CN116496253B - c-MET蛋白靶向降解剂及其医药应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类c‑MET蛋白靶向降解剂及其制备方法与医药用途。本发明提供一类基于蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)策略的c‑MET降解剂及其制备方法，以及该类c‑MET降解剂在非小细胞肺癌和胃癌等癌症预防和/或治疗中的应用。本发明的化合物能够高效，快速降解肿瘤细胞c‑MET，显著抑制c‑MET异常表达肿瘤细胞的增殖及其裸鼠异种移植瘤的生长。此外，本发明的化合物对于特泊替尼耐药细胞株也具有明显的抗增殖作用，凸显了其在克服小分子抑制剂耐药方面的优势。本发明提供了一类新型的抗肿瘤药物，具有较大的临床应用价值。

Description

c-MET蛋白靶向降解剂及其医药应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一类新型蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)类化合物及其制备方法与作为c-MET降解剂的应用，特别是在癌症预防和/或治疗中的应用。

背景技术

在肺癌人群中非小细胞肺癌(NSCLC)患者比例高达80％，约3％～5％的NSCLC患者是由MET14号外显子跳读

(METex14)所导致，因此临床上对于该类疾病的治疗药物有着重大需求。

间质-上皮细胞转化因子(c-Met)又称肝细胞生长因子(HGF)受体，属于受体酪氨酸激酶家族(RTKs)。c-Met与其配体HGF的结合后会发生同源二聚化，酪氨酸激酶区磷酸化，进而激活下游的多种信号通路，如PI3K-Akt、Ras-MAPK、STAT和Wnt/β-catenin等，从而发挥促进细胞增殖、细胞生长、细胞迁移及血管生成等效应。但是HGF/c-Met信号通路异常激活与肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关，其机制主要包括c-Met蛋白过度表达、MET蛋白过度表达、 MET14号外显子跳读(METex14)，其中METex14已被明确为致癌驱动因素。目前已有三款高选择性的c-Met小分子抑制剂上市，均属于I型抑制剂(根据结合方式分类)，分别为特泊替尼、卡马替尼、沃利替尼，其适应症均为携带METex14的非小细胞肺癌成人患者。然而I 型抑制剂在使用过程中容易出现的耐药问题给临床治疗带来了巨大挑战，因此需要开发新型靶向c-Met的药物来解决此问题。

蛋白降解靶向嵌合体PROTAC(Proteolysis targeting chimeras)是一种基于细胞自身的泛素-蛋白酶体系统(UPS)发展而来的靶向降解蛋白的技术。它是一种异双功能分子，由三部分组成：靶蛋白配体、Liner、E3泛素连接酶配体。PROTAC进入细胞后，两端的靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体分别识别靶蛋白和招募E3泛素连接酶，从而诱导形成稳定的三元复合物 (靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶)，之后E3泛素连接酶直接或间接地将靶蛋白泛素化，泛素化后的靶蛋白被26S蛋白酶体识别，从而实现靶蛋白降解。PROTAC分子相比于传统的小分子抑制剂有几个明显的优势：①作用范围更广、活性更高、可靶向“不可成药”靶点。②提高选择性、活性和安全性。③克服耐药性。

基于PROTAC策略开发c-Met降解剂可以为携带METex14的NSCLC患者提供一种新的治疗策略，并且有望克服小分子抑制剂耐药的问题，能更好地满足临床需求。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术存在的不足而提供下述通式I所示的PROTAC化合物及其应用，所述的PROTAC化合物具有抗肿瘤的活性，且对特泊替尼耐药株具有明显的抑制活性，可以作为新的抗肿瘤药物进行开发，具有广泛的应用前景。

M—L—E

式I

其中：

M为c-Met激酶的配体，L为连接链，E为E3泛素连接酶的配体。

具体地，M为式II所示结构。

L为式III所示任意结构之一：

其中，各个n为独立的1-20之内的任意一个整数。

E为式IV所示结构：

根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，式I所示化合物的结构式为D1-D15任意结构之一，但其不构成对本专利保护范围的限制：

本发明的第二个目的是提供制备式1化合物的方法：

本发明的第三个目的是提供一种c-Met降解剂，包括所述结构式如式I所示的化合物，其光学异构体，及药学上可接受的盐、溶剂合物或多晶型物。

本发明的第四个目的是提供一种c-Met降解剂，以及与其他药物联合用药用于制备治疗或预防肿瘤疾病的药物中的应用。所述的联用药物包括但不限于依鲁替尼、环磷酰胺、多柔吡星、阿糖胞苷、Azacitidine、Decitabine、卡非佐米、沙利度胺、来那度胺、泊马渡胺、吉非替尼、奥希替尼、厄洛替尼、特泊替尼、卡马替尼、奥司他丁、阿法替尼、氟他胺、尼鲁米特。

所述肿瘤疾病为胃癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、大肠癌、肾癌、骨肉瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤中的一种或几种。

本发明的第五个目的是提供一种c-Met降解剂及其药物组合物，包括其药学上可接受的载体或赋形剂。所述的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明的第六个目的是提供一种c-Met降解剂，及其可以适宜的给药途径。所述的适宜途径包括口服、舌下、直肠、胃肠外、注射(皮内、皮下、肌肉、静脉、动脉注射)、肺、鼻、舌、颊、皮肤、粘膜、结膜、局部给药或以植入物的形式给药。

适于口服给药的有可以迅速和/或以改变的方式传递活性成分的公知的给药形式，如片剂 (未包衣片或包衣片，如具有肠包衣或莫包衣的片剂)、胶囊、糖衣片、颗粒、小药丸、粉剂、乳剂、混悬液和气雾剂。

采用胃肠外给药可能可避免吸收步骤(静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰髓内给药) 或者包含吸收(肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内给药)。适于胃肠外给药的给药形式特别是用于注射和输入的溶液、混悬液、乳剂、冷冻干燥物和无菌粉末形式的制剂。

适于其他给药途径的有例如吸入(特别是粉末吸入、喷雾)的药物、鼻滴剂/溶液、喷雾剂；用于舌、舌下或颊给药的片剂或胶囊、栓剂、用于耳朵和眼睛的制剂、阴道胶囊、水性混悬液(洗剂、振摇混合物)、亲脂性混悬液、软膏、乳膏、乳液、糊剂、撒粉或植入物，如斯腾特固定模。

可以用本身已知的方法将该活性成分转化成所述的给药形式。其可以用惰性无毒的适宜药用赋形剂来实现。其特别是包括载体(例如微晶纤维素)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)、分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然生物聚合物 (例如蛋白质)、稳定剂(例如抗氧剂和抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料如氧化铁)或矫味剂和/或掩味剂。在适宜的情况中，所说的活性成分可以以微囊包封的形式存在于一种或多种上述载体中。

本发明的有益效果：

本发明的化合物能够有效降解c-Met，且在体内外均具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。此外，本发明化合物在发生I型抑制剂耐药突变的EBC-1和Hs746T细胞系中也表现出显著的抗增殖作用，凸显了其在克服小分子抑制剂耐药方面的优势。

具体实施方式

不需进一步详细说明，认为本领域熟练技术人员借助前面的描述，可以最大程度地利用本发明。因此，下面提供的实施例仅仅是进一步阐明本发明，并不意味着以任何方式限制本发明范围。

原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。化合物的结构通过核磁共振(¹H-NMR)和/或质谱(MS)来确定。NMR是采用AVANCENEO 600MHz核磁共振仪测定，溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d6)，TMS为内标。MS的测定采用Agilent 1100LC/MSD Trap SL version Mass Spectrometer(ESI)液相色谱-质谱联用仪。柱层析采用青岛海洋化工厂生产的200-300目硅胶。

【实施例1】：关键中间体1：(3-(6-氧代-1-(3-(5-(哌啶-4-基甲氧基)嘧啶-2-基)苄基)-1，6-二氢哒嗪-3-基)苯甲腈)的制备

以上反应路线中，所使用的试剂与条件如下：a)三苯基膦，偶氮二甲酸二异丙酯，无水四氢呋喃，0℃；b)[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯，磷酸钾，1，4-二氧六环∶水(2∶1)，70℃： c)三苯基膦，四氯化碳，二氯甲烷，45℃；d)碳酸钾，N，N-二甲基甲酰胺，80℃；e)三氟乙酸，二氯甲烷，室温

步骤1：4-((2-氯嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯

将2-氯-5-羟基嘧啶(5.00g，38.30mmol)、N-Boc-4-哌啶甲醇(10.00g，46.60mmol)、三苯基膦(12.20g，46.60mmol)溶于无水四氢呋喃(100mL)中，氮气保护，在0℃下搅拌10min， z之后向反应体系缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(9.40g，46.60mmol)，反应12h。反应完成后旋干，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化得白色固体(12.20g，产率98.91％)。¹H NMR (600MHz，DMSO-d6)δ8.54(s，2H)，4.02(d，J＝6.5Hz，2H)，4.00-3.92(m，2H)，2.73(s，2H)， 1.96(dddt，J＝14.4，11.6，6.7，2.9Hz，1H)，1.77-1.67(m，2H)，1.40(s，9H)，1.14(d，J＝4.3Hz， 2H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+Na]⁺350.13

步骤2：4-(2-(3-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯

将4-((2-氯嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(14.30g，42.80mmol)，3-羟甲基苯基硼酸频哪醇酯(10.20g，42.80mmol)，[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(0.93g， 1.30mmol)，磷酸钾(18.00g，85.60mmol)溶于1，4-二氧六环(100mL)中，加入水(20mL)，氮气保护，在80℃条件下搅拌7h。反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，之后经柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)得白色固体(16.10g，产率94.21％)。¹H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ8.64(s，2H)，8.30(d，J＝1.7Hz，1H)，8.16(dd，J＝7.6，1.6Hz，1H)，7.44(t，J＝ 7.5Hz，1H)，7.39(d，J＝7.6Hz，1H)，5.28(t，J＝5.7Hz，1H)，4.58(d，J＝5.7Hz，2H)，4.07(d，J＝ 6.4Hz，2H)，4.03-3.92(m，2H)，2.75(s，2H)，2.04-1.87(m，1H)，1.81-1.71(m，2H)，1.40(s， 9H)，1.18(qd，J＝12.4，4.4Hz，2H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺400.20

步骤3：4-(2-(3-(氯甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯

将4-(2-(3-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(17.10g，42.60mmol)，三苯基膦(17.00g，65.30mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，加入四氯化碳(10.20g，65.30mmol)，氮气保护，在45℃条件下搅拌6h。反应完成后，旋干，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化得白色固体(16.20g，产率91.20％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ8.65(s，1H)，8.38(d，J ＝2.0Hz，1H)，8.26(dt，J＝7.3，1.8Hz，1H)，7.56-7.48(m，2H)，4.87(s，2H)，4.07(d，J＝6.4Hz， 2H)，4.00-3.97(m，2H)，2.75(s，2H)，1.98(ddtt，J＝13.1，9.5，6.6，3.5Hz，1H)，1.82-1.69(m， 2H)，1.40(s，J＝4.6Hz，9H)，1.24-1.17(m，2H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺418.18

步骤4：叔丁基4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基) 嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸酯

将4-(2-(3-(氯甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(12.80g，30.60mmol)，3-(6-羰基-1，6-二氢-3-哒嗪基)苯氰(6.10g，30.60mmol)，碳酸钾(8.10g，61.20mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(100mL)中，加入10mL水，在80℃下搅拌4h。反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)进行洗涤，饱和食盐水(50mL*3)进行洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)得黄白色固体(14.20g，产率80.20％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.64(s，2H)，8.43-8.28(m，2H)，8.24(tt，J＝8.8，2.1Hz，2H)，8.17(d，J＝9.7Hz，1H)，7.93(dt，J＝7.7，1.4Hz， 1H)，7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.48(dd，J＝4.7，2.2Hz，2H)，7.16(d，J＝9.8Hz，1H)，5.44(s，2H)， 4.06(d，J＝6.4Hz，2H)，4.02-3.89(m，2H)，2.95-2.59(m，2H)，2.02-1.89(m，1H)，1.76(dd，J ＝13.5，3.6Hz，2H)，1.40(s，9H)，1.18(tt，J＝12.4，6.2Hz，2H)。LC/MS(ESDm/z：[M+H]⁺579.21

步骤5：3-(6-氧代-1-(3-(5-(哌啶-4-基甲氧基)嘧啶-2-基)苄基)-1，6-二氢哒嗪-3- 基)苯甲腈

将叔丁基4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-羧酸酯(9.80g，17.10mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，加入三氟乙酸(8.20g，70.30mmol)，室温下搅拌过夜。反应完成后，旋干，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化得黄白色固体(7.90g，产率97.41％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.65 (s，2H)，8.38(t，J＝1.8Hz，2H)，8.27-8.20(m，2H)，8.18(d，J＝9.8Hz，1H)，7.94(dt，J＝7.8，1.4 Hz，1H)，7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.49(d，J＝6.2Hz，2H)，7.17(d，J＝9.8Hz，1H)，5.45(s，2H)，4.08(d，J＝6.3Hz，2H)，3.27-3.18(m，2H)，2.82(td，J＝12.7，2.9Hz，2H)，2.11-2.02(m，1H)， 1.88(d，J＝12.6Hz，2H)，1.46-1.40(m，2H)，1.30(s，1H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺478.20

【实施例2】：关键中间体2：(3-溴-N-(2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异喹啉-4-基) 丙酰胺)的制备

将泊马度胺(1.00g，3.70mmol)，3-溴丙酰氯(1.20g，7.40mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL) 中，在65℃条件下回流，搅拌6h，反应完成后，旋干，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化得白色固体(1.20g，产率79.70％)。¹H NMR(600MHz，DMSO)δ11.15(s，1H)，9.89(s，1H)， 8.43(d，J＝8.4Hz，1H)，7.91-7.83(m，1H)，7.65(d，J＝7.1Hz，1H)，5.15(dd，J＝12.9，5.4Hz， 1H)，3.74(t，J＝6.4Hz，2H)，3.13(t，J＝6.4Hz，2H)，2.90(ddd，J＝17.2，14.0，5.4Hz，1H)，2.61 (dd，J＝14.4，3.1Hz，1H)，2.58-2.51(m，1H)，2.11-2.04(m，1H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺408.20

【实施例3】：3-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)丙酰胺(D1)的制备

将3-(6-氧代-1-(3-(5-(哌啶-4-基甲氧基)嘧啶-2-基)苄基)-1，6-二氢哒嗪-3-基)苯甲腈(0.31g，0.63mmol)，3-溴-N-(2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异喹啉-4-基)丙酰胺(0.52g，1.25mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入三乙胺(0.13g，1.25mmol)搅拌48h，反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝4∶1)得白色固体(0.25g，产率49.29％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ11.16 (s，1H)，10.51(s，1H)，8.64(s，2H)，8.57(d，J＝8.4Hz，1H)，8.38(dd，J＝7.8，1.9Hz，2H)，8.27-8.20(m，2H)，8.17(d，J＝9.7Hz，1H)，7.93(dt，J＝7.8，1.4Hz，1H)，7.83(dd，J＝8.4，7.3Hz，1H)， 7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.61(d，J＝7.3Hz，1H)，7.50-7.45(m，2H)，7.16(d，J＝9.7Hz，1H)，5.45 (s，2H)，5.14(dd，J＝12.8，5.5Hz，1H)，4.13-3.88(m，2H)，3.11-2.98(m，2H)，2.89(ddd，J＝ 16.8，13.8，5.5Hz，1H)，2.68-2.59(m，4H)，2.08(dtd，J＝13.0，5.2，2.2Hz，1H)，1.99(s，2H)，1.76 (d，J＝12.4Hz，3H)，1.43(pd，J＝11.9，6.0Hz，2H)，1.23(s，2H)。LC/MS(ESD m/z：[M+H]⁺806.12

【实施例4】：4-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)丁酰胺(D2)的制备

按照【实施例1-3】的步骤，制备得到白色固体化合物D2(0.21g，产率43.12％)。¹HNMR (600MHz，DMSO-d6)δ11.17(s，1H)，9.86(s，1H)，8.66(s，2H)，8.42(d，J＝8.4Hz，1H)，8.38 (d，J＝9.3Hz，2H)，8.24(t，J＝7.2Hz，2H)，8.18(d，J＝9.8Hz，1H)，7.93(d，J＝7.7Hz，1H)，7.85 (t，J＝7.8Hz，1H)，7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.65(d，J＝7.3Hz，1H)，7.49(d，J＝6.2Hz，2H)，7.17 (d，J＝9.7Hz，1H)，5.45(s，2H)，5.16(dd，J＝12.9，5.5Hz，1H)，4.09(d，J＝6.2Hz，2H)，3.55(d，J ＝11.6Hz，2H)，3.13-3.04(m，2H)，3.02-2.87(m，3H)，2.68-2.59(m，3H)，2.55(d，J＝4.2Hz， 1H)，2.13-2.03(m，4H)，2.03-1.95(m，2H)，1.79-1.68(m，2H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]+ 820.31

【实施例5】：5-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)戊酰胺(D3)的制备

按照【实施例1-3】的步骤，制备得到白色固体化合物D3(0.22g，产率45.23％)。¹HNMR (600MHz，DMSO-d₆)δ11.17(s，1H)，9.69(s，1H)，8.63(s，2H)，8.48(d，J＝8.5Hz，1H)，8.38(d，J ＝12.8Hz，2H)，8.24(d，J＝8.3Hz，2H)，8.17(d，J＝9.8Hz，1H)，7.92(d，J＝7.6Hz，1H)，7.83(t， J＝7.9Hz，1H)，7.71(t，J＝7.9Hz，1H)，7.61(d，J＝7.3Hz，1H)，7.48(s，2H)，7.16(d，J＝9.8Hz， 1H)，5.44(s，2H)，5.16(dd，J＝12.6，5.5Hz，1H)，4.09-3.91(m，2H)，2.62(d，J＝17.3Hz，1H)， 2.29(s，2H)，2.09(s，2H)，1.95-1.81(m，2H)，1.74(d，J＝11.7Hz，3H)，1.68-1.58(m，2H)，1.57-1.44(m，2H)，1.29(q，J＝12.7Hz，2H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺834.32

【实施例6】：6-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)己酰胺(D4)的制备

按照【实施例1-3】的步骤，制备得到白色固体化合物D4(0.20g，产率41.33％)。¹HNMR (600MHz，DMSO-d₆)δ11.17(s，1H)，9.70(s，1H)，8.63(s，2H)，8.48(d，J＝8.4Hz，1H)，8.42- 8.32(m，2H)，8.28-8.20(m，2H)，8.17(d，J＝9.7Hz，1H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1H)，7.83(t，J＝7.9 Hz，1H)，7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.61(d，J＝7.3Hz，1H)，7.53-7.43(m，2H)，7.16(d，J＝9.8Hz， 1H)，5.44(s，2H)，5.16(dd，J＝12.9，5.5Hz，1H)，4.02(d，J＝6.1Hz，2H)，3.00-2.82(m，3H)， 2.66-2.59(m，1H)，2.55(td，J＝13.3，4.6Hz，2H)，2.47(t，J＝7.4Hz，2H)，2.37-2.20(m，2H)， 2.13-2.02(m，1H)，1.89(s，1H)，1.81-1.70(m，3H)，1.64(p，J＝7.5Hz，2H)，1.47(dd，J＝14.4， 6.5Hz，2H)，1.32(td，J＝15.6，8.2Hz，4H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺848.33

【实施例7】：关键中间体3：(7-溴-N-(2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异喹啉-4-基) 庚酰胺)的制备

以上反应路线中，所使用的试剂与条件如下：a)二氯亚砜，二氯甲烷，室温；b)泊马度胺，无水四氢呋喃，65℃

步骤1：7-溴庚酰氯

将7-溴庚酸(1.50g，7.22mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，滴加二氯亚砜(1.70g，14.42mmol)，反应6h，旋干得淡黄色油状物(0.41g)。

步骤2：7-溴-N-(2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异喹啉-4-基)庚酰胺

将7-溴庚酰氯(0.41g，1.78mmol)，泊马度胺(0.70g，2.64mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，在65℃条件下回流，搅拌6h，反应完成后，旋干，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化得白色固体(0.66g，产率80.08％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ11.15(s，1H)， 9.71(s，1H)，8.46(d，J＝8.5Hz，1H)，7.83(dd，J＝8.4，7.3Hz，1H)，7.62(d，J＝7.3Hz，1H)，5.15(dd，J＝12.9，5.4Hz，1H)，3.53(t，J＝6.7Hz，2H)，2.90(ddd，J＝17.1，13.9，5.4Hz，1H)，2.61(ddd， J＝17.1，4.4，2.4Hz，1H)，2.56(dd，J＝13.1，4.5Hz，1H)，2.47(t，J＝7.4Hz，2H)，2.07(dtd，J＝ 13.0，5.4，2.3Hz，1H)，1.81(p，J＝6.8Hz，2H)，1.63(p，J＝7.5Hz，2H)，1.49-1.30(m，4H)。 LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺464.02

【实施例8】：7-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)庚酰胺(D5)的制备

按照【实施例1、3、7】的步骤，制备得到白色固体化合物D5(0.17g，产率42.35％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.17(s，1H)，9.69(s，1H)，8.62(s，2H)，8.48(d，J＝8.4Hz，1H)，8.38(dd，J＝12.4，1.9Hz，2H)，8.27-8.19(m，2H)，8.17(d，J＝9.8Hz，1H)，7.92(dt，J＝7.7，1.4 Hz，1H)，7.89-7.78(m，1H)，7.71(t，J＝7.9Hz，1H)，7.61(d，J＝7.3Hz，1H)，7.53-7.40(m，2H)， 7.16(d，J＝9.8Hz，1H)，5.44(s，2H)，5.16(dd，J＝12.9，5.4Hz，1H)，4.01(d，J＝5.9Hz，2H)，2.97 -2.80(m，3H)，2.62(ddd，J＝17.1，4.4，2.5Hz，1H)，2.55(s，1H)，2.46(t，J＝7.4Hz，2H)，2.23(t，J ＝7.3Hz，2H)，2.12-2.03(m，1H)，1.84(t，J＝11.2Hz，2H)，1.72(dd，J＝10.9，4.0Hz，3H)，1.63 (p，J＝7.4Hz，2H)，1.42(p，J＝7.2Hz，2H)，1.31(ddt，J＝26.3，9.9，5.3Hz，6H).LC/MS(ESI)m/z： [M+H]⁺862.34

【实施例9】：8-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)辛酰胺(D6)的制备

按照【实施例1、7、8】的步骤，制备得到白色固体化合物D6(0.16g，产率39.33％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.18(s，1H)，9.71(s，1H)，8.66(s，2H)，8.47(d，J＝8.4Hz，1H)，8.38(d，J＝8.6Hz，2H)，8.24(t，J＝7.6Hz，2H)，8.18(d，J＝9.8Hz，1H)，7.93(d，J＝7.7Hz，1H)， 7.84(t，J＝7.9Hz，1H)，7.72(t，J＝7.8Hz，1H)，7.62(d，J＝7.3Hz，1H)，7.49(d，J＝6.2Hz，2H)， 7.17(d，J＝9.7Hz，1H)，5.45(s，2H)，5.16(dd，J＝12.8，5.5Hz，1H)，4.09(s，2H)，3.02-2.74(m， 4H)，2.63(dt，J＝17.0，3.4Hz，1H)，2.58-2.51(m，3H)，2.48(t，J＝7.4Hz，2H)，2.14-2.02(m， 2H)，1.94(d，J＝12.8Hz，2H)，1.75-1.52(m，6H)，1.43-1.25(m，6H).LC/MS(ESI)m/z： [M+H]⁺876.36

【实施例10】：9-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)壬酰胺(D7)的制备

按照【实施例1、7、8】的步骤，制备得到白色固体化合物D7(0.18g，产率38.23％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.18(s，1H)，9.69(s，1H)，8.63(s，2H)，8.48(d，J＝8.4Hz，1H)，8.38(dd，J＝11.5，1.9Hz，2H)，8.23(td，J＝8.8，8.2，2.0Hz，2H)，8.17(d，J＝9.7Hz，1H)，7.93(d， J＝7.7Hz，1H)，7.82(t，J＝7.9Hz，1H)，7.71(t，J＝7.8Hz，1H)，7.61(d，J＝7.3Hz，1H)，7.51- 7.43(m，2H)，7.16(d，J＝9.8Hz，1H)，5.44(s，2H)，5.16(dd，J＝12.9，5.4Hz，1H)，4.02(d，J＝5.9 Hz，2H)，2.91(ddd，J＝17.1，13.8，5.5Hz，3H)，2.62(ddd，J＝17.2，4.5，2.5Hz，1H)，2.59-2.52 (m，1H)，2.46(t，J＝7.5Hz，2H)，2.28(s，2H)，2.08(dtd，J＝13.1，5.3，2.3Hz，1H)，1.90(s，2H)， 1.75(d，J＝12.4Hz，3H)，1.62(p，J＝7.2Hz，2H)，1.48-1.37(m，2H)，1.36-1.21(m，11H). LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺890.38

【实施例11】：10-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-oxopyridazin-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5- 基)氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)癸酰胺(D8) 的制备

按照【实施例1、7、8】的步骤，制备得到白色固体化合物D8(0.16g，产率37.13％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.19(s，1H)，9.68(s，1H)，8.62(s，2H)，8.48(d，J＝8.5Hz，1H)，8.38(dt，J＝14.0，1.8Hz，2H)，8.26-8.20(m，2H)，8.17(d，J＝9.8Hz，1H)，7.92(dt，J＝7.7，1.3 Hz，1H)，7.82(dd，J＝8.4，7.3Hz，1H)，7.71(t，J＝7.9Hz，1H)，7.60(d，J＝7.3Hz，1H)，7.51- 7.45(m，2H)，7.16(d，J＝9.7Hz，1H)，5.44(s，2H)，5.16(dd，J＝12.9，5.5Hz，1H)，4.01(d，J＝5.9 Hz，2H)，2.98-2.78(m，3H)，2.62(ddd，J＝17.2，4.5，2.5Hz，1H)，2.56(d，J＝6.5Hz，1H)，2.45(t， J＝7.4Hz，2H)，2.21(t，J＝7.3Hz，2H)，2.08(ddq，J＝10.6，5.5，2.7Hz，1H)，1.83(t，J＝11.4Hz， 2H)，1.77-1.68(m，3H)，1.62(p，J＝7.4Hz，2H)，1.38(p，J＝7.0Hz，2H)，1.34-1.21(m，12H). LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺904.39

【实施例12】：5-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)戊酰胺(D9)的制备

按照【实施例1、7、8】的步骤，制备得到灰白色固体化合物D9(0.22g，产率45.25％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.13(s，1H)，11.10-10.94(m，1H)，8.66(s，2H)，8.38(d，J＝ 7.0Hz，2H)，8.33(s，1H)，8.27-8.22(m，2H)，8.18(d，J＝9.8Hz，1H)，8.02(ddt，J＝7.8，5.1，2.7 Hz，1H)，7.93(d，J＝7.7Hz，1H)，7.87(d，J＝8.2Hz，1H)，7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.49(q，J＝4.4， 3.1Hz，2H)，7.16(d，J＝9.7Hz，1H)，5.45(s，2H)，5.13(dd，J＝12.9，5.4Hz，1H)，4.08(s，2H)， 3.01(s，2H)，2.90(ddd，J＝17.1，13.9，5.4Hz，2H)，2.61(dt，J＝17.3，3.3Hz，1H)，2.12-1.99(m，2H)，1.99-1.90(m，2H)，1.80-1.59(m，6H)，1.30(s，1H)，1.26(s，1H)，1.23(d，J＝8.1Hz，3H)， 0.85(t，J＝6.9Hz，1H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺834.32

【实施例13】：关键中间体4：(2-(4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H) -基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酸)的制备

以上反应路线中，所使用的试剂与条件如下：a)溴乙酸叔丁酯，N，N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，室温；b)三氟乙酸，二氯甲烷，室温

步骤1：乙酸叔丁酯2-(4-(2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基

将3-(6-氧代-1-(3-(5-(哌啶-4-基甲氧基)嘧啶-2-基)苄基)-1，6-二氢哒嗪-3-基)苯甲腈(1.00g，2.12mmol)，溴乙酸叔丁酯(0.48g，2.53mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(15mL) 中，加入碳酸钾(0.41g，3mmol)搅拌8h。反应完成后，加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得白色固体(0.99g，产率78.88％)。1 H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.65(s，2H)，8.41-8.35(m，2H)，8.27-8.21(m，2H)，8.18(d，J ＝9.7Hz，1H)，7.93(dt，J＝7.6，1.4Hz，1H)，7.72(t，J＝7.8Hz，1H)，7.52-7.45(m，2H)，7.16(d，J ＝9.7Hz，1H)，5.45(s，2H)，4.08(s，2H)，2.28-2.19(m，2H)，1.88(s，2H)，1.58-1.45(m，5H)， 1.40(s，10H)，1.23(s，2H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺593.13

步骤2：2-(4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酸

将乙酸叔丁酯2-(4-(2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基(1.20g，2.12mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入三氟乙酸(1.21g，10.11mmol)，室温下搅拌过夜。反应完成后，旋干，经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化得白色固体(0.97g，产率92.81％)。

【实施例14】：关键中间体5：(4-((2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基)-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)异吲哚啉-1，3-二酮)的制备

以上反应路线中，所使用的试剂与条件如下：a)叔丁基(2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯，N，N-二异丙基乙胺，N，N-二甲基甲酰胺，80℃；b)二氯甲烷，三氟乙酸，室温

步骤1：叔丁基(2-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)氨基甲酸乙酯

将2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1，3-二酮(2.03g，7.20mmol)，叔丁基(2-(2- 氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(1.09g，4.90mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(1.22g，7.20mmol)搅拌8h。反应完成后，加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得黄绿色固体(0.38g，产率 16.82％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ11.06(s，1H)，7.57(d，J＝8.3Hz，1H)，7.14(t，J＝5.5 Hz，1H)，7.01(d，J＝2.2Hz，1H)，6.90(dd，J＝8.4，2.2Hz，1H)，6.79(q，J＝7.5，6.6Hz，1H)，5.03 (dd，J＝12.8，5.4Hz，1H)，3.57(t，J＝5.4Hz，2H)，3.45-3.38(m，3H)，3.13-3.03(m，3H)，2.87 (ddd，J＝17.0，13.9，5.5Hz，1H)，2.58(ddd，J＝17.0，5.2，2.5Hz，1H)，2.00(dddd，J＝12.9，11.1， 5.7，3.0Hz，2H)，1.37(s，9H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺461.15

步骤2：4-((2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基)-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)异吲哚啉-1，3- 二酮

将叔丁基(2-(2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1，3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)氨基甲酸乙酯(0.38g，0.83mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入三氟乙酸(1.02g，8.26mmol)，室温下搅拌过夜。反应完成后，旋干，经柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化得黄绿色固体(0.28g，产率93.45％)。

【实施例15】：2-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基)乙氧基)乙基)乙酰胺(D10)的制备

将2-(4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酸(0.30g，0.56mmol)，4-((2-(2-氨基乙氧基)乙基) 氨基)-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)异吲哚啉-1，3-二酮(0.21g，0.56mmol)，溶于N，N-二甲基甲酰胺(30mL)中，在0℃下缓缓加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(0.32g，0.83mmol)，N，N-二异丙基乙胺(0.10g，0.83mmol)，搅拌48h，反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得黄绿色固体(0.18g，产率36.61％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.06(s，1H)，8.62(s，2H)，8.45- 8.31(m，2H)，8.25(dt，J＝8.0，1.4Hz，1H)，8.23-8.21(m，1H)，8.19(d，J＝9.8Hz，1H)，7.93(dt，J＝7.9，1.4Hz，1H)，7.72(t，J＝7.9Hz，1H)，7.55(d，J＝8.3Hz，1H)，7.51-7.46(m，2H)，7.32(s， 1H)，7.16(d，J＝9.7Hz，1H)，7.04(s，1H)，6.96-6.87(m，1H)，5.45(s，2H)，5.02(dd，J＝12.8，5.5 Hz，1H)，4.02(d，J＝6.0Hz，2H)，3.61(t，J＝5.4Hz，2H)，3.49(t，J＝5.7Hz，2H)，3.36-3.32(m， 3H)，3.30(q，J＝5.8Hz，2H)，2.86(ddd，J＝16.6，13.6，5.4Hz，5H)，2.58-2.52(m，1H)，2.50- 2.46(m，1H)，2.11(d，J＝19.6Hz，2H)，2.01-1.93(m，1H)，1.75(d，J＝12.6Hz，3H)，1.50-1.30 (m，2H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺879.28

【实施例16】：2-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(D11)的制备

按照【实施例13-15】的步骤，制备得到黄绿色固体化合物D11(0.18g，产率35.12％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.06(s，1H)，8.62(s，2H)，8.38(dt，J＝9.6，1.8Hz，2H)，8.23 (ddt，J＝10.7，6.6，1.8Hz，2H)，8.17(d，J＝9.7Hz，1H)，7.92(dt，J＝7.7，1.4Hz，1H)，7.71(t，J＝ 7.9Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4Hz，1H)，7.51-7.45(m，2H)，7.19-7.12(m，2H)，7.00(d，J＝2.1Hz， 1H)，6.88(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，5.44(s，2H)，5.03(dd，J＝12.8，5.5Hz，1H)，4.03(d，J＝5.9Hz， 2H)，3.59(t，J＝5.5Hz，2H)，3.58-3.51(m，4H)，3.44(t，J＝5.8Hz，2H)，3.27(q，J＝5.9Hz，2H)， 3.18(d，J＝4.9Hz，2H)，2.98-2.75(m，5H)，2.57(dt，J＝16.8，3.2Hz，1H)，2.07(d，J＝20.9Hz， 2H)，2.01-1.95(m，1H)，1.75(d，J＝12.1Hz，3H)，1.44-1.35(m，2H)，1.22(s，3H).LC/MS(ESI) m/z：[M+H]⁺923.32

【实施例17】：2-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基) 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(D12)的制备

按照【实施例13-15】的步骤，制备得到黄绿色固体化合物D12。(0.15g，产率32.11％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.07(s，1H)，8.64(s，2H)，8.43-8.34(m，2H)，8.27-8.20(m， 2H)，8.17(d，J＝9.7Hz，1H)，7.93(dt，J＝7.7，1.4Hz，1H)，7.71(t，J＝7.9Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4 Hz，1H)，7.51-7.45(m，2H)，7.20(t，J＝5.6Hz，1H)，7.16(d，J＝9.7Hz，1H)，7.00(d，J＝2.2Hz， 1H)，6.88(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，5.44(s，2H)，5.04(dd，J＝12.8，5.5Hz，1H)，4.04(d，J＝5.9Hz， 2H)，3.58(t，J＝5.5Hz，2H)，3.56-3.48(m，8H)，3.43(d，J＝11.6Hz，2H)，3.34(d，J＝5.6Hz， 1H)，3.26(q，J＝5.8Hz，2H)，2.88(ddt，J＝23.4，11.8，5.8Hz，5H)，2.58(dt，J＝19.9，4.5Hz，1H)， 2.11(d，J＝20.3Hz，3H)，2.00(dtt，J＝12.8，5.4，2.9Hz，1H)，1.83-1.71(m，3H)，1.39(q，J＝12.3 Hz，2H)，1.15(s，1H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺967.38

【实施例18】：2-(4-(((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧代哒嗪-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基) 氧基)甲基)哌啶-1-基)-N-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙基)乙酰胺(D13)的制备

按照【实施例13-15】的步骤，分别制备下列黄绿色固体化合物D13(0.20g，产率41.13％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.11(s，1H)，8.61(s，2H)，8.40-8.34(m，2H)，8.26-8.20(m， 2H)，8.17(d，J＝9.8Hz，1H)，7.92(dt，J＝7.7，1.4Hz，1H)，7.74-7.66(m，2H)，7.56(dd，J＝8.5， 7.1Hz，1H)，7.51-7.45(m，2H)，7.14(dd，J＝20.6，9.1Hz，2H)，7.01(d，J＝7.0Hz，1H)，6.60(t，J ＝5.8Hz，1H)，5.45(s，2H)，5.06(dd，J＝12.9，5.5Hz，1H)，3.99(d，J＝6.0Hz，2H)，3.62(t，J＝5.5 Hz，2H)，3.48(dt，J＝16.6，5.8Hz，4H)，3.30(q，J＝5.9Hz，2H)，2.94-2.87(m，3H)，2.82(d，J＝ 10.8Hz，2H)，2.59(dt，J＝16.9，3.3Hz，1H)，2.11-1.96(m，3H)，1.80-1.67(m，3H)，1.40-1.30 (m，2H)，1.22(d，J＝4.5Hz，1H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺879.28

【实施例19】：关键中间体6：(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-((2-(哌嗪-1-基)乙基)氨基)异二氢吲哚-1，3-二酮)的制备

以上反应路线中，所使用的试剂与条件如下：a)4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二异丙基乙胺，80℃；b)二氯甲烷，三氟乙酸，室温

步骤1：4-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基)乙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1，3-二酮(5.00g，18.10mmol)，4-(2-氨基乙基) 哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4.10g，18.10mmol)溶于溶于N，N-二甲基甲酰胺(50mL)中，加入N，N- 二异丙基乙胺(2.30g)，在80℃下搅拌8h，反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得黄绿色固体(0.48g，产率5.48％)¹H NMR (600MHz，DMSO-d6)δ11.06(s，1H)，7.57(d，J＝8.3Hz，1H)，7.02(d，J＝16.0Hz，2H)，6.89(d，J ＝8.3Hz，1H)，5.03(dd，J＝12.9，5.4Hz，1H)，2.94-2.81(m，1H)，2.62-2.47(m，10H)，2.37(d，J ＝26.1Hz，4H)，2.00(dtd，J＝13.0，5.4，2.3Hz，1H)，1.40(s，9H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺486.18

步骤2：2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-((2-(哌嗪-1-基)乙基)氨基)异二氢吲哚-1，3-二酮

将4-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基)乙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.48g，1.00mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入三氟乙酸(0.91g，8.00mmol)，室温下搅拌过夜。反应完成后，旋干，经柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化得黄绿色固体 (0.38g，产率98.70％)。

【实施例20】：3-(1-(3-(5-((1-(2-(4-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5- 基))氨基)乙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)哌啶-4-基)甲氧基)嘧啶-2-基)苄基)-6-氧代 -1，6-二氢哒嗪-3-基)苄腈(D14)的制备

将2-(4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酸(0.30g，0.56mmol)，2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-((2-(哌嗪-1-基)乙基)氨基)异二氢吲哚-1，3-二酮(0.21g，0.56mmol)，溶于N，N-二甲基甲酰胺(30mL) 中，在0℃下缓缓加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(0.32g， 0.83mmol)，N，N-二异丙基乙胺(0.12g，0.83mmol)，搅拌48h，反应完成后加入乙酸乙酯 (200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝4∶1)得黄绿色固体(0.15g，产率29.66％)。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.08(s，1H)，8.64(s，2H)，8.38(d，J＝13.4Hz， 2H)，8.24(t，J＝6.7Hz，2H)，8.17(d，J＝9.8Hz，1H)，7.93(d，J＝7.7Hz，1H)，7.71(t，J＝7.9Hz， 1H)，7.57(d，J＝8.4Hz，1H)，7.48(d，J＝6.4Hz，2H)，7.16(d，J＝9.7Hz，1H)，7.06(t，J＝5.4Hz， 1H)，7.04-7.00(m，1H)，6.94-6.86(m，1H)，5.45(s，2H)，5.04(dd，J＝12.8，5.5Hz，1H)，4.04(d， J＝5.9Hz，2H)，3.52(d，J＝46.6Hz，4H)，3.32(d，J＝6.2Hz，3H)，2.99-2.80(m，3H)，2.65- 2.52(m，4H)，2.45(d，J＝39.3Hz，4H)，2.14-1.96(m，2H)，1.79(d，J＝12.0Hz，3H)，1.43-1.17 (m，5H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺904.28

【实施例21】：关键中间体7：(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)异吲哚啉-1，3-二酮)的制备

以上反应路线中，所使用的试剂与条件如下：a)哌嗪-1-羧酸叔丁酯，N，N-二甲基甲酰胺， N，N-二异丙基乙胺，80℃；b)二氯甲烷，三氟乙酸，室温

步骤1：4-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯

将2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1，3-二酮(2.12g，7.30mmol)，哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.50g，7.51mmol)溶于溶于N，N-二甲基甲酰胺(40mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺 (1.41g)，在80℃下搅拌8h，反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得黄绿色固体(1.78g，产率55.17％)。¹H NMR(600MHz， DMSO-d6)δ11.08(d，J＝7.2Hz，1H)，7.70(d，J＝8.5Hz，1H)，7.35(d，J＝2.3Hz，1H)，7.25(dd， J＝8.6，2.4Hz，1H)，4.11(q，J＝5.3Hz，1H)，3.47(s，8H)，3.17(d，J＝5.2Hz，2H)，3.11(s，1H)， 2.73(s，1H)，1.43(s，9H).LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺443.18

步骤2：2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)异吲哚啉-1，3-二酮

将4-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.03g， 2.30mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(2.02g，18.40mmol)，室温下搅拌过夜。反应完成后，旋干，经柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)纯化黄绿色固体(0.72g，产率91.53％)。

【实施例22】：3-(1-(3-(5-((1-(2-(4-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-5-基)哌嗪-1-)yl)-2-氧代乙基)哌啶-4-基)甲氧基)嘧啶-2-基)苄基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)苄腈 (D15)的制备

将2-(4-((2-(3-((3-(3-氰基苯基)-6-氧吡啶-1(6H)-基)甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)甲基)哌啶-1-基)乙酸(0.3g，0.56mmol)，2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)异吲哚啉-1，3-二酮(0.20g，0.56mmol)，溶于N，N-二甲基甲酰胺(30mL)中，在0℃下缓缓加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(0.32g，0.83mmol)，N，N-二异丙基乙胺(0.11g，0.83mmol)，搅拌48h，反应完成后加入乙酸乙酯(200mL)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL*3)洗涤，饱和食盐水(50mL*3)洗涤。乙酸乙酯相无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝4∶1)得黄绿色固体(0.17g，产率35.30％)。¹HNMR (600MHz，DMSO-d₆)δ11.10(s，1H)，8.64(s，2H)，8.38(d，J＝4.6Hz，2H)，8.27-8.20(m，2H)， 8.18(d，J＝9.7Hz，1H)，7.93(d，J＝7.6Hz，1H)，7.75-7.66(m，2H)，7.48(d，J＝5.8Hz，2H)， 7.40-7.35(m，1H)，7.27(dd，J＝8.7，2.3Hz，1H)，7.16(d，J＝9.6Hz，1H)，5.44(s，2H)，5.08(dd， J＝12.8，5.5Hz，1H)，4.05(d，J＝6.1Hz，2H)，3.73(s，2H)，3.64-3.45(m，6H)，3.21(s，1H)，2.97 -2.82(m，3H)，2.63-2.55(m，1H)，2.15-1.93(m，3H)，1.79(d，J＝11.5Hz，3H)，1.45-1.17(m， 5H)。LC/MS(ESI)m/z：[M+H]⁺861.12

【实施例23】：化合物体外抗肿瘤活性测试

本实施例中细胞模型选取了c-MET过表达EBC-1非小细胞肺癌细胞株和METex14突变的 Hs746T胃癌细胞株，该细胞株过表达c-MET以及磷酸化c-MET(p-c-MET)。同时选取c-MET 不依赖的A549非小细胞肺癌细胞株、HepG2肝癌细胞株，该细胞株中c-MET以及p-c-MET表达含量较低。同时选取正常人肝细胞LO2以及人胚胎肾细胞293(HEK293T)细胞株，测定了实施例中15个化合物对上述细胞株的抑制活性。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2实验步骤

2.1化合物储液的制备

将化合物溶于DMSO，制备成10mM的储液。三个月内使用的化合物室温储存于干燥器内，其它的可以在-20℃长期储存。

工作液的制备：

上述化合物及阳性参比化合物tepotinib都用DMSO稀释，起始浓度1000nM，在EBC-1， Hs746T，HepG2，A549，LO2，HEK293T细胞实验中，进行3倍梯度稀释，10个浓度点。振荡器上震荡5min。

2.2细胞加药

2.2.1处于对数生长期的EBC-1，Hs746T，HepG2，A549，LO2，HEK293T细胞种于96孔板中，每孔3000-4000细胞量，将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO₂的条件下)。

2.2.2更换孔板中的培养基，向培养板加入100μl相应浓度的化合物及阳性药。

2.2.3将培养板在培养箱孵育一段72小时，向每孔加入10μlCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

2.2.4用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

3数据分析

计算％Inhibition：

％Inhibition＝100-(Signal_cmpd-Signal_{Ave_PC})/(Signal_{Ave_VC}-Signal_{Ave_PC})×100.

计算化合物的IC₅₀和Plot效应剂量曲线：

使用GraphPad 6.0，通过将％Inhibition和化合物浓度的对数拟合为非线性回归(剂量响应-可变斜率)来计算IC₅₀值。

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*HillSlope))

X：log of inhibitor concentration；Y：％Inhibition

4试验结果

计算％Inhibition后，以受试化合物浓度的对数为横坐标，酶抑制率平均值为纵坐标绘制剂量效应曲线，拟合出IC₅₀值，结果显示：

如表1所示，本实施例化合物对c-MET过表达EBC-1非小细胞肺癌细胞、METex14突变的 Hs746T胃癌细胞，均表现出优良的抗增殖活性，其IC₅₀均在纳摩尔水平，其中D14与D15与 tepotinib活性相当；对c-MET非依赖的肿瘤细胞A549、HepG2细胞表现出相对较弱的抗增殖活性，其IC₅₀均在微摩尔水平，表明本实施例化合物抗增殖活性与c-MET表达水平相关；在正常细胞LO2、HEK293T细胞中100μM未观察到明显的抗增殖活性。与tepotinib相比，所有化合物对正常细胞的选择性均有所提高，说明其副作用较小。

表1.化合物对EBC-1，Hs746T，HepG2，A549，LO2，HEK293T细胞抑制作用

【实施例24】：化合物对c-MET蛋白的降解作用

本实施例中细胞模型选取EBC-1非小细胞肺癌细胞株和Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例23中具有优良抗肿瘤增殖活性的化合物D3、D10、D12、D14、D15，测定其对c-MET蛋白的降解作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

半干转印仪，细胞计数板，微量加样器，凝胶成像系统和化学发光成像系统购自美国 Bio-Rad公司；

2.实验步骤

2.1工作液的制备：

上述化合物及阳性参比化合物tepotinib都用DMSO稀释，起始浓度2430nM，在EBC-1，Hs746T细胞实验中，进行3倍梯度稀释，11个浓度点。振荡器上震荡5min。

2.2细胞加药

2.2.1处于对数生长期的EBC-1，Hs746T细胞种于6孔板中，每孔100万细胞量，将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO₂的条件下)。

2.2.1更换孔板中的培养基，向培养板加入100μl相应浓度的化合物及阳性药。

2.3细胞总蛋白样品制备：

用PBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂用细胞刮刀将细胞收集到1.5ml离心管中，12000g离心5min，收集上清并测定蛋白浓度。

2.4依次进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭及一抗、二抗孵育，最后进行化合物发光显色，并使用imageJ定量分析灰度值，计算％degradation和最大降解率(D_max)并使用GraphPad 6.0，以受试化合物浓度的对数为横坐标，％degradation平均值为纵坐标绘制剂量效应曲线，拟合出半数有效降解浓度DC₅₀值。

3.试验结果

如附图1、表2所示，从Western-Blot试验中可以观察到，在EBC-1、Hs746T细胞系中D3、D10、D12、D14和D15均具有显著的c-MET降解作用，且其DC₅₀均处于纳摩尔水平，且D_max均大于95％。另外，D10、D14的DC₅₀＜1nM，D_max＞99％；D15的降解效果最优，其DC₅₀＜0.5 nM，D_max＞99％，表明本实施例化合物是高效的c-MET降解剂。

表2.c化合物对EBC-1，Hs746T细胞中c-MET蛋白降解作用

如附图2所示，从Western-Blot试验中可以观察到，D10和D15在100nM浓度下3h显著抑制 EBC-1和Hs746T细胞中p-c-MET的表达，在10nM浓度下处理6h完全抑制EBC-1和Hs746T细胞中p-c-MET的表达。此外，D10和D15在100nM浓度下9h显著降解EBC-1和Hs746T细胞中c-MET，12h几乎完全降解c-MET。表明本实施例化合物是能快速发挥c-MET的降解和p-c-MET 的抑制作用。

【实施例25】：D10、D15对肿瘤细胞转移的抑制活性测定

本实施例中的细胞模型选取EBC-1非小细胞肺癌细胞株和Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例24中具有优良降解c-MET蛋白化合物D10和D15，通过划痕实验，测定其对肿瘤细胞转移的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2.实验步骤

2.1所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min。

2.2先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

2.3取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在 10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2.4在6孔板中加入约5-10×10⁵个细胞，过夜后细胞铺满整个6孔板，第二天用200μL枪头垂直比着直尺，横线划痕。

2.5工作液的制备：上述化合物及阳性参比化合物tepotinib都用DMSO稀释，振荡器上震荡5min。

2.6用PBS洗细胞3次，洗去划下的细胞，将培养液更换为目的条件培养基。

2.7随机选取几个点在显微镜下拍照，并记录细胞的初始位置，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。

2.8按12小时取样，在初始拍照的位置再次在显微镜下拍照，记录细胞迁移的位置。使用图像处理软件测量细胞迁移的距离。

3.试验结果

如附图3及表3所示，细胞划痕试验表明，D10和D15在低纳摩尔浓度下以剂量依赖性方式抑制EBC-1和Hs746T细胞的迁移能力，其抑制活性与tepotinib相当。

表3.c-MET降解剂D10、D15及tepotinib抗EBC-1，Hs746T细胞转移抑制率

【实施例26】：化合物D10、D15对肿瘤细胞侵袭的抑制作用测定

本实施例中的细胞模型选取EBC-1非小细胞肺癌细胞株和Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例24中具有优良降解c-MET蛋白作用的化合物D10和D15，测定其对肿瘤细胞侵袭的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2.实验步骤

2.1基质胶铺板：用预冷的PBS稀释BD公司PBS：Matrigel＝1∶8至总体积为90μL(稀释比例可根据细胞产生MMP的量适当调整)，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃培养箱中1h使Matrigel聚合成凝胶。

2.2制备细胞悬液：

2.2.1贴壁细胞培养基更换为无血清培养基，饥饿12-24h。

2.2.2消化细胞，取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，终止消化后离心弃去培养液，PBS洗2次，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5× 10⁵/mL。

2.3工作液的制备：上述化合物及阳性参比化合物tepotinib都用DMSO稀释，振荡器上震荡5min。

2.4接种细胞

2.4.1 24孔板下室加入600μl含20％FBS的培养基，轻轻将Transwell小室放于下层培养液上，避免气泡产生。

2.4.2取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

2.4.3根据癌细胞侵袭能力常规培养12-48h。

2.5结果统计

2.5.1取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。

2.5.2 0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即六个视野观察细胞，统计实验结果

3.试验结果

如附图4及表4所示，transwell小孔试验表明，D10和D15在低纳摩尔浓度下以剂量依赖性方式抑制EBC-1和Hs746T细胞的侵袭能力，其抑制活性与tepotinib相当。

表4.c-MET降解剂D10、D15及tepotinib对EBC-1，Hs746T细胞侵袭抑制率

【实施例27】化合物D10、D15对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

本实施例中的细胞模型选取EBC-1非小细胞肺癌细胞株和Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例24中具有优良降解c-MET蛋白化合物D10和D15，测定其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2.实验步骤

2.1取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在 10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2.2将细胞悬液作梯度倍数稀释，种于6孔板内，每孔3-5×10⁴个细胞，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜。

2.3工作液的制备：上述化合物及阳性参比化合物tepotinib都用DMSO稀释，振荡器上震荡5min。

2.4将培养板中的培养基更换为含有不同浓度的待测物质的完全培养基处理24-48h。

2.5贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(3000rpm，离心5min)，用PBS洗涤细胞二次(3000rpm离心5min)，收集10⁵细胞；

2.6加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，依次加入5μL Annexin V-PE和5μL PI混匀；

2.7室温避光反应5～15min后进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝578nm。使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

3.试验结果

如附图5及表5所示，实验结果表明，D10和D15在10nM和100nM浓度下显著诱导EBC-1 和Hs746T细胞凋亡，其抑制活性与tepotinib相当，且具有剂量依赖效应。

表5.c-MET降解剂D10、D15及tepotinib对EBC-1，Hs746T凋亡细胞百分比

【实施例28】：测定D10、D15对肿瘤细胞周期的阻滞作用

本实施例中的细胞模型选取EBC-1非小细胞肺癌细胞株和Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例24中具有优良降解c-MET蛋白化合物D10和D15，测定其对肿瘤细胞周期的阻滞作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2.实验步骤

2.1细胞样品的准备

2.1.1取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2.1.2将细胞悬液作梯度倍数稀释，种于6孔板内，每孔3-5×10⁴个细胞，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜。

2.1.3工作液的制备：上述化合物及阳性参比化合物tepotinib都用DMSO稀释，振荡器上震荡5min。

2.1.4将培养板中的培养基更换为含有不同浓度的待测物质的完全培养基处理24-48h.

2.1.5用胰酶(无EDTA)消化细胞，收集所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞，收集细胞约106。

2.1.6 PBS洗两次后，用250μL预冷的PBS重悬细胞

2.2细胞固定

缓慢加入750μL预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，-20℃固定过夜，封口膜封口。

2.3 PI染色

2.3.1取-20℃固定的细胞3000r/min左右离心3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清

2.3.2PBS洗两次后，加入用200μL预冷的PBS重悬细胞。

2.3.3加入0.2mL RNaseA(1mg/mL，溶于PBS中)，37℃水浴30min。

2.3.4每管细胞样品中加入5μL碘化丙啶染色液，再加入0.3mL PBS，缓慢并充分混匀后4℃避光孵育30min。

2.4流式检测和分析

细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用FlowJoX10.0软件进行细胞DNA含量分析。

3.试验结果

如附图6及表6所示，实验结果表明，D10和D15在10nM和100nM作用下，G0/G1含量显著增加，表明D10和D15阻滞EBC-1和Hs746T细胞周期在G1期，其阻滞能力与tepotinib相当，且具有剂量依赖效应。

表6.c-MET降解剂D10、D15及tepotinib对EBC-1，Hs746T细胞周期的作用

【实施例29】：化合物D10、D15口服给药对裸鼠异种移植瘤的生长抑制及c-MET降解活性

本实施例中的细胞模型选取Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例13中具有优良降解c-MET 蛋白化合物D10和D15，测定其对肿瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2.实验步骤

胰酶消化对数生长期细胞，细胞计数后重悬于PBS中，将5×106个Hs746T细胞分别接种于4～6周龄大小的雌性BALB/c裸鼠的乳房垫处(一般选择腋下或腹股沟等血管丰富的部位)，每只裸鼠注射0.1mL细胞悬液，根据不同实验要求可设置每组7只。动物实验给药方案为：溶剂对照，D10(20，40mg/kg)，D15(20，40mg/kg)，口服给药，每天给药一次。

从接种时间开始，每隔2天观察和测量肿瘤生长的大小情况，测量肿瘤的最大直径(L) 和最小直径(D)，肿瘤体积大小的计算公式为V＝L×D²×1/2。每隔2天称量裸鼠体重，在最后一次给药24小时后，根据肿瘤体积大小计算抑瘤率TGI(％)＝(Vc-Vt)/(Vc-V₀)*100。Vc， Vt和V₀分别为初始给药肿瘤体积，给药组肿瘤体积和控制组肿瘤体积。处死小鼠，解剖对皮下移植的肿瘤进行称重，并取部分肿瘤组织用多聚甲醛溶液固定48h，石蜡包埋切片，然后进行HE(苏木精一伊红染色法)染色及免疫组织化学染色分析。

3.试验结果

如附图7及表7所示，实验结果表明，D10和D15显著抑制Hs746T移植瘤的生长，且具有剂量依赖效应。相同剂量下，D15抑制效果优于D10，当D15给药剂量为40mg/kg时，D15的抑瘤率已高达99.2％。实验过程中没有出现裸鼠体重降低及其他毒副反应，表明D10和D15具有良好的耐受性。HE染色剂免疫组化结果表明，D10和D15显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤汇总p-c-MET的含量，升高细胞凋亡标志物cleaved-PARP的含量，且同等剂量下，D15对肿瘤c-MET 的抑制效果优于D10，表明D15具有更优的体内c-MET降解效应.

表7.c-MET降解剂D10、D15对Hs746T裸鼠异种移植瘤蛋白的抑制作用

【实施例30】化合物D10和D15对EBC-1、Hs746T耐药细胞株的增殖抑制作用

本实施例中的细胞模型选取EBC-1非小细胞肺癌细胞株和Hs746T胃癌细胞株，挑选了实施例24中具有优良降解c-MET蛋白化合物D10和D15，测定其对具有Y1230H、D1228N耐药突变的EBC-1、Hs746T细胞株的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。

1.实验材料和仪器

1.1用于生物活性评价的实验耗材

2.实验步骤

2.1构建c-MET^Y1230H和c-MET^D1228N质粒

2.2慢病毒的包装

2.2.1转染前一天，将HKE293T细胞平铺于10cm培养皿上。将细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8-24h，当细胞汇集至80％可开始转染。转染前1h更换为全新的完全培养基。

2.2.2混匀目的基因质粒和包装质粒，按如下剂量配置混合液：

加入Opti-MEM^TM培养基至总体积1mL，充分混匀，室温孵育15-20min。将上述混合液逐滴加入HEK293T细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO₂的37℃温箱孵育。

2.2.348h后收集含慢病毒的上清，1000r/min离心1min，取上清进行感染或者分装后置于-80℃储存待用。

2.2.4将待构建的细胞平铺于6孔板或12孔板，最佳密度为30％-70％。对于六孔板加入 10μg/mL polybrene，充分摇匀后置于37℃温箱孵育。12-24h后更换为全新的完全培养基。加入2-5μg/mL puromycin，48h后检测基因表达情况。

2.3化合物储液的制备

工作液的制备：

上述化合物及阳性参比化合物tepotinib，Crizotinib都用DMSO稀释，起始浓度20000nM，进行3倍梯度稀释，15个浓度点。振荡器上震荡5min。

2.4细胞加药

2.4.1处于对数生长期的EBC-1-，Hs746T-c-MET^Y1230H和EBC-1-，Hs746T-c-MET^D1228N细胞种于96孔板中，每孔3000-4000细胞量，将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO₂的条件下)。

2.4.2更换孔板中的培养基，向培养板加入100μl相应浓度的化合物及阳性药。

2.4.3将培养板在培养箱孵育一段72小时，向每孔加入10μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

2.4.4用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

3数据分析

计算％Inhibition：

％Inhibition＝100-(Signal_cmpd-Signal_{Ave_PC})/(Signal_{Ave_VC}-Signal_{Ave_PC})×100.

计算化合物的IC₅₀和Plot效应剂量曲线：

使用GraphPad 6.0，通过将％Inhibition和化合物浓度的对数拟合为非线性回归(剂量响应-可变斜率)来计算IC₅₀值。

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*HillSlope))

X：log of inhibitor concentration；Y：％Inhibition

4试验结果

计算％Inhibition后，以受试化合物浓度的对数为横坐标，酶抑制率平均值为纵坐标绘制剂量效应曲线，拟合出IC₅₀值，结果显示：

如附图8，表8所示，在发生Y1230H、D1228N耐药突变的EBC-1、Hs746T细胞中，tepotinib 的抗肿瘤活性显著降低，而D10、D15的抗细胞增殖活性均优于tepotinib，其中D15的效果最优，其活性比tepotinib高约10倍，凸显出本发明化合物在克服小分子抑制剂耐药方面的优势。其次，在EBC-1^Vector，Hs746T^Vector；EBC-1-，Hs746T-c-MET^Y1230H和EBC-1-，Hs746T-c-MET^D1228N细胞中，D10、D15的抗细胞增殖活性均优于已上市的I型c-MET抑制剂克唑替尼(Crizotonib)。

表8.D10、D15在EBC-1、Hs746T耐药细胞系的抗增殖活性试验结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

附图说明

本申请中包括的附图是说明书的一个构成部分，附图与说明书和权利要求一起用于说明本发明的实质内容，用于更好的理解本发明。

图1为化合物对细胞中c-MET蛋白降解72小时的Western Blot测定图；

图2为化合物对细胞中c-MET的降解和p-c-MET抑制时间依赖Western Blot测定图；

图3为D10和D15化合物抗肿瘤细胞转移的细胞划痕试验图；

图4为化合物D10、D15对肿瘤细胞侵袭的抑制作用测定图；

图5为化合物D10、D15对肿瘤细胞凋亡的诱导作用测定图；

图6为化合物D10、D15对肿瘤细胞周期的阻滞作用测定结果图；

图7化合物D10、D15口服给药对裸鼠异种移植瘤的生长抑制及免疫组化图

图8化合物D10和D15对EBC-1、Hs746T耐药细胞株的增殖抑制作用。

Claims (9)

1.一种结构式如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，

M—L—E

式I

其中：M为式II所示结构：

L为式III所示以下任意结构之一：

其中，各个n独立地为1-20之间的任意一个整数，

E为式IV所示的结构：

2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：

3.权利要求1或2所述的如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防肿瘤疾病的药物中的应用。

4.权利要求1或2所述的如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐与其他药物联合在制备用于治疗或预防肿瘤疾病的药物中的应用，其中所述其他药物选自：依鲁替尼、环磷酰胺、多柔吡星、阿糖胞苷、Azacitidine、Decitabine、卡非佐米、沙利度胺、来那度胺、泊马渡胺、吉非替尼、奥希替尼、厄洛替尼、特泊替尼、奥司他丁、阿法替尼、氟他胺和尼鲁米特。

5.权利要求3或4所述的应用，其中所述肿瘤疾病为胃癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、大肠癌、肾癌、骨肉瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤中的一种或几种。

6.药物组合物，包括权利要求1或2所述的如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

7.权利要求6所述的药物组合物，其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂选自：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，缓冲物质，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡和羊毛脂。

8.权利要求7所述的药物组合物，其中所述血清蛋白为人血白蛋白，所述缓冲物质为磷酸盐，所述盐或电解质为硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态氧化硅或三硅酸镁。

9.权利要求6～8任一项所述的药物组合物，其以适宜的途径进行给药，其中所述的适宜的途径为口服、舌下、直肠、胃肠外、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、动脉注射、肺、鼻、舌、颊、皮肤、粘膜、结膜、局部给药或以植入物的形式给药。