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CN116438438A - 用于基于流动的单颗粒和/或单分子分析的方法和设备 - Google Patents

用于基于流动的单颗粒和/或单分子分析的方法和设备 Download PDF

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CN116438438A
CN116438438A CN202180075938.8A CN202180075938A CN116438438A CN 116438438 A CN116438438 A CN 116438438A CN 202180075938 A CN202180075938 A CN 202180075938A CN 116438438 A CN116438438 A CN 116438438A
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particles
emission
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D·T·邱
Y·蒋
赵孟夏
Y·程
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Original Assignee
University of Washington
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Abstract

本发明提供了描述了用于分析在通道中流动的颗粒的系统和方法。在一个实施方案中，该通道被构造成使颗粒流过该通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开该管腔的探询窗口；光引擎，该光引擎包括：被定位成将第一激发光输出到该通道在该探询窗口中的第一部分上的第一光源；以及被定位成将第二激发光输出到该通道在该探询窗口中的与该第一部分分离的第二部分上的第二光源。在一个实施方案中，该系统包括发射光纤束，该发射光纤束包括第一发射光纤和第二发射光纤，其中该第一发射光纤和该第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中。

Description

用于基于流动的单颗粒和/或单分子分析的方法和设备
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年11月10日提交的共同未决的美国临时专利申请号63/198,748的权益，该美国临时专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
政府许可权利声明
本发明根据美国国立卫生研究院授予的授权号UG3 TR002874在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
针对诸如胞外囊泡的小颗粒的基于流动的分析可能存在若干挑战。典型的基于流动的颗粒分析包括使分散在流体悬浮液中的大量颗粒流过通道。随着颗粒尺寸的减小，这些颗粒趋于比较大颗粒更快地扩散。另外，因为在层流条件下流过通道的流体的速度根据其与通道壁的距离而径向变化，所以流过通道的颗粒的速度根据其与壁的距离对应地变化。因此，更难以区分流过通道的各种较小颗粒，因为颗粒速度取决于其径向位置，这继而受到其相对较高的扩散率的强烈影响。
因此，目前需要用于小颗粒的基于流动的分析的装置、系统和方法，其考虑到鉴定和表征此类小颗粒时的基于扩散的挑战。
发明内容
在某些方面，本公开提供用于颗粒和/或分子的基于流动的分析的装置、系统和方法以解决这些挑战和相关挑战。
在一个方面，本公开提供了一种用于分析颗粒和/或分子的系统。在一个实施方案中，该系统包括：通道，该通道被构造成使颗粒和/或分子流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；光引擎，该光引擎包括：被定位成将第一激发光输出到通道在探询窗口中的第一部分上的第一光源；以及被定位成将第二激发光输出到通道在探询窗口中的与第一部分分离的第二部分上的第二光源；发射光纤束，该发射光纤束包括第一发射光纤和第二发射光纤，其中第一发射光纤和第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中，并且其中第一发射光纤的近侧端部被定位成接收从第一部分发出的第一发射光，并且第二发射光纤的近侧端部被定位成接收从第二部分发出的第二发射光；以及检测器系统，该检测器系统包括：被定位成接收从第一发射光纤的远侧端部发出的第一发射光的第一光电检测器；以及被定位成接收从第二发射光纤的远侧端部发出的第二发射光的第二光电检测器。
在另一方面，本公开提供了一种探询颗粒和/或分子的方法，该方法包括：使颗粒和/或分子流过通道；通过探询窗口将第一激发光输出到通道的第一部分上；通过探询窗口将第二激发光输出到通道的与第一部分不同的第二部分上；基于通过第一发射光纤的近侧端部接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；以及基于通过第二发射光纤的近侧端部接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号，其中第一发射光纤的近侧端部和第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中。
在另一方面，本公开提供了一种用于分析颗粒和/或分子的系统，该系统包括：通道，该通道被构造成使颗粒和/或分子流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；光引擎，该光引擎被配置为通过探询窗口将激发光输出到通道中；检测器系统，该检测器系统被定位成接收从通道发出的发射光并被配置为基于所接收的发射光生成信号；以及光收集系统，该光收集系统被定位成收集来自通道的发射光并将所收集的发射光引导到检测器系统上，该光收集系统包括具有在大于0.91且小于0.99、大于0.92且小于0.98、大于0.93且小于0.97以及大于0.94且小于0.96的范围内的数值孔径的空气物镜。
在又一个方面，本公开提供了一种用于分析流体样本中的颗粒或分子的方法，该方法包括：使包含多个颗粒/分子的流体样本流过通道；在通道中照射具有小于1μm的流体动力学直径的多个颗粒/分子中的一个颗粒/分子；利用光收集系统收集从通道发出的发射光，该光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99范围内的数值孔径的空气物镜；以及基于所收集的基于颗粒/分子从通道发出的发射光生成信号；以及基于该信号为颗粒/分子分配值。
在另一方面，本公开提供了一种用于自校正的单颗粒/分子流动分析的系统，该系统包括：通道，该通道被构造成使颗粒/分子流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；光引擎，该光引擎包括：被定位成将第一激发光输出到通道在探询窗口中的第一部分上的第一光源；以及被定位成将第二激发光输出到通道在探询窗口中的与第一部分分离的第二部分上的第二光源；以及检测器系统，该检测器系统包括：被定位成接收从通道的第一部分发出的第一发射光的第一光电检测器；以及被定位成接收从第二部分发出的第二发射光的第二光电检测器；以及控制器，该控制器操作地耦合到第一光源、第二光源、第一光电检测器和第二光电检测器并且包括逻辑，该逻辑在被控制器执行时致使系统执行包括以下方面的操作：利用第一光源输出第一激发光；利用第二光源输出第二激发光；基于从第一部分接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；基于从第二部分接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号；以及基于生成第一发射信号与第二发射信号之间的时间差以及第一部分与第二部分之间的距离来确定通道中的颗粒/分子的速度。
在又一个方面，本公开提供了一种用于自校正的单颗粒/分子流动分析的方法，该方法包括：使颗粒/分子流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；利用第一光源将第一激发光输出到探询窗口的第一部分中；利用第二光源将第二激发光输出到探询窗口的与第一部分分离的第二部分中；基于从第一部分接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；基于从第二部分接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号，以及基于第一发射信号与第二发射信号之间的时间差以及第一部分与第二部分之间的距离来确定通道中的颗粒/分子的速度。
在另一方面，本公开提供了另一种用于自校正的单颗粒/分子流动分析的方法，该方法包括：使颗粒/分子流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；利用光源将激发光输出到探询窗口的一部分中；基于从该部分接收的发射光利用光电检测器生成发射信号；以比颗粒/分子穿过该部分的通行时间更快的速率获取发射信号；确定颗粒/分子穿过该部分的通行时间。在一个实施方案中，以颗粒/分子的通行时间至少2倍、至少5倍或至少10倍的速率获取发射信号。在一个实施方案中，基于将所获取的发射信号迹线拟合到一个函数来确定颗粒/分子穿过该部分的通行时间。在一个实施方案中，该函数是高斯曲线。在另一方面，本公开提供了一种保持聚焦在流体通道上的方法，该方法包括：利用来自光源的光照射流体通道的探询窗口；利用设置在通道与光电检测器之间的光学部件将光聚焦在探询窗口上；基于在第一时间从探询窗口背反射的聚焦光利用光电检测器生成锁定信号；基于在第一时间之后的第二时间从探询窗口背反射的聚焦光利用光电检测器生成测试信号；确定测试信号是否在锁定信号的预定百分比内；以及如果测试信号在锁定信号的预定百分比之外，则相对于光电检测器移动流体通道。
在又一个方面，本公开提供了一种将光学部件聚焦在流体通道上的方法，该方法包括：利用来自光源的光照射流体通道的探询窗口；利用设置在通道与光电检测器之间的光学部件将光聚焦在探询窗口上；基于在第一时间从探询窗口背反射的聚焦光利用光电检测器生成锁定信号；基于在第一时间之后的第二时间从探询窗口背反射的聚焦光利用光电检测器生成测试信号；确定测试信号是否在锁定信号的预定百分比内；以及如果测试信号在锁定信号的预定百分比之外，则相对于高数值孔径空气物镜移动流体通道。在一个实施方案中，成像在可见光范围外进行，更优选地在近红外区域进行。在一个实施方案中，使用NA介于0.91和0.99之间的空气物镜进行成像。在一个实施方案中，使用NA为约0.95的空气物镜进行成像。
在另一方面，本公开提供了一种保持被引导到流体通道上的光学部件的聚焦的方法，该方法包括：利用来自光源的光照射微流体系统的成像区域；利用相机生成成像区域的图像；确定图像的散焦量；确定散焦量是否在预定散焦量内；以及如果测试信号在预定范围之外，则相对于相机移动流体通道。
在又一个方面，本公开提供了一种单分子检测方法，该方法包括：使多个分子流过通道，其中多个分子中的一个或多个分子与可检出试剂缔合；在通道中照射多个分子中的分子；利用光收集系统收集从通道发出的发射光，该光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99范围内的数值孔径的空气物镜；基于所收集的基于分子从通道发出的发射光生成发射信号；以及基于该信号为分子分配值。
在另一方面，本公开提供了一种具有单分子检测效率的设备，该设备包括：通道，该通道被构造成使分子流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；光引擎，该光引擎被配置为通过探询窗口将激发光输出到通道中；检测器系统，该检测器系统被定位成接收从通道发出的发射光并被配置为基于所接收的发射光生成信号；光收集系统，该光收集系统被定位成收集来自通道的发射光并将所收集的发射光引导到检测器系统上，该光收集系统包括具有在大于0.91且小于0.99的范围内的数值孔径的空气物镜；以及控制器，该控制器操作地耦合到光引擎和检测器并且包括逻辑，该逻辑在被控制器执行时致使系统执行包括使多个分子和/或多个颗粒流过通道的操作，其中多个分子中的一个或多个分子和/或多个颗粒中的一个或多个颗粒与可检出试剂缔合；在通道中照射多个分子中的分子或多个颗粒中的颗粒；利用光收集系统收集从通道发出的发射光；基于所收集的基于分子和/或颗粒从通道发出的发射光生成发射信号；以及基于该信号为分子和/或颗粒分配值。
提供本发明内容是为了以简化形式介绍将在以下具体实施方式中进一步描述的一些概念。本发明内容并不旨在标识受权利要求书保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定受权利要求书保护的主题的范围。
附图说明
本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易解释，因为当结合附图参考以下详细描述时，这些方面和优点将变得更好理解，其中：
图1A是根据本公开的一个实施方案的使用高数值孔径(NA)空气物镜的基于流动的单颗粒/分子分析系统的示意图；
图1B是根据本公开的一个实施方案的图1A的系统的发射光纤束头的示意图；
图2是根据本公开的一个实施方案的基于流动的单分子/颗粒系统的检测器模块的示意图；
图3A是根据本公开的一个实施方案的基于流动的单分子/颗粒系统的光引擎和通道的示意图；
图3B是根据本公开的一个实施方案的图3A的通道的探询窗口的示意图；
图3C是根据本公开的一个实施方案的图3A的光引擎和通道的示例的示意图；
图3D是根据本公开的一个实施方案的图3A的光引擎和通道的示例的示意图；
图3E是根据本公开的一个实施方案的图3A的光引擎和通道的示例的示意图；
图3F是根据本公开的一个实施方案的图3A的光引擎和通道的示例的示意图；
图4是根据本公开的一个实施方案的系统的通道的图像；
图5A示意性地示出根据本公开的一个实施方案的穿过光学不透明盖的孔并到达检测器系统的发射光纤束头上的发射光；
图5B示出了根据本公开的一个实施方案的图5A的光学不透明盖的示例；
图5C是根据本公开的一个实施方案的基于流动的单分子/颗粒系统的发射光纤束头的图像；
图6是根据本公开的一个实施方案的使用高NA空气物镜的基于流动的单分子/颗粒系统的示意图；
图7A是根据本公开的一个实施方案的基于流动的单分子/颗粒系统的示意图；
图7B是根据本公开的一个实施方案的相对于图7A的系统的样本将高NA空气物镜聚焦在系统的通道上的示意图；
图7C是示出根据本公开的一个实施方案的聚焦基于流动的单分子/颗粒系统的高NA空气物镜的方法的框图；
图7D是根据本公开的一个实施方案的在通道与高NA空气物镜之间的多个距离拍摄的并且具有不同散焦量的通道的一系列图像；
图7E示出了根据本公开的一个实施方案的在通道与高NA空气物镜之间的各种距离处的聚焦质量的量，注意图7D的图像的位置；
图7F是示出根据本公开的一个实施方案的用于使用具有高NA空气物镜的近红外成像来设置焦平面的反馈控制回路的框图；
图7G是示出根据本公开的一个实施方案的用于执行由近红外机器视觉和高NA空气物镜辅助的实时聚焦的反馈控制回路的另一个框图；
图8用图形示了根据本公开的一个实施方案的在基于流动的单分子/颗粒系统的三个探询窗口中随时间推移生成的信号；
图9A在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的通过基于流动的单分子/颗粒系统的探询窗口的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的用一种类型的膜染料染色并在相同激发波长下激发两次的颗粒的吸收和发射光谱；
图9B在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的通过基于流动的单分子/颗粒系统的探询窗口的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的用一种类型的膜染料染色并能够在两个激发波长下激发的颗粒的吸收和发射光谱；
图9C在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的通过基于流动的单分子/颗粒系统的探询窗口的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的用两种类型的膜染料染色并在两个不同激发波长下激发的颗粒的吸收和发射光谱；
图9D在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的通过基于流动的单分子/颗粒系统的探询窗口的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的用膜染料和体积染料染色并在两个不同激发波长下激发的颗粒的吸收和发射光谱；
图10A在左侧示出了根据本公开的一个实施方案的与流体装置的探询窗口的部分的颗粒缔合的染料在由第一光源和第二源照射时的峰值发射强度之间的比较，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的与流体装置的探询窗口的部分的颗粒缔合的染料在由第一光源和第二源照射时并用本公开的方法校正后的峰值发射面积之间的比较；
图10B在左侧示出了根据本公开的一个实施方案的与流体装置的探询窗口的部分的颗粒缔合的染料在由第一光源和第二源照射时的峰值发射强度之间的比较，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的与流体装置的探询窗口的部分的颗粒缔合的染料在由第一光源和第二源照射时并用本公开的方法校正后的峰值发射面积之间的比较；
图11A示出了根据本公开的一个实施方案的流体系统的通道中的颗粒的归一化线速度之间的比较；
图11B示出了根据本公开的一个实施方案的测量通过流体系统通道的流体样本中胞外囊泡的浓度的结果，使用根据本公开的一个实施方案的图11A中所示的比较进行计算；
图12A至图12C显示根据本公开的一个实施方案的由(图12A)二-8-ANEPPS、(图12B)单个R-藻红蛋白(PE)和(图12C)单个Alexa 647染色的人类精液外泌体的荧光光谱(左)、流动中的样本迹线(中)和信号强度分布(右)；
图13示出了根据本公开的一个实施方案的使用高数值孔径空气物镜(具有0.95NA的40倍放大率)获得的测量的背景水平在两个荧光通道中在2000秒实验测量时段期间高度稳定；
图14A示出了根据本公开的一个实施方案的用二-8-ANEPPS膜染料、抗CD63-Alexa647抗体和抗CD81-PE/CF594抗体标记的精浆胞外囊泡的多色共定位，其中在实验中使用了4个激光激发区域或激光线，并且流动方向首先遇到640nm、然后遇到561nm、488nm，最后遇到405nm激发区域或激光线，其中峰搜索的方向在与流动相反的方向上，因为最后两条激光线用于检测来自二-8-ANEPPS的信号；
图14B示出了根据本公开的一个实施方案的基于二-8-ANEPPS膜染料、抗CD63-Alexa647抗体和抗CD81-PE/CF594抗体的共定位的精浆胞外囊泡的亚群或亚型；
图15示出了根据本公开的一个实施方案的在产生原始原液精浆胞外囊泡(sEV)样本的一系列稀释液之后，sEV的浓度测量结果；
图16用图形示出了根据本公开的一个实施方案的通过使用近红外成像或机器视觉与高数值孔径空气物镜(NA＝0.95)一起实现自动聚焦的设备；
图17A至图17C示出了根据本公开的一个实施方案的对于CD63+(图17A)、CD81+(图17B)和CD9+(图17C)外泌体，精液外泌体大小与抗体荧光强度；
图17D是示出根据本公开的一个实施方案的图17A至图17C所示的精液外泌体的亚群的百分比的文氏图；
图18A至图18C示出了根据本公开的一个实施方案的单个抗CD63(图18A)、抗CD81(图18B)和抗CD9(图18C)抗体以及对应的抗体标记精液外泌体的强度分布；
图18D至图18F示出了根据本公开的一个实施方案的四次跨膜蛋白CD63(图18D)、CD9(图18E)和CD81(图18F)的拷贝数分布；
图19A示出了根据本公开的一个实施方案的含有和不含由膜渗透RNA染料(SYTO)报告的RNA的由膜染料报告的囊泡或含脂质纳米颗粒的百分比，以及此外含有RNA的囊泡(对膜染料和RNA染料呈阳性)的百分比，具有和不具有抗CD63抗体的那些相对于所有囊泡(对膜染料呈阳性)的百分比；
图19B示出了根据本公开的一个实施方案的由膜渗透RNA染料(SYTO)报告的含RNA颗粒或分子的是或不是由膜染料报告的囊泡或含脂质纳米颗粒百分比，以及此外含有RNA的囊泡(对膜染料和RNA染料呈阳性)的百分比，含有和不含抗CD63抗体的那些相对于所有含RNA颗粒或分子(对RNA染料呈阳性)的百分比；
图19C示出了根据本公开的一个实施方案的含有RNA并且对CD63呈阳性(即对膜染料和RNA染料以及对抗CD63呈阳性)的囊泡相对于所有含有RNA的囊泡或含脂质纳米颗粒(即对膜染料和RNA染料呈阳性)的百分比；
图19D示出了根据本公开的一个实施方案的图19A的囊泡或含脂质纳米颗粒的囊泡尺寸与RNA含量；
图20A和图20B示出了经由单荧光颗粒或分子的直接计数进行的浓度确定，其中图20A示出了以涵盖约4个数量级的浓度范围的相同流速计数的单个200nm荧光珠，使得通过增大流速，可进一步增大较低浓度范围；通过结合泊松校正，也可进一步扩展上限浓度范围，并且图20B示出单荧光蛋白质的浓度的绝对定量低于1fM浓度。
具体实施方式
本公开提供了用于颗粒和分子的基于流动的分析的系统和方法。在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对实施方案的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，本文中所述的技术可在没有这些具体细节中的一个或多个具体细节的情况下实践，或用其他方法、部件、材料等实践。在其他情况下，未详细示出或描述众所周知的结构、材料或操作以避免模糊某些方面。
在整个本说明书对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。
小颗粒和分子趋于在通道内流动的流体中比大颗粒扩散得更多。由于颗粒的扩散，颗粒的径向位移(即，颗粒在正交于通道的主流动轴的方向上的位移)可使得这此类颗粒的测量特性(诸如荧光测量)具有挑战性，特别是当有大量颗粒或分子流过通道时。例如，在多个颗粒或分子同时流过通道的情况下，单个颗粒或分子可具有不同的通过通道的速度。在通道中的各个点处测量通道中的颗粒和/或分子的情况下，将由被定位成在沿通道长度的各个点处探询通道的光电检测器生成的信号与单个分子或颗粒相关联可能变得具有挑战性。实际上，随着颗粒的尺寸朝向例如胞外囊泡或甚至单分子的尺寸减小，此类测量可能变得非常具有挑战性。
系统
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于分析颗粒诸如单个生物纳米颗粒和/或分子的系统。
光纤束发射和激发
就这一点而言，关注图1A和图1B，其中示出了根据本公开的一个实施方案的系统100。
如图所示，系统100包括：通道102，该通道被构造成使颗粒和/或分子流过通道102的管腔104，通道102限定被构造成允许光进入和离开管腔104的探询窗口106；光引擎108，该光引擎被配置为将光输出到探询窗口106中；发射光纤束130，该发射光纤束被定位成接收从探询窗口106发出的发射光；以及检测器系统142，该检测器系统被定位成接收从发射光纤束130发出的发射光。
在一个实施方案中，系统100或其包括例如通道102和探询窗口106的一部分包括微流体芯片。微流体芯片可由衬底(例如硅、玻璃、陶瓷、塑料、有机硅、石英、聚合材料或它们的组合)形成并且可包括流体流过的微流体通道的网络。微流体装置可用来处理微小体积的流体样本，并且提供优于传统宏观尺度设备的优点(例如，与宏观尺度设备相比，需要的流体样本体积大大减少、需要使用的试剂更少，并且处理时间缩短)。微流体芯片为颗粒和/或分子的操作、分离、分选和/或运输提供了有吸引力的多功能平台。微流体通道的阵列可容易地被图案化和整合在微流体装置内，使得这些微流体装置对于涉及颗粒和/或分子的应用而言是有吸引力的平台。微流体芯片是平面设备，因此可通过使得能够使用高光收集效率物镜来增强光收集并因此有利于颗粒和/或分子的检测、分析、确定和/或鉴定，从而有利于颗粒和/或分子的检测和分析。
在一些实施方案中，本公开的方法、系统、装置和设备包括可有利于在途生物纳米颗粒和/或单分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定的微流体芯片。微流体芯片可用来处理小体积的流体样本，并且提供优于传统宏观尺度设备的优点(例如，与宏观尺度设备相比，微流体芯片仅需要微小体积的流体样本、需要较少试剂，并且在较短时间内进行处理，从而增加了效率)。微流体芯片是平面设备，因此可通过使得能够使用高NA(数值孔径)物镜(例如高NA空气物镜，诸如具有约0.95或介于0.91和0.99之间的NA的空气物镜)、透镜或具有高数值孔径的光收集系统来增强光收集并因此有利于生物纳米颗粒和/或分子的检测、分析、确定和/或鉴定，从而有利于生物纳米颗粒和/或分子的检测和分析。在某些实施方案中，微流体芯片是平面设备，从而增强其与显微镜装置(例如，与其上放置有微流体芯片的平移台)的相容性。微流体芯片还可允许设计和产生互连的没有死体积的流体网络，这继而可有利于生物纳米颗粒和/或分子的检测和操作(例如，在三个或更多个流体通道的连接处使用流量位移进行分选)。死体积是微流体芯片内的在流动路径外部的体积的一部分(例如，可能携带样本纳米颗粒和/或分子的液体可扩散到其中的体积，因此可能降低准确度)。通过微制造方法，微流体芯片可允许形成横截面为非球形或非正方形(例如，矩形)的通道，这可有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的检测、分析、测定和/或鉴定。微流体芯片可有利于形成沿通道长度具有不同宽度或高度的通道(例如，通道的宽度和/或高度具有收缩部或阶跃变化)，以有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定。微流体芯片可通过结合到具有期望厚度以及具有期望材料性质(例如折射率)的盖玻片(例如由玻璃或塑料制成)而形成，以增强与高效光收集系统(例如，高数值孔径物镜，诸如高NA空气物镜，需要适当的基底厚度以最大化光收集)的相容性，以有利于在途生物纳米颗粒和/或单分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定。微流体芯片为生物纳米颗粒和/或单分子的操作、分离、分选和/或运输提供了有吸引力的多功能平台。
仍然参考图1A和图1B，在一个实施方案中，系统100的部分(诸如包括通道102的那些部分)由包括但不限于以下材料的材料制成：聚合材料(聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚氨酯-甲基丙烯酸酯(PUMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚对二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯、lexan、聚苯乙烯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、聚氨酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己内酯、聚酮、聚邻苯二甲酰胺、乙酸纤维素、聚丙烯腈、聚砜、环氧聚合物、热塑性塑料、含氟聚合物和聚偏二氟乙烯、聚酰胺、聚酰亚胺)、无机材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融二氧化硅、陶瓷、玻璃(有机)和/或其他材料以及它们的组合。在一个实施方案中，系统100包括多孔膜、羊毛的织造或非织造纤维(诸如布或网片)、金属(例如不锈钢或Monel)、玻璃、纸或合成纤维(例如尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、聚对二甲苯和各种聚酯)、烧结不锈钢和其他金属，以及多孔无机材料(诸如氧化铝、二氧化硅或碳)。
通道102的探询窗口106允许诸如来自光引擎108的激发光进入通道102的管腔104，并且允许发射光离开通道102以供检测器系统142接收。此类激发光和发射光可包括来自多个波长范围的光，诸如包括但不限于可见光、红外光、近红外光和紫外光以及它们的组合。就这一点而言，探询窗口106适合激发流过通道102的颗粒和/或分子并且允许从探询窗口106发射的光被检测器系统142接收以用于进一步分析。
如本文进一步所讨论，在一个实施方案中，通道102的在探询窗口106内或在某些实施方案中与探询窗口106相邻的管腔104限定管腔104的横截面或直径或其他尺寸特征的收缩部或其他变窄。管腔104的此类收缩部或变窄被构造成逐颗粒地和/或逐分子地并且在层流条件下使颗粒和/或分子流过通道102的包括探询窗口106的部分。
在一个实施方案中，探询窗口106包括通道的在物镜186的视场内和/或能够由检测器系统142检测的一部分。在一个实施方案中，探询窗口106包括通道102的限定相对于通道102的其他部分的收缩部的一部分。如本文进一步所述，在此类实施方案中，探询窗口106的收缩部可具有小于通道102的其他直接相邻部分的尺寸，诸如高度、宽度、横截面积等。
在一些实施方案中，收缩部具有的宽度小于微流体通道102的最宽部分的宽度。在某些实施方案中，收缩部具有相对于微流体通道102的最宽部分的宽度。在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的最大宽度的50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的宽度。作为非限制性示例，具有100μm的最大宽度的微流体通道102可具有小于最大宽度值的25％(即，小于25μm)的收缩部。在优选实施方案中，收缩部具有小于微流体通道102的最大宽度的10％的宽度。
在一些实施方案中，微流体通道102的最大宽度具有小于900μm且大于0.1μm、小于800μm且大于0.5μm、小于700μm且大于1μm、小于600μm且大于5μm、小于500μm且大于10μm、小于1,000μm且大于10μm、小于900μm且大于10μm、小于800μm且大于10μm、小于700μm且大于10μm、小于600μm且大于10μm、小于500μm且大于10μm、小于400μm且大于10μm、小于300μm且大于10μm、小于500μm且大于0.1μm、小于500μm且大于1μm、小于500μm且大于2μm、小于500μm且大于5μm、小于800μm且大于0.1μm、小于700μm且大于0.1μm、小于600μm且大于0.1μm、小于500μm且大于0.1μm、小于400μm且大于0.1μm或小于300μm且大于0.1μm的值。在优选实施方案中，微流体通道102的最大宽度具有小于500pm且大于10μm的值。
在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的平均宽度的宽度。在某些实施方案中，收缩部具有相对于微流体通道的平均宽度的宽度。在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道102的平均宽度的50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的宽度。
在一些实施方案中，微流体通道102的平均宽度具有小于900μm且大于0.1μm、小于800μm且大于0.5μm、小于700μm且大于1μm、小于600μm且大于5μm、小于500μm且大于10μm、小于1,000μm且大于10μm、小于900μm且大于10μm、小于800μm且大于10μm、小于700μm且大于10μm、小于600μm且大于10μm、小于500μm且大于10μm、小于400μm且大于10μm、小于300μm且大于10μm、小于500μm且大于0.1μm、小于500μm且大于1μm、小于500μm且大于2μm、小于500μm且大于5μm、小于800μm且大于0.1μm、小于700μm且大于0.1μm、小于600μm且大于0.1μm、小于500μm且大于0.1μm、小于400μm且大于0.1μm或小于300μm且大于0.1μm的值。在优选实施方案中，微流体通道102的平均宽度具有小于500μm且大于10μm的值。
在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道102的最大高度值(即，最大高度)的高度。在某些实施方案中，收缩部具有相对于微流体通道的最大高度的高度。在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的最大高度的50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的高度。作为非限制性示例，具有20μm的最大高度的微流体通道102可具有小于最大高度值的10％(即，小于2μm)的收缩部。在优选实施方案中，收缩部具有小于微流体通道102的最大高度的25％的高度。
在一些实施方案中，微流体通道102的最大高度具有小于900μm且大于0.1μm、小于800μm且大于0.5μm、小于700μm且大于1μm、小于600μm且大于5μm、小于500μm且大于10μm、小于1,000μm且大于10μm、小于900μm且大于10μm、小于800μm且大于10μm、小于700μm且大于10μm、小于600μm且大于10μm、小于500μm且大于10μm、小于400μm且大于10μm、小于300μm且大于10μm、小于500μm且大于0.1μm、小于500μm且大于1μm、小于500μm且大于2μm、小于500μm且大于5μm、小于800μm且大于0.1μm、小于700μm且大于0.1μm、小于600μm且大于0.1μm、小于500μm且大于0.1μm、小于400μm且大于0.1μm或小于300μm且大于0.1μm的值。在优选实施方案中，微流体通道102的最大高度具有小于500μm且大于10μm的值。
在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的平均高度的高度。在某些实施方案中，收缩部具有相对于微流体通道的平均高度的高度。在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的平均高度的50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的高度。
在一些实施方案中，微流体通道的平均高度具有小于900μm且大于0.1μm、小于800μm且大于0.5μm、小于700μm且大于1μm、小于600μm且大于5μm、小于500μm且大于10μm、小于1,000μm且大于10μm、小于900μm且大于10μm、小于800μm且大于10μm、小于700μm且大于10μm、小于600μm且大于10μm、小于500μm且大于10μm、小于400μm且大于10μm、小于300μm且大于10μm、小于500μm且大于0.1μm、小于500μm且大于1μm、小于500μm且大于2μm、小于500μm且大于5μm、小于800μm且大于0.1μm、小于700μm且大于0.1μm、小于600μm且大于0.1μm、小于500μm且大于0.1μm、小于400μm且大于0.1μm或小于300μm且大于0.1μm的值。在优选实施方案中，微流体通道的平均高度具有小于500μm且大于10μm的值。
在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的最大横截面积(即，最大横截面积)的横截面积。在某些实施方案中，收缩部具有相对于微流体通道的最大横截面积的横截面积。在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的最大横截面积的50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于24％、小于23％、小于22％、小于21％、小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.2％、小于0.1％、小于0.05％、小于0.02％、小于0.01％、小于0.005％、小于0.002％或小于0.001％的横截面积。作为非限制性示例，具有200μm2的最大横截面积的微流体通道可具有小于最大横截面积值的10％(即，小于20μm2)的收缩部。在优选实施方案中，收缩部具有介于微流体通道的最大横截面积的10％和0.01％之间的横截面积。
在一些实施方案中，微流体通道的最大横截面积具有小于1,000,000μm2且大于10μm2、小于750,000μm2且大于25μm2、小于500,000μm2且大于100μm2、小于250,000μm2且大于250μm2、小于900,000μm2且大于100μm2、小于800,000μm2且大于100μm2、小于700,000μm2且大于100μm2、小于600,000μm2且大于100μm2、小于400,000μm2且大于100μm2、小于300,000μm2且大于100μm2、小于200,000μm2且大于100μm2、小于100,000μm2且大于100μm2、小于50,000μm2且大于100μm2、小于25,000μm2且大于100μm2、小于10,000μm2且大于100μm2、小于1,000μm2且大于100μm2、小于2,000,000μm2且大于250μm2、小于1,000,000μm2且大于250μm2、小于900,000μm2且大于250μm2、小于800,000μm2且大于250μm2、小于700,000μm2且大于250μm2、小于600,000μm2且大于250μm2、小于400,000μm2且大于250μm2、小于300,000μm2且大于250μm2、小于200,000μm2且大于250μm2、小于100,000μm2且大于250μm2、小于50,000μm2且大于250μm2、小于25,000μm2且大于250μm2、小于10,000μm2且大于250μm2或小于1,000μm2且大于250μm2的值。在优选实施方案中，微流体通道的最大横截面积具有小于250,000μm2且大于250μm2的值。
在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的平均横截面积的横截面积。在某些实施方案中，收缩部具有相对于微流体通道的平均横截面积的横截面积。在一些实施方案中，收缩部具有小于微流体通道的平均横截面积的50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于24％、小于23％、小于22％、小于21％、小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.2％、小于0.1％、小于0.05％、小于0.02％、小于0.01％、小于0.005％、小于0.002％或小于0.001％的横截面积。
在一些实施方案中，微流体通道的平均横截面积具有小于1,000,000μm2且大于10μm2、小于750,000μm2且大于25μm2、小于500,000μm2且大于100μm2、小于250,000μm2且大于250μm2、小于900,000μm2且大于100μm2、小于800,000μm2且大于100μm2、小于700,000μm2且大于100μm2、小于600,000μm2且大于100μm2、小于400,000μm2且大于100μm2、小于300,000μm2且大于100μm2、小于200,000μm2且大于100μm2、小于100,000μm2且大于100μm2、小于50,000μm2且大于100μm2、小于25,000μm2且大于100μm2、小于10,000μm2且大于100μm2、小于1,000μm2且大于100μm2、小于2,000,000μm2且大于250μm2、小于1,000,000μm2且大于250μm2、小于900,000μm2且大于250μm2、小于800,000μm2且大于250μm2、小于700,000μm2且大于250μm2、小于600,000μm2且大于250μm2、小于400,000μm2且大于250μm2、小于300,000μm2且大于250μm2、小于200,000μm2且大于250μm2、小于100,000μm2且大于250μm2、小于50,000μm2且大于250μm2、小于25,000μm2且大于250μm2、小于10,000μm2且大于250μm2或小于1,000μm2且大于250μm2的值。在优选实施方案中，微流体通道的平均横截面积具有小于250,000μm2且大于250μm2的值。
在一些实施方案中，收缩部具有小于10μm的高度、小于9μm的高度、小于8μm的高度、小于7μm的高度、小于6μm的高度、小于5μm的高度、小于4μm的高度、小于3μm的高度、小于2μm的高度或小于1μm2的高度。在一些实施方案中，收缩部具有小于10μm的宽度、小于9μm的宽度、小于8μm的宽度、小于7μm的宽度、小于6μm的宽度、小于5μm的宽度、小于4μm的宽度、小于3μm的宽度、小于2μm的宽度或小于1μm的宽度。
在一些实施方案中，至少一个微流体通道包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个收缩部。在一些实施方案中，微流体芯片包括多个微流体通道，该多个微流体通道中的至少一部分各自包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个收缩部。在一些实施方案中，微流体芯片包括多个微流体通道，该多个微流体通道中的大部分各自包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个收缩部。在一些实施方案中，微流体芯片包括多个微流体通道，该多个微流体通道中的每一个包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个收缩部。
在一些实施方案中，至少一个微流体通道102的至少一部分具有小于10,000μm2的横截面积、小于5,000μm2的横截面积、小于3,000μm2的横截面积、小于1,000μm2的横截面积、小于800μm2的横截面积、小于600μm2的横截面积、小于400μm2的横截面积、小于200μm2的横截面积或小于100μm2的横截面积。在优选实施方案中，至少一个微流体通道的至少一部分具有小于100μm2的横截面积、小于90μm2的横截面积、小于80μm2的横截面积、小于70μm2的横截面积、小于60μm2的横截面积、小于50μm2的横截面积、小于40μm2的横截面积、小于30μm2的横截面积、小于20μm2的横截面积、小于10μm2、小于5μm2的横截面积、小于2μm2的横截面积或小于1μm2的横截面积。在一些实施方案中，至少一个微流体通道具有小于250,000μm2、小于100,000μm2、小于50,000μm2、小于25,000μm2、小于10,000μm2、小于5,000μm2、小于3,000μm2、小于1,000μm2、小于800μm2、小于600μm2、小于400μm2、小于200μm2或小于100μm2的最大横截面积。在一些实施方案中，至少一个微流体通道具有小于100μm2、小于90μm2、小于80μm2、小于70μm2、小于60μm2、小于50μm2、小于40μm2、小于30μm2、小于20μm2、小于10μm2、小于5μm2、小于2μm2或小于1μm2的最大横截面积。在优选实施方案中，至少一个微流体通道的至少一部分具有介于1μm2和100μm2之间的横截面积。在一些实施方案中，至少一个微流体通道具有介于100μm2和10,000μm2之间的最大横截面积。
在某些实施方案中，至少一个微流体通道的至少一部分包括其宽度或高度中的至少一者的不连续变化(例如，使用微制造技术实现)。本文所用的微流体芯片可包括其高度或宽度中的至少一者具有阶跃梯度或阶跃变化的微流体通道，这与包括高度或宽度的连续变化的微流体通道相反。包括高度或宽度的连续变化的通道在包括例如玻璃管的装置中是常见的，玻璃管可通过拉动加热管来实现。在具体实施方案中，至少一个微流体通道的至少一部分具有彼此独立变化的高度和宽度。高度和宽度的独立变化与例如玻璃管相反，其中减小高度的制造伴随着宽度的对应减小(例如，已被加热至接近其熔化温度的玻璃管的拉延和减薄)。
如上所述，系统100包括光引擎108。在例示的实施方案中，光引擎108显示为包括多个光源110、114、118和120，每个光源被定位成将激发光发射或输出到探询窗口106中的通道102的相应分离部分122、124、126和128上。就这一点而言，光引擎108显示为包括：被定位成将第一激发光112输出到探询窗口106中的通道102的第一部分122上的第一光源110；以及被定位成将第二激发光116发射或输出到探询窗口106中的通道102的与第一部分122分离的第二部分124上的第二光源114。光引擎108显示为还包括被定位成将第三激发光和第四激发光分别输出到探询窗口106中的通道102的第三部分126和第四部分128上的第三光源118和第四光源120。
在一个实施方案中，部分122、124、126和128由激发光的在被物镜186聚焦并照射在通道102上之后的宽度限定。例如，在一个实施方案中，部分122具有由激发光112的照射在通道102上的宽度限定的宽度。在一个实施方案中，部分122、124、126和128的宽度小于2.0μm、1.5μm、1.0μm、0.9μm、0.8μm、0.7μm、0.6μm、0.5μm、0.4μm、0.3μm或0.2μm。在一个实施方案中，部分122、124、126和128的宽度在约2.0μm至约0.2μm、1.0μm至约0.2μm、0.9μm至约0.2μm、0.8μm至约0.2μm、0.7μm至约0.2μm或约0.6μm至约0.2μm的范围内。在一个实施方案中，部分122、124、126和128的宽度被限定为激发光强度的最大值的1/e2。在一个实施方案中，部分122、124、126和128的宽度被限定为激发光强度的最大值的1/e。
在部分122、124、126和128的宽度太宽的情况下，信噪比对于例如单分子/颗粒检测和分析而言将太低。就这一点而言，太宽且间隔太紧密的激发线宽度(例如，当两条激发线基本上重叠时)将在通道102的各部分之间产生串扰。另外，太宽的激发线宽度将照射通道102的较大部分，从而形成较大量的背景光，这将降低信噪比，特别是在由单颗粒/分子发射的光量可能相对低的情况下。
如图所示，光源110和114光学耦合到光纤164和168，使得从其输出的激发光112和116由光纤164和168接收并传输。在例示的实施方案中，第一光源110光学耦合到第一激发光纤164的近侧端部166；并且第二光源114光学耦合到第二激发光纤168的近侧端部170。
虽然示出了光学耦合的光源，但应当理解，在某些实施方案中，光引擎108的光源110、114、118和120是没有光学耦合到激发光纤的自由空间光源。就这一点而言并且在一个实施方案中，自由空间光源没有设置在自由空间光源与被定位成接收激发光并将激发光输出到自由空间中的探询窗口106之间的光纤。就这一点而言，相邻光源的激发光之间的间距至少部分地由系统100的另外光学部件限定，该另外光学部件引导和/或成形从其发射的激发光。因此，在一个实施方案中，诸如激发光纤束172的激发光纤164和168的激发光纤是任选的。并且在一些实施方案中，没有激发光纤束172。
由光引擎108的光源110、114、118和120输出的激发光可具有任何波长。在一个实施方案中，一个光源的激发光与光引擎108的另一光源输出的激发光相同。在一个实施方案中，一个光源的激发光与光引擎108的另一光源输出的激发光不同。在一个实施方案中，第一激发光112具有在第一波长范围内的波长，并且其中第二激发光116具有与第一波长范围不同的第二波长范围内的波长。在一个实施方案中，第一激发光112具有在第一波长范围内的波长，并且其中第二激发光116具有与第一波长范围共同的第二波长范围内的波长。
第一激发光112和第二激发光116可以是适合光学激发颗粒中或颗粒上或与分子缔合的染料或其他可检出试剂的任何激发光。在一个实施方案中，第一激发光112和/或第二激发光116包括诸如来自激光器的相干光。在一个实施方案中，第一光源110和第二光源114各自独立地选自固态激光器、二极管泵浦激光器、发光二极管(LED)、灯、电弧放电和自然光。
在一个实施方案中，第一激发光112在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。在一个实施方案中，第二激发光116在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
如图所示，第一激发光纤164的远侧端部和第二激发光纤168的远侧端部布置在激发光纤束头172中。如图所示，激发光纤164和168的远侧端部以间距176间隔开。在一个实施方案中，该间距176至少部分地限定由激发光纤束头172和光引擎108输出的激发光112和116的间距。对应地，在一个实施方案中，第一激发光纤164的远侧端部与第二激发光纤168的远侧端部之间的间距176对应于第一部分122与第二部分124之间的间距。就这一点而言，激发光可由光引擎108的不同定位的光源110、112、118和120输出，由激发光纤束头172聚集在一起，然后根据激发光纤的远侧端部的间距176输出到通道102的探询窗口106的分开定位部分上。激发光纤束头172的这种配置可由激发光学器件进一步操纵。未示出，参见例如图3A。在一个实施方案中，激发光纤164和168在光纤束头中彼此相邻地设置，诸如在彼此的一个光纤直径内(例如，边缘到边缘距离)。
在一个实施方案中，光纤束诸如激发光纤束172是指在光纤的端部处耦合或以其他方式接近的光纤。如本文进一步所讨论，通过使光纤的端部彼此接近，诸如在光纤直径宽度内，从耦合到光纤的不同定位的光源输出的光可通过光纤传输并在由光纤束中的光纤的取向成形或以其他方式部分限定的取向上从光纤发射。
如上所述，虽然示出了光学耦合的光源，但应当理解，光引擎108可包括自由空间光源，诸如本文结合图6进一步所讨论。此外，应当理解，由光引擎108照射的探询窗口106的部分以及它们之间的间距由定位在自由空间光源和探询窗口106之间的光学元件操纵。
如图所示，系统100包括被定位成朝向通道102的探询窗口106反射激发光112和116的至少一部分的二向色镜160。在例示的实施方案中，系统100还包括被定位成收集从二向色镜160反射的激发光并被配置为将激发光112和116聚焦在通道102上的物镜186，诸如空气物镜186。就这一点而言，来自光源的激发光被输出到通道102的在探询窗口106内的空间分离部分上。如上所述，在一个实施方案中，探询窗口106至少部分地由物镜186的视场限定。
虽然示出了二向色镜160，但应当理解，可使用其他光学部件来选择性地或部分地透射和反射光。在一个实施方案中，二向色镜160被替换为透射镜，诸如20％反射/80％透射镜，或被构造成选择性地或部分地透射和反射光的其他结构。
如上所述，流过通道102的颗粒或分子(诸如包含一种或多种可检出试剂的颗粒和/或与一种或多种可检出试剂缔合的分子)可由激发光112和116激发。此类被激发的颗粒/分子可发出发射光146和152，该光被辐射或以其他方式发射出探询窗口106并穿过二向色镜160。如图所示，发射光146和152具有与照射在探询窗口106上的激发光112和116相同或相似的相对间距。
发射光146和152显示为照射在系统100的发射光纤束130上。在例示的实施方案中，发射光纤束130显示为包括在空间中紧密耦合的四根发射光纤。类似于激发光纤束172，发射光纤束130使光纤(此处为发射光纤134和138)的端部紧密靠近并符合特定取向或布置。如本文进一步所讨论，发射光纤在光纤束头132内的具体布置适合将发射光纤134和138定位成接收发射光146和152。
虽然图1A中示出了四根发射光纤，但应当理解，发射光纤的其他数量和构型也是可以的。在一个实施方案中，发射光纤束130包括至少三根发射光纤、至少四根发射光纤、至少五根发射光纤、至少六根发射光纤、至少七根发射光纤或更多。在一个实施方案中，发射光纤束130包括第一发射光纤134和第二发射光纤138，其中第一发射光纤134的近侧端部136和第二发射光纤138布置在发射光纤束头132中，并且其中第一发射光纤134的近侧端部136被定位成接收从第一部分122发出的第一发射光146，并且第二发射光纤138的近侧端部140被定位成接收从第二部分124发出的第二发射光152。
在一个实施方案中，发射光纤束130的每根发射光纤134和138的近侧端部136和140设置在发射光纤束头132中。在一个实施方案中，发射光纤束130的每根发射光纤134和138的近侧端部136和140被定位成接收从探询窗口106的不同部分122和124发出的发射光146和152。在一个实施方案中，发射光纤134和138的近侧端部136和140彼此相邻地设置，诸如在彼此的一个光纤直径内(例如，一根光纤的边缘到相邻光纤的最近边缘之间的距离在一个光纤直径内)。
在一个实施方案中，发射光纤束头132的发射光纤被布置成接收(诸如单个地或分开地接收)对应于探询窗口106的不同激发区域或部分的发射光。如上所述，在一个实施方案中，探询窗口106的部分(诸如部分122和124)由激发光(诸如激发光112和116)在照射在探询窗口上时的宽度限定。
通过将发射光纤134和138的近侧端部136和140紧密相邻地放置在发射光纤束头132中，发射光纤134和138被定位成接收来自通道102的不同部分(诸如通道102的由光引擎108的不同光源激发的部分)的发射光。在一个实施方案中，发射光纤134和138的近侧端部136和140之间的间距基于通道102的部分122和124的间距，诸如基于照射在探询窗口106上的激发光112和116的间距。
就这一点而言，关注图1B，这是系统100的发射光纤束头132的示意图。图1B示出了发射光纤束头132的发射光纤的多种构型。在一个优选实施方案中，发射光纤134以线性构型布置在发射光纤束头132内。
在一个实施方案中，发射光纤134和138的近侧端部136和140的间距174和/或布置对应于探询窗口106的由光引擎108的光源激发的部分的间距和/或布置。如图所示，发射光纤134和138的近侧端部136和140以线性构型布置。就这一点而言，发射光纤134和138布置在发射光纤束头132中以接收来自通道102的发射光146和152，其中光引擎108被配置为以例如线性构型将激发光发射或输出到探询窗口106中。
在一个实施方案中，间距174在约1μm和约1,000μm的范围内、在约100μm和约900μm的范围内、在约1μm和约100μm的范围内、在约10μm和约500μm的范围内、在约50μm和约800μm的范围内。在另一个实施方案中，在光纤束头的近侧端部中的一根发射光纤的边缘与另一根发射光纤的最近边缘之间的距离接近零(即，接触)或在光纤的半径内。
在一个实施方案中，间距174是一根发射光纤的中心与不同发射光纤的中心之间的距离。在一个实施方案中，间距174是一根发射光纤的边缘与另一根发射光纤的最近边缘之间的距离。
在一个实施方案中，第一发射光纤134的近侧端部136与第二发射光纤138的近侧端部140之间的间距174对应于探询窗口106的第一部分122与第二部分124之间的间距。在该实施方案中，间距是中心到中心的距离。在一个实施方案中，这种对应关系是直接对应关系，其中发射光纤134和138的近侧端部136与140之间的间距和第一部分122与第二部分124之间的间距在考虑到光学系统的放大之后直接或紧密匹配。在一个实施方案中，根据系统100的光学器件，诸如设置在探询窗口106与发射光纤束头132之间的物镜186和任何其他透镜、反射镜等，来调整和/或修改对应关系。
在一个实施方案中，第一激发光纤164的远侧端部166与第二激发光纤168的远侧端部170之间的间距176对应于探询窗口106的第一部分122与第二部分124之间的间距。在一个实施方案中，这种对应关系是直接对应关系，其中激发光纤164和168的远侧端部166与170之间的间距和第一部分122与第二部分124之间的间距在考虑到光学系统的放大之后直接或紧密匹配。就这一点而言，从远侧端部166输出的第一光源110与从远侧端部170输出的第二光源114之间的间距对应于第一部分122与第二部分124之间的间距。在一个实施方案中，根据系统100的光学器件，诸如设置在探询窗口106与激发光纤束头172之间的物镜186和任何其他透镜、反射镜等，来调整和/或修改对应关系。
在一个实施方案中，第一激发光纤134的远侧端部166与第二激发光纤138的远侧端部170之间的间距176对应于第一发射光纤164的近侧端部136与第二发射光纤168的近侧端部140之间的间距174。如上所述，这种对应关系可以是直接对应关系，或由操纵或引导发射光的任何光学部件修改的对应关系。
在一个实施方案中，间距176在约1μm和约1,000μm的范围内、在约1μm和约100μm的范围内、在约250μm和约750μm的范围内、在约1μm和约50μm的范围内、在约10μm和约500μm的范围内。在另一个实施方案中，在光纤束头的一根光纤的边缘与另一根光纤的最近边缘之间的距离接近零(即，接触)或在光纤的半径内。
如上所述，系统100包括被定位成接收从发射光纤束130发出的发射光的检测器系统142。如图所示，发射光纤134和138分别在其近侧端部136和140处从发射光纤束头132散开，以在其相邻于并光学耦合到检测器系统142的检测器模块144和150的远侧端部148和154处终止。如本文所用，“检测器模块”是指检测结构和/或检测部件的集合，其被配置为基于由检测器模块接收的光(诸如由一个或多个检测结构和/或部件接收的光)生成一个信号或一组信号。本公开的检测器系统诸如检测器系统142可包括一个或多个检测器模块和/或一个或多个单独的检测器，诸如一个或多个单独的光电检测器。
在一个实施方案中，检测器模块144和150中的一者或多者包括光学耦合并被定位成接收发射光146和152的单个光电检测器。在另一个实施方案中，检测器模块144和150中的一者或多者包括多个单独的光电检测器，诸如本文结合图2进一步所讨论。就这一点而言，检测器模块144和150中的每一者可被配置为接收发射光146和152并基于该发射光146和152(诸如基于发射光146和152内的特定波长范围)生成多个信号。
在一个实施方案中，每根发射光纤134和138的远侧端部148和154被定位成将光发射到至少一个相应检测器模块144和150上。在一个实施方案中，检测器系统142被定位成接收来自探询窗口106的散射发射光、冷光发射光、荧光发射光或它们的组合。在一个实施方案中，散射发射光选自反向散射光、侧向散射光或前向散射光。
虽然讨论了诸如检测器模块144和150内的光电检测器的光电检测器，但应当理解，其他类型的光检测结构和部件也是可以的并且在本公开的范围内。在一个实施方案中，检测器模块144和150内的光电检测器选自相机、电子倍增器、电荷耦合器件(CCD)图像传感器、光电倍增管(PMT)、微通道板PMT(MCP)、混合PMT检测器、雪崩光电二极管(APD)、单光子雪崩二极管(SPAD)、单光子计数模块(SPCM)、硅光电倍增管(SiPM)和互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器。
在例示的实施方案中，每根发射光纤的终端光学耦合到用于接收发射光的检测器模块。就这一点而言，检测器系统142显示为包括：被定位成接收从第一发射光纤134的远侧端部148发出的第一发射光146的第一检测器模块144；以及被定位成接收从第二发射光纤138的远侧端部154发出的第二发射光152的第二检测器模块150。
系统100显示为还包括操作地耦合到光引擎108和检测器系统142的控制器156。此类控制器156包括被配置为设计这些部件的操作的逻辑。虽然一个控制器156显示为直接耦合到这些部件，但应当理解，多个控制器诸如无线耦合和/或位于分布式系统中的那些也是可以的并且在本公开的范围内。
在一个实施方案中，控制器156包括用于执行本文进一步描述的方法的一些或所有方面的逻辑。在一个实施方案中，控制器156包括用于利用光引擎108将激发光输出到探询窗口106中并基于从探询窗口106发出并由检测器系统142接收的发射光利用检测器系统142生成信号的逻辑。在一个实施方案中，控制器156包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：利用第一光源110输出第一激发光112；利用第二光源114输出第二激发光116；基于从第一发射光纤134接收的第一激发光112利用第一检测器模块144生成第一发射信号；以及基于从第二发射光纤138接收的第二激发光116利用第二检测器模块150生成第二发射信号。
在一个实施方案中，控制器156还包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：使颗粒悬浮液和/或分子溶液流过通道102，诸如与通道102流体连通的悬浮液。如本文所用，“颗粒”是指诸如在周围介质内的局部对象或实体。在一个实施方案中，颗粒限定相对于其周围环境(诸如固体颗粒被包围并悬浮在液相或气相中)的相不连续性。如本文进一步所讨论，在某些实施方案中，颗粒是来自受试者、源自受试者、来自生物体、源自生物体、来自环境样本等的生物颗粒，诸如生物纳米颗粒。
在一个实施方案中，使悬浮液流过通道102包括使悬浮液逐颗粒或逐分子地流过通道102。此类颗粒的逐颗粒流动或分子的逐分子流动适合单独分析流过通道102的颗粒和/或分子。在一个实施方案中，探询窗口106限定相对于通道102的其他部分使管腔104变窄的收缩部。在一个实施方案中，逐颗粒流动和/或逐分子流动发生在管腔104的收缩部内。
在一个实施方案中，控制器156包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：对通道102中的颗粒和/或分子进行分级。此类分级可基于例如是否存在与颗粒和/或分子相关联的发射光(诸如由检测器系统142检测到的发射光)。在一个实施方案中，分级基于诸如由检测器系统142检测到的发射光的强度和/或发射光的波长。在一个实施方案中，分级与基于第一发射光146和第二发射光152中的一者或多者的颗粒和/或分子的测得发射光谱对应。在一个实施方案中，分级与基于第一激发光112和第二激发光116中的一者或多者的颗粒和/或分子的测量激发光谱对应。
如本文所用，术语“分配”是指为作为分配主体的颗粒和/或分子指定颗粒和/或分子类别的定量性质、定性性质或重要性。在一个实施方案中，可为颗粒分配尺寸值。在一个实施方案中，基于从颗粒或分子发出的光进行分配，并且基于此类发射光的存在、不存在和/或强度进行分配。如本文所用，术语“尺寸值”是指相对尺寸值或实际尺寸值。尺寸值提供线性距离的真实或相对度量。在某些实施方案中，由计算机和表示分配算法的软件执行分配。
如本文所用，术语“分级”是指通过分类来评估颗粒和/或分子的定量性质、定性性质或重要性。在一个实施方案中，颗粒和/或分子可被分级为零(例如，当纳米颗粒和/或分子具有低于可检出阈值的发射强度时)或非零(例如，当检测到颗粒和/或分子时)。在一些实施方案中，分级是二进制的。例如，为具有高于阈值限值的检测光强度的每个颗粒和/或分子分配值1，而为不具有高于阈值限值的检测光强度的每个测量样本分配值0，由此形成二进制分级。在其他实施方案中，颗粒和/或分子可根据另外的类别进行分级，例如，其与颗粒和/或分子的鉴定、存在可检测特性、存在区别特征等相关。可为分级分配对应于多个预定的定量或定性类别中的一者的任意数字。在其他实施方案中，分级是非二进制的，例如，基于从颗粒和/或分子测量的发射光强度的量来分配值。在某些实施方案中，由计算机和表示分级算法的软件执行分级。
如本文所用，“可检出特性”是指与颗粒和/或分子相关联的可观测性质，例如与颗粒和/或分子相关联的或纳米颗粒和/或分子固有的光活性、电活性、生物活性或磁性。在某些实施方案中，“可检出特性”包括颗粒和/或分子与可检出试剂或生物标志物的缔合。
光活性性质的示例包括例如通常由生物颗粒形态(粒度、内部亚细胞结构)引起的光强度的改变(光反射、散射、偏转、透射、吸收或发射)、荧光、冷光、免疫荧光等。光活性性质的检测可例如针对纳米颗粒上、纳米颗粒中或与纳米颗粒相关联的尺寸、质量、表面积、体积、蛋白质含量、膜面积、脂质含量、酶含量、代谢物含量、碳水化合物含量、肽含量、核酸含量、蛋白质同一性或核酸同一性进行报告。
在一个实施方案中，分级与颗粒的测得尺寸值对应。在一个实施方案中，测得尺寸值是相对尺寸值。在一个实施方案中，测得尺寸值用测得发射光强度的差来衡量。在一个实施方案中，测得尺寸值是实际尺寸值。
在一个实施方案中，系统100还包括被构造成引导颗粒和/或分子在通道102中的流动的导流器，诸如包括一个或多个阀。在一个实施方案中，导流器操作地耦合到控制器156，并且其中控制器156包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：基于从探询窗口106接收并与颗粒和/或分子相关联的发射光的存在或不存在来引导颗粒和/或分子的流动。在一个实施方案中，导流器操作地耦合到控制器156，并且其中控制器156包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：基于分级来引导颗粒和/或分子的流动。在一个实施方案中，引导颗粒和/或分子的流动包括将颗粒和/或分子引导到两个或更多个分选通道中的一者中。在一个实施方案中，导流器操作地耦合到控制器156，并且其中控制器156包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：量化与来自探询的发射光相关联的颗粒和/或分子的数量；以及确定与来自探询窗口106的发射光相关联的颗粒和/或分子的浓度。在一个实施方案中，浓度还基于测量流量体积，如本文结合图11A和图11B进一步所讨论。
在一个实施方案中，用于引导颗粒和/或颗粒的流动的导流器或流动引导机构包括电极、磁性元件、声学元件、电致动元件以及光学致动元件、电场或磁场。在一些实施方案中，用于引导颗粒和/或分子流动的机构包括一个或多个电致动阀或活塞，其中该阀或活塞控制液体在至少第一方向性流动通道中的流动，该第一方向性流动通道在第一接头处与第一输入通道和两个出口通道相交。在一个实施方案中，螺线管活塞是电致动螺线管阀的子部件。在另一个实施方案中，螺线管活塞通过模制嵌入装置中。在又一个实施方案中，嵌入式螺线管活塞可由经由管道流体连通的螺线管阀代替。
在一个特定实施方案中，本文提供的设备可包括用于跟踪和/或操纵颗粒和/或分子、颗粒、分子或流体样本的轨迹或流动的一个或多个电极。在某些实施方案中，电极可基于诸如介电电泳或电渗流或电泳的现象来增强纳米颗粒和/或分子的分离。在颗粒和/或分子具有小于100nm的流体动力学直径的实施方案中，鞘流聚焦或声聚焦可能不足以充分地操纵用于本文所公开的方法和设备的颗粒的轨迹，诸如引导通道102内的颗粒的轨迹。参见例如Optics Express，第15卷，第10期，第6167-6176页(2007年)，其以引用方式并入本文。因此，在一些实施方案中，用于聚集颗粒的机制不包括鞘流聚集、声流聚集或它们的组合。在一些实施方案中，颗粒是定向的，条件是所述定向不使用声聚焦、鞘流聚焦或它们的组合。
自校正的基于流动的颗粒分析
如上所述，在一个实施方案中，系统100包括：通道102，该通道被构造成使颗粒流过通道102的管腔104，通道102限定被构造成允许光进入和离开管腔104的探询窗口106；光引擎108，该光引擎包括：被定位成将第一激发光112输出到探询窗口106中的通道102的第一部分122上的第一光源110；以及被定位成将第二激发光116输出到探询窗口106中的通道102的与第一部分122分离的第二部分124上的第二光源114；以及检测器系统142，该检测器系统包括：被定位成接收从通道102的第一部分122发出的第一发射光146的第一检测器模块144；以及被定位成接收从第二部分124发出的第二发射光152的第二检测器模块150。本公开的系统100的此类实施方案适合用于自校正的单颗粒和/或单分子流动分析。如本文进一步所讨论，从流动流中的单颗粒和/或单分子发出的荧光的测量受到流动和激光束的剖面的显著影响。因此，荧光颗粒和/或分子的准确定量需要来自流动剖面和/或激光束剖面的信号的去卷积。
为了克服这些挑战，本公开内容提供了分析流动流中的单分子和颗粒(诸如囊泡、病毒、脂蛋白和大分子复合物)的系统和方法。此类系统和方法适合准确地执行以下操作：1)共定位在流过多个探询窗口或单个探询窗口106的各部分的相同颗粒和/或分子上表达的生物标志物，2)鉴定并计数单颗粒和/或分子，3)获得由每个单个颗粒和/或分子采样的流速，以及4)因此确定所分析的颗粒和/或分子的浓度。
简单地说，探询窗口106的空间分离部分以已知空间图案设置，并且在探询窗口106的两个不同部分处测量颗粒和/或颗粒的性质(例如荧光发射)两次(参见例如图8)。在层流下，特定颗粒流过探询窗口106的两个相邻部分或两个不同部分的通行时间与这两个部分之间的距离成比例。同样由于层流的性质，特定颗粒和/或分子在通道102的横截面中的位置通常保持相同。在两个此类部分之间的距离较小并且通行时间较短使得颗粒在通道内的扩散对应地较小的情况下尤其如此。因此，该特性表明，颗粒和/或分子与不同光源在通道横截面中非常相似位置处的不同激发光相互作用。考虑到这些性质，可以鉴定单种分析物(例如，由荧光染料染色的囊泡或病毒体或脂类纳米颗粒或单分子)并使用所提取的通行时间或所提取的位置或分析物在通道102的横截面中的相对位置来进一步共定位与分析物上的其他生物标志物相关联的荧光信号，诸如来自结合到其对应生物标志物上的不同染料标记的抗体和/或来自分析物或生物纳米颗粒的不同核酸染色剂和/或其他特定荧光染色剂(参见图8)。
因此，在一个实施方案中，在自校正的单纳米颗粒或单分子流动分析中使用的系统100包括用于执行本公开的自校正的单分子/颗粒流动分析方法的逻辑。在一个实施方案中，系统100包括控制器156，该控制器操作地耦合到光引擎108和检测器系统142，并且包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：测量探询窗口106的各个部分处的颗粒/分子的特性。在一个实施方案中，系统100包括控制器156，该控制器操作地耦合到第一光源110、第二光源114、第一检测器模块144和第二检测器模块150，包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：利用第一光源110输出第一激发光112；利用第二光源114输出第二激发光116；基于从第一部分122接收的第一发射光146利用第一检测器模块144生成第一发射信号；基于从第二部分124接收的第二发射光152利用第二检测器模块150生成第二发射信号；以及基于生成第一发射信号和第二发射信号之间的时间差以及第一部分122和第二部分124之间的距离来确定通道102中的颗粒的速度。在一个实施方案中，颗粒的速度用于确定通过管腔104的体积流速。
在传统流体动力学中，平均线速度
Figure BDA0004220925140000291
被定义为/>
Figure BDA0004220925140000292
其中V是体积流速并且A是横截面积。众所周知，如果流动剖面是抛物线形，则平均线速度是中心线处的速度的一半
Figure BDA0004220925140000301
传统上，首先测量体积流速，并相应地计算平均线速度。
在我们的系统中，因为体积流速极慢(例如约nl/分钟)，所以在某些实施方案中，不能方便地直接测量体积流速。相反，在一个实施方案中，通过测量许多单个颗粒(诸如大于100、500、1,000、5,000、10,000或更多个颗粒)的线速度来采样通道中的流动剖面，以获得平均观测值
Figure BDA0004220925140000302
在一个实施方案中，因为当我们对流动剖面进行采样时，观测线速度受到流动剖面的影响，所以/>
Figure BDA0004220925140000303
实际上不同于在传统流体动力学中定义的平均速度(即，
Figure BDA0004220925140000304
)。
在层流中，在单位时间期间通过各层的横截面的体积(ΔQ)为ΔQ＝u(r)·2πr·Δr。因此，在特定单位时间期间通过横截面的具有相同速度(即，u(r))的颗粒数量为，
Figure BDA0004220925140000305
其中C是颗粒的浓度。因此，观测线速度的平均值为：
Figure BDA0004220925140000306
其中r是横截面处的径向位置。在抛物线流动中，
Figure BDA0004220925140000307
就这一点而言，式2可被重新组织为
Figure BDA0004220925140000308
Figure BDA0004220925140000309
与V之间的关系是，/>
Figure BDA00042209251400003010
如图11A所示。
因此，在一个实施方案中，体积流速由下式确定，
Figure BDA0004220925140000311
其中
Figure BDA0004220925140000312
是许多单个颗粒通过通道的平均观测线速度，并且
R是通道的半径。上述分析假设通道具有圆柱形几何形状，但可容易地调整为具有矩形几何形状或正方形几何形状或任何其他几何形状的通道。
在一个实施方案中，控制器156还包括当由控制器156执行时致使系统100执行操作的逻辑，操作包括：基于由第一发射信号和第二发射信号共享的激发或发射信号特性或关系来关联第一发射信号和第二发射信号。
空气物镜
在一个实施方案中，系统100还包括光收集系统184，该光收集系统被定位成收集来自通道102的发射光(诸如第一发射光146和第二发射光152)并将所收集的发射光引导到检测器系统142上，光收集系统184包括具有在大于0.91且小于0.99的范围内的数值孔径的空气物镜186。在一个实施方案中，物镜186诸如空气物镜186具有约0.95的数值孔径。
如本文所用，“空气物镜”是指这样的光学物镜或透镜，其中物镜与其焦平面或焦点之间的空间至少部分地被诸如空气的气体占据，而不被诸如油或水的浸没液体占据。就这一点而言，空气物镜与其中透镜浸入设置在透镜与样本之间(通常在透镜与盖玻片或样本架之间)的油或水中的油浸透镜或水浸透镜相反。
如本文所用，“高NA(数值孔径)空气物镜”是指NA介于0.91和0.99之间、优选地介于0.92和0.98之间、更优选地介于0.93和0.97之间、甚至更优选地介于0.94和0.96之间的空气物镜。在一个实施方案中，空气物镜具有约0.95的NA。如本文进一步所讨论，此类高NA空气物镜适合执行单分子和/或单颗粒分析，诸如确定通过本公开的装置和系统的颗粒/分子的存在、不存在或浓度。如本文别处所述，高NA空气物镜提供优于常规物镜(诸如油浸物镜或水浸物镜)的诸多优点，诸如高光收集效率、准确且高效地扫描的能力以及许多其他优点。
空气物镜通常比例如油浸物镜更容易扫描并且更稳定。此外，在某些实施方案中，使用物镜186不是为了实现高图像质量(例如，高分辨率)，而是为了实现其高光收集效率。就这一点而言，空气物镜也优于油浸物镜。因此，具有较低数值孔径(诸如在大于0.91且小于0.99的范围内)的空气物镜186适合检测流动通道102中的单颗粒和/或单分子。
发射复用
在一个实施方案中，本公开的系统的检测器模块包括两个或更多个光电检测器，每个光电检测器被定位成接收来自发射光纤的远侧端部的发射光。就这一点而言，关注图2，其中示出了根据本公开的一个实施方案的系统的检测器模块242的示意图。在一个实施方案中，示出的检测器模块242是图1A所示的检测器系统142的检测器模块144或150的示例。
在例示的实施方案中，检测器模块242显示为包括多个光电检测器244、250A、250B和250C，这些光电检测器被定位成接收来自发射光纤234的远侧端部248的发射光246A或其部分，此处显示为荧光发射光246A。如图所示，检测器模块242包括被定位成接收从发射光纤234的远侧端部248发出的发射光246A的多个二向色镜260。此类二向色镜260被构造成反射发射光246A的一部分(例如，一个波长范围)并允许发射光的不同部分(例如，不同波长范围)通过二向色镜260。在例示的实施方案中，每个二向色镜260被定位成朝向光电检测器244、250A、250B、250C反射发射光246A的一部分，这些光电检测器被配置为基于发射光246A的该反射或透射部分生成信号。
就这一点而言，检测器模块242显示为包括设置在第一发射光纤234的远侧端部248与第一光电检测器244之间并被定位成将第一发射光246A的一部分246B反射到第一光电检测器244上的二向色镜260。在一个实施方案中，根据本公开的一个实施方案的系统的检测器还包括光学耦合到第二发射光纤的第二检测器模块，如图1A所示，诸如包括第二光电检测器的第二检测器模块。在图2所示的实施方案中，检测器模块242显示为分别包括第三光电检测器250A、第四光电检测器250B和第五光电检测器250C。在一个实施方案中，第一光电检测器244被配置为基于第一发射光246B的第一发射波长范围(诸如包括发射光246B)生成第一发射信号，并且其中第三光电检测器250A、第四光电检测器250B和第五光电检测器250C被配置为基于发射光246C、246D和246E中与发射光246B的第一发射波长范围不同或显著不同的第三发射波长范围、第四发射波长范围和第五发射波长范围生成第三发射信号、第四发射信号和第五发射信号。
虽然检测器模块242显示为包括4个光电检测器244、250A、250B和250C，但应当理解，任何数量的光电检测器都是可以的。在一个实施方案中，检测器模块包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个或更多个光检测器。
在例示的实施方案中，检测器模块242还包括被配置为对反射发射光246B-246E的一部分进行滤光的滤光器262，诸如带通滤光器262。就这一点而言，光电检测器244和250A-250C被配置并定位成基于发射光246A的滤光部分246B-246E生成信号。如本文进一步所讨论，在一个实施方案中，光引擎用不同波长的光激发通道中的颗粒和/或分子。还如本文进一步所讨论，在一个实施方案中，颗粒和/或分子本身可用一种或多种可检出试剂浸渍或与其缔合，可检出试剂被配置为发射具有不同波长范围的荧光并被配置为由不同波长的光激发。因此，图2所示的检测器模块242的配置适合利用阵列化光电检测器和对应的滤光器基于具有一个或多个波长范围中的波长的发射光来生成信号。就这一点而言，例示的检测器模块242适合执行颗粒和/或分子的发射复用，这将光发射到检测器模块242的部分上。如本文所用，“发射复用”是指适合通过分析从颗粒、分子或其他分析物发出的不同波长范围的光来分析此类颗粒、分子或其他分析物的系统或方法。
在一个实施方案中，第一发射光纤234的远侧端部248被配置为将第一发射光246A发射到至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个光电检测器上。在一个实施方案中，光电检测器中的每个光电检测器被配置为接收发射光的显著不同光谱部分，诸如当通过一个或多个二向色镜或光学滤光器接收时。
图2中示出的检测器模块242的部分显示为还包括被成形并定位成将反射发射光和/或透射发射光聚焦在其相应光电检测器上的透镜290。
在一个实施方案中，本公开的系统包括多个检测器模块，诸如如图2所示的一个或多个检测器模块242。在一个实施方案中，发射光纤的远侧端部中的每一者被配置为将发射光发射到检测器模块中，诸如如图2中所示。
激发复用
如本文进一步所讨论，本公开的系统的光引擎可包括被配置为输出各种波长范围的光的光源，诸如在适合激发设置在流过通道的颗粒中或颗粒上的一种或多种可检出试剂的波长范围中。在一些实施方案中，此类光波长范围重叠。在一些实施方案中，光波长范围是分开的。就这一点而言，关注图3A至图3F，其中示出了根据本公开的一个实施方案的光引擎308和由光引擎308照射的通道302的实施方案。
图3A是根据本公开的一个实施方案的系统的光引擎308和通道302的示意图。在一个实施方案中，光引擎308和通道302是图1A的系统100的光引擎108和通道102的示例。在一个实施方案中，光引擎308和通道302适合与图2的检测器模块242的部分结合使用。
在例示的实施方案中，光引擎308显示为包括四个光源，每个光源耦合到激发光纤的远侧端部。虽然示出了四个光源，但应当理解，更多或更少的光源也是可以的并且在本公开的范围内。还应当理解，如本文进一步所讨论，可在本公开的范围内使用自由空间光源。激发光纤显示为终止于被定位成输出激发光的激发光纤束。如图所示，激发光纤束头372被定位成将激发光输出到二向色镜360上并进入物镜386。激发光显示为从物镜386发射到探询窗口306内的通道302的相应部分上。
图3B是通道302的探询窗口306的示意图，该探询窗口限定管腔304，颗粒和/或分子被配置为流动通过该管腔。如图所示，第一激发光312被引导至通道302的第一部分322，第二激发光316被引导至通道302的与第一部分322隔开的第二部分324，第三激发光被引导至通道302的与通道302的第一部分322和第二部分324隔开的第三部分326，并且第四激发光被引导至通道302的与通道302的第一部分322、第二部分324和第三部分326隔开的第四部分328。通道302的第一部分322和第二部分324显示为由间距374隔开。在一个实施方案中，第一部分322和第二部分324的间距374对应于第一激发光纤364的远侧端部366与第二激发光纤368的远侧端部370之间的间距376，并且至少部分地由该间距限定。就这一点而言，激发光纤364的远侧端部366与激发光纤368的远侧端部370之间的间距376确定由光引擎308的光源照射的通道302的部分322与324之间的间距374。这由图4进一步示出，该图是根据本公开的一个实施方案的由光引擎308照射的通道302的荧光图像。
如上所述，部分322、324、326和328由间距374隔开。在一个实施方案中，此类间距在约100nm至约100微米、约10nm至约10微米、约500nm至约10微米、约1微米至约20微米、3微米至约30微米或2微米至约8微米的范围内。
在一个实施方案中，间距374基于照射在探询窗口306上的一个激发光(诸如激发光312)的中心与照射在探询窗口306上的另一激发光(诸如激发光316)的中心之间的距离。在另一个实施方案中，间距374基于照射在探询窗口306上的激发光的边缘(诸如激发光312的边缘与激发光316的相对边缘)之间的距离。
如本文结合图1A进一步所讨论，在一个实施方案中，部分322、324、326和328具有由在穿过高NA空气物镜386或被该高NA空气物镜聚焦之后照射在探询窗口306上的激发光(诸如激发光312和316)的宽度限定的宽度。在一个实施方案中，间距374与部分322、324、326和328中的一者或多者的宽度的比率大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1或更大。在一个实施方案中，间距374与部分322、324、326和328中的一者或多者的宽度的比率在约1:1至约20:1、2:1至约20:1、2:1至约10:1、2:1至约5:1的范围内。这样的比率足够大以从各个部分产生激发光，例如在来自不同部分322、324、326和328的发射之间具有最小串扰，诸如由本公开的系统的检测器模块检测到的。
图3C至图3F是根据本公开的光引擎308和通道302的示意图。在一个实施方案中，光引擎308和通道302是图3A的光引擎308和通道302的示例。如图所示，光引擎308包括第一光源310、第二光源314、第三光源318和第四光源320。在例示的实施方案中，光源310、314、318和320光学耦合到激发光纤364、368等，这些激发光纤的远侧端部在激发光纤束372中耦合在一起。第一激发光纤364的远侧端部366和第二激发光纤368的远侧端部370被布置成提供间距376。
在例示的实施方案中，光源310、314、318和320包括具有所关注波长的多个激光器。如图所示，在某些实施方案中，激光器310、314、318和320中的两者或更多者被配置为输出具有共同波长的光。在某些其他实施方案中，激光器310、314、318和320被配置为输出具有不同波长的光。
就这一点而言，光引擎308可被配置为用相同波长的光来分析或操纵通过通道302的颗粒和/或分子，诸如在特定颗粒移动通过通道302时跟踪特定颗粒。类似地，在一个实施方案中，光引擎308可被配置为用不同波长的光来分析或操纵颗粒，以帮助确定是否存在与不同标志物缔合的特定可检出试剂。
如本文进一步所讨论，光引擎308的光源的可变布置和波长范围适合执行激发和发射复用。如本文所用，“激发复用”是指用具有不同波长范围的激发光来分析颗粒、分子或其他分析物(包括激发与此类颗粒、分子或其他分析物缔合的可检出试剂)的方法。如本文进一步所讨论，通过用具有不同波长范围的激发光激发可检出试剂，可确定与可检出试剂缔合的颗粒、分子或其他分析物的不同质量或特性。
盖
在一个实施方案中，本公开的系统包括联接到发射光纤束的盖。就这一点而言，关注图5A至图5C，其中示出了根据本公开的一个实施方案的盖。
图5A示意性地示出根据本公开的一个实施方案的穿过光学不透明盖592的孔594A和594B并到达系统的发射光纤束530上的发射光。图5B示出了图5A的光学不透明盖592的示例。在一个实施方案中，发射光纤束530是图1A的发射光纤束130的示例。
如图所示，透镜590将第一发射光552和第二发射光546引导至发射光纤束头532。在例示的实施方案中，盖592限定被成形为允许第一发射光552通过并到达第一发射光纤534的近侧端部536上的孔594A。就这一点而言，允许第一发射光552穿过孔594A并到达第一发射光纤534的近侧端部536上。在一个实施方案中，盖592是光学不透明的。就这一点而言，诸如不是第一发射光552的光不太可能进入第一发射光纤534。
在例示的部分分解实施方案中，盖592显示为与发射光纤束头532分离。在一个实施方案中并且在使用中，光学不透明盖592联接到发射光纤束头532以防止或减少杂散光进入发射光纤。就这一点而言，光学不透明盖592适合增大检测器系统的信噪比和/或最小化或消除不同发射光之间的串扰(例如，进入第二发射光纤538的近侧端部540的第一发射光552的一部分，反之亦然)。
如图所示，光学不透明盖限定被成形为允许第二发射光546通过并到达第二发射光纤538的近侧端部540上的第二孔594B。就这一点而言，允许第二发射光546穿过盖592并进入第二发射光纤538。
虽然示出了呈线性布置的四个孔(包括孔594A和594B)，但应当理解，盖592的任何数量的孔可以各种构型布置以对应于发射光纤束530的发射光纤，诸如本文结合图1A和图1B进一步讨论的那些。
图5C是根据本公开的一个实施方案的系统的光纤束头532的近侧端部的图像。如图所示，光纤以线性构型布置，使得当图5A和图5B的盖592联接到其上时，孔594A和594B与光纤束头的光纤对准。
图6是根据现在将描述的本公开的实施方案的系统600的示意图。如图所示，系统600包括：通道602，该通道被构造成使颗粒或分子流过通道602的管腔604，通道602限定被构造成允许光进入和离开管腔604的探询窗口606；光引擎608；发射光纤束630，该发射光纤束被成形并定位成接收从探询窗口606发出的发射光；以及检测器系统，该检测器系统被配置为基于所收集的发射光生成信号。
在例示的实施方案中，光引擎608包括被定位成将光输出到通道602上的四个光源。就这一点而言，在一个实施方案中，光引擎608包括：被定位成将第一激发光612输出到探询窗口606中的通道602的第一部分上的第一光源；以及被定位或配置为将第二激发光616输出到探询窗口606中的通道602的与第一部分分离的第二部分上的第二光源。在一个实施方案中，光源是不耦合到激发光纤的自由空间光源。就这一点而言，在一个实施方案中，激发光的间距至少部分地由自由空间光源的间距限定。在另一个实施方案中，来自自由空间光源的激发间距至少部分地由来自其的激发光输出与诸如二向色元件和/或透镜以及其他光学部件组合的方式来限定。在一个实施方案中，光引擎608包括如本文结合图1A进一步讨论的光纤耦合光源。
如图所示，激发光被引导通过透镜690并照射在二向色镜660上，二向色镜将激发光反射到物镜686。物镜686收集激发光并将其引导至通道602的探询窗口606中。
从通道602发出的发射光通过物镜686和二向色镜660返回到发射光纤束630。如本文进一步所讨论，虽然示出了二向色镜，但在本公开的范围内其他部分反射/透射结构也是可以的。
在例示的实施方案中，系统600显示为还包括被定位成将光反射到发射光纤束630上的反射镜和被构造成避免除发射光之外的光进入发射光纤束630的盖692。
系统600显示为包括光学耦合到发射光纤的多个光电检测器。就这一点而言，系统600显示为包括发射光纤束630，该发射光纤束包括第一发射光纤634和第二发射光纤638，其中第一发射光纤634的近侧端部636的一部分和第二发射光纤638布置在发射光纤束头632中，并且其中第一发射光纤634的近侧端部636被定位成接收从第一部分发出的第一发射光646，并且第二发射光纤638的近侧端部640被定位成接收从第二部分发出的第二发射光652。发射光纤的近侧端部可指此类光纤的设置在发射光纤束诸如发射光纤束630中的部分以及与发射光纤束相邻的部分。
系统600显示为包括：被定位成接收从第一发射光纤634的远侧端部发出的第一发射光646的第一光电检测器644、658A和658B；以及被定位成接收从第二发射光纤638的远侧端部发出的第二发射光652的第二光电检测器650A和650C。
如本文结合图2进一步讨论并且在这里示出的，系统600还包括设置在第一发射光纤634的远侧端部与第一光电检测器644之间并被定位成将第一发射光646的一部分反射到第三光电检测器658A和658B上的二向色镜660。在例示的实施方案中，每根发射光纤光学耦合到二向色镜660以及带通滤光器662，继而光学耦合到第二光电检测器650A、650B和650C以及第三光电检测器658B、658C、658D、658E和658F。在一个实施方案中，第一光电检测器644被配置为基于第一发射光646的第一波长范围生成第一信号，第三光电检测器658A和658B被配置为基于第一发射光646的不同波长范围集生成一组信号。在一个实施方案中，第二光电检测器650A至650C被配置并定位成基于不同于第一发射光646的发射光(诸如基于第二发射光652)生成一组信号。就这一点而言，由每根发射光纤接收的发射光被配置为由多个光电检测器进行光谱分析。
如图所示，每根发射光纤光学耦合到多个光电检测器。例如，第一发射光纤634光学耦合到光电检测器644、658A和658B。在一个实施方案中，光电检测器644、658A和658B包括检测器模块，诸如本文结合图2进一步讨论的检测器模块。类似地，在一个实施方案中，光电检测器650A和658C被分组在第二检测器模块中。在一个实施方案中，此类检测器模块包括包封检测器模块的各种光电检测器的盒或其他外壳。
系统600显示为还包括操作地耦合到光引擎608和光电检测器的控制器656。如本文结合图1A进一步所论述，在一个实施方案中，控制器656被配置为设计光引擎608和光电检测器系统的操作，诸如以执行本公开的一种或多种方法。
控制器656还显示为操作地耦合到物理联接到通道602的可移动台688。通道602显示为是限定多个通道的微流体芯片的一部分。在一个实施方案中，控制器656包括当由控制器656执行时致使系统600利用可移动台688移动微流体芯片的逻辑。因此，物镜686的焦点从微流体芯片的第一通道602变为第二通道。就这一点而言，系统600可用于分析流过多个通道的颗粒和/或分子，诸如流过不同的颗粒悬浮液和/或分子溶液的多个通道。
自动聚焦
在一个实施方案中，本公开的系统适合诸如利用自动聚焦过程来分析流过其的颗粒或分子。就这一点而言，关注图7A和图7B，其中示出了根据本公开的一个实施方案的系统700。图7A是系统700的示意图。图7B是将系统700的高NA空气物镜786聚焦在系统700的通道702上的示意图。在一个实施方案中，系统700是图1A的系统100的示例或图6的系统600的示例。
如图所示，系统700包括：通道702，该通道被构造成使颗粒和/或分子流过通道702的管腔，通道702限定被构造成允许光进入和离开通道702的探询窗口706；可移动台788，该可移动台联接到通道702并被构造成相对于光收集系统784移动通道702；光引擎708；检测器系统；控制器756，该控制器操作地耦合到光引擎708、可移动台788和检测器系统。如图所示，通道702限定探询窗口706内的收缩部。如本文进一步所讨论，此类收缩部适合提供通过通道702的逐颗粒流动和/或逐分子流动。
在例示的实施方案中，光引擎708显示为将激发光712输出到二向色镜760上，该激发光被反射到光收集系统784中和通道702的探询窗口706中。发射光746显示为从探询窗口706发出，穿过二向色镜760、透镜790A和光学不透明盖778的孔794，由包括发射光纤束头732的发射光纤束730接收。发射光纤束730的发射光纤734中的一者的远侧端部显示在与检测器系统的光电检测器744相邻处终止。发射光穿过透镜790和带通滤光器762，然后照射在光电检测器上。光电检测器744被配置为基于所接收的发射光746生成信号。
在一个实施方案中，控制器756包括当由控制器756执行时致使系统700执行操作的逻辑。在一个实施方案中，根据本公开的一个实施方案，此类操作包括将光学部件聚焦在流体通道702上的一种或多种方法。在一个实施方案中，操作包括：利用来自光源的光照射流体通道702的探询窗口706；利用设置在通道702与光电检测器744之间的光学部件将光聚焦在探询窗口706上；基于在第一时间从探询窗口706背反射的聚焦光利用光电检测器744生成锁定信号；基于在第一时间之后的第二时间从探询窗口706背反射的聚焦光利用光电检测器744生成测试信号；确定测试信号是否在锁定信号的预定百分比内；以及如果测试信号在锁定信号的预定百分比之外，则相对于高NA空气物镜786移动流体通道702。如图7B所示，高NA空气物镜786可相对于通道702移动以将激发光712聚焦在通道702的管腔704内。在一个实施方案中，诸如响应于从控制器756接收的指令，利用可移动台788来控制空气物镜786的此类移动，如本文结合图6进一步所讨论。
图7C是示出根据本公开的一个实施方案的聚焦系统700的高NA空气物镜786的方法的框图。如图所示，该框图示出了通过将当前反射值与先前时间点(例如，200ms前)的值以及参考值进行比较来控制物镜786的运动的反馈回路。在测量值与参考或锁定值之间的差高于预定阈值的情况下，驱动马达以相对于高NA空气物镜786移动流体通道702。
在一个实施方案中，物镜被定位成利用光收集系统784收集从探询窗口背反射的聚焦光。在一个实施方案中，光收集系统784包括具有在约0.91至小于0.99的范围内或约0.95的数值孔径的空气物镜。
在一个实施方案中，光在不可见波长范围内。在一个实施方案中，光是红外光，诸如在约700nm至约2000nm的范围内。
在一个实施方案中，控制器756包括当由控制器756执行时致使系统700执行操作的逻辑，操作包括：用相机对通道702成像以及确定图像中的散焦量，例如通过基于通道702中具有已知形状和/或尺寸的结构(诸如通道702的壁)来确定图像中的散焦量。在一个实施方案中，结构可以是与通道702相邻的单独结构并且被设计用于执行此基于图像的自动聚焦和/或平台移动，以将通道定位在探询窗口内。在一个实施方案中，操作还包括：如果散焦量在预定范围之外，则相对于光收集系统784移动流体通道702。
在一个实施方案中，操作包括：利用来自光源的光照射系统700的成像区域；利用相机或其他图像传感器生成成像区域的图像；确定图像的散焦量；确定散焦量是否在预定散焦量内；以及如果测试信号在预定范围之外，则相对于高NA空气物镜移动流体通道702。在一个实施方案中，利用可移动台788使通道相对于高NA空气物镜移动。在一个实施方案中，操作是迭代的，因为例如相机周期性地生成图像以确认焦点和/或相对于高NA空气物镜移动通道702以调整焦点。在一个实施方案中，光源在不可见波长范围内。在一个实施方案中，光是近红外光，诸如在约700nm至约2000nm的范围内。在一个实施方案中，物镜是空气物镜。在一个实施方案中，物镜是具有介于0.91和0.99之间的NA的空气物镜。在一个实施方案中，物镜是具有介于0.92和0.98之间的NA的空气物镜。在一个实施方案中，物镜是具有介于0.93和0.97之间的NA的空气物镜。在一个实施方案中，物镜是具有介于0.94和0.96之间的NA的空气物镜。在一个实施方案中，物镜是具有约0.95的NA的空气物镜。
方法
在另一方面，本公开提供了探询颗粒和/或分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用本文所述的系统。
使用高NA(数值孔径)空气物镜进行单分子检测
在一个实施方案中，该方法是用于单分子检测的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用包括高NA空气物镜的光收集部件，诸如进行光收集。
在一个实施方案中，该方法包括使与可检出试剂缔合的多个分子流过通道。在一个实施方案中，这种流动包括使与可检出试剂缔合的多个分子流过通道，包括使多个分子中的分子逐分子地流过通道。就这一点而言，如本文其他地方所讨论，在一个实施方案中，多个分子中的分子一次一个地穿过通道，诸如穿过通道的包括收缩部的部分。就这一点而言，该方法适合单独照射流过通道的分子。
如上所述，分子与可检出试剂缔合。在一个实施方案中，单个分子与一种或多种可检出试剂缔合。在一个实施方案中，多个分子中的分子与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种可检出试剂缔合。如本文别处所讨论，此类可检出试剂被配置为响应于激发光而生成信号，诸如荧光信号。
在一个实施方案中，分子选自细胞信号分子、细胞因子、趋化因子、抗体、蛋白质、核酸、核酸结合蛋白、RNA结合蛋白、肽、碳水化合物、药物分子和治疗分子。
在一个实施方案中，该方法还包括在通道中照射多个分子中的分子。在一个实施方案中，照射分子包括在随着分子逐分子地流过通道而照射多个分子中的分子。在一个实施方案中，照射多个分子包括用光在一个或多个波长范围内的多个光源照射分子。在一个实施方案中，此类一个或多个光源被定位成照射通道的空间上不同部分，诸如探询窗口的不同部分，如本文其他地方所讨论。
在一个实施方案中，该方法包括收集来自超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％的流过通道的单分子的发射光。通过使多个分子逐分子地流过通道，可单独检测和评估分子。就这一点而言并且如本文结合图12A至图12C进一步所讨论，可通过本公开的方法和系统有效且准确地检测诸如分子的颗粒。这种有效且准确的检测适合准确地确定大量颗粒/分子中的颗粒和分子的浓度。这在例如基于对来自许多可检出试剂的信号进行的检测而为分子或颗粒分配值的情况下尤其重要。如果未检测到与分子或颗粒缔合的每种不同可检出试剂，则不能准确地鉴定该分子或颗粒。
在一个实施方案中，“单分子灵敏度”是指检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％的流过通道的单分子、优选地超过90％的流过通道的单分子的能力。在一个实施方案中，“单分子灵敏度”是指大于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、优选地大于90％的检测效率。
在一个实施方案中，对于流动的单分子和/或颗粒的“检测效率”是检测到的分子/颗粒的数量与流过通道(例如，流过激发区域)的分子/颗粒的数量之比。在一个实施方案中，“单分子检测效率”是指大于99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、优选地大于90％的检测效率。在一个实施方案中，“单分子检测效率”是指检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％的流过通道的单分子、优选地超过90％的流过通道的单分子的能力。对于给定类型的荧光分子/颗粒，具有“单分子灵敏度”或“单分子检测效率”是流动系统或设备的灵敏度的直接指标，并且因此是评估设备或仪器的灵敏度和性能的重要度量。
在一个实施方案中，在通道中照射多个分子中的分子包括使用线照明将激发光通过探询窗口输出到通道的一部分上。在一个实施方案中，在通道中照射多个分子中的分子包括使用共焦检测几何结构或线共焦检测几何结构将激发光通过探询窗口输出到通道的一部分上。
在一个实施方案中，利用紧密聚焦的激光线来实现对通道的照射，该激光线覆盖通道的整个横截面以确保以非常高的概率(诸如超过90％的概率，并且优选地接近100％的概率)照射和激发穿过通道的每个分子。在一个实施方案中，通过使用孔(例如光纤开口或狭缝孔)来实现共焦检测几何结构，这通过增大信噪比并通过最小化不同激发区域或激光线之间的串扰来提高检测灵敏度。在一个实施方案中，使用采用高NA空气物镜、具有紧密聚焦的激光线的线照明和共焦检测几何结构的设备，从而确保以高检测效率和高单分子灵敏度和高通量检测流过通道的每个分子或颗粒或几乎每个分子或颗粒。
在一个实施方案中，该方法包括利用光收集系统收集从通道发出的发射光，该光收集系统包括具有在0.91至小于0.99范围内、优选地约0.95的数值孔径的高NA空气物镜。如本文其他地方所讨论，高NA空气物镜特别适合收集相对大量的光。另外，此类空气物镜适合准确地扫描设备，同时保持空气物镜与成像装置之间的一致距离。通常，油浸或水浸物镜将油或水拖到成像装置上，因此在扫描时不能保持物镜与成像装置之间的一致距离。
在一个实施方案中，空气物镜具有介于0.91和小于0.99之间的数值孔径。在一个实施方案中，空气物镜具有在约0.92和约0.98的范围内、在约0.93和约0.97的范围内、在约0.94和约0.96的范围内的数值孔径。在一个实施方案中，空气物镜具有约0.95的数值孔径。
在一个实施方案中，该方法包括基于所收集的基于分子从通道发出的发射光生成发射信号。在一个实施方案中，如本文其他地方所述，使用一个或多个检测器系统、检测器模块和/或光电检测器生成信号。
在一个实施方案中，该方法包括基于该信号为颗粒和/或分子分配值。在一个实施方案中，该值基于从颗粒/分子发出的一个或多个荧光信号。此类值可用于例如分选多个颗粒/分子中的颗粒/分子，诸如基于设置在颗粒/分子上的一个或多个可检出部分的存在和/或不存在进行分选。
如上文所述，在一个实施方案中，本公开的方法、系统、装置和设备包括可有利于生物纳米颗粒和/或单分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定的包含微流体通道的微流体芯片。包含微流体通道的微流体芯片可用来处理小体积的流体样本，并且提供优于传统宏观尺度设备的优点(例如，与宏观尺度设备相比，微流体芯片仅需要微小体积的流体样本、需要较少试剂，并且在较短时间内进行处理，从而增加了效率)。在某些实施方案中，微流体芯片是平面设备，因此可通过使得能够使用高NA(数值孔径)物镜(例如高NA空气物镜)、透镜或具有高数值孔径的光收集系统来增强光收集并因此有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的检测、分析、确定和/或鉴定，从而有利于生物纳米颗粒和单分子的检测和分析。在某些实施方案中，微流体芯片是平面设备，从而增强其与显微镜装置(例如，与其上放置有微流体芯片的平移台)的相容性。微流体芯片还可允许设计和产生互连的没有死体积的流体网络，这继而可有利于生物纳米颗粒和/或分子的检测和操作(例如，在三个或更多个流体通道的连接处使用流量位移进行分选)。死体积是微流体芯片内的在流动路径外部的体积的一部分(例如，可能携带样本纳米颗粒和/或分子的液体可扩散到其中的体积，因此可能降低准确度)。通过微制造方法，微流体芯片可允许形成横截面为非球形或非正方形(例如，矩形)的通道，这可有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的检测、分析、测定和/或鉴定。微流体芯片可有利于形成沿通道长度具有不同宽度或高度的通道(例如，通道的宽度和/或高度具有收缩部或阶跃变化)，以有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定。微流体芯片可通过结合到具有期望厚度以及具有期望材料性质(例如折射率)的盖玻片(例如由玻璃或塑料制成)而形成，以增强与高效光收集系统(例如，高数值孔径物镜，诸如高NA空气物镜，需要适当的基底厚度以最大化光收集)的相容性，以有利于在途生物纳米颗粒和/或单分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定。微流体装置使得可以在同一装置上形成许多通道(例如，用于96个或384个样本的96个或384个通道)，用于大量样本的高通量分析(例如，96个或384个与多通道移液器相容的形式)。微流体芯片为生物纳米颗粒和/或单分子的操作、分离、分选和/或运输提供了有吸引力的多功能平台。
光纤束发射检测
在一个实施方案中，该方法：包括使颗粒和/或分子流过通道；通过探询窗口将第一激发光输出到通道的第一部分上；通过探询窗口将第二激发光输出到通道的与第一部分不同的第二部分上；基于通过第一发射光纤的近侧端部接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；以及基于通过第二发射光纤的近侧端部接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号，其中第一发射光纤的近侧端部和第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中。
在一个实施方案中，输出第一激发光和第二激发光包括用光引擎输出光，如本文进一步所讨论。在一个实施方案中，第一激发光和/或第二激发光包括诸如来自激光器的相干光。在一个实施方案中，第一光源和第二光源各自独立地选自固态激光器、二极管泵浦激光器、发光二极管(LED)、灯、电弧放电和自然光。
在一个实施方案中，第一光电检测器和第二光电检测器各自光学耦合到发射光纤束，如本文别处所述。在一个实施方案中，第一光电检测器是第一检测器模块的一部分，诸如本文结合图2进一步描述的检测器模块，其光学耦合到发射光纤束的第一发射光纤。在一个实施方案中，第二光电检测器是第二检测器模块的一部分，如本文结合图1A进一步所述，其光学耦合到发射光纤束的第二发射光纤。
在一个实施方案中，该方法包括利用包括第一发射光纤和第二发射光纤的发射光纤束接收第一发射光和第二发射光，其中第一发射光纤和第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中，并且其中第一发射光纤的近侧端部被定位成接收从第一部分发出的第一发射光，并且第二发射光纤的近侧端部被定位成接收从第二部分发出的第二发射光。
在一个实施方案中，使颗粒和/或分子流过通道包括使包括颗粒和/或分子的颗粒悬浮液和/或分子溶液流过通道。在一个实施方案中，颗粒悬浮液或分子溶液是或来源于生物样本。在一个实施方案中，颗粒悬浮液或分子溶液包含体液、或基于体液、或基于来自细胞或与细胞缔合的流体。在一个实施方案中，颗粒选自胞外囊泡、生物纳米颗粒、细胞器、微泡、细胞衍生囊泡、脂蛋白、大分子复合体、外泌颗粒、RNA结合蛋白、核酸结合蛋白、包含蛋白质或核酸的生物聚集体、蛋白质聚集体、核酸聚集体、脂质聚集体、单个生物分子、细胞因子、趋化因子、抗体、细胞信号分子、治疗分子、核酸、病毒、细菌和外泌体。在一个实施方案中，颗粒是胞外囊泡。在一个实施方案中，体液包括血清、血浆、脊髓液、唾液、鼻咽液、泪液、全血、尿液、痰或淋巴液。在一个实施方案中，颗粒是分离的。在一个实施方案中，分子是分离的。在一个实施方案中，颗粒与至少一种生物标志物缔合。
在一个实施方案中，使颗粒悬浮液和/或分子溶液流过通道包括使悬浮液和/或溶液逐颗粒地和/或逐分子地流过通道。在一些实施方案中，逐颗粒地检测多个颗粒中的至少一些。在一些实施方案中，逐分子地检测多个分子中的至少一些。在一些实施方案中，逐颗粒地和/或逐分子地照射多个颗粒和/或分子中的至少一些。逐颗粒地或逐分子地描述了对多个颗粒或分子单独地(即一次一个地)穿过一个区域(例如，具有给定宽度的光束)的观测。作为逐颗粒地或逐分子地的非限制性示例，包含多个颗粒或分子的流体样本可流过微流体通道的收缩部并穿过光束，使得多个颗粒或分子中的至少一些单独地穿过光束(即，不存在多个颗粒中的任何其他颗粒)。作为逐颗粒地或逐分子地的颗粒或分子的另一个非限制性示例，包含多个颗粒或分子的流体样本可流过微通道并穿过光束，使得一次不超过一个颗粒或分子穿过光束，而与多个颗粒或分子中的其他颗粒或分子没有任何重叠。在一些具体实施方案中，大部分颗粒或分子穿过光束，使得一次不超过一个颗粒或分子穿过光束，而与多个颗粒或分子中的其他颗粒或分子没有重叠。在一些实施方案中，逐颗粒地或逐分子地照射多个被照射颗粒或分子中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的颗粒或分子。在优选实施方案中，逐颗粒地或逐分子地照射多个颗粒或分子中被照射颗粒或分子的大于90％。在一些实施方案中，逐颗粒地或逐分子地检测多个被检测颗粒或分子中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的颗粒或分子。在优选实施方案中，逐颗粒地或逐分子地检测多个被检测颗粒或分子中大于90％的颗粒或分子。
单个颗粒或分子的照射可指在包含多个颗粒或分子的流体样本中并且在不存在多个颗粒或分子中的任何其他颗粒或分子的情况下被照射的颗粒或分子。单个颗粒或分子的照射不同于被随机共定位于照射区域的两个或更多个颗粒或分子的照射。单个颗粒或分子的照射不同于颗粒或分子的聚集体的照射。作为非限制性示例，单个颗粒或分子可穿过光束并因此被照射。单个颗粒或分子可在不存在多个颗粒或分子中的任何其他颗粒或分子的情况下穿过光束，单个颗粒或分子因此被自身照射。在一些实施方案中，单个颗粒或分子是可在流体样本中不存在任何其他颗粒或分子的情况下被光源探询的单个纳米颗粒或分子(例如，对于给定光束宽度，单个颗粒或分子存在于光束中，因此允许其在不存在多个颗粒或分子中的任何其他颗粒或分子的情况下被照射)。
虽然描述了使颗粒流过通道并且逐颗粒地检测颗粒，但应当理解，相同的概念通过类比应用于使用本公开的方法和系统逐分子地进行的分子的流动和检测。因此，在一个实施方案中，本公开的方法包括使分子逐分子地流过通道，诸如流过通道的探询窗口。就这一点而言，感兴趣分子诸如与一种或多种可检出试剂缔合的分子一次一个地通过探询。因此，在一个实施方案中，一次只有一个分子与探询窗口内的可检出试剂缔合。类似地，在一个实施方案中，没有两个或更多个感兴趣分子同时与探询窗口内的相应可检出试剂缔合。在一个实施方案中，其他分子在通道的探询窗口内，其中感兴趣分子与可检出试剂缔合。此类分子可包括例如帮助感兴趣分子流动的溶剂分子。
在一个实施方案中，此类可逐分子地通过探询窗口的分子选自蛋白质、肽、抗体、细胞因子、趋化因子、信号分子、治疗分子、药物分子、RNA结合蛋白、大分子复合物、核酸、DNA、RNA、合成分子、适体等。在一个实施方案中，分子选自单个染料分子、单个蛋白质染料分子、单个聚合物染料分子、单个聚合物点、单个荧光探针、单个荧光单元、与一种或多种染料缀合的单个抗体、与一种或多种染料缀合的单个蛋白质、与一种或多种染料缀合的单个核酸分子。
在一个实施方案中，第一发射光和第二发射光独立地选自散射发射光、冷光发射光、荧光发射光以及它们的组合。
在一个实施方案中，颗粒是生物颗粒。在一个实施方案中，生物颗粒是生物纳米颗粒。在一个实施方案中，颗粒选自胞外囊泡、细胞器、微泡、细胞衍生囊泡、脂蛋白、大分子复合体、外泌颗粒、RNA结合蛋白、核酸结合蛋白、包含蛋白质或核酸的生物聚集体、蛋白质聚集体、核酸聚集体、脂质聚集体、单个生物分子、细胞因子、趋化因子、抗体、细胞信号分子、治疗分子、核酸、核酸结合蛋白、RNA结合蛋白、DNA结合蛋白、治疗分子、病毒、细菌和外泌体。
如上所述，在一个实施方案中，本公开的方法适合分析流过通道的相对小的颗粒。在某些实施方案中，颗粒的尺寸是流体动力学直径。在具体实施方案中，流体动力学直径小于1,000纳米、小于900纳米、小于800纳米、小于700纳米、小于600纳米、小于500纳米、小于400纳米、小于300纳米、小于200纳米、小于150纳米、小于100纳米、小于90纳米、小于80纳米、小于70纳米、小于60纳米、小于50纳米、小于40纳米或小于30纳米。在优选实施方案中，流体动力学直径小于100纳米。在某些实施方案中，流体动力学直径通过测量动态光散射(DLS)来确定，并且是指以与被测量的生物纳米颗粒相同的方式漫射光的硬球的尺寸。
在一些实施方案中，流体动力学直径介于1,000纳米和1纳米之间、介于900纳米和1纳米之间、介于800纳米和1纳米之间、介于700纳米和1纳米之间、介于600纳米和1纳米之间、介于500纳米和1纳米之间、介于400纳米和1纳米之间、介于300纳米和1纳米之间、介于200纳米和1纳米之间、介于100纳米和1纳米之间、介于90纳米和1纳米之间、介于80纳米和1纳米之间、介于70纳米和1纳米之间、介于60纳米和1纳米之间、介于50纳米和10纳米之间或介于40纳米和1纳米之间。在某些实施方案中，流体动力学直径介于1,000纳米和800纳米之间、介于800纳米和600纳米之间、介于600纳米和400纳米之间、介于400纳米和200纳米之间或介于200纳米和10纳米之间。在优选实施方案中，流体动力学直径介于200纳米和2纳米之间。在另外的优选实施方案中，流体动力学直径介于200纳米和10纳米之间。在更优选实施方案中，流体动力学直径介于100纳米和20纳米之间。
在某些实施方案中，颗粒的尺寸是直径。在具体实施方案中，直径小于1,000纳米、小于900纳米、小于800纳米、小于700纳米、小于600纳米、小于500纳米、小于400纳米、小于300纳米、小于200纳米、小于150纳米、小于100纳米、小于90纳米、小于80纳米、小于70纳米、小于60纳米、小于50纳米、小于40纳米或小于30纳米。在优选实施方案中，直径小于100纳米。在某些实施方案中，通过使用电子显微镜(TEM)或超分辨率成像测量来确定直径。
在一些实施方案中，直径介于1,000纳米和1纳米之间、介于900纳米和1纳米之间、介于800纳米和1纳米之间、介于700纳米和1纳米之间、介于600纳米和1纳米之间、介于500纳米和1纳米之间、介于400纳米和1纳米之间、介于300纳米和1纳米之间、介于200纳米和1纳米之间、介于100纳米和1纳米之间、介于90纳米和1纳米之间、介于80纳米和1纳米之间、介于70纳米和1纳米之间、介于60纳米和1纳米之间、介于50纳米和10纳米之间或介于40纳米和1纳米之间。在某些实施方案中，直径介于1,000纳米和800纳米之间、介于800纳米和600纳米之间、介于600纳米和400纳米之间、介于400纳米和200纳米之间或介于200纳米和10纳米之间。在优选实施方案中，直径介于200纳米和2纳米之间。在另外的优选实施方案中，直径介于200纳米和10纳米之间。在更优选实施方案中，直径介于100纳米和20纳米之间。
在一个实施方案中，该方法还包括引导颗粒或分子的流动。在一个实施方案中，基于是否存在从探询窗口接收到并与颗粒或分子相关联的发射光来引导颗粒或分子的流动。在一个实施方案中，基于由检测器系统从探询窗口接收到的发射光的强度来引导颗粒或分子的流动。就这一点而言，该方法适合将例如发射荧光和/或散射激发光的颗粒或分子与不发射荧光和/或散射激发光的那些颗粒或分子分离。
在一个实施方案中，引导颗粒或分子的流动包括将颗粒或分子引导到一个或两个或更多个分选通道中，这样的两个或更多个通道包括用于提供超过预定阈值的荧光信号或发射信号的那些颗粒或分子的通道和用于不提供超过预定阈值的荧光信号或发射信号的那些颗粒或分子的通道。在一些实施方案中，该方法包括将颗粒或分子分选成富集群体。在一些实施方案中，分选包括流动位移分选。在一些实施方案中，分选不包括声聚焦或物理屏障的使用。在一些实施方案中，分选通过尺寸值、存在生物标志物、不存在生物标志物、测得光强度、发射波长、多个发射波长、颗粒或分子的鉴定或它们的组合来确定。在一些实施方案中，分选通过存在生物标志物组合来确定。在一些实施方案中，分选通过存在一种或多种生物标志物和不存在一种或多种其他生物标志物的不存在来确定，诸如基于免疫表型(immune phenotype或immuno-phenotype)(表型基于通过抗体组合的结合测量的标志物的存在、不存在或量)。在一些实施方案中，表型至少部分地通过颗粒上存在或不存在两种或更多种生物标志物来确定(例如，免疫表型)，并且可通过物理特征(诸如颗粒大小或颗粒是否含有核酸或构成颗粒的脂质分子的量)来进一步知情或确定。参见例如本文进一步讨论的实施例9。在一些实施方案中，分选通过设定分选阈值按存在的生物标志物的数量或类型来确定。
在一个实施方案中，该方法包括：量化或计数与来自探询的发射光相关联的颗粒和/或分子的数量；以及确定与来自探询窗口的发射光相关联的颗粒和/或分子的浓度。参见例如本文进一步讨论的实施例13。
在一个实施方案中，该方法包括基于是否存在来自探询窗口的发射光对通道中的颗粒或分子进行分级。在一个实施方案中，分级与基于第一发射光和第二发射光中的一者或多者的颗粒或分子的测得发射光谱对应。在一个实施方案中，分级与颗粒的测得尺寸值对应。在一个实施方案中，测得尺寸值是相对尺寸值。在一个实施方案中，测得尺寸值用测得光强度的差来衡量。
在一个实施方案中，颗粒或分子与可检出试剂缔合。在一个实施方案中，可检出试剂可以例如是存在于待分析颗粒上或中的感兴趣分子(例如，胞外囊泡上或中的蛋白质、或核酸、或生物标志物)。另选地，可检出试剂可以是这样的分子(例如，与荧光探针或核酸探针缀合的抗体)，其与缔合到颗粒的靶分子(例如，胞外囊泡或生物纳米颗粒或大分子复合物上或中的蛋白质、或核酸分子、或生物标志物)缔合，从而能够检测到纳米颗粒。在一些实施方案中，可检出试剂是荧光的，因此可通过本领域已知的基于荧光的检测方法来检测。
在一个实施方案中，颗粒包含至少一种生物标志物，诸如与一种或多种可检出试剂缔合的生物标志物。在一个实施方案中，该方法包括测定至少一种生物标志物的至少一个拷贝数，如本文结合实施例10进一步所讨论。
如本文所用，“缔合”包括经由共价和/或非共价相互作用的相互作用。例如，可检出试剂可共价附着于颗粒。另选地，可检出试剂可例如嵌入颗粒的膜中和/或颗粒的疏水内部中。在特定实施方案中，可检出试剂可经由诸如范德华力或静电力的非共价相互作用嵌入颗粒的膜中。
在具体实施方案中，可检出试剂与颗粒表面缔合。在一些实施方案中，可检出试剂可共价和/或非共价附着于颗粒表面。在其他实施方案中，可检出试剂可嵌入颗粒表面内。在具体实施方案中，可检出试剂被颗粒表面包围，例如，膜染料嵌入胞外囊泡的脂质层中。与颗粒表面缔合的可检出试剂的关系提供关于颗粒尺寸的信息。例如，具有大表面积的颗粒将与大量可检出试剂缔合，而具有小表面积的颗粒将与少量可检出试剂缔合。与颗粒表面缔合的可检出试剂的数量关系提供光强度与纳米颗粒表面积之间的相关性。这样，发射光强度的量对应于颗粒尺寸，并且具体地对应于颗粒表面积。
如本文结合实施例11进一步所讨论，所测定的颗粒尺寸(诸如通过来自膜染料的荧光的强度)连同与颗粒表面上的分析物缔合的多种可检出试剂的拷贝可用于确定颗粒是否是完整颗粒。
在其他实施方案中，可检出试剂与颗粒内部缔合。在一些实施方案中，可检出试剂嵌入颗粒内(例如，亲脂性染料嵌入脂蛋白内)。在一些实施方案中，可检出试剂不与颗粒表面缔合，而是嵌入颗粒内，或以其他方式被颗粒包围。在具体实施方案中，可检出试剂被颗粒环绕，但不与内表面缔合，例如，胞外囊泡内不与其脂质膜内部缔合的自由漂浮染料。内部可检出试剂，诸如嵌入颗粒中的那些(例如嵌入脂蛋白中的亲脂性染料)或被颗粒环绕但不与内表面缔合的那些(例如囊泡内的自由漂浮染料)在本文中也称为“体积染料”。被颗粒嵌入或包围的体积染料的关系提供关于颗粒尺寸的信息。例如，具有大体积的颗粒将包含大量体积染料，而具有小体积的颗粒将包含更少体积染料。颗粒内的体积染料的数量关系提供光强度与纳米颗粒体积之间的相关性。这样，发射光强度的量对应于颗粒尺寸，并且具体地对应于颗粒体积。
在一些实施方案中，颗粒包含体积染料和与表面缔合的可检出试剂两者。包含体积染料和表面缔合可检出试剂两者的纳米颗粒可提供与颗粒的表面积和体积两者相关的信息。在一些实施方案中，体积染料和表面积可检出试剂相同。在其他实施方案中，体积染料和表面积可检出试剂不同。在某些实施方案中，体积染料可提供关于被检测或隔离的颗粒的鉴定或类型的信息。在一些实施方案中，作为荧光底物的体积染料的使用可提供关于被检测或隔离的颗粒的鉴定或类型的信息。在一个具体实施方案中，作为对颗粒诸如外泌体特异性的酶的荧光底物的体积染料的使用可进一步提供关于被检测或隔离的颗粒的鉴定或类型的信息。
在一些实施方案中，颗粒用膜染料和膜渗透核酸染料诸如膜渗透RNA染料标记。如本文结合实施例11进一步所述，可检出试剂的此类组合适合确定颗粒是否包括核酸，诸如RNA或DNA，以及确定颗粒是否包括膜或含有脂质分子。此类颗粒可进一步用可检出试剂诸如荧光标记的抗体标记，该可检出试剂被配置为选择性地结合到表面标志物，以便确定颗粒的免疫表型以及确定它是否包括膜和/或核酸，即包括物理特性(例如，是否存在脂质膜和/或核酸)和免疫表型(例如，某些生物标志物是否存在或具有如由抗体报告的不同量)的总体表型。
在一个实施方案中，可检出试剂选自荧光标记的抗体、荧光标记的蛋白质、荧光标记的核酸、荧光标记的脂质、膜染料、荧光染料、染料、聚合物点以及它们的组合。在一个实施方案中，可检出试剂选自冷光染料、荧光染料、荧光标记的抗体、荧光标记的蛋白质、荧光标记的核酸、荧光标记的脂质、荧光标记的碳水化合物、荧光标记的小分子、膜染料、荧光染料、染料、聚合物点、酶的荧光底物、膜渗透核酸染料(诸如膜渗透RNA染料)或它们的组合。
在一些实施方案中，可检出试剂特异性结合与颗粒缔合的一种或多种结合靶标。在某些方面，结合靶标是多肽诸如蛋白质，并且可检出试剂是特异性地结合到靶标多肽的荧光标记的抗体。当涉及生物纳米颗粒时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)与......发生免疫反应”是指通常在纳米颗粒和其他生物学的异质群体中，确定感兴趣生物纳米颗粒的存在或与感兴趣生物纳米颗粒缔合的生物标志物的存在的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，指定抗体与特定生物纳米颗粒的结合是背景的至少两倍，并且更典型地是背景的超过10倍至100倍。在此类条件下与抗体的特异性结合需要针对其对特定生物纳米颗粒或对特定生物标志物或对特定分子(例如细胞因子、趋化因子、抗体、核酸)的特异性而选择的抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与所选抗原发生特异性免疫反应而不与其他蛋白发生特异性免疫反应的那些多克隆抗体。这种选择可通过去除与其他分子交叉反应的抗体来实现。
在一个实施方案中，可检出试剂是第一可检出试剂，并且其中颗粒与第二可检出试剂缔合。在一个实施方案中，可检出试剂是第一可检出试剂，并且其中分子(例如细胞因子或细胞信号分子)与第二可检出试剂缔合。在一个实施方案中，第一可检出试剂具有在第一发射波长范围内的第一发射光谱，并且第二可检出试剂具有在不同于第一发射波长范围的第二发射波长范围内的第二发射光谱。在一个实施方案中，第一可检出试剂具有在第一激发波长范围内的第一激发光谱，并且第二可检出试剂具有在第二激发波长范围内的第二激发光谱。在一个实施方案中，第一可检出试剂和第二可检出试剂具有类似、相同和/或重叠的发射光谱。在一个实施方案中，第一可检出试剂和第二可检出试剂具有不同的发射光谱。在一个实施方案中，第一可检出试剂和第二可检出试剂具有类似、相同和/或重叠的激发光谱。在一个实施方案中，第一可检出试剂和第二可检出试剂具有不同的激发光谱。
在一些实施方案中，可检出试剂附着于颗粒表面，可检出试剂在颗粒表面中，可检出试剂在颗粒内部内，可检出试剂在颗粒基质内，或为它们的组合。在一些实施方案中，可检出试剂是荧光的，可检出试剂是冷光的，或为它们的任何组合。在一些实施方案中，颗粒与多种可检出试剂缔合。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的至少一种附着于颗粒表面。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的至少一种附着于颗粒表面并且多种可检出试剂中的至少一种在颗粒表面中。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的至少一种附着于颗粒表面并且多种可检出试剂中的至少一种在颗粒内部内。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的至少一种附着于颗粒表面并且多种可检出试剂中的至少一种在颗粒基质内。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的至少一种附着于颗粒表面，多种可检出试剂中的至少一种在颗粒表面中，多种可检出试剂中的至少一种在颗粒内部内，或为它们的组合。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的可检出试剂具有重叠的发射分布。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的可检出试剂具有相同的发射分布。在一些实施方案中，发射分布具有相同的峰值波长。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的可检出试剂具有重叠的激发分布。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的可检出试剂具有相同的激发分布。在一些实施方案中，激发分布具有相同的峰值波长。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的可检出试剂包含相同的可检出试剂。在一些实施方案中，多种可检出试剂中的可检出试剂包含多于一种类型的可检出试剂。
在某些方面，多种可检出试剂中的可检出试剂具有不同的发射分布。在一些实施方案中，发射分布具有不同的峰值波长。就这一点而言，可检出试剂适合用于发射复用，由此不同的发射光谱用于检测不同的可检出试剂。在一个实施方案中，可检出试剂具有不同的发射寿命。在一个实施方案中，可检出试剂在共同波长下具有不同的发射强度。
在一个实施方案中，第一可检出试剂具有在第一激发波长范围内的第一激发光谱，并且第二可检出试剂具有在不同于第一激发波长范围的第二激发波长范围内的第二激发光谱。就这一点而言，可检出试剂适合用于激发复用，由此可通过用不同的激发波长范围激发它们来使用不同的可检出试剂。
在一个实施方案中，可检出试剂被配置为由不同波长范围内的光激发。在一个实施方案中，可检出试剂被配置为由第一波长范围内的第一激发光激发第一量并且由不同于第一波长范围的第二波长范围内的第二激发光激发第二量。就这一点而言，可检出试剂被配置为响应于第一激发光发出第一强度的发射光并且响应于第二激发光发出第二强度的发射光。第一发射光和第二发射光的比率可用于跟踪或以其他方式鉴定与可检出试剂缔合的颗粒。
在一些实施方案中，峰值波长隔开大于10纳米、大于20纳米、大于30纳米、大于40纳米、大于50纳米、大于75纳米、大于100纳米、大于120纳米、大于140纳米、大于160纳米、大于180纳米、大于200纳米、大于300纳米、大于400纳米、大于500纳米、大于600纳米或大于700纳米。
在另一方面，本公开提供了一种用于分析流体样本中的颗粒的方法。在一个实施方案中，该方法包括：使包含多个颗粒和/或分子的流体样本流过通道；在通道中照射多个颗粒中的颗粒或多个分子中的分子；利用光收集系统收集从通道发出的发射光，该光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99范围内的数值孔径的高NA空气物镜；以及基于所收集的基于颗粒或分子从通道发出的发射光生成信号；以及基于该信号为颗粒或分子分配值。
在一些实施方案中，采用流体装置的检测或成像使用具有等于或大于0.91、等于或大于0.92、等于或大于0.93、等于或大于0.94、等于或大于0.95、等于或大于0.96、等于或大于0.97或等于或大于0.98的数值孔径的光收集系统。在优选实施方案中，光收集系统包括具有约0.95的数值孔径的空气物镜。如本文进一步所讨论，高NA空气物镜适合单分子流动检测。此类空气物镜通常比油浸物镜更稳定并且更容易扫描。在光收集效率比图像质量更重要的情况下，诸如在基于流动的分析和单分子流动检测中，尤其如此。在许多实施方案中，本公开的方法包括基于来自探询通道的发射生成信号。此类信号通常不是常规的图像信号，诸如产生通道中或固定在表面上或基质中的颗粒或分子的图像的图像信号。相反，在许多实施方案中，本公开的方法依赖于从通道发射的光的存在、不存在或强度。就这一点而言，光收集效率和发射光强度对于本公开的方法而言更重要。这与常规成像应用相反，在常规成像应用中，图像分辨率和缺乏光学像差(例如，球面像差或色差)可能与简单的光收集效率一样重要或更重要。因此，高NA空气物镜通常是合适的，并且油浸或水浸物镜是不必要的并且通常不适用于本公开的方法。
在一个实施方案中，该方法是测定颗粒尺寸的方法，并且其中值是尺寸值。在一个实施方案中，基于是否存在来自探询窗口的发射光对通道中的颗粒进行分级。在一个实施方案中，基于来自探询窗口的发射光的强度对通道中的颗粒进行分级。在一个实施方案中，分级与基于第一发射光和第二发射光中的一者或多者的颗粒的测得发射光谱对应。在一个实施方案中，分级与颗粒的测得尺寸值对应。在一个实施方案中，测得尺寸值是相对尺寸值。在一个实施方案中，测得尺寸值用测得光强度的差来衡量。
在一个实施方案中，颗粒或分子与可检出试剂缔合。在一个实施方案中，可检出试剂是第一可检出试剂，并且其中颗粒或分子与第二可检出试剂缔合。在一个实施方案中，第一可检出试剂具有在第一发射波长范围内的第一发射光谱，并且第二可检出试剂具有在不同于第一发射波长范围的第二发射波长范围内的第二发射光谱。在一个实施方案中，可检出试剂是荧光可检出试剂。在一个实施方案中，第一可检出试剂具有在第一发射波长范围内的第一发射光谱，并且第二可检出试剂具有与第一发射波长范围共同、相同、类似和/或重叠的第二发射光谱。
自校正的基于流动的分析
在另一方面，本公开提供了一种自校正的单分子/颗粒流动分析的方法。从流动流中的单分子或颗粒发出的荧光的测量受到流动和/或激光束的剖面的显著影响。因此，在一个实施方案中，荧光分子的准确定量要求从流动剖面去卷积信号，这通常很难，甚至是不可能的。所观测信号的复杂性质及其解释对分析流动流中的颗粒(例如胞外囊泡(EV)、脂蛋白、RNA结合蛋白和病毒)或分子(例如细胞因子、抗体、核酸分子、蛋白质、肽和细胞信号分子)提出了许多挑战。挑战包括：i)共定位对EV或其他生物纳米颗粒的表型分析而言重要的生物标志物；ii)测量颗粒的浓度；iii)检查生物异质性，通常由生物标志物的拷贝数描述；iv)确定与EV或其他生物纳米颗粒缔合的生物标志物的拷贝数；以及v)表征物理性质，诸如用膜染料染色的囊泡或颗粒的尺寸。
为了克服这些挑战，本公开提供了适合以自校正方式分析流动流中的单分子和颗粒的方法。使用此类“自校正的单分子/颗粒”方法，可以准确地执行以下操作：1)共定位在探询窗口内流过通道的多个激发区域或部分的同一颗粒上表达的生物标志物，2)鉴定并计数单颗粒和/或分子，3)获得由每个单颗粒和/或分子采样的流速，以及4)因此测量所分析的颗粒和/或分子的浓度。使用此类“自校正的单分子/颗粒”方法，还可以准确地确定与EV或其他生物纳米颗粒缔合的生物标志物的拷贝数。参见例如实施例10。
简单地讲，在该方法中，探询窗口内的通道的多个激发区域或部分配置有已知的空间图案。在颗粒流经的微通道的两个不同部分测量颗粒或分子两次(参见例如图8)。因为通过微流体通道的流动通常是层流，所以流过通道的任何两个相邻或紧密间隔的激发区域或部分的特定颗粒的通行时间一般来讲与通道的这两个激发区域或部分之间的距离和颗粒的速度成比例。同样由于层流的性质和通道的激发区域或部分之间的小间隔距离，特定颗粒在通道横截面中的位置在通行时间期间一般来讲保持相同。因此，该颗粒通常与在通道横截面中非常类似的位置处聚焦在通道不同部分上的不同激光束相互作用。考虑到这些性质，可以鉴定单种分析物(例如，被荧光染料染色的囊泡或用抗体标记的生物纳米颗粒)，并且使用所提取的通行时间或颗粒速度来进一步共定位其他生物标志物(参见例如图8)。
因此，在一个实施方案中，该方法包括：使颗粒流过通道的管腔，该通道限定被构造成允许光进入和离开管腔的探询窗口；利用第一光源将第一激发光输出到探询窗口的通道的第一部分中；利用第二光源将第二激发光输出到探询窗口的通道的与第一部分分离的第二部分中；基于从第一部分接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；基于从第二部分接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号；以及基于第一发射信号与第二发射信号之间的时间差以及第一部分与第二部分之间的距离来确定通道中的颗粒的速度。在一个实施方案中，该方法包括使用本公开的任何系统。如本文别处所讨论，在一个实施方案中，第一光电检测器是第一检测器模块的一部分并且第二光电检测器是第二检测器模块的一部分。
在一个实施方案中，该方法包括使用时间箱(time bin)检测光，诸如第一发射光和第二发射光。所公开的用于确定生物纳米颗粒特性的设备和方法可快速进行，具有较短信号积分时间或快速箱时间。箱时间可用于评估例如荧光探询的开始-停止时间，以便帮助分选信息。时间箱(在本文中也被称为信号积分时间)可公开事件发生或观测到事件的直方图中的时间范围。在一些实施方案中，生物纳米颗粒的检测、测量和/或探询使用时间箱。在一些实施方案中，时间箱具有小于10ms、小于5ms、小于1ms、小于0.5ms、小于0.1ms、小于90μs、小于80μs、小于70μs、小于60μs、小于50μs、小于40μs、小于30μs、小于20μs、小于10μs、小于5μs或小于1μs的范围。在一些实施方案中，时间箱具有介于10ms和0.1ms之间、介于5ms和0.1ms之间、介于1ms和0.1ms之间、介于0.5ms和0.1ms之间、介于0.1ms和1μs之间、介于90μs和1μs之间、介于80ns和1μs之间、介于70ns和1μs之间、介于60ns和1μs之间、介于50ns和1μs之间、介于40ns和1μs之间、介于30ns和1μs之间、介于20ns和1μs之间、介于10μs和0.1μs之间、介于5μs和0.1μs之间、介于1μs和0.1μs之间的值。在优选实施方案中，时间箱具有介于1μs和2ms之间的范围。
在一个实施方案中，该方法包括基于由第一发射信号和第二发射信号共享的发射信号特性或颗粒特性使第一发射信号与第二发射信号相关。在一个实施方案中，基于发射信号特性或基于颗粒特性使第一发射信号与第二发射信号相关。如图8中所示，在第一检测窗口或通道的第一部分或第一激发线中检测到的信号可在下游在第二检测窗口或通道的第二部分或第二激发线中检测到。就这一点而言，可在颗粒前进通过通道时对其进行跟踪。另外，还可针对各种不同生物标志物来探询颗粒。在一个实施方案中，如本文进一步所讨论，检测窗口包括通道的一部分或激发光的激发线和/或至少部分地由通道的一部分或激发光的激发线限定。
在一个实施方案中，该方法包括基于发射信号特性或基于颗粒特性使第一发射信号与第二发射信号相关。在一个实施方案中，使第一发射信号与第二发射信号相关包括将第一发射信号的强度与第二发射信号的强度进行比较。在一个实施方案中，该方法还包括基于使第一发射信号与第二发射信号相关来对穿过通道的颗粒数量进行计数。在一个实施方案中，该方法还包括基于使第一发射信号与第二发射信号相关来在颗粒上共定位靶分子。在一个实施方案中，该方法还包括基于使第一发射信号与第二发射信号相关来确定颗粒浓度。此类浓度可至少部分地基于通过通道的体积流速来进一步限定，如本文结合图11A和图11B进一步所讨论。在一个实施方案中，该方法还包括基于使第一发射信号与第二发射信号相关来确定检测效率和回收率。
在一个实施方案中，颗粒与一种或多种可检出试剂缔合。在一个实施方案中，一种或多种可检出试剂被配置为响应于激发光而生成一个或多个信号。在一个实施方案中，颗粒与一种或多种膜染料缔合。在一个实施方案中，颗粒与一种或多种体积染料结合。此类可检出试剂可用于检测颗粒中是否存在标志物，如本文结合图9A至图9D进一步所讨论。
在一个实施方案中，该方法包括检测每个颗粒和/或分子以及用其自身的流动信息(诸如颗粒和/或分子的通行时间和/或颗粒和/或分子的速度)标记颗粒和/或分子。在一个实施方案中，用对应的流动信息(例如通行时间和/或速度)标记或分配检测颗粒或分子实现自校正的流动分析。
图9A在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的穿过流体装置的通道的两个激发区域或部分的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的标记颗粒的膜染料的吸收和发射光谱。在例示的实施方案中，颗粒(例如胞外囊泡或脂质体)用膜染料(例如二-8-ANEPPS)标记，并且由具有相同波长(例如488nm)的两条激光线激发。就这一点而言，可通过测量从通道的两个例示部分发射的信号之间的时间来跟踪颗粒。如所讨论的那样，这种跟踪在通过对通道中的颗粒悬浮液的流速进行准确采样来对颗粒群中的颗粒进行计数、对通过通道的颗粒进行计数以及在计算流过通道的悬浮液中的某些类型颗粒的浓度时是有用的。如所讨论的那样，这种跟踪在用不同荧光探针标记的颗粒上共定位不同生物标志物时也是有用的。
图9B在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的穿过流体装置的通道的两个激发区域或部分的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的标记颗粒的膜染料的吸收和发射光谱。在例示的实施方案中，颗粒(例如胞外囊泡或脂质体)用膜染料(例如二-8-ANEPPS)标记，并且由具有不同波长(例如405nm和488nm)的两条激光线激发。在一个实施方案中，膜染料由第一波长和第二波长两者激发，尽管程度不同。在一个实施方案中，染料响应于第一激发光(例如405nm激光)而发射第一强度的信号并且响应于第二激发光(例如488nm激光)而发射不同于第一强度的第二强度的第二信号。因此，在一个实施方案中，该方法包括测量在通道或激发区域的不同位置处生成的信号的比率，诸如信号强度的比率。只要染料以高于某一水平存在于颗粒中或颗粒上，就可使用该比率准确地鉴定颗粒。
图9C在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的穿过流体装置的两个激发区域的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的颗粒的吸收和发射光谱。在例示的实施方案中，颗粒(例如胞外囊泡或脂质体)用两种膜染料(例如DiO和DiD)的组合标记，并且由具有不同波长(例如488nm和640nm)的两条激光线激发。如图所示，染料基于不同波长范围内的激发光提供单独的发射信号。就这一点而言，可通过测量由两种染料从两个检测窗口(即，通道的两个例示部分或激发区域)发射的两个信号之间的时间来跟踪颗粒。
图9D在左侧用图形示出了根据本公开的一个实施方案的穿过流体装置的两个检测窗口的颗粒，并且在右侧示出了根据本公开的一个实施方案的颗粒的吸收和发射光谱。在例示的实施方案中，颗粒(例如胞外囊泡或脂质体)用与体积染料(例如钙黄绿素AM)组合的膜染料(例如DiD)标记。如图所示，染料基于不同波长范围内的激发光提供单独的发射信号。就这一点而言，可通过测量由两种染料从通道的两个例示部分或激发区域(检测窗口)发射的两个信号之间的时间来跟踪颗粒。
自校正的单分子/颗粒计数方法提供许多优点，与其他传统方法相比，结果的质量大大提高，如下所述。
准确计数和共定位。
因为本公开的方法在真实事件(例如胞外囊泡或生物纳米颗粒)的鉴定中去除或减少了许多干扰信号，诸如背景波动和染料的小聚集体，所以本方法适合获得或测定更准确数量的分析物(例如胞外囊泡或生物纳米颗粒或分子)。(参见例如图10A、图10B、图11B、图12、图14和图15)。通过统计方法(例如交叉相关函数)在流动流中共定位单分子事件经常遭受空间接近事件、污染、背景波动的干扰，并且特别是遭受由层流剖面引起的颗粒之间的线速度差异的干扰。使用本方法，可以最小化这些干扰，并且因此改善计数和共定位的质量。图14A示出了根据本公开的一个实施方案的用二-8-ANEPPS膜染料、抗CD63-Alexa647抗体和抗CD81-PE/CF594抗体标记的精浆胞外囊泡的多色共定位。图14B示出了根据本公开的一个实施方案的基于二-8-ANEPPS膜染料、抗CD63-Alexa647抗体和抗CD81-PE/CF594抗体的共定位的精液细胞外囊泡的亚群或亚型。图15示出了根据本公开的一个实施方案的精浆胞外囊泡(sEV)的浓度的测量结果。
生物标志物(诸如在相同生物纳米颗粒上表达的那些生物标志物)的准确共定位是许多重要应用(例如用于鉴定生物纳米颗粒或分子的亚型的免疫表型，参见实施例9)的基础。当流动流中非常接近的多个颗粒和/或分子通过激发区域或检测窗口时，将在不同检测窗口处观测到的信号或来自不同激发区域的信号正确地分配给给定颗粒和/或分子可能具有挑战性，因为由于微流体流动环境的层流性质和抛物线流动剖面，颗粒/分子可能在微流体通道中以宽范围的速度流动。使用本公开的方法解决了这些困难以能够将生物标志物准确地共定位在单个生物纳米颗粒或分子上(参见例如图10A、图10B、图11、图12、图14和图15以及相关实施例)。
准确地采样流速。
本公开的自校正方法提供了流过通道横截面中不同位置的每个颗粒的通行时间。利用由不同空间分离的激发光照射的通道或检测窗口的各部分之间的已知间距，可计算每个被检查颗粒的线速度并且相应地确定体积流速样本。如图11A所示，可以将平均线速度转换为通过通道的体积流速。
通常需要知道基于微流体的分析中的体积流速来确定在实验期间已经分析的样本的体积。因此，可基于分析物/分子/纳米颗粒的计数及分析体积来测量单颗粒/分子的绝对浓度。体积流速也是评价样本的通量和消耗的有用参数。尽管很重要，但由于激发区域探询的样本具有超小体积，体积流速的直接测量在微流体环境中常常具有挑战性，特别是当体积流速极低(例如，每秒几pL至几nL)时。使用本公开的方法，基于在该微流体环境中流动是层流的事实，可使用流过激光线或激发区域的每个分子和/或颗粒的通行时间来确定体积流速。因此，可计算每个颗粒和/或分子的线速度，从而知道这些激光线或激发区域之间的距离。利用所测量的平均颗粒和/或分子速度并且通过知道通道横截面的面积，可测量体积流速。因此，使用本公开的方法，可通过使用所测量的单颗粒和/或单分子通行时间和/或速度来确定体积流速(参见例如图10、图11、图15和相关实施例)。
浓度的准确测量。
因为利用本方法可以准确地确定在给定时间段内检查的单种分析物的数量并且通过知道体积流速来获得样本的分析体积(通常为纳升水平)，所以本方法也适合准确地测量分析物的浓度。图11B示出了根据本公开的一个实施方案的通过系统通道的流体样本中胞外囊泡的浓度的测量结果，使用图11A中所示的比较进行计算。因为本公开的方法提供给定体积中分析物的绝对计数，而不依赖于从大量样本获得的参数(例如消光系数)和任何外部校准曲线，所以可以实现分析物浓度的更准确测定。图15示出了根据本公开的一个实施方案的精浆胞外囊泡(sEV)的浓度的测量结果。
检测效率和回收率的准确确定。
检测效率可定义为在流过通道或激发区域或检测区域或检测窗口的分析物中，诸如通过本公开的方法计数的分析物的分数。如果与流过通道的分析物相关联的信号的分布遵循已知统计模型(例如，在流动分析中常见的对数正态分布)，则可以通过知道截止值处的累积分布函数(CDF)来量化检测效率。
回收率，诸如被定义为所计数分析物与掺入或存在于给定体积中的分析物的量之间的比率的回收率，除了受到检测效率的影响之外，还受许多其他因素(例如，原液浓度的准确性、分析物的可能聚集和降解、表面吸收等)的影响。如果准确地知道分析物的原液浓度，则也可以相应地确定回收率。图12A至图12C示出本公开的方法对单荧光染料和颗粒(例如，EV)都格外灵敏。就这一点而言，图12A至图12C示出本公开的方法对单个小分子(例如Alexa647标记的抗体，参见图12B)和蛋白质(R藻红蛋白(PE，参见图12C))染料都格外灵敏，具有超过99％的检测效率。用膜染料染色的EV的平均SNR为约54，具有高于95％的回收率，这在原液浓度的不确定性内；从而表明对颗粒和分子的灵敏度高于通过常规方法可获得的灵敏度。
拷贝数的准确确定
如本文结合实施例10进一步所讨论，本公开的方法适合确定存在于单个颗粒上的生物标志物的拷贝数。因为本方法适合检测样本中存在的单分子/颗粒或样本的等分试样或穿过微通道的非常大百分比的此类分子/颗粒(诸如大于90％)的整个群体，所以本方法还可使用单分子强度分布对单颗粒强度分布去卷积以准确地确定每个颗粒上的结合抗体的数量并因此确定对应蛋白质的数量。此类方法可用于确定例如与颗粒诸如EV缔合的荧光标记的抗体的数量，以提供关于单颗粒的分子组成的定量信息。如本文结合实施例12进一步所讨论，该信息与关于颗粒尺寸的其他信息一起可用于确定所分析的颗粒是完整的还是片段化的，或确定所分析的颗粒是空的(例如含有核酸)和无功能的还是具有生物学功能的。
自动聚焦方法
在另一方面，本公开提供了一种将系统的光学部件聚焦在系统的通道上的方法。以单分子/颗粒水平计数和测量流动中的颗粒和分子，诸如胞外囊泡、病毒、脂蛋白、RNA结合蛋白或细胞因子，通常对环境(例如热引起的膨胀)和仪器配置(例如光学对准的细微漂移和通道尺寸的变化)的变化极其灵敏。为了一致地收集数据并提高基于流动的装置的灵敏度，本公开提供了一种自动聚焦方法。
在一个实施方案中，诸如经由本文结合图7A进一步讨论的光纤耦合共焦方案来收集激发光，诸如由微流体装置背反射的特定激光(例如870nm)。该背反射的幅度经外部校准并用中性密度滤光器衰减以确保其处于光电检测器的动态范围内。在一个实施方案中，背反射光的优选或最佳值在实现检测通道的正确聚焦时确定并且被设置为“锁定”聚焦水平的参考值(参见例如图7B)。在一个实施方案中，微流体装置的一部分(诸如包括探询窗口的通道)或物镜可操作地联接到机动可移动台，诸如由压电或DC马达驱动的台。就这一点而言，光收集系统被配置为相对于通道的探询窗口移动以将光收集系统聚焦在探询窗口上。如图7C详细示出的，可基于将反射的当前值与先前时间点(例如，200ms前)的值以及参考值进行比较来控制可移动台。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了穿过光学部件将激发光聚焦在流体通道上的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用结合图7A和图7B在本文进一步讨论的系统700。在一个实施方案中，该方法包括：利用来自光源的光照射流体通道的探询窗口或其他部分；利用设置在通道与光电检测器之间的光学部件将光聚焦在探询窗口上；基于在第一时间从探询窗口背反射的聚焦光利用光电检测器生成锁定信号；基于在第一时间之后的第二时间从探询窗口背反射的聚焦光利用光电检测器生成测试信号；确定测试信号是否在锁定信号的预定百分比内；以及如果测试信号在锁定信号的预定百分比之外，则相对于高NA空气物镜移动流体通道。
如图7C、图7F和图7G所示，在一个实施方案中，预定百分比为约5％。在一个实施方案中，预定百分比在约0.5％至约15％的范围内、在约1％至约10％的范围内、在约2％至约8％的范围内、在约2.5％至约7.5％的范围内、在约3％至约6％的范围内或在约3％至约5％的范围内。
在一个实施方案中，本公开提供了一种保持聚焦在流体通道上的方法，该方法包括：利用来自近红外光源的光照射微流体系统的成像区域；利用相机生成成像区域的图像；确定图像的散焦量；确定散焦量是否在预定散焦量内；以及如果测试信号在预定范围之外，则相对于高NA空气物镜移动流体通道。在一个实施方案中，被成像的结构是与通道相邻的结构，并且在某些实施方案中是与通道分离的结构。在一个实施方案中，该结构相对于成像区域的其他部分具有高水平的对比度。在一个实施方案中，该结构限定了在微流体系统内的空气填充外壳。此类填充空气结构将具有比例如填充流体通道更高的对比度，并且就这一点而言，适合生成确定图像的散焦量的图像。
图7D是根据本公开的一个实施方案的在距离高NA空气物镜的多个距离拍摄的并且具有不同散焦量的通道的一系列图像。图7E示出了根据本公开的一个实施方案的在通道与高NA空气物镜之间的各种距离处的聚焦质量的量，注意图7D的图像的位置。在例示的实施方案中，使用NIR成像和NA 0.95空气物镜来检测焦平面。图16用图形示出了根据本公开的一个实施方案的通过使用近红外成像或机器视觉与高数值孔径空气物镜(NA＝0.95)一起实现自动聚焦的设备。
如图所示，聚焦通道包括收缩部。如图7E所示，实时监测收缩部的聚焦质量。当物镜向上移动时，聚焦质量增加，直至它达到第一最大值，这表明焦平面位于收缩通道的底部。随着物镜位置的升高，聚焦质量下降并随后增加至第二最大值，这表明焦平面设置在收缩通道的顶部。图7D中的四张图片示出了当高NA空气物镜对应地处于四个位置时的实时成像。
图7F示意性地示出了根据本公开的一个实施方案的用于设置焦平面的反馈控制回路。图7G是根据本公开的一个实施方案的用于执行由近红外机器视觉通过高NA空气物镜辅助的实时聚焦的另一个反馈控制回路。图7F和图7G中示意性地示出的聚焦方法可用于实现通道的聚焦。
在一个实施方案中，该方法包括利用光收集系统收集从探询窗口背反射的聚焦光，其中光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99的范围内或约0.95的数值孔径的空气物镜。
在一个实施方案中，该方法包括通过利用光收集系统收集光来利用相机收集用于生成成像区域的图像的光，其中光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99的范围内或约0.95的数值孔径的空气物镜。
在一个实施方案中，光在约700nm至约1.5μm的范围内。在一个实施方案中，光在约700nm至约1100nm的范围内。在一个实施方案中，光在不可见波长范围内。
以上所述的某些过程是根据计算机软件和硬件来描述的。所述技术可构成体现在有形或非暂态机器(例如，计算机)可读存储介质内的机器可执行指令，这些指令在由机器执行时将致使机器执行所述操作。另外，过程可体现在硬件内，诸如专用集成电路(“ASIC”)或其他硬件。
有形机器可读存储介质包括以机器(例如，计算机、网络装置、个人数字助理、制造工具、具有一组一个或多个处理器的任何装置等)能够访问的非暂态形式提供(即，存储)信息的任何机制。例如，机器可读存储介质包括可记录/不可记录介质(例如，只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、磁盘存储介质、光学存储介质、闪存存储器装置等)。
本发明的例示实施方案的以上描述(包括说明书摘要中描述的内容)并不旨在是穷尽性的或将本发明限于所公开的精确形式。虽然本文出于说明目的描述了本发明的具体实施方案和实施例，但相关领域的技术人员将认识到的，各种修改也可以在本发明的范围内。
根据以上具体实施方式，可对本发明进行这些修改。以下权利要求中使用的术语不应被解释为将本发明限于说明书中公开的具体实施方案。相反，本发明的范围完全由所附权利要求确定，这些权利要求将根据权利要求解释的既定原则来解释。
实施例
实施例1：使用自由空间激光器和发射光纤束的复用单颗粒/分子检测
本实施例描述了能够使用自由空间激光器和发射光纤束在流动中进行单分子和单颗粒分析的设备。该设备(例如图6)被配置为检测来自空间上分离的不同激发区域或检测窗口或通道的部分的多个颜色通道中的荧光，包括两个功能模块：使用自由空间激光器的激发模块和使用发射光纤束和检测器模块的检测器系统。
激发模块将多个激光束组合并成形为期望的轮廓和空间图案(例如图4)。激发区域之间的间距可例如通过望远镜结构来调节，诸如彼此共轭的两个平凸透镜(f＝75mm和f＝125mm)。激光束由柱面透镜(f＝200mm)成形以产生四条线(针对四个激发区域/检测窗口/通道的部分)，之后由多频带二向色镜或由部分反射镜透射到物镜的后焦平面。因此，四条激光线聚焦在微流体通道的相应四个部分上，从而形成四个激发区域或检测窗口(图3B)，其中用荧光染料标记的颗粒或分子流动并与激发激光照射装置相互作用，从而导致从每个颗粒或分子发出荧光。
取决于应用，该激发模块可以不同方式配置。例如，波长为405nm、488nm、561nm和640nm的四条激光线以相等间距聚焦在微流体通道上，或另选地波长为488nm、488nm、561nm和640nm的四条激光线以相等间距聚焦在微流体通道上，或波长为488nm、405nm、640nm和561nm的四条激光线以相等间距聚焦在微流体通道上，或波长为355nm、405nm、488nm和640nm的四条激光线以相等间距聚焦在微流体通道上。尽管相等间距通常是优选的，但在一些应用中，可能希望具有不相等间距，这可通过调节激发模块容易地实现。可容易地调节激光器和激发区域的数量，诸如扩展以包括更多激光颜色。
检测器系统分离并定量地测量从四个激发区域发出的荧光。为了随着颗粒/分子经过四个空间分离的激光线/激发区域并与其相互作用而收集从颗粒/分子发射的四个空间分离的荧光信号，我们使用发射光纤束(例如图5)。光纤束的每根光纤收集由激光线/激发窗口中的每一者对颗粒/分子的激发所引起的荧光，并且由每根光纤收集的荧光可被进一步光谱分离并由检测器模块的不同光电检测器检测(例如图2)。这里，由物镜收集的荧光穿过多频带二向色镜并由镜筒透镜聚焦。四个狭缝的微制造阵列被准确地放置在镜筒透镜的焦平面处，使得仅来自通道的期望部分的光可穿过狭缝(例如图5A)。因为该狭缝阵列被放置在光纤束的近侧端部(例如图5A)，所以来自四个激发区域/激光线的四个紧密间隔的荧光信号通过光纤束的四根光纤被分离。
然后通过检测器模块中的一系列二向色镜和带通滤光器将来自光纤束的每根光纤的荧光信号进一步光谱分离，诸如分离成若干色带(例如图2)。使用非球面透镜(f＝7.8mm)，对应于光谱区或色带的荧光随后聚焦在光电检测器上，诸如雪崩光电二极管或单光子计数模块，光子在其上被转换成电信号。使用高频计数装置，一定时间间隔内的光子数量被计数并存储在与该设备通信的计算机上的二进制文件中，以供进一步分析，如以下实施例中所述。
实施例2：使用高数值孔径空气物镜对在具有线照明和共焦检测的平面微流体通 道中流动的单分子和颗粒进行超高灵敏度和稳健的检测
本实施例描述了利用线共焦检测对在平面微流体通道中流动的单分子进行超高灵敏度和效率检测的设备和方法。对于在平面微流体芯片或通道中流动的单颗粒，该设备和方法提供了与对于流过平面微流体通道的单分子所描述的相同的超高水平灵敏度和效率。
单分子流动分析通常受限于缺乏灵敏度、通量和稳健性。为了解决这些挑战，实施例1中描述的设备配置有高数值孔径空气物镜和具有平面通道的微流体装置。为了确保超高单分子检测灵敏度，收集尽可能多的光信号是至关重要的，并且在我们的设备中，我们使用0.95NA空气物镜。尽管当使用浸没介质(例如油或水)时物镜的NA可高于1.0，但此类“湿”物镜大大降低了系统的稳健性，更容易发生介质的振动、漂移和蒸发。通过用“湿”物镜在微流体芯片上从一个平面通道扫描到另一个平面通道来将感兴趣通道从一个通道切换到另一个通道也是困难的，因为此类“湿”物镜常常由于浸润介质的拖尾效应而难以在更长距离上扫描，因此导致显著降低的吞吐量和更复杂的仪器设计。
除了使用高NA空气物镜之外，平面微流体通道是实现单分子流动分析的超高灵敏度和效率的另一个重要部件。高NA物镜通常要求非常有限的工作距离(例如，对于在该实施例中使用的40倍/0.95NA物镜为170μm)，因此一般来讲只有物镜与样本之间的平面基底或芯片适合该工作距离。其他广泛使用的流动构造(诸如微毛细管)通常具有比这种非常有限的工作距离更厚的壁，并且因此不适合与高NA物镜一起使用。另外，平面微流体通道的使用消除了与圆柱形毛细管的使用相关联的球形/圆柱形像差，该像差是影响高NA物镜的收集效率和聚焦质量的另一重要因素。此外，微流体芯片或装置可有利于形成沿通道长度具有不同宽度或高度的通道(例如，通道的宽度和/或高度具有收缩部或阶跃变化)，以有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定。通过微制造方法，微流体芯片可允许形成横截面为非球形或非正方形(例如，矩形)的通道，这可有利于在途生物纳米颗粒和/或分子的检测、分析、测定和/或鉴定。微流体芯片可通过结合到具有期望厚度以及具有期望材料性质(例如折射率)的盖玻片(例如由玻璃或塑料制成)而形成，从而增强与高NA空气物镜的相容性以最大化光收集，并且有利于在途生物纳米颗粒和/或单分子的操作、检测、分析、测定和/或鉴定。最后，微流体装置使得可以在同一装置上形成许多通道(例如，用于96个或384个样本的96个或384个通道)，用于大量样本的高通量分析(例如，96个或384个与多通道移液器相容的形式)。微流体芯片提供与高NA空气物镜一起使用以实现单分子和/或颗粒的超高灵敏度和效率分析的有吸引力的多功能平台。
如该实施例中所述，用覆盖通道的整个横截面的紧密聚焦的激光线照射通道(例如图3B和图4)确保以接近百分之百的概率照射和激发通过通道的每个分子。使用孔(例如图5A)的共焦检测几何结构通过增大信噪比并通过最小化不同激发区域或激光线之间的串扰提高了检测灵敏度。我们的设备使用高NA空气物镜、具有紧密聚焦的激光线的线照明和共焦检测几何结构，从而确保以高效率以及高灵敏度和通量检测流过通道的每个分子或颗粒。这与现有技术形成对比，例如当使用聚焦激光点(不是紧密聚焦的激光线)来探询流过通道的分子的一些或一小部分时，因为激光点的直径仅为几微米(例如5微米)并且不能很好地照射具有大得多的直径(例如100微米)的毛细管的整个横截面；位于100μm直径毛细管的中心处的5微米直径激光点仅占通道横截面的约1/400并且分子或颗粒在其中流动，即使假设流过该激光点的每个分子都被检测到，这也只说明检测到流动的400个分子中的约1个。为了解决此问题，在我们的设备中，激光束由柱面透镜(f＝200mm)成形以形成一组激光线，该组激光线聚焦在平面微流体通道的收缩部的中心处以照射通道的整个横截面(例如图4)，因此流动的每个分子可与激光激发相互作用。此外，共焦几何形状(经由光纤的充当孔的开口或具有狭缝(图5A))增强了来自流动的每个分子的检测信噪比，从而得到超高检测效率(检测到的单分子的数量超过流过通道的单分子的数量)。
接下来的实施例3将更详细地描述使用该实施例2中所述的设备实现的检测效率。除了在接下来的实施例3中详细描述的极高单分子检测效率之外，与油浸或水浸物镜相比，高NA空气物镜的使用提供了流动的单分子的高度稳定和稳健的检测。图14示出了运行2000秒的空白样本(PBS缓冲液)，背景噪声完全没有变化，表明没有与高NA空气物镜相关联的不稳定性或变化，而使用油浸或水浸物镜时通常不是这种情况。
实施例3：在流动下实现单分子的高检测效率
该实施例示出了使用实施例1和实施例2中描述的装置(即0.95NA空气物镜和发射光纤束)以极高检测效率检测流动的单分子的能力。
对于流动的单分子和/或颗粒的检测效率是检测到的分子/颗粒的数量与流过通道(例如，流过激发区域)的分子/颗粒的数量之比。对于给定类型的荧光分子/颗粒，该度量是流动分析设备的灵敏度的直接指标，并且因此是评估设备或仪器的灵敏度和性能的重要度量。
在该实施例中，我们应用单分子计数的原理来确定检测效率。当测量单分子的群体时，我们始终获得信号的分布，而不是具有来自每个分子的相同信号。这些信号的变化由分子的固有性质(例如光子发射概率或漂白概率)和外部因素(诸如来自测量过程本身)两者确定。我们的研究表明这种分布可能遵循对数正态分布。图12B和图12C分别示出单个R-藻红蛋白(PE)和Alexa 647的信噪比(SNR)的分布。在拟合到对数正态分布之后，应用统计度量(例如，确定系数R2)来量化拟合质量。当R2值高于特定阈值(例如0.98)时，我们可推断单分子SNR的分布遵循对数正态模型。
在信号分析中，通常将检测限(LOD)定义为可与SNR为3的背景区分来的最弱信号。使用相同的定义并使用对数正态分布的结果，当SNR高于LOD时，可计算累积分布。使用该分析，图12B和图12C示出了流动的单个PE和Alexa647的检测效率超过99％(例如，分别为99.5％和99.8％)。
实施例4：自校正的流动分析
该实施例描述了一种使用自校正的微流体通道中的荧光测量来鉴定具有与每个颗粒相关联的特定流动信息的生物颗粒群的方法。
生物纳米颗粒通常通过物理参数和/或生物参数来描述。例如，胞外囊泡(EV)是从细胞释放的脂质双层限定的颗粒，并且可通过用膜染料染色进行鉴定，当插入疏水环境(例如脂质双层)中时，膜染料可表现出强荧光。流动的EV的成功分析(例如，多色共定位、检测效率的确定、流动剖面的测量以及浓度的估计)需要对每个颗粒进行检测以及用其自己的流动信息(例如，速度)来标记颗粒。使用上述实施例中所述的设备，我们描述了用其自身的流动信息(例如速度)来标记每个检测到的颗粒。取决于用于检测EV的具体标志物，可不同方式实现此类标记。以下是四个示例：
1)EV用二-8-ANEPPS膜染料染色并顺序地由两个488nm激光线或激发区域激发：简单地讲，将199μL浓度为5×109个颗粒/mL的EV溶液与1μL溶解在DMSO中的20μM二-8-ANEPPS混合，并在室温下温育30分钟。温育之后，将该样本引入与具有收缩(2μm×2μm×125μm)的微流体通道流体连通的储液器中；流动由重力和表面张力驱动。将波长为488nm(20mW)的两条激光线聚焦在微流体通道的该部分上，以产生间隔10μm的两个激发区域或检测窗口(图9A)。当用二-8-ANEPPS染色的EV流过这两个不同的激发区域或检测窗口时，由于微流体通道中的层流性质，顺序地观察到具有类似强度的两个荧光信号(在575nm至625nm的波长范围内)。因此，该颗粒被检测到并标记或分配有对应的流动信息，在该示例中，流动信息是两个488nm激光激发区域之间的通行时间，并且因此是知道两个激发区域之间的间距的速度。该方法可类似地应用于单分子的分析，应用于用其自身的流动信息(例如，通行时间和/或速度)来标记每个所检测的分子。
2)EV用二-8-ANEPPS染色并顺序地由405nm激光和488nm激光激发：简单地讲，将199μL浓度为5×109个颗粒/mL的EV溶液与1μL溶解在DMSO中的20μM二-8-ANEPPS混合，并在室温下温育30分钟。温育之后，将该样本引入与具有收缩(2μm×2μm×125μm)的微流体通道流体连通的储液器中；流动由重力和/或表面张力驱动。由于二-8-ANEPPS的吸收光谱(图9B)，我们将405nm激光输出和488nm激光输出聚焦在微通道的相应部分上，功率分别为100mW和20mW，以产生间隔10μm的两个激发区域或检测窗口(图9B)。当用二-8-ANEPPS染色的EV流过这两个不同的激发区域时，由于微流体通道中的层流性质和所用激发激光功率的差异，顺序地观察到在575nm和625nm之间的波长范围内收集的具有类似强度的两个荧光信号。如果使用类似的激光激发功率，则顺序地观察到具有已知强度差异的两个荧光信号。因此，该颗粒被检测到并标记或分配有对应的流动信息，在该示例中，流动信息是两个激光激发区域之间的通行时间，并且因此是知道两个激发区域之间的间距的速度。
3)EV用两种结构类似的膜染料DiO和DiD的混合物染色并顺序地用488nm激光和640nm激光进行探询：简单地讲，将396μL浓度为5×109个EV/mL的颗粒溶液与2μL 20μM DiO(在DMSO中)和2μL 20μM DiD(在DMSO中)混合，并在室温下温育30分钟。温育之后，将该样本引入与具有收缩(2μm×2μm×125μm)的微流体通道流体连通的储液器中；流动由重力和/或表面张力驱动。由于DiO和DiD的吸收光谱(图9C)，将488nm激光输出和640nm激光输出聚焦在微流体通道的相应部分上，以产生分隔10μm的两个激发区域或检测窗口。当用DiO和DiD染色的颗粒流过这两个激光激发区域时，分别在495nm至515nm之间和660nm至700nm之间收集两个荧光信号。因此，该颗粒被检测到并标记或分配有对应的流动信息，在该示例中，流动信息是两条激光线之间的通行时间，并且因此是知道两个激发区域之间的间距的速度。
4)考虑到脂质膜碎片或固体脂颗粒也可用膜染料标记，完整的EV可通过膜染料(例如DiD)和体积染料(例如钙黄绿素AM)的共染色来检测并顺序地用488nm激光线和640nm激光线进行分析(图9D)：简单地讲，将396μL浓度为5×109个颗粒/mL的颗粒溶液与2μL 20μM DiD(在DMSO中)和2μL 2mM钙黄绿素AM(在DMSO中)混合，并在37℃下于暗处温育30分钟。温育之后，将该样本引入具有收缩部(2μm×2μm×125μm)的微流体通道中。由于钙黄绿素AM和DiD的吸收光谱(图9D)，将488nm激光输出和640nm激光输出聚焦在微流体通道上，功率分别为20mW和10mW，以产生分隔10μm的两个检测窗口或激发区域。当用钙黄绿素AM和DiD染色的EV流过这两个激光激发区域时，分别在495nm至515nm之间和660nm至700nm之间收集两个荧光信号。因此，该EV被检测到并标记或分配有对应的流动信息，在该示例中，流动信息是两条激光线之间的通行时间，并且因此是知道两个激发区域之间的间距的速度。
用对应的流动信息(例如，通行时间和/或速度)标记或分配检测颗粒或分子实现在该实施例和后面的实施例中描述的自校正的流动分析。该方法可类似地应用于单分子或其他生物纳米颗粒或其他纳米级实体的分析，用于用其自身的流动信息(例如，通行时间和/或速度)来标记每个所检测的分子/纳米颗粒/实体。
实施例5：使用自校正的流动分析的多色共定位
该实施例描述了使用自校正的流动分析将多种标志物(例如不同的染料标记的抗体和/或膜染料)共定位在胞外囊泡(EV)上。该方法可类似地应用于单分子或其他生物纳米颗粒或其他纳米级实体的分析。
在相同生物纳米颗粒上表达的生物标志物的准确共定位是许多重要应用(例如用于鉴定EV的亚型的免疫表型)的基础。当流动流中非常接近的多个颗粒通过激发区域或检测窗口时，将在不同检测窗口处观测到的信号或来自不同激发区域的信号正确地分配给给定颗粒可能具有挑战性，因为由于微流体流动环境的层流性质和抛物线流动剖面，颗粒可能在微流体通道中以宽范围的速度流动。使用上述实施例中描述的自校正的流动分析，其中生物标志物(例如膜染料或给定染料标记的抗体)在两个激发区域或检测窗口处被测量两次，颗粒或分子被检测并标记有其流动信息(即线速度和/或通行时间)。由于微流体系统中的层流性质，针对具体位置处(在具体通行时间之前或之后)的非常窄的时间窗(例如，±0.1ms；参见图8)寻找是否存在其他生物标志物(例如，存在于EV上的其他染料标记的抗体)，因此，自校正的流动分析的使用极大提高了共定位的准确性，如图10所示。
在该实施例中，使用人类精液外泌体(sEV)并用CD63-A647、CD81-PE/CF594和二-8-ANEPPS共染色。简单地讲，将490μL浓度为5×109个颗粒/mL的sEV溶液与5μL 2μg/mL的CD63-A647和2.5μL CD81-PE/CF594混合(原液的100倍稀释)，并在室温下于暗处温育60分钟。然后，向样本中添加2.5μL 20μM二-8-ANEPPS(溶解于DMSO中)，将其再温育30分钟。温育之后，将该样本引入具有收缩部(2μm×2μm×125μm)的微流体通道中，在该通道中进行检测。为了使用自校正的流动分析进行多色共定位，将四条激光线(640nm、561nm、488nm和405nm，以该顺序)聚焦在微流体通道的各部分上，以沿流动方向顺序地产生四个激发区域或检测窗口。使用具有同一组发射滤光器(600/50nm)的前两条激光线(405nm、100mW和488nm、20mW)测量来自二-8-ANEPPS的荧光(图9B)。
第一步是用其相应的流动信息(即，405nm和488nm激光线之间的通行时间)检测和标记用二-8-ANEPPS染色的sEV。在不存在和存在自校正的情况下，可使用两个膜染料信号来验证该步骤，如图10所示。来自每个用该膜染料染色的颗粒的由405nm激发的二-8-ANEPPS的荧光应与用488nm激光激发的相应荧光共定位，效率接近100％。另外，这两个信号的强度应类似(即±10％的差异)，这是由于在该实施例中使用的功率设置(即，对于405nm激光为100mW，并且对于488nm激光为20mW)。图10B中的左图示出了使用自相关函数的共定位事件，该函数计算“最可能”时间窗口以找到共定位事件。使用此统计方法共定位的许多事件是假阳性，因为这两个通道中的信号强度不匹配。在应用自校正的流动分析之后，散点图(图10B中的右图)显著变窄，表明大多数假阳性事件被去除。采用略微不同的设备配置，图10A示出了当使用两条488nm的激光线来执行自校正的流动分析时观察到的类似改进。
除了极大降低或消除假阳性率之外，用具体通行时间和/或速度标记每个生物纳米颗粒或分子(对于相同或类似间距的每两个相邻的激光激发区域，通行时间和/或速度可以是接近恒定的值)使得能够精确地共定位多个生物标志物。简单地讲，首先检测到用二-8-ANEPPS染色的具体sEV并如图14A所示用在405nm和488nm激光线或激发区域之间的具体通行时间(t)进行标记。自校正的流动分析算法在以488nm和561nm激光线(t)之间的通行时间为中心的非常窄(例如±0.1ms)的时间窗口内搜索是否存在由另一激光器(例如561nm激光线)激发的信号，以寻找与CD81-PE/CF594共定位的sEV。然后应用在488nm和640nm激光(2t)之间的通行时间位置处的另一个搜索窗口来寻找与CD63-Alexa647共定位的sEV。在检查更多标志物和检测窗口或激发区域时，可重复类似的搜索过程(图8)。在用自校正的流动分析处理数据之后，可基于不同生物标志物的组合来确定sEV的不同亚群，如通过针对对应生物标志物(例如免疫表型(immune-phenotype或immuno-phenotype))的对应抗体的组合的结合所测量。在该实施例中，sEV的四个亚群是：CD81+为3.7％，CD63+为32.9％，CD81+/CD63+为1.8％，并且CD81-/CD63-为65.2％(图14B)。
实施例6：使用单颗粒/分子通行时间来确定体积流速
该实施例描述了使用单颗粒/分子的通行时间来确定体积流速。
通常需要知道基于微流体的分析中的体积流速来确定在实验期间已经分析的样本的体积。因此，可基于分析物/分子/纳米颗粒的计数及分析体积来测量单颗粒/分子的绝对浓度。体积流速也是评价样本的通量和消耗的有用参数。尽管很重要，但由于激发区域探询的样本具有超小体积，体积流速的直接测量在微流体环境中常常具有挑战性，特别是当体积流速极低(例如，每秒几pL至几nL)时。
该实施例描述了基于在该微流体环境中流动是层流的事实，使用流过激光线或激发区域的每个分子和/或颗粒的通行时间来确定体积流速。因此，可计算每个颗粒/分子的线速度，从而知道这些激光线或激发区域之间的距离。
因为该特定通道几何形状(即2μm×2μm×150μm)接近于具有圆形横截面和显著大于直径的长度的管，所以流动剖面可近似地为具有圆柱形几何形状的管中的抛物线流动剖面。基于该简化假设，可将单颗粒/分子的线速度转化为该样本的体积流速。简单地讲，首先计算我们观测到的线性速度
Figure BDA0004220925140000731
的算术平均值。在层流中，在单位时间期间通过各层的横截面的体积(ΔV)为
ΔV＝u(r)·2πr·Δr(式1)。
在单位时间期间通过横截面的具有相同速度(即，u(r))的颗粒数量为，
Figure BDA0004220925140000741
其中C是颗粒的浓度。因此，观测平均线速度为，
Figure BDA0004220925140000742
其中r是横截面处的径向位置。在抛物线流动中，已知线速度剖面如下：
Figure BDA0004220925140000743
其中umax是流动中心(抛物线剖面中的最快层流)处的线速度，并且R是通道的半径(例如，在该实施例中为1μm)，因此式3可被重新组织为
Figure BDA0004220925140000744
因为在抛物线流动中，已知体积流速(Q)可表示为，
Figure BDA0004220925140000745
Figure BDA0004220925140000746
和V(图11A)之间的关系因此为，
Figure BDA0004220925140000747
总之，因为我们可获得
Figure BDA0004220925140000748
以及通道横截面的面积，所以可使用式7(图11A)测量体积流速。该分析是第一近似，并且为了实现更精确的描述，直接考虑微流体通道的精确横截面几何形状和总体几何形状。该实施例示出了一种通过使用所测量的单颗粒/分子通行时间/速度来测量体积流速的新方法。
实施例7：测定颗粒/分子浓度
该实施例描述了无需任何外部校准即可准确地测量颗粒/分子绝对浓度的方法。
如实施例6中所述，体积流速测量的直接应用是测定分析物(例如颗粒和/或分子)的浓度。简单地讲，使用自校正的流动分析，对流过激发区域或检测窗口的颗粒群体进行计数。由于仪器的超高灵敏度，对用特定标志物(例如，本实施例中为二-8-ANEPPS)染色的所有颗粒进行计数(N)。已知由所测量的单颗粒的线速度/通行时间(图11A)和实验测量时间(t)确定的体积流速(Q)，使用V＝Qt确定分析体积(V)，因此可计算分析物的浓度(C)：C＝N/V＝N/(Qt)。
在该实施例的实验中，首先通过将1μL原液添加到999μL PBS缓冲液(pH＝7.2)中将人类精液外泌体(sEV)的样本稀释1000倍。然后用溶解在DMSO中的1μL 20μM二-8-ANEPPS将199μL稀释样本染色，并在室温下温育30分钟。使用间隔开10.7μm的405nm激光线(100mW)和488nm激光线(20mW)来检测该膜染料的荧光。温育之后，将10μL标记的sEV引入具有收缩部(尺寸为2μm宽×2μm高×125μm长)的微流体通道，在其上将激光束聚焦成线以照射通道收缩部的整个横截面。在加载样本3分钟之后开始数据采集，并且一次实验测量花费300秒。图11B示出了35次重复测量的sEV浓度。
为了进一步证明该方法的稳健性，稀释相同的sEV样本以产生一系列浓度(1×107至1×1010个颗粒/mL)，使用上述相同方法测量每个浓度。对于具有较低浓度的样本，数据采集进行较长时间以收集足够的数据点。对于每个浓度，重复至少3次。图15示出了所检测的sEV的频率与稀释比的关系以及测量浓度与计算浓度的关系，这两者都显示测量浓度与稀释比之间呈跨至少3个数量级的线性关系。这些结果表明sEV浓度的测量结果高度稳健。
实施例8：使用近红外成像和高数值孔径空气物镜的自动聚焦
该实施例描述了分别用于在实验之前和实验期间确定和维持正确焦点位置的设备和方法。
单颗粒/分子流动分析的质量取决于微流体通道相对于物镜的聚焦方式，两个原因有以下两个：1)将焦平面设置在中心将确保激发的最佳质量，因此激光束可探询在通道中流动的所有分子。2)它也影响收集荧光的效率。将焦平面从期望位置偏移即使1μm可能干扰测量。优选的是在每次实验之前自动地确定和设置微流体通道的中心处的焦平面，这是因为自动化方式提供改进的吞吐量和稳健性。另外，自动聚焦方法将消除由手动过程引起的用户之间的变化，并且因此改进测量质量。
在该实施例，单分子/颗粒流动分析仪的设备被配置为能够实现由近红外(NIR)机器视觉辅助的自动聚焦。使用采用NIR光的照射以最小化与线共焦荧光测量的界面，线共焦荧光测量主要存在于可见光光谱波长区域内。如图16所示的设备由NIR LED(中心波长为870nm)、用于流动分析的微流体装置、安装在Z维平台上的高NA空气物镜、多波段二向色镜、镜筒透镜、短通二向色镜和NIR相机组成。简单地讲，照射微流体通道的NIR光被高NA空气物镜(40倍/0.95NA)收集，被第一二向色镜反射，然后被镜筒透镜聚焦。NIR光束被短通二向色镜引导，并且最终图像被投影到相机的传感器上。
当物镜上下移动时，在每个位置记录一系列照片(图7D)，其中微流体通道聚焦或散焦。将边缘检测滤光器应用于所有这些图像以找到中心通道的边界，使得可测量该通道的对比度。因此使用该对比度值来定义聚焦质量；更高的对比度表明检测通道处于更好的焦点。图7D示出了作为物镜相对于通道的位置的函数的聚焦质量的变化，并且两个峰值分别指示通道的底部(位置2)和顶部(位置3)在焦点上。知道这两个峰值的位置，就可确定通道的中心，并且移动物镜，使得焦点相应地移动到该位置。图7F示出了使用高NA空气物镜由NIR机器视觉辅助的该自动聚焦方法的反馈控制回路。
在开始数据采集之后，也很重要的一点是将焦平面保持在期望位置，以最小化由微流体芯片的振动和/或热膨胀和/或可能导致设备漂移或波动的其他因素导致的SNR的任何波动。在此实施例中，应用由NIR机器视觉辅助的相同自动聚焦机制以在实验期间锁定焦平面。因为NIR光源(870±25nm)不干扰荧光检测，所以该自动聚焦方案可与单分子/颗粒流动实验实时地一起使用。图7F示出了该过程的反馈控制机制。简单地讲，当在实验之前初始设定并锁定焦平面时，对应的聚焦质量被记录为参考值。在实验开始之后，每隔100ms捕获一次芯片的NIR图像，并且将获得的聚焦质量与参考值进行比较。如果差异在5％以内，则焦平面被锁定在相同位置。如果不是，则以每隔50nm测量的新聚焦质量向上移动物镜。如果差变得更小，则说明物镜在正确的方向上移动；如果不是，则在相反方向上移动物镜。使用这些迭代和逻辑控制，可在实验期间实时地检测并校正焦平面的偏移。
实施例9：单EV和生物纳米颗粒免疫表型分析
本实施例描述了使用根据本公开的一个实施方案的装置和方法的单颗粒免疫表型。
精浆胞外囊泡(EV)和纳米颗粒的分离
精液样本得自华盛顿大学男性生育计划(University of Washington MaleFertility Program)。从每个捐献者取得了书面知情同意书。所有方案均得到华盛顿大学的机构审查委员会(Institutional Review Boards of the University of Washington)和福瑞德哈金森癌症研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Center)批准。简单地讲，采用一系列离心步骤从精液样本中分离精浆，然后用0.22μm注射过滤器过滤精浆。在蔗糖密度梯度上进行超速离心之后，将含有精浆EV和纳米颗粒的30％和25％蔗糖垫合并，并通过Amicon Ultracel 100-kDa纤维素离心过滤器进行离心洗涤。然后用尺寸排阻色谱柱过滤精浆EV/纳米颗粒以除去溶液中的蛋白质。基于纳米颗粒跟踪分析，最终EV/纳米颗粒浓度为约1013/mL。
精浆胞外囊泡和纳米颗粒的流动分析
在标记之前，将精浆EV/纳米颗粒悬浮液在HEPES缓冲液(20mM，pH 7.4)中稀释至1010/mL。为了标记四次跨膜蛋白，将100μL稀释后的EV/纳米颗粒悬浮液与10μL稀释后的抗体溶液一起温育。对于每种抗体，测试了10-6μg/mL至10-1μg/mL范围内的多个浓度以生成滴定曲线。与抗体一起温育1小时之后，向溶液中添加1μL 20μM二-8-ANEPPS的二甲基亚砜溶液以标记脂质膜。用二-8-ANEPPS温育10分钟之后，将溶液离心并使用离心柱(SartoriusVivaspin 500，300-kDA)在含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的HEPES缓冲液中再稀释溶液三次以去除过量抗体。
根据本公开的一个实施方案，基于线共焦设计开发了流动平台，并且该流动平台包括四条空间分离的激光线和五个雪崩光电二极管。在每个实验中，将5μL样本注入微流体芯片上的入口储液器。由于储液器液位具有高度差，流动在没有外部泵的情况下启动，使得操作简单而稳健。所注入的样本流过2×2μm通道并由四条激光线激发。这种通道几何形状提供高灵敏度和高通量且没有堵塞。激光线超过通道宽度的10倍，以实现跨通道的均匀激发。在最大激光输出下，通道内的功率密度为约20kWcm-2。将每条激光线处的发射光子用孔和带通滤光器滤光，之后再聚焦在检测器上。采用使用640nm激光线的反向散射作为实时反馈的定制自动聚焦系统来最小化聚焦漂移。由于高激发功率密度、高聚焦稳定性以及减少的激发和检测体积，该系统为单个荧光团的检测提供了足够的灵敏度。
如上所述，对于流动测量，将5μL样本注入微流体芯片的入口储液器。典型的体积流速为约15pL/s。在10kHz下通过APD收集荧光信号。使用诸如实施例8中所述的自动聚焦系统以最小化实验过程中的聚焦漂移。为了区分信号与噪声，将阈值设置为平均背景加上背景的中值绝对偏差的五倍。每个事件的强度通过扣除背景之后在固定时间窗内进行积分来计算。
收集了稀释后的游离抗体和二-8-ANEPPS标记的EV/纳米颗粒在不同激发功率下的流动轨迹，以确定每个通道中的最佳信噪比。
为了实现四次跨膜蛋白的高通量分析，用膜染料二-8-ANEPPS和荧光团缀合的抗四次跨膜蛋白抗体、亮紫510(BV510)抗CD9、藻红蛋白(PE)抗CD63和Alexa Fluor 647抗CD81标记精浆EV/纳米颗粒。二-8-ANEPPS在水中是无荧光的，但在插入脂质膜中时变成高荧光的。膜染料染色的EV的荧光强度与脂质膜的表面积成正比。我们观察到，经过缩放，二-8-ANEPPS染色的EV的强度的平方根分布可与从动态光散射(DLS)确定的EV大小分布重叠。缩放因子允许利用在流动时检测到的膜染料信号来估计EV大小。收集了三种稀释后的游离抗体在不同激发功率下的流动轨迹，以确定每个检测通道中的最佳信噪比。在最佳激发功率下，可将单个抗体强度直方图拟合为对数正态分布。基于强度直方图拟合中的截断分数，确定在流动系统中检测到超过98％的单种抗体。
随着用膜染料和荧光标记的抗四次跨膜蛋白抗体标记的EV流过激光线，通过对应的检测器检测每种染料的荧光信号。通过由检测通道收集的轨迹的交叉相关分析来确定两条激光线之间的通行时间。通行时间用于执行不同通道之间的共定位。仅当抗体峰出现在膜染料峰附近的预期时间窗口内以最小化游离抗体的影响时，信号才归因于EV。
将膜染料强度的平方根转化为EV大小并将EV大小对抗体强度作图(图17A至图17C)。所得的散点图显示所有三种四次跨膜蛋白的蛋白表达水平和EV大小之间具有弱相关性。通过四色共定位分析，鉴定出精液外泌体的七个亚组(图17D)。15.1％的精液外泌体仅表达CD9，9.2％仅表达CD63，并且1.5％仅表达CD81。仅1.1％的精液外泌体具有全部三种四次跨膜蛋白。图17D中未示出的53.5％的膜染色囊泡未显示CD63、CD81或CD9的显著表达。这些结果表明，虽然CD63、CD81和CD9都被认为是常见的外泌体标志物，但许多精液外泌体仅表达这些标志物中的一种或两种，并且在外泌体之间以及这些四次跨膜蛋白之间四次跨膜蛋白表达水平存在很大的异质性。
实施例10：单EV和生物纳米颗粒蛋白拷贝数测定
使用实施例9中制备的精浆EV/纳米颗粒，通过使用单抗体强度分布对抗体标记的外泌体的强度分布去卷积以获得四次跨膜蛋白拷贝数分布(图18A至图18C)。对于每种四次跨膜蛋白，用不同浓度的抗体标记外泌体并分析流动的外泌体以确保饱和标记。CD63、CD81和CD9的平均拷贝数分别为12.8、1.6和17.0(图18D至图18F)。
因为可检测到存在的最暗的<1％的单分子，所以我们使用单分子强度分布对单EV强度分布去卷积以准确地每个EV上的结合抗体的数量并因此确定对应蛋白质的数量。图18A至图18C示出在单个实验中，我们能够获得单种抗体和用该抗体完全标记的单种EV的强度分布。3个四次跨膜蛋白的平均拷贝数分别为12.8(CD63)、1.6(CD81)和17.0(CD9)；图18D至图18F还示出了拷贝数如何在EV之间变化。关于单种EV的分子组成的这种定量信息在区分完整EV与片段化EV、对EV进行分型或研究EV的生物发生和调节方面是有用的。
实施例11：单种含核酸的纳米颗粒和分子分析，诸如EV、RNA或DNA结合蛋白、RNA或 DNA颗粒和其他含RNA或DNA的纳米颗粒
图19A至图19D示出本公开的单EV/纳米颗粒/分子流动分析仪可检测和跟踪单种EV以及其他非EV生物纳米颗粒或分子(诸如RNA结合蛋白)的RNA含量。这里，我们使用膜渗透RNA染料，并且由于流动分析仪的高灵敏度，我们能够检测包含在EV、其他非EV囊泡以及其他非囊泡生物纳米颗粒和分子中的RNA。为了进行该测量，用膜染料(标记所有EV和非EV膜囊泡)、抗CD63抗体(经典外泌体标志物)和膜渗透性RNA染料(SYTO)对精液EV样本进行染色。该结果显示，在存在的所有膜囊泡中，仅约15％含RNA(图19A)，并且在存在的所有含RNA的生物颗粒中，仅约35％在膜囊泡内(图19B)。但如果RNA包含在膜囊泡中，则这些囊泡中的约75％是如CD63所定义的外泌体(图19C)。没有发现EV大小与RNA含量之间的显著相关性(图19D)。
由单EV/纳米颗粒/分子流动分析仪提供的这种能力允许单EV/纳米颗粒免疫表型分析并跟踪EV和其他生物纳米颗粒的RNA含量。
实施例12：单病毒颗粒分析
本实施例描述了通过确定蛋白质拷贝数和核酸含量来确定病毒颗粒的完整性或功能状态。
病毒颗粒中或病毒颗粒上的蛋白质和核酸如前述实施例诸如实施例9和11所述进行标记。如上所述，荧光标记的病毒蛋白的单分子强度分布用于对单病毒颗粒强度分布去卷积以准确地确定结合抗体的数量。此外，如上所述，核酸染色剂的荧光强度报告病毒颗粒中是否存在核酸或包含的核酸量。对于含有膜的病毒颗粒，如上所述，膜染料染色的病毒颗粒的荧光强度与脂质膜的表面积成正比，并且可基于来自单颗粒的信号强度来确定病毒颗粒的大小。
然后使用所确定的颗粒蛋白质和/或核酸含量以及任选的大小来确定所分析的病毒颗粒是典型的完整或功能性病毒颗粒，还是太小而不完整，是病毒颗粒的一部分或亚单位，还是非功能性病毒颗粒(例如，一种不同的完整病毒颗粒，但却是空的并且不含核酸)。
实施例13：经由荧光单颗粒或单分子的直接计数进行的浓度的绝对定量
本实施例展示了用于通过对穿过根据本公开的实施方案的装置的荧光颗粒或分子进行直接计数来绝对定量样本中的此类颗粒或分子的浓度的方法。
如本文进一步所述，本公开的装置被配置为基本上或几乎检测流过通道的每个荧光颗粒或分子(或至少大部分，诸如超过90％)。因此，还可以高精度地提取每个颗粒或颗粒的一部分的线速度，加之已知通道的横截面，从而能够确定对应的体积流速。因此，本公开的装置被配置为提供样本中EV/生物纳米颗粒浓度的绝对定量，而无需经由单颗粒计数进行校准(计数的颗粒数÷流过的体积)。研究人员将发现这种新能力在研究生物纳米颗粒的领域中具有广泛用途，这些生物纳米颗粒包括EV、病毒、脂蛋白(例如HDL、LDL、VLDL)和大分子复合物(例如循环RNA结合蛋白、RNA颗粒、外泌颗粒)。例如，这种能力允许基于生物纳米颗粒或EV的表型(例如基于某些生物标志物(例如蛋白质)和/或核酸的存在和/或不存在和/或量和/或颗粒的大小)来确定该颗粒或EV的亚型的绝对浓度，如以上实施例9至实施例12中所述。
图20A和图20B示出了荧光纳米颗粒和荧光蛋白质分子的直接计数。此处示出了荧光抗体，但本实施例的方法适用于其他荧光蛋白质、荧光DNA、荧光RNA和其他荧光分子。图20A示出了低至每mL 106个荧光纳米颗粒的测量值，这对应于1.67×10-18M。该限值由实验运行时间设定。在本实施例中，采样速率为每秒104个事件，因此即使该非常低的浓度检测限值也可通过增大流速来扩展。使用相同的流速执行图20A中所示的大约4个数量级的范围。图20B示出了荧光蛋白质分子(Alexa647缀合蛋白质)的类似绝对定量。
虽然举例并描述了例示性实施方案，但应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在其中进行各种改变。

Claims (176)

1.一种用于分析颗粒和/或分子的系统，所述系统包括：
通道，所述通道被构造成使颗粒和/或分子流过所述通道的管腔，所述通道限定被构造成允许光进入和离开所述管腔的探询窗口；
光引擎，所述光引擎包括：
第一光源，所述第一光源被定位成将第一激发光输出到所述通道在所述探询窗口中的第一部分上；以及
第二光源，所述第二光源被定位成将第二激发光输出到所述通道在所述探询窗口中的与所述第一部分分离的第二部分上；
发射光纤束，所述发射光纤束包括第一发射光纤和第二发射光纤，其中所述第一发射光纤和所述第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中，并且其中所述第一发射光纤的所述近侧端部被定位成接收从所述第一部分发出的第一发射光，并且所述第二发射光纤的所述近侧端部被定位成接收从所述第二部分发出的第二发射光；以及
检测器系统，所述检测器系统包括：
第一光电检测器，所述第一光电检测器被定位成接收从所述第一发射光纤的远侧端部发出的所述第一发射光；以及
第二光电检测器，所述第二光电检测器被定位成接收从所述第二发射光纤的远侧端部发出的所述第二发射光。
2.根据权利要求1所述的系统，还包括操作地耦合到所述光引擎和所述检测器系统的控制器，所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
利用所述第一光源输出所述第一激发光；
利用第所述二光源输出所述第二激发光；
基于从所述第一发射光纤接收的所述第一发射光利用所述第一光电检测器生成第一发射信号；以及
基于从所述第二发射光纤接收的所述第二发射光利用所述第二光电检测器生成第二发射信号。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的波长，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的波长。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的波长，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围共同的第二波长范围内的波长。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一激发光在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述第二激发光在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
7.根据权利要求1所述的系统，还包括：
二向色镜，所述二向色镜设置在所述第一发射光纤的所述远侧端部与所述第一光电检测器之间并被定位成将所述第一发射光的一部分反射到第三光电检测器上。
8.根据权利要求7所述的系统，还包括带通滤光器，所述带通滤光器设置在所述二向色镜与所述第三光电检测器之间并被配置为对所述第一发射光的所述部分进行滤光。
9.根据权利要求7所述的系统，其中所述第一光电检测器被配置为基于所述第一发射光的第一发射波长范围生成第一发射信号，并且其中所述第三光电检测器被配置为基于所述第一发射光的与所述第一发射波长范围不同的第三发射波长范围生成第三发射信号。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一发射光纤的所述远侧端部被构造成将所述第一发射光发射到至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个光电检测器上，并且其中所述光电检测器中的每个光电检测器被配置为接收所述发射光的显著不同光谱部分。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一光源和所述第二光源中的一者或两者是自由空间光源。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一光源和所述第二光源各自独立地选自固态激光器、二极管泵浦激光器、发光二极管(LED)、灯和电弧放电。
13.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述第一光源光学耦合到第一激发光纤的近侧端部；并且
所述第二光源光学耦合到第二激发光纤的近侧端部。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一激发光纤的远侧端部和所述第二激发光纤的远侧端部布置在激发光纤束头中。
15.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一激发光纤的所述远侧端部与所述第二激发光纤的所述远侧端部之间的间距对应于所述第一部分与所述第二部分之间的间距。
16.根据权利要求13所述的系统，其中所述第一激发光纤的所述远侧端部与所述第二激发光纤的所述远侧端部之间的间距对应于所述第一发射光纤的所述近侧端部与所述第二发射光纤的所述近侧端部之间的间距。
17.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一光源与所述第二光源之间的间距对应于所述第一部分与所述第二部分之间的间距。
18.根据权利要求1所述的系统，还包括联接到所述发射光纤束头的光学不透明盖，所述光学不透明盖限定被成形为允许所述第一发射光通过并到达所述第一发射光纤的所述近侧端部上的孔。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述光学不透明盖限定被成形为允许所述第二发射光通过并到达所述第二发射光纤的所述近侧端部上的第二孔。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述发射光纤束包括至少三根发射光纤、至少四根发射光纤、至少五根发射光纤、至少六根发射光纤、至少七根发射光纤或更多。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述发射光纤束的每根发射光纤的近侧端部设置在所述发射光纤束头中。
22.根据权利要求20所述的系统，其中所述发射光纤束的每根发射光纤的近侧端部被定位成接收从所述探询窗口的不同部分发出的发射光。
23.根据权利要求20所述的系统，其中每根发射光纤的远侧端部被定位成将光发射到相应检测器模块中。
24.根据权利要求1所述的系统，其中所述通道的在所述探询窗口内的所述管腔限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
25.根据权利要求1所述的系统，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述微流体装置限定平面部分。
27.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测器系统被定位成接收来自所述探询窗口的散射发射光、冷光发射光、荧光发射光或它们的组合。
28.根据权利要求2所述的系统，其中所述控制器还包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
使颗粒悬浮液和/或分子溶液流过所述通道。
29.根据权利要求28所述的系统，其中使所述悬浮液流过所述通道包括使所述悬浮液逐颗粒地流过所述通道。
30.根据权利要求28所述的系统，其中使所述溶液流过所述通道包括使分子的溶液流动，包括使感兴趣分子逐分子地流过所述通道。
31.根据权利要求2所述的系统，其中所述控制器还包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
基于是否存在发射光对所述通道中的颗粒和/或分子进行分级。
32.根据权利要求2所述的系统，其中所述控制器还包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
基于发射光的强度对所述通道中的颗粒和/或分子进行分级。
33.根据权利要求31和32中任一项所述的系统，其中所述分级与基于所述第一发射光和所述第二发射光中的一者或多者的所述颗粒和/或分子的测得发射光谱对应。
34.根据权利要求31和32中任一项所述的系统，其中所述分级与所述颗粒的测得尺寸值对应。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述测得尺寸值是相对尺寸值。
36.根据权利要求34所述的系统，其中所述测得尺寸值用测得发射光强度的差来衡量。
37.根据权利要求34所述的系统，其中所述测得尺寸值是实际尺寸值。
38.根据权利要求2所述的系统，还包括被构造成引导所述颗粒和/或分子在所述通道中的流动的导流器。
39.根据权利要求38所述的系统，其中所述导流器操作地联接到所述控制器，并且其中所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
基于是否存在从所述探询窗口接收到并与所述颗粒和/或分子相关联的发射光来引导所述颗粒和/或分子的流动。
40.根据权利要求38所述的系统，其中所述导流器操作地联接到所述控制器，并且其中所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
基于所述颗粒和/或分子的分级来引导所述颗粒和/或分子的流动。
41.根据权利要求39所述的系统，其中引导所述颗粒和/或分子的所述流动包括将所述颗粒和/或分子引导到一个或两个或更多个分选通道中。
42.根据权利要求38所述的系统，其中所述导流器操作地联接到所述控制器，并且其中所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
量化与来自所述探询的发射光相关的颗粒和/或分子的数量。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
确定与来自所述探询窗口的所述发射光相关联的所述颗粒和/或分子的浓度。
44.根据权利要求42所述的系统，其中所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
基于与所述颗粒和/或分子缔合的生物标志物的存在、不存在或量来鉴定所述颗粒和/或分子的子集。
45.根据权利要求42所述的系统，其中量化颗粒和/或分子的所述数量包括单分子灵敏度或检测效率。
46.根据权利要求45所述的系统，其中单分子灵敏度或检测效率包括检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的流过所述通道的所述单分子。
47.根据权利要求45所述的系统，其中单分子检测效率包括检测超过90％的流过所述通道的所述单分子。
48.根据权利要求1所述的系统，还包括光收集系统，所述光收集系统被定位成收集来自所述通道的所述第一发射光和所述第二发射光并将所收集的发射光引导到所述检测器系统上，所述光收集系统包括具有在大于0.91且小于0.99的范围内的数值孔径的空气物镜。
49.根据权利要求1所述的系统，其中所述空气物镜具有约0.95的数值孔径。
50.一种探询颗粒和/或分子的方法，所述方法包括：
使颗粒和/或分子流过通道；
通过探询窗口将第一激发光输出到所述通道的第一部分上；
通过所述探询窗口将第二激发光输出到所述通道的与所述第一部分不同的第二部分上；
基于通过第一发射光纤的近侧端部接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；以及
基于通过第二发射光纤的近侧端部接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号，
其中所述第一发射光纤的所述近侧端部和所述第二发射光纤的所述近侧端部布置在发射光纤束头中。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述方法包括使用根据权利要求1至49中任一项所述的系统。
52.根据权利要求50所述的方法，还包括基于是否存在从所述探询窗口接收到并与所述颗粒和/或分子相关联的发射光来引导所述颗粒和/或分子的流动。
53.根据权利要求50所述的方法，其中引导所述颗粒和/或分子的所述流动包括将所述颗粒和/或分子引导到一个或两个或更多个分选通道中。
54.根据权利要求50所述的方法，其中使所述颗粒和/或分子流过所述通道包括使包含所述颗粒的颗粒悬浮液和/或包含所述分子的分子溶液流过所述通道，并且其中使所述颗粒悬浮液和/或分子溶液流过所述通道包括使所述悬浮液和/或溶液逐颗粒地和/或逐分子地流过所述通道。
55.根据权利要求50所述的方法，还包括：
量化与来自所述探询的发射光相关的颗粒和/或分子的数量；以及
确定与来自所述探询窗口的所述发射光相关联的所述颗粒和/或分子的浓度。
56.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一发射光和所述第二发射光独立地选自散射发射光、冷光发射光、荧光发射光以及它们的组合。
57.根据权利要求50所述的方法，还包括基于是否存在来自所述探询窗口的发射光对所述通道中的颗粒和/或分子进行分级。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述分级与基于所述第一发射光和所述第二发射光中的一者或多者的所述颗粒和/或分子的测得发射光谱对应。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述分级与所述颗粒的测得尺寸值对应。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述测得尺寸值是相对尺寸值。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述测得尺寸值用测得光强度的差来衡量。
62.根据权利要求55所述的方法，其中量化颗粒和/或分子的所述数量包括单分子灵敏度或检测效率。
63.根据权利要求62所述的方法，其中单分子灵敏度或检测效率包括检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的流过所述通道的所述单分子。
64.根据权利要求62所述的方法，其中单分子检测效率包括检测超过90％的流过所述通道的所述单分子。
65.根据权利要求50所述的方法，其中所述颗粒和/或分子与可检出试剂缔合。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述可检出试剂是第一可检出试剂，并且其中所述颗粒和/或分子与第二可检出试剂缔合。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述第一可检出试剂具有在第一发射波长范围内的第一发射光谱，并且所述第二可检出试剂具有在不同于所述第一发射波长范围的第二发射波长范围内的第二发射光谱。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述可检出试剂是荧光可检出试剂。
69.根据权利要求50所述的方法，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述微流体装置限定平面部分。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
72.一种用于分析颗粒和/或分子的系统，所述系统包括：
通道，所述通道被构造成使颗粒和/或分子流过所述通道的管腔，所述通道限定被构造成允许光进入和离开所述管腔的探询窗口；
光引擎，所述光引擎被配置为通过所述探询窗口将激发光输出到所述通道中；
检测器系统，所述检测器系统被定位成接收从所述通道发出的发射光并被配置为基于所接收的发射光生成信号；以及
光收集系统，所述光收集系统被定位成收集来自所述通道的所述发射光并将所收集的发射光引导到所述检测器系统上，所述光收集系统包括具有在大于0.91且小于0.99的范围内的数值孔径的空气物镜。
73.根据权利要求72所述的系统，其中所述光收集系统具有约0.95的数值孔径。
74.根据权利要求72所述的系统，还包括：
发射光纤束，所述发射光纤束包括第一发射光纤和第二发射光纤，其中所述第一发射光纤和所述第二发射光纤的近侧端部布置在发射光纤束头中，并且其中所述第一发射光纤的所述近侧端部被定位成接收从所述第一部分发出的第一发射光，并且所述第二发射光纤的所述近侧端部被定位成接收从所述第二部分发出的第二发射光。
75.根据权利要求72所述的系统，其中
所述光引擎包括：
第一光源，所述第一光源被定位成将第一激发光输出到所述通道在所述探询窗口中的第一部分上；以及
第二光源，所述第二光源被定位成将第二激发光输出到所述通道在所述探询窗口中的与所述第一部分分离的第二部分上；并且
所述检测器系统包括：
第一光电检测器，所述第一光电检测器被定位成接收从所述第一发射光纤的远侧端部发出的所述第一发射光；以及
第二光电检测器，所述第二光电检测器被定位成接收从所述第二发射光纤的远侧端部发出的所述第二发射光。
76.根据权利要求75所述的系统，还包括操作地耦合到所述光引擎和所述检测器系统的控制器，所述控制器包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
利用所述第一光源输出所述第一激发光；
利用第所述二光源输出所述第二激发光；
基于从所述第一发射光纤接收的所述第一激发光利用所述第一光电检测器生成第一发射信号；以及
基于从所述第二发射光纤接收的所述第二激发光利用所述第二光电检测器生成第二发射信号。
77.根据权利要求75所述的系统，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的波长，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的波长。
78.根据权利要求75所述的系统，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的波长，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围共同的第二波长范围内的波长。
79.根据权利要求74所述的系统，还包括：
二向色镜，所述二向色镜设置在所述第一发射光纤的所述远侧端部与所述第一光电检测器之间并被定位成将所述第一发射光的一部分反射到第三光电检测器上。
80.根据权利要求74所述的系统，其中所述第一发射光纤的所述远侧端部被构造成将所述第一发射光发射到至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个光电检测器上。
81.根据权利要求79所述的系统，还包括带通滤光器，所述带通滤光器设置在所述二向色镜与所述第三光电检测器之间并被配置为对所述第一发射光的所述部分进行滤光。
82.根据权利要求74所述的系统，其中所述第一光电检测器被配置为基于所述第一发射光的第一发射波长范围生成第一发射信号，并且其中所述第三光电检测器被配置为基于所述第一发射光的与所述第一发射波长范围不同的第三发射波长范围生成第三发射信号。
83.根据权利要求72所述的系统，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
84.根据权利要求83所述的系统，其中所述微流体装置限定平面部分。
85.根据权利要求83所述的系统，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
86.一种用于分析流体样本中的颗粒和/或分子的方法，所述方法包括：
使包含多个颗粒和/或多个分子的流体样本流过通道；
在所述通道中照射所述多个颗粒中的颗粒和/或所述多个分子中的分子；
利用光收集系统收集从所述通道发出的发射光，所述光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99范围内的数值孔径的空气物镜；
基于所收集的基于所述颗粒或分子从所述通道发出的发射光生成信号；以及
基于所述信号为所述颗粒和/或所述分子分配值。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述光收集系统具有约0.95的数值孔径。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述方法是测定颗粒尺寸的方法，并且其中所述值是尺寸值。
89.根据权利要求86所述的方法，其中所述方法是测定所述流体样本中的感兴趣颗粒或分子的浓度的方法。
90.根据权利要求86所述的方法，其中所述方法是量化与所述流体样本中的感兴趣颗粒缔合的生物分子的拷贝数的方法。
91.根据权利要求86所述的方法，其中所述方法是确定所述多个颗粒中的颗粒的表型的方法。
92.根据权利要求86所述的方法，其中所述发射光选自散射发射光、冷光发射光、荧光发射光以及它们的组合。
93.根据权利要求86所述的方法，还包括基于是否存在来自所述探询窗口的发射光对所述通道中的颗粒和/或分子进行分级。
94.根据权利要求86所述的方法，还包括基于来自所述探询窗口的发射光的强度对所述通道中的颗粒和/或分子进行分级。
95.根据权利要求93和94中任一项所述的方法，其中所述分级与基于所述第一发射光和所述第二发射光中的一者或多者的所述颗粒和/或分子的测得发射光谱对应。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的方法，其中所述分级与所述颗粒的测得尺寸值对应。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述测得尺寸值是相对尺寸值。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述测得尺寸值用测得光强度的差来衡量。
99.根据权利要求86所述的方法，其中分析所述颗粒包括测定所述颗粒的尺寸，包括：
基于所收集的基于所述颗粒从所述通道发出的发射光生成信号；以及
基于所述信号为所述颗粒分配尺寸值。
100.根据权利要求86所述的方法，其中所述颗粒和/或分子与可检出试剂缔合。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述可检出试剂是第一可检出试剂，并且其中所述颗粒和/或分子与第二可检出试剂缔合。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述第一可检出试剂具有在第一发射波长范围内的第一发射光谱，并且所述第二可检出试剂具有在不同于所述第一发射波长范围的第二发射波长范围内的第二发射光谱。
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述第一可检出试剂具有在第一激发波长范围内的第一激发光谱，并且所述第二可检出试剂具有在不同于所述第一激发波长范围的第二激发波长范围内的第二激发光谱。
104.根据权利要求99所述的方法，其中所述可检出试剂是荧光可检出试剂。
105.根据权利要求86所述的方法，其中所述方法包括使用根据权利要求59至69中任一项所述的系统。
106.根据权利要求86所述的方法，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述微流体装置限定平面部分。
108.根据权利要求106所述的方法，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
109.根据权利要求86所述的方法，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述微流体装置限定平面部分。
111.根据权利要求109所述的方法，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
112.一种用于自校正的单分子和/或单颗粒流动分析的系统，所述系统包括：
通道，所述通道被构造成使颗粒和/或分子流过所述通道的管腔，所述通道限定被构造成允许光进入和离开所述管腔的探询窗口；
光引擎，所述光引擎包括：
第一光源，所述第一光源被定位成将第一激发光输出到所述通道在所述探询窗口中的第一部分上；以及
第二光源，所述第二光源被定位成将第二激发光输出到所述通道在所述探询窗口中的与所述第一部分分离的第二部分上；以及
检测器系统，所述检测器系统包括：
第一光电检测器，所述第一光电检测器被定位成接收从所述通道的所述第一部分发出的第一发射光；以及
第二光电检测器，所述第二光电检测器被定位成接收从所述第二部分发出的第二发射光；以及
控制器，所述控制器操作地耦合到所述第一光源、所述第二光源、所述第一光电检测器和所述第二光电检测器并且包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
利用所述第一光源输出所述第一激发光；
利用第所述二光源输出所述第二激发光；
基于从所述第一部分接收的第一发射光利用所述第一光电检测器生成第一发射信号；
基于从所述第二部分接收的第二发射光利用所述第二光电检测器生成第二发射信号；以及
基于生成所述第一发射信号与所述第二发射信号之间的时间差以及所述第一部分与所述第二部分之间的距离来确定所述通道中的颗粒和/或分子的速度。
113.根据权利要求112所述的系统，其中所述控制器还包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
基于由所述第一发射信号和所述第二发射信号共享的发射信号特性使所述第一发射信号与所述第二发射信号相关。
114.根据权利要求112所述的系统，其中所述第一激发光和所述第二激发光具有在重叠波长范围内的光。
115.根据权利要求112所述的系统，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的光，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的光。
116.根据权利要求112所述的系统，其中所述颗粒和/或分子的所述速度用于确定通过包括所述探询窗口的所述管腔的体积流速。
117.根据权利要求112所述的系统，其中所述第一激发光在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
118.根据权利要求112所述的系统，其中所述第二激发光在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
119.根据权利要求112所述的系统，其中量化颗粒和/或分子的所述数量包括单分子灵敏度或检测效率。
120.根据权利要求119所述的系统，其中单分子灵敏度或检测效率包括检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的流过所述通道的所述单分子。
121.根据权利要求119所述的系统，其中单分子检测效率包括检测超过90％的流过所述通道的所述单分子。
122.根据权利要求112所述的系统，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
123.根据权利要求122所述的系统，其中所述微流体装置限定平面部分。
124.根据权利要求122所述的系统，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
125.一种用于自校正的单分子和/或单颗粒流动分析的方法，所述方法包括：
使颗粒和/或分子流过通道的管腔，所述通道限定被构造成允许光进入和离开所述管腔的探询窗口；
利用第一光源将第一激发光输出到所述探询窗口的第一部分中；
利用第二光源将第二激发光输出到所述探询窗口的与所述第一部分分离的第二部分中；
基于从所述第一部分接收的第一发射光利用第一光电检测器生成第一发射信号；
基于从所述第二部分接收的第二发射光利用第二光电检测器生成第二发射信号；以及
基于所述第一发射信号与所述第二发射信号之间的时间差以及所述第一部分与所述第二部分之间的距离来确定所述通道中的颗粒和/或分子的速度。
126.根据权利要求125所述的方法，还包括基于发射信号特性使所述第一发射信号与所述第二发射信号相关。
127.根据权利要求126所述的方法，其中使所述第一发射信号与所述第二发射信号相关包括将所述第一发射信号的强度与所述第二发射信号的强度进行比较。
128.根据权利要求126所述的方法，还包括基于使所述第一发射信号与所述第二发射信号相关来对穿过所述通道的颗粒和/或分子的数量进行计数。
129.根据权利要求126所述的方法，还包括基于将所述第一发射信号与所述第二发射信号相关来在颗粒和/或分子上共定位靶分子。
130.根据权利要求126所述的方法，还包括基于将所述第一发射信号与所述第二发射信号相关来确定颗粒和/或分子浓度。
131.根据权利要求126所述的方法，还包括基于将所述第一发射信号与所述第二发射信号相关来确定检测效率和回收率。
132.根据权利要求125所述的方法，其中所述第一激发光和所述第二激发光具有在重叠波长范围内的光。
133.根据权利要求125所述的方法，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的光，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的光。
134.根据权利要求125所述的方法，其中所述第一激发光具有在第一波长范围内的波长，并且其中所述第二激发光具有在与所述第一波长范围共同的第二波长范围内的波长。
135.根据权利要求125所述的方法，其中所述颗粒和/或分子的所述速度用于确定通过包括所述探询窗口的所述管腔的体积流速。
136.根据权利要求125所述的方法，其中所述第一激发光在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
137.根据权利要求125所述的方法，其中所述第二激发光在约350nm至约360nm的波长范围内、在约400nm至约410nm的波长范围内、在约480nm至约490nm的波长范围内、在约530nm至约540nm的波长范围内、在约555nm至约565nm的波长范围内或在约630nm至约690nm的波长范围内。
138.根据权利要求125所述的方法，其中所述颗粒和/或分子包含由所述第一激发光和所述第二激发光中的一者或多者激发的染料。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述染料选自膜染料和体积染料。
140.根据权利要求138所述的方法，其中所述染料由所述第一激发光和所述第二激发光中的一者激发。
141.根据权利要求138所述的方法，其中所述染料由所述第一激发光和所述第二激发光两者激发。
142.根据权利要求138所述的方法，其中所述染料是由所述第一激发光激发的第一染料，并且其中所述颗粒和/或分子还包含由所述第二激发光激发的第二染料。
143.根据权利要求138所述的方法，其中所述染料是由所述第一激发光激发的第一染料，并且其中所述颗粒和/或分子还包含由所述第一激发光激发的第二染料。
144.根据权利要求138所述的方法，其中所述第一染料是膜染料并且所述第二染料是体积染料。
145.根据权利要求138所述的方法，其中所述第一染料和所述第二染料是膜染料。
146.根据权利要求128所述的方法，其中对颗粒和/或分子的数量进行计数包括单分子灵敏度或检测效率。
147.根据权利要求146所述的方法，其中单分子灵敏度或检测效率包括检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的流过所述通道的所述单分子。
148.根据权利要求147所述的方法，其中单分子检测效率包括检测超过90％的流过所述通道的所述单分子。
149.根据权利要求147所述的方法，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
150.根据权利要求147所述的方法，其中所述微流体装置限定平面部分。
151.根据权利要求125所述的方法，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
152.一种将光学部件聚焦在流体通道上的方法，所述方法包括：
利用来自光源的光照射流体通道的探询窗口；
利用设置在所述通道与光电检测器之间的光学部件将光聚焦在所述探询窗口上；
基于在第一时间从所述探询窗口背反射的聚焦光利用所述光电检测器生成锁定信号；
基于在所述第一时间之后的第二时间从所述探询窗口背反射的聚焦光利用所述光电检测器生成测试信号；
确定所述测试信号是否在所述锁定信号的预定百分比内；以及
如果所述测试信号在所述锁定信号的所述预定百分比之外，则相对于高数值孔径空气物镜移动所述流体通道。
153.一种保持被引导到流体通道上的光学部件的聚焦的方法，所述方法包括：
用来自光源的光照射微流体系统的成像区域；
利用相机生成所述成像区域的图像；
确定所述图像的散焦量；
确定所述散焦量是否在预定散焦量内；以及
如果所述测试信号在所述预定范围之外，则相对于所述相机移动所述流体通道。
154.根据权利要求152和153中任一项所述的方法，还包括利用光收集系统收集从所述探询背反射的聚焦光，其中所述光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99的范围内或约0.95的数值孔径的空气物镜。
155.根据权利要求152和153中任一项所述的方法，其中所述光在约700nm至约1mm的范围内。
156.根据权利要求152和153中任一项所述的方法，其中所述光在约700nm至约1500nm的范围内。
157.根据权利要求152和153中任一项所述的方法，其中所述光在不可见波长范围内。
158.一种单分子检测方法，所述方法包括：
使多个分子流过通道，其中所述多个分子中的一个或多个分子与可检出试剂缔合；
在所述通道中照射所述多个分子中的分子；
利用光收集系统收集从所述通道发出的发射光，所述光收集系统包括具有在约0.91至小于0.99范围内的数值孔径的空气物镜；
基于所收集的基于所述分子从所述通道发出的发射光生成发射信号；以及
基于所述信号为所述分子分配值。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述光收集系统具有约0.95的数值孔径。
160.根据权利要求158所述的方法，其中所述方法包括收集来自超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的流过所述通道的所述单分子的所述发射光。
161.根据权利要求158所述的方法，其中使与所述可检出试剂缔合的所述多个分子流过所述通道包括使所述多个分子中的分子逐分子地流过所述通道。
162.根据权利要求158所述的方法，其中在所述通道中照射所述多个分子中的所述分子包括使用线照明将激发光通过探询窗口输出到所述通道的一部分上。
163.根据权利要求158所述的方法，其中在所述通道中照射所述多个分子中的所述分子包括使用线共焦检测几何结构将激发光通过探询窗口输出到所述通道的一部分上。
164.根据权利要求158所述的方法，其中所述空气物镜具有约0.95的数值孔径。
165.根据权利要求158所述的方法，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述微流体装置限定平面部分。
167.根据权利要求158所述的方法，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
168.一种具有单分子检测效率的设备，所述设备包括：
通道，所述通道被构造成使颗粒或分子流过所述通道的管腔，所述通道限定被构造成允许光进入和离开所述管腔的探询窗口；
光引擎，所述光引擎被配置为通过所述探询窗口将激发光输出到所述通道中；
检测器系统，所述检测器系统被定位成接收从所述通道发出的发射光并被配置为基于所接收的发射光生成信号；
光收集系统，所述光收集系统被定位成收集来自所述通道的所述发射光并将所收集的发射光引导到所述检测器系统上，所述光收集系统包括具有在大于0.91且小于0.99的范围内的数值孔径的空气物镜；以及
控制器，所述控制器操作地耦合到所述光引擎和所述检测器系统并且包括逻辑，所述逻辑在被所述控制器执行时致使所述系统执行包括以下方面的操作：
使多个分子和/或多个颗粒流过所述通道，其中所述多个分子中的一个或多个分子和/或所述多个颗粒中的一个或多个颗粒与可检出试剂缔合；
在所述通道中照射所述多个分子中的分子或所述多个颗粒中的颗粒；
利用所述光收集系统收集从所述通道发出的发射光；
基于所收集的基于所述分子和/或所述颗粒从所述通道发出的发射光生成发射信号；以及
基于所述信号为所述分子和/或所述颗粒分配值。
169.根据权利要求168所述的设备，其中所述空气物镜具有约0.95的数值孔径。
170.根据权利要求168所述的设备，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
171.根据权利要求170所述的设备，其中所述微流体装置限定平面部分。
172.根据权利要求168所述的设备，其中单分子检测效率包括检测超过99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％的流过所述通道的所述单分子。
173.根据权利要求172所述的设备，其中单分子检测效率包括检测超过90％的流过所述通道的所述单分子。
174.根据权利要求168所述的设备，其中所述通道设置在微流体装置的一部分中。
175.根据权利要求174所述的设备，其中所述微流体装置限定平面部分。
176.根据权利要求168所述的设备，其中所述探询窗口内的所述通道限定相对于所述通道的相邻部分的收缩部。
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