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CN116808279A - 一种亲水性复合胶原蛋白海绵及其制备方法 - Google Patents

一种亲水性复合胶原蛋白海绵及其制备方法 Download PDF

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CN116808279A CN202311078313.4A CN202311078313A CN116808279A CN 116808279 A CN116808279 A CN 116808279A CN 202311078313 A CN202311078313 A CN 202311078313A CN 116808279 A CN116808279 A CN 116808279A
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Abstract

本发明涉及一种亲水性复合胶原蛋白海绵及其制备方法，具体包括：首先获得胶原蛋白原液A；胶原蛋白原液A经改性得水溶性胶原蛋白原液B；水溶性胶原蛋白原液B拉丝预处理后再冷冻干燥得到亲水性胶原蛋白拉丝基膜D；将胶原蛋白原液A均匀平铺至胶原蛋白拉丝基膜D上，拉丝预处理后冷冻干燥得到胶原蛋白拉丝海绵E；将壳聚糖溶液C均匀平铺至胶原蛋白拉丝海绵E上，冷冻干燥后得到亲水性复合胶原蛋白海绵。该胶原蛋白海绵具有两个特征接触面，改性胶原接触面亲水性更好，壳聚糖接触面具有杀菌抑菌效果，中间的胶原蛋白海绵层具备三螺旋结构特征、生物活性稳定，抗拉性能优良，不易破碎，临床应用效果良好。

Description

一种亲水性复合胶原蛋白海绵及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体地，本发明涉及一种亲水性复合胶原蛋白海绵及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白广泛存在生物体的皮肤、肌腱、骨骼等部位，对于人体而言，胶原蛋白占人体体重的6%，是人体中含量最为丰富的蛋白，占人体蛋白含量的25%-30%，在人体中起到保护、支撑等作用，胶原蛋白有其独特的三螺旋结构，具有优良的生物相容性，主要用于医用材料、化妆品、食品工业等领域。
胶原蛋白在医疗器械领域中主要用于创面止血、皮下组织填充等，用于术中止血的胶原蛋白主要产品形式为海绵状，胶原蛋白海绵有良好的吸血止血性能，促进组织的修复愈合。胶原蛋白海绵在发挥良好的止血性能的同时，还可有效促进伤口的愈合，因而在临床止血方面有着良好的应用前景。
胶原蛋白分子中含有大量的羟基、羧基、氨基等活性基团，因此对胶原蛋白上的这些活性基团进行改性处理，增加胶原蛋白的亲水性和抗血栓性能成为目前研究的热点。通过在胶原侧链上引入亲水改性基团，可使胶原蛋白更具吸水性，同时胶原蛋白表面负电荷大幅度增加可降低血小板的粘附，呈现出一定的抗血栓性能。
现有技术中的胶原蛋白海绵大多是将胶原蛋白和壳聚糖进行复合制备，其制备工艺一般呈现复杂化的趋势，相关的海绵性能也存在改进提升的空间。
如CN107233613B公开了一种水生生物源高纯度高活性医用胶原蛋白，解决了天然胶原蛋白敷料的机械强度差、抗降解能力弱、伤口易受微生物感染的问题。采用酸提法结合胃蛋白酶去除端肽的方法提取胶原蛋白，通过超高压处理和组织捣碎的方法提高提取率，并通过脱细胞、除杂蛋白、脱脂、多次盐析、透析、除菌、脱色和除热源等一系列操作纯化，制备高纯度高活性医用胶原蛋白。通过真空冷冻干燥工艺制得孔隙均匀的网络状胶原蛋白海绵，再经物理交联和化学交联的方式对胶原蛋白海绵进行改性制备内层，然后与壳聚糖外层膜和医用无纺布基布层进行复合，最后经Co-60灭菌后得到复合多层医用敷料成品。
如CN105327383A涉及一种止血用生物材料-胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵及制备方法。该止血海绵由胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚糖按一定的配比溶解后，采用冷冻干燥法制备而成。该复合止血海绵与创面接触后，能够使血小板迅速聚集，形成血痂，其良好的吸液性使其吸收大量渗出液对伤口产生一定的压力，进而起到一定的按压止血作用，并且其中大量的Ca2+在其与创面接触后能迅速与血液里的Na+发生交换，从而促进凝血酶的产生，加快创面自身凝血。
如US20180169293A1涉及一种由牛胶原蛋白生产的水解胶原蛋白面团，以及由牛皮生产胶原蛋白面团的方法。胶原面团包含水、牛胶原、苯甲酸钠和盐酸。为了生产胶原蛋白面团，将皮层与牛皮分离并进行处理。胶原蛋白生面团可用于生物医学应用中，例如细胞技术/组织工程，缝合材料或用于皮肤移植的薄膜和海绵。胶原面团可以进一步包含壳聚糖。
基于此，亟待需要一种亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，制备工艺相对简单，同时产品性能优异，亲水性更好、抗拉强度高、抗菌抑菌性能优良。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的亲水性复合胶原蛋白海绵制备工艺，在工业化生产上实现操作简单，同时生产出抗拉性、亲水性、止血性、抗菌性良好的胶原蛋白海绵。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其包括如下步骤：
S1：动物组织经预处理、病毒灭活处理、酸酶提取胶原、盐析纯化后获得胶原蛋白原液A；
S2：所述胶原蛋白原液A经亲水接枝改性、改性胶原析出、清洗、复溶得水溶性胶原蛋白原液B；
S3：壳聚糖配制后得到壳聚糖溶液C；
S4：所述水溶性胶原蛋白原液B均匀平铺在冻干机模具中，进行拉丝预处理后再冷冻干燥，制备得到亲水性胶原蛋白拉丝基膜D；
S5：将所述胶原蛋白原液A均匀平铺至所述亲水性胶原蛋白拉丝基膜D上，进行拉丝预处理后冷冻干燥得到胶原蛋白拉丝海绵E；
S6：将所述壳聚糖溶液C均匀平铺至所述胶原蛋白拉丝海绵E上，进行冷冻干燥后得到所述亲水性复合胶原蛋白海绵。
作为本发明进一步的改进，所述S1中所述动物组织为牛跟腱，所述S1中所述预处理的方式包括去除表层油脂后切片处理。
作为本发明进一步的改进，所述S1中所述病毒灭活处理的方式为用0.5-1M的氢氧化钠浸泡所述预处理后的物料0.5-2h，用纯化水多次清洗；所述S1中所述酸酶提取胶原具体为按照动物组织：胃蛋白酶质量比为（10-30）:1进行酸酶提取；所述S1中所述盐析纯化的方法为氯化钠透析，氯化钠的加入浓度为40-50 g/L，透析的时间为12-36h。
作为本发明进一步的改进，所述S2中所述亲水接枝改性的工艺采用的改性剂为丁二酸酐，溶剂为二甲基亚砜。
作为本发明进一步的改进，所述S2中所述改性胶原析出的等电点为pH=4.1~4.9，所述S2中所述水溶性胶原蛋白原液B的浓度为5-20mg/mL。
作为本发明进一步的改进，所述S3中所述壳聚糖溶液C的浓度为1-10mg/mL。
作为本发明进一步的改进，所述S4中所述水溶性胶原蛋白原液B平铺至所述冻干机模具中的厚度为1-5mm，所述S4中所述拉丝预处理为：利用冻干机的负压真空对所述水溶性胶原蛋白原液B进行负压、常压反复拉丝处理，具体参数为：所述负压的真空度为-60至-100Pa；所述负压的保持时间为20-50min，所述常压的保持时间为20-50min，所述负压和所述常压的反复次数为1-5次；所述拉丝预处理工艺的核心就是负压抽真空后，瞬间变成常压，所述水溶性胶原蛋白原液B的表面就会出现拉丝；
所述S4中所述冷冻干燥包括预冻，升华干燥和解析干燥，具体的工艺参数如下：
所述预冻的温度为-35℃~-45℃，所述的降温速率为1~2℃/min，所述预冻的时间为0.5-2h；所述升华干燥的温度为-10~-25℃，所述升华干燥的阶段时长为5-10h；所述升华干燥中的负压真空度为-25~-45Pa；所述解析干燥的温度为30~40℃，所述解析干燥的时长为1-3h；所述冷冻干燥的总时间为7-18h。
作为本发明进一步的改进，所述S5中所述胶原蛋白原液A平铺至所述亲水性胶原蛋白拉丝基膜D上的厚度为5-10mm；所述S5中所述拉丝预处理为：利用冻干机的负压真空对所述胶原蛋白原液A进行负压、常压反复拉丝处理，具体参数为：所述负压的真空度为-70至-100Pa；所述负压的保持时间为30-120min，所述常压的保持时间20-50min，所述负压和所述常压的反复次数为1-5次；所述拉丝预处理工艺的核心就是负压抽真空后，瞬间变成常压，所述胶原蛋白原液A的表面就会出现拉丝；
所述S5中所述冷冻干燥包括预冻，升华干燥和解析干燥，具体的工艺参数如下：
所述预冻的温度为-35℃~-45℃，所述预冻的降温速率为1~2℃/min，所述预冻的时间为2-4h；所述S5中所述升华干燥的温度为-10~-25℃，所述升华干燥的阶段时长为10-20h；所述升华干燥中的负压真空度为-25~-45 Pa；所述解析干燥的温度为30~40℃，所述解析干燥的时长为1-5h；所述冷冻干燥的总时间为36-72h；
所述S5中所述胶原蛋白原液A的浓度为10-25mg/mL。
作为本发明进一步的改进，所述S6中所述壳聚糖溶液C平铺至所述胶原蛋白拉丝海绵E上的厚度为1-5mm；
所述S6中所述冷冻干燥包括预冻，升华干燥和解析干燥，具体的工艺参数如下：
所述S6中所述预冻的温度为-35℃~-45℃，所述预冻的降温速率为1~2℃/min，所述预冻的时间为0.5-2h；所述S6中所述升华干燥的温度为-10~-25℃，所述升华干燥的阶段时长为5-10h；所述升华干燥中的负压真空度为-25~-45Pa；所述解析干燥的温度为30~40℃，所述解析干燥的时长为0.5-2h；所述冷冻干燥的总时间为6-18h。
本发明提供一种上述所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法所制备得到亲水性复合胶原蛋白海绵。
本发明提供了一种亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，通过研究胶原原液B的改性工艺、胶原原液A的浓度摸索、胶原蛋白原液和壳聚糖溶液冻干参数的摸索、冻干厚度等方面的探索；同时发明人在研究的过程中意外发现，调整冻干机的真空度参数和抽真空次数，可以制备出表面拉丝、具有一定粗糙度的胶原蛋白水溶性基膜，所述基膜与胶原蛋白原液混合后，经冷冻干燥后制得的海绵，基膜与海绵之间结合能力较强，使复合胶原蛋白海绵物理性能更优，避免临床使用过程中出现碎屑掉渣等不良事件。同时复合了壳聚糖表层，增加海绵的抗菌抑菌能力。本发明可制备出亲水性更好、抗拉强度高、抗菌抑菌性能优良的复合胶原蛋白海绵。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明所提供的制备方法制成的亲水性复合胶原蛋白海绵，其亲水性更强，临床使用上止血效果优异。
本发明通过对胶原蛋白提取、改性工艺探索，建立亲水性胶原蛋白海绵的新型制备工艺，制备出的亲水性复合胶原蛋白海绵亲水性更优。
本发明工艺利用冻干机对亲水性胶原蛋白原液进行负压真空拉丝处理，未使用任何粘合剂，利用物质本身的特性，增加基膜与海绵的附着力，制备出的复合胶原蛋白海绵抗拉性能强，避免临床使用过程中出现碎屑掉渣等不良事件发生。
本发明工艺中添加了壳聚糖膜层，增加胶原蛋白海绵的抗菌抑菌能力，临床使用上更具优势。
附图说明
图1 为实施例1的具体的工艺流程图；
图2 为实施例1所得亲水性复合胶原蛋白海绵的照片；
图3 为实施例1所得亲水性胶原蛋白拉丝基膜D照片；
图4 为实施例1所得胶原蛋白拉丝海绵E照片；
图5 为实施例1所得亲水性复合胶原蛋白海绵的红外光谱图；
图6 为实施例1所得亲水性复合胶原蛋白海绵的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
如无特别说明，本实施方式部分所使用的设备为常规设备，所用的试剂均为常规试剂，均可以商购取得，所用的操作方法均记载在本领域教科书籍中。
实施例1 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
亲水性复合胶原蛋白海绵的制备工艺流程图如图1所示，具体工艺为：
S1：动物组织经预处理、病毒灭活处理、酸酶提取胶原、盐析纯化后获得胶原蛋白原液A；
牛跟腱预处理：动物来源组织牛跟腱经清洗后，去除表层油脂后进行切片处理。
病毒灭活处理：切片后的组织浸泡在0.5M的氢氧化钠溶液中，2h后用纯化水反复冲洗组织切片，将切片继续切碎至糜状。
酸酶法提取胶原蛋白：将糜状组织称重后放入反应釜中，再加入胃蛋白酶（加入量为组织重量的1/20）和乙酸（加入量为组织重量的2.5%），以160rpm的转速反应48h后获得胶原蛋白粗溶液；
盐析、透析纯化：向胶原蛋白粗溶液中加入氯化钠溶液，使其在胶液中的终浓度为42g/L，此时胶原蛋白以絮状物形式析出，离心弃上清液；絮状物中加入0.3%的乙酸水溶液使胶原蛋白溶解后，装入透析袋中，密封后放入纯化水中，透析24h；得纯化后胶原蛋白原液A，测定胶原蛋白原液A浓度为20 mg/mL，纯度为96.5%；
S2：胶原蛋白原液A经亲水接枝改性、改性胶原析出、清洗、复溶得水溶性胶原蛋白原液B；
亲水改性：取适量胶原蛋白原液A，用0.3%的乙酸稀释成浓度为10mg/mL的胶原蛋白溶液，调整pH至12，加入改性剂丁二酸酐，丁二酸酐的质量与胶原蛋白的质量比为1:1，搅拌3h后获得改性后胶原蛋白粗溶液；
改性胶原析出：将改性后胶原蛋白粗溶液中加入5M的氢氧化钠溶液，使其pH值为4.5，析出水溶性胶原蛋白固状物；
清洗、复溶：用5%的氯化钠溶液反复清洗水溶性胶原蛋白固状物3次，离心弃上清后用0.3%的乙酸溶解，即得水溶性胶原蛋白原液B。测得水溶性胶原蛋白原液B浓度为10mg/mL，纯度为97.6%。
S3：配置壳聚糖溶液C；
壳聚糖溶液C：壳聚糖溶液C中壳聚糖的浓度为5mg/mL。
S4：水溶性胶原蛋白原液B均匀平铺在冻干机模具中，进行拉丝预处理后再冷冻干燥，制备得到亲水性胶原蛋白拉丝基膜D；
亲水性胶原蛋白拉丝基膜D：将上述浓度为10mg/mL的水溶性胶原蛋白原液B放入冻干机模具中，铺平厚度为3mm；利用冻干机的负压真空对水溶性胶原蛋白原液B进行负压、常压反复拉丝处理，具体参数为：负压真空度为-80Pa；负压保持时间为30min，常压保持时间为30min，负压、常压反复次数为3次。拉丝预处理工艺的核心就是负压抽真空后，瞬间变成常压，水溶性胶原蛋白原液B表面就会出现拉丝。
预冻温度为-40℃，预冻的降温速率为1℃/min，冷冻时间为1h；升华干燥温度为-20℃，升华干燥阶段时长为8h；升华干燥时负压真空度为-40Pa；解析干燥温度为35℃，解析干燥时长为1h；冷冻干燥总时间为12h，即得亲水性胶原拉丝基膜D，制得的亲水性胶原蛋白拉丝基膜D的照片见图3。
S5：将胶原蛋白原液A均匀平铺至亲水性胶原蛋白拉丝基膜D上，进行拉丝预处理后冷冻干燥得到胶原蛋白拉丝海绵E，制得的胶原蛋白拉丝海绵E的照片见图4；
胶原蛋白拉丝海绵E：将上述浓度为20mg/mL的胶原蛋白原液A喷洒至上述亲水性胶原蛋白拉丝基膜D上，胶原蛋白原液A厚度为8mm；冻干拉丝进行负压、常压反复拉丝处理，具体参数为：负压真空度为-80Pa，负压保持时间为60min，常压保持时间为30min，反复处理3次；
预冻温度为-40℃，预冻的降温速率为1℃/min，预冻时间为3h；升华干燥温度为-20℃，升华干燥阶段时长为16h；升华干燥时负压真空度为-40 Pa；解析干燥温度为35℃，解析干燥时长为3h；冷冻干燥总时间为48h，即得胶原蛋白拉丝海绵E。
S6：将壳聚糖溶液C均匀平铺至胶原蛋白拉丝海绵E上，进行冷冻干燥后得到亲水性复合胶原蛋白海绵。
亲水性复合胶原蛋白海绵：上述壳聚糖溶液C均匀喷洒至胶原蛋白拉丝海绵E上，冷冻干燥参数为：
预冻温度为-45℃，预冻的降温速率为2℃/min，预冻时间为1h；升华干燥温度为-20℃，升华干燥阶段时长为8h；升华干燥时负压真空度为-45Pa；解析干燥温度为30℃，解析干燥时长为1h；冷冻干燥总时间为12h，即得亲水性复合胶原蛋白海绵，制得的亲水性复合胶原蛋白海绵的照片见图2。
实施例2 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于壳聚糖溶液C的溶液浓度为1mg/mL。
实施例3 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于壳聚糖溶液C的溶液浓度为3mg/mL。
实施例4 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于壳聚糖溶液C的溶液浓度为8mg/mL。
实施例5 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于壳聚糖溶液C的溶液浓度为10mg/mL。
实施例6 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S2中改性后胶原析出等电点为pH=4.1。
实施例7 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S2中改性后胶原析出等电点为pH=4.3。
实施例8 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S2中改性后胶原析出等电点为pH=4.7。
实施例9 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S2中改性后胶原析出等电点为pH=4.9。
实施例10 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，水溶性胶原蛋白原液B浓度5mg/mL；
实施例11 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，水溶性胶原蛋白原液B浓度8mg/mL；
实施例12 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，水溶性胶原蛋白原液B浓度20mg/mL；
实施例13 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，平铺厚度1mm；
实施例14 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，平铺厚度4mm；
实施例15 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，平铺厚度5mm；
实施例16 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，拉丝工艺负压真空度为-60Pa；
实施例17 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，拉丝工艺负压真空度为-90Pa；
实施例18 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，拉丝工艺负压真空度为-100Pa；
实施例19 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，负压保持时间为20min；
实施例20 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，负压保持时间为40min；
实施例21 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，负压保持时间为50min；
实施例22 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，常压保持时间为20min；
实施例23 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，常压保持时间为40min；
实施例24 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，常压保持时间为50min；
实施例25 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，处理次数1次；
实施例26 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，处理次数5次；
实施例27 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，胶原蛋白原液A浓度10mg/mL；
实施例28 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，胶原蛋白原液A浓度15mg/mL；
实施例29 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，胶原蛋白原液A浓度25mg/mL；
实施例30 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，平铺厚度7mm；
实施例31 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，平铺厚度9mm；
实施例32 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，平铺厚度10mm；
实施例33 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，拉丝工艺负压真空度为-70Pa；
实施例34 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，拉丝工艺负压真空度为-90Pa；
实施例35 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，拉丝工艺负压真空度为-100Pa；
实施例36 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，负压保持时间为30min；
实施例37 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，负压保持时间为90min；
实施例38 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，负压保持时间为120min；
实施例39 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，常压保持时间为20min；
实施例40 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，常压保持时间为40min；
实施例41 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，常压保持时间为50min；
实施例42 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，处理次数1次；
实施例43 亲水性复合胶原蛋白海绵的制备
与实施例1相比，区别仅在于S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，反复处理次数5次；
对比例1
对比例1所述试验与实施例1所述试验条件一致，区别在于对比例1不含步骤S5胶原蛋白拉丝海绵E的制备，直接将壳聚糖溶液C均匀喷洒在亲水性胶原拉丝基膜D上。
对比例2
对比例2所述试验与实施例1所述试验条件一致，区别在于对比例2不含步骤S6。
对比例3:
对比例3所述试验与对比文件1所述试验条件一致，区别在于对比例3不含步骤S2，即基膜D的原料也为胶原蛋白原液A。
对比例4
与实施例1相比，S4中的拉丝冻干参数不同，具体在于，没有拉丝工艺，直接预冻；
对比例5
与实施例1相比，S5中的拉丝冻干参数不同，具体在于，没有拉丝工艺，直接预冻；
测试1 亲水性复合胶原蛋白海绵成品外观观察
通过对实施例和对比例的过程和产品进行观察，具体结果参见表1。
测试2 亲水性复合胶原蛋白海绵成品的吸液性能测试
对实施例和对比例得到的胶原蛋白海绵进行吸液性能测试，测试方法如下：
取胶原蛋白海绵大小为2cm的正方形，测量其重量，记为m1，放入水中，用手指轻柔至完全浸湿，轻持镊子在水面排水1min，称重记为m2，吸水性能=（m2-m1）/m1，同样的方法测试10次，取其平均值即为吸水性能。具体结果参见表1。
试验3 胶原蛋白海绵抗拉性能测试
对实施例和对比例得到的胶原蛋白海绵进行抗拉性能测试，将海绵制成1cm宽、10cm长的条形，用夹具夹住两端，对其施加拉力直至断裂，记录断裂时的拉力值。检测结果参见表1：
表1 实施例和对比例所得胶原蛋白海绵性能测试数据
试验4 胶原蛋白海绵成品的止血性能测试
对实施例和对比例得到的亲水性复合胶原蛋白海绵进行止血性能测试，测试方法如下：
采用小型猪作为动物模型；实验动物备皮后暴露股动脉/颈静脉做长度为1cm的切口，缝合后使其自由出血2s，即完成模型建立。然后将胶原蛋白海绵覆盖出血点，记录止血时间和出血量；
由于本试验例采用动物模型评价胶原蛋白海绵的止血性能，出于对试验动物的保护原则考虑，本发明选取与产品止血性能相关的实施例和对比例所得的试验样品进行止血试验考察，具体数据如下表2所述：
表2 胶原蛋白海绵止血性能测试数据
试验5 亲水性复合胶原蛋白海绵的质量评价
本发明所述制备工艺制得亲水性复合胶原蛋白海绵的工艺过程中所述胶原原液A和B均为Ⅰ型胶原蛋白，为表征所述发明工艺制成产品的特征，本试验例列出的胶原蛋白海绵的质量评价项目包括红外光谱鉴别、SDS-PAGE凝胶电泳鉴别、Ⅰ型胶原蛋白纯度检测。
红外光谱鉴别检测方法参考《中国药典》四部中0402红外分光光度法，取实施例1制备所得胶原蛋白海绵样品加入到溴化钾粉末中研磨压片，用溴化钾片进行背景扫描后待测样品上机检测，检测到红外图谱如说明书附图图5所示，待测样本胶原蛋白海绵具备以下红外光谱特征峰：3488-3188cm-1、3102-3062cm-1、2985-2915cm-1、1667-1627 cm-1、1548 cm-1、1452 cm-1、1402 cm-1、1338 cm-1、1238 cm-1；符合I型胶原蛋白红外图谱特征。
SDS-PAGE凝胶电泳鉴别检测方法参考《中国药典》四部中0541电泳法第四法规定的方法进行，用SDS-PAGE电泳法，分离胶浓度为7%，加样量不低于20μg，取实施例海绵作为供试品，供试品及对照品（标注参照物）经SDS-PAGE分析后得出电泳条带，结果见图6。
图6为实施例1进行两次平行试验条件得到的电泳条带，图中可明显看到α1和α2条带，为典型的Ⅰ型胶原蛋白图谱特征，表明本发明工艺过程中所得胶原蛋白为具有生物活性的三螺旋结构的Ⅰ型胶原蛋白。
Ⅰ型胶原蛋白纯度检测纯度检测方法参考GB/T 1453-2016 组织工程医疗器械产品Ⅰ型胶原蛋白表征方法附录A中方法，本发明使用SDS-PAGE检测Ⅰ型胶原蛋白的纯度，检测原理为胶原蛋白中特有的三螺旋结构经特异性的胶原蛋白酶作用后，通过考马斯亮蓝对牛血清蛋白（BSA）染色极限的确定，检测胶原蛋白样品中所含杂蛋白总量。
具体检测步骤如下：所需试剂配制完成后进行电泳上样，分别在加样孔中加入供试品、MaKer，110V恒压电泳至条带分离完成，加入考马斯亮蓝试剂进行染色，染色1h后进行脱色处理，将脱色完成的SDS-PAGE凝胶放置显影系统白板上，按“VISIBLE”程序，自动曝光的设置拍摄，得到条带清洗的胶片，用Image J软件计算供试品泳道上（大于50kDa）区域的光密度，计算出胶原蛋白纯度，结果见下表：
表3 Ⅰ型胶原蛋白纯度检测结果统计
由表中数据可以看出，本发明实施例1所得胶原蛋白原液A和B的纯度均在95%以上，可满足临床需求。
4.Ⅰ型胶原蛋白含量检测
含量检测方法参考《中国药典》四部中0731蛋白质含量测定方法第三法双缩脲法，检测原理：依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
具体检测步骤如下：精密称取实施例样品约0.5g于10mL试管中，加水至1mL溶解。配制BSA标准曲线，在540nm出检测样品和标准曲线的吸光度，将样品所得吸光度带入标准曲线，计算胶原蛋白含量，结果如下表4所示：
表4 Ⅰ型胶原蛋白含量检测结果统计
本试验例所述红外光谱鉴别、SDS-PAGE凝胶电泳鉴别、Ⅰ型胶原蛋白纯度检测、含量检测的质量研究，为本发明的重要原材料胶原蛋白A液和胶原蛋白B液的过程检测控制，旨在保证工艺过程中所得胶原蛋白具有三螺旋的活性结构及纯度符合产品质量要求。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域技术人员依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：动物组织经预处理、病毒灭活处理、酸酶提取胶原、盐析纯化后获得胶原蛋白原液A；
S2：所述胶原蛋白原液A经亲水接枝改性、改性胶原析出、清洗、复溶得水溶性胶原蛋白原液B；
S3：壳聚糖配制后得到壳聚糖溶液C；
S4：所述水溶性胶原蛋白原液B均匀平铺在冻干机模具中，进行拉丝预处理后再冷冻干燥，制备得到亲水性胶原蛋白拉丝基膜D；
S5：将所述胶原蛋白原液A均匀平铺至所述亲水性胶原蛋白拉丝基膜D上，进行拉丝预处理后冷冻干燥得到胶原蛋白拉丝海绵E；
S6：将所述壳聚糖溶液C均匀平铺至所述胶原蛋白拉丝海绵E上，进行冷冻干燥后得到所述亲水性复合胶原蛋白海绵。
2.如权利要求1所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S1中所述动物组织为牛跟腱，所述S1中所述预处理的方式包括去除表层油脂后切片处理。
3. 如权利要求1或2所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S1中所述病毒灭活处理的方式为用0.5-1M的氢氧化钠浸泡所述预处理后的物料0.5-2h，用纯化水多次清洗；所述S1中所述酸酶提取胶原具体为按照动物组织：胃蛋白酶质量比为（10-30）:1进行酸酶提取；所述S1中所述盐析纯化的方法为氯化钠透析，氯化钠的加入浓度为40-50 g/L，透析的时间为12-36h。
4.如权利要求1所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S2中所述亲水接枝改性的工艺采用的改性剂为丁二酸酐，溶剂为二甲基亚砜。
5.如权利要求1或4所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S2中所述改性胶原析出的等电点为pH=4.1~4.9，所述S2中所述水溶性胶原蛋白原液B的浓度为5-20mg/mL。
6.如权利要求1所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S3中所述壳聚糖溶液C的浓度为1-10mg/mL。
7.如权利要求1所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S4中所述水溶性胶原蛋白原液B平铺至所述冻干机模具中的厚度为1-5mm，所述S4中所述拉丝预处理为：利用冻干机的负压真空对所述水溶性胶原蛋白原液B进行负压、常压反复拉丝处理，具体参数为：所述负压的真空度为-60至-100Pa；所述负压的保持时间为20-50min，所述常压的保持时间为20-50min，所述负压和所述常压的反复次数为1-5次；所述拉丝预处理工艺的核心就是负压抽真空后，瞬间变成常压，所述水溶性胶原蛋白原液B的表面就会出现拉丝；
所述S4中所述冷冻干燥包括预冻，升华干燥和解析干燥，具体的工艺参数如下：
所述预冻的温度为-35℃~-45℃，所述预冻的降温速率为1~2℃/min，所述预冻的时间为0.5-2h；所述升华干燥的温度为-10~-25℃，所述升华干燥的阶段时长为5-10h；所述升华干燥中的负压真空度为-25~-45Pa；所述解析干燥的温度为30~40℃，所述解析干燥的时长为1-3h；所述冷冻干燥的总时间为7-18h。
8.如权利要求1所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S5中所述胶原蛋白原液A平铺至所述亲水性胶原蛋白拉丝基膜D上的厚度为5-10mm；所述S5中所述拉丝预处理为：利用冻干机的负压真空对所述胶原蛋白原液A进行负压、常压反复拉丝处理，具体参数为：所述负压的真空度为-70至-100Pa；所述负压的保持时间为30-120min，所述常压的保持时间20-50min，所述负压和所述常压的反复次数为1-5次；所述拉丝预处理的核心就是负压抽真空后，瞬间变成常压，所述胶原蛋白原液A的表面就会出现拉丝；
所述S5中所述冷冻干燥包括预冻，升华干燥和解析干燥，具体的工艺参数如下：
所述预冻的温度为-35℃~-45℃，所述预冻的降温速率为1~2℃/min，所述预冻的时间为2-4h；所述S5中所述升华干燥的温度为-10~-25℃，所述升华干燥的阶段时长为10-20h；所述升华干燥中的负压真空度为-25~-45 Pa；所述解析干燥的温度为30~40℃，所述解析干燥的时长为1-5h；所述冷冻干燥的总时间为36-72h；
所述S5中所述胶原蛋白原液A的浓度为10-25mg/mL。
9.如权利要求1所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，所述S6中所述壳聚糖溶液C平铺至所述胶原蛋白拉丝海绵E上的厚度为1-5mm；
所述S6中所述冷冻干燥包括预冻，升华干燥和解析干燥，具体的工艺参数如下：
所述S6中所述预冻的温度为-35℃~-45℃，所述预冻的降温速率为1~2℃/min，所述预冻的时间为0.5-2h；所述S6中所述升华干燥的温度为-10~-25℃，所述升华干燥的阶段时长为5-10h；所述升华干燥中的负压真空度为-25~-45Pa；所述解析干燥的温度为30~40℃，所述解析干燥的时长为0.5-2h；所述冷冻干燥的总时间为6-18h。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的亲水性复合胶原蛋白海绵的制备方法所制备得到亲水性复合胶原蛋白海绵。
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