所述物种的适当密码子偏好表。
在一些实施例中，含血红素的蛋白可以从生产生物体中提取(例如，从动物组织或植物、真菌、藻类或细菌生物质中提取，或者从经分泌的蛋白质的培养上清液中提取)或者从生产生物体的组合(例如，多种植物物种)中提取。豆血红蛋白可容易地以商品豆类作物(例如，大豆、苜蓿或豌豆)的未使用的副产品形式获得。在美国这些作物的根中的豆血红蛋白的量超过在美国消费的所有红肉的肌红蛋白含量。
在一些实施例中，含血红素的蛋白的提取物包含来自源材料(例如，其它动物、植物、真菌、藻类或细菌蛋白)或来自源材料的组合(例如，不同的动物、植物、真菌、藻类或细菌)的一种或多种不含血红素的蛋白。例如，含血红素的蛋白可以是如本文所述的蛋白质组合物的一部分。
在一些实施例中，含血红素的蛋白可以以不是如本文所述的蛋白质组合物的一部分的形式提供在食物产品中。在一些实施例中，含血红素的蛋白可以通过本领域已知的任何方法纯化。
蛋白质可以基于其分子量，例如通过尺寸排阻色谱法、通过膜的超滤或密度离心来分离。在一些实施例中，蛋白质可以基于其表面电荷，例如通过等电沉淀、阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法来分离。蛋白质还可以基于其溶解度，例如通过硫酸铵沉淀、等电沉淀、表面活性剂、洗涤剂或溶剂提取来分离。蛋白质还可以通过其对另一种分子的亲和力，使用例如疏水相互作用色谱法、活性染料或羟基磷灰石来分离。亲和色谱法还可以包含使用对蛋白质(例如，含血红素的蛋白)具有特异性结合亲和力的抗体、对His标记的重组蛋白的镍NTA、与糖蛋白上的糖部分结合的凝集素或与蛋白质特异性结合的其它分子。
还可以使用多肽表达技术(例如，使用细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞(如酵母)、植物细胞(如烟草、大豆或拟南芥)或哺乳动物细胞的异源表达技术)重组产生含血红素的蛋白。在一些情况下，标准多肽合成技术(例如，液相多肽合成技术或固相多肽合成技术)可以用于合成地产生含血红素的蛋白。在一些情况下，体外转录-翻译技术可以用于产生含血红素的蛋白。
在一些实施例中，含血红素的蛋白是如本文所述的总细胞蛋白组合物的一部分。
含血红素的蛋白可以以约0.005％至约5％(含血红素的蛋白wt/食物产品wt)(例如，约0.005％至约0.01％、约0.01％至约0.1％、约0.1％至约0.5％、约0.5％至约1％、约1％至约2％、约2％至约3％、约3％至约4％、约4％至约5％、约1％至约3％、约3％至约5％或约1％至约5％(wt/wt))的量存在于食物产品(例如，乳制复制品、奶酪复制品、蛋复制品、肉复制品、牛肉类食物产品、鸡肉类食物产品、猪肉类食物产品、鱼类食物产品、牛肉食物产品、鸡肉食物产品、猪肉食物产品或鱼食物产品)中。在一些实施例中，含血红素的蛋白可以是非动物含血红素的蛋白。在一些实施例中，含血红素的蛋白可以是藻类、细菌、真菌、植物或古细菌含血红素的蛋白。
血红素可以以约0.00005％至约2％(血红素wt/食物产品wt)(例如，约0.00005％至约0.0001％、约0.0001％至约0.0005％、约0.0005％至约0.001％、约0.001％至约0.005％、约0.005％至约0.01％、约0.01％至约0.05％、约0.05％至约0.1％、约0.1％至约0.5％、约0.5％至约1％、约0.1％至约0.2％、约0.2％至约0.4％、约0.4％至约0.6％、约0.6％至约0.8％、约0.8％至约1％、约1％至约2％、约1.0％至约1.2％、约1.2％至约1.4％、约1.4％至约1.6％、约1.6％至约1.8％或约1.8％至约2.0％(wt/wt))的量存在于食物产品(例如，乳制复制品、奶酪复制品、蛋复制品、肉复制品、牛肉类食物产品、鸡肉类食物产品、猪肉类食物产品、鱼类食物产品、牛肉食物产品、鸡肉食物产品、猪肉食物产品或鱼食物产品)中。
本文所描述的食物产品可以不含或基本上不含一些类型的动物产品(例如，动物含血红素的蛋白，或所有动物产品)。
在一些实施例中，食物产品可以基本上不含大豆、基本上不含小麦、基本上不含酵母、基本上不含MSG、基本上不含蛋白水解产物、不含大豆、不含小麦、不含酵母、不含MSG和/或不含蛋白水解产物，并且可以尝起来有肉味、非常可口并且没有变味或异味。
在一些实施例中，食物产品可以包含一种或多种风味剂前体。合适的风味剂前体包含糖、糖醇、糖衍生物、油(例如，植物油)、游离脂肪酸、α-羟基酸、二羧酸、氨基酸和其衍生物、核苷、核苷酸、维生素、肽、蛋白水解物、提取物、磷脂、卵磷脂和有机分子。表1中提供了此类风味剂前体的非限制性实例。
表1
风味剂前体分子
Figure BDA0004190539340000631
本文所描述的食物产品可以以各种方式包装，包含密封在单独的包装或摇动器中，使得组合物可以在烹饪之前或烹饪期间喷洒或涂抹在食物产品的顶部上。
本文所描述的食物产品可以包含另外的成分，包含食品级油，如芥花油、玉米油、葵花油、大豆油、橄榄油或椰子油；调味剂，如食用盐(例如，氯化钠或氯化钾)或香草(例如，迷迭香、百里香、罗勒属植物、鼠尾草或薄荷)；调味剂；蛋白质(例如，大豆蛋白分离物、小麦明胶蛋白、豌豆球蛋白和/或豌豆豆球蛋白)；蛋白浓缩物(例如，浓缩大豆蛋白)；乳化剂(例如，卵磷脂)、胶凝剂(例如，k-角叉菜胶或明胶)；纤维(例如，竹纤维或菊粉)；或矿物质(例如，碘、锌和/或钙)。
本文所描述的食物产品还可以包含天然着色剂(如姜黄或甜菜汁)或人工着色剂(如偶氮染料、三苯甲烷、呫吨、奎宁、靛蓝、二氧化钛、红色#3、红色#40、蓝色#1或黄色#5)。
本文所描述的食物产品还可以包含肉保质期延长剂，如一氧化碳、亚硝酸盐、焦亚硫酸钠、Bombal、维生素E、迷迭香提取物、绿茶提取物、儿茶素和其它抗氧化剂。
在一些实施例中，包含血红素、风味剂前体或其组合的食物产品在烹饪时可能导致与肉类香味相关联的一种或多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)挥发性化合物的产量增加。在所附附录1中呈现了与肉类香味相关联的挥发性化合物的非限制性实例，所述挥发性化合物中的每种挥发性化合物与肉香味(如牛肉、鸡肉或猪肉的香味)相关联，如所列出的参考文献所支持的。在一些实施例中，烹饪如本文所述的食物产品中的任何食物产品可能导致一种或多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、12种、14种、16种、18种、20种或更多种)选自由以下组成的组的挥发性化合物的产量增加：(E)-2-癸烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯-1-醇、(E)-2-辛烯醛、(E)-3-戊烯-2-酮、(E，E)-2，4-己二烯醛、1-(2-呋喃基)-乙酮、1-(乙酰氧基)-2-丙酮、1-庚醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊烯-3-酮、1-十一烷醇、2，3-二甲基-吡嗪、2，3-己二酮、2，4-二甲基-噻唑、2，5-二甲基-吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙酰基噻唑、2-丁醇、2-丁酮、2-丁烯醛、2-庚酮、2-羟基-苯甲醛、2-甲基-2(E)-丁烯醛、2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基-丁醛、2-甲基-丙醛、2-甲基-噻唑、2-正丁基呋喃、2-戊基-呋喃、2-丙烯醛、2-十一烷酮、3-乙基-吡啶、3-甲基-2-丁烯醛、3-甲基-3-丁烯-2一酮、3-甲基-丁醛、3-甲基-己烷、3-甲基-噻吩、4-戊烯醛、5-甲基-2-噻吩甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙醛、丙酮、苯乙酮、苯甲醛、苯乙醛、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫化物、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、十二醛、E-2-十一烯醛、乙基-吡嗪、呋喃、糠醛、庚醛、己醛、甲硫基丙醛、甲基-环硫乙烷、丙硫醇、吡嗪、吡啶、十四烷、四氢-2H-吡喃-2-酮和三甲基-吡嗪。
本文所描述的食物产品可以包含脂质(也称为脂肪)组分。脂质可以被分离和/或纯化，并且可以呈甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、游离脂肪酸、鞘氨醇(sphingoside)、糖脂、磷脂或油、或此类脂质的集合体(例如，膜、卵磷脂、溶血卵磷脂或在本体水相中含有少量脂质的脂肪滴)的形式。在一些实施例中，脂质来源是从包含经基因工程化的细菌、藻类、古细菌或真菌在内的非动物来源的油(例如，从植物、藻类、真菌(如酵母或丝状真菌)、海藻、细菌或古细菌获得的油)。植物油的非限制性实例包含玉米油、橄榄油、大豆油、花生油、核桃油、杏仁油、芝麻油、棉籽油、油菜籽油、芥花油、红花油、葵花油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、巴巴苏油、乳木果油、芒果脂、可可脂、小麦胚芽油或米糠油；或人造黄油。油可以是氢化的(例如，氢化植物油)或非氢化的。
在一些实施例中，脂质可以是甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、游离脂肪酸、鞘氨醇、糖脂、卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂(如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸)；鞘脂类，如鞘磷脂或神经酰胺；甾醇，如豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜子甾醇、二氢谷甾醇、菜油甾烷醇、麦角甾醇、酵母甾醇、粪甾醇(fecosterol)、甲藻甾醇(dinosterol)、羊毛甾醇、胆固醇或表甾醇；脂质酰胺，如N-棕榈酰脯氨酸、N-硬脂酰甘氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、N-花生四烯酰甘氨酸、N-棕榈酰牛磺酸、N-花生四烯酰组氨酸或大麻素(anandamide)；游离脂肪酸，如棕榈油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、肉豆蔻脑酸、己酸、癸酸、辛酸、壬酸、十一烷酸、亚油酸(C18:2)、二十烷酸(C22:0)、花生四烯酸(C20:4)、二十碳五烯酸(C20:5)、二十二碳五烯酸(C22:5)、二十二碳六烯酸(C22:6)、芥酸(C22:1)、共轭亚油酸、亚麻酸(C18:3)、油酸(C18:1)、反油酸(油酸的反式异构体)、反式异油酸(C18:1反式11)或共轭油酸；或此类脂肪酸的酯，包含此类脂肪酸的单酰甘油酯、二酰甘油酯和三酰甘油酯。
脂质可以包括磷脂、脂质酰胺、甾醇或中性脂质。磷脂可以包括多个两亲性分子，所述两亲性分子包括脂肪酸、甘油和极性基团。在一些实施例中，极性基团是例如胆碱、乙醇胺、丝氨酸、磷酸酯、甘油-3-磷酸酯、肌醇或肌醇磷酸酯。在一些实施例中，脂质是例如鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、醚脂质、缩醛磷脂或聚乙二醇化脂质。
在一些实施例中，脂肪可以以食物产品(例如，肉复制品、牛肉类食物产品、鸡肉类食物产品、猪肉类食物产品、鱼类食物产品、牛肉食物产品、鸡肉食物产品、猪肉食物产品或鱼食物产品)的约0.1重量％至约95重量％(例如，约0.1％至约1％、约1％至约5％、约5％至约10％、约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约95％、约10％至约30％、约30％至约50％、约50％至约70％、约70％至约90％、约0.1％至约20％、约20％至约40％、约40％至约60％、约60％至约80％、约80％至约95％、约0.1％至约33％、约33％至约66％、约66％至约95％、约0.1％至约50％或约50％至约95％)的量存在。
在一些实施例中，脂肪可以以脂肪复制品的形式存在于食物产品中。
食物产品可以包含粘合剂或基于碳水化合物的凝胶。在一些实施例中，基于碳水化合物的凝胶可以包含在粘合剂中。粘合剂可以是食物产品的约2重量％至约10重量％。粘合剂可以包含已经被化学或酶修饰以改善它们的质地和/或风味性质或者改变它们的变性和胶凝温度的一种或多种蛋白质。基于碳水化合物的凝胶可以含有甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、瓜尔胶、刺槐豆胶、黄原胶、琼脂、果胶、角叉菜胶、魔芋、藻酸盐、经化学修饰的琼脂糖或其混合物。粘合剂可以包含卵白蛋白或胶原。
在某些实施例中，本公开提供了用于例如通过确定动物或人类是否可以将消费品与合法上市食物产品(predicate food product)(例如，特定肉)区分来确定消费品有资格作为食物产品的复制品的适合性的方法。确定消费品是否与食物产品(例如，肉)相当的一种方法是a)定义肉的性质，以及b)确定消费品是否具有类似的性质。
可以测试或用于比较或描述食物产品的性质包含机械性质，如硬度、内聚性、脆性、咀嚼性、胶粘性、粘度、弹性和粘附性。可以测试的食物产品的性质还包含几何性质，如粒径和形状，以及颗粒形状和取向。还可以测试颗粒的三维组织。另外的性质可以包含水分含量和脂肪含量。可以使用如以下等术语来描述这些性质：用于描述硬度的“软的”、“坚硬的”或“硬的”；用于描述内聚性的“易碎的”、“松脆的”、“脆性的”、“耐嚼的”、“嫩的”、“坚韧的”、“短的”、“粉状的”、“糊状的”或“黏性的”；用于描述粘度的“稀的”或“粘的”；用于描述弹性的“塑料的”或“弹性的”；用于描述粘附性的“粘性的”、“发粘的”或“胶粘的”；用于描述颗粒形状和大小的“多沙的”、“多粒的”或“粗的”；用于描述颗粒形状和取向的“纤维的”、“细胞的”或“结晶的”；用于描述水分含量的“干的”、“潮湿的”、“湿的”或“含水的”；或者用于描述脂肪含量的“油性”或“油脂性”。因此，在一些实施例中，可以要求一组人根据描述某一参考食物产品(例如，碎牛肉)的性质来对所述参考食物产品进行评级。本文所描述的食物产品可以由相同的人进行评级以确定等效性。
还可以评估本公开的食物产品的风味。可以根据与参考食物的类似性来对风味进行评级，例如，“蛋腥味”、“鱼腥味”、“黄油味”、“巧克力味”、“水果味”、“胡椒味”、“培根味(baconlike)”、“奶油味”、“奶味”或“牛肉味”。可以根据七种基本味道(即，甜味、酸味、苦味、咸味、鲜味(可口的)、辛辣(pungent或piquant)和金属味)来对风味进行评级。可以根据与由化学品(例如，二乙酰(黄油味)、3-羟基-2丁酮(黄油味)、壬-2E-烯醛(脂肪)、1-辛烯-3-醇(蘑菇)、己酸(汗味)、4-羟基-5-甲基呋喃酮(HMF，肉味)、吡嗪(坚果味)、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫化物(烤肉味)、癸酮(霉味/水果味)、乙酸异戊酯(香蕉味)、苯甲醛(苦杏仁味)、肉桂醛(肉桂味)、丙酸乙酯(水果味)、邻氨基苯甲酸甲酯(葡萄味)、柠檬烯(橙味)、癸二烯酸乙酯(梨味)、己酸烯丙酯(菠萝味)、乙基麦芽酚(糖、棉花糖)、乙基香兰素(ethylvanillin)(香草味)、丁酸(腐臭味)、12-甲基十三醛(牛肉味)或水杨酸甲酯(冬青树味))引起的体验的类似性来描述风味。这些评级可以用作参考食物产品的性质的指示。然后可以将本公开的食物产品与参考食物产品进行比较，以确定食物产品与参考食物产品的类似程度。在一些实施例中，然后改变本公开的食物产品的性质，以使本公开的食物产品更类似于参考食物产品。因此，在一些实施例中，根据人类评估，本公开的食物产品被评级为类似于参考食物产品。在一些实施例中，对于人类来说，本公开的食物产品与参考食物产品是无法区分的。
在一些实施例中，被要求鉴定本公开的食物产品的受试者可以将所述食物产品鉴定为参考食物产品的一种形式，或者鉴定为特定参考食物产品，例如，受试者将本公开的食物产品鉴定为肉。例如，在一些实施例中，人类可以将本公开的食物产品鉴定为具有等效于肉的性质。在一些实施例中，根据人类的感知，本公开的食物产品的一种或多种性质等效于肉的对应性质。此类性质包含可以测试的性质。在一些实施例中，人类将本公开的食物产品鉴定为比本领域中发现的任何肉复制品更像肉。
实验可以证明，本公开的食物产品对于消费者而言是可接受的。可以使用一个小组来筛选本文所描述的多种消费品。许多人类小组成员可以对多种食物产品样品进行测试，即，天然肉对本文所描述的食物产品，或肉替代品对本文所描述的可消费组合物。如脂肪含量等变量可以标准化，例如使用瘦肉和肥肉混合物至20％的脂肪。可以使用巴布柯克肉方法(Babcock for meat method)来确定脂肪含量(S.S.Nielson，《食品化学分析导论(Introduction to the Chemical Analysis of Foods)》(波士顿琼斯和巴特利特出版社(Jones&Bartlett Publishers，Boston))，1994)。可以调配根据本文所描述的程序制备的本发明的碎牛肉和食物产品的混合物。
在开放的消费者小组中，可以在红光或白光下向小组成员提供样品(例如，在小间中)。可以给样品分配随机三位数字并且在选票位置中旋转以防止偏置。可以要求小组成员使用从1＝极度不喜欢至9＝极度喜欢，其中中值为5＝既不喜欢也不厌恶的嗜好程度(hedonic scale)评估样品的压痛、多汁性、质地、风味和总体可接受性。可以鼓励小组成员在样品之间用水漱口，并且给予小组成员对每个样品进行评论的机会。
此实验的结果可以表明传统肉与本公开的食物产品之间的显著差异或类似性。
这些结果可以证明，本文所描述的食物产品被判定为可接受地等效于真正的肉制品。另外，这些结果可以证明，与其它可商购获得的肉替代品相比，小组成员更偏爱本文所描述的食物产品。因此，在一些实施例中，本公开提供了类似于传统肉并且比先前已知的肉替代物更像肉的食物产品。
本公开的食物产品还可以具有与食物产品，例如传统肉类似的物理特性。在一个实施例中，用固定直径的钢棒刺穿由本公开的食物产品制成的1英寸厚的结构(例如，肉饼)所需的力与用类似的固定直径的钢棒刺穿1英寸厚的类似食物产品结构(例如，碎牛肉肉饼)所需的力没有显著不同。因此，本公开提供了具有与肉类似的物理强度特性的食物产品。在另一个实施例中，撕裂横截面面积为100mm2的本公开的食物产品的样品所需的力与撕裂以相同方式测量的横截面面积为100mm2的动物组织(肌肉、脂肪或结缔组织)的样品所需的力没有显著不同。可以使用例如TA.XT Plus质地分析仪(泰克特尔技术公司(TextureTechnologies Corp.))来测量力。因此，本公开提供了具有与肉类似的物理强度特性的食物产品。
本文所描述的食物产品可以具有与食物产品(例如，肉)类似的烹饪损失特性。例如，本公开的食物产品可以具有与碎牛肉类似的脂肪和蛋白质含量，并且当烹饪时具有与真正的碎牛肉相同的大小缩减。对于与各种肉相匹配的本文所描述的食物产品的各种组合物，可以获得大小损失概况的类似性。本文所描述的食物产品的烹饪损失特性还可以被设计成优于食物产品。例如，可以生产在烹饪期间具有较少损失但实现与烹饪产品类似的味道和质地的食物产品。实现这一点的一种方法是通过基于本公开的食物产品的熔融温度改变脂质的比例。实现这一点的另一种方法是通过控制蛋白质浓度或通过形成组织复制品的机制来改变食物产品的蛋白质组成。
在一些实施例中，基于嗅觉计读数，将本公开的食物产品与参考食物产品(例如，基于动物的食物产品(例如，肉))进行比较。在一些实施例中，嗅觉计可以用于评估气味浓度和气味阈值、或与参考气体相比的气味超阈值、用于确定欣赏程度的嗜好程度分数或气味的相对强度。在一些实施例中，嗅觉计允许专家小组的训练和自动评估。因此，在一些实施例中，本公开的食物产品是引起与参考食物产品具有类似或相同的嗅觉计读数的食物产品。在一些实施例中，差异足够小以低于人类感知的检测阈值。
气相色谱-质谱法(GCMS)是一种将气相色谱法和质谱法的特征组合以分离和鉴定测试样品内的不同物质的方法。在一些实施例中，GCMS可以用于评估本公开的食物产品的性质。例如，可以从肉周围的顶部空间中隔离挥发性化学品。可以使用GCMS鉴定这些化学品。由此可以产生肉周围的顶部空间中的挥发性化学品的概况。在一些实施例中，可以进一步评估GCMS的每个峰。例如，人类可以对闻到导致某一特定峰的化学品的体验进行评级。此信息可以用于进一步细化概况。GCMS然后可以用于评估消费品的性质。GCMS概况可以用于细化消费品。
特征风味和香味组分大部分都是在烹饪过程期间通过化学反应分子(包含在植物以及肉中发现的氨基酸、脂肪和糖)而产生的。因此，在一些实施例中，测试本公开的食物产品在烹饪期间或之后与肉的类似性。在一些实施例中，使用人类评级、人类评估、嗅觉计读数或GCMS测量结果或其组合来创建参考食物产品(例如，经烹饪的肉)的嗅觉图。类似地，可以创建本公开的食物产品(例如，肉复制品)的嗅觉图。可以比较这些图，以评估经烹饪的消费品与肉的类似程度。在一些实施例中，本公开的食物产品在烹饪期间或之后的嗅觉图与经烹饪的或正在烹饪的肉的嗅觉图类似或无法区分。在一些实施例中，类似性足以超过人类感知的检测阈值。在一些实施例中，可以产生本公开的食物产品，使得所述食物产品的特性类似于烹饪后的参考食物产品，但本公开的未烹饪食物产品可以具有不同于烹饪之前的参考食物产品的性质。
在一些实施例中，食物产品可以是乳制复制品(也称为非乳制产品)。
在一方面，本公开提供了可以用作用于制备非乳制奶酪的起始材料的非乳制奶酪来源。术语“非乳制奶酪来源”是指包括蛋白质(例如，包含如本文所述的蛋白质组合物、可商购获得的蛋白质或通过本领域已知的任何方法纯化的蛋白质或其组合)和脂肪的乳液，其中所述蛋白质和脂肪是由非乳制来源制备的。
在一些实施例中，非乳制奶酪来源可以是奶复制品(也称为非乳制奶)。在一些实施例中，奶复制品可以用于制备奶酪复制品(也称为非乳制奶酪)。
在一些实施例中，非乳制奶是包括一种或多种蛋白质(例如，如本文所述的蛋白质组合物、可商购获得的蛋白质、通过本领域已知的任何方法纯化的蛋白质或其组合)和一种或多种脂肪的乳液。在一些实施例中，蛋白质含有在蛋白质溶液中。溶液可以包括EDTA(0-0.1M)、NaCl(0-1M)、KCl(0-1M)、NaSO4(0-0.2M)、磷酸钾(0-1M)、柠檬酸钠(0-1M)、碳酸钠(0-1M)、蔗糖(0-50％)、尿素(0-2M)或其任何组合。溶液的pH可以为3至11。在一些实施例中，所述一种或多种蛋白质占所述蛋白质溶液的蛋白质含量的0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。在一些实施例中，所述一种或多种蛋白质占所述蛋白质溶液的蛋白质含量的0.1-5％、1-10％、5-20％、10-40％、30-60％、40-80％、50-90％、60-95％或70-100％。在一些实施例中，蛋白质溶液的总蛋白质含量为约0.1重量/体积％、0.2重量/体积％、0.3重量/体积％、0.4重量/体积％、0.5重量/体积％、0.75重量/体积％、1重量/体积％、1.5重量/体积％、2重量/体积％、5重量/体积％、7.5重量/体积％、10重量/体积％、12.5重量/体积％、15重量/体积％、17.5重量/体积％、20重量/体积％或超过20％。在一些实施例中，蛋白质溶液的总蛋白质含量为0.1-5重量/体积％、1-10重量/体积％、5-20重量/体积％或超过20重量/体积％。
在一些实施例中，使用本领域已知的任何方法对蛋白质进行浓缩。可以将蛋白质浓缩2倍、五倍、10倍或至多100倍。可以将蛋白质浓缩至0.001-1％、0.05-2％、0.1-5％、1-10％、2-15％、4-20％或超过20％的最终浓度。示例性方法包含例如超滤(或切向流过滤)、冻干、喷雾干燥或薄膜蒸发。
在一些实施例中，用于制备乳液的脂肪可以来自各种来源。在一些实施例中，来源可以是从包含经基因工程化的细菌、藻类、古细菌或真菌在内的非动物来源(例如，从植物、藻类、真菌(如酵母或丝状真菌)、海藻、细菌、古细菌获得的油)。油可以是氢化的(例如，氢化植物油)或非氢化的。植物油的非限制性实例包含玉米油、橄榄油、大豆油、花生油、核桃油、杏仁油、芝麻油、棉籽油、油菜籽油、芥花油、红花油、葵花油、亚麻籽油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、巴巴苏油、乳木果油、芒果脂、可可脂、小麦胚芽油或米糠油；或人造黄油。
在一些实施例中，脂肪可以是甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、鞘氨醇、糖脂、卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂(如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸)；鞘脂类，如鞘磷脂或神经酰胺；甾醇，如豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜子甾醇、二氢谷甾醇、菜油甾烷醇、麦角甾醇、酵母甾醇、粪甾醇、甲藻甾醇、羊毛甾醇、胆固醇或表甾醇；游离脂肪酸，如棕榈油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、肉豆蔻脑酸、己酸、癸酸、辛酸、壬酸、十一烷酸、亚油酸(C18:2)、二十烷酸(C22:0)、花生四烯酸(C20:4)、二十碳五烯酸(C20:5)、二十二碳五烯酸(C22:5)、二十二碳六烯酸(C22:6)、芥酸(C22:1)、共轭亚油酸、亚麻酸(C18:3)、油酸(C18:1)、反油酸(油酸的反式异构体)、反式异油酸(C18:1反式11)或共轭油酸；或此类脂肪酸的酯，包含此类脂肪酸的单酰甘油酯、二酰甘油酯和三酰甘油酯。
脂肪可以包括磷脂、甾醇或脂质。磷脂可以包括多个两亲性分子，所述两亲性分子包括脂肪酸(例如，参见上文)、甘油和极性基团。在一些实施例中，极性基团是例如胆碱、乙醇胺、丝氨酸、磷酸酯、甘油-3-磷酸酯、肌醇或肌醇磷酸酯。在一些实施例中，脂质是例如鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、醚脂质、缩醛磷脂或聚乙二醇化脂质。
在一些实施例中，通过以下步骤制备乳液：制备包括所述一种或多种蛋白质的溶液，将所述溶液与一种或多种脂肪混合，由此产生所述乳液。蛋白质溶液与脂肪的比率可以为约1∶10、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1或10∶1。蛋白质溶液与脂肪的比率可以为约10∶1-1∶2、1∶4-2∶1、1∶1-4∶1或2∶1-10∶1。乳液可以用作用于制备非乳制奶酪的非乳制奶。仅通过举例的方式，可以将0重量/重量或重量/体积％-50重量/重量或重量/体积％的脂肪添加到蛋白质溶液中。
风味化合物可以由用于生产本文所描述的许多不同的非乳制产品(包含奶酪复制品)的非动物源性材料中的微生物产生。调味方法通常包含使非乳制奶或蛋白质溶液与一种或多种微生物接触，并且由该非乳制奶制备经培养的非乳制产品。如细菌、酵母或霉菌等微生物可以用于产生具有期望的风味概况的产品或可以用作产品中的风味的组分，因为细菌可以在中性、植物性或豆类产品中产生令人期望的风味(例如，黄油味、奶油味、奶味或奶酪味)。
本文描述了示例性非乳制奶。任何非乳制奶酪奶或其组合可以与一种或多种微生物(例如，受控量的细菌)接触，以控制所得经培养的非乳制产品(如奶酪复制品)的风味。在一些实施例中，微生物可以选自细菌、酵母或霉菌。在一些实施例中，细菌可以包括嗜中温细菌和/或嗜热细菌。在一些实施例中，细菌可以包括来自商业起始物的细菌。本文描述了示例性商业起始物。
复制品中的风味产生可以通过使用一种或多种微生物(例如，一种或多种细菌、酵母或霉菌)来控制，包含但不限于复制品中的风味产生可以通过使用一种或多种微生物(例如，一种或多种细菌、酵母或霉菌)来控制，包含但不限于乳球菌属(Lactococcus)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis lactis，LLL，单独使用或作为商业混合物MA11的组分)、乳酸乳球菌乳脂(Lactococcus lactis cremoris，LLC，单独使用或作为商业混合物MA11的组分)或乳酸乳球菌乳丁二酮变种(Lactococcus lactis biovar diacetylactis，LLBD，通常用作商业培养基MD88)；乳杆菌属(Lactobacillus)，如德氏乳杆菌乳(Lactobacillusdelbrueckii lactis)、德氏保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；明串珠菌属(Leuconostocaceae)，如肠膜明串珠菌乳脂(Leuconostoc mesenteroides cremoris，LM)；链球菌属(Streptococcus)，如嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles，ST，通常用作商业培养基TA61)；片球菌属(Pediococcus)，如戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)；梭菌属(Clostridium)，如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)；葡萄球菌属(Staphylococcus)，如木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus，SX)；短杆菌属(Brevibacterium)，如亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)；丙酸杆菌属(Propioniibacteria)；青霉菌属(Penicillium)，如白青霉(Penicillium candidum)、卡门柏青霉(Penicillium camemberti)或娄地青霉(Penicillium roqueforti)；德巴利酵母属(Debaryomyces)，如汉森德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；地丝菌属(Geotrichum)，如白地霉(Geotrichum candidum)；棒状杆菌属(Corynebacteria)；轮枝孢属(Verticillium)，如蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)；克鲁维酵母属，如乳酸克鲁维酵母；酵母属(Saccharomyces)，如酿酒酵母；假丝酵母属，如杰佛假丝酵母(Candidajefer)或产朊假丝酵母(Candida utilis)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，如隐红冬孢酵母(Rhodosporidium infirmominiatum)；微球菌属(Micrococcus)；盐单胞菌属(Halomonas)；嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。在一些实施例中，使用乳酸菌，如乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、乳球菌属或链球菌属。在一些实施例中，细菌不包括嗜酸乳杆菌(Lactobacciliusacidophilus)菌株。在一些实施例中，可以使用酵母，如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和/或汉森德巴利酵母。在一些实施例中，霉菌可以是白青霉、卡门柏青霉、娄地青霉、白地霉或其组合。
在一些实施例中，使用以下微生物中的一种或多种：戊糖片球菌、丁酸梭菌、德氏乳杆菌乳、德氏保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、木糖葡萄球菌和亚麻短杆菌。
在一些实施例中，非乳制奶酪来源可以与一种或多种微生物(例如，单独的细菌、酵母或霉菌)一起培养，或者与两种或更多种微生物(例如，两种不同的细菌、两种不同的酵母、两种不同的霉菌、细菌和酵母、细菌和霉菌或酵母和霉菌)组合培养。当使用两种或更多种微生物时，可以共培养或顺序培养微生物，即，在添加另一种微生物之前，可以将一种微生物培养一段时间。在复制品中产生风味的特别好的组合是用SX预培养，随后用TA61或MD88预培养，或MD88与MA11共培养。
微生物的生长条件还可以控制复制品中的风味产生。范围为4℃至45℃的微生物生长温度可以控制复制品中产生的风味化合物的量和类型。通过摇动的通气量(例如，0rpm至300rpm)可以改变许多不同细菌在非乳制培养基中的风味产生。在通过SX、TA61或MD88进行培养期间更大的通气可以产生更多期望的奶酪和黄油状化合物。通气还可以减少一些不期望的风味化合物。当用通气培养SX、MD88或TA61时，如2-庚酮等期望的奶酪化合物可能有所增加。还可以通过通气调节奶酪复制品中MD88的己酸甲酯的产生。在豆奶中培养期间SX的通气的增加可以使3-甲基和2-甲基丁酸的产生增加，并且可以减少奶酪复制品中不令人期望的香味化合物(如2-乙基呋喃或2-戊基呋喃)的量。
培养一种或多种微生物的时间量也可以调节风味化合物的量和类型。在一些实施例中，培养的范围可以为1小时至多天。在一些实施例中，将一种或多种微生物和非乳制奶一起温育，持续范围为1-60分钟、0.5-5小时、3-10小时、6-15小时、10-20小时或超过20小时的时间长度。在一些实施例中，大多数黄油状化合物在前10小时内产生，而另外的奶酪化合物可以在24-48小时或更多小时内形成。MD88和MA11可以仅在豆奶中培养20小时之后在非乳制培养基(例如，非乳制奶酪来源或奶复制品)中产生丁内酯(一种奶油状的乳白色的基本口味化合物)。
在一些实施例中，所述一种或多种微生物还可以以不同的接种物添加，例如，102-109cfu/mL或甚至更大。细菌培养物的生长期(即，稳定期对指数期)和细胞密度可能影响培养基的风味化合物概况。起始物培养物的较高接种物可以保护复制品免受不想要的微生物污染(例如，细菌污染)。因此，通常使用106-109cfu/mL的接种物。
所述一种或多种微生物的风味产生也可以通过指导代谢途径，例如通过调节所述一种或多种微生物的氮源、碳源、另外的可用营养素和生长条件来调节。
在一些实施例中，将所述一种或多种微生物、非乳制奶酪来源和可以用于改变风味的一种或多种任选组分(例如，糖、脂肪、碳水化合物、维生素、有机酸、核苷酸或食物产品)一起温育足够的时间，以达到期望的pH值。pH的范围可以为pH 3-5、4-6或4.3-5.7。期望的pH可以为pH 6或更低、pH 5或更低、或者pH 4或更低。在一些情况下，通过细菌培养材料会使pH降低至6.5、6、5.5、5、4.5、4或3.5，而在其它情况下，产生风味而不改变pH。用乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属和/或链球菌属进行培养通常导致大多数起始材料的pH降低，而用葡萄球菌属、短杆菌属和/或梭菌属进行培养通常对pH几乎没有或没有影响。
在一些实施例中，一种或多种酶可以单独使用或与所描述的用于帮助调节风味、质地和/或熔化特性的任一种培养方法和添加剂组合使用，所述培养方法包括使非乳制奶酪来源与一种或多种酶接触。在一些实施例中，所述一种或多种酶可以在固化之前、固化之后但在排出乳清之前或在排出乳清之后添加。令人惊讶的是，添加痕量的一种或多种酶(例如，蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶)可以增强所得非乳制奶酪复制品的质地、风味和/或可熔性，如通过盲味测试或通过例如GCMS检测挥发性气味物所确定的。使用此类酶还可能影响微生物培养物的风味产生(例如，当用淀粉酶预处理豆奶时，TA61会产生更多的二乙酰)。
在一些实施例中，所述酶是天冬氨酸蛋白酶。
在具体实施例中，所述蛋白酶是木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、AO蛋白酶、无花果蛋白酶(ficin)、凝乳酶、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的XXI型蛋白酶、来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶、来自米曲霉的蛋白酶、来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko)、枯草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)、X型蛋白酶或XIII型真菌蛋白酶。
在一些实施例中，所述酶是脂肪酶。
按重量或体积计，所添加的酶可以占非乳制奶酪来源的0.00001重量或体积％-0.005重量或体积％、0.001重量或体积％-0.01重量或体积％、0.01重量或体积％-0.1重量或体积％、0.05重量或体积％-1重量或体积％、0.1重量或体积％-2重量或体积％或0.5重量或体积％-5重量或体积％。在一些实施例中，所添加的酶可以占非乳制奶酪来源的0.00001重量或体积％-0.1重量或体积％。
在一些实施例中，所述蛋白酶是木瓜蛋白酶。在一些实施例中，将0.001-0.01％的木瓜蛋白酶添加到非乳制奶酪来源中。在一些实施例中，通过加热/冷却方法来使具有所添加的蛋白酶的蛋白质溶液固化。在一些实施例中，添加木瓜蛋白酶改善了所得奶酪复制品的柔软度和乳脂性。
方法可以包括将一种或多种脂肪添加到非乳制奶酪来源中以产生乳液。
仅通过举例的方式，一些非乳制奶酪复制品可以通过以下制备：将0％-50％的脂肪添加到非乳制奶酪来源中以产生乳液，然后通过蛋白质变性(例如，通过加热)来使所述乳液固化。在一些实施例中，在固化之前或在固化之后添加一种或多种脂肪。在一些实施例中，在固化之后并且在排出乳清之后添加所述一种或多种脂肪。仅通过其它举例的方式，由蛋白质变性制成的一些奶酪复制品具有在通过变性固化之后添加的0％至50％的脂肪，或者在排出乳清之后添加的0％至50％的脂肪。在一些实施例中，在通过蛋白质变性或交联形成凝胶之后，乳清可以被排出以增加奶酪复制品中的总脂肪，进一步排出和老化奶酪可以减少水分含量以增加奶酪复制品的总脂肪。
在一些实施例中，向酶交联凝胶中添加5-20％的不饱和脂肪可以增加凝胶的硬度。
在一些实施例中，添加5％-50％的饱和脂肪可以增加奶酪复制品的硬度。
在另一方面，本公开提供了奶酪复制品和其制备方法。在一些实施例中，所述方法包括使非乳制奶酪来源(例如，非乳制奶)(例如，通过形成凝胶)固化。在一些实施例中，非乳制奶能够在所述固化之后保持形状。存在可以固化非乳制奶酪来源的许多方式，包含使用酶、热变性、形成冷凝胶、形成凝聚层、液体分离、酸、离子强度变化、高压处理、溶剂、离液剂或二硫键还原剂，如本章节中所描述的。
酶(或化学品)可以用于交联非动物(例如，基于植物的)蛋白质或非乳制奶酪来源，具有或不具有乳化脂肪或油、糖和培养物。所得交联奶酪复制品可以添加或不添加细菌培养物，并且添加的时间可以在交联步骤之前或之后。在一些实施例中，固化涉及交联非乳制奶酪来源中的组分(例如，多肽，在本文中也称为蛋白质)的过程。在一些实施例中，交联包括使非乳制奶酪来源与交联酶接触，由此在多肽链之间产生交联。在一些实施例中，交联酶可以是转谷氨酰胺酶、酪氨酸酶、脂肪氧合酶、蛋白质二硫键还原酶、蛋白质二硫键异构酶、巯基氧化酶、过氧化物酶、己糖氧化酶、赖氨酰氧化酶或胺氧化酶。
在一些实施例中，所述交联酶是转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶是催化在游离胺与谷氨酰胺的γ羧基之间形成共价键，由此将蛋白质连接在一起的酶家族。例如，转谷氨酰胺酶催化例如蛋白质或肽中的赖氨酸以及蛋白质谷氨酰胺残基或肽谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团的交联。由转谷氨酰胺酶形成的共价键可以表现出对蛋白水解降解的高抗性。
可以在本发明的各个实施例中使用许多类型的转谷氨酰胺酶。用于交联的可接受的转谷氨酰胺酶包含但不限于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)转谷氨酰胺酶(一种类似于来自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的酶)；其它微生物转谷氨酰胺酶；由经基因工程化的细菌、真菌或藻类产生的转谷氨酰胺酶；因子XIII(纤维蛋白稳定因子)；角化细胞转谷氨酰胺酶(TGM1)；组织转谷氨酰胺酶(TGM2)；表皮转谷氨酰胺酶(TGM3)；前列腺转谷氨酰胺酶(TGM4)；TGM X(TGM5)；TGM Y(TGM6)；TGM Z(TGM7)；或赖氨酰氧化酶。
添加培养物的时间、培养物的类型和培养物的量可以改变乳液的pH，并且因此改变转谷氨酰胺酶的活性和奶酪的最终质地。另外，通过添加酸或碱来改变溶液的pH以及乳液的总体缓冲能力可以改变奶酪复制品的交联能力和最终质地。
在一些实施例中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括非乳制奶和茂原链轮丝菌转谷氨酰胺酶(一种类似于来自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的酶)；其它微生物转谷氨酰胺酶；由经基因工程化的细菌、真菌或藻类产生的转谷氨酰胺酶；因子XIII(纤维蛋白稳定因子)；角化细胞转谷氨酰胺酶(TGM1)；组织转谷氨酰胺酶(TGM2)；表皮转谷氨酰胺酶(TGM3)；前列腺转谷氨酰胺酶(TGM4)；TGM X(TGM5)；TGM Y(TGM6)和/或TGM Z(TGM7)。在一些实施例中，用于交联的酶不是因子XIII(纤维蛋白稳定因子)、角化细胞转谷氨酰胺酶(TGM1)、组织转谷氨酰胺酶(TGM2)、表皮转谷氨酰胺酶(TGM3)、前列腺转谷氨酰胺酶(TGM4)、TGM X(TGM5)、TGM Y(TGM6)、TGM Z(TGM7)或赖氨酰氧化酶。
转谷氨酰胺酶可以通过茂原链轮丝菌发酵以商业量生产或从动物组织中提取。另外，本公开的转谷氨酰胺酶(TGM)可以从细菌或真菌中分离，从合成或克隆的基因在细菌或真菌中表达。在一些特定实施例中，转谷氨酰胺酶从商业来源获得，例如，以来自味之素食品成分有限责任公司(Ajinomoto Food Ingredients LLC)的ActivaTM的形式获得。
在一些实施例中，转谷氨酰胺酶以0.0000001-0.001重量/体积％、0.0001-0.1重量/体积％、0.001-0.05重量/体积％、0.1-2重量/体积％、0.5-4重量/体积％或大于4重量/体积％的量添加。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶以大于0.1％且至多10％的量添加。
在一些实施例中，通过转谷氨酰胺酶的交联可以在范围为10-30℃、20-60℃、30-70℃或50-100℃的温度下进行。转谷氨酰胺酶交联可以发生10分钟-24小时。
在一些实施例中，每1mL非乳制奶添加介于0.1单位(U)与20U的转谷氨酰胺酶。在一些实施例中，每1mL非乳制奶添加约0.1U、0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、5U、7U、10U、15U或20U的转谷氨酰胺酶。在一些实施例中，在添加转谷氨酰胺酶之后，例如在100°F的水浴中进行加热温育。所述加热温育可以在针对酶功能优化的温度下进行。在一些实施例中，所述温度为约65°F、70°F、75°F、80°F、85°F、90°F、95°F、100°F、105°F、110°F、115°F、120°F或125°F。在一些实施例中，酶交联不包括使非乳制奶酪来源与谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶接触。转谷氨酰胺酶交联已经在室温和至多65℃下进行10分钟至24小时。
在一些实施例中，固化包括诱导蛋白质变性。在一些实施例中，通过加热混合物，随后冷却混合物来诱导变性。在一些实施例中，通过将混合物加热至介于30-35℃、32-40℃、37-45℃、40-50℃、45-55℃、50-60℃、55-65℃、60-70℃、65-75℃、70-80℃、75-85℃、80-95℃、90-100℃之间的温度或高于100℃来诱导变性。在一些实施例中，通过将混合物加热约10-20秒、15-30秒、25-40秒、30-50秒、40-70秒或约1-3分钟、2-5分钟、3-8分钟或5-20分钟来诱导变性。在一些实施例中，允许混合物在加热后冷却。例如，优选地浓度＞1％的蛋白质(例如，如本文所公开的蛋白质组合物、可商购获得的蛋白质、通过本领域已知的任何方法纯化的蛋白质、经纯化或经分级的植物蛋白质，如来自豌豆、月豆、大豆、RuBisCO或其组合的蛋白质)可以以0.1-60％的浓度与油(如芥花油、葵花油、棕榈油或来自种子如葵花的油体)均质化。可以使乳液经受加热-冷却循环，其中将乳液加热至45-100℃的温度持续5-60分钟，并且然后冷却至低于30℃(例如，20-25℃)。可以将所得凝胶在≤30℃的温度下温育，优选地持续2-16小时，并且然后通过粗棉布排出。经排出的凝乳准备好通过加热或压制进一步成形和老化或加工。
酸、离子强度变化、高压处理、溶剂、离液剂或二硫键还原剂可以用于使非乳制奶酪来源中的蛋白质变性。在一些实施例中，将尿素添加到非乳制奶酪来源中，以形成凝乳。
在一些实施例中，固化导致形成固体凝乳和乳清(在形成凝乳后留下的所得液体)。在一些实施例中，凝乳从乳清中分离。
在一些实施例中，固化包括两种或更多种方法的组合。例如，固化可以包含使蛋白质交联和通过加热随后冷却而变性。例如，冷定型凝胶可以与转谷氨酰胺酶交联以产生更坚硬的凝胶，或者与其它蛋白质(如大豆、豌豆-豆蛋白、豌豆-白蛋白、来自鹰嘴豆和小扁豆的粗蛋白部分或材料(例如，脂肪或豌豆蛋白凝聚层))组合以增加硬度和/或可熔性。
在另一方面，本公开提供了用于调味经培养的非乳制产品的方法，所述非乳制产品包含酸奶油、鲜奶油、酸奶或奶酪复制品。在一些实施例中，所述方法包括将具有本文所描述的一种或多种风味添加剂和/或一种或多种单独的微生物菌株的测试非乳制产品的风味注释概况与不具有添加剂和/或单独的微生物菌株的对照非乳制产品的风味注释概况进行比较。非乳制产品(例如，奶酪复制品)的质地和风味概况可以通过本领域已知的或本文所描述的任何方法来确定。确定风味和质地的示例性方法可以通过味道测试进行，例如，盲味测试，或使用气相色谱-质谱法(GCMS)。
GCMS是一种将气相色谱法和质谱法的特征组合以鉴定测试样品内的不同物质的方法。在一些实施例中，GCMS可以用于评估乳制奶酪和奶酪复制品的性质。例如，可以从乳制奶酪或奶酪复制品周围的顶部空间检测挥发性化学品。可以使用GCMS鉴定这些化学品。由此产生奶酪周围的顶部空间中的挥发性化学品的概况。在一些实施例中，可以进一步评估GCMS的每个峰。例如，人类可以对闻到导致某一特定峰的化学品的体验进行评级。此信息可以用于进一步细化概况。GCMS然后可以用于评估奶酪复制品的性质。GCMS可以用于细化奶酪复制品。在一些实施例中，奶酪复制品的GCMS概况类似于乳制奶酪的GCMS概况。在一些实施例中，奶酪复制品的GCMS概况与乳制奶酪的GCMS概况相同。
乳制复制品的风味概况可以通过一种或多种风味注释的存在和/或强度来表征。示例性风味注释包含但不限于黄油味、水果味、坚果味、乳制品味、奶味、奶酪味、脂肪味、水果味、菠萝味、蜡质、黄油味、零陵香豆味、黑皮水果味、柑橘味、酸味、香蕉味、甜味、苦味、霉味、似花的、似山羊的(goaty)、汗味、木质味、土味、蘑菇味、麦芽味、辣味、梨味、绿色味、香油味、辛辣味、油性味、玫瑰味、脂肪味、奶油糖果味、橙子味、松木味、康乃馨味、甜瓜味、菠萝味、香草味、大蒜味、草本味、木质味、肉桂味、芸香味、酸奶味、桃味、香草味、山楂味和草本味。风味注释可能与一种或多种挥发性化合物的释放相关联。风味概况可以通过一种或多种风味注释的不存在或强度降低来表征。示例性风味注释包含：植物味、豆味、大豆味、绿色味、蔬菜味、坚果味、脏味和酸味。
示例性挥发性化合物包含例如γ-壬内酯、γ-十一碳内酯、γ-癸内酯、δ-十四内酯、S-甲硫醇丙酸酯、δ-十三内酯、δ-十四内酯、δ-十四内酯、丁酰乳酸丁酯、2，3-己二酮、己酸甲酯、丁内酯、丙酸、2-甲基丙酸、甲基异丁基酮、γ-辛内酯、δ-辛内酯、γ-壬内酯、5-羟基-4-辛酮、2-乙基-1-己醇、辛烷、乙醇、2，3-丁二酮、2-庚酮、1-丁醇、乙偶姻、丁酸、壬醛、乙酸、1，3丁二醇、甲基-3-丁烯-1-醇、甲醇、己醇、二甲基-苯、乙基-苯、吲哚、柠檬烯、甲苯、苯乙酮、戊-2，3-二酮、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、丙酮、丁酮、2-甲基丙酸、丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、4-甲基戊酸、己酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、丙-2-醇、丁-2-醇、戊-2-醇、己-2-醇、庚-2-醇、壬-2-醇、十一烷-2-醇、辛烯-3-醇、辛-1，5-二烯-3-醇、3-甲基-2-环己烯醇、2-甲基丙醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、3-甲基戊醇、苯基甲醇、2-苯基乙醇、2-苯基-乙-2-醇、丙-2-酮、丁-2-酮、戊-2-酮、己-2-酮、庚-2-酮、辛-2-酮、壬-2-酮、癸-2-酮、十四-2-酮、十二烷-2-酮、十三烷-2-酮、十五-2-酮、戊-3-酮、辛-3-酮、3-甲基戊-2一酮、4-甲基戊-2-酮、甲基己-2-酮、羟基丙-2-酮、庚-5-烯-2-酮、4-甲基戊-3-烯-2-酮、辛烯-3-酮、辛-1，5-二烯-3-酮、壬烯-2-酮、十一碳烯-2-酮、甲基呋喃酮、苯基丙-2-酮、苯丙酮、丁酸甲酯、己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、十四烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、肉桂酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯、十四烷酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸丙酯、甲酸丁酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、甲酸异戊酯、乙酸异戊酯、丙酸异戊酯、丁酸异戊酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、2-乙酸苯乙酯、2-丙酸苯乙酯、2-丁酸苯乙酯、3-甲硫基丙醇、甲硫醇、硫化氢、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚、甲基乙基二硫醚、二乙基二硫醚、2，4-二硫代戊烷、甲硫基丙醛、3-甲硫基-2，4-二硫代戊烷、2，4，5-三硫代己烷、1，1-双-甲基硫基二硫醚、甲硫醇乙酸酯、硫代丙酸甲酯、硫代苯甲酸甲酯、噻吩-2-醛、甲基吲哚、对乙基苯酚、对甲酚、乙醛、丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、己醛、庚醛、壬醛、2-甲基丁烯-2-醛、苯甲醛、3-甲基庚乙酸酯、1-丁醇、1-丁醇、3-甲基、1-庚醇、甲酸、1-己醇-2，乙基、1-辛醇、2-丁酮、2-庚烯-1-醇、2-己酮、庚醛、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、2-戊酮、2，3-丁二酮、3-丁烯-1-醇、5-庚烯-2-酮、辛烷、乙醇、2，3-丁二酮、2-庚酮、1-丁醇、丁酸、壬醛、乙酸、1，3丁二醇、甲基-3-丁烯苯乙醇、甲苯、1-戊醇、3-辛烯-1-醇、2-辛烯-1-醇、2-十一烷酮、1-辛醇、苯甲醛、1-庚醇、2-庚酮、4-甲基-2-壬酮、2-甲基-2-壬醇、1-己醇、2-甲基-2-丙醇、乙醇、3甲基-1-丁醇、1-己醇、2-甲基-2-壬醇、2-壬酮、2-庚酮、4-甲基、1-庚醇、1-辛醇、2-辛烯-1-醇、3-辛烯-1-醇、1-辛醇、1-庚醇、2-庚酮、4-甲基-2-壬酮、2-十二烷醇、2-十二烷酮、3-癸烯1-醇乙酸酯、苯甲醇、苯乙醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-癸烯1-醇乙酸酯、2-十二烷酮、2-十二烷醇或2-甲氧基-4-乙烯基苯酚。
在一些实施例中，改良的风味是由于挥发性风味化合物的水平降低而产生的，例如，1-己醇；2-丁基呋喃；2-甲基-2-戊烯醛；3-辛酮；乙酸乙酯；2-乙基-呋喃；2-戊基-呋喃；吡嗪；1-癸醇；苯乙酮；1-壬醇；2，5-二甲基-吡嗪；十二醛；苯乙醛；壬醛；丁内酯；辛醛；2-癸酮；己醛；2-壬酮；苯甲醛；庚醛；2-辛酮；糠醛；2-庚酮；戊醛；3-甲基丁醛；3-甲基丁酸。
在一些实施例中，所述方法进一步包括通过在制备复制品的过程的任何时间点向非乳制e来源受控添加本文所描述的风味添加剂的限定组合，制备具有受控风味概况的经培养的非乳制产品，如奶酪复制品、酸奶、酸奶油或鲜奶油。本文描述了示例性添加剂和特定组合。
示例性实施例
实施例1是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得经过滤的裂解物；
d)对所述经过滤的裂解物进行浓缩，以获得蛋白质组合物；以及
e)任选地对蛋白质的所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例2是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)对所述经澄清的裂解物进行浓缩，以获得蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例3是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例4是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)使用微滤对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得第一经过滤的裂解物；
d)使用渗滤对所述第一经过滤的裂解物进行过滤，以获得第二经过滤的裂解物；
e)使用超滤对所述第二经过滤的裂解物进行过滤，以获得第三经过滤的裂解物；
f)使用渗滤对所述第三经过滤的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
g)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物；
其中步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例5是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)使用微滤对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得第一经过滤的裂解物；
d)使用渗滤对所述第一经过滤的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)、d)和e)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例6是根据实施例1至5中任一项所述的方法，其中过滤包括微滤。
实施例7是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中过滤包括超滤。
实施例8是根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中过滤包括渗滤。
实施例9是根据实施例8所述的方法，其中对至少两个渗滤体积进行渗滤。
实施例10是根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括微生物细胞。
实施例11是根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括真菌细胞。
实施例12是根据实施例11所述的方法，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、克鲁维酵母属、亚罗酵母属和镰孢属细胞。
实施例13是根据实施例11所述的方法，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母和镰孢霉。
实施例14是根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括细菌细胞。
实施例15是根据实施例14所述的方法，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、乳杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属和甲烷球菌属。
实施例16是根据实施例14所述的方法，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌、荧光假单胞菌和海沼甲烷球菌。
实施例17是根据实施例1至16中任一项所述的方法，其中所述多个细胞的所述水性悬浮液包括约2％至约25％的干固体。
实施例18是根据实施例1至17中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤a)之前，在介于约8.5与约12.0之间的pH下洗涤所述多个细胞的所述水性悬浮液。
实施例19是根据实施例1至18中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约4℃与约15℃之间的温度下进行的。
实施例20是根据实施例1至19中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是以生物化学方式进行的。
实施例21是根据实施例1至20中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是以化学方式进行的。
实施例22是根据实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是以机械方式进行的。
实施例23是根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约9.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例24是根据实施例22所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约9.0与约10.0之间的pH下进行的。
实施例25是根据实施例22所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约10.0与约11.0之间的pH下进行的。
实施例26是根据实施例22所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约11.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例27是根据实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述澄清步骤是任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，在介于约9.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例28是根据实施例27所述的方法，其中所述澄清步骤是在介于约9.0与约10.0之间的pH下进行的。
实施例29是根据实施例27所述的方法，其中所述澄清步骤是在介于约10.0与约11.0之间的pH下进行的。
实施例30是根据实施例27所述的方法，其中所述澄清步骤是在介于约11.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例31是根据实施例1至30中任一项所述的方法，其中澄清步骤是通过离心至少于约20％的干固体来进行的。
实施例32是根据实施例1至31中任一项所述的方法，其中所述澄清步骤是通过重力沉降至少于约20％的干固体来进行的。
实施例33是根据实施例1至32中任一项所述的方法，其中所述澄清步骤是通过硅藻土过滤至少于约20％的干固体来进行的。
实施例34是根据实施例1至33中任一项所述的方法，其中所述裂解物是在澄清之前用水或盐或缓冲液的水溶液1∶1稀释的，其中所述pH介于约8.5与约12.0之间。
实施例35是根据实施例1至34中任一项所述的方法，其中在存在一种或多种絮凝剂的情况下对来自步骤a)的所述细胞裂解物进行澄清。
实施例36是根据实施例35所述的方法，其中所述一种或多种絮凝剂包括以下中的一者或多者：烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚胺、石灰、熟石灰、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸铝、铝酸钠、氯化铝、碱式碳酸镁、碳酸钙、氢氧化钙、活化硅酸盐、瓜尔胶、淀粉、单宁、海藻酸钠、聚合硫酸铝、聚合羟基氯化铝、
Figure BDA0004190539340000821
和合成聚电解质。
实施例37是根据实施例36所述的方法，其中所述一种或多种絮凝剂选自由以下组成的组：烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚胺、石灰、熟石灰、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸铝、铝酸钠、氯化铝、碱式碳酸镁、碳酸钙、氢氧化钙、活化硅酸盐、瓜尔胶、淀粉、单宁、海藻酸钠、聚合硫酸铝、聚合羟基氯化铝、
Figure BDA0004190539340000822
和合成聚电解质。
实施例38是根据实施例1至37中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物的蛋白质含量为约2mg/mL至约250mg/mL。
实施例39是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出一种或多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例40是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出两种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例41是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出三种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例42是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出四种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例43是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出五种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例44是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出六种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例45是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出七种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例46是根据实施例1至38中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出以下特性：
当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S，
所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶，
所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm，
在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性，
当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶，
其中所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶，
所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的，并且
所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例47是根据实施例1至45中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
实施例48是根据实施例1至45中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例49是根据实施例1至45中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例50是根据实施例1至45中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例51是根据实施例1至45中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例52是根据实施例47至51中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例53是根据实施例47至51中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例54是根据实施例47至51中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例55是根据实施例47至51中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例56是根据实施例1至55中任一项所述的方法，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行干燥。
实施例57是根据实施例56所述的方法，其中将所述蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例58是根据实施例56所述的方法，其中将所述蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例59是根据实施例1至55中任一项所述的方法，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物。
实施例60是根据实施例59所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过微滤进行巴氏杀菌的。
实施例61是根据实施例59所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过高温短时巴氏杀菌进行巴氏杀菌的。
实施例62是根据实施例59所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过添加一种或多种抗微生物剂进行巴氏杀菌的。
实施例63是根据实施例59至62中任一项所述的方法，其进一步包括对所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物进行干燥。
实施例64是根据实施例63所述的方法，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例65是根据实施例63所述的方法，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例66是根据实施例1至65中任一项所述的方法，其中与其中所述裂解步骤、澄清步骤或过滤步骤中的一个或多个不在介于约8.5与约12.0的pH下进行的对应方法相比，一种或多种挥发性化合物的量减少至少约0.05/1.05，其中所述挥发性化合物选自由以下组成的组：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例67是根据实施例1至66中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例68是根据实施例1至67中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例69是根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中对所述经澄清的裂解物进行过滤包括使用平均孔径为0.2μm至2.0μm的过滤器对所述经澄清的裂解物进行微滤和/或对所述经澄清的裂解物进行渗滤，以产生经过滤的裂解物。
实施例70是根据实施例69所述的方法，其中所述渗滤包括使用超滤膜系统。
实施例71是根据实施例1至2中任一项所述的方法，其中在浓缩之前，对来自步骤c)的所述经过滤的裂解物进行进一步过滤。
实施例72是根据实施例71所述的方法，其中使用具有约10kDa至约30kDa截留分子量的膜对所述经过滤的裂解物进行超滤。
实施例73是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)对所述细胞裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
c)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)和c)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例74是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)使用微滤对所述细胞裂解物进行过滤，以获得第一经过滤的裂解物；
c)使用渗滤对所述第一经过滤的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例75是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)使用微滤对所述细胞裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
c)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)和c)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例76是根据实施例73至75中任一项所述的方法，其中过滤包括微滤。
实施例77是根据实施例73至76中任一项所述的方法，其中过滤包括超滤。
实施例78是根据实施例73至77中任一项所述的方法，其中过滤包括渗滤。
实施例79是根据实施例78所述的方法，其中对至少两个渗滤体积进行渗滤。
实施例80是根据实施例73至79中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括微生物细胞。
实施例81是根据实施例73至80中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括真菌细胞。
实施例82是根据实施例81所述的方法，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、克鲁维酵母属、亚罗酵母属和镰孢属细胞。
实施例83是根据实施例81所述的方法，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母和镰孢霉。
实施例84是根据实施例73至83中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括细菌细胞。
实施例85是根据实施例84所述的方法，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、乳杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属和甲烷球菌属。
实施例86是根据实施例84所述的方法，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌、荧光假单胞菌和海沼甲烷球菌。
实施例87是根据实施例73至86中任一项所述的方法，其中所述多个细胞的所述水性悬浮液包括约2％至约25％的干固体。
实施例88是根据实施例73至87中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤a)之前，在介于约8.5与约12.0之间的pH下洗涤所述多个细胞的所述水性悬浮液。
实施例89是根据实施例73至88中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约4℃与约15℃之间的温度下进行的。
实施例90是根据实施例73至89中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是以生物化学方式进行的。
实施例91是根据实施例73至90中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是以化学方式进行的。
实施例92是根据实施例73至91中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是以机械方式进行的。
实施例93是根据实施例73至92中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约9.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例94是根据实施例93所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约9.0与约10.0之间的pH下进行的。
实施例95是根据实施例93所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约10.0与约11.0之间的pH下进行的。
实施例96是根据实施例93所述的方法，其中所述裂解步骤是在介于约11.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例97是根据实施例73至96中任一项所述的方法，其中所述裂解物是在过滤之前用水或盐或缓冲液的水溶液1∶1稀释的，其中所述pH介于约8.5与约12.0之间。
实施例98是根据实施例73至97中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物的蛋白质含量为约2mg/mL至约250mg/mL。
实施例99是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出一种或多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例100是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出两种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例101是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出三种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例102是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出四种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例103是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出五种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例104是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出六种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例105是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出七种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例106是根据实施例73至98中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物表现出以下特性：
当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S，
所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶，
所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm，
在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性，
当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶，
其中所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶，
所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的，并且
所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例107是根据实施例73至106中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
实施例108是根据实施例73至106中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例109是根据实施例73至106中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例110是根据实施例73至106中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例111是根据实施例73至106中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例112是根据实施例107至111中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例113是根据实施例107至111中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例114是根据实施例107至111中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例115是根据实施例107至111中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例116是根据实施例73至115中任一项所述的方法，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行干燥。
实施例117是根据实施例116所述的方法，其中将所述蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例118是根据实施例116所述的方法，其中将所述蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例119是根据实施例73至115中任一项所述的方法，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物。
实施例120是根据实施例119所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过微滤进行巴氏杀菌的。
实施例121是根据实施例119所述的方法，其中蛋白质组合物是通过高温短时巴氏杀菌进行巴氏杀菌的。
实施例122是根据实施例119所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过添加一种或多种抗微生物剂进行巴氏杀菌的。
实施例123是根据实施例119至122中任一项所述的方法，其进一步包括对所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物进行干燥。
实施例124是根据实施例123所述的方法，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例125是根据实施例123所述的方法，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例126是根据实施例73至125中任一项所述的方法，其中与其中所述裂解步骤或过滤步骤中的一个或多个不在介于约8.5与约12.0的pH下进行的对应方法相比，一种或多种挥发性化合物的量减少至少约0.05/1.05，其中所述挥发性化合物选自由以下组成的组：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例127是根据实施例73至126中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例128是根据实施例73至127中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例129是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
实施例130是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述蛋白质组合物的缓冲能力小于约2.5mmol NaOH/克干固体。
实施例131是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中将所述蛋白质组合物的10％(w/v)悬浮液加热至至少约95℃会产生储能模量为至少约100Pa的凝胶。
实施例132是根据实施例129至131中任一项所述的蛋白质组合物，其中当未将L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中时，在25℃下经过约24小时之后，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
实施例133是根据实施例129至132中任一项所述的蛋白质组合物，其中在将约25mM L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
实施例134是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中当未将L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中时，在25℃下经过约24小时之后，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
实施例135是根据实施例134所述的蛋白质组合物，其中在将约25mM L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
实施例136是根据实施例129至127中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
实施例137是根据实施例129至136中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在加热至65℃时转变成凝胶。
实施例138是根据实施例129至137中任一项所述的蛋白质组合物，其中在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性。
实施例139是根据实施例129至138中任一项所述的蛋白质组合物，其中当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶。
实施例140是根据实施例129至139中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶。
实施例141是根据实施例129至140中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物可以在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的。
实施例142是根据实施例129至141中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D10小于约0.1m。
实施例143是根据实施例129至142中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D50小于约1.0μm。
实施例144是根据实施例129至143中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D90小于约5μm。
实施例145是根据实施例129至144中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例146是根据实施例129或131至145中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的缓冲能力小于约2.5mmol NaOH/克干固体。
实施例147是根据实施例129至146中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在一种或多种多步骤代谢途径中显示活性。
实施例148是根据实施例129至147中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少10种不同的功能性蛋白。
实施例149是根据实施例129至148中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少20种不同的功能性蛋白。
实施例150是根据实施例129至149中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少50种不同的功能性蛋白。
实施例151是根据实施例129至150中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括功能性微生物蛋白质。
实施例152是根据实施例129至151中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括功能性真菌蛋白。
实施例153是根据实施例129至152中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括功能性细菌蛋白。
实施例154是根据实施例129至153中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、曲霉属、木霉属或镰孢属。
实施例155是根据实施例129至154中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母或镰孢霉。
实施例156是根据实施例129至155中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、乳杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属或甲烷球菌属。
实施例157是根据实施例129至156中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌、荧光假单胞菌或海沼甲烷球菌。
实施例158是根据实施例129至157中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括一种或多种异源功能性蛋白。
实施例159是根据实施例129或136至158中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例160是根据实施例129或136至158中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例161是根据实施例129或136至158中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例162是根据实施例129或136至158中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例163是根据实施例129或136至158中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约80％的大于5kDa的化合物。
实施例164是根据实施例129或136至163中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例165是根据实施例129或136至163中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例166是根据实施例129或136至163中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例167是根据实施例129或136至163中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例168是根据实施例129至167中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例169是根据实施例129至168中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例170是一种酿酒酵母蛋白质组合物，其包括：
多种功能性酿酒酵母蛋白，
其中基于干重，所述酿酒酵母蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物，并且
其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出两种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例171是根据实施例170所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出三种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例172是根据实施例170所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出四种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例173是根据实施例170所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出五种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例174是根据实施例170所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出六种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例175是根据实施例170所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出七种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例176是根据实施例170所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述酿酒酵母蛋白质组合物表现出以下特性：
当未将L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述酿酒酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S，
其中所述酿酒酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶，
其中所述酿酒酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm，
其中在约85℃下经过约20分钟之后，所述酿酒酵母蛋白质组合物至少约80％变性，
其中当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述酿酒酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶，
其中所述酿酒酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；
其中所述酿酒酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的，并且
其中所述酿酒酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例177是根据实施例170至176中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例178是根据实施例170至176中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例179是根据实施例170至176中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例180是根据实施例170至176中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例181是根据实施例170至176中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约80％的大于5kDa的化合物。
实施例182是根据实施例170至181中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例183是根据实施例170至181中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例184是根据实施例170至181中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例185是根据实施例170至181中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例186是根据实施例170至185中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例187是根据实施例170至186中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例188是一种巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其包括：
多种功能性巴斯德毕赤酵母蛋白，
其中基于干重，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物，并且
其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出两种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例189是根据实施例188所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出三种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例190是根据实施例188所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出四种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例191是根据实施例188所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出五种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例192是根据实施例188所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出六种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例193是根据实施例188所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出七种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例194是根据实施例188所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物表现出以下特性：
当未将L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S，
其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶，
其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm，
其中在约85℃下经过约20分钟之后，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物至少约80％变性；
其中当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶，
其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶，
其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的，并且
其中所述巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例195是根据实施例188至194中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例196是根据实施例188至194中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例197是根据实施例188至194中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例198是根据实施例188至194中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例199是根据实施例188至194中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约80％的大于5kDa的化合物。
实施例200是根据实施例188至199中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例201是根据实施例188至199中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例202是根据实施例188至199中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例203是根据实施例188至199中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例204是根据实施例188至203中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例205是根据实施例188至204中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例206是一种大肠杆菌蛋白质组合物，其包括：
多种功能性大肠杆菌蛋白，
其中基于干重，所述大肠杆菌蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物，并且
其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出两种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例207是根据实施例206所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出三种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例208是根据实施例206所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出四种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例209是根据实施例206所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出五种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例210是根据实施例206所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出六种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例211是根据实施例206所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出七种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例212是根据实施例206所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述大肠杆菌蛋白质组合物表现出以下特性：
当未将L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述大肠杆菌蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S，
其中所述大肠杆菌蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶，
其中所述大肠杆菌蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；
其中在约85℃下经过约20分钟之后，所述大肠杆菌蛋白质组合物至少约80％变性；
其中当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述大肠杆菌蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶，
其中所述大肠杆菌蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；
其中所述大肠杆菌蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的，并且
其中所述大肠杆菌蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例213是根据实施例206至212中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例214是根据实施例206至212中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例215是根据实施例206至212中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例216是根据实施例206至212中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例217是根据实施例206至216中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约80％的大于5kDa的化合物。
实施例218是根据实施例206至216中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例219是根据实施例206至216中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例220是根据实施例206至216中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例221是根据实施例206至216中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例222是根据实施例206至221中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例223是根据实施例206至222中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例224是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得经过滤的裂解物；
d)对所述经过滤的裂解物进行浓缩，以获得蛋白质组合物；以及
e)任选地对蛋白质的所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)、d)和e)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例225是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)对所述经澄清的裂解物进行浓缩，以获得蛋白质组合物；以及
d)任选地对蛋白质的所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例226是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例227是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)使用微滤对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得第一经过滤的裂解物；
d)使用渗滤对所述第一经过滤的裂解物进行过滤，以获得第二经过滤的裂解物；
e)使用超滤对所述第二经过滤的裂解物进行过滤，以获得第三经过滤的裂解物；
f)使用渗滤对所述第三经过滤的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
g)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物；
其中步骤a)、b)、c)、d)、e)、f)和g)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例228是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，对所述细胞裂解物进行澄清，以获得经澄清的裂解物；
c)使用超滤对所述经澄清的裂解物进行过滤，以获得第一经过滤的裂解物；
d)使用渗滤对所述第一经过滤的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)、d)和e)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例229是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)对所述细胞裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
c)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)和c)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例230是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)使用超滤对所述细胞裂解物进行过滤，以获得第一经过滤的裂解物；
c)使用渗滤对所述第一经过滤的裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)、c)和d)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例231是一种通过包括以下的方法产生的蛋白质组合物：
a)对所述多个细胞的水性悬浮液进行裂解，以获得细胞裂解物；
b)使用超滤对所述细胞裂解物进行过滤，以获得蛋白质组合物；以及
c)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物，
其中步骤a)、b)和c)独立地在介于约8.5与约12.0之间的pH下进行。
实施例232是根据实施例224至228中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述澄清步骤是任选地在存在一种或多种絮凝剂的情况下，在介于约9.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例233是根据实施例232所述的蛋白质组合物，其中所述澄清步骤是在介于约9.0与约10.0之间的pH下进行的。
实施例234是根据实施例232所述的蛋白质组合物，其中所述澄清步骤是在介于约10.0与约11.0之间的pH下进行的。
实施例235是根据实施例232所述的蛋白质组合物，其中所述澄清步骤是在介于约11.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例236是根据实施例224至228或232至235中任一项所述的蛋白质组合物，其中澄清步骤是通过离心至少于约20％的干固体来进行的。
实施例237是根据实施例224至228或232至236中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述澄清步骤是通过重力沉降至少于约20％的干固体来进行的。
实施例238是根据实施例224至228或232至237中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述澄清步骤是通过硅藻土过滤至少于约20％的干固体来进行的。
实施例239是根据实施例224至228或232至238中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解物是在澄清之前用水或盐或缓冲液的水溶液1∶1稀释的，其中所述pH介于约8.5与约12.0之间。
实施例240是根据实施例224至228或232至239中任一项所述的蛋白质组合物，其中在存在一种或多种絮凝剂的情况下对来自步骤a)的所述细胞裂解物进行澄清。
实施例241是根据实施例240所述的蛋白质组合物，其中所述一种或多种絮凝剂包括以下中的一者或多者：烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚胺、石灰、熟石灰、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸铝、铝酸钠、氯化铝、碱式碳酸镁、碳酸钙、氢氧化钙、活化硅酸盐、瓜尔胶、淀粉、单宁、海藻酸钠、聚合硫酸铝、聚合羟基氯化铝、
Figure BDA0004190539340001122
和合成聚电解质。
实施例242是根据实施例240所述的蛋白质组合物，其中所述一种或多种絮凝剂选自由以下组成的组：烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚胺、石灰、熟石灰、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸铝、铝酸钠、氯化铝、碱式碳酸镁、碳酸钙、氢氧化钙、活化硅酸盐、瓜尔胶、淀粉、单宁、海藻酸钠、聚合硫酸铝、聚合羟基氯化铝、
Figure BDA0004190539340001121
和合成聚电解质。
实施例243是根据实施例224至242中任一项所述的方法，其中过滤包括微滤。
实施例244是根据实施例224至243中任一项所述的方法，其中过滤包括超滤。
实施例245是根据实施例224至244中任一项所述的方法，其中过滤包括渗滤。
实施例246是根据实施例245所述的方法，其中对至少两个渗滤体积进行渗滤。
实施例247是根据实施例224至246中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多个细胞包括微生物细胞。
实施例248是根据实施例224至247中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多个细胞包括真菌细胞。
实施例249是根据实施例248所述的蛋白质组合物，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、克鲁维酵母属、亚罗酵母属和镰孢属细胞。
实施例250是根据实施例248所述的蛋白质组合物，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母和镰孢霉。
实施例251是根据实施例224至250中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多个细胞包括细菌细胞。
实施例252是根据实施例251所述的蛋白质组合物，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、乳杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属和甲烷球菌属。
实施例253是根据实施例251所述的蛋白质组合物，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌、荧光假单胞菌和海沼甲烷球菌。
实施例254是根据实施例224至253中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多个细胞的所述水性悬浮液包括约2％至约25％的干固体。
实施例255是根据实施例224至254中任一项所述的蛋白质组合物，其进一步包括在步骤a)之前，在介于约8.5与约12.0之间的pH下洗涤所述多个细胞的所述水性悬浮液。
实施例256是根据实施例224至255中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是在介于约4℃与约15℃之间的温度下进行的。
实施例257是根据实施例224至256中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是以生物化学方式进行的。
实施例258是根据实施例224至257中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是以化学方式进行的。
实施例259是根据实施例224至258中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是以机械方式进行的。
实施例260是根据实施例224至259中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是在介于约9.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例261是根据实施例260所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是在介于约9.0与约10.0之间的pH下进行的。
实施例262是根据实施例260所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是在介于约10.0与约11.0之间的pH下进行的。
实施例263是根据实施例260所述的蛋白质组合物，其中所述裂解步骤是在介于约11.0与约12.0之间的pH下进行的。
实施例264是根据实施例224至263中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述裂解物是在过滤之前用水或盐或缓冲液的水溶液1∶1稀释的，其中所述pH介于约8.5与约12.0之间。
实施例265是根据实施例224至264中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的蛋白质含量为约2mg/mL至约250mg/mL。
实施例266是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出一种或多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例267是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出两种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例268是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出三种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例269是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出四种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例270是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出五种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例271是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出六种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例272是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出七种或更多种选自由以下组成的组的特性：当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S；所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶；所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm；在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性；当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶；所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶；所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的；并且所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例273是根据实施例224至265中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物表现出以下特性：
当未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S，并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S，
所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶，
所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm，
在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性，
当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶，
其中所述蛋白质组合物在约pH 5.5与约pH 10.0之间形成凝胶，
所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的，并且
所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例274是根据实施例224至273中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
实施例275是根据实施例224至273中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例276是根据实施例224至273中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例277是根据实施例224至273中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例278是根据实施例224至273中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例279是根据实施例274至278中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例280是根据实施例274至278中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例281是根据实施例274至278中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例282是根据实施例274至278中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例283是根据实施例224至282中任一项所述的蛋白质组合物，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行干燥。
实施例284是根据实施例283所述的蛋白质组合物，其中将所述蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例285是根据实施例283所述的蛋白质组合物，其中将所述蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例286是根据实施例224至282中任一项所述的蛋白质组合物，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物。
实施例287是根据实施例286所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物是通过微滤进行巴氏杀菌的。
实施例288是根据实施例286所述的蛋白质组合物，其中蛋白质组合物是通过高温短时巴氏杀菌进行巴氏杀菌的。
实施例289是根据实施例286所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物是通过添加一种或多种抗微生物剂进行巴氏杀菌的。
实施例290是根据实施例286至289中任一项所述的蛋白质组合物，其进一步包括对所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物进行干燥。
实施例291是根据实施例290所述的蛋白质组合物，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例292是根据实施例290所述的蛋白质组合物，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例293是根据实施例224至292中任一项所述的蛋白质组合物，其中与其中所述裂解步骤、澄清步骤或过滤步骤中的一个或多个不在介于约8.5与约12.0的pH下进行的对应方法相比，一种或多种挥发性化合物的量减少至少约0.05/1.05，其中所述挥发性化合物选自由以下组成的组：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例294是根据实施例224至293中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
实施例295是根据实施例224至294中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例296是一种食物产品，其包括：
根据实施例129至169中任一项所述的蛋白质组合物。
实施例297是一种食物产品，其包括：
根据实施例170至187中任一项所述的酿酒酵母蛋白质组合物。
实施例298是一种食物产品，其包括：
根据实施例188至205中任一项所述的巴斯德毕赤酵母蛋白质组合物。
实施例299是一种食物产品，其包括：
根据实施例206至223中任一项所述的大肠杆菌蛋白质组合物。
实施例300是根据实施例296至290中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品是乳制复制品。
实施例301是根据实施例300所述的食物产品，其中所述食物产品是奶复制品。
实施例302是根据实施例300所述的食物产品，其中所述食物产品是奶酪复制品。
实施例303是根据实施例300至302中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品进一步包括一种或多种微生物。
实施例304是根据实施例303所述的食物产品，其中所述一种或多种微生物选自由以下组成的组：乳球菌、乳杆菌、明串珠菌、链球菌、片球菌、梭菌、葡萄球菌、短杆菌、丙酸杆菌、青霉菌、德巴利酵母、地丝菌、棒状杆菌、轮枝菌、克鲁维酵母、酵母、假丝酵母、红冬孢酵母、微球菌、盐单胞菌、嗜冷杆菌或其组合。
实施例305是根据实施例303所述的食物产品，其中所述一种或多种微生物选自由以下组成的组：乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂、乳酸乳球菌乳丁二酮变种、德氏乳杆菌乳、德氏保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌乳脂、嗜热链球菌、戊糖片球菌、丁酸梭菌、木糖葡萄球菌、亚麻短杆菌、白青霉、卡门柏青霉、娄地青霉、汉森德巴利酵母、白地霉、蜡蚧轮枝菌、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、杰佛假丝酵母、产朊假丝酵母、隐红冬孢酵母。
实施例306是根据实施例296至299中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品是肉复制品。
实施例307是根据实施例306所述的食物产品，其进一步包括血红素。
实施例308是根据实施例308所述的食物产品，其中所述血红素以含血红素的蛋白的形式提供。
实施例309是根据实施例306至308中任一项所述的食物产品，其进一步包括一种或多种风味剂前体。
实施例310是根据实施例309所述的食物产品，其中所述一种或多种风味剂前体包括选自由以下组成的组的化合物：糖、糖醇、糖酸、糖衍生物、含硫化合物、氨基酸或其衍生物、核苷酸、核苷、维生素、酸、肽、蛋白水解物、提取物和其组合。
实施例311是根据实施例309所述的食物产品，其中所述风味剂前体包括糖和含硫化合物。
实施例312是根据实施例310至311中任一项所述的食物产品，其中所述含硫化合物选自由以下组成的组：半胱氨酸、胱氨酸、半胱氨酸亚砜、蒜素、硒代半胱氨酸、甲硫氨酸、硫胺素和其组合。
实施例313是根据实施例310至312中任一项所述的食物产品，其中所述糖选自由以下组成的组：葡萄糖、果糖、核糖、蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖1，6-二磷酸、肌醇、麦芽糖、糖蜜、麦芽糖糊精、糖原、半乳糖、乳糖、核糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、直链淀粉、支链淀粉、木糖和其组合。
实施例314是根据实施例306至313中任一项所述的食物产品，其进一步包括油。
实施例315是根据实施例314所述的食物产品，其中所述油选自由以下组成的组：椰子油、芒果油、葵花油、棉籽油、红花油、米糠油、可可脂、棕榈果油、棕榈油、大豆油、芥花油、玉米油、芝麻油、核桃油、亚麻籽、荷荷巴油、蓖麻、葡萄籽油、花生油、橄榄油、海藻油、来自细菌或真菌的油和其组合。
实施例316是根据实施例296至299中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品是蛋白质补充剂。
实施例317是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于10％(按所述食物产品的重量计)的动物产品。
实施例318是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于5％(按所述食物产品的重量计)的动物产品。
实施例319是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于1％(按所述食物产品的重量计)的动物产品。
实施例320是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品不含有动物产品。
实施例321是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于10％(按所述食物产品的重量计)的动物源性产品。
实施例322是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于5％(按所述食物产品的重量计)的动物源性产品。
实施例323是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于1％(按所述食物产品的重量计)的动物源性产品。
实施例324是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品不含有动物源性产品。
实施例325是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于10％(按所述食物产品的重量计)的动物肉。
实施例326是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于5％(按所述食物产品的重量计)的动物肉。
实施例327是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品含有少于1％(按所述食物产品的重量计)的动物肉。
实施例328是根据实施例296至316中任一项所述的食物产品，其中所述食物产品不含有动物肉。
实施例329是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例330是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。
实施例331是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例332是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例333是一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例334是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例335是一种用于从多个细胞中制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。
实施例336是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及
f)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌；
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例337是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及
f)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌；
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例338是一种用于从多个细胞中制备富含胞质蛋白的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成富含胞质蛋白的蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述富含胞质蛋白的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例339是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至b)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例340是一种用于从多个细胞中制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及
d)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至b)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。
实施例341是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例342是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例343是一种用于从多个细胞中制备膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物的方法，所述方法包括：
a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)从所述固体部分中提取蛋白质，以形成膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述膜结合和/或亚细胞区室富含蛋白质的蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例344是根据实施例339至343中任一项所述的方法，其中从所述固体部分中提取蛋白质包括所述固体部分的机械裂解。
实施例345是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例346是一种用于从多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
a)用碱处理表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。
实施例347是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
a)用碱处理表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及
f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例348是一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及
f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例349是一种用于从多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
a)将表达所述可溶性蛋白的所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例350是根据实施例345至349中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白是含血红素的蛋白。
实施例351是根据实施例350所述的方法，其中所述方法包括用约5mM至约500mM还原当量的还原剂处理所述多个细胞。
实施例352是根据实施例351所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约20mM至约80mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例353是根据实施例351至352中任一项所述的方法，其中所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。
实施例354是根据实施例351至353中任一项所述的方法，其中所述还原剂是食品安全还原剂。
实施例355是根据实施例345至354中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白具有熔点，并且方法进一步包括：在a)之前，将所述多个细胞加热至比所述可溶性蛋白的所述熔点低约10℃或约5℃的温度。
实施例356是根据实施例355所述的方法，其中所述可溶性蛋白的熔点为至少约60℃。
实施例357是根据实施例345至356中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白对于所述多个细胞是异源性的。
实施例358是根据实施例345至357中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白占所述蛋白质组合物中的蛋白质的至少约30干重％。
实施例359是根据实施例345至357中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白占所述蛋白质组合物中的蛋白质的至少约50干重％。
实施例360是根据实施例345至357中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白占所述蛋白质组合物中的蛋白质的至少约70干重％。
实施例361是根据实施例345至357中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白占所述蛋白质组合物中的蛋白质的至少约90干重％。
实施例362是根据实施例339或实施例340所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。
实施例363是根据实施例341或实施例342所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。
实施例364是根据实施例329、330、333、334、335、338、343、345、346或349中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。
实施例365是根据实施例331、332、336、337、347或348中任一项所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。
实施例366是根据实施例339或实施例340所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在约9.0至约12.0的pH下进行。
实施例367是根据实施例341或实施例342所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在约9.0至约12.0的pH下进行。
实施例368是根据实施例329、330、333、334、335、338、343、345、346或349中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约9.0至约12.0的pH下进行。
实施例369是根据实施例331、332、336、337、347或348中任一项所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约9.0至约12.0的pH下进行。
实施例370是根据实施例339或实施例340所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。
实施例371是根据实施例341或实施例342所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。
实施例372是根据实施例329、330、333、334、335、338、343、345、346或349中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。
实施例373是根据实施例331、332、336、337、347或348中任一项所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。
实施例374是根据实施例339或实施例340所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在约10.0至约11.0的pH下进行。
实施例375是根据实施例341或实施例342所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在约10.0至约11.0的pH下进行。
实施例376是根据实施例329、330、333、334、335、338、343、345、346或349中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约10.0至约11.0的pH下进行。
实施例377是根据实施例331、332、336、337、347或348中任一项所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约10.0至约11.0的pH下进行。
实施例378是根据实施例339或实施例340所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在约11.0至约12.0的pH下进行。
实施例379是根据实施例341或实施例342所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在约11.0至约12.0的pH下进行。
实施例380是根据实施例329、330、333、334、335、338、343、345、346或349中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约11.0至约12.0的pH下进行。
实施例381是根据实施例331、332、336、337、347或348中任一项所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约11.0至约12.0的pH下进行。
实施例382是根据实施例339或实施例340所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
实施例383是根据实施例341或实施例342所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
实施例384是根据实施例329、330、333、334、335、338、343、345、346或349中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
实施例385是根据实施例331、332、336、337、347或348中任一项所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
实施例386是根据实施例333、338、343或349中任一项所述的方法，其进一步包括：在加热所述多个细胞与对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分之间，用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0。
实施例387是根据实施例333、338、343或349中任一项所述的方法，其中当所述多个细胞具有细胞壁时，所述方法进一步包括：在加热所述多个细胞与对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分之间，对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔。
实施例388是根据实施例330至332、335至337、340至342或346至348中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约3分钟。
实施例389是根据实施例330至332、335至337、340至342或346至348中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约5分钟。
实施例390是根据实施例330至332、335至337、340至342或346至348中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间包括：其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约10分钟。
实施例391是根据实施例330至332、335至337、340至342或346至348中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
实施例392是根据实施例329至332、334至337、339至342或345至348中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：在对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离以形成固体部分和液体部分之前，将所述多个细胞加热至至少约60℃。
实施例393是根据实施例329、331、332、334、336、337、339、341、342、345、347或348中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
实施例394是根据实施例329、331、332、334、336、337、339、341、342、345、347或348中任一项所述的方法，其中穿孔包括用还原剂进行处理、用酶进行处理、电穿孔或其组合。
实施例395是根据实施例394所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约10mM至约500mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例396是根据实施例394所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约20mM至约80mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例397是根据实施例394所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约50mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例398是根据实施例394至397中任一项所述的方法，其中所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。
实施例399是根据实施例394至398中任一项所述的方法，其中所述还原剂是食品安全还原剂。
实施例400是根据实施例329至399中任一项所述的方法，其中来自所述液体部分的干燥固体在脱盐之后的A260/A280比率小于约1.5。
实施例401是根据实施例329至400中任一项所述的方法，其中来自所述固体部分的干燥固体在脱盐后的A260/A280比率大于约1.5。
实施例402是根据实施例329至401中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
实施例403是根据实施例329至402中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约60重量％的胞质蛋白。
实施例404是根据实施例329至403中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约70重量％的胞质蛋白。
实施例405是根据实施例329至404中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约80重量％的胞质蛋白。
实施例406是根据实施例329至402中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的己糖激酶。
实施例407是根据实施例329至406中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约70重量％的己糖激酶。
实施例408是根据实施例329至407中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约90重量％的己糖激酶。
实施例409是根据实施例329至408中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的非膜结合细胞壁蛋白质。
实施例410是根据实施例329至409中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约70重量％的非膜结合细胞壁蛋白质。
实施例411是根据实施例329至410中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约90重量％的非膜结合细胞壁蛋白质。
实施例412是根据实施例329至411中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分中的蛋白质包括所述多个细胞的少于40重量％的膜结合和亚细胞区室蛋白。
实施例413是根据实施例329至412中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分中的蛋白质包括所述多个细胞的少于35重量％的膜结合和亚细胞区室蛋白。
实施例414是根据实施例329至413中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分中的蛋白质包括所述多个细胞的少于33重量％的膜结合和亚细胞区室蛋白。
实施例415是根据实施例329至414中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的少于50重量％的总组蛋白。
实施例416是根据实施例329至415中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的少于70重量％的总组蛋白。
实施例417是根据实施例329至416中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的少于90重量％的总组蛋白。
实施例418是根据实施例329至417中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的少于50重量％的总亚铁螯合酶。
实施例419是根据实施例329至418中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的少于70重量％的总亚铁螯合酶。
实施例420是根据实施例329至419中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的少于90重量％的总亚铁螯合酶。
实施例421是根据实施例329至420中任一项所述的方法，其中所述方法使所述多个细胞中的至少约25重量％的细胞保持完整。
实施例422是根据实施例329至421中任一项所述的方法，其中所述方法使所述多个细胞中的至少约50重量％的细胞保持完整。
实施例423是根据实施例329至422中任一项所述的方法，其中所述方法使所述多个细胞中的至少约75重量％的细胞保持完整。
实施例424是根据实施例329至423中任一项所述的方法，其中在对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离以形成固体部分和液体部分之前，所述多个细胞的粒径分布中值为约2μm至约4μm。
实施例425是根据实施例329至343或345至424中任一项所述的方法，其中所述方法不包括对所述多个细胞的机械裂解。
实施例426是根据实施例425所述的方法，其中与包括机械裂解的类似方法相比，所述蛋白质组合物包括更高比例的胞质蛋白。
实施例427是根据实施例329至424中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对所述多个细胞的机械裂解。
实施例428是根据实施例329至427中任一项所述的方法，其中对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离以形成固体部分和液体部分是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
实施例429是根据实施例329至428中任一项所述的方法，其中对所述液体部分进行过滤以形成滤液和截留物是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
实施例430是根据实施例329至429中任一项所述的方法，其中所述分离包括离心、重力沉降、深度过滤、微滤或其组合。
实施例431是根据实施例430所述的方法，其中所述离心包括至少约3,000xg的离心。
实施例432是根据实施例329至431中任一项所述的方法，其中与每个步骤在约6.5的pH下进行的类似方法相比，所述蛋白质组合物包括少至少约9/10的酯。
实施例433是根据实施例329至432中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物是低风味蛋白质组合物。
实施例434是根据实施例329至433中任一项所述的方法，其中所述过滤包括微滤、超滤、渗滤或其组合。
实施例435是根据权利要求329至434中任一项所述的方法，其中进行所述过滤，直到将所述蛋白质组合物的2％(w/v)悬浮液的pH从pH 3调节至pH 12所需的氢氧化钠的量小于或等于3mmol。
实施例436是根据实施例329至435中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括微生物细胞。
实施例437是根据实施例329至436中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括真核细胞。
实施例438是根据实施例329至437中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括真菌细胞。
实施例439是根据实施例438所述的方法，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酵母细胞、毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、汉逊酵母细胞、球拟酵母细胞、克鲁维酵母细胞、耶氏酵母细胞、镰胞菌细胞和其组合。
实施例440是根据实施例438所述的方法，其中所述真菌细胞选自由以下组成的组：酿酒酵母细胞、巴斯德毕赤酵母细胞、博伊丁假丝酵母细胞、多形汉逊酵母细胞、乳酸克鲁维酵母细胞、解脂耶氏酵母细胞、镰孢霉细胞和其组合。
实施例441是根据实施例329至440中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括细菌细胞。
实施例442是根据实施例441所述的方法，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：芽孢杆菌细胞、埃希氏杆菌细胞、乳杆菌细胞、棒状杆菌细胞、假单胞菌细胞、甲烷球菌细胞和其组合。
实施例443是根据实施例441所述的方法，其中所述细菌细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸乳杆菌细胞、谷氨酸棒状杆菌细胞、荧光假单胞菌细胞、海沼甲烷球菌细胞和其组合。
实施例444是根据实施例329至443中任一项所述的方法，其中所述多个细胞的所述水性悬浮液包括约2％至约25％的干固体。
实施例445是根据实施例329至444中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤a)之前，在约8.5至约12.0的pH下洗涤所述多个细胞。
实施例446是根据实施例329至445中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物的蛋白质含量为约2mg/mL至约250mg/mL。
实施例447是根据实施例329至446中任一项所述的方法，其中在未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
实施例448是根据实施例329至447中任一项所述的方法，其中在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
实施例449是根据实施例329至448中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物在加热至65℃时形成凝胶。
实施例450是根据实施例329至449中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D10、D50和D90分别小于0.1μm、1.0μm和5μm。
实施例451是根据实施例329至450中任一项所述的方法，其中在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性。
实施例452是根据实施例329至451中任一项所述的方法，其中当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物的10％(w/v)悬浮液形成储能模量为至少约100Pa的凝胶。
实施例453是根据实施例329至452中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物在约5.5至约pH 10.0的pH下形成凝胶。
实施例454是根据实施例329至453中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的。
实施例455是根据实施例329至454中任一项所述的方法，所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例456是根据实施例329至455中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
实施例457是根据实施例329至455中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约40％的大于5kDa的化合物。
实施例458是根据实施例329至455中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约50％的大于5kDa的化合物。
实施例459是根据实施例329至455中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约60％的大于5kDa的化合物。
实施例460是根据实施例329至455中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约70％的大于5kDa的化合物。
实施例461是根据实施例456至460中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例462是根据实施例456至460中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例463是根据实施例456至460中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例464是根据实施例456至460中任一项所述的方法，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例465是根据实施例329至464中任一项所述的方法，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行干燥。
实施例466是根据实施例465所述的方法，其中将所述蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例467是根据实施例465所述的方法，其中将所述蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例468是根据实施例329至464中任一项所述的方法，其进一步包括对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，以获得经巴氏杀菌的蛋白质组合物。
实施例469是根据实施例468所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过微滤进行巴氏杀菌的。
实施例470是根据实施例468所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过高温短时巴氏杀菌进行巴氏杀菌的。
实施例471是根据实施例468所述的方法，其中所述蛋白质组合物是通过添加一种或多种抗微生物剂进行巴氏杀菌的。
实施例472是根据实施例468至471中任一项所述的方法，其进一步包括对所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物进行干燥。
实施例473是根据实施例472所述的方法，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物喷雾干燥。
实施例474是根据实施例472所述的方法，其中将所述经巴氏杀菌的蛋白质组合物冷冻干燥。
实施例475是根据实施例329至474中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例476是一种蛋白质组合物，其通过根据实施例329至475中任一项所述的方法制备。
实施例477是一种通过根据实施例329至475中任一项所述的方法制备的蛋白质组合物在食品、饮料或补充剂中的用途。
实施例478是一种通过根据实施例329至475中任一项所述的方法制备的蛋白质组合物在肉复制品中的用途。
实施例479是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述蛋白质组合物能够使水包油乳液稳定。
实施例480是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述蛋白质组合物能够使水包空气乳液稳定。
实施例481是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述多种功能性蛋白包括至少约50干重％的胞质蛋白。
实施例482是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中来自所述蛋白质组合物的干固体的悬浮液或溶液的A260/A280比率小于约1.5。
实施例483是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述蛋白质组合物是低风味蛋白质组合物。
实施例484是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中基于干重，至少约35％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例485是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述蛋白质组合物的缓冲能力小于约3.0mmol NaOH/克干固体。
实施例486是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中将所述蛋白质组合物的10％(w/v)悬浮液加热至至少约95℃会产生储能模量为至少约100Pa的凝胶。
实施例487是根据实施例479至100中任一项所述的蛋白质组合物，其中当未将L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中时，在25℃下经过约24小时之后，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
实施例488是根据实施例479至101中任一项所述的蛋白质组合物，其中将约25mML-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中，并且随后在25℃下温育约24小时之后，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
实施例489是一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中当未将L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中时，在25℃下经过约24小时之后，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
实施例490是根据实施例103所述的蛋白质组合物，其中在25℃下经过约24小时之后并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中之后，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
实施例491是根据实施例479至481或483至490中任一项所述的蛋白质组合物，其中来自所述蛋白质组合物的干固体的悬浮液或溶液的A260/A280比率小于约1.5。
实施例492是根据实施例479至491中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物是低风味蛋白质组合物。
实施例493是根据实施例479至492中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少约50干重％的胞质蛋白。
实施例494是根据实施例480至493中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物能够使水包油乳液稳定。
实施例495是根据实施例479或481至494中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物能够使水包空气乳液稳定。
实施例496是根据实施例479至495中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约30干重％的所述蛋白质组合物包括丰富蛋白。
实施例497是根据实施例479至495中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约40干重％的所述蛋白质组合物包括丰富蛋白。
实施例498是根据实施例479至494中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约50干重％的所述蛋白质组合物包括丰富蛋白。
实施例499是根据实施例496至498中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述丰富蛋白是含血红素的蛋白。
实施例500是根据实施例479至499中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括对所述多种功能性蛋白的来源生物体异源的至少一种蛋白质。
实施例501是根据实施例500所述的蛋白质组合物，其中对所述多种功能性蛋白的来源生物体异源的所述至少一种蛋白质包括含血红素的蛋白。
实施例502是根据实施例500或实施例501所述的蛋白质组合物，其中对所述多种功能性蛋白的来源生物体异源的所述至少一种蛋白质不包括分泌信号。
实施例503是根据实施例500至502中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约30％干重的所述蛋白质组合物包括对所述多种功能性蛋白的来源生物体异源的所述至少一种蛋白质。
实施例504是根据实施例500至502中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约40％干重的所述蛋白质组合物包括对所述多种功能性蛋白的来源生物体异源的所述至少一种蛋白质。
实施例505是根据实施例500至502中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约50％干重的所述蛋白质组合物包括对所述多种功能性蛋白的来源生物体异源的所述至少一种蛋白质。
实施例506是根据实施例479至505中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约35％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例507是根据实施例479至506中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在加热至65℃时转变成凝胶。
实施例508是根据实施例479至507中任一项所述的蛋白质组合物，其中在约85℃下经过约20分钟之后，所述蛋白质组合物至少约80％变性。
实施例509是根据实施例479至508中任一项所述的蛋白质组合物，其中当在等于或高于约85℃下加热约20分钟时，所述蛋白质组合物形成储能模量为至少约100Pa的凝胶。
实施例510是根据实施例479至509中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物能够在约pH 5.5至约pH 10.0的pH下形成凝胶。
实施例511是根据实施例479至510中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物可以在离子强度低于约0.5M的溶液中形成凝胶，其中所述离子强度是基于非蛋白溶质的浓度计算的。
实施例512是根据实施例479至511中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D10小于约0.1μm。
实施例513是根据实施例479至512中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D50小于约1.0μm。
实施例514是根据实施例479至513中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的粒径分布D90小于约5μm。
实施例515是根据实施例479至514中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的乳液活性指数在约pH 4.0至约pH 8.0的范围内大于或等于约50m2/g蛋白质。
实施例516是根据实施例479至484或486至515中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的缓冲能力小于约3.0mmol NaOH/克干固体。
实施例517是根据实施例479至516中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在一种或多种多步骤代谢途径中显示活性。
实施例518是根据实施例479至517中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少10种不同的功能性蛋白。
实施例519是根据实施例479至518中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少20种不同的功能性蛋白。
实施例520是根据实施例479至519中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少50种不同的功能性蛋白。
实施例521是根据实施例479至520中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括功能性微生物蛋白质。
实施例522是根据实施例479至521中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括功能性真菌蛋白。
实施例523是根据实施例479至522中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括功能性细菌蛋白。
实施例524是根据实施例479至523中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、曲霉属、木霉属、镰孢属或其组合。
实施例525是根据实施例479至524中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、镰孢霉或其组合。
实施例526是根据实施例479至525中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、乳杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、甲烷球菌属或其组合。
实施例527是根据实施例479至526中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括来自以下的功能性蛋白：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌、荧光假单胞菌、海沼甲烷球菌或其组合。
实施例528是根据实施例479至527中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括一种或多种异源功能性蛋白。
实施例529是根据实施例479至528中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约40％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例530是根据实施例479至529中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约50％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例531是根据实施例479至529中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约60％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例532是根据实施例479至529中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约70％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例533是根据实施例479至529中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约80％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
实施例534是根据实施例484或529至533中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于10kDa的化合物。
实施例535是根据实施例484或529至533中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于15kDa的化合物。
实施例536是根据实施例484或529至533中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于20kDa的化合物。
实施例537是根据实施例484或529至533中任一项所述的蛋白质组合物，其中大于5kDa的所述化合物是大于25kDa的化合物。
实施例538是根据实施例479至537中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮、戊醛、3-甲基丁醛和3-甲基丁酸。
实施例539是根据实施例479至538中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物中的至少约50％的蛋白质介于约10kDa与约200kDa之间。
实施例540是一种食品、饮料或补充剂，其包括根据实施例479至539中任一项所述的蛋白质组合物。
实施例541是一种肉替代品，其包括根据实施例479至539中任一项所述的蛋白质组合物。
实施例542是一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
实施例543是一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包括：
用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
实施例544是一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
实施例545是一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
实施例546是一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包括：
将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
实施例547是根据实施例542至546中任一项所述的方法，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例548是一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，
其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例549是一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包括：
用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，
其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例550是一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例551是一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例552是一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包括：
将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，
其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例553是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在约8.5至约12.0的pH下进行的。
实施例554是根据实施例546或实施例552所述的方法，其中所述加热是在约8.5至约12.0的pH下进行的。
实施例555是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在约9.0至约12.0的pH下进行的。
实施例556是根据实施例546或实施例552所述的方法，其中所述加热是在约9.0至约12.0的pH下进行的。
实施例557是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中所述处理包括用所述碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH是约9.0至约12.0的约pH。
实施例558是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在约9.0至约10.0的pH下进行的。
实施例559是根据实施例546或实施例552所述的方法，其中所述加热是在约9.0至约10.0的pH下进行的。
实施例560是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中所述处理包括用所述碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH是约9.0至约10.0的约pH。
实施例561是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在约10.0至约11.0的pH下进行的。
实施例562是根据实施例546或实施例552所述的方法，其中所述加热是在约10.0至约11.0的pH下进行的。
实施例563是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中所述处理包括用所述碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH是约10.0至约11.0的约pH。
实施例564是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在约11.0至约12.0的pH下进行的。
实施例565是根据实施例546或实施例552所述的方法，其中所述加热是在约11.0至约12.0的pH下进行的。
实施例566是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中所述处理包括用所述碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH是约11.0至约12.0的约pH。
实施例567是根据544、545、550或551中任一项所述的方法，其中a)和b)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
实施例568是根据实施例544、545、550或551中任一项所述的方法，其中a)至c)中的每一个独立地在小于或等于约10℃的温度下进行。
实施例569是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述穿孔是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
实施例570是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中所述处理是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
实施例571是根据实施例546或实施例552所述的方法，其进一步包括：在加热所述多个细胞之后，用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0。
实施例572是根据实施例546或实施例552所述的方法，其中当所述多个细胞具有细胞壁时，所述方法进一步包括：在加热所述多个细胞之后，对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔。
实施例573是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约3分钟。
实施例574是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约5分钟。
实施例575是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0包括：其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约10分钟。
实施例576是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：在所述穿孔之后，将所述多个细胞加热至至少约60℃。
实施例577是根据实施例543至545或549至551中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：在所述处理之后，将所述多个细胞加热至至少约60℃。
实施例578是根据实施例542、544、545、548、550或551中任一项所述的方法，其中穿孔包括用还原剂进行处理、用酶进行处理、电穿孔或其组合。
实施例579是根据实施例578所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约10mM至约500mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例580是根据实施例578所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约20mM至约80mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例581是根据实施例578所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约50mM还原当量的所述还原剂进行处理。
实施例582是根据实施例578至581中任一项所述的方法，其中所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。
实施例583是根据实施例578至582中任一项所述的方法，其中所述还原剂是食品安全还原剂。
实施例584是一种组合物，其通过根据实施例542至583中任一项所述的方法制备。
实施例585是一种组合物，其包括：
多个细胞，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
实施例586是根据实施例所述的组合物，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例587是一种组合物，其包括：
多个细胞，
其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
实施例588是根据实施例585至587中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括还原剂。
实施例589是根据实施例588所述的组合物，所述还原剂以约10mM至约500mM还原当量的所述还原剂的量存在于所述组合物中。
实施例590是根据实施例588所述的组合物，所述还原剂以约20mM至约80mM还原当量的所述还原剂的量存在于所述组合物中。
实施例591是根据实施例588所述的组合物，所述还原剂以约50mM还原当量的所述还原剂的量存在于所述组合物中。
实施例592是根据实施例588至591中任一项所述的组合物，其中所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。
实施例593是根据实施例588至592中任一项所述的组合物，其中所述还原剂是食品安全还原剂。
实施例594是根据实施例585至593中任一项所述的组合物，其中所述多个细胞中的至少约25重量％的细胞是完整的。
实施例595是根据实施例585至593中任一项所述的组合物，其中所述多个细胞中的至少约50重量％的细胞是完整的。
实施例596是根据实施例585至593中任一项所述的组合物，其中所述多个细胞中的至少约75重量％的细胞是完整的。
实施例597是根据实施例585至593中任一项所述的组合物，其中所述多个细胞的粒径分布中值为约2μm至约4μm。
本发明将在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
实例1
在pH 6.0或9.0下酵母细胞的裂解
使用酵母屑粒或酵母膏以15-21％的最终干固体制备酿酒酵母的水性细胞悬浮液(CS)，如由制造商提供的。在酵母屑粒的情况下，使用milliQ水制备1∶1的悬浮液。将CS维持在pH 6.0或pH 9.0。使用珠粒研磨裂解CS中的酵母细胞，同时视情况将pH维持为6.0或9.0。通过使用中试规模碟式离心机的小规模模型以8,000x g离心3分钟来对经裂解的细胞进行澄清。使用具有0.2um标称孔径的膜对经澄清的裂解物进行微滤。
使用pH 9.0对6.0具有若干令人期望的结果。在离心期间，固体被更有效地去除。离心后，相对于维持在pH 6.0的裂解物，维持在pH 9.0的经澄清的裂解物的产率增加25-50％(例如，在一个实验中，pH 6.0给出了10％干基(DB)产率对在pH 9.0下15％DB产率)，并且在微滤(0.2μm膜)期间蛋白质损失减少30％。从碱性工艺获得的蛋白质如通过混合流变仪确定的更具功能性(图10)。在感官水平上，上清液/离心分离液中不令人期望的异味的产生显著减少，使得一组有经验的嗅探器能够立即分选盲样品。分析结果支持这些发现，并且与内部感官小组评述一致。
实例2
在pH 6.0或9.0下酵母细胞的裂解
使用由不可食用的食品发酵的肉汤制备表达大豆豆血红蛋白的巴斯德毕赤酵母的水性悬浮液。通过使用中试规模碟式离心机进行离心分离全细胞(阿法拉伐BRPX810SGV-34CG；进给速率：10LPM；初始放电定时器：5分钟；进给％SS：10-13；离心分离液固体％SS：55-60；2-10℃)。使用去离子水(2-10℃)以1∶1的比率重悬细胞。使用5M HCl或5MNaOH将细胞悬浮液的pH调节至pH 6.0或9.0，直到细胞悬浮液的pH稳定30分钟。使用小规模均质器(Gaulin 30CD；13,000-15,000psi；3次通过)，在冷却至2-10℃并且在各次通过之间进行pH调节的情况下，对细胞悬浮液进行裂解。通过使用中试规模碟式离心机的小规模模型以12,000x g离心20分钟来对经裂解的细胞进行澄清。将经澄清的裂解物(“离心分离液”)直接应用到中空纤维超滤膜(Koch Romicon部件编号：0721039；30kDa截留分子量(MWCO)，1.1mm直径纤维)，浓缩至约10％的干固体(DS)，并且使用去离子水在pH 6.0或pH9.0下渗滤。在冻干机中干燥后获得最终产物。干燥后，在大约7.0的最终pH下，制备使用每种最终产物的10％(w/v)悬浮液，并且使用混合流变仪(美国热分析仪器公司(TAInstruments)，DHR系列；4C/分钟步骤)分析。
使用pH 9.0对6.0具有若干令人期望的结果。离心后，相对于维持在pH 6.0的裂解物，维持在pH 9.0的经澄清的裂解物的蛋白质产率增加35％。当以10％(w/v)DS加热至95℃时，使用pH 9.0最终产物的热定型凝胶比从来自pH 6.0工艺的最终产物获得的凝胶强约10倍(即，更高的储能模量)。
实例3
在pH 6.0或9.0下细菌细胞的裂解
通过在37℃下在摇瓶中在溶源性肉汤(LSB培养基)中生长来制备大肠杆菌细胞(DH5α，总共8升)的培养物。通过使用地板模型实验室离心机以15,000xg离心20分钟来对全细胞进行分离。
使用
Figure BDA0004190539340001482
水(2-10℃)以1∶5的比率(克细胞沉淀物∶毫升水)重悬细胞。将细胞悬浮液分成两半，使用5M HCl或5M NaOH将pH调节至pH 6.0或9.0，直到细胞悬浮液的pH稳定30分钟。使用小规模均质器(Gaulin 30CD；13,000-15,000psi；3次通过)，在冷却至2-10℃并且在各次通过之间进行pH调节的情况下，对细胞悬浮液进行裂解。直接在30kDa透析膜(Pierce Slide-a-Lyzer)上对经裂解的细胞进行透析。
使用pH 9.0对6.0具有若干令人期望的结果：1)细胞裂解后释放的蛋白质增加了30％；2)热定型凝胶的储能模量(硬度)增加提高了约6倍(过程变体C的最终产物；pH 9对pH6；在
Figure BDA0004190539340001481
水中制备的10％w/v悬浮液至pH 7.0；通过如先前所描述的流变仪测定)；来自一系列类别的关键气味活性挥发物减少了30-75％(例如，3-辛酮、乙酸乙酯、吡嗪、壬醛、乙醛)。
实例4
在pH 6.5或9.5下蛋白质的纯化
在两个不同的实验中，使用相同的方法和材料从酿酒酵母的培养物中纯化总细胞蛋白，除了在整个纯化过程中溶液的pH为pH 6.5或pH 9.5之外。使用酵母屑粒或酵母膏以15-21％的最终干固体制备酿酒酵母的水性细胞悬浮液(CS)，如由制造商提供的。在酵母屑粒的情况下，使用milliQ水制备1∶1的悬浮液。使用珠粒研磨裂解酵母细胞，同时视情况将pH维持为6.5或9.5，以制备细胞裂解物。通过使用中试规模碟式离心机的小规模模型以8,000x g离心3分钟来对裂解物进行澄清。将经澄清的裂解物(“离心分离液”)在4℃下温育过夜。然后，一组受过训练的品尝师和嗅觉师对冷藏后的所得产物进行测试。通过在不存在其它视觉提示的情况下对变味进行评分，小组成员能够正确地从pH 9.5工艺样品中分选pH6.5。
实例5
在pH 9.5下蛋白质浓度或分离物的过滤、浓缩和/或脱盐
如先前实例中所示进行酵母细胞的裂解。可以任选地对材料进行微滤以去除过程中的微生物计数(例如，使用WaterSep Mini-BioProducer41，HF 0.2μm微型滤波器，目录号：WA 920 10MPR41 SG)，从而产生30％的改进的蛋白质通过率。使用或不使用微滤，可以使用超滤对材料进行浓缩、渗滤并且耗竭小分子。例如，在最终浓度降至10-16％的干固体之前，使用4-10渗滤体积将材料应用于WaterSep(目录号：BC 030 20GRA43 1L)和Koch(目录号：HF，6043-97-43-PM30两者)。所描述的碱性处理方法产生了一种优异的成分，其显示出改进的食品活性：烹饪时凝胶更硬(图3-5、10和11A-B)，具有更低的变味和异味(参见例如表4)。表2列出了通过此工艺产生的蛋白质的一些示例性规格。表3列出了与pH 6.5技术相比，pH 9.5技术的一些示例性益处。表4列出了可以通过pH 9.5技术耗竭的一些示例性化合物。
表2：材料规格
Figure BDA0004190539340001491
Figure BDA0004190539340001501
表3：使用与过滤组合的碱性工艺技术获得的工艺和组成益处
Figure BDA0004190539340001502
表4：使用碱性处理技术耗竭的小分子
Figure BDA0004190539340001511
实例6
蛋白质组合物中多肽完整性的测量结果
根据使用过程变体B或C(图2)，将来自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌的经干燥的蛋白质组合物置于
Figure BDA0004190539340001521
水中的10％(w/v)的材料的最终悬浮液中。使用NaOH或HCl将pH调节至pH 9.0，并且根据制造商的说明书，使用Pierce 660nm蛋白质测定试剂(目录号：22660)测量蛋白质浓度。然后，将悬浮液在具有新鲜添加的最终0.1mM DTT的1X最终浓度SDS-PAGE上样缓冲液(4x Laemmli样品缓冲液Bio-Rad#1610747)中调节至0.1mg/mL的最终蛋白质浓度。将样品以50-500uL等分试样在紧密密封的容器(1.7mL Eppendorf管)中在95℃下温育10分钟，以使蛋白质变性。根据制造商的说明书，在梯度(例如，4-10％聚丙烯酰胺)SDS-PAGE凝胶(伯乐标准凝胶(Bio-Rad Criterion gel)，目录号：5671091)上进行解析之前，将经加热的样品在20,000xg 25℃下澄清5分钟。取决于染色方法，每个凝胶泳道加载介于100ng-5μg之间的蛋白质。在相邻泳道中，根据制造商的建议，加载覆盖10-200kDa范围的分子量标记(伯乐精密加标记(Bio-Rad Precision Plus markers)，目录号：1610373)。在一个实例中，根据制造商的说明书，使用伯乐QC胶体考马斯染色(目录号：1610803)使蛋白质条带可视化。
在使用配备有图像实验室(Image Lab)的伯乐Gel Doc系统(目录号：1708270EDU)测量条带强度之前，对脱色的凝胶进行扫描。使用自动条带检测和分子量校准，对照所加载的标准品，对条带进行检测、定量和设定大小。将数据导出至Microsoft Excel。对单独的条带强度进行求和，以证明大于50％的单独的条带强度位于10kDa与200kDa之间。
实例7
过程变体前后缓冲能力的变化的测量结果
使用酿酒酵母细胞作为起始材料，源自开始(“裂解物”)和结束(“最终产物”)过程变体C(图2)的蛋白质组合物的两个独立的中试规模工艺复制品作为冻干粉末获得。制备每个重复的悬浮液(500mL)至2％(w/v)的最终悬浮液，将200mL转移到配备有磁力搅拌棒的玻璃烧杯中。将悬浮液充分混合(200rpm-700rpm)。使用配备有针对标准化缓冲溶液(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，目录号：810199)校准的pH探针(赛默飞世尔奥利龙模块(ThermoFisher Orion module)，目录号：VSTAR82)的pH计测量悬浮液的pH。
以0.2mL增量，添加5M NaOH，直到pH＝12.0+/-0.1单位。记录所添加的NaOH溶液的总体积，然后丢弃样品。用200mL悬浮液的新鲜等分试样重复所述过程，除了以0.2mL增量添加5M HCl的增量，直到pH＝3.0+/-0.1单位之外。记录所添加HCl溶液的总体积，然后丢弃样品。
为了计算每种悬浮液的缓冲能力，对在滴定期间添加的HCl和NaOH的总体积进行求和，并且以毫升(mL)为单位表示。将此数乘以5以获得将200mL的2％(w/v)溶液(4克干固体)从起始pH 3.0调节至最终pH 12.0所需的总毫摩尔(mmol)NaOH。使用此方法，蛋白质组合物(最终产物)仅需要2.5mmol/克干固体，而起始材料(裂解物)需要约50％以上的NaOH来实现相同的pH变化。
实例8
蛋白质组合物的硫化氢释放能力的量度
将来自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌的过程变体B或C(图2)的冻干最终产物悬浮于
Figure BDA0004190539340001531
水中的2％(w/v)，并且使用如上所述的用于测量缓冲能力的方法使用HCl将最终pH调节为约7.0。将5mL体积的经pH调节的样品转移到50mL Falcon锥形管(康宁公司(Corning)，目录号：352070)中。用25mM最终浓度的L-半胱氨酸(百灵威公司(Acros)，目录号：173600250)或所添加的等体积的水(对照)制备三份样品。将来自用于检测硫化氢(哈希HS-C，目录号：2537900)的哈希试剂盒的单个过滤器装配到每个管的帽中。将加帽的管在室温(25℃)下放置约24小时以检测释放的硫化氢。
使用标准曲线来确定所释放的硫化氢，如下所示。所使用的哈希检测试剂盒提供了用于确定硫化氢(以ppm表示)的一组参考图像。使用柯尼卡美能达色度计(KonicaMinolta Chroma Meter)CR-5 E350测量这些图像的比色强度，其中每个参考图像在黑色背景下测量。这在“b”通道(黄色)中产生了介于0ppm与1ppm硫化氢之间的线性标准曲线。为了确定四种未知样品(大肠杆菌(变体C)、毕赤酵母(变体B)、酵母(变体C)和酵母(变体B))中的硫化氢释放，用同一装置测量滤色，并且将“B”(黄色)强度与标准曲线进行比较。图6中给出的此测定的结果显示硫化氢释放的半胱氨酸依赖性增加。对照实验(图6和7)证明了此活性：1)从未添加L-半胱氨酸的酿酒酵母的起始裂解物中的高(＞1ppm)降低至在过程变体B或C的最终产物中不可检测；2)被盐酸吡哆醛抑制，这与巯基酶的特征一致(Yamagata和Takeshima(1976)《生物化学杂志(J.Biochem)》80：777)。在图7所示的实验中，来自酵母细胞的裂解物以最终约2％(w/v)通过以下来制备：在过程变体C期间，在均质器裂解后取过程中样品，对干固体进行定量，然后补充水(对照)，或补充至50mM最终浓度盐酸吡哆醛(pH 7)或50mM最终浓度半胱氨酸(pH 7)。如所描述使用HS-C硫化物检测过滤器测量硫化物释放并且与给定的试剂盒标准进行比较(在图7中示出)。要注意的是，吡哆醛抑制硫化物释放，而未渗滤的裂解物产生强烈的硫化物信号，所述硫化物信号在添加L-半胱氨酸后得到进一步增加。
实例9
测量裂解物、离心分离液和最终产物蛋白质组合物在加热期间的流变性
将来自酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母的过程变体B或C的冻干裂解物、离心分离液或最终产物悬浮于含10％(w/v)的
Figure BDA0004190539340001541
水，并且使用如上所述的用于测量缓冲能力的方法使用NaOH或HCl将最终pH调节为约7.0。将1.25mL体积的经pH调节的样品转移到混合流变仪(美国热分析仪器公司，DHR单位)中的钢(珀尔帖(Peltier))板。当温度以每分钟3℃的斜变速率从25℃上升至95℃时，根据制造商的建议测量储能模量。将所得储能模量数据以对数标度对对应的线性标度温度作图，从而得到图3、4和5。
实例10
测量疏水氨基酸的热暴露
将过程变体B或C的冻干裂解物、离心分离液或最终产品制备为各种pH(例如，pH6、7、8、9)和浓度(例如，0.5％、1％、2％w/v)的悬浮液。使用如在Lo等人(2004)《分析生物化学(Anal.Biochem.)》332(1)：153中描述的“热位移”方法测量在热变性期间相对和总荧光信号增加。使用工厂校准在伯乐CFX96(C1000 Touch)装置上运行样品。来自通道2(HEX)的数据被绘制为相对荧光强度(RFI)对温度。在以每分钟1℃的斜变速率从25℃上升至100℃期间，每分钟读取一次荧光。在减去基线和仅染料信号之后，将最大荧光指定为最大峰高度，以计算疏水暴露量。最大峰高度被认为是样品的“100％变性”。
实例11
粒径分布(PSD)的测量结果
以10％(w/v)制备酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母裂解物或最终产物(过程变体B或C)(图2)的悬浮液。将这些悬浮液分散在配备有Hydro MV单元的Malvern Mastersizer 3000单元中，直到遮蔽度达到约15％。使用以下仪器参数测量分布。材料性质：折射率：1.45；吸光度指数：0.001；密度：1g/cm3；分散剂：水；折射率：1.33；非球形颗粒；背景测量时间：10秒；样品测量时间：10秒；遮蔽极限：0.1％-50％；超声功率：50％；搅拌器：2000rpm。使用这些值和过程变体B和C，观察到如表2中所给出的PSD值：D10＜0.1μm；D50＜1.0μm；D90＜5μm。当使用pH 6工艺时，特性PSD值相当大，推测是由于静电介导的聚集。
实例12
微生物蛋白质样品的顶部空间概况的取样和表征
将在工艺pH 6.0-6.5(对照)或pH 9.0-9.5(测试)下制备的由酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌的微生物提取物(LY、CN、MF截留物、MF渗透物、UF截留物、UF渗透物、最终产物)制备的过程中样品全部用
Figure BDA0004190539340001551
水制成10％溶液(wt/wt)。用10M NaOH或3M HCl将所有样品调节至pH 6.5(或pH 9.5)。将3mL的每种样品放入20mL GCMS管中进行测量。为了评估挥发性化合物的产量，使用结合Leco Pegasus HT-C高通量TOFMS的Agilent 7890AGC连同Gerstel多功能取样器进行自动取样。使用Gerstel自动取样器对样品中的每个样品进行HS-SPME。使用2cm 50/30μm二乙烯基苯/羰基/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)、Stable flex、23Ga、自动取样器(Supleco公司(Supleco)，目录号：57299-U)SPME纤维，将每个样品在50℃下在250rpm搅拌下温育15分钟，然后在50℃下在250rpm搅拌下提取20分钟。
通过将SPME纤维解吸到Gerstel无隔膜头中在GCMS上运行经提取的样品，其中PTV入口设置为240℃持续60秒，并且使用Gerstel冷却注射系统(CIS)在-50℃下低温聚焦。将CIS在-50℃下保持0.1分钟，将温度以+12℃/秒升温至240℃并且在剩余运行时间内保持不变。将经解吸的样品在60米蜡柱(安捷伦公司(Agilent)，VF-WAXms 60m x 0.25mm x0.25mm，部件号：CP9207)上使用50分钟GC方法(35℃持续2分钟，以5℃/分钟升温，直到255℃，在255℃下保持4分钟)和1.5毫升/分钟的氦气流速在无分流模式下进行分离。将经分离的化合物用质谱仪进行分析，并且在20-500μ质量范围内收集所有数据，其中采集速率为10光谱/秒，并且检测器电压偏移为200。
然后使用针对Pegasus 4D(4.71.0.0版)优化的Leco ChromaTOF结合NIST MSSearch 2.2对样品进行分析。在两步过程中鉴定每个样品中每个峰的同一性。首先，使用650的类似性阈值，将信噪比大于30的每个峰的质谱与NIST库中的质谱进行匹配。另外，将内部开发的校准方法应用于数据集，以确认所关注化合物的同一性。在第二步中，使用ChromaTOF的统计比较函数来比对跨一组中的所有样品的命名分析。用于比对跨所有样品的单个峰的标准是匹配分数(跨所有样品的峰谱之间的类似性)为700，最大保留时间差为10秒，并且所述峰必须已经存在于至少两个样品中。
表4包含使用此技术测定的化合物。
实例13
另外的过程变体
进行另外的过程变体。图9A示出了用于处理细胞悬浮液(CS)的示例性过程变体，开始于碱性耗竭(AE)或还原(例如，用50mM L-半胱氨酸)(RD)。在一些情况下，细胞悬浮液经历预先巴氏杀菌(PZ1)，作为第一步(例如，单独的或以任何顺序与RD或AE组合)，或作为在RD或AE之后的步骤作为第一步。图9B示出了用于处理“进料”输入细胞的示例性过程变体，如来自图9A的过程的变体；一些过程变体使用机械裂解，并且一些过程变体依赖于细胞的穿孔，如由图9A中的处理产生的穿孔。
实例14
微生物细胞的化学和热处理通过简单地澄清混合物而实现实质性靶富集
微生物细胞(此处，表达大量靶蛋白的巴斯德毕赤酵母的菌株)不影响所有可检测蛋白的相对丰度(图12A)，但允许通过离心对细胞质靶标进行实质性纯化(图12B、12C)。在图12A中，示出了在水(“对照肉汤”)中洗涤并且用碱和热(“AE_PZ”)处理的毕赤酵母细胞的总蛋白质含量的相对丰度(在严格的机械和化学释放后通过鸟枪法质谱法测量)。这表明“AE_PZ”处理基本上没有改变总蛋白质含量。在图12B和12C中，示出了用碱和热处理，然后分离成固体部分(“AE_PZ_沉淀物”)和液体部分(“AE_PZ上清液”)的毕赤酵母细胞的蛋白质的相对丰度(通过鸟枪法质谱法)。图12B给液体部分中富集的蛋白质中的一些蛋白质，包含丰富的靶蛋白和细胞壁相关蛋白作注释。然而，机械裂解的细胞在澄清后没有显示出相对蛋白丰度的此类变化(图12D)。
实例15
化学和热处理可以简单地通过对细胞进行穿孔和去除固体来完全释放靶胞质蛋 白
将来自巴斯德毕赤酵母发酵的微生物细胞在冷水(RN)中洗涤。添加氢氧化钠(NaOH)直到搅拌悬浮液pH稳定在约pH 9，持续至少10分钟(碱性耗竭，或“AE”)。将AE悬浮液加热至60℃(PZ)，然后冷却至4℃。随后将材料以12-15kpsi通过均质器(HG)，同时冷却以测试是否提取了另外的蛋白质。在每个阶段，取出样品、离心，并且然后分析靶蛋白释放到上清液中的情况。图13显示半胱氨酸(50mM，在NaOH之前添加)处理改善了靶胞质蛋白的释放，并且即使没有半胱氨酸，超过75％的靶胞质蛋白在没有均质化的情况下被释放。
实例16
可以选择化学和热处理来控制粒径
通过如所描述的工艺处理来调节细胞絮凝，以促进固体去除以及重建细胞壁表面的粘附。图14A显示未添加还原剂的经洗涤的毕赤酵母细胞(“CW”)的粒径分布；将细胞在pH10.5下用碱性耗竭(“AE”)处理并且随后在60℃下加热(“AE/PZ”)。体积分数(竖轴)相对于以微米为单位的大小(横轴，对数标度)作图。图14B示出了添加食品安全还原剂(L-半胱氨酸，50mM)的经洗涤的细胞(“CW”)的粒径分布；随后将细胞在pH 10.5下进行碱性耗竭(“AE”)，然后加热至60C(“AE/PZ”)(如图14A所示的轴)。图14C显示如所指示处理的毕赤酵母细胞的光学显微镜的图像，示出了与图14A和14B中所示的粒径数据一致的聚集或分散。将细胞在冷水中以100X稀释，然后在可见光下以100X可视化。
实例17
蛋白质组合物I的性质
在中性水中制备过程变体1(参见图9B)的产物的10％(w/v)悬浮液，然后如表2中所描述进行测定。当加热至375℃时，悬浮液形成具有高弹性模量的凝胶(图15)，并且形成有弹性、有光泽的凝胶。
实例18
蛋白质组合物II的性质
通过以下形成水包油乳液：将植物油与过程变体1的产物的10％(w/v)悬浮液以1∶1的体积比组合，然后在室温下用手持式均质器混合。在375℃下加热时，乳液是稳定的。以此方式制备的乳液在以至多20,000x g离心下是稳定的，并且在4℃下储存若干天也是稳定的。
实例19
与未调节的pH相比，碱性处理会使酵母(巴斯德毕赤酵母)细胞去风味
说明在一些应用中pH对可能是不令人期望的化学品物种的影响。将微生物组合物调节至pH，调节至pH 4.0和10.5，以5,000x g离心10分钟，将上清液倾析，将细胞用水重构至起始体积并且充分混合。通过如表2所示的气相色谱质谱法对样品进行分析。“AE”去风味的一个实例是，在AE阶段pH(10.5)升高导致相对于pH 4.0工艺，风味化合物的去除增加(图16A和16B)。如表2中总结的测定样品。
公开了可以用于所公开的方法和组合物，可以与所公开的方法和组合物结合使用，可以用于制备所公开的方法和组合物，或者是所公开的方法和组合物的产物的方法和组合物。本文公开了这些和其它材料，并且应当理解，公开了这些方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。即，虽然没有明确公开具体提及这些组合物和方法的每种不同的和集体的组合和排列，但是在本文中具体考虑和描述了每一种组合和排列。例如，如果公开和讨论了具体的物质组合物或具体方法并且讨论了许多组合物或方法，则具体考虑了组合物和方法的每种组合和排列，除非明确指出相反。同样，还具体考虑和公开了这些组合物或方法的任何子集或组合。
应当理解，虽然本文已经结合多个不同的方面描述了方法和物质组合物，但是各个方面的前述描述旨在说明而非限制方法和物质组合物的范围。其它方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
其它实施例
应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 非凡食品有限公司（Impossible Foods Inc.）
<120> 碱性pH下的蛋白质纯化方法
<130> 38767-0247WO1
<160> 27
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 161
<212> PRT
<213> 绿豆（Vigna radiata）
<400> 1
Met Thr Thr Thr Leu Glu Arg Gly Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu
1 5 10 15
Val Val Lys Ser Trp Asn Val Met Lys Lys Asn Ser Gly Glu Leu Gly
20 25 30
Leu Lys Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Thr Val Pro Leu Glu Gln Asn Pro
50 55 60
Lys Leu Lys Pro His Ala Val Ser Val Phe Val Met Thr Cys Asp Ser
65 70 75 80
Ala Val Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Asn
85 90 95
Leu Lys Lys Leu Gly Ala Thr His Phe Arg Thr Gly Val Ala Asn Glu
100 105 110
His Phe Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala
115 120 125
Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Ala Met Lys Asn Ala Trp Gly Glu Ala
130 135 140
Tyr Asp Gln Leu Val Asp Ala Ile Lys Tyr Glu Met Lys Pro Pro Ser
145 150 155 160
Ser
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 地狱甲基嗜酸菌（Methylacidiphilum infernorum）
<400> 2
Met Ile Asp Gln Lys Glu Lys Glu Leu Ile Lys Glu Ser Trp Lys Arg
1 5 10 15
Ile Glu Pro Asn Lys Asn Glu Ile Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Asn Leu
20 25 30
Phe Lys Glu Glu Pro Thr Val Ser Val Leu Phe Gln Asn Pro Ile Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Arg Lys Leu Met Gln Val Leu Gly Ile Leu Val Gln Gly
50 55 60
Ile Asp Asn Leu Glu Gly Leu Ile Pro Thr Leu Gln Asp Leu Gly Arg
65 70 75 80
Arg His Lys Gln Tyr Gly Val Val Asp Ser His Tyr Pro Leu Val Gly
85 90 95
Asp Cys Leu Leu Lys Ser Ile Gln Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Phe Thr
100 105 110
Glu Glu Ala Lys Ala Ala Trp Thr Lys Val Tyr Gly Ile Ala Ala Gln
115 120 125
Val Met Thr Ala Glu
130
<210> 3
<211> 139
<212> PRT
<213> 超嗜热菌（Aquifex aeolicus）
<400> 3
Met Leu Ser Glu Glu Thr Ile Arg Val Ile Lys Ser Thr Val Pro Leu
1 5 10 15
Leu Lys Glu His Gly Thr Glu Ile Thr Ala Arg Met Tyr Glu Leu Leu
20 25 30
Phe Ser Lys Tyr Pro Lys Thr Lys Glu Leu Phe Ala Gly Ala Ser Glu
35 40 45
Glu Gln Pro Lys Lys Leu Ala Asn Ala Ile Ile Ala Tyr Ala Thr Tyr
50 55 60
Ile Asp Arg Leu Glu Glu Leu Asp Asn Ala Ile Ser Thr Ile Ala Arg
65 70 75 80
Ser His Val Arg Arg Asn Val Lys Pro Glu His Tyr Pro Leu Val Lys
85 90 95
Glu Cys Leu Leu Gln Ala Ile Glu Glu Val Leu Asn Pro Gly Glu Glu
100 105 110
Val Leu Lys Ala Trp Glu Glu Ala Tyr Asp Phe Leu Ala Lys Thr Leu
115 120 125
Ile Thr Leu Glu Lys Lys Leu Tyr Ser Gln Pro
130 135
<210> 4
<211> 145
<212> PRT
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 4
Met Gly Ala Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Ser Ser Ser Phe
1 5 10 15
Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr
20 25 30
Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Ser Asn Gly Val Asp Pro Ser Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu
50 55 60
Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Gly Gln Leu Lys Ala Asn
65 70 75 80
Gly Thr Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys
85 90 95
Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys
100 105 110
Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser
115 120 125
Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala
130 135 140
Phe
145
<210> 5
<211> 162
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 5
Met Ser Ala Ala Glu Gly Ala Val Val Phe Ser Glu Glu Lys Glu Ala
1 5 10 15
Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Ile Met Lys Lys Asp Ser Ala Asn Leu
20 25 30
Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Arg
35 40 45
Gln Met Phe Pro Phe Leu Arg Asp Ser Asp Val Pro Leu Glu Thr Asn
50 55 60
Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Val Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ile Thr Val Arg Glu Thr
85 90 95
Thr Leu Lys Arg Leu Gly Gly Thr His Leu Lys Tyr Gly Val Ala Asp
100 105 110
Gly His Phe Glu Val Thr Arg Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu
115 120 125
Ala Leu Pro Ala Asp Met Trp Gly Pro Glu Met Arg Asn Ala Trp Gly
130 135 140
Glu Ala Tyr Asp Gln Leu Val Ala Ala Ile Lys Gln Glu Met Lys Pro
145 150 155 160
Ala Glu
<210> 6
<211> 1153
<212> PRT
<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）
<400> 6
Met Asp Gly Ala Val Arg Leu Asp Trp Thr Gly Leu Asp Leu Thr Gly
1 5 10 15
His Glu Ile His Asp Gly Val Pro Ile Ala Ser Arg Val Gln Val Met
20 25 30
Val Ser Phe Pro Leu Phe Lys Asp Gln His Ile Ile Met Ser Ser Lys
35 40 45
Glu Ser Pro Ser Arg Lys Ser Ser Thr Ile Gly Gln Ser Thr Arg Asn
50 55 60
Gly Ser Cys Gln Ala Asp Thr Gln Lys Gly Gln Leu Pro Pro Val Gly
65 70 75 80
Glu Lys Pro Lys Pro Val Lys Glu Asn Pro Met Lys Lys Leu Lys Glu
85 90 95
Met Ser Gln Arg Pro Leu Pro Thr Gln His Gly Asp Gly Thr Tyr Pro
100 105 110
Thr Glu Lys Lys Leu Thr Gly Ile Gly Glu Asp Leu Lys His Ile Arg
115 120 125
Gly Tyr Asp Val Lys Thr Leu Leu Ala Met Val Lys Ser Lys Leu Lys
130 135 140
Gly Glu Lys Leu Lys Asp Asp Lys Thr Met Leu Met Glu Arg Val Met
145 150 155 160
Gln Leu Val Ala Arg Leu Pro Thr Glu Ser Lys Lys Arg Ala Glu Leu
165 170 175
Thr Asp Ser Leu Ile Asn Glu Leu Trp Glu Ser Leu Asp His Pro Pro
180 185 190
Leu Asn Tyr Leu Gly Pro Glu His Ser Tyr Arg Thr Pro Asp Gly Ser
195 200 205
Tyr Asn His Pro Phe Asn Pro Gln Leu Gly Ala Ala Gly Ser Arg Tyr
210 215 220
Ala Arg Ser Val Ile Pro Thr Val Thr Pro Pro Gly Ala Leu Pro Asp
225 230 235 240
Pro Gly Leu Ile Phe Asp Ser Ile Met Gly Arg Thr Pro Asn Ser Tyr
245 250 255
Arg Lys His Pro Asn Asn Val Ser Ser Ile Leu Trp Tyr Trp Ala Thr
260 265 270
Ile Ile Ile His Asp Ile Phe Trp Thr Asp Pro Arg Asp Ile Asn Thr
275 280 285
Asn Lys Ser Ser Ser Tyr Leu Asp Leu Ala Pro Leu Tyr Gly Asn Ser
290 295 300
Gln Glu Met Gln Asp Ser Ile Arg Thr Phe Lys Asp Gly Arg Met Lys
305 310 315 320
Pro Asp Cys Tyr Ala Asp Lys Arg Leu Ala Gly Met Pro Pro Gly Val
325 330 335
Ser Val Leu Leu Ile Met Phe Asn Arg Phe His Asn His Val Ala Glu
340 345 350
Asn Leu Ala Leu Ile Asn Glu Gly Gly Arg Phe Asn Lys Pro Ser Asp
355 360 365
Leu Leu Glu Gly Glu Ala Arg Glu Ala Ala Trp Lys Lys Tyr Asp Asn
370 375 380
Asp Leu Phe Gln Val Ala Arg Leu Val Thr Ser Gly Leu Tyr Ile Asn
385 390 395 400
Ile Thr Leu Val Asp Tyr Val Arg Asn Ile Val Asn Leu Asn Arg Val
405 410 415
Asp Thr Thr Trp Thr Leu Asp Pro Arg Gln Asp Ala Gly Ala His Val
420 425 430
Gly Thr Ala Asp Gly Ala Glu Arg Gly Thr Gly Asn Ala Val Ser Ala
435 440 445
Glu Phe Asn Leu Cys Tyr Arg Trp His Ser Cys Ile Ser Glu Lys Asp
450 455 460
Ser Lys Phe Val Glu Ala Gln Phe Gln Asn Ile Phe Gly Lys Pro Ala
465 470 475 480
Ser Glu Val Arg Pro Asp Glu Met Trp Lys Gly Phe Ala Lys Met Glu
485 490 495
Gln Asn Thr Pro Ala Asp Pro Gly Gln Arg Thr Phe Gly Gly Phe Lys
500 505 510
Arg Gly Pro Asp Gly Lys Phe Asp Asp Asp Asp Leu Val Arg Cys Ile
515 520 525
Ser Glu Ala Val Glu Asp Val Ala Gly Ala Phe Gly Ala Arg Asn Val
530 535 540
Pro Gln Ala Met Lys Val Val Glu Thr Met Gly Ile Ile Gln Gly Arg
545 550 555 560
Lys Trp Asn Val Ala Gly Leu Asn Glu Phe Arg Lys His Phe His Leu
565 570 575
Lys Pro Tyr Ser Thr Phe Glu Asp Ile Asn Ser Asp Pro Gly Val Ala
580 585 590
Glu Ala Leu Arg Arg Leu Tyr Asp His Pro Asp Asn Val Glu Leu Tyr
595 600 605
Pro Gly Leu Val Ala Glu Glu Asp Lys Gln Pro Met Val Pro Gly Val
610 615 620
Gly Ile Ala Pro Thr Tyr Thr Ile Ser Arg Val Val Leu Ser Asp Ala
625 630 635 640
Val Cys Leu Val Arg Gly Asp Arg Phe Tyr Thr Thr Asp Phe Thr Pro
645 650 655
Arg Asn Leu Thr Asn Trp Gly Tyr Lys Glu Val Asp Tyr Asp Leu Ser
660 665 670
Val Asn His Gly Cys Val Phe Tyr Lys Leu Phe Ile Arg Ala Phe Pro
675 680 685
Asn His Phe Lys Gln Asn Ser Val Tyr Ala His Tyr Pro Met Val Val
690 695 700
Pro Ser Glu Asn Lys Arg Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Ala Asp Leu
705 710 715 720
Phe Asp Phe Glu Ala Pro Lys Tyr Ile Pro Pro Arg Val Asn Ile Thr
725 730 735
Ser Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr Ile Leu Glu Thr Gln Glu Lys Tyr Lys
740 745 750
Val Thr Trp His Glu Gly Leu Gly Phe Leu Met Gly Glu Gly Gly Leu
755 760 765
Lys Phe Met Leu Ser Gly Asp Asp Pro Leu His Ala Gln Gln Arg Lys
770 775 780
Cys Met Ala Ala Gln Leu Tyr Lys Asp Gly Trp Thr Glu Ala Val Lys
785 790 795 800
Ala Phe Tyr Ala Gly Met Met Glu Glu Leu Leu Val Ser Lys Ser Tyr
805 810 815
Phe Leu Gly Asn Asn Lys His Arg His Val Asp Ile Ile Arg Asp Val
820 825 830
Gly Asn Met Val His Val His Phe Ala Ser Gln Val Phe Gly Leu Pro
835 840 845
Leu Lys Thr Ala Lys Asn Pro Thr Gly Val Phe Thr Glu Gln Glu Met
850 855 860
Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Ile Phe Thr Thr Ile Phe Phe Asp Leu Asp
865 870 875 880
Pro Ser Lys Ser Phe Pro Leu Arg Thr Lys Thr Arg Glu Val Cys Gln
885 890 895
Lys Leu Ala Lys Leu Val Glu Ala Asn Val Lys Leu Ile Asn Lys Ile
900 905 910
Pro Trp Ser Arg Gly Met Phe Val Gly Lys Pro Ala Lys Asp Glu Pro
915 920 925
Leu Ser Ile Tyr Gly Lys Thr Met Ile Lys Gly Leu Lys Ala His Gly
930 935 940
Leu Ser Asp Tyr Asp Ile Ala Trp Ser His Val Val Pro Thr Ser Gly
945 950 955 960
Ala Met Val Pro Asn Gln Ala Gln Val Phe Ala Gln Ala Val Asp Tyr
965 970 975
Tyr Leu Ser Pro Ala Gly Met His Tyr Ile Pro Glu Ile His Met Val
980 985 990
Ala Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Thr Asp Ala Leu Leu Leu Gly Tyr
995 1000 1005
Ala Met Glu Gly Ile Arg Leu Ala Gly Thr Phe Gly Ser Tyr Arg
1010 1015 1020
Glu Ala Ala Val Asp Asp Val Val Lys Glu Asp Asn Gly Arg Gln
1025 1030 1035
Val Pro Val Lys Ala Gly Asp Arg Val Phe Val Ser Phe Val Asp
1040 1045 1050
Ala Ala Arg Asp Pro Lys His Phe Pro Asp Pro Glu Val Val Asn
1055 1060 1065
Pro Arg Arg Pro Ala Lys Lys Tyr Ile His Tyr Gly Val Gly Pro
1070 1075 1080
His Ala Cys Leu Gly Arg Asp Ala Ser Gln Ile Ala Ile Thr Glu
1085 1090 1095
Met Phe Arg Cys Leu Phe Arg Arg Arg Asn Val Arg Arg Val Pro
1100 1105 1110
Gly Pro Gln Gly Glu Leu Lys Lys Val Pro Arg Pro Gly Gly Phe
1115 1120 1125
Tyr Val Tyr Met Arg Glu Asp Trp Gly Gly Leu Phe Pro Phe Pro
1130 1135 1140
Val Thr Met Arg Val Met Trp Asp Asp Glu
1145 1150
<210> 7
<211> 530
<212> PRT
<213> 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）
<400> 7
Met Lys Gly Ser Ala Thr Leu Ala Phe Ala Leu Val Gln Phe Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Gln Leu Val Trp Pro Ser Lys Trp Asp Glu Val Glu Asp Leu
20 25 30
Leu Tyr Met Gln Gly Gly Phe Asn Lys Arg Gly Phe Ala Asp Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Cys Glu Phe Gly Ser Asn Val Pro Gly Thr Gln Asn Thr Ala
50 55 60
Glu Trp Leu Arg Thr Ala Phe His Asp Ala Ile Thr His Asp Ala Lys
65 70 75 80
Ala Gly Thr Gly Gly Leu Asp Ala Ser Ile Tyr Trp Glu Ser Ser Arg
85 90 95
Pro Glu Asn Pro Gly Lys Ala Phe Asn Asn Thr Phe Gly Phe Phe Ser
100 105 110
Gly Phe His Asn Pro Arg Ala Thr Ala Ser Asp Leu Thr Ala Leu Gly
115 120 125
Thr Val Leu Ala Val Gly Ala Cys Asn Gly Pro Arg Ile Pro Phe Arg
130 135 140
Ala Gly Arg Ile Asp Ala Tyr Lys Ala Gly Pro Ala Gly Val Pro Glu
145 150 155 160
Pro Ser Thr Asn Leu Lys Asp Thr Phe Ala Ala Phe Thr Lys Ala Gly
165 170 175
Phe Thr Lys Glu Glu Met Thr Ala Met Val Ala Cys Gly His Ala Ile
180 185 190
Gly Gly Val His Ser Val Asp Phe Pro Glu Ile Val Gly Ile Lys Ala
195 200 205
Asp Pro Asn Asn Asp Thr Asn Val Pro Phe Gln Lys Asp Val Ser Ser
210 215 220
Phe His Asn Gly Ile Val Thr Glu Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Lys Asn
225 230 235 240
Pro Leu Val Ala Ser Lys Asn Ala Thr Phe His Ser Asp Lys Arg Ile
245 250 255
Phe Asp Asn Asp Lys Ala Thr Met Lys Lys Leu Ser Thr Lys Ala Gly
260 265 270
Phe Asn Ser Met Cys Ala Asp Ile Leu Thr Arg Met Ile Asp Thr Val
275 280 285
Pro Lys Ser Val Gln Leu Thr Pro Val Leu Glu Ala Tyr Asp Val Arg
290 295 300
Pro Tyr Ile Thr Glu Leu Ser Leu Asn Asn Lys Asn Lys Ile His Phe
305 310 315 320
Thr Gly Ser Val Arg Val Arg Ile Thr Asn Asn Ile Arg Asp Asn Asn
325 330 335
Asp Leu Ala Ile Asn Leu Ile Tyr Val Gly Arg Asp Gly Lys Lys Val
340 345 350
Thr Val Pro Thr Gln Gln Val Thr Phe Gln Gly Gly Thr Ser Phe Gly
355 360 365
Ala Gly Glu Val Phe Ala Asn Phe Glu Phe Asp Thr Thr Met Asp Ala
370 375 380
Lys Asn Gly Ile Thr Lys Phe Phe Ile Gln Glu Val Lys Pro Ser Thr
385 390 395 400
Lys Ala Thr Val Thr His Asp Asn Gln Lys Thr Gly Gly Tyr Lys Val
405 410 415
Asp Asp Thr Val Leu Tyr Gln Leu Gln Gln Ser Cys Ala Val Leu Glu
420 425 430
Lys Leu Pro Asn Ala Pro Leu Val Val Thr Ala Met Val Arg Asp Ala
435 440 445
Arg Ala Lys Asp Ala Leu Thr Leu Arg Val Ala His Lys Lys Pro Val
450 455 460
Lys Gly Ser Ile Val Pro Arg Phe Gln Thr Ala Ile Thr Asn Phe Lys
465 470 475 480
Ala Thr Gly Lys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Gly Phe Gln Ala Lys Thr
485 490 495
Met Phe Glu Glu Gln Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Val Leu Gly Gly Ser
500 505 510
Pro Ala Ser Gly Val Gln Phe Leu Thr Ser Gln Ala Met Pro Ser Gln
515 520 525
Cys Ser
530
<210> 8
<211> 358
<212> PRT
<213> 禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）
<400> 8
Met Ala Ser Ala Thr Arg Gln Phe Ala Arg Ala Ala Thr Arg Ala Thr
1 5 10 15
Arg Asn Gly Phe Ala Ile Ala Pro Arg Gln Val Ile Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Arg Arg Tyr Tyr Ser Ser Glu Pro Ala Gln Lys Ser Ser Ser Ala Trp
35 40 45
Ile Trp Leu Thr Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Phe
50 55 60
Tyr Gly Asn Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Lys Val Phe Asn Pro Ser
65 70 75 80
Lys Glu Asp Tyr Gln Lys Val Tyr Asn Glu Ile Ala Ala Arg Leu Glu
85 90 95
Glu Lys Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Pro Val Leu Val Arg
100 105 110
Leu Ala Trp His Ala Ser Gly Thr Tyr Asp Lys Glu Thr Gly Thr Gly
115 120 125
Gly Ser Asn Gly Ala Thr Met Arg Phe Ala Pro Glu Ser Asp His Gly
130 135 140
Ala Asn Ala Gly Leu Ala Ala Ala Arg Asp Phe Leu Gln Pro Val Lys
145 150 155 160
Glu Lys Phe Pro Trp Ile Thr Tyr Ser Asp Leu Trp Ile Leu Ala Gly
165 170 175
Val Cys Ala Ile Gln Glu Met Leu Gly Pro Ala Ile Pro Tyr Arg Pro
180 185 190
Gly Arg Ser Asp Arg Asp Val Ser Gly Cys Thr Pro Asp Gly Arg Leu
195 200 205
Pro Asp Ala Ser Lys Arg Gln Asp His Leu Arg Gly Ile Phe Gly Arg
210 215 220
Met Gly Phe Asn Asp Gln Glu Ile Val Ala Leu Ser Gly Ala His Ala
225 230 235 240
Leu Gly Arg Cys His Thr Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Pro Trp Thr
245 250 255
Phe Ser Pro Thr Val Leu Thr Asn Asp Tyr Phe Arg Leu Leu Val Glu
260 265 270
Glu Lys Trp Gln Trp Lys Lys Trp Asn Gly Pro Ala Gln Tyr Glu Asp
275 280 285
Lys Ser Thr Lys Ser Leu Met Met Leu Pro Ser Asp Ile Ala Leu Ile
290 295 300
Glu Asp Lys Lys Phe Lys Pro Trp Val Glu Lys Tyr Ala Lys Asp Asn
305 310 315 320
Asp Ala Phe Phe Lys Asp Phe Ser Asn Val Val Leu Arg Leu Phe Glu
325 330 335
Leu Gly Val Pro Phe Ala Gln Gly Thr Glu Asn Gln Arg Trp Thr Phe
340 345 350
Lys Pro Thr His Gln Glu
355
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 卵配衣藻（Chlamydomonas eugametos）
<400> 9
Met Ser Leu Phe Ala Lys Leu Gly Gly Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asp Lys Phe Tyr Asn Lys Ile Val Ala Asp Pro Thr Val Ser Thr
20 25 30
Tyr Phe Ser Asn Thr Asp Met Lys Val Gln Arg Ser Lys Gln Phe Ala
35 40 45
Phe Leu Ala Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Ser Glu Trp Lys Gly Lys Asp
50 55 60
Met Arg Thr Ala His Lys Asp Leu Val Pro His Leu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Phe Gln Ala Val Ala Arg His Leu Ser Asp Thr Leu Thr Glu Leu Gly
85 90 95
Val Pro Pro Glu Asp Ile Thr Asp Ala Met Ala Val Val Ala Ser Thr
100 105 110
Arg Thr Glu Val Leu Asn Met Pro Gln Gln
115 120
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 梨形四膜虫（Tetrahymena pyriformis）
<400> 10
Met Asn Lys Pro Gln Thr Ile Tyr Glu Lys Leu Gly Gly Glu Asn Ala
1 5 10 15
Met Lys Ala Ala Val Pro Leu Phe Tyr Lys Lys Val Leu Ala Asp Glu
20 25 30
Arg Val Lys His Phe Phe Lys Asn Thr Asp Met Asp His Gln Thr Lys
35 40 45
Gln Gln Thr Asp Phe Leu Thr Met Leu Leu Gly Gly Pro Asn His Tyr
50 55 60
Lys Gly Lys Asn Met Thr Glu Ala His Lys Gly Met Asn Leu Gln Asn
65 70 75 80
Leu His Phe Asp Ala Ile Ile Glu Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Glu
85 90 95
Leu Gly Val Thr Asp Ala Val Ile Asn Glu Ala Ala Lys Val Ile Glu
100 105 110
His Thr Arg Lys Asp Met Leu Gly Lys
115 120
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> 大草履虫（Paramecium caudatum）
<400> 11
Met Ser Leu Phe Glu Gln Leu Gly Gly Gln Ala Ala Val Gln Ala Val
1 5 10 15
Thr Ala Gln Phe Tyr Ala Asn Ile Gln Ala Asp Ala Thr Val Ala Thr
20 25 30
Phe Phe Asn Gly Ile Asp Met Pro Asn Gln Thr Asn Lys Thr Ala Ala
35 40 45
Phe Leu Cys Ala Ala Leu Gly Gly Pro Asn Ala Trp Thr Gly Arg Asn
50 55 60
Leu Lys Glu Val His Ala Asn Met Gly Val Ser Asn Ala Gln Phe Thr
65 70 75 80
Thr Val Ile Gly His Leu Arg Ser Ala Leu Thr Gly Ala Gly Val Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Val Glu Gln Thr Val Ala Val Ala Glu Thr Val Arg Gly
100 105 110
Asp Val Val Thr Val
115
<210> 12
<211> 147
<212> PRT
<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）
<400> 12
Met Pro Leu Thr Pro Glu Gln Ile Lys Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro
1 5 10 15
Val Leu Gln Glu Tyr Gly Thr Lys Ile Thr Thr Ala Phe Tyr Met Asn
20 25 30
Met Ser Thr Val His Pro Glu Leu Asn Ala Val Phe Asn Thr Ala Asn
35 40 45
Gln Val Lys Gly His Gln Ala Arg Ala Leu Ala Gly Ala Leu Phe Ala
50 55 60
Tyr Ala Ser His Ile Asp Asp Leu Gly Ala Leu Gly Pro Ala Val Glu
65 70 75 80
Leu Ile Cys Asn Lys His Ala Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Asp Glu Tyr
85 90 95
Lys Ile Val Gly Lys Tyr Leu Leu Glu Ala Met Lys Glu Val Leu Gly
100 105 110
Asp Ala Cys Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Ala Ala Tyr Trp
115 120 125
Ala Leu Ala Asp Ile Met Ile Asn Arg Glu Ala Ala Leu Tyr Lys Gln
130 135 140
Ser Gln Gly
145
<210> 13
<211> 165
<212> PRT
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 13
Met Ala Leu Ala Glu Ala Asp Asp Gly Ala Val Val Phe Gly Glu Glu
1 5 10 15
Gln Glu Ala Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Val Met Lys Lys Asp Ala
20 25 30
Ala Asn Leu Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Val Phe Glu Ile Ala Pro
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Asp Val Pro Leu
50 55 60
Glu Lys Asn Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Met Ser Val Phe Val Met
65 70 75 80
Thr Cys Glu Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val
85 90 95
Arg Glu Thr Thr Leu Lys Arg Leu Gly Ala Thr His Leu Arg Tyr Gly
100 105 110
Val Ala Asp Gly His Phe Glu Val Thr Gly Phe Ala Leu Leu Glu Thr
115 120 125
Ile Lys Glu Ala Leu Pro Ala Asp Met Trp Ser Leu Glu Met Lys Lys
130 135 140
Ala Trp Ala Glu Ala Tyr Ser Gln Leu Val Ala Ala Ile Lys Arg Glu
145 150 155 160
Met Lys Pro Asp Ala
165
<210> 14
<211> 169
<212> PRT
<213> 粳稻（Oryza sativa subsp. japonica）
<400> 14
Met Ala Leu Val Glu Gly Asn Asn Gly Val Ser Gly Gly Ala Val Ser
1 5 10 15
Phe Ser Glu Glu Gln Glu Ala Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Ile Met
20 25 30
Lys Lys Asp Ser Ala Asn Ile Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Ile Phe
35 40 45
Glu Val Ala Pro Ser Ala Ser Gln Met Phe Ser Phe Leu Arg Asn Ser
50 55 60
Asp Val Pro Leu Glu Lys Asn Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Met Ser
65 70 75 80
Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly
85 90 95
Lys Val Thr Val Arg Asp Thr Thr Leu Lys Arg Leu Gly Ala Thr His
100 105 110
Phe Lys Tyr Gly Val Gly Asp Ala His Phe Glu Val Thr Arg Phe Ala
115 120 125
Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala Val Pro Val Asp Met Trp Ser Pro
130 135 140
Ala Met Lys Ser Ala Trp Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Leu Val Ala Ala
145 150 155 160
Ile Lys Gln Glu Met Lys Pro Ala Glu
165
<210> 15
<211> 160
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 15
Met Glu Ser Glu Gly Lys Ile Val Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu
1 5 10 15
Val Val Lys Ser Trp Ser Val Met Lys Lys Asn Ser Ala Glu Leu Gly
20 25 30
Leu Lys Leu Phe Ile Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Thr Thr Lys Lys
35 40 45
Met Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Pro Ile Pro Ala Glu Gln Asn Pro
50 55 60
Lys Leu Lys Pro His Ala Met Ser Val Phe Val Met Cys Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ala Val Gln Leu Arg Lys Thr Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Thr Thr
85 90 95
Leu Lys Arg Leu Gly Ala Ser His Ser Lys Tyr Gly Val Val Asp Glu
100 105 110
His Phe Glu Val Ala Lys Tyr Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala
115 120 125
Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Glu Met Lys Val Ala Trp Gly Gln Ala
130 135 140
Tyr Asp His Leu Val Ala Ala Ile Lys Ala Glu Met Asn Leu Ser Asn
145 150 155 160
<210> 16
<211> 147
<212> PRT
<213> 豌豆（Pisum sativum）
<400> 16
Met Gly Phe Thr Asp Lys Gln Glu Ala Leu Val Asn Ser Ser Trp Glu
1 5 10 15
Ser Phe Lys Gln Asn Leu Ser Gly Asn Ser Ile Leu Phe Tyr Thr Ile
20 25 30
Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe Ser Phe Leu Lys
35 40 45
Asp Thr Ala Gly Val Glu Asp Ser Pro Lys Leu Gln Ala His Ala Glu
50 55 60
Gln Val Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Ala Gln Leu Arg Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Val Val Leu Gly Asn Ala Thr Leu Gly Ala Ile His Val Gln
85 90 95
Arg Gly Val Thr Asp Pro His Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu
100 105 110
Gln Thr Ile Lys Lys Ala Ser Gly Asn Asn Trp Ser Glu Glu Leu Asn
115 120 125
Thr Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Gly Leu Ala Thr Ala Ile Lys Lys
130 135 140
Ala Met Thr
145
<210> 17
<211> 145
<212> PRT
<213> 豇豆（Vigna unguiculata）
<400> 17
Met Val Ala Phe Ser Asp Lys Gln Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Lys Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr
20 25 30
Thr Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asn Leu Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Ala Asn Gly Val Asp Ala Thr Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu
50 55 60
Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Ala Gln Leu Arg Ala Ser
65 70 75 80
Gly Gly Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ala Val His Ser Gln Lys
85 90 95
Ala Val Asn Asp Ala Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Val Lys
100 105 110
Thr Leu Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Gly Thr
115 120 125
Ala Val Glu Leu Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala
130 135 140
Tyr
145
<210> 18
<211> 154
<212> PRT
<213> 家牛（Bos taurus）
<400> 18
Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Ala Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg
20 25 30
Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys
35 40 45
His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys
50 55 60
His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Gly His His Glu Ala Glu Val Lys His Leu Ala Glu Ser His Ala Asn
85 90 95
Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile
100 105 110
Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala
115 120 125
Gln Ala Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala
130 135 140
Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe His Gly
145 150
<210> 19
<211> 154
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 19
Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Val Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg
20 25 30
Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys
35 40 45
His Leu Lys Ser Glu Asp Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys
50 55 60
His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Gly His His Glu Ala Glu Leu Thr Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr
85 90 95
Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Ala Ile
100 105 110
Ile Gln Val Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala
115 120 125
Gln Gly Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala
130 135 140
Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly
145 150
<210> 20
<211> 154
<212> PRT
<213> 家马（Equus caballus）
<400> 20
Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Gln Val Leu Asn Val Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Glu Ala Asp Ile Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg
20 25 30
Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys
35 40 45
His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys
50 55 60
His Gly Thr Val Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Gly His His Glu Ala Glu Leu Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr
85 90 95
Lys His Lys Ile Pro Ile Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile
100 105 110
Ile His Val Leu His Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala
115 120 125
Gln Gly Ala Met Thr Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Ile Ala
130 135 140
Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly
145 150
<210> 21
<211> 152
<212> PRT
<213> 本氏烟（Nicotiana benthamiana）
<400> 21
Met Ser Ser Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu Val Val Lys Ser Trp
1 5 10 15
Asp Ser Met Lys Lys Asn Ala Gly Glu Trp Gly Leu Lys Leu Phe Leu
20 25 30
Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Lys Lys Leu Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Lys Asp Ser Asn Val Pro Leu Glu Gln Asn Ala Lys Leu Lys Pro His
50 55 60
Ser Lys Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ala Ala Val Gln Leu Arg
65 70 75 80
Lys Ala Gly Lys Val Val Val Arg Asp Ser Thr Leu Lys Lys Leu Gly
85 90 95
Ala Thr His Phe Lys Tyr Gly Val Ala Asp Glu His Phe Glu Val Thr
100 105 110
Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala Val Pro Glu Met Trp
115 120 125
Ser Val Asp Met Lys Asn Ala Trp Gly Glu Ala Phe Asp Gln Leu Val
130 135 140
Asn Ala Ile Lys Thr Glu Met Lys
145 150
<210> 22
<211> 132
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 22
Met Gly Gln Ser Phe Asn Ala Pro Tyr Glu Ala Ile Gly Glu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Gln Leu Val Asp Thr Phe Tyr Glu Arg Val Ala Ser His Pro
20 25 30
Leu Leu Lys Pro Ile Phe Pro Ser Asp Leu Thr Glu Thr Ala Arg Lys
35 40 45
Gln Lys Gln Phe Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Gly Pro Pro Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Glu His Gly His Pro Met Leu Arg Ala Arg His Leu Pro Phe Pro
65 70 75 80
Ile Thr Asn Glu Arg Ala Asp Ala Trp Leu Ser Cys Met Lys Asp Ala
85 90 95
Met Asp His Val Gly Leu Glu Gly Glu Ile Arg Glu Phe Leu Phe Gly
100 105 110
Arg Leu Glu Leu Thr Ala Arg His Met Val Asn Gln Thr Glu Ala Glu
115 120 125
Asp Arg Ser Ser
130
<210> 23
<211> 131
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 23
Met Thr Thr Ser Glu Asn Phe Tyr Asp Ser Val Gly Gly Glu Glu Thr
1 5 10 15
Phe Ser Leu Ile Val His Arg Phe Tyr Glu Gln Val Pro Asn Asp Asp
20 25 30
Ile Leu Gly Pro Met Tyr Pro Pro Asp Asp Phe Glu Gly Ala Glu Gln
35 40 45
Arg Leu Lys Met Phe Leu Ser Gln Tyr Trp Gly Gly Pro Lys Asp Tyr
50 55 60
Gln Glu Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Met Arg His Val Asn Tyr
65 70 75 80
Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Glu Arg Trp Leu Gln Leu Met Ser Asn
85 90 95
Ala Leu Asp Gly Val Asp Leu Thr Ala Glu Gln Arg Glu Ala Ile Trp
100 105 110
Glu His Met Val Arg Ala Ala Asp Met Leu Ile Asn Ser Asn Pro Asp
115 120 125
Pro His Ala
130
<210> 24
<211> 124
<212> PRT
<213> 集胞藻（Synechocystis sp.）
<400> 24
Met Ser Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Gly Thr Thr Ala Val Asp Leu
1 5 10 15
Ala Val Asp Lys Phe Tyr Glu Arg Val Leu Gln Asp Asp Arg Ile Lys
20 25 30
His Phe Phe Ala Asp Val Asp Met Ala Lys Gln Arg Ala His Gln Lys
35 40 45
Ala Phe Leu Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Thr Asp Lys Tyr Asp Gly Arg
50 55 60
Tyr Met Arg Glu Ala His Lys Glu Leu Val Glu Asn His Gly Leu Asn
65 70 75 80
Gly Glu His Phe Asp Ala Val Ala Glu Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys
85 90 95
Glu Met Gly Val Pro Glu Asp Leu Ile Ala Glu Val Ala Ala Val Ala
100 105 110
Gly Ala Pro Ala His Lys Arg Asp Val Leu Asn Gln
115 120
<210> 25
<211> 183
<212> PRT
<213> 聚球藻（Synechococcus sp.）
<400> 25
Met Asp Val Ala Leu Leu Glu Lys Ser Phe Glu Gln Ile Ser Pro Arg
1 5 10 15
Ala Ile Glu Phe Ser Ala Ser Phe Tyr Gln Asn Leu Phe His His His
20 25 30
Pro Glu Leu Lys Pro Leu Phe Ala Glu Thr Ser Gln Thr Ile Gln Glu
35 40 45
Lys Lys Leu Ile Phe Ser Leu Ala Ala Ile Ile Glu Asn Leu Arg Asn
50 55 60
Pro Asp Ile Leu Gln Pro Ala Leu Lys Ser Leu Gly Ala Arg His Ala
65 70 75 80
Glu Val Gly Thr Ile Lys Ser His Tyr Pro Leu Val Gly Gln Ala Leu
85 90 95
Ile Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Leu Ala Ala Asp Trp Thr Glu Gln Leu
100 105 110
Ala Thr Ala Trp Val Glu Ala Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Met Ile
115 120 125
Glu Gly Ala Asp Asn Pro Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Glu Leu Thr Phe
130 135 140
Tyr Glu Trp Leu Asp Leu Tyr Gly Glu Glu Ser Pro Lys Val Arg Asn
145 150 155 160
Ala Ile Ala Thr Leu Thr His Phe His Tyr Gly Glu Asp Pro Gln Asp
165 170 175
Val Gln Arg Asp Ser Arg Gly
180
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 普通念珠藻（Nostoc commune）
<400> 26
Met Ser Thr Leu Tyr Asp Asn Ile Gly Gly Gln Pro Ala Ile Glu Gln
1 5 10 15
Val Val Asp Glu Leu His Lys Arg Ile Ala Thr Asp Ser Leu Leu Ala
20 25 30
Pro Val Phe Ala Gly Thr Asp Met Val Lys Gln Arg Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Phe Leu Ala Gln Ile Phe Glu Gly Pro Lys Gln Tyr Gly Gly Arg
50 55 60
Pro Met Asp Lys Thr His Ala Gly Leu Asn Leu Gln Gln Pro His Phe
65 70 75 80
Asp Ala Ile Ala Lys His Leu Gly Glu Arg Met Ala Val Arg Gly Val
85 90 95
Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Ala Leu Asp Arg Val Thr Asn Met Lys
100 105 110
Gly Ala Ile Leu Asn Lys
115
<210> 27
<211> 136
<212> PRT
<213> 巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）
<400> 27
Met Arg Glu Lys Ile His Ser Pro Tyr Glu Leu Leu Gly Gly Glu His
1 5 10 15
Thr Ile Ser Lys Leu Val Asp Ala Phe Tyr Thr Arg Val Gly Gln His
20 25 30
Pro Glu Leu Ala Pro Ile Phe Pro Asp Asn Leu Thr Glu Thr Ala Arg
35 40 45
Lys Gln Lys Gln Phe Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Gly Pro Ser Leu Tyr
50 55 60
Thr Glu Glu His Gly His Pro Met Leu Arg Ala Arg His Leu Pro Phe
65 70 75 80
Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ala Lys Ala Trp Leu Thr Cys Met His Glu
85 90 95
Ala Met Asp Glu Ile Asn Leu Glu Gly Pro Glu Arg Asp Glu Leu Tyr
100 105 110
His Arg Leu Ile Leu Thr Ala Gln His Met Ile Asn Ser Pro Glu Gln
115 120 125
Thr Asp Glu Lys Gly Phe Ser His
130 135

Claims (60)

1.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
2.一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约10重量％的胞质蛋白。
3.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
b)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的DH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
4.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0；
c)对所述多个细胞的所述水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
d)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
e)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
f)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
5.一种用于从多个细胞中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
a)将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
6.一种用于从具有细胞壁的多个细胞中纯化可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
a)对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔；
b)对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分；
c)对所述液体部分进行过滤，以形成滤液和截留物；
d)对所述截留物进行浓缩，以形成蛋白质组合物，所述蛋白质组合物包括所述可溶性蛋白；以及
e)任选地对所述蛋白质组合物进行巴氏杀菌，
其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5和约12.0的pH下进行，和/或其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述可溶性蛋白是含血红素的蛋白。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述可溶性蛋白具有熔点，并且方法进一步包括：在a)之前，将所述多个细胞加热至比所述可溶性蛋白的所述熔点低约10℃或约5℃的温度。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述可溶性蛋白占所述蛋白质组合物中的蛋白质的至少约30干重％。
10.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。
11.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约8.5至约12.0的pH下进行。
12.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。
13.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在约9.0至约10.0的pH下进行。
14.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的方法，其中a)至d)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
15.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中a)至e)中的每一个独立地在小于或等于约12℃的温度下进行。
16.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括：在加热所述多个细胞与对所述多个细胞的水性悬浮液进行分离，以形成固体部分和液体部分之间，用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0。
17.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约5分钟。
18.根据权利要求1、3、4或6中任一项所述的方法，其中穿孔包括用还原剂进行处理、用酶进行处理、电穿孔或其组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约10mM至约500mM还原当量的所述还原剂进行处理。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述还原剂选自由以下组成的组：半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和其组合。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述还原剂是食品安全还原剂。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法使所述液体部分包括所述多个细胞的至少约50重量％的胞质蛋白。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法使所述多个细胞中的至少约25重量％的细胞保持完整。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法不包括对所述多个细胞的机械裂解。
25.根据权利要求24所述的方法，其中与包括机械裂解的类似方法相比，所述蛋白质组合物包括更高比例的胞质蛋白。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中进行所述过滤，直到将所述蛋白质组合物的2％(w/v)悬浮液的pH从pH 3调节至pH 12所需的氢氧化钠的量小于或等于3mmol。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中在未将L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中时，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在将约25mM L-半胱氨酸添加到所述蛋白质组合物中之后，在25℃下经过约24小时，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中基于干重，所述蛋白质组合物包括至少约35％的大于5kDa的化合物。
30.一种蛋白质组合物，其通过根据权利要求1至29中任一项所述的方法制备。
31.一种通过根据权利要求1至29中任一项所述的方法制备的蛋白质组合物在食品、饮料或补充剂中的用途。
32.一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中所述蛋白质组合物的缓冲能力小于约3.0mmolNaOH/克干固体。
33.一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中将所述蛋白质组合物的10％(w/v)悬浮液加热至至少约95℃会产生储能模量为至少约100Pa的凝胶。
34.一种蛋白质组合物，其包括：
多种功能性蛋白，
其中当未将L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中时，在25℃下经过约24小时之后，在顶部空间中能够检测到小于约0.1ppm的量的H2S。
35.根据权利要求34所述的蛋白质组合物，其中在25℃下经过约24小时之后并且在将约25mM L-半胱氨酸添加到5mL的所述蛋白质组合物的pH 7.0的2％(w/v)悬浮液中之后，在顶部空间中能够检测到至少约0.2ppm的量的H2S。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物是低风味蛋白质组合物。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述多种功能性蛋白包括至少约50干重％的胞质蛋白。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物能够使水包油乳液稳定。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物能够使水包空气乳液稳定。
40.根据权利要求32至39中任一项所述的蛋白质组合物，其中至少约30干重％的所述蛋白质组合物包括丰富蛋白。
41.根据权利要求40所述的蛋白质组合物，其中所述丰富蛋白是含血红素的蛋白。
42.根据权利要求32或34至41中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在加热至65℃时转变成凝胶。
43.根据权利要求32至42中任一项所述的蛋白质组合物，其中基于干重，至少约40％的所述蛋白质组合物包括大于5kDa的化合物。
44.根据权利要求32至43中任一项所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物不包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：半胱氨酸、1-己醇、2-丁基呋喃、2-甲基-2-戊烯醛、3-辛酮、乙酸乙酯、2-乙基-呋喃、2-戊基-呋喃、吡嗪、1-癸醇、苯乙酮、1-壬醇、2，5-二甲基-吡嗪、十二醛、苯乙醛、壬醛、丁内酯、辛醛、2-癸酮、己醛、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、2-辛酮、糠醛、2-庚酮和戊醛。
45.一种食品、饮料或补充剂，其包括根据权利要求32至44中任一项所述的蛋白质组合物。
46.一种用于处理具有细胞壁的多个细胞的方法，所述方法包括：
对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
47.一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包括：
用碱处理所述多个细胞的水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
48.一种用于处理多个细胞的方法，所述方法包括：
将所述多个细胞加热至约50℃至约85℃的温度，
其中用甘露糖苷酶处理所述多个细胞的上清液会在所述上清液中产生少于约30μg/mL的可检测甘露糖，其中所述上清液是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 10.5下在50℃下温育10分钟并且离心以去除固体之后制备的。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中在可溶相中能够检测到少于约200μg/mL的β葡聚糖，其中所述可溶相是使用所述多个细胞的10％(w/v)悬浮液，在pH 12.0下在50℃下温育10分钟后制备的。
50.根据权利要求46所述的方法，其中所述穿孔是在约8.5至约12.0的pH下进行的。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述加热是在约8.5至约12.0的pH下进行的。
52.根据权利要求46所述的方法，其中所述穿孔是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
53.根据权利要求47所述的方法，其中所述处理是在小于或等于约12℃的温度下进行的。
54.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括：在加热所述多个细胞之后，用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0。
55.根据权利要求48所述的方法，其中当所述多个细胞具有细胞壁时，所述方法进一步包括：在加热所述多个细胞之后，对所述多个细胞的所述细胞壁进行穿孔。
56.根据权利要求47所述的方法，其中用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH为约8.5至约12.0包括：用碱处理所述多个细胞的所述水性悬浮液，直到所述水性悬浮液的pH介于约8.5与12.0之间，持续至少约3分钟。
57.根据权利要求46所述的方法，其中所述方法进一步包括：在所述穿孔之后，将所述多个细胞加热至至少约60℃。
58.根据权利要求46所述的方法，其中穿孔包括用还原剂进行处理、用酶进行处理、电穿孔或其组合。
59.根据权利要求58所述的方法，其中用所述还原剂进行处理包括用约10mM至约500mM还原当量的所述还原剂进行处理。
60.一种组合物，其通过根据权利要求46至59中任一项所述的方法制备。
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