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CN116916961A - 溶致液晶相颗粒 - Google Patents

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CN116916961A
CN116916961A CN202180087540.6A CN202180087540A CN116916961A CN 116916961 A CN116916961 A CN 116916961A CN 202180087540 A CN202180087540 A CN 202180087540A CN 116916961 A CN116916961 A CN 116916961A
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CN
China
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lyotropic liquid
liquid crystal
particles
crystal phase
phase particles
Prior art date
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Pending
Application number
CN202180087540.6A
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English (en)
Inventor
C·德拉蒙德
B·P·戴特
C·康恩
H·于
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RMIT University
Original Assignee
RMIT University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本公开提供了可用于递送活性剂以治疗革兰氏阴性细菌和/或真菌感染的非层状溶致液晶相颗粒。所述非层状溶致液晶相颗粒被证明在通过与所述革兰氏阴性细菌外膜或真菌外层的融合事件来递送所述活性剂方面提供益处。

Description

溶致液晶相颗粒
技术领域
本发明涉及疾病的医疗和诊断领域。更具体地，本发明涉及非层状溶致液晶相颗粒及其用途，非层状溶致液晶相颗粒是活性剂的载体颗粒。
背景技术
本文中对背景技术的任何引用不应被解释为承认此类技术构成澳大利亚或其它地方的公知常识。
抗生素抗性细菌的日益流行已被确定为人类健康的关键风险之一。该抗性主要由抗生素的过度使用引发的抗性遗传突变造成的。预计未来将增加来自抗性细菌的财政和健康并发症。尽管目前正在广泛研究抗微生物治疗的新方法，但新抗生素的开发仍然缓慢。革兰氏阴性细菌的外质膜提供了额外的渗透屏障，使其对常规的小分子抗生素特别有弹性，革兰氏阴性细菌包括著名的物种如大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。已经报道了对作为最后手段的抗生素具有抗性的革兰氏阴性细菌。为此，世界卫生组织已优先考虑对革兰氏阴性细菌的新治疗方法的特别迫切需要。
由于新抗生素的发现率仍然很低，开发补充现有治疗方法的技术可能被证明是至关重要的。递送技术和载体控制的内化可能为有效打击细菌提供更有效的治疗。特别地，纳米材料既可作为单一或多种治疗化合物的载体，又可能破坏细菌膜屏障，放大抗微生物剂结果。然而，对纳米材料载体与细菌之间的相互作用仍然缺乏理解。1
与通常通过胞吞途径内化纳米材料的哺乳动物细胞相反，2,3细菌依赖于它们细胞壁的渗透性来运输材料。细胞壁的固有复杂性是造成开发有效抗生素困难的主要原因，因此适于哺乳动物细胞的载体也很少适于递送至细菌细胞。溶致液晶中间相载体，例如立方相脂质纳米载体(立方晶(cubosome))在通过胞吞以外的方式将治疗剂递送至哺乳动物细胞系方面显示出一些前景4,5,6,7。在现有文献中，仍未解决任何包封活性剂的递送机制以及随之而来的可靠性和递送程度。
类似地，抗性真菌感染的流行正在增加，并且威胁当前的健康实践。一旦进入血流，这些感染的致死率约为25％。估计医疗费用为每年30亿美元。抗真菌药物通常表现出高细胞毒性并且水溶性差。类似于细菌，真菌的外部细胞壁材料(例如几丁质)可提供针对抗微生物剂的显著的扩散屏障。
需要提供另外的载体来递送抗微生物剂，包括抗细菌剂和抗真菌剂，以及其它生物活性剂。还需要开发新的溶致液晶相颗粒，作为这些活性物质的载体，用于在其它医疗用途中更有效地治疗微生物感染。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种非层状溶致液晶相颗粒，其包含一种或多种促融合两亲性脂质，并且所述颗粒包封活性剂。
在第二方面，提供了一种药物组合物，其包含第一方面的非层状溶致液晶相颗粒，和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在第三方面，提供了一种用于活性剂的控制释放的方法，其包括以下步骤：形成第一方面的非层状溶致液晶相颗粒；以及将所述非层状溶致液晶相颗粒施用至目标区域。
在第四方面，提供了一种用于形成第一方面的非层状溶致液晶相颗粒的方法，其包括以下步骤：(i)提供一种或多种促融合两亲性脂质；以及(ii)在活性剂存在下，将所述一种或多种促融合两亲性脂质暴露于溶液。
在第五方面，提供了一种用于治疗或预防疾病、病症或病状的方法，该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用治疗有效量的第一方面的非层状溶致液晶相颗粒或第二方面的药物组合物，从而治疗或预防所述疾病、病症或病状。
在第六方面，提供了第一方面的非层状溶致液晶相颗粒或第二方面的药物组合物在治疗或预防疾病、病症或病状中的用途。
在第七方面，提供了第一方面的非层状溶致液晶相颗粒在制备用于治疗疾病、病症或病状的药物中的用途。
在第八方面，提供了一种用于将活性剂递送至生物靶标的方法，其包括以下步骤：施用第一方面的非层状溶致液晶相颗粒。
在第九方面，提供了一种用于诊断哺乳动物的疾病、病症或病状的方法，其包括以下步骤：向哺乳动物或从哺乳动物获得的生物样品施用第一方面的非层状溶致液晶相颗粒或第二方面的组合物，从而促进哺乳动物的疾病、病症或病状的诊断，其中第一方面的非层状溶致液晶相颗粒内的活性剂是标记的活性剂。
在以上各部分中提到的本发明的各种特征和实施例适当地适用于其它部分，并作必要的修改。因此，在一个部分中指定的特征可以适当地与在其它部分中指定的特征组合。
从下面的详细描述中，本发明的其它特征和优点将变得明显。
附图说明
为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将参考附图通过实例来描述优选实施例，其中：
图1是不存在荧光标记的立方晶颗粒的细菌的一系列荧光图像。左和右分别显示在λex＝405nm和λex＝647nm处记录的图像。比例尺＝2μm。
图2a至2f是示出了蜡状芽孢杆菌(B.cereus)对立方晶吸收的一系列图像和图形表示。(a)TIRF快照显示了单个立方晶到蜡状芽孢杆菌表面的原位附着。比例尺＝5μm。(b)附着立方晶的均方位移。(c)快照突出显示了约4小时内MO立方晶到蜡状芽孢杆菌表面的连续附着。(d)24小时内从颗粒到蜡状芽孢杆菌的长期荧光转移。比例尺＝20μm。(e)提取的与蜡状芽孢杆菌表面接触的单个立方晶的荧光强度随时间的变化。数据以插图内的对数标度和-1/2的指示斜率示出。(f)提取的蜡状芽孢杆菌的强度随时间的变化。
图3a至3g是示出了金黄色葡萄球菌对立方晶吸收的一系列图像和图形表示。(a至b)TIRF快照突出显示了MO-DOTAP立方晶到金黄色葡萄球菌(S.aureus)表面的连续附着。比例尺＝2μm。(c)提取的与金黄色葡萄球菌表面接触的单个立方晶的荧光强度随时间的变化。数据以log-log标度显示在插图中，指示斜率-1/3和-1/2分别显示为实线和虚线。(d)金黄色葡萄球菌簇、肽聚糖提取物和用脂磷壁酸处理的肽聚糖提取物的荧光强度随时间的变化。(e)TIRF快照突出显示了MO立方晶到金黄色葡萄球菌肽聚糖提取物表面的连续附着。比例尺＝5μm。(f)不存在立方晶和通过立方晶处理的金黄色葡萄球菌肽聚糖提取物的SEM显微照片。比例尺＝1μm。(g)通过立方晶处理后的固定金黄色葡萄球菌的SEM。比例尺＝300nm。
图3h是一系列TIRF快照，其显示了没有任何立方晶附着到金黄色葡萄球菌肽聚糖和脂磷壁酸提取物的表面。比例尺＝5μm。
图4a至4m是示出了大肠杆菌(Escherichia coli)对立方晶吸收的变化的一系列图像。(a)TIRF快照突出显示了MO立方晶到大肠杆菌表面的连续附着。比例尺＝2μm。(b)MO-DOTAP立方晶到大肠杆菌表面的连续附着和扩散。比例尺＝2μm。(c至d)在λex＝647nm处的快照，突出显示了MO和MO-DOTAP分别在大肠杆菌上的明显的荧光爆发。比例尺＝2μm。(e)两个MO-DOTAP立方晶的快速相互作用的快照。第一帧显示来自λex＝405nm的荧光，随后的四个帧是λex＝647nm。在10秒和20秒处观察到两个立方晶降落。在下面的帧中，不再存在立方晶，然而在细菌周边中显示了强度梯度。(f至m)通过MO-立方晶处理的大肠杆菌的SEM显微照片。比例尺＝400nm。
图5a至5f是示出了大肠杆菌对立方晶吸收的一系列图像和图形表示。(a至b)MO和MO-DOTAP分别在单个大肠杆菌细胞上的峰强度分布。(c)大肠杆菌细胞上的强度。左轴显示总面积强度。右轴显示峰强度。(d)与大肠杆菌接触时单个MO-DOTAP立方晶的峰强度随时间的变化。插图包括在对数标度上重新绘制的数据。陡虚线和浅虚线分别表示-1和-1/6的斜率。(e)单个立方晶在对数标度上的单一代表性图。(f)在(e)中绘制的单个立方晶的相应TIRF快照。比例尺＝2μm。
图6a至6b是示出了快速吸收事件的图形表示。(a)与大肠杆菌接触的单个立方晶随时间的峰强度。箭头标记荧光在整个细菌中快速扩散的时间点。(b)数据以时间(秒)的对数标度绘制。陡虚线和浅虚线分别表示-1和-1/6的斜率。
图7a至7f是一系列图像和图形表示，示出了(a)示出立方晶(亮点)与SLB的融合的TIRF间隔摄影(time lapse)。比例尺＝1.5μm。(b)立方晶吸收到大肠杆菌中表现出两种明显的状态(regime)。插图图像相隔10秒，显示纳米载体(NC)的扩散。(c)吸收到金黄色葡萄球菌中表现出一种明显的状态。(c至d)分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的NC(亮点)附着和内化的TIRF间隔摄影。比例尺＝2μm(e)NC(红色)内化到白色念珠菌(C.albicans)中。
图8示出了含有不同程度的新生霉素(novobiocin)的抗铜绿假单胞菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。x轴上的浓度是溶液中的药物浓度。整个制剂的药物浓度是一致的。增加1％-3％-5％摩尔的Novo反映了每个颗粒增加的药物负载，然而随着浓度增加，存在的颗粒更少。
图9示出了含有不同程度的新生霉素的抗大肠杆菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。x轴上的浓度是溶液中的药物浓度。整个制剂的药物浓度是一致的。增加1％-3％-5％摩尔的Novo反映了每个颗粒增加的药物负载，然而随着浓度增加，存在的颗粒更少。
图10示出了在不同血清环境存在下新生霉素制剂对铜绿假单胞菌的抑制。x轴是蛋白质环境的浓度，而每种制剂的抗生素浓度固定为20μg/ml。在HSA、BSA、和FBS中评估MO-TAP-3Novo。游离抗生素的当量负载分别用黑色正方形、圆形和三角形表示。虚线表示不存在任何血清蛋白时MO-TAP-3Novo的性能。
图11示出了含有不同程度的哌拉西林(piperacillin)的抗铜绿假单胞菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图12示出了含有不同程度的哌拉西林的抗大肠杆菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图13示出了含有不同程度的美罗培南(meropenem)的抗铜绿假单胞菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图14示出了含有不同程度的美罗培南的抗大肠杆菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图15示出了含有不同程度的克拉霉素(clarithromycin)的抗大肠杆菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图16是表示克拉霉素制剂易于沉降/分散不良的照片。
图17示出了含有不同程度的庆大霉素(gentamicin)的抗铜绿假单胞菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图18示出了含有不同程度的庆大霉素的抗大肠杆菌的立方晶制剂。游离抗生素以黑线表示。
图19示出了含有双氯西林(dicloxacillin)和他唑巴坦(tazobactam)的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图20示出了含有苄青霉素(benzyl penicillin)的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图21示出了含有不同程度的利福平(rifampicin)的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图22示出了不同剂量的游离于溶液中(实心条)和包封于MO-1TAP-3Fus中(虚线柱)的利福平的CFU计数。最小抑制浓度(90％死亡)以星号表示。对于利福平，在检测的最低浓度(0.05μg/ml)下，与游离药物相比，CFU已经减少50％。然后，在0.5μg/ml处，计数显著降低约7倍。对于游离的和包封的Rif，再次在图中用*表示的各自的MIC，分别为3至5μg/ml和1μg/ml，表明MIC降低至少三倍。游离的MIC值与大肠杆菌O157:H7的报告值(约4μg/ml)合理一致。
图23示出了含有1％利福平和0％-10％-20％的不同程度的DOPE(曲率增加)的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图24示出了含有1％利福平和不同程度的DOPE(曲率增加)的抗大肠杆菌的立方晶制剂，如对于图23，在延迟测试后。
图25示出了含有1％利福平、1％DOTAP(正电荷)和10或20的不同程度的DOPE(曲率增加)的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图26示出了含有1％利福平、70％MO、30％DOPE(摩尔％)或1％利福平、60％MO、40％DOPE(摩尔％)(随着DOPE的增加而曲率增加)、并因此呈现了六方相的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图27是图26所示制剂的抗大肠杆菌的第二数据组。
图28示出了含有1％利福平、1％DOTAP(正电荷)、70％MO和30％DOPE或1％利福平、1％DOTAP(正电荷)、60％MO和40％DOPE(随着DOPE的增加而曲率增加)、并因此呈现了六方相的抗大肠杆菌的立方晶制剂。
图29是图28所示制剂的抗大肠杆菌的第二数据组。
图30示出了不同剂量的游离于溶液中(实心条)和包封于MO-1DOTAP-3Fus中(虚线柱)的抗大肠杆菌的夫西地酸(fusidic acid)的CFU计数。最小抑制浓度(90％死亡)以星号表示。
图31示出了铜绿假单胞菌和大肠杆菌对不同浓度的脂质纳米颗粒的存活力，没有包封的活性物作为对照。
图32示出了利福平制剂和DOTAP(正电荷)掺入对耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的MIC测定结果。
图33示出了用利福平制剂和DOTAP(正电荷)掺入对耻垢分枝杆菌实现的细胞死亡。
图34示出了利福平制剂和DOTAP(正电荷)掺入对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Ra的MIC测定结果。
图35示出了用利福平制剂和DOTAP(正电荷)掺入对结核分枝杆菌H37Ra实现的细胞死亡。
图36示出了含有1％菲律宾菌素(filipin)、0/1％DOTAP(正电荷)、0/10％胆固醇的抗白色念珠菌的立方晶制剂。
图37示出了含有1％两性霉素B(amphotericin B)、0/1％DOTAP(正电荷)、0/10％胆固醇的抗白色念珠菌的立方晶制剂。
图38示出了通过共焦和SEM获得的单独氟康唑(fluconazole)；不含氟康唑的脂质颗粒(对照纳米颗粒)和负载氟康唑的脂质纳米颗粒的图像。a)在pH-5.0处的共焦图像，b)在pH-5.0处的SEM图像，c)在pH-7.0处的共焦图像，d)在pH-7.0处的SEM图像。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下认识：可以操纵非层状溶致液晶相载体颗粒的某些参数和组分，例如组分促融合脂质的性质、内部或平均自发曲率、电荷、药物负载和微流变学，以提供能够实现以下中的一者或多者的载体颗粒：(i)改进了活性剂包封；(ii)改善了与微生物的促融合行为；(iii)活性剂的最佳释放曲线；(iv)减少与生物膜接触的空间屏障和/或静电屏障；(v)保护活性物质免受在其它方式下将发生并使活性物质的活性失活或降低的损害或结合；(vi)递送活性剂的能力，活性剂在其它方式下将不能穿过细菌膜；和(vii)与游离活性剂的递送相比，改善活性剂的功效。
非层状溶致液晶相载体颗粒的形成将允许在包括检测、靶向治疗、成像等医学应用中广泛使用，非层状溶致液晶相载体颗粒可被调整以改善特定活性剂和/或特定生物靶标的递送。
特别地，本文证明了可以设计能够将有效负载递送至真菌和分枝杆菌以及革兰氏阴性细菌的非层状溶致液晶相载体颗粒。本文中颗粒的设计可以，特别地但不排他地，通过颗粒与革兰氏阴性细菌的细菌膜或真菌膜的融合来递送抗细菌剂和抗真菌剂。
众所周知，向真菌，特别是革兰氏阴性细菌递送活性物质具有挑战性。众所周知，对于革兰氏阳性物种，细菌膜由肽聚糖的厚外层和内部血浆磷脂膜组成。相反地，革兰氏阴性物种表现出夹在两个磷脂膜之间的相对较薄的肽聚糖层，其中脂多糖以外膜为特征。存在于革兰氏阴性物种中的外膜使得它们对抗微生物化合物特别有弹性，并且对递送抗微生物剂提出了独特的挑战。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在本专利说明书中，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”或类似术语旨在表示非排他性的包括，使得包括一系列要素的方法或组合物不仅仅包括那些要素，还可以包括未列出的其它要素。
“由……组成”是指包括但不限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它要素。
“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何要素并且限于不干扰或有助于在本公开中针对所列出的要素指定的活动或动作的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其它要素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活动或动作。
如本文所用，术语“非层状溶致液晶相颗粒”是指包括液晶非层状结构的自组装颗粒，其由至少一种两亲物形成以得到能够携带活性剂的二维和/或三维中间相结构。本文证明非层状溶致液晶相颗粒实现与生物膜的优异融合以及活性剂通过生物膜的递送。术语“脂质载体”、“非层状溶致液晶相颗粒”、“非层状LLC颗粒”、“颗粒”和“纳米颗粒”在本文中可互换使用。
在实施例中，术语“非层状溶致液晶相颗粒”可用于包括立方、六方和海绵形态。虽然“海绵相”或“海绵颗粒”(L3)被认为不具有长程有序性，并且表现出相反的双连续立方相(QII)的等效结晶周期，但是它们通常被认为是“熔融的”QII立方相，因此被认为作为第一方面的颗粒而包括在内。因此，短程有序海绵相被明确地认为是在该术语的范围内。在实施例中，术语“非层状溶致液晶相颗粒”可用于包括选自以下组成的组的一种或多种相：六方相(正相和反相)、立方相(正相离散相、反相离散相、反相双连续相(包括初基、螺旋状和菱形)和反相不连续相)，和其它“中间相”，包括带状、网状或非立方“海绵状”双连续相。优选地，该术语用于立方相和/或六方相。
如本文所用，术语“两亲物”、“两亲的”和“两亲性脂质”是指包含亲水性和疏水性部分两者的化合物，并且可以在本文所述的LLC颗粒的形成中用作脂质(促融合的或以其它方式)。通常，此类化合物将具有亲水首基和疏水尾部。合适的实例包括脂肪酸和一系列脂质分子。
如本文所提及的，术语“促融合”是指化合物，通常为脂质，其将作为非层状溶致液晶相颗粒的一部分，促进或增强颗粒与生物膜(例如细菌细胞膜)的融合，从而促进活性剂的递送。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指对于全身或局部给药毒理学上安全的活性剂的盐，例如由药学上可接受的无毒碱或酸(包括无机或有机碱和无机或有机酸)制备的盐。药学上可接受的盐可以选自包括以下的组：碱金属和碱土金属、铵、铝、铁、胺、葡糖胺、氯化物、硫酸盐、磺酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、苹果酸盐、马来酸盐、萘磺酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、对苯二甲酸盐、棕榈酸盐、哌嗪、果胶酸盐和S-甲基甲硫氨酸盐等。
根据本发明的第一方面，提供了一种脂质载体，其可以是包含一种或多种促融合两亲性脂质的非层状溶致液晶相颗粒，并且该颗粒包封活性剂。
在实施例中，可以是非层状溶致液晶相颗粒的脂质载体通过一种或多种促融合两亲性脂质的自组装形成。应当理解，当存在水溶液，例如水或缓冲水溶液时，合适的两亲性脂质将自组装，以形成显示非层状中间相的溶致液晶(LLC)结构。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒包含至少两种促融合两亲性脂质，任选地至少三种或至少四种、或至少5种、或至少6种、或至少7种、8种、9种或10种或更多种促融合两亲性脂质。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒可以由一种、两种、三种或四种促融合两亲性脂质组成或基本上由其组成。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒可以由一种、两种、三种或四种两亲性脂质(促融合的或非促融合的)组成或基本上由其组成。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒通过在活性剂存在下一种或多种促融合两亲性脂质的自组装而形成。应当理解，可以有多种方式将活性剂附着、掺入或包封在颗粒内，并且最终的方法将取决于活性剂的性质和颗粒递送它的方式。例如，在某些实施例中，可能合适的是集中于活性物质与颗粒的大部分表面的附着。然而，典型地，颗粒将在活性剂的存在下形成，使得除了任何附带的表面结合的活性剂之外，活性剂结合在脂质颗粒的内部通道和褶皱中。
在实施例中，大部分活性剂位于第一方面的颗粒的内部通道内。优选地，在递送至目标区域时，与第一方面的颗粒缔合的活性剂的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％位于第一方面的颗粒的内部通道内。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒可以是胶体颗粒，具有小于10微米的颗粒尺寸。
在实施例中，第一方面的颗粒的粒度可以为约10微米至约40纳米。优选地，粒度为约5微米至约50纳米之间，更优选约1微米至约50纳米之间，甚至更优选约800纳米至约50纳米之间，还更优选约600纳米至约50纳米，甚至还更优选约500纳米至约50纳米之间或约400纳米至约50纳米之间，或约5微米至约100纳米之间，更优选约1微米至约100纳米之间，甚至更优选约800纳米至约100纳米之间，还更优选约600纳米至约100纳米之间，甚至还更优选约500纳米至约100纳米之间或约400纳米至约100纳米之间。因此，第一方面的颗粒可以在上述粒度范围的实施例中作为活性剂的纳米载体。
在实施例中，非层状溶致相颗粒具有选自立方相、六方相和海绵相的体相，适当时包括正相和逆相/反相。
与它们的层状类似物，例如脂质体相比，非层状LLC颗粒基质提供了一系列优点。它们的脂质组合物可以使它们与细菌的外膜更易融合，并且由于它们的高内表面积和两亲性，非层状LLC颗粒，例如立方晶具有包封和释放活性物质阵列的能力。非层状LLC颗粒基质还可以保护包封的活性剂的结构完整性免于酶促降解。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒是选自由以下组成的组的一种：六方相(正相和反相)、立方相(正相离散相、反相离散相、反相双连续相(包括初基、螺旋状和菱形)和反相不连续相)，和其它“中间相”，包括带状、网状或非立方“海绵状”双连续相。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒是选自由立方晶、六方晶(hexosome)和海绵颗粒组成的组中的一种。
在实施例中，第一方面的非层状溶致液晶相颗粒可以是立方晶或六方晶。
优选地，立方晶是双连续立方相(V1)或逆双连续立方相(V2)立方晶。逆双连续立方相(V2)立方晶是特别优选的。本领域技术人员应当理解，V2是变化立方相的伞形项。V2也可称为VII或QII。在QII中有QII D(Pn3m)、QII P(Im3m)、QIIG(Ia3d)。
逆(反)相颗粒可以是优选的，因为它们提供了一系列复杂的内部通道，这些通道可以容纳活性剂并且在某些情况下允许更好的控制释放曲线。
立方晶内的立方相结构提供了重复包裹在三周期最小表面上的脂质双层基序。第一方面的这些颗粒内脂质膜的增加的表面曲率可以在与其它自组装系统(包括脂质膜，例如细菌膜)接触时帮助促进双层融合。因此，在本公开的脂质载体中优选高曲率值。由于它们的高内表面积和两亲性，立方晶具有包封和释放多种目前可获得的活性剂的能力，活性剂包括抗微生物剂，例如小分子、蛋白质、抗微生物肽和其它杀生物组分。
就用于形成第一方面的颗粒的促融合脂质而言，脂质的临界堆积参数(CPP)可用于合理化平均曲率和高斯曲率，它们为所形成颗粒的特性，因此指示所形成或正在形成的中间相的性质，且考虑所得非层状LLC颗粒作为活性剂载体的适用性。CPP通过以下等式与平均曲率和高斯曲率相关：
其中：
lc是烃链的有效长度
H是平均曲率
K是高斯曲率
用于形成本公开的颗粒的相关两亲物脂质的分子几何形状应满足上述等式，以产生CPP>1。
相同的方法可用于一种以上的两亲物脂质。对于多种两亲物，具有小于1的固有CPP的两亲物可以包括在具有CPP>1的二级两亲物的组合物中，使得平均CPP为>1。也可有助于曲率增加以实现CPP>1的二级添加剂包括小疏水分子、与两亲物首基相互作用的聚合物、强亲液剂(kosmotrope)和SiRNA和DNA。相反，通过包含CPP<1的两亲物、高分子量PEG、强离液剂(chaotrope)、带电首基和LogP在-1.5至0之间的溶剂，可以降低曲率。
因此，LLC颗粒可以基于它们的界面曲率来分类，界面曲率可以通过本领域已知的方法来计算。一般而言，逆溶致相的曲率以层状<双连续立方<六方<胶束立方的顺序增加。
在实施例中，一种或多种促融合两亲性脂质具有约1.0或大于1.0的临界堆积参数(CPP)。
在实施例中，一种或多种促融合两亲性脂质具有约1.0至约3.0、优选约1.0至约2.5、更优选约1.0至约2.0、甚至更优选约1.0至约1.75、还更优选约1.0至约1.5的CPP。
应当理解的是，当将多种脂质掺入到第一方面的颗粒中时，则以上对单独脂质的CPP值的所有引用变成对平均CPP值的引用。即，当LLC颗粒包含多于一种的两亲物(脂质)时，平均CPP可定义为组成性两亲物脂质的所有CPP值的摩尔平均值。平均CPP值可以从上面提供的那些中选择。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有约1.0至约3.0、优选约1.0至约2.5、更优选约1.0至约2.0、甚至更优选约1.0至约1.75、还更优选约1.0至约1.5的平均CPP值。
CPP计算如下：v/a0lc；其中lc是两亲物(脂质)链的有效长度；a0是有效表面活性剂首基面积(由链间吸引和首基排斥相互作用的平衡确定)；并且v是由两亲物分子占据的平均体积。
不希望受理论的束缚，本发明人假定平均CPP值在约1.0至约3.0之间，最佳地在约1.0至约1.5之间，提供允许捕获活性剂并随后释放的颗粒曲率。CPP值还可以允许预测颗粒与生物膜融合的可能性。
类似地，自发展曲值对应于非层状LLC颗粒的自发曲率。当两个脂质具有相应的自发展曲能量时，它们之间的融合在能量上变得更有利。因此，认为具有以下展曲值的第一方面的颗粒将更可能经历与生物膜如细菌膜的所需融合事件。
促融合脂质的选择将清楚地影响展曲，并且可以基于例如疏水物的选择来确定以增强链展曲，包括使用不饱和疏水物，例如十四烷基、十五烯基、油基、油烯基、亚油烯基、亚麻烯基、花生四烯基、二十二烯基，和/或类异戊二烯型疏水物，例如3,7,11-三甲基-十二烷基、5,9,13-三甲基十四烷基、3,7,11,15-四甲基-十六烷基、5,9,13,17-四甲基十八烷基。这些脂质的非限制性实例包括本领域已知的ME、MP、MM、MV、MO、ML和MR。
由于展曲导致的单位表面积的能量成本可以近似为
其中κ是单层的展曲模量，是自发展曲。
κt是单层的展曲模量，t是倾斜向量。
总能源成本
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有小于-0.05nm-1的内部曲率诱导的展曲
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有小于-0.10nm-1的内部曲率诱导的展曲
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有小于-0.15nm-1的内部曲率诱导的展曲
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有小于-0.20nm-1的内部曲率诱导的展曲
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有小于-0.25nm-1的内部曲率诱导的展曲
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有在约-0.05nm-1至约-0.95nm-1之间、或在约-0.05nm-1至约-0.85nm-1之间、或在约-0.05nm-1至约-0.75nm-1之间、或在约-0.05nm-1至约-0.65nm-1之间、或在约-0.05nm-1至约-0.55nm-1之间、或在约-0.05nm-1至约-0.40nm-1之间、或在约-0.10nm-1至约-0.95nm-1之间、或在约-0.10nm-1至约-0.85nm-1之间、或在约-0.10nm-1至约-0.75nm-1之间、或在约-0.10nm-1至约-0.65nm-1之间、或在约-0.10nm-1至约-0.55nm-1之间、或在约-0.10nm-1至约-0.40nm-1之间、或在约-0.15nm-1至约-0.75nm-1之间、或在约-0.15nm-1至约-0.65nm-1之间、或在约-0.15nm-1至约-0.55nm-1之间、或在约-0.15nm-1至约-0.40nm-1之间、或在约-0.20nm-1至约-0.75nm-1之间、或在约-0.20nm-1至约-0.65nm-1之间、或在约-0.20nm-1至约-0.55nm-1之间、或在约-0.25nm-1至约-0.75nm-1之间、或在约-0.25nm-1至约-0.65nm-1之间、或在约-0.25nm-1至约-0.55nm-1之间的内部曲率诱导的展曲
此外，根据本公开，本领域技术人员将能够使用以下等式来确定适当的曲率水平以提供本文所述的益处：
c0T＝xc0i+(1-x)c0j
其中c0T是总曲率，x是脂质i的分数组成，c0i是脂质i的曲率，c0j是脂质j的曲率，(1-x)是脂质j的分数组成。对于进一步的组合，将等式扩展为包括脂质k；其中组合物的总和等于1。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒的晶格参数为约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约160之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约之间、或约至约之间、或约至约之间、或约 至约
晶格参数可(例如，相对于通常具有比立方晶或六方晶大的晶格参数的海绵颗粒)在高达的范围内溶胀。更常见的溶胀相可以具有至的值。溶胀的晶格参数具有某些设计规则，包括首基可包含静电荷，并且这些可带负电荷(例如，PG和PS磷脂)或带正电荷(例如，DOTAP和DOMA)。首基可包含具有多个羟基的水合剂(例如，DGMO和OG)。疏水区可包含胆固醇或其它硬化剂以稳定膜，且/或可包含促进膜曲率减小的两亲物(例如，PC和PE磷脂)。脂质-PEG聚合物(例如，DOPE-PEG和MO-PEG)可与带电脂质组合使用，以溶胀水通道。此外，当需要纳米颗粒分散体时，嵌段共聚物(例如，普朗尼克F127、F108和Polysorbate 80)可用作稳定剂，尽管它们可能对水通道的溶胀没有直接影响。
在实施例中，一种或多种脂质中的至少一种呈现或已经被修饰以呈现电荷。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒可以还包含非两亲性和/或非促融合带电化合物。
已发现带电物质的存在在促进第一方面的颗粒与生物膜之间的接触方面具有有益结果，如结果中所示。这被认为是由于非层状LLC颗粒上的正电荷有助于克服在其它方式下可能使颗粒和生物膜分开的任何空间或静电屏障。从而可以增加接触事件的数量，导致相应更多的融合和递送事件。这对于呈现净负电荷的细菌膜(例如革兰氏阴性细菌膜)尤其重要。
可以通过将一种或多种带电物质结合到非层状LLC颗粒中来产生电荷。这可以通过包含带电荷的两亲物或表面活性剂来实现。应当理解，本领域已知的宽范围的阳离子脂质、表面活性剂和相关化合物可以是合适的。
在实施例中，非层状LLC颗粒可以包括阳离子脂质。
在实施例中，阳离子脂质可以是包含能够携带正电荷的含氮首基的脂质。
带正电的物种，例如两亲性或表面活性剂分子的首基，也被假定在产生期望与第一方面的非层状LLC颗粒融合的生物膜的初始扰动中是重要的。这可能涉及膜的弯曲、倾斜、展曲等，这可能是融合的初始事件。
在实施例中，阳离子脂质可以以0.1摩尔％至小于20摩尔％之间、或0.1摩尔％至小于10摩尔％之间、或0.1摩尔％至小于5摩尔％之间、或0.1摩尔％至小于4摩尔％之间、或0.1摩尔％至小于3摩尔％之间、或0.1摩尔％至小于2摩尔％之间、或0.5摩尔％至小于20摩尔％之间、或0.5摩尔％至小于10摩尔％、或0.5摩尔％至小于5摩尔％、或0.5摩尔％至小于4摩尔％、或0.5摩尔％至小于3摩尔％、或0.5摩尔％至小于2摩尔％的量掺入非层状LLC颗粒。
在实施例中，可以是非层状溶致液晶相颗粒的脂质载体可以具有大于0mV的ζ电位。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒可以具有大于约0mV至约60mV、大于约0mV至约50mV、大于约0mV至约40mV、约1mV至约60mV之间、约1mV至约50mV之间、约1mV至约40mV之间的ζ电位。
本发明人假定，为了实现第一方面的颗粒与生物膜如革兰氏阴性细菌、分枝杆菌或真菌的膜的适当融合，设计和控制第一方面的颗粒的粘度是要考虑的重要参数。特别地，一旦第一方面的颗粒与生物膜接触，重要的是确保它们具有足够的粘度以实现足够的粘附并确保它们不分离。这也将确保在大多数流动条件下保持纳米结构。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒在0℃至40℃之间可具有约10Pa s-1至约1x10^6Pa s-1之间的动态粘度。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒在小于100s-1的剪切速率下可以具有约5cSt至约30,000cSt之间、或约10cSt至约20,000cSt之间的剪切粘度。
一种或多种促融合两亲性脂质可以选自本领域已知形成的那些，特别是立方晶和六方晶。合适的一种或多种促融合两亲性脂质的选择可以基于本领域中理解的某些要求进行。例如，脂质可以选自在环境温度和生理温度下采用II型溶致液晶相的那些。适于选择合适脂质的参数包括(i)在疏水组分上：1。温度应当高于链熔融温度，使得存在熔融链；并且2。在至少14个碳的碳链中在沿着主链的至少中间位置处应该存在至少一个顺式不饱和键；或3。碳主链应含有至少12个碳，其中3个是具有甲基支链的仲碳；并且4。疏水物的分子量应为至少>200amu；以及(ii)关于首基：5。首基应包含至少三个具有最小亲水性的官能团(例如，羟基)；6。首基应能形成首基-水氢键网络；并且7。首基面积相对于疏水物足迹应该小。作为指导，这由本公开的实例中使用的MO脂质例示为：满足疏水物的标准1、2和4；并满足首基的标准5、6和7。可以理解的是，可以获得适当满足这些标准的许多其它脂质，并且可以基于这些已知或容易确定的标准来选择它们。
指导可以在以下出版物中的一个或多个中找到，这些出版物各自以全文引用的方式并入本文：(i)T.Kaasgaard和C.J.Drummond“在过量溶剂中稳定的有序2D和3D纳米结构两亲物自组装材料(Ordered 2D and 3D Nanostructured Amphiphile Self-AssemblyMaterials Stable in Excess Solvent)”《物理化学化学物理(Phys.Chem.Chem.Phys.)》2006,8,4957-4975。(ii)C.Fong,T.Le和C.J.Drummond“溶致液晶工程-有序纳米结构小分子两亲物自组装材料设计(Lyotropic Liquid Crystal Engineering–OrderedNanostructured Small Molecule Amphiphile Self-Assembly Materials by Design)”《化学会评论(Chem.Soc.Rev.)》,2012,41,1297–1322DOI:10.1039/c1cs15148g；(iii)L.van‘t Hag,S.L.Gras,C.E.Conn和C.J.Drummond“移动超过二元组成空间的溶致液晶工程-有序纳米结构两亲物自组装材料设计(Lyotropic liquid crystal engineeringmoving beyond binary compositional space–Ordered nanostructured amphiphileself-assembly materials by design)”《化学会评论》,2017,46,2705–2731,DOI:10.1039/c6cs00663a；以及(iv)S.Sarkar,N.Tran,Md H.Rashid,T.C.Le,I.Yarovsky,C.E.Conn和C.J.Drummond“往细胞膜仿生脂质立方相：一种高通量的脂质组成空间探索(Toward cell membrane biomimetic lipidic cubic phases:a high-throughputexploration of lipid compositional space)”《ACS应用生物材料(ACS AppliedBiomaterials)》,2019,2,182–195,DOI:10.1021/acsabm.8b00539。
聚羟基(糖脂)和聚醚(聚环氧乙烷)形成形成头基的II型的最大类别中的两种。头基基序的非限制性实例包括醇、脂肪酸、单酰基甘油酯、MAG、2-MAG、甘油酸酯、甘油醚、环氧乙烷、酰胺、单乙醇酰胺、二乙醇酰胺、丝氨酸酰胺、甲基丙二醇酰胺、乙基丙二醇酰胺、脲、脲醇、缩二脲、缩二脲醇、酰脲、内源性大麻素(花生四烯酰乙醇胺、维罗达明(virodhamine)、2-甘油、多巴胺、2-甘油醚)和糖脂。实例包括磷脂，例如DMPC和DMPE。
在实施例中，一种或多种促融合两亲性脂质可以选自由环氧乙烷-、单酰基甘油-、糖脂-、磷脂酰乙醇胺-和基于脲的两亲物及其衍生物或类似物组成的组。
环氧乙烷两亲物可包括C12(EO)2、C12(EO)4、C12(EO)5和C12(EO)6以及二烷基环氧乙烷两亲物。单酰基甘油可包括甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单油酸酯、甘油一油酸酯和甘油单芥酸酯。类似单酰基甘油的两亲物可以是合适的，包括油烯基甘油酸酯、植基甘油酸酯、甘油单油基醚、甘油植基醚、植烷三醇和单壬烯酸甘油酯。合适的具有糖部分的糖脂包括单取代的糖脂：β-Mal3(Phyt)2、β-Glc(Phyt)、β-Xyl(Phyt)、β-Glc-(TMO)2、β-Mal2(Phyt)2和β-Glc(Phyt)2；和二取代的无支链糖脂：1,2-二酰基-(β-D-吡喃葡萄糖基)-sn-甘油；1,2-二烃基-(β-D-吡喃葡萄糖基)-sn-甘油；1,3-二酰基-(β-D-吡喃葡萄糖基)-sn-甘油；1,3-二烷基-(β-D-吡喃葡萄糖基)-sn-甘油。磷脂酰乙醇胺两亲物可包括二油酸磷脂酰胆碱(DOPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。脲两亲物可包括十二烷基脲(DU)、十八烷基脲(ODU)、油烯基脲(OU)、油烯基缩二脲(OBU)、亚油基脲(LU)、植烷基脲(PU)、六氢法呢基脲(HFU)。
在实施例中，一种或多种促融合两亲性脂质可以选自由以下组成的组：1-甘油一油酸酯、2-甘油一油酸酯、香茅酯、油酰乳酸酯、油酰胺、甘油一反油酸酯、亚油酸、反油酸、甘油一棕榈酸酯、甘油一亚油酸酯、植烷三醇、甘油二油酸酯、甘油三油酸酯、二油酰甘油、双十二烷基二甲基溴化铵、双十八烷基(二甲基)氯化铵(DOAC/DODMAC)或双十八烷基(二甲基)溴化铵(DODAB)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-磷脂酰甘油(DOPG)、油酸、溶血-1-羟基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-二己基-磷酸胆碱、维生素E生育酚、维生素E(生育酚)乙酸酯、植酰基单乙醇酰胺、法呢酰基单乙醇酰胺、油酰基单乙醇酰胺、亚油基酰单乙醇酰胺和亚麻酰基单乙醇酰胺。
单链两亲性脂质可以选自由以下组成的组：饱和脂肪酸C7-C16、油酸、反油酸、亚油酸、油酸钠/油酸钆、油酰胺、1-甘油单油基醚(GME)、GMO、2-MO、油酰乳酸酯、柠檬烯、二甘油单油酸酯(DGMO)、溶血(1-油酰基)-磷脂酰胆碱、(Z)-十八碳-9-烯基二茂铁、N-十二烷基-己内酰胺(C12)、维生素K1、泛醌-10(辅酶Q10)、维生素E、维生素E乙酸酯、维生素A棕榈酸酯、α-生育酚PEO1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)、PEG2000-MO、PEG-PT、PEOx-硬脂酸酯(x＝40-100)、聚山梨醇酯80。
具有多个烷基链的两亲物脂质可选自由以下组成的组：双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)；二(低芥酸菜子乙酯)二甲基氯化铵(DEEDAC)；双十八烷基(二甲基)氯化铵(DOAC/DODMAC)或双十八烷基(二甲基)溴化铵(DODAB)；甘油二油酸酯；二油酰基-甘油(DOG)、EDTA-二油酰基；EDTA-双-植烷；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-磷脂酸(DOPA)；1,2-二油酰-磷脂酰甘油(DOPG)、1,2-二硬脂酰-磷脂酰甘油(DSPG)；1,2-二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(DOPS)；1,2-二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)；DSPE-mPEG350、750、2000(X＝7、16或45)；DSPE-PEG2000、3400、5000；DMPE-mPEG550；(C18)2DTPA(Gd)、心磷脂、环糊精衍生物(βCD-nC10)。
在本文的任何实施例中，促融合两亲性脂质可以是甘油一油酸酯和/或植烷三醇。
在本文的任何实施例中，本公开的脂质颗粒可包含与胆固醇、DLPC、DSPC、DPPE、DPPS、DOPS、DPPC、DMPC、DMPS和DLPS中的一种或多种组合的MO或植烷三醇。
已知单酰基甘油在其相图的较大区域上形成反相，其中甘油一油酸酯是最突出的。由于通过顺式双键引入扭结，反相的形成是有利的。较长的酰基链增加了疏水链体积并使甘油一油酸酯在中间相的光谱中更呈楔形并向2型相移动。如果双键更靠近脂质的末端，则它降低其影响并使其更不楔形。预期酰基链延伸驱动中间相形成更加朝向2型相，在此基础上，H2相变成具有这种变化的主相并不令人惊讶。
在其中非层状溶致液晶相颗粒包含至少两种促融合两亲性脂质的实施例中，促融合两亲性脂质中的至少一种可选自甘油一油酸酯和植烷三醇。
在这样的实施例中，甘油一油酸酯和/或植烷三醇促融合两亲性脂质可以单独地或组合地与甘油三油酸酯、维生素E和DOPE中的一者或多者组合。如果需要在非层状溶致液晶相颗粒上提供电荷，则这些组合本身可以进一步与一种或多种阳离子脂质组合，阳离子脂质选自本领域公知的和可商购的那些，并且包括多种季铵阳离子化合物。
可以选择某些脂质，特别是因为它们对最终脂质颗粒例如DOPE的内部曲率有影响。当除了主要的促融合脂质(例如甘油一油酸酯)之外还包括此类脂质时，它们可以以约10摩尔％至40摩尔％存在。
代表性的阳离子脂质可以选自以下非限制性实例：3-β[4N(1N8双胍基亚精胺)-氨基甲酰基]胆固醇(BGSC)；3-β[N,N-二胍基乙基-氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(BGTC)；N,N1,N2,N3四甲基四棕榈酰精胺(cellfectin)；NtN'-丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基-氨基丙-脒(CLONfectin)二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；1,2-肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)；2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-p-柠烯(硝基三氟乙酸酯)(DOSPA)；1,3-二油酰氧基-2-(6-羧精酰基)-丙酰胺(DOSPER)；4-(2,3-二-棕榈酰氧基-丙基)-1-甲基-1H-咪唑(DPIM)；N,N,N',N'-四甲基-N,N'-双(2-羟乙基)-2,3-二油酰氧基-1,4-丁烷二碘化铵(Tfx-50)；N-1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)或其它N-(N,N-1-二烷氧基)-烷基-N,N,N-三取代的铵表面活性剂；三甲基铵基团是双链的(DOT)，通过丁醇间隔臂1,2-二油酰基-3-(4'-三甲基铵基)丁醇-sn-甘油(DOBT)或胆甾醇基(4'-三甲基铵基)丁酸酯(ChOTB)连接至胆甾醇基(对于ChOTB)DORI(DL-1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙基铵)或DORIE(DL-1,2-O-二油酰基-3-二甲基氨基丙基)，如WO 93/03709中所公开，-B-羟乙基铵)(DORIE)或其类似物；1,2-二油酰基-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)；作为阳离子相转移剂的四辛基溴化铵(TOAB)；胆固醇半琥珀酸酯(ChOSC)；二十八烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)和二棕榈酰磷脂酰乙醇戊精胺(DPPES)或阳离子脂质公开于美国专利第5,283,185号，胆甾醇基-3β-羧基-酰氨基-乙烯三甲基氯化铵、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基羧酸胆固醇酯碘化物、胆甾醇基-3-O-羧胺基乙胺、胆甾醇基-3-β-氧基琥珀酰胺-乙烯三甲基碘化铵、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物、2-(2-三甲基铵基)-乙基甲胺基乙基-胆甾醇三乙基-3-β-氧基琥珀酸酯碘化物、3-β-N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨甲酰胆固醇(DC-chol)和3-β-N-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基胆固醇；O,O-二肉豆蔻基-N-赖氨酰-天冬氨酸酯(DMKE)；O,O-二肉豆蔻基-N-赖氨酰-谷氨酸盐(DMKD)：1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DPEPC)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DSEPC)；1,2-二油酰基-3-三甲胺基丙烷(DOTAP)；二油酰基二甲氨基丙烷(DODAP)；1,2-棕榈酰基-3-三甲胺基丙烷(DPTAP)；1,2-二硬脂酰-3-三甲胺基丙烷(DSTAP)；1,2-十四酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)；和十二烷基硫酸钠(SDS)。
在实施例中，特别优选的阳离子脂质是DOTAP和/或DODAB和/或四辛基溴化铵(TOAB)。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒除了包含一种或多种促融合脂质(例如，油酸)之外，还可以包含脂肪酸。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒可以包含至少一种稳定剂。稳定剂可以选自本领域已知的那些。
优选地，稳定剂是泊洛沙姆(Poloxamer)或表面活性剂或聚乙二醇化(PEGylated)脂质稳定剂，或这些的修饰形式。
在实施例中，稳定剂选自PEG-PPO-PEG三嵌段共聚物和非离子嵌段共聚物表面活性剂以及与带电部分共聚的PEO。泊洛沙姆407(Poloxamer 407)和普朗尼克127(Pluronic127)可以是稳定剂的合适实例，并且可以并入本文所述的第一方面的任何实施例中。与(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵或类似的带电荷部分共聚的PEO也可以是合适的。聚乙二醇化脂质稳定剂也是合适的，包括但不限于PEG2000-MO、PEG-PT、DSPE-PEG(2000)胺、18:0PEG2000 PE和DSPE-PEG(5000)胺。许多其它这种稳定剂是本领域已知的。
稳定剂的使用是优选的，虽然稳定剂的性质可以基于脂质的性质来选择，但是对这些组分的相容性的选择和理解可以基于本领域已知的信息。
迄今为止已经报道的许多空间稳定剂可分为四组：(i)两亲性嵌段共聚物(即泊洛沙姆TM)、(ii)聚乙二醇化脂质、(iii)定制脂质共聚物和(iv)替代空间稳定剂(例如，胆汁盐、蛋白质)。理想地，所选择的稳定剂将通过在接近的颗粒之间提供静电屏障或更常见的空间屏障来防止颗粒聚集。可以在本公开的脂质颗粒中起最佳作用的稳定剂具有相似的性质，包括(i)它们通常是高度亲水的、具有高HLB(亲水亲油平衡)值，这是由于具有较大亲水域的不对称两亲性聚合物结构。重要的是分子的亲水部分不被疏水区域包围。高HLB可以通过使用较长的PEG链或多个PEG链来实现；(ii)存在氢键受体且不存在氢键供体；以及(iii)电中性。本领域技术人员可以在此基础上选择合适的稳定剂。此外，以下期刊论文阐述了稳定剂的关键方面，稳定剂可适合与本公开的脂质颗粒一起使用，这些期刊论文以全文引用的方式并入本文：(i)J.Y.T.Chong,X.Mulet,B.J.Boyd和C.J.Drummond；“用于立方相溶致液晶纳米分散体(立方晶)的空间稳定剂(Steric Stabilizers for Cubic PhaseLyotropic Liquid Crystal Nanodispersions(Cubosomes))”于《平面脂质双层和脂质体研究进展(Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes)》,第21卷,第5章,(2015)第131-187页,ISSN 1554-4516,Elsevier；(ii)J.Zhai,B.Fan,S.H.Thang,C.J.Drummond“用于形成刺激响应性非层状脂质纳米颗粒的新型两亲嵌段共聚物(Novelamphiphilic block copolymers for the formation of stimuli-responsive non-lamellar lipid nanoparticles)”《分子(Molecules)》,2021,26,3648–3664,DOI:10.3390/molecules26123648；(iii)J.Zhai,R.Suryadinata,B.Luan,N.Tran,T.M.Hinton,J.Ratcliffe,X.Hao和C.J.Drummond“通过RAFT聚合方法生产的两亲性刷状聚合物稳定并降低脂质溶致液晶纳米颗粒的细胞毒性(Amphiphilic brush polymers produced by theRAFT polymerisation method stabilise and reduce the cell toxicity of lipidlyotropic liquid crystalline nanoparticles)”《法拉第讨论(FaradayDiscussions)》,2016,191,545–563.DOI:10.1039/C6FD00039H；《法拉第讨论》191关于具有形态和功能各向异性的纳米颗粒(Nanoparticles with Morphological and FunctionalAnisotropy)；(iv)J.Zhai,T.J.Hinton,L.J.Waddington,C.Fong,N.Tran,X.Mulet,C.JDrummond和B.W.Muir"脂质-PEG缀合物的空间稳定和降低植烷三醇基溶致液晶纳米颗粒的毒性(Lipid-PEG Conjugates Sterically Stabilise and Reduce the Toxicity ofPhytantriol-Based Lyotropic Liquid Crystalline Nanoparticles)"《朗缪尔(Langmuir)》,2015,31,10871–10880,DOI:10.1021/acs.langmuir.5b02797；(v)J.Y.T.Chong,X.Mulet,D.Keddie,L.J.Waddington,S.T.Mudie,B.J.Boyd和C.J.Drummond“用于溶致液晶纳米颗粒的新型空间稳定剂：聚乙二醇化植基共聚物(Novel StericStabilisers for Lyotropic Liquid Crystalline Nanoparticles:Pegylated PhytanylCopolymers)”《朗缪尔》,2015,31,2615-2629,DOI:10.1021/la501471z；(vi)J.Y.T.Chong,X.Mulet,A.Postma,D.J.Keddie,L.J.Waddington,B.J.Boyd和C.J.Drummond“用于立方晶的新型RAFT两亲物刷状共聚物空间稳定剂：聚(丙烯酸十八烷基酯)-嵌段-聚(聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯)(Novel RAFT Amphiphile Brush Copolymer Steric Stabilisers forCubosomes:Poly(octadecyl acrylate)-block-poly(polyethylene glycol methylether acrylate))”《软物质(Soft Matter)》,2014,10,6666-6676,DOI:10.1039/C4SM01064G；(vii)A.Tilley,C.J.Drummond和B.J.Boyd“空间稳定剂普朗尼克F127在溶致液晶纳米结构颗粒分散体中的处置和缔合(Disposition and Association of theSteric Stabiliser Pluronic F127 in Lyotropic Liquid CrystallineNanostructured Particle Dispersions)”《胶体与界面科学杂志(J.Colloid andInterface Science)》,2013,392,288–296,DOI:10.1016/j.jcis.2012.09.051；(viii)J.Y.T.Chong,X.Mulet,L.J.Waddington,B.J.Boyd和C.J.Drummond“用于立方溶致液晶纳米颗粒分散体的新型空间稳定剂的高通量发现(High Throughput Discovery of NovelSteric Stabilisers for Cubic Lyotropic Liquid Crystal NanoparticleDispersions)”《朗缪尔》,2012,28,9223-9232,DOI:10.1021/la301874v；(ix)J.Y.T.Chong,X.Mulet,L.J.Waddington,B.J.Boyd和C.J.Drummond“立方溶致液晶纳米颗粒的空间稳定性：三嵌段聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物的高通量评价。(Steric Stabilisation of Cubic Lyotropic Liquid Crystalline Nanoparticles:High Throughput Evaluation of Triblock Polyethylene Oxide–PolypropyleneOxide–Polyethylene Oxide Copolymers.)”《软物质》,2011,7,4768–4777,DOI:10.1039/c1sm05181d。
稳定剂可以在第一方面的颗粒的形成过程中存在。
稳定剂可以5重量％至20重量％、6重量％至18重量％、7重量％至16重量％或8重量％至14重量％存在。
在实施例中，形成第一方面的颗粒的脂质可以基本上包含以下：
(a)甘油一油酸酯和/或植烷三醇；
(b)甘油一油酸酯和/或植烷三醇，和DOPE；
(c)甘油一油酸酯和/或植烷三醇，和DOTAP；
(d)甘油一油酸酯和/或植烷三醇，和TOAB；
(e)甘油一油酸酯和/或植烷三醇，和油酸；
(e)甘油一油酸酯和/或植烷三醇，和DOPE和DOTAP。
在第一方面的脂质颗粒包含DOPE的实施例中，它可以以10摩尔％至40摩尔％存在。
在第一方面的脂质颗粒包含DOTAP的实施例中，其可以以0.5摩尔％至5摩尔％，或0.5摩尔％至4摩尔％存在。
在某些实施例中，形成第一方面的颗粒的脂质可以基本上包含以下：
a)甘油一油酸酯；或
b)甘油一油酸酯(80摩尔％至99.9摩尔％)、甘油三油酸酯(0.1摩尔％至20摩尔％)；或
c)甘油一油酸酯(80摩尔％至99.9摩尔％)、维生素E(0.1摩尔％至20摩尔％)；或
d)甘油一油酸酯(80摩尔％至99.9摩尔％)、DOPE(0.1摩尔％至20摩尔％)。
在某些实施例中，形成第一方面的颗粒的脂质可以基本上包含以下：
a)甘油一油酸酯(95摩尔％至99.9摩尔％)、DOTAP(0.1摩尔％至5摩尔％)；或
b)甘油一油酸酯(95摩尔％至99.9摩尔％)、DODAB(0.1摩尔％至5摩尔％)；或
c)来自上述列表的任何脂质和DOTAP(0.1摩尔％至5摩尔％)。
非层状溶致液晶相颗粒可以由或基本上由甘油一油酸酯和/或植烷三醇以及一种或两种选自上述促融合两亲性脂质的两亲性脂质组成。
在实施例中，一种或多种促融合两亲性脂质可以选自呈现疏水性尾基的那些脂质，所述疏水性尾基选自由油酰基、亚油酰基、亚麻酰基、植酰基、法呢酰基或延长的脂肪族疏水性链组成的组。
在此类实施例中，促融合两亲性脂质的首基可以是经修饰以呈现化学部分的电荷或其它所需表面官能度的“非传统”首基。
在其中至少一种促融合两亲性脂质呈现非传统首基的实施例中，其可以是通常不与所附接的疏水性尾部缔合的肽首基或阳离子首基。在一个非限制性实例中，首基可以是基于氨基糖苷的首基。
在实施例中，促融合两亲性脂质的疏水性尾部可以是经修饰以呈现特定表面功能性或物理特性的“非传统”尾基。特别地，可以修饰尾基以允许控制颗粒的最终CPP值。因此，在实施例中，可选择促融合两亲性脂质的疏水性尾部，使得提供约1.0至约3.0、优选约1.0至约2.5、更优选约1.0至约2.0、甚至更优选约1.0至约1.75、还更优选约1.0至约1.5的CPP值。
在其中非层状溶致液晶相颗粒包含一种或多种带电的两亲物或表面活性剂(促融合或其它方式)的实施例中，它们可以选自DOTAP、DOTMA、DODAP、双十八烷基(二甲基)氯化铵(DOAC/DODMAC)或双十八烷基(二甲基)溴化铵(DODAB)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和CTAB。
在实施例中，活性剂可以选自可以影响或有助于鉴定生物系统、途径、分子的任何物理或生化性质或与生物体(包括但不限于动物和人)相关的相互作用的任何物质。具体地，如本文所用，药剂包括但不限于旨在用于诊断、治愈、检测、减轻、治疗或预防人或其它动物的疾病或以其它方式增强人或动物的身体或精神健康的任何物质。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、染料、酶和小分子药物。适用于本文所述的方法和组合物的活性剂的种类包括但不限于药物、前药、放射性核素、成像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、含金属的纳米颗粒、抗炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、基因表达调节剂、敲低剂、siRNA、RNAi剂、dicer底物、miRNA、shRNA、反义寡核苷酸、适体、微生物来源的毒素、抗体及其片段(包括抗结核抗体片段)等。
特别优选的活性剂可以包括已知对革兰氏阴性细菌和/或分枝杆菌和/或真菌有效的任何试剂。
活性剂可以以0.1摩尔％至30.0摩尔％、或0.1摩尔％至25.0摩尔％、或0.1摩尔％至20.0摩尔％、或0.1摩尔％至10.0摩尔％、或0.1摩尔％至5.0摩尔％、或0.1摩尔％至4.0摩尔％、或0.1摩尔％至3.5摩尔％、或0.1摩尔％至3.0摩尔％、或0.5摩尔％至30.0摩尔％、或0.5摩尔％至25.0摩尔％、或0.5摩尔％至20.0摩尔％存在。或0.5摩尔％至10.0摩尔％、或0.5摩尔％至5.0摩尔％、或0.5摩尔％至4.0摩尔％、或0.5摩尔％至3.5摩尔％、或0.5摩尔％至3.0摩尔％存在。
本发明的一个优点是可以使用以其它方式不能用作“游离”活性剂的活性剂。例如，已知某些抗生素与血清蛋白结合的程度使其功效显著降低。或者，当在细菌细胞中时，一些活性剂对靶标具有活性，但它们不能穿过细菌膜。本方法提供了一种脂质载体颗粒，其保护活性剂免于降解或不期望地与血清蛋白结合，并且还改善了向细菌或真菌细胞中的递送。
应了解，术语“药剂”或“活性剂”可包括呈医药学上有效或可接受的盐形式的活性化合物。
在本文的任何实施例中，活性剂不是金属纳米晶体。
因此，在一个实施例中，提供了一种非层状溶致液晶相颗粒，其包含一种或多种促融合两亲性脂质，并且所述颗粒包封活性剂，其中颗粒包含：(i)约1.0至约3.0之间的平均CPP；(ii)大于0mV的ζ电位；(iii)以及在0℃至40℃之间下约10Pa s-1至约1e6Pa s-1之间的动态粘度。
在此类实施例中，平均CPP值可以在约1.0至约2.5之间、更优选在约1.0至约2.0之间、甚至更优选在约1.0至约1.75之间、还更优选在约1.0至约1.5之间。
在实施例中，提供了一种非层状溶致液晶相颗粒，其包含一种或多种促融合两亲性脂质，并且所述颗粒包封活性剂，其中颗粒具有：(i)约-0.10nm-1至约-0.55nm-1之间的内部曲率诱导的展曲(ii)大于+0mV的ζ电位；(iii)以及约至约之间的晶格参数。
在实施例中，非层状溶致液晶相颗粒具有50nm至450nm、80nm至400nm、100nm至300nm或120nm至300nm之间的粒径。
优选地，非层状溶致液晶相颗粒是立方晶颗粒。
优选地，活性剂是革兰氏阴性细菌活性剂或分枝杆菌抗细菌活性剂或抗真菌剂中的一种或多种。
合适地，非层状溶致液晶相颗粒(在一个实施例中是立方晶纳米载体颗粒)包含一种或多种带正电荷的脂质或稳定剂。
在第二方面，提供了一种药物组合物，其包含脂质载体，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的，脂质载体可以是第一方面的非层状溶致液晶相颗粒。
合适地，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂可以是或包括稀释剂、溶剂、pH缓冲剂、粘合剂、填充剂、乳化剂、崩解剂、聚合物、润滑剂、油、脂肪、蜡、包衣、粘度调节剂、助流剂等中的一种或多种。
稀释剂可包括微晶纤维素、乳糖、甘露醇、磷酸钙、硫酸钙、高岭土、干淀粉、糖粉等中的一种或多种。粘合剂可以包括聚维酮、淀粉、硬脂酸、树胶、羟丙基甲基纤维素等中的一种或多种。崩解剂可以包括淀粉、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、淀粉羟乙酸钠等中的一种或多种。溶剂可以包括乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、丙酮、甲乙酮、二氯甲烷、水等中的一种或多种。润滑剂可包括硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、氢化植物油、甘油二十二烷酸酯等中的一种或多种。助流剂可以是胶体二氧化硅、滑石或玉米淀粉等中的一种或多种。缓冲剂可以包括磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂和碳酸盐缓冲剂，但不限于此。填充剂可以包括一种或多种凝胶，包括明胶、淀粉和合成聚合物凝胶，但不限于此。包衣可包含成膜剂、溶剂、增塑剂等中的一种或多种。合适的成膜剂可以是羟丙基甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、丙烯酸酯等中的一种或多种。合适的溶剂可以是水、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、丙酮、甲基乙基酮、二氯甲烷等中的一种或多种。增塑剂可以是丙二醇、蓖麻油、甘油、聚乙二醇、聚山梨醇酯等中的一种或多种。
参考《辅料手册(Handbook of Excipients)》第6版,Eds.Rowe,Sheskey和Quinn(药学出版社(Pharmaceutical Press))，其提供了可根据本发明使用的赋形剂的非限制性实例。
应当理解，药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的选择将至少部分地取决于制剂的施用模式。仅作为实例，组合物可以是片剂、胶囊、囊片、粉末、可注射液体、栓剂、缓释制剂、渗透泵制剂的形式或对于施用有效且安全的任何其它形式。
优选地，药物组合物是第一方面的颗粒的液体分散体。液体分散体可以是水性分散体。液体分散体可以包封在已知用于递送液体制剂的标准胶囊中。
合适地，药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的疾病、病症或病状，如本文进一步描述的。
在第三方面，提供了一种用于活性剂的控制释放的方法，其包括以下步骤：形成第一方面的非层状溶致液晶相颗粒；以及将所述非层状溶致液晶相颗粒施用至目标区域。
在实施例中，目标区域可以是革兰氏阴性细菌感染，或分枝杆菌感染，或真菌感染。感染可以在哺乳动物体内。
在第四方面，提供了一种用于形成第一方面的非层状溶致液晶相颗粒的方法，其包括以下步骤：(i)提供一种或多种促融合两亲性脂质；以及(ii)在活性剂存在下，将所述一种或多种促融合两亲性脂质暴露于溶液。
溶液可以是水溶液。
在实施例中，可以将溶液调整为更适于使用疏水性活性剂。例如，可以使用溶剂共混物。
如所讨论的，由于在非层状LLC颗粒的复杂内部结构内捕获活性剂，第一方面的颗粒可以提供活性剂的期望的释放曲线。
第一方面的颗粒可以以多种方式形成，具体取决于所需的组成。简言之，所选择的促融合脂质可以与适当的活性剂组合，然后暴露于例如水溶液以引发自组装。典型地，稳定剂也将包括在水溶液中。稳定剂如泊洛沙姆和普朗尼克可以是合适的，包括上述那些。
如果需要在颗粒中包含另外的带电组分，那么DOTAP或类似的带电物质可以与促融合脂质和活性剂一起被包括。
可以选择这些组分的性质以影响最终颗粒产品的中间相，其又将影响活性剂的释放曲线。
目标区域可以是期望递送活性剂的任何区域。典型地，目标区域将在诸如人类受试者的受试者的生物样品或组织或流体内。例如，目标区域可以是感染有细菌感染的组织，通过第一方面的颗粒将抗细菌剂递送到该组织。
应当理解，最终的释放曲线可以通过具有相同活性物质的不同释放曲线的第一方面的许多不同颗粒来最佳地实现。例如，可以选择上述参数以提供两种不同的颗粒群。一个群体可以是立方晶群体，另一个是六方晶群体，各自携带抗细菌剂。不同的群体可以分开或一起施用，并且由于不同的内部结构和不同的促融合脂质，它们可以以不同的速率递送抗细菌剂以在更长的时间窗内实现治疗效果。
可替代地，不同的群体可以包含不同的抗细菌剂，其中第一方面的颗粒的结构适合于相关的活性物质。
在第五方面，提供了一种用于治疗或预防疾病、病症或病状的方法，该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用治疗有效量的第一方面的非层状溶致液晶相颗粒或第二方面的药物组合物，从而治疗或预防所述疾病、病症或病状。
在第六方面，提供了第一方面的非层状溶致液晶相颗粒或第二方面的药物组合物在治疗或预防疾病、病症或病状中的用途。
在第七方面，提供了第一方面的非层状溶致液晶相颗粒在制备用于治疗疾病、病症或病状的药物中的用途。
如本文通常使用的，术语“施用”或“给予”等描述了将相关颗粒或组合物例如通过特定途径或媒介物引入哺乳动物。施用途径可包括局部、肠胃外和肠内施用途径，包括口服、口腔、舌下、鼻、肛门、胃肠、皮下、肌内和皮内施用途径，但不限于此。
“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指将相关颗粒或组合物施用于受试者以至少改善、减少或抑制受试者经历的疾病、病症或病状的现有体征或症状达到医学状况根据临床上可接受的标准得到改善的程度。例如，“治疗细菌感染”是指在患者体内减少感染，或根除感染，或减轻感染的症状，其中用临床上可接受的标准化测试和/或经验测试(包括拭子样品测试等)评价改善和减轻。
“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防性(preventative)”是指将相关颗粒或组合物预防性地给予未表现出疾病、病症或病状的体征或症状，但在没有预防的情况下预期或预期可能表现出此类体征或症状的受试者。预防性治疗可至少减轻或部分改善预期症状或体征。
如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指施用一定量的相关颗粒或组合物，其足以预防所治疗病状的症状的发生，或足以使症状恶化停止，或足以治疗和减轻或至少降低症状的严重程度。有效量将以本领域技术人员理解的方式随患者年龄、性别、体重等而变化。合适的剂量或剂量方案可通过常规试验或基于经由第一方面的颗粒递送的活性物质的当前治疗方案来确定。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“患者”可指需要治疗的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。合适的脊椎动物包括但不限于灵长类、鸟类、家畜动物(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如，猫、狗)和圈养的野生动物(例如，狐狸、鹿、小猫)。优选的受试者是需要治疗本文所述的疾病、病症或病状的人。然而，应当理解，上述术语并不意味着症状必然存在。在一个实施例中，受试者是被治疗细菌感染，特别是革兰氏阴性细菌感染的人。
如本文所用，术语“共同疗法”和“组合疗法”应意指通过以任何合适的方式同时、依序、分开或在单一药物制剂或组合中施用如本文所述的一种或多种颗粒或组合物和一种或多种用于治疗疾病、病症或病状的药剂来治疗有需要的受试者。当以分开的剂型施用时，每种化合物每天施用的剂量数可以相同或不同。用于治疗疾病、病症或病状的相关颗粒或组合物和一种或多种活性剂可以通过相同或不同的施用途径施用。
如上所述，可以形成显示不同结构的第一方面的颗粒，并且这些颗粒用于递送相同或不同的活性剂。这可能是特别合适的，例如，如果治疗多菌株细菌感染，可以基于颗粒的形态对于递送相关活性物质和/或与特定菌株融合或粘附的能力最佳来选择两种或更多种颗粒。
在实施例中，所述疾病、病症或病状可以是与微生物相关或由微生物引起的疾病、病症或病状，微生物选自革兰氏阴性细菌，包括分枝杆菌和真菌。
为了本公开的目的，分枝杆菌被认为是革兰氏阴性细菌。尽管分枝杆菌被认为具有例示革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁，但关键的分枝杆菌如结核分枝杆菌可被认为在基因组上比革兰氏阳性细菌更接近革兰氏阴性细菌：https://doi.org/10.1054/ tube.2002.0328，因此在本文中遵循该术语。不希望受理论束缚，注意到细胞壁的主要共同组分是肽聚糖，其存在于几乎所有细菌中并且负责保护细胞的完整性。分枝杆菌(复合细胞壁)的独特特征是公认的具有异常强疏水特性的药物靶标。关键的核心单元壁结构由三个主要部件组成：阿拉伯半乳聚糖多糖、肽聚糖和外层长链、分枝菌酸。大约60％的分枝杆菌细胞膜由脂质组成。在本文中已经显示，分枝杆菌细胞壁适于使用第一方面的颗粒递送活性剂。
在一个具体实施例中，所述疾病、病症或病状是对使用抗细菌剂(包括抗生素和/或抗真菌剂)的治疗有响应的疾病、病症或病状。也就是说，所述疾病、病症或病状是革兰氏阴性细菌感染和/或真菌感染。
在一个实施例中，所述疾病、病症或病状由病原体引起或与病原体相关。病原体可以是革兰氏阴性细菌或能够感染哺乳动物的真菌。
在所治疗的感染是革兰氏阴性感染的实施例中，致病病原体可以选自由以下组成的组：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、军团菌属(Legionella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、嗜血杆菌属(Hemophilus)和巴尔通氏菌属(Bartonella)。
在实施例中，革兰氏阴性细菌可选自由大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌组成的组。
真菌的非限制性实例包括念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)和曲霉属(Aspergillus)物种，但不限于此。在实施例中，与所述疾病、病症或病状相关或引起所述疾病、病症或病状的真菌选自由白色念珠菌、光滑念珠菌(C.glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、热带念珠菌(C.tropicalis)、都柏林念珠菌(C.dublinensis)、克柔念珠菌(C.krusei)、鲁希特念珠菌(C.lusitaniae)、耳念珠菌(C.Auris)、新生隐球菌(C.Neoformans)、烟曲霉(A.fumigatus)组成的组。
本发明人已经发现，本公开的颗粒提供了有利的性质，其导致与革兰氏阴性细菌和真菌的融合事件，但不遵循与革兰氏阳性细菌的类似融合事件，并且因此，虽然一些活性剂仍可以递送至革兰氏阳性细菌，但它们显示出针对革兰氏阴性和真菌物种具有最佳功效。
在本文的任何方面或实施例中，活性剂可以是疏水性活性剂。
在实施例中，活性剂是疏水性抗细菌或抗真菌活性剂。优选地，疏水抗细菌活性剂是革兰氏阴性疏水抗细菌活性剂。
这样的活性剂是本领域公知的，并且常用于对抗革兰氏阴性细菌和真菌感染。本公开内容提供了一种用于此类已知的抗细菌剂和抗真菌剂的改进的递送媒介物，因此本领域技术人员基于本公开内容将不难选择用于负载本公开内容的颗粒的合适的活性物以用于随后递送至感染部位。
当活性剂是抗真菌剂时，抗真菌剂可以选自唑类、棘白菌素类(Echinocandins)和两性霉素B。前两类是真菌细胞壁成分的抑制剂(分别为麦角固醇和葡聚糖)，而后者结合麦角固醇。
在实施例中，活性剂选自由利福平、夫西地酸、氨苄西林(Ampicillin)、哌拉西林、庆大霉素、万古霉素(Vancomycin)、菲律宾菌素、两性霉素B、苄青霉素、美罗培南、克拉霉素、新生霉素、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素(Streptomycin)、氟康唑(Fluconazole)、伊曲康唑(Itraconazole)和异烟酰胺组成的组。应当理解，这样的活性剂仅是代表性的。
应当理解，在非层状溶致液晶相颗粒与革兰氏阴性细菌或真菌的外层或膜之间的融合事件之后，抗细菌剂或抗真菌剂被释放到革兰氏阴性细菌或真菌中。也就是说，革兰氏阴性细菌或真菌感染的治疗不是活性剂在病原体附近或邻近病原体的扩散释放。相反，第一方面的非层状溶致液晶相颗粒与病原体外壁、层或膜的融合允许活性剂直接释放到病原体中。
在第八方面，提供了一种用于将活性剂递送至生物靶标的方法，其包括以下步骤：施用第一方面的非层状溶致液晶相颗粒。
在一个实施例中，被递送的活性剂可以是检测剂，因此递送方法可以是检测方法。
检测剂可以是标签、探针或染料。
第一方面的颗粒活性剂和生物靶标可以如先前针对以上方面中的任一方面所述。生物靶标优选为来自患者的生物样品或体内组织、器官或流体。在实施例中，患者可能具有细菌感染。
将活性物质包封在第一方面的颗粒内可提供一种或多种益处，包括改善活性物质的溶解度或掩盖溶解度问题；保护活性物质免受体内破坏或修饰；影响受试者体内的循环时间；降低所述包封活性物质的细胞毒性；并且由于更有效地递送到靶细胞中而减少所需剂量。
在其中第一方面的颗粒用于治疗革兰氏阴性细菌感染的实施例中，颗粒不以任何显著的程度通过胞吞作用进入细菌。换言之，当第一方面的颗粒用于治疗革兰氏阴性细菌感染时，则在颗粒与细菌膜融合之后、并且由于颗粒与细菌膜融合而递送活性剂。
应当理解，在真核细胞的情况下，吸收通过包封和内化许多已知纳米载体或治疗剂的许多胞吞途径来调节。尽管是内化的，包括转运到溶酶体的细胞过程经常导致载体和任何包封的治疗剂分解，导致治疗效率低。然而，由于其固有的脂质双层基序，第一方面的颗粒可通过利用不同的内化机制，即颗粒的双层基序与外部细胞壁或内部内体的膜融合破坏这些过程。第一方面的颗粒与细胞膜的直接亲和力可以通过它们共有的自组装性质来合理化。虽然聚合物或无机纳米载体由束缚分子的键构成，但是非层状LLC颗粒是由分子间相互作用形成的物体。因此前者需要显著更大的膜扰动以用于内化。非层状LLC颗粒内的组成脂质的表面曲率增加可以特别地促进双层融合。结构上，酵母细胞具有与革兰氏阴性细菌相似的内脂质膜，被几丁质\葡聚糖和蛋白质的外层包裹。
在本发明的第九方面，提供了一种用于诊断哺乳动物的疾病、病症或病状的方法，其包括以下步骤：向哺乳动物或从哺乳动物获得的生物样品施用第一方面的非层状溶致液晶相颗粒或第二方面的组合物，从而促进哺乳动物的疾病、病症或病状的诊断，其中第一方面的非层状溶致液晶相颗粒内的活性剂是标记的活性剂。
从本文所示的结果可以理解，染料或标记的试剂可以被递送至一系列哺乳动物细胞，因此第一方面的颗粒可用作检测试剂。还可以设计颗粒以掺入分子标签或靶向部分，使得它们靶向特定细胞类型或受体。
以下实验部分更详细地描述本发明的某些化合物的表征及其功效。目的是说明本发明化合物的某些具体实施例及其功效，而不以任何方式限制本发明。
实验
参考表
命名约定
关于下文中使用的附图和符号，使用以下：成分_脂质-改性剂_脂质-药物，例如MO-DOTAP-1NOVO，意指甘油一油酸酯作为主要脂质，另外通过DOTAP改性，并且包封1摩尔％的新生霉素作为活性剂。
绘图/数据/实验惯例
浓度以μg/ml为单位，是使用的药物浓度。存活力通常通过细胞生长对不同浓度的抑制百分比来评估。更高的数量等于更多的死细菌。在一些实例中，通过菌落形成单位(CFU)计数来评估存活力。更低的数量等于更多的死细菌。
材料
甘油一油酸酯(MO)(97％，Sigma)、普朗尼克F127(Sigma)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)(99％，Avanti)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(99％，Avanti)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)(99％，Avanti)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOTAP)(99％，Avanti)、TOAB(99％，Sigma)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(花青5)(Cy-5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺若丹明B磺酰基)(99％，Avanti)、十八烷基若丹明氯化物(R18)(Thermofisher)、乙醇(AR)、异丙醇(AR)按原样使用而无需进一步纯化。肽葡聚糖提取物(来自金黄色葡萄球菌)和脂磷壁酸(来自金黄色葡萄球菌)按原样通过制备1mg/ml分散体来使用。利福平(98％，Sigma)、夫西地酸(98％+，Sigma)、氨苄西林(Sigma)、哌拉西林(Sigma)、庆大霉素(Sigma)、万古霉素(Sigma)，菲律宾菌素(Sigma)、两性霉素B(Sigma)、苄青霉素(Sigma)、美罗培南(Sigma)、克拉霉素(Sigma)、新生霉素(Sigma)、乙胺丁醇(Sigma)、异烟肼(Sigma)、链霉素(Sigma)和异烟酰胺(Sigma)。
McFarland 0.5硫酸钡浊度标准：
为了标准化接种密度，使用BaSO4浊度标准(0.5McFarland标准)。该程序由以下步骤组成：
(1)通过向99.5mL的0.18摩尔/L H2SO4(1％v/v)中加入0.5mL的0.048摩尔/LBaCl2(1.175％w/v BaCl2×2H2O)来制备该浊度标准品。
(2)使用1-cm光路的分光光度计和配套比色皿测定吸光度，验证浊度标准品的正确密度。对于0.5McFarland标准，625nm处的吸光度应为0.08至0.10。
(3)将4mL至6mL分配到与用于生长或稀释肉汤培养物接种物的那些相同尺寸的螺旋盖管中。
(4)将这些管紧密密封并在室温下避光保存。
(5)在即将使用前在机械涡旋混合器上剧烈搅拌该浊度标准品。
(6)在制备后3个月更换标准品或重新检查其密度。
确定活性物质对颗粒的影响并优化颗粒设计
颗粒制备：将脂质组分(例如，甘油一油酸酯，50mg)与活性剂(例如Cy5，0.1mg)在乙醇(0.5ml)中混合。将溶液在真空烘箱中干燥至少12小时。均质脂质混合物通过稳定剂溶液(例如，0.5重量％F-127嵌段共聚物)水合。通过探针超声处理(Branson超声波仪250，50％工作循环，5分钟)分散该混合物，得到5重量％的立方晶分散体。可以在脂质混合阶段引入脂质组成和包封载物的变化。稳定剂和改变的脂质组分可用于尽量减少任何不希望的相变、释放曲线或下文概述的胶体稳定性的总体降低。
将在应用前表征颗粒的胶体性质。颗粒尺寸和ζ电位将通过动态光散射(DLS)测定。颗粒的内部纳米结构将通过SAXS测定。将对纯颗粒和各包封制剂进行该表征。在接触病原体靶之前，颗粒需要较低的游离药物释放速率。在无限吸收(infinite sink)条件下使用UV-吸光度测量测定来自透析样品的包封药物的释放。通过在缓冲液(例如，PBS)、培养基(DMEM)和LB肉汤存在下重复胶体和释放实验来确定对生物培养基的反应，以提供与常规实验室实验相反的背景，以及通过含有血清蛋白的溶液来模拟体内条件。随后确定特定蛋白质的影响。暴露于生物培养基后的蛋白质表征，通过SDS page凝胶电泳筛选与颗粒结合的蛋白质，每个颗粒/环境组合使用至少3次重复。等温滴定量热法(ITC)将用于量化单个生物分子对颗粒的亲和力。一般筛选使用2μL/360秒，然而注射体积和等待时间将针对各自的热特征进行优化。将在(10μM至100μM)上筛选浓度的影响。将在目标1中概述的温度下重复ITC，并且每个目标重复至少三次。将进行稀释实验作为对照。
一般程序：通过将脂质例如甘油一油酸酯(总计约50mg)混合在乙醇(1ml)中来制备立方晶/六方晶。为了包括电荷，在脂质混合相中包括DOTAP或TOAB以产生1摩尔％，例如(MO 49.5mg，DOTAP 0.93mg)。对于药物负载，将诸如Rif(3.46mg)和Fus(2.17mg)的抗生素分别包括在样品MO-DOTAP-3Rif和MO-DOTAP-3Fus的脂质混合相中。随后将溶液在真空烘箱中干燥至少12小时。用F-127溶液(1mL，5mg/mL)水合均质脂质混合物。通过探针超声处理(Branson超声波仪250，50％工作循环，3秒开5秒关，5分钟总持续时间)分散混合物，得到约5重量％的立方晶分散体。
示例DOPE负载：MO-10PE-1DOTAP-甘油一油酸酯(40mg)、DOPE(9.91mg)、DOTAP(0.93mg)、MO-20PE-1DOTAP-甘油一油酸酯(32.5mg)、DOPE(16.7mg)、DOTAP(0.93mg)、MO-30DOPE-1TAP-甘油一油酸酯(26mg)、DOPE(24mg)、DOTAP(0.93mg)、MO-40DOPE-1TAP-甘油一油酸酯(21.5mg)、DOPE(28.2mg)、DOTAP(0.93mg)、MO-1DOTAP-1Rif-甘油一油酸酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、利福平(1.15mg)、MO-1DOTAP-2Rif-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、利福平(2.30mg)、MO-1DOTAP-3Rif-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、利福平(3.46mg)、MO-1DOTAP-4Rif-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、利福平(4.62mg)、MO-1DOTAP-1NOVO-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、新生霉素(0.86mg)、MO-1DOTAP-3NOVO-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、新生霉素(2.58mg)、MO-1DOTAP-5NOVO-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、新生霉素(4.29mg)、MO-1DOTAP-1PIP-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、哌拉西林(0.72mg)、MO-1DOTAP-3PIP-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、哌拉西林(2.17mg)、MO-1DOTAP-5PIP-单油酸甘油酯(49.5mg)、DOTAP(0.93mg)、哌拉西林(3.63mg)。
大肠杆菌O157:H7的基于MTS的细胞存活力测定
大肠杆菌O157:H7的纯培养物获自澳大利亚的皇家墨尔本理工大学(RMITUniversity,Australia)的微生物培养物保藏中心。将菌株维持在营养肉汤(NB)和营养琼脂(NA)(澳大利亚的Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich,Australia))中。注射器过滤器(0.45μm，PES)购自澳大利亚的Millipore公司(Millipore,Australia)。无菌Technoplas皮氏培养皿购自澳大利亚的Interpath Services公司(Interpath Services,Australia)。MTS测定试剂盒(Promega CellTiter 96单水溶液)购自Promega公司。
细胞存活力测定
基于线粒体琥珀酸脱氢酶活性的平均值，使用MTS测定试剂盒测定细胞存活力。
大肠杆菌O157:H7和铜绿假单胞菌(ATCC 2835)细菌细胞在10mL无菌塑料螺旋盖离心管内的营养肉汤(NB)培养基中培养，光密度(O.D600)为0.5至0.6，并在37℃下以150rpm振荡生长。
针对大肠杆菌O157:H7和铜绿假单胞菌(ATCC 2835)菌株对于所有样品组一式两份进行细胞存活力测定实验。每组含有纯抗生素或负载抗生素的纳米颗粒。在二甲亚砜(DMSO)中制备纯抗生素储备溶液。将1％细菌接种物添加至含有DMSO(1％)的阳性对照和含有50μg/mL MO-基阳离子(DOTAP 1摩尔％)脂质纳米颗粒的阴性对照。使用无菌millex-GP注射器过滤器(0.45μm，PES，Millipore)过滤不同抗生素负载的纳米颗粒并用于实验。在接种时将游离抗生素(储备液5mg/mL于DMSO中)和具有预期浓度的负载抗生素的脂质纳米颗粒添加至5mL培养物(具有1％接种物)培养基中并孵育20至24小时，此时细菌生长在37℃下以150rpm振荡达到稳定期。
从每个样品中取出100μL细胞培养基，并分配在96孔板中。通过使用MTS测定试剂盒测量细菌细胞存活力。每100μL样品加入10μL MTS溶液，并在37℃下孵育2小时。使用酶标仪(SpectraMax，Molecular Devices公司)测量490nm处的吸光度。将从对照样品测量的吸光度设定为100％细胞存活力。因此，相对于该值调整所有其它样品数据。
大肠杆菌O157:H7的基于CFU的细胞存活力测定
最小抑制浓度(MIC)测定试验。大肠杆菌O157:H7的纯培养物获自澳大利亚的皇家墨尔本理工大学(RMIT University,Australia)的微生物培养物保藏中心。将菌株维持在营养肉汤(NB)和营养琼脂(NA)(澳大利亚的Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich,Australia))中。针对大肠杆菌O157:H7在所有样品组中一式两份进行MIC测定试验，每组含有游离利福平(或夫西地酸)或负载利福平(或夫西地酸)的本公开的纳米颗粒。对于每次重复，将50μL大肠杆菌过夜培养物稀释到5mL营养肉汤(NB)中，并在37℃下以150rpm振荡生长到0.5至0.6的光密度(O.D600)。在DMSO中制备游离利福平和夫西地酸储备溶液。阳性对照含有1％细菌接种物和DMSO(1％)，阴性对照含有50μg/mL MO-基阳离子(DOTAP 1摩尔％)脂质纳米颗粒。在使用前使用无菌millex-GP注射器过滤器(0.45μm)过滤负载利福平和夫西地酸的纳米颗粒。
用UV-Vis光谱法评价过滤前后药物的浓度。在乙醇中制备4mg/ml利福平储备溶液。在乙醇中制备10种浓度为0、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015、0.0078和0.0039mg/ml的标准系列稀释溶液，将340nm处的吸光度对相对浓度作图，得到标准校准曲线。在过滤之前和之后，将50μL负载利福平(3摩尔％或3.5mg/mL)的MO-基阳离子(DOTAP 1摩尔％)脂质纳米颗粒溶解在950μL乙醇溶液中。从利福平的标准曲线测量两种纳米颗粒样品(过滤之前和之后)的利福平浓度。发现过滤后利福平浓度比未过滤的样品低约5％。在接种时加入游离利福平(储备液5mg/mL于DMSO中)和负载利福平(3摩尔％或3.5mg/mL)药物的MO-基阳离子(DOTAP 1摩尔％)脂质纳米颗粒，浓度范围为0.05μg/mL至5μg/mL至5mL培养基。通过读取600nm处的吸光度以及通过测定培养24小时后的菌落形成单位(CFU/mL)来测量细菌生长，此时细菌生长达到稳定期。最小抑制浓度(MIC)定义为抑制细菌在营养琼脂平板(NA)上的任何生长超过90％的游离药物或纳米颗粒的最小浓度。
真菌细胞存活力测定
将白色念珠菌(ATCC10251)生物体从无菌小瓶传代培养到沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂上，并传代以确保纯度和存活力。整个孵育温度为35℃。
通过从24小时的白色念珠菌老培养物中挑取5个直径约1mm的菌落来制备接种物。将菌落悬浮于5mL无菌0.145-摩尔/L盐水(8.5g/L NaCl；0.85％盐水)。将所得悬浮液涡旋15秒，并通过加入足够的无菌盐水用分光光度计调节细胞密度，以将透射率提高至由0.5McFarland标准(下文给出)在530nm波长下产生的透射率。
该方法将产生1×106至5×106细胞/mL的真菌细胞储备悬浮液。通过1:100稀释，然后用RPMI 1640肉汤培养基1:20稀释储备悬浮液来制备工作悬浮液，这得到5.0×102至2.5×103个细胞/mL。
对所有样品组一式两份进行抗白色念珠菌菌株的细胞存活力测定试验。每组含有纯抗生素或负载抗生素的纳米颗粒。在二甲亚砜(DMSO)中制备纯抗生素储备溶液。将1％的细胞储备悬浮液添加至含有DMSO(1％)的阳性对照和含有50μg/mL MO-基阳离子(DOTAP 1摩尔％)脂质纳米颗粒的阴性对照。使用无菌millex-GP注射器过滤器(0.45μm，PES，Millipore)过滤不同抗生素负载的纳米颗粒并用于实验。在接种时将游离抗生素(于DMSO中储备5mg/mL)和具有预期浓度的负载抗生素的脂质纳米颗粒添加至5mL培养物(具有1％的细胞储备悬浮液)培养基中并孵育24至30小时，此时真菌细胞生长在35℃至37℃下达到稳定期。
从每个样品中取出100μL细胞培养基，并分配在96孔板中。通过使用MTS测定试剂盒测量真菌细胞存活力。每100μL样品加入10μL MTS溶液，并在37℃下孵育2小时。使用酶标仪(SpectraMax，Molecular Devices公司)测量490nm处的吸光度。将从对照样品测量的吸光度设定为100％细胞存活力。因此，相对于该值调整所有其它样品数据。
结果
与革兰氏阳性细菌的相互作用
评价进入两种革兰氏阳性细菌物种—蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，B.cereus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)的立方晶吸收。对于这些物种，估计肽聚糖的最外层分别为约50nm和23nm厚。使用全内反射荧光显微镜(TIRF)揭示立方晶的原位相互作用。可以通过在λex＝405nm处激发的其固有荧光观察细菌细胞，以蓝色显示。同时，用红色显示的磷脂染料18:1-Cy5(λex＝647nm)荧光标记立方晶。细菌本身在该波长(λex＝647nm)下显示出可忽略的荧光。图1显示了不存在荧光标记时细菌的代表性荧光图像。
在图2a中示出了显示荧光标记的立方晶吸收到蜡样芽胞杆菌中的间隔摄影序列。从图2a中的间隔摄影，溶液中的瞬态立方晶由白色箭头突出显示。在t＝8.7秒和14.5秒的帧之间，观察到立方晶(可见为亮圆形斑点)在整个溶液中移动，然后在t＝约14.9秒时粘附到蜡样芽胞杆菌表面。通过颗粒跟踪测定均方位移(Δr2)，并示于图2b中。在约8.7秒处的斜率的突然偏差(由虚线表示)与立方晶与细菌表面的附着一致。注意，在位移数据中，t＝0对应于立方晶的出现(最接近图2a中的间隔摄影中的帧8.7秒)。一旦附着，立方晶保持在细菌的表面上，甚至当立方晶在溶液中移动时也是如此。这也由图2b所示的位移跟踪显示，其中一旦附着，减小的梯度指示明显更大的胶体，即细菌-立方晶复合物的运动。图2c中的间隔摄影显示，在较长的时间(约3小时)内，观察到立方晶连续附着到蓝色细菌的表面(λex＝405nm)，作为亮红色斑点(λex＝647nm)。立方晶表现出长期稳定性，在数分钟的时间内保持尺寸和形状。
图2c至2d中的延长的间隔摄影表明，在许多小时后，来自立方晶的最初定位的荧光源已经逐渐扩散覆盖整个蜡样芽胞杆菌细胞。这在间隔摄影中通过红色信号的稳定增加而被定性地观察到。在图2e至2f中量化了这种行为。单个立方晶(图2e)的荧光强度(I)随时间指数衰减。以对数标度绘制数据显示两种不同的状态：第一个在大约15秒表征为-1/9的斜率，且在大约15秒和400秒之间为-1/2的主斜率，表示强度衰减，其中对于每个状态分别为I～t-1/9或I～t-1/2。该寿命与在真核细胞中观察到的吸收行为形成鲜明对比，其中立方晶似乎在10秒内融合。预期在附着的早期阶段，立方晶可以润湿表面，即蜡样芽胞杆菌的外部肽聚糖层。对于后面的部分(接下来的15秒)观察到的主要比例与点源释放在1维中的扩散预期的相关，C最大～t-0.5d，其中C最大是在时间t的最大浓度，dd是维数。通过立方晶成分脂质通过厚肽聚糖层向内扩散，这在概念上是合理的。
许多立方晶与细菌相互作用的累积效应反映在整个细胞的荧光强度中，其显示稳定增加(图2f)。在所有立方晶组合物中观察到荧光强度的增加。荧光强度增加的幅度和速率在MO和PT之间相当相似，然而对于带正电荷的立方晶存在显著的加速和更大的幅度。例如，孵育3小时后，观察到的MO-DOTAP立方晶(ζ＝+31mV)的强度是MO立方晶(ζ＝-12mV)的两倍。该增加可归因于与细菌的成功碰撞的数量增加，由带负电荷的蜡样芽胞杆菌膜和阳性立方晶表面之间的吸引潜力促进。
立方晶吸收到金黄色葡萄球菌中如图3所示。虽然较小的球形细菌在某种程度上更难观察到，但是它们确实始终如一地附着在表面上，这允许更清楚的颗粒跟踪。在图3a至3b中示出了两个代表性的间隔摄影。在第一系列中，在大约4分钟的过程中逐渐消散之前，可以观察到单个立方晶撞击表面。在第二系列中，观察到立方晶的数量增加，包括三个单个立方晶同时附着于下层细菌。在该系列中，清楚地观察到立方晶在约2至7分钟内降落和消散。间隔摄影表示立方晶通常保持它们的形状，但是在附着之后尺寸减小。然而，图3b中最下面的立方晶示出了立方晶横向覆盖区的明显收缩。
在相同的时差内(图3b)，尺寸和附着持续时间有一些变化，这归因于颗粒尺寸的变化。推测较大的立方晶具有强度增加的较大足迹，并且花费较长的持续时间来完全衰变。颗粒似乎在2至10分钟后消散。再次跟踪单个立方晶的峰值荧光强度随时间的变化，代表性曲线示于图3c。在图3c的插图中，对数标度上的数据证明了与约-1/3的斜率的相关性，其中一些点更接近-1/2。有趣的是，这种比例与蜡样芽胞杆菌观察到的相当一致。两种革兰氏阳性细菌的比例之间的相似性表明相互作用受外部肽聚糖层的存在支配。-1/3和-1/2之间的斜率变化可由几何差异引起。金黄色葡萄球菌相对于蜡样芽胞杆菌可用表面积减小，甚至可以导致融合立方晶之间的相互作用。然而，观察到的主要比例再次与通过肽聚糖外层的物质的1-d点源释放相关。
来自金黄色葡萄球菌的肽聚糖提取物用于进一步评价立方晶和细菌的外部肽聚糖层之间的相互作用。基于提取物和金黄色葡萄球菌本身之间的相似度，净提取物提供了肽聚糖壳，其保留了原始细菌的形状。在这种情况下，成像的分辨率比实时金黄色葡萄球菌稍微更加清楚(图3e)。球状颗粒通常存在于界面处的平面片或堆中。从间隔摄影(图3e)观察到许多立方晶围绕簇的周边累积。随着时间的推移，观察到红色荧光逐渐遍布簇域。与体外实验相反，立方晶似乎没有减少足迹或强度。
在类似实验中，通过包括另外的细胞壁组分来检验模拟物。在这种情况下，肽聚糖提取物与脂磷壁酸(LTA)提取物(50％w/w LTA：肽聚糖)孵育。与之前的结果形成鲜明对比的是，没有观察到立方晶附着于合并的提取物。图3h示出了立方晶附着于组合提取物的间隔摄影。金黄色葡萄球菌簇、肽聚糖和肽聚糖+LTA提取物之间的相对吸收在图3d中定量。通常，金黄色葡萄球菌簇本身表现出稳定的吸收，其中一些峰归因于新的立方晶的加入。这种逐渐增加再次反映了立方晶材料到金黄色葡萄球菌的吸收，与蜡样芽胞杆菌示出的先前的结果相关。相比之下，肽聚糖和肽聚糖+LTA提取物分别表现出增强的和受阻的吸收。似乎在肽聚糖层中广泛发现的LTA的存在阻碍了立方晶的附着，尽管其确切机制尚未阐明。
为了以更高的分辨率研究附着，对肽聚糖提取物和金黄色葡萄球菌进行SEM。(图3f、3g)。同样，提取物的几何结构与固定金黄色葡萄球菌相似。SEM图像显示，在用立方晶处理后，提取物体之间的粗糙度被清楚地淹没，表明立方晶材料已经扩散并吞噬提取物(图3f)。相比之下，在经处理和未经处理的金黄色葡萄球菌之间未观察到几何形状的显著差异。这可能反映了活细菌对颗粒的分解，或者可能反映了立方晶相互作用的定时，因为SEM仅在时间上捕获单个快照。对于经立方晶处理然后固定的金黄色葡萄球菌，SEM显示了净细菌的双峰分布和在细菌边缘由较小的圆形特征装饰的那些。在图3g中示出了两个代表性图像，其突出显示了细胞外部的球形特征。特征的尺寸(在左和右图中的290nm和220nm的横向直径)与立方晶的尺寸一致。此外，该位置与TIRF测量期间观察到的吸收位置一致。在图3g中，球形特征和金黄色葡萄球之间的表观接触角分别为约132°和120°。高接触角与TIRF测量中立方晶的最小铺展一致，尽管角度可能在固定期间通过物理处理改变。立方晶在真空中的物理稳定性归因于锇和戊二醛在MO中交联不饱和键和羟基。内部结构的任何细节将不会被SEM分辨，特别是在给定5nm溅射涂层的情况下。应注意，聚合和负染色先前已允许介观结构的TEM。这些结果表明难以接近革兰氏阳性细菌的治疗。
与革兰氏阴性细菌的相互作用
用大肠杆菌检测与革兰氏阴性细菌的相互作用。如金黄色葡萄球菌，大肠杆菌仍然很好地粘附在界面上。从图4a所示的间隔摄影，观察到立方晶在大约30分钟内连续附着。一旦附着，立方晶似乎逐渐褪色和收缩，主要表现如前所述的革兰氏阳性物种。虽然这些单一的立方晶相互作用是最常见的，也观察到涉及多个立方晶的相互作用，如图4b中的间隔摄影所示，其跨越约3小时的更大时间段。在0至约47分钟之间，观察到单个立方晶粘附于细菌表面。在此之后，在先前粘附的立方晶的顶部观察到二次吸附。在大约90分钟的帧中，观察到新的立方晶着落并促使荧光在细胞的大部分中扩散。在94分钟的帧时，整个细胞在立方晶波长处明亮荧光。在该序列的后一帧中，该过程被示出重复(大约175分钟)。这些序列表明，对于新的立方晶，立方晶污染的细菌区域是有利的着陆位点，可能通过将促融合脂质包含到细胞膜中而实现。此外，立方晶材料可以快速扩散通过整个大肠杆菌细菌。
通过检查单通道(λex＝647nm)上的吸收，可以更清楚地分辨快速吸收的事件。图4c中的简短系列突出了MO立方晶的情况。在上图中，在20秒时，小的圆形特征被解析为直径约100nm至200nm。突然地，3分钟后，该特征似乎诱导整个细胞体的荧光爆发。在图4d中示出了MO-DOTAP立方晶的类似事件，其中立方晶附着可以通过在单元体右中心的中心亮点来推断。如上所述，对于革兰氏阴性细菌，立方晶将首先与外质膜而不是肽聚糖层相互作用。在这种意义上，立方晶和革兰氏阴性细菌之间的相互作用与和哺乳动物膜的相互作用更平行。材料的快速扩散可以反映立方晶材料与外膜融合的能力。在图4e中，材料通过质膜的转移可以说是最清楚的。初始帧显示λex＝405nm处的信号通道，以突出细菌位置。在以下图像系列(λex＝647nm)中，可以观察到两个立方晶分别在10秒和20秒处着陆。30秒时，局部荧光在整个细菌中消散。有趣的是，在细胞周边观察到与染料在脂质膜中的位置一致的信号增加。在该系列中，快速相互作用和大量立方晶材料的组合使得可以分辨膜中材料的时间梯度。
图4f至4m中所示的SEM图像显示出与图4a中所示的那些明显相似的立方晶附着的图像。从该图像系列中，可以在大肠杆菌的表面上观察到几个不同的球形粗糙。图像中突起的尺寸在直径上从约400nm到约50nm变化。在与大肠杆菌表面的接触中，较大的立方晶与细菌表面的接触角似乎更高。这在图4g和4l中最明显，其中接触角看起来大于90°。与之相比，小的立方晶表现出更多的扩散和吞噬进入细菌表面。从尺寸的变化可以推断，每个立方晶在细菌内化的不同阶段被捕获，通过固定过程被有效冷冻。
个体大肠杆菌细菌的吸收速率通过定量荧光强度随时间的变化来评估。单个立方晶吸收事件的数量可以在图5a至5b中观察到，其分别是MO和MO-DOTAP立方晶的代表性结果。观察到许多强度峰，这可归因于立方晶与细胞的附着。在这两张图之间，立即可以看出MO-DOTAP导致归因于立方晶附着的峰的频率增加。这通常与先前对于蜡样芽胞杆菌所示的结果以及先前的脂质体结果一致，其中通过向脂质体中引入正电荷而使阻碍最小化。在图5c中集中于较窄的持续时间，红色曲线示出了具有来自立方晶附着的两个显著峰的峰强度曲线。灰色点显示记录的整个细胞区域的荧光强度。在每个立方晶附着事件后，峰强度衰减，而面积强度逐步增加。这些的组合显示被赋予的荧光从立方晶转移到细菌。此外，该结果清楚地证明了来自立方晶的负载成分的量化传递。
通过跟踪附着于大肠杆菌的各个立方晶随时间的强度，观察到与革兰氏阳性物种的额外差异。在对数标度上仍然显示指数衰减的同时，观察到两个状态，如两个斜率-1/6和-1所示(图5d)。在图5e中绘出了一个代表性结果，在图5f中绘出了对应的图像时间序列。这两个斜率表明立方晶与大肠杆菌的相互作用分两个阶段发生。给定荧光团在立方晶内的均匀分散体，强度I最大与立方晶尺寸(R)成比例，且质量(m)平衡可由 导出，其可在立方晶扩散到高度为h的2D脂质双层时由浓度梯度δc驱动。基于与扩展扩散长度(颗粒的接触印迹直径的一半，L/2)缠绕的2D扩散，δc随时间的演变与～t-3/2成比例；方程的积分得到I最大～t-1/6的最终强度比例，这提供了与在实验的早期阶段获得的数据的良好一致性。在图5f中，通过纳米载体斑点尺寸的逐渐减小和围绕细胞周边的清楚的强度梯度，可以定性地观察到融合。
在稍后的阶段，斜率逐渐过渡到值-1，表示I～t-1的比例。这种比例表明立方晶有效地以二维方式递送作为点源的材料。两步法可以推断为(1)融合到质膜中，和(2)通过细胞壁连续扩散。可以建立融合脂质和细菌之间的质量平衡为其中Fm和Fw分别代表脂质在外质膜和内细胞壁中的扩散。假设立方晶最初遇到质膜，其驱动质膜中的浓度梯度，融合在早期阶段占主导地位，Fm>>Fw，并且Fw可以忽略。然后，当膜中的脂质浓度逐渐增加时，通过内壁进入细胞内部的脂质转移增强。如图5d所示，对于寿命较短的相互作用，融合相占优势。然后在后面的阶段中，当材料从外膜通过内部肽聚糖层转变时强度衰减，其中立方晶作为点源。
预期包括常规抗生素(例如，β-内酰胺、安沙霉素(ansamycin))或抗微生物肽的抗微生物剂可以以与本文研究的磷脂染料类似的方式递送。假定包封的材料没有泄漏，应该通过附着的立方晶的数量来量化递送。以指数-1/2换算的对革兰氏阳性细菌的递送，与1-D点释放一致。对于革兰氏阴性细菌，两阶段方法包括指数为-1/6的初始融合，随后以指数为-1在2-D释放作为点源的载物，表明递送可能比革兰氏阳性细菌种更有效。这进一步得到以下观察结果的支持：所递送的化合物可以快速地遍布整个革兰氏阴性细菌，并且表明革兰氏阴性细菌的质膜有助于立方晶材料和细胞壁的整合。围绕该外膜的能力可以证明在将治疗剂递送至越来越有弹性的革兰氏阴性物种中是至关重要的。此外，包含降低对融合的能量屏障的促融合脂质应该进一步促进该过程。
图4c至4d中显示的快速荧光扩散的间歇发生，导致与两阶段模型的偏差。图6示出了在它们的附着期间表现出快速扩散的立方晶的强度对时间曲线的子集。通常，强度曲线遵循先前在图6a至6b中示出的比例，然而，这里每个曲线也具有强度的急剧下降，由曲线图中的箭头标记。该下降对应于荧光定位扩展到整个细菌的时间点。发生该下降所花费的时间是散发性的，并且没有对于所有的立方晶发生。在每种情况下，峰值荧光降低40％至50％，并且下降持续时间比通常观察到的衰减快(秒对分钟)。因此，由于减少了数据点的数量，该间歇过程的比例分析是不可行的；也就是说，对数图上显示的下降的指示斜率在大约-2.13至2.33之间变化。由于这些事件是不规则的，并且考虑到整个细菌变成荧光的，这些特定的立方晶(或部分立方晶)可能已经穿过整个细胞壁。与两阶段转运模型的偏差可以反映细菌分泌的酶的影响。Thorn等人最近证明脂肪酶的存在促进疏水性载物的突释。8
图7a示出了使用全内反射荧光(TIRF)的立方纳米载体和负载的脂质双层(SLB)之间的融合行为。该系列显示了立方晶材料的融合，最初观察到的是明亮的点，荧光在大约6.5秒内径向扩散。在真核细胞上使用同样的方法，可以直接观察和量化这些相互作用的动力学。实验显示在12小时内立方晶与细菌共定位。结果显示了立方晶转运进入革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的不同状态和差异，分别在图7b和7c中突出显示。图7d至7e中的快照显示了来自原位表面敏感测量的代表性结果，其允许区分立方晶和细菌，并观察个体立方晶-细菌相互作用。
在图7f的上部图像中，可以观察到真菌周围的红色荧光环。当真菌经历有丝分裂时，真菌膜变形以允许粘附的立方晶与质膜融合。如图7f的下部图像所示，可以观察到来自立方晶的红色荧光的广泛内化。合理预期细菌的相同设计标准将适用于真菌。
递送活性剂
新生霉素
新生霉素抑制参与DNA合成的酶。图8和9以及表2示出了由含有在表1中表示的抗生素新生霉素的立方晶制剂对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制。该图显示了每种制剂对新生霉素浓度(x轴)的抑制(y轴)。各制剂之间的总浓度相等。
对铜绿假单胞菌，新生霉素的所有包封制剂比自由溶解的(实心黑线)具有显著更多的抑制。
随着每个立方晶(或每个颗粒的药物分子)的药物浓度增加，抑制增加。覆盖范围(1摩尔％至5摩尔％)。该结果表明具有较高载药量的较少的颗粒比具有较低载药量的较多的颗粒更有效。
例如，在80μg/ml下，MO-DOTAP-1NOVO、MO-DOTAP-3NOVO、MO-DOTAP-5NOVO分别显示51％、55％和85％的抑制。游离抗生素达到13％的抑制。
包含次级药物夫西地酸，其为抑制蛋白质合成的抗生素/抑菌剂，也进一步增加抑制作用(加号与五边形)。
在实践中，由于穿过外质膜的渗透性有限，铜绿假单胞菌通常表现出对新生霉素的高抗性。当被包封时，增加的抑制归因于本文中通过立方相纳米颗粒证明的融合机制。
包含“促融合”脂质将促进融合吸收机制。包含高度弯曲的脂质，10摩尔％的DOPE，在所有浓度范围内平均增加57％的抑制。例如，MO-DOTAP-3NOVO和MO-DOTAP-10PE-3NOVO在60μg/ml下分别产生约48％和约85％。
由于与血清蛋白的结合导致血清中的高度失活，新生霉素在实际中不经常使用。相反，当新生霉素被包裹在立方晶中时，在血清白蛋白的存在下抑制似乎得到改善。
在人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和胎牛血清(FBS)存在下，使用MO-DOTAP-3NOVO评价抑制。图10表明，相对于自由溶解的抗生素(黑线)，包封保持了抗生素活性。虚线反映了MO-DOTAP-3NOVO在不存在当量负载(20μg/ml)的血清蛋白下的性能。
表1：含有新生霉素的制剂。
表2：用MO-DOTAP-3NOVO中的游离和包封的新生霉素处理后的大肠杆菌的CFU计数。更低的CFU数目指示结果改善或更多的抑制。最后一列显示了游离抗生素的CFU计数比立方晶处理中的CFU分数。
浓度(μg/ml) CFU游离 CFU立方晶 CFU_立方晶/CFU_游离
5 812 467 0.58
10 800 210 0.26
20 476 117 0.25
30 280 65 0.23
40 137.5 14 0.10
50 40 0 0
哌拉西林
哌拉西林是一种β内酰胺抗生素，其抑制肽聚糖的交联，导致细胞破裂。图11和12以及表4示出了由含有如表3中所表示的抗生素哌拉西林的立方晶制剂对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制。
对铜绿假单胞菌(图11)，哌拉西林的所有包封制剂比自由溶解的药物(实线)具有显著更高的抑制。
随着每个立方晶(或每个颗粒的药物分子)的药物浓度增加，抑制增加。
例如，MO-DOTAP-1Pip、MO-DOTAP-3Pip、MO-DOTAP-5Pip分别达到52％、59％和75％。
通过包含阳离子脂质DOTAP而引入正电荷大大增加了抑制作用。这可以通过具有约80％+抑制(菱形、十字、加号)的阳离子性质和不具有约50％的阳离子脂质(倒三角形、五角形、正方形)的颗粒分组观察到。
通过包含TOAB作为阳离子部分实现类似的抑制(十字与加号)。
对大肠杆菌(图12)，观察到相同的趋势。当包封浓度高于1摩尔％时，包封的哌拉西林超过游离抗生素的性能。
表4证明了哌拉西林对大肠杆菌的抑制，当包封在不同的关键成分脂质、甘油一油酸酯或植烷三醇的立方晶中时。制剂之间的性能相似。
表3：含有哌拉西林的制剂。
表4：含有1摩尔％哌拉西林的MO和PT立方晶制剂对铜绿假单胞菌的抑制百分比。
药物浓度[μg/ml] PT-PIP MO-1PIP-
0.01 6.85 12.32
0.05 12.26 17.73
0.50 17.91 24.96
1.00 26.27 35.3
5.00 39.23 45.89
10.00 47.59 50.57
25.00 65.05 60.43
50.00 72.84 71.76
美罗培南
美罗培南是β-内酰胺抗生素，其抑制细胞壁合成，导致细胞破裂和死亡。图13和14示出了含有如表5所表示的抗生素哌拉西林的立方晶制剂对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制。
对铜绿假单胞菌和大肠杆菌，美罗培南的所有包封制剂比自由溶解的药物(实心黑线)具有显著更多的抑制。
随着每个立方晶(或每个颗粒的药物分子)的药物浓度增加，抑制增加。在美罗培南的情况下，这种影响在3摩尔％至5摩尔％之间表现出饱和。
通过包含阳离子脂质DOTAP而引入正电荷大大增加了抑制作用。这可以通过具有约80％+抑制(菱形、十字、加号)的阳离子性质和不具有约50％的阳离子脂质(方形、三角形、五边形)的颗粒分组观察到。
表5：含有美罗培南的制剂。
克拉霉素
克拉霉素抑制蛋白质合成。图15示出了含有如表6中表示的该抗生素的立方晶制剂对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制。
通过包含阳离子脂质DOTAP而引入正电荷增加了抑制作用。当以1摩尔％和3摩尔％包封在阳离子立方晶内时，与自由溶解的抗生素相比，包封的克拉霉素提供对大肠杆菌的增加的抑制。
在不存在阳离子脂质的情况下，制剂之间的性能基本上相等。
如图16所示，克拉霉素的增强作用可能是由于药物的沉淀而引起的。这可以通过制剂的其它变化来解决，以最小化这种影响。
表6：含有克拉霉素的制剂。
庆大霉素
庆大霉素是一种氨基糖苷，可阻断蛋白质合成，并可能对细菌细胞膜产生一些影响。图17和18示出了含有如表7中所表示的该抗生素的立方晶制剂对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制。
当包封时，抑制大大增强，与自由溶解的抗生素相比，在显著降低的浓度下实现峰值抑制。
当带电的脂质DOTAP或OA掺入到立方晶颗粒中时，观察到抑制增加10％至20％，这分别增加ζ电位和负曲率。
这种明显的对比可以归因于增强的输送，结合庆大霉素的作用方式，庆大霉素是浓度依赖性抗生素。它需要高浓度，而不是连续低浓度存在。
表7：含有庆大霉素的制剂。
双氯西林
双氯西林是一种窄谱的β-内酰胺抗生素，其抑制细胞壁合成，导致细胞破裂和死亡。双氯西林对革兰氏阴性细菌的活性有限。
图19示出了含有如表8中所表示的抗生素双氯西林的立方晶配制对大肠杆菌的抑制。使用他唑巴坦(β内酰胺酶抑制剂)的双重包封有效地使抑制加倍(正方形与三角形)，从而表明甚至通常不适合用于抗革兰氏阴性细菌的抗生素，当与第二活性剂组合使用时，也可用于本公开的方法中。
表8：含有双氯西林的制剂。
苄青霉素
苄青霉素是一种窄谱的β-内酰胺抗生素，其抑制细胞壁合成，导致细胞破裂和死亡。由于对β-内酰胺酶抗生素的固有抗性，苄青霉素对革兰氏阴性细菌具有活性。图20示出了含有如表9所示的抗生素苄青霉素的立方晶制剂对大肠杆菌的抑制。
当以3摩尔％包封时，与游离抗生素相比，苄青霉素产生抑制的增加，从而表明制剂的简单变化，如药物浓度/负载，可用于改善结果。
CFU测试显示当包封时，菌落计数进一步减少10-84％，通常随浓度增加(表10)。
表9：含有苄青霉素的制剂。
表10：当在不同水平的游离BP和MO-DOTAP-3BP下孵育时，大肠杆菌的CFU计数。
浓度(μg/ml) CFU游离药物 CFU立方晶 CFU_立方晶/CFU_游离
40 732.5 672 0.92
50 587.5 516.5 0.88
80 312.5 256 0.82
110 340 184.5 0.54
120 148.5 91.5 0.62
130 3 0 0
利福平
利福平抑制RNA合成。图21和22指出了含有如表11中所表示的抗生素利福平的立方晶制剂对大肠杆菌的抑制。
随着每个立方晶(或每个颗粒的药物分子)的药物浓度增加，抑制增加。该结果表明具有较高载药量的较少的颗粒比具有较低单个载药量的较多的颗粒更有效。该结果还表明包封大大增强了相同量药物的有效性。
注意到在4摩尔％的负载量下，抑制比3摩尔％的负载量减少。这种功能性损失归因于纳米颗粒中有序结构的损失，或更具体地，归因于较高药物浓度的促融合立方相介观结构的损失。
表11：含有利福平的制剂。
增大曲率
不希望受理论的限制，本文所述的抗生素活性剂的递送被提出通过自组装纳米颗粒和细菌膜的融合而发生。因此，包含促融合脂质应通过进一步减少发生融合的能量屏障来促进融合递送途径。对于利福平，这通过具有增加浓度的DOPE、高促融合脂质(表12)和存在阳离子脂质(表13)的一系列制剂来证明。
0％至20％(含)的DOPE的颗粒是立方相。而具有30％至40％DOPE的颗粒显示出六方对称性。随着DOPE 0-20(即0％至20％)的增加，颗粒的晶格参数从146降低到反映了颗粒曲率的增加。平均自发曲率从-0.161nm-1移动到-0.216nm-1。同时，观察到用1摩尔％利福平的抑制增加(图22和23)。例如，在2μg/ml下，抑制分别为14％、36％、60％。
结果证明包含促融合脂质增加了立方晶在抗生素递送中的有效性。用阳离子纳米颗粒也观察到这种趋势(图24)。相对于30％的DOPE，从具有40％的DOPE的制剂也观察到增加的抑制(图26和27)。这种增加对于阳离子纳米颗粒来说不太明显(图28和29)。
表12：含有不同曲率度的利福平的制剂。
表13：含有利福平的制剂，其由具有不同程度油酸的甘油一油酸酯或植烷三醇组成。
表14：通过与含有不同浓度利福平的MO-OA颗粒孵育，大肠杆菌的抑制百分比。
药物浓度[μg/ml] MO-10OA-1-RIF MO-30OA-1-RIF MO-50OA-1-RIF
1 2 3
0.05 6.86 0.75 1.57
0.1 9.94 6.05 4.75
0.5 15.68 12.42 11.75
1 20.39 19.08 21.93
2 28.52 22.03 28.89
3 35.48 26.53 35.52
5 41.38 35.66 40.98
10 47.34 45.03 47.34
表15：通过与含有不同浓度PT-OA立方晶孵育，大肠杆菌的抑制百分比。
氨苄西林
氨苄西林是β-内酰胺抗生素，它抑制肽聚糖的交联，导致细胞破裂。表17示出了含有如表16中所表示的抗生素氨苄西林的立方晶制剂对铜绿假单胞菌的抑制。
在0.5μg/ml至10μg/ml之间，包封的制剂显示出比游离抗生素多50％至70％的抑制。例如，在0.5μg/ml处，其为62％，与39％相比。由于药物的时间依赖性与浓度依赖性，在较高浓度下的增强停滞。
表16：含有氨苄西林的制剂。
表17：通过与不同浓度的MO-OA-氨苄西林立方晶孵育，铜绿假单胞菌的抑制百分比。
万古霉素
万古霉素是一种糖肽类抗生素，可抑制细胞壁的合成，由于跨膜的扩散障碍和靶标的改变，通常对革兰氏阴性菌株(例如，铜绿假单胞菌)没有活性。
表19示出了含有如表18中所表示的抗生素万古霉素的立方晶制剂对铜绿假单胞菌的抑制。在0.5μg/ml至20μg/ml的浓度下，包封的万古霉素产生至少2.7倍更多的抑制。在最低浓度0.5μg/ml时，包封产生16倍以上的抑制作用。这表明本方法的优点在于能够有效地递送和利用药物，这些药物通常由于难以跨细菌膜扩散而可能对革兰氏阴性细菌无效。
表18：含有万古霉素的立方晶制剂。
表19：通过与不同浓度的MO-OA-万古霉素立方晶孵育，铜绿假单胞菌的抑制百分比。(注：文献MIC(90％抑制)高度可变，通常为256μg/ml++)。
浓度μg/ml MO-10-OA-VANC 游离浓度μg/ml 抑制％
0.5 20.32 0.50 1.24
5 33.1 2.50 9.83
10 43.74 5.00 11.60
25 51.28 7.50 14.21
50 62.86 10.00 16.60
100 71.86 15.00 17.57
150 88.59 20.00 18.03
200 96.13 25.00 18.42
双药物负载
本公开的脂质颗粒的周期性三维拓扑有利于将多种药物货物包封在同一颗粒内。这在下面对于Novo-Fus、Rif-Fus和Pip-Fus的组合得到证明。
表20：通过包封新生霉素与新生霉素和夫西地酸的立方晶，对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑制。
表21：通过包封新生霉素与新生霉素和夫西地酸的立方晶，对大肠杆菌的抑制。
MO-3Rif-3fus MO-DOTAP-3％Rif 3％fus
23.83 28.05
27.97 31.66
50.3 39.13
52.06 45.91
54 53.03
55.4 60.24
63.23 66.66
70.27 72.82
表22：通过包封哌拉西林与哌拉西林和夫西地酸的立方晶，对铜绿假单胞菌的抑制。
MO-3PIP- MO-3Pip-3Fus
6.86 3.86
20.75 6.08
28.47 16.32
35.08 20.19
42.88 30.03
48.11 37.03
53.51 44.25
54.54 70.08
夫西地酸
夫西地酸是一种干扰蛋白质合成的抑菌剂。它是极度疏水的，因此对革兰氏阴性细菌的效用最小。当用于本公开的脂质颗粒中时，在大肠杆菌菌落形成单位(CFU)中观察到显著下降，特别是当浓度增加时，如图30所示。在Fus浓度超过0.1mg/ml时观察到CFU计数显著下降，在0.2mg/ml时减少一半以上。在图中用*表示的包封药物和游离药物各自的最小抑制浓度(MIC)分别为0.5mg/ml和1.5mg/ml。MIC是指达到90％细胞增殖抑制的最低浓度。再次注意到，由于分子尺寸和疏水性，Fus穿过外膜的转运差，因此通常具有有限的抗革兰氏阴性细菌活性。
对照
针对大肠杆菌和铜绿假单胞菌检测未负载活性剂的纳米颗粒的毒性。根据图31所示的结果，当没有包封抗生素时，脂质立方晶颗粒对细菌存活力的影响可忽略。
负载有基于MO的立方晶的抗TB药物的制剂
市售TB药物寿命短且清除速度快，这限制了它们的功效。为了增加抗结核药物的功效并提高结核病治疗的成功率，需要有效且稳健的递送系统，如本公开的脂质颗粒递送。
本实验评价了基于甘油一油酸酯(MO)的立方晶用于包封和递送单一抗结核药物(利福平、乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺和链霉素)对抗耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌H37Ra体外培养模型的潜力。
为了测试这一点，将五种抗TB药物利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素包封在MO立方晶中。疏水性药物利福平和异烟肼(其辛醇-水分配系数分别为4.24和-0.70)的包封导致Im3m相的晶格参数增加。利福平和15摩尔％异烟肼的载药量高达4摩尔％。结果如图32至35所示，其中图32表示耻垢分枝杆菌的MIC测定，图33表示耻垢分枝杆菌MIC下的细胞死亡。报道的Rif对胞内细菌的MIC值为4μg/mL至5μg/mL，并且发现在MO-Rif(1摩尔％)存在下对胞内细菌的MIC值为3μg/mL，而在MO-DOTAP(0.1摩尔％)存在下对胞内细菌的MIC值为1μg/mL。报告的细胞死亡值约为20至24小时。MO-Rif将MIC值的孵育时间从24小时减少到15小时，而MO-DOTAP(0.1摩尔％)-Rif(1摩尔％)将MIC值的孵育时间从24小时减少到6小时。
图34表示结核分枝杆菌H37Ra的MIC测定，图35表示结核分枝杆菌H37Ra在MIC下的细胞死亡。报道的Rif对胞内细菌的MIC值为0.04μg/mL至0.05μg/mL，并且发现在MO-Rif(1摩尔％)存在下对胞内细菌的MIC值为0.03μg/mL，而在MO-DOTAP(0.1摩尔％)存在下对胞内细菌的MIC值为0.015μg/mL。在MIC下细胞死亡的报告值为约8至9天。MO-Rif将MIC值的孵育时间减少到7至8天，而MO-DOTAP(0.1摩尔％)-Rif(1摩尔％)将MIC值的孵育时间从8天减少到5天。
因此，与游离药物相比，包封在立方晶中的利福平具有显著更大的杀灭效果，并且具有缩短无菌细菌培养物的生命周期持续时间的潜力。此外，通过加入阳离子脂质DOTAP(0.1摩尔％)引入正电荷显著增加了杀灭效果。抗TB药物利福平在阳离子立方晶中的包封改善了体外研究中的药物生物利用度，消除细菌负荷所花费的时间从3天减少到1天。这可以降低给药频率，并潜在地解决由于延长的TB药物治疗方案而导致的患者依从性差的困难。
表23：封装利福平(A)、异烟肼(B)、乙胺丁醇(C)、链霉素(D)和吡嗪酰胺(E)后MO立方晶所采用的相、晶格参数和尺寸。
表24：DOTAP掺入后MO立方晶的所采用的相、晶格参数和尺寸。
与真菌的相互作用
菲律宾菌素和两性霉素B
检测抗真菌剂对真菌菌株白色念珠菌的功效。菲律宾菌素和两性霉素B是通过从质膜除去麦角固醇而起作用的抗真菌剂，其促使细胞渗漏和死亡。化合物都是疏水性的，一些脂质复合物产物是可获得的。本公开的用于菲律宾菌素的所有包封制剂产生比游离药物增加的抑制(图36)。通过包含阳离子脂质DOTAP而引入正电荷大大增加了抑制作用。这可以通过具有阳离子性质的颗粒的分组(加号和五边形符号)和没有阳离子性质的颗粒的分组(三角形和正方形)观察到。
两性霉素的所有包封制剂产生的抑制作用至少与自由溶解的药物相当(图37)。包含阳离子脂质再次大大增加了抑制。与自由溶解的药物相比，达到98％抑制所需的浓度降低100倍，从10μg/ml降低到0.1μg/ml。
表25：含有1％菲律宾菌素、0/1％DOTAP(正电荷)、0/10％胆固醇的立方晶制剂。
表26：含有1％两性霉素B、0/1％DOTAP(正电荷)、0/10％胆固醇的立方晶制剂。
氟康唑
氟康唑通过削弱麦角固醇合成来控制真菌疾病，麦角固醇合成是真菌细胞膜的基本结构成分。然而，使用氟康唑的全身治疗引起两个显著的问题，即药物毒性和耐药性。
可电离氨基脂质的合成：使用4-(2-羟乙基)吗啉和油酸(OA)之间的酯化反应合成氨基脂质吗啉油酯(MOE/脂质-5)。简而言之，将氨基醇(1.1当量)加入到冷却的OA(1.0当量)于DCM、EDCl(1.1当量)和DMAP(0.2当量)中的溶液中。将反应温度在室温下搅拌24小时。使用旋转蒸发器除去溶剂，并通过快速硅胶柱纯化所得粗物质。通过核磁共振(NMR)成像(1H)分析确认合成的脂质结构。采用干脂质水化法制备了含氟康唑的脂质纳米粒和不含氟康唑的空纳米粒。通过溶解MO(20mg/1mL乙醇)和MOE(20mg/1mL乙醇)并将它们以70:30的比例混合并通过将其在真空烘箱中保持12小时除去乙醇来制备干膜。通过用1mL的F127(2mg于1mL的DI中的溶液)溶液水合所形成的干燥脂质来制备不含药物的空纳米颗粒。使用探针超声波仪(QSonica)以脉冲模式超声处理所得混合物5分钟，以获得不透明分散体。通过用1mL的含有F127和氟康唑(各2mg)的DI水水合形成的干燥脂质来制备氟康唑包封的制剂。使用探针超声波仪(Q Sonica)以脉冲模式超声处理所得混合物5分钟，以获得不透明分散体。
染色和生长条件：抗真菌氟康唑的新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)得自SA Pathology，并在-80℃储存在马铃薯葡萄糖(PD)肉汤中。使用前将真菌在马铃薯葡萄糖(PD)板中在37℃下培养过夜。使用接种环将细胞悬浮在PDB肉汤中，并使用UV-vis光谱仪将600nm处的光密度(OD600)调节至约2。将5μl的真菌悬浮液加入到最终体积为100μl的96孔板中，以获得约0.1的最终OD600浓度。
抗微生物剂试验：使用96孔板研究抗微生物剂的最小抑制浓度为不含氟康唑的药剂、不含药物的对照纳米颗粒和氟康唑包封的脂质纳米颗粒抑制50％(MIC-50)和90％(MIC-90)的耐氟康唑新型隐球菌的生长。将96孔板在UV-vis分光光度计中孵育24小时，并在220nm至1000nm的范围内收集光谱。总之，平板含有一定浓度范围的与真菌孵育的抗微生物剂，包括真菌对照、PD肉汤对照和抗微生物对照。该实验在pH 5.2和pH 7.1下进行。
结果
O2ME在pH-7.4下是中性的，并且在较低pH(4-6.0)下带正电荷，并且在较低pH下将引起头基膨胀和电荷排斥。在pH约7.4下将30重量％的O2ME掺入到MO中产生具有内六方相的六方晶。由于在较低pH值下的头基膨胀和电荷排斥，膜曲率减小并且中间相从六方变为立方。由于氟康唑耐药，单独用氟康唑治疗感染未能达到MIC-90，但具有立方结构和正电荷的胶囊化制剂在pH 5.17时的MIC-90值为123.015μg/ml，而在pH 7.08时为183.843μg/ml。SEM和共焦图像支持真菌壁的破坏，如图38所示。
表27：与单独的氟康唑和不含药物的对照纳米颗粒相比，负载氟康唑的纳米颗粒抑制50％(MIC-50)和90％(MIC-90)的耐氟康唑新型隐球菌生长的最小抑制浓度。
＊ND表示未测定为未达到90％抑制
表28：不同pH值下氟康唑负载纳米颗粒的内部中间相。
*N/S表示非散射峰；这可以是乳液。
参考文献列表
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Claims (28)

1.一种用于治疗或预防与革兰氏阴性细菌或真菌相关的疾病、病症或病状的方法，其包括以下步骤：向有需要的受试者施用治疗有效量的包含抗细菌剂或抗真菌剂的非层状溶致液晶相颗粒，所述非层状溶致液晶相颗粒包含一种或多种促融合两亲性脂质，从而治疗或预防所述疾病、病症或病状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是由革兰氏阴性细菌或真菌引起的感染。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒将所述抗细菌剂或抗真菌剂包封在其通道或褶皱内。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒是通过所述一种或多种促融合两亲性脂质的自组装而形成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒包含至少两种促融合两亲性脂质。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒已通过在活性剂存在下所述一种或多种促融合两亲性脂质的自组装而形成。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒具有选自由立方相、六方相和海绵相组成的组的体相。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒是立方晶。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒具有小于-0.05nm-1的内部曲率诱导的展曲
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒具有大于0mV的ζ电位。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒具有大于约50nm，任选地大于约100nm的粒径。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒包含至少一种稳定剂，任选地其中所述稳定剂以所述颗粒的6重量％至18重量％存在。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒包含一种或多种带正电荷的脂质，任选地其量在0.1摩尔％至小于20摩尔％之间。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒还包含非两亲性和/或非促融合带电化合物。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种促融合两亲性脂质选自呈现疏水性尾基的那些脂质，所述疏水性尾基选自由油酰基、亚油酰基、亚麻酰基、植酰基、法呢酰基和延长的脂肪族疏水性组成的组。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种促融合两亲性脂质选自呈现首基的那些脂质，所述首基选自由醇、羧基、多元醇、糖、酰胺、胺、乳酸酯、甘油基、双甘油基、配位络合物、己内酰胺、醚、乙酸酯、醌和其组合组成的组。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种促融合两亲性脂质可能选自由以下组成的组：1-甘油一油酸酯、2-甘油一油酸酯、香茅酯、油酰乳酸酯、油酰胺、甘油一反油酸酯、亚油酸、反油酸、甘油一棕榈酸酯、甘油一亚油酸酯、植烷三醇、甘油二油酸酯、甘油三油酸酯、二油酰甘油、双十二烷基二甲基溴化铵、双十八烷基(二甲基)氯化铵(DOAC/DODMAC)或双十八烷基(二甲基)溴化铵(DODAB)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-磷脂酰甘油(DOPG)、油酸、溶血-1-羟基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-二己基-磷酸胆碱、维生素E生育酚、维生素E(生育酚)乙酸酯、植酰基单乙醇酰胺、法呢酰基单乙醇酰胺、油酰基单乙醇酰胺、亚油基酰单乙醇酰胺和亚麻酰基单乙醇酰胺。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述非层状溶致液晶相颗粒包含至少两种促融合两亲性脂质时，则所述促融合两亲性脂质中的至少一种将选自甘油一油酸酯和植烷三醇。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗细菌剂是革兰氏阴性细菌抗细菌剂。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗细菌剂是革兰氏阴性细菌抗生素。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗细菌剂或抗真菌剂是疏水性的。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗细菌剂或抗真菌剂是两种或更多种抗细菌剂或抗真菌剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述两种或更多种抗细菌剂或抗真菌剂是在相同的非层状溶致液晶相颗粒内的两种或更多种抗细菌剂或两种或更多种抗真菌剂。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗细菌剂或抗真菌剂以所述颗粒的0.1摩尔％至30.0摩尔％存在。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是革兰氏阴性感染，则病原体选自由肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、军团菌属(Legionella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、嗜血杆菌属(Hemophilus)和巴尔通菌属(Bartonella)组成的组。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述疾病、病症或病状是真菌感染时，则真菌病原体选自由念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)和曲霉属(Aspergillus)组成的组。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述非层状溶致液晶相颗粒与所述革兰氏阴性细菌或真菌的外层或膜之间的融合事件之后，所述抗细菌剂或抗真菌剂被释放到所述革兰氏阴性细菌或真菌中。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非层状溶致液晶相颗粒包含甘油一油酸酯。
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