CN116421643A - 蓝靛果提取物在制备用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蓝靛果提取物在制备用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明以蓝靛果作为天然原料，经过浓缩提取，再配合经过磁场处理，得到蓝靛果提取物；所得蓝靛果提取物在改善酒精导致的胆汁酸淤积症、缓解胆汁酸淤积所导致的肝细胞坏死、促进胆汁酸的粪便排出、降低血清中的碱性磷酸酶、总胆红素和直接胆红素的含量方面，具有更良好的效果，并且能够有效治疗缓解胆汁淤积性肝病。

Description

蓝靛果提取物在制备用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物中 的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及蓝靛果提取物在制备用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物中的应用。

背景技术

酒文化我国从先秦时期就开始产生并逐渐发展，中国饮酒的人数日益增多且呈现低龄化。肝脏是酒精主要的损伤器官，人长期每天超过一定量的饮酒会导致一定的肝损伤，同时会伴随着一定程度的胆汁淤积。胆汁淤积是指十二指肠的胆汁排出减少或消失，临床上会出现黄疸、瘙痒等症状，同时伴有胆红素、胆盐、碱性磷酸酶等指标升高。所以酒精性肝病并发胆汁淤积是发生在酒精性肝病基础上的一种胆汁淤积性肝病。目前，治疗酒精性胆汁淤积肝病的方法除了严格戒酒并给与营养支持，目前比较常用的熊去氧胆酸、S-腺苷蛋氨酸等药物会产生着一定的副作用，降低患者生活质量。因此亟需寻找一个有效的酒精性胆汁淤积肝病治疗策略。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以蓝靛果作为天然原料，经过浓缩提取，再经过磁场处理，制备一种能够缓解胆汁淤积性肝病的药物。

本发明提供蓝靛果提取物在制备用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述蓝靛果提取物通过如下方法制得：

(1)将蓝靛果和纯水在胶体磨中反复破壁磨浆形成果浆，然后离心、收集上清液；随后浓缩得到浓缩汁；

(2)对上述浓缩汁外加磁场处理，得到蓝靛果提取物。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，蓝靛果和纯水的质量比为1：1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，离心的条件为3000rpm转速离心30分钟。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，在60℃，60r/min条件下旋蒸浓缩。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，浓缩前与浓缩后的果汁体积比为5：1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，将浓缩汁置于磁感应热反应器中进行磁场处理。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，磁场处理的过程为：设置激励电压为500V，频率为50kHz，流速为10L/h，并加热升温至60℃后提取一段时间；然后调整电压至450V，调整温度维持在45℃，流速为10L/h，继续搅拌提取。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：将蓝靛果提取物与药用辅料混合制得用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物。

在本发明的一种实施方式中，药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

本发明还提供一种包含上述蓝靛果提取物的用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物。

有益效果：

1、本发明提供了对胆汁酸淤积性肝病具有改善作用的新药物方案，且具有安全无毒、疗效好、应用前景广阔等优势效果。

2、蓝靛果提取物经过磁场处理，在改善酒精导致的胆汁酸淤积症、缓解胆汁酸淤积所导致的肝细胞坏死、促进胆汁酸的粪便排出、降低血清中的碱性磷酸酶、总胆红素和直接胆红素的含量方面，具有更良好的效果。

3、本发明提供一种针对胆汁淤积所导致的相关疾病，特别是对肝脏类疾病具有更优疗效的经磁场处理的蓝靛果提取物。

附图说明

图1为各组小鼠实验期间的体重变化和最终的肝脏重量及肝系数结果对比图。

图2为各组小鼠的血清ALT、AST活性及AST/ALT比值结果对比图。

图3为各组小鼠的血清ALP、DBIL、TBIL含量结果对比图。

图4为各组小鼠的肝脏、血清以及粪便中的总胆汁酸含量结果对比图。

图5为各组小鼠的肝脏HE染色对比图。

图6为各组小鼠的血清和肝脏的TC、TG含量结果对比图。

具体实施方式

实验材料：

蓝靛果，黑龙江峰然生物科技有限公司；雌性SPF级C57BL/6N小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司；Lieber-DeCarli酒精液体饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司；甘油三酯(TC)、总胆固醇(TG)、总胆汁酸(TBA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、碱性磷酸酶(ALP)总酚等生化测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；多聚甲醛，北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBRGreen染料法qPCR试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；引物，上海生工生物工程股份有限公司。

实验仪器：

实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；分析天平，梅特勒托利多公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨仪、宁波新芝生物科技有限公司；R-220Pro旋转蒸发仪、瑞士BUCHI公司；FORMA 700型超低温冰箱、NanoDrop 2000分光光度计、美国赛默飞世尔科技公司；3K15型低温高速离心机，德国Sigma公司；BS224型电子天平，北京塞多利斯仪器系统有限公司；LeicaASP300S型全自动脱水机、Leica RM2245型半自动切片机、Leica TS5015型全自动染色机，德国LEICA公司；Olympus BX53型光学显微镜、SC180型图像分析系统，日本Olympus；BSA124S-CW天平，德国赛多利斯；超声仪，深圳市雷德邦电子有限公司；Illumina MiSeq测序平台，美国Illumina公司；磁感应热反应器，无锡市英都斯特感应科技有限公司。

实施例1

蓝靛果提取物的制备：

(1)将蓝靛果和纯水在胶体磨中以1：1(g/mL)的比例混合，并反复破壁磨浆形成果浆。然后将获得的果浆以3000rpm的转速离心30分钟后收集上清果汁。最后再将果汁用旋蒸仪在60℃，60r/min条件下旋转蒸发为蓝靛果浓缩汁，浓缩前与浓缩后的果汁体积比为5：1，然后将蓝靛果浓缩汁分装后放于-20℃备用。

(2)磁场处理：量取上述所获得蓝靛果浓缩汁700mL；利用磁感应热反应器辅助处理蓝靛果浓缩汁，设置激励电压为500V，频率为50kHz，流速为10L/h，液体持续升温至60℃后，提取30min；然后调整电压至450V，料液温度维持在45℃，流速为10L/h，继续提取100min，期间用玻璃棒不断搅拌，最后得到蓝靛果提取物。所得蓝靛果提取物于-20℃存储备用。

实施例2

应用蓝靛果提取物治疗缓解胆汁淤积性肝病

试验方法：小鼠先适应性喂养五天，实验期间自由饮水及摄食正常饲料。适应期结束后，将小鼠随机分为4组，具体为：对照组、模型组、果汁组(实施例1中步骤(1)所得的浓缩汁)、磁场处理果汁组(实施例1中步骤(2)最终所得的蓝靛果提取物)。为了建立慢性酒精摄入加单次暴饮模型，所有小鼠前5天给予Lieber-DeCarli对照液体饲料，然后模型组和受试物组采用梯度酒精适应模式喂养9天，具体为3天1.7％(g/mL)酒精、3天2.5％(g/mL)酒精、3天3.3％(g/mL)酒精。酒精适应期结束后，给予模型组和受试物组含有5％(g/mL)酒精的Lieber-DeCarli酒精液体饲料16天，在此期间，对照组喂养Lieber-DeCarli对照液体饲料。造模期间每天早上九点灌胃受试物，下午五点更换酒精液体饲料，受试物组小鼠灌胃果汁的剂量均为3mL/只/天。最后一天，实验组灌胃浓度为31.5％(vol/vol)乙醇溶液，灌胃体积(uL)＝体重(g)×20。对照组灌胃等热量麦芽糊精溶液。灌胃9小时后处死小鼠，取一部分肝脏组织放入4％多聚甲醛固定，避光保存，用于切片染色实验。然后再取血清、肝脏进行生化分析及qPCR分析。

动物实验结果如图1-6所示。

图1显示了各组小鼠实验期间的体重变化和最终的肝脏重量及肝系数(肝脏重量/体重)。在适应期阶段，各组小鼠的体重正常增加，小鼠处于正常生长状态。当小鼠被喂食含有乙醇的液体饲料时，各组小鼠的体重开始发生不同的变化。模型组小鼠的体重呈现下降的趋势，果汁组的小鼠体重高于模型组小鼠，磁场处理果汁组的小鼠体重均大于模型组和果汁组。此外，肝脏重量和肝系数的结果表明，蓝靛果果汁具有降低酒精饮食小鼠肝脏重量和肝指数的作用，且磁场处理后的蓝靛果提取物的效果最佳。

血清转氨酶是临床上应用最广泛的预测肝细胞损伤的指标，当肝脏细胞受损导致细胞膜通透性增大时，ALT和AST将从细胞中释放出来，进而导致血清中AST和ALT活性明显升高。目前AST、ALT和AST/ALT比值常被作为肝脏疾病的诊断指标。结果表明(图2)，长期摄入酒精使模型组小鼠中的血清AST、ALT和AST/ALT比值显著升高，这表明模型组小鼠肝细胞受损严重。蓝靛果果汁可以降低小鼠的血清ALT、AST活性及AST/ALT比值，且磁场处理后的蓝靛果提取物效果最佳。提示蓝靛果果汁经磁场处理后所得的蓝靛果提取物具有良好的减缓酒精导致的肝细胞损伤的作用。

ALP、TBIL、DBIL水平代表胆汁细胞损伤和胆汁淤积的程度，结果如图3所示，进一步对这些生化指标进行了检测。结果发现，与空白组比较，模型组小鼠血清ALP、DBIL、TBIL的含量水平均显著升高，说明酒精导致胆汁酸淤积的小鼠模型建立成功。而与模型组比较，果汁组和磁场处理果汁组小鼠的血清DBIL、ALP、TBIL含量均显著下降，磁场处理果汁的降低效果大于未经磁场处理的果汁。这说明蓝靛果果汁具有缓解酒精造成的胆汁淤积的作用，且蓝靛果果汁经过磁场处理后所得的蓝靛果提取物缓解肝脏胆汁淤积的作用变得更强。

在动物体内，不同程度的酒精性肝病都可能伴随着胆汁酸的代谢异常。本实施例进一步对肝脏、血清以及粪便中的总胆汁酸含量进行检测。如图4所示，与正常组小鼠相比，长期酒精喂养会导致模型组小鼠肝脏和血清的的总胆汁酸水平显著性升高，粪便总胆汁酸显著性减少，而经过蓝靛果果汁的干预，果汁组小鼠的肝脏、血清以及粪便总胆汁酸的水平有恢复到与空白组相似水平的趋势，磁场处理果汁组小鼠的肝脏、血清以及粪便总胆汁酸显著性的恢复到了与空白组的相似的水平。这说明，这种饮酒模式会抑制胆汁酸的粪便排出和加重肝脏胆汁酸淤积。蓝靛果果汁具有促进小鼠胆汁酸的粪便排出以及减轻肝脏胆汁酸淤积的作用，且果汁经过磁场处理后所得的蓝靛果提取物起效的作用发生了增强。

通过HE染色可以观察肝脏组织和细胞的形态、大小以及数量等，以此来判断肝脏疾病的类型和轻重程度。如图5，通过HE染色发现，空白小鼠肝细胞形态均匀，结构整齐，细胞核呈圆形且均一，细胞无病变坏死，细胞间隙清晰可见。而经过长期饮酒的模型组小鼠的肝细胞结构杂乱，细胞核与细胞质发生错位，各细胞的边界发生融合或者消失，部分细胞核破裂，整个细胞产生严重的病变，这也验证了ALT以及AST的结果。此外模型组小鼠肝切片中还出现大量白色空泡，说明肝细胞间有脂质聚集，与正常小鼠肝组织细胞产生明显差异。与模型组相比，果汁组小鼠肝脏HE染色切片中的白色空泡减少，无破裂细胞核，接近正常组。磁场处理果汁组小鼠肝脏HE染色切片基本无白色空泡，细胞边界清晰，细胞结构正常且与空白组相似。说明果汁可以降低小鼠的肝组织损伤和脂质积累，磁场处理后所得的蓝靛果提取物效果更佳。

对各组小鼠的血清和肝脏的TC、TG进行检测，如图6所示，与空白组相比，模型组的肝脏和血清的TG、TC出现明显的上升，这表明长期酒精喂养导致小鼠肝脏的脂质积累和血脂的上升。与模型组相比，蓝靛果果汁干预后小鼠血清和肝脏中的TC、TG水平明显降低，经过磁场处理的果汁效果最佳。这说明蓝靛果果汁具有减少ALD小鼠的血清和肝脏脂质积累的作用，再经过磁场处理后所得的蓝靛果提取物的起效作用增强。

肝脏TC是肝脏TBA的合成来源，TC的变化与TBA变化趋势一致，这说明长期饮酒不仅会造成肝脏胆汁淤积，还会造成肝脏脂质积累。CYP7A1作为肝脏中TC合成TBA的主要限速物质，其mRNA表达在模型组小鼠中显著性上升，蓝靛果的干预可以显著性降低其含量，尤其是磁场处理后所得的蓝靛果提取物降低效果更为显著。

以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明权力要求书所界定的保护范围之内。

Claims (10)

1.蓝靛果提取物在制备用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物中的应用，

所述蓝靛果提取物通过如下方法制得：

(1)将蓝靛果和纯水在胶体磨中反复破壁磨浆形成果浆，然后离心、收集上清液；随后浓缩得到浓缩汁；

(2)对上述浓缩汁外加磁场处理，得到蓝靛果提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，蓝靛果和纯水的质量比为1：1。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，离心的条件为3000rpm转速离心30分钟。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，在60℃，60r/min条件下旋蒸浓缩。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，浓缩前与浓缩后的果汁体积比为5：1。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，将浓缩汁置于磁感应热反应器中进行磁场处理。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，磁场处理的过程为：设置激励电压为500V，频率为50kHz，流速为10L/h，并加热升温至60℃后提取一段时间；然后调整电压至450V，调整温度维持在45℃，流速为10L/h，继续搅拌提取。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将蓝靛果提取物与药用辅料混合制得用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，，药用辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

10.一种用于治疗缓解胆汁淤积性肝病的药物，其特征在于，包含权利要求1中所述蓝靛果提取物。

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