CN116983288A - 一种口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用，该制剂的有效成分为汉黄芩素及其药学上可接受的盐，并包括渗调节剂氯化钠、可实现汉黄芩素较高溶解度的氨基酸类物质以及水，采用雾化吸入的鼻腔给药方式，避免了胃肠道降解和血脑屏障，增强药物在大脑中的聚集及治疗效果，能够有效抑制脑胶质瘤，具有很好的临床应用前景。

Description

一种口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种药物制剂的用途，具体涉及一种口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

背景技术

我国脑胶质瘤年发病率为5～8/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。脑胶质瘤起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的40％-50％。2021年版WHO中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为1～4级，1、2级为低级别脑胶质瘤，3、4级为高级别脑胶质瘤。脑胶质瘤治疗以手术切除为主，结合放疗、化疗等综合治疗方法。胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM，4级)术后放疗联合替莫唑胺同步并辅助替莫唑胺化疗，是成人新诊断GBM的标准治疗方案。高级别脑胶质瘤预后差，生存率较低，低级别脑胶质瘤的5年生存率总体上为80％。

汉黄芩素(wogonin)是中药黄芩中的有效单体，研究发现它具有治疗脑胶质瘤的药理学活性[Tsai CF，Yeh WL，Huang SM，Tan T W，Lu DY.Wogonin induces reactiveoxygen species production and cell apoptosis in human glioma cancer cells.IntJ Mol Sci.2012；13(8)：9877-9892.]。然而，对于脑部疾病的治疗，药物必须能够克服血脑屏障的障碍。

现有技术中，还未有利用口鼻吸入汉黄芩素的方式治疗脑胶质瘤的研究。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

技术方案：本发明所述的口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

所述的应用，汉黄芩素包括如式(1)所示的汉黄芩素、及其药学上可接受的盐。

所述的应用，所述制剂是由汉黄芩素、及其药学上可接受的盐添加了药学上可接受的辅料所制成的包含汉黄芩素的制剂。

所述的应用，所述口鼻吸入用汉黄芩素制剂为可雾化后吸入的口鼻吸入制剂。

所述的应用，所述口鼻吸入制剂为液体制剂。

所述的应用，所述制剂的成分包括汉黄芩素、等渗调节剂氯化钠、可实现汉黄芩素较高溶解度的氨基酸类物质以及水。

所述的应用，所述可实现汉黄芩素较高溶解度的氨基酸类物质包括精氨酸、赖氨酸。

所述的应用，所述水为纯化水或注射用水。

所述的应用，所述口鼻吸入用汉黄芩素制剂的制备方法包括以下步骤：

将精氨酸溶于水中，溶清；加入处方量原料药汉黄芩素，加热，溶清；或可用枸橼酸调节pH值；

各组分含量范围：汉黄芩素含量为0.1-5.0％(w/v)，精氨酸含量为2％～10％(w/v)，枸橼酸含量为0.01％～0.05％(w/v)，pH值为7.0～11.0。

所述的应用，所述pH值为9～10。

所述的脑胶质瘤，是原位脑胶质瘤。

所述的脑胶质瘤，是原位接种U87细胞构建的小鼠脑胶质瘤模型。

鼻腔具有其独特的解剖结构优势：呼吸区域的三叉神经与脑内中枢神经系统相连，嗅觉区域存在连接脑组织与外部环境的有孔毛细血管，是血脑屏障最薄弱的地方。同时，鼻腔与口腔通过咽腔相连，经口吸入气溶胶时，一部分气溶胶可通过咽腔到达鼻腔，从而进入脑部。因此口鼻吸入的方式相比单纯的鼻腔给药，可进一步增加药物的递送量。因此，通过口鼻吸入的方法(图1)，具有将药物递送至中枢神经系统治疗脑部肿瘤、越过血脑屏障、提高生物利用度高、降低不良反应、降低创伤性的多项优势。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：汉黄芩素具有治疗原位脑胶质瘤的应用。在原位接种U87 MG-Luciferase构建的小鼠脑胶质瘤模型中，口鼻吸入用汉黄芩素能够显著抑制裸鼠原位胶质瘤在颅内的生长，减少肿瘤区域，并显著延长荷瘤小鼠的生存期。

附图说明

图1为制剂吸入至到达病区治疗过程示意图；

图2为吸入制剂空气动力学粒径分布图；

图3为新一代药用圆盘撞击器(NGI)组件示意图；

图4为小动物口鼻吸入暴露系统示意图；

图5为汉黄芩素口鼻吸入溶液在暴露塔内单位时间药量曲线图；

图6为口鼻吸入用汉黄芩素治疗脑胶质瘤气溶胶浓度变化图；

图7为口鼻吸入用汉黄芩素对转染了荧光素的脑胶质瘤在小鼠体内的生长水平的影响；

图8为图7的统计图和显著性差异分析；

图9为相比阴性对照组，口鼻吸入用汉黄芩素对脑胶质瘤组织和脑正常组织的病理影响(T代表肿瘤区域，N代表正常组织区域)；

图10为口鼻吸入用汉黄芩素对原位胶质瘤模型小鼠生存期的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种汉黄芩素口鼻吸入溶液的空气动力学粒径分布特性

汉黄芩素系黄酮类化合物，具备黄酮类化合物常规特点：水溶性差。

在本发明中，我们尝试加入精氨酸来提高汉黄芩素的水溶性，制备可用于口鼻吸入的溶液。研究表明：当处方中汉黄芩素含量为0.1-5.0％(w/v)，精氨酸含量为2％～10％(w/v)时，均可获得均匀的溶液。同时，为确保该溶液的pH值稳定在7.0～11.0范围，处方中可能需要加入一定量的枸橼酸，含量为0.01％～0.05％(w/v)。

本实施例中处方如下：

组成成分	口鼻吸入溶液1(23051201)
		汉黄芩素	10mg
精氨酸	40mg
		注射用水	2.5ml

制备方法：将精氨酸溶于水中，搅拌溶清后加入处方量原料得亮黄色溶液。

根据中国药典2020年版四部通则0951(吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法)要求，采用新一代药用圆盘撞击器(NGI)对口鼻吸入溶液1的空气动力学粒径进行检测分析(见图2)。

实验方法(见图3)：将新一代药用圆盘撞击器与人工喉组装并置于5℃冷却装置中预冷90min，并在微孔收集器(micro-orifice collector，MOC)放置滤膜，将新一代药用圆盘撞击器与真空泵连接。将人工喉与流量计连接，开启真空泵，调节流速为每分钟15L·min-1(±5％)，取下流量计。依次连接压缩机、雾化器、口含器和适配器，再将适配器与人工喉连接。精密量取药物溶液汉黄芩素2ml，置雾化器中，开启压缩机并计时，600s后关闭压缩机，取下雾化器，关闭真空泵。在1～7级和MOC级收集盘中分别精密加入收集液10mL，加盖振荡10min，作为1～8级；采用收集液清洗适配器、L型连接管，清洗至100ml中，作为第9级。采用收集液清洗雾化杯，采用溶剂清洗至100ml中，作为第10级。HPLC检测各级药量。

实验结果：结果见图2。

图2表明：该口鼻吸入溶液在气溶胶状态下的中值粒径为4.3μm，可吸入的微细粒子占比(FPF％)为57％，该比例有利于汉黄芩素充分发挥药效。

实施例2

一种含等渗调节剂的汉黄芩素口鼻吸入溶液的稳定性考察

本实施例提供一种含有等渗调节剂的汉黄芩素口鼻吸入溶液的稳定性考察。

处方和制备方法如下：

制备方法：将精氨酸、氯化钠(处方中若有)溶处方量水中，搅拌溶清得亮黄色溶液。

为防止等渗调节剂氯化钠的加入对汉黄芩素口鼻吸入溶液产生影响，本发明对比了是否加入氯化钠后的汉黄芩素含量变化，0天、10天含量结果如下表。

样品信息	测定浓度mg/ml	与0天对比
			20230411-01-0h	10.12	100.0％
20230411-01-24h	9.91	97.9％
			20230411-01-10天	10.05	99.3％
20230411-02-0h	10.23	100.0％
			20230411-02-24h	9.93	97.1％
20230411-02-10天	10.00	97.8％

结果表明：氯化钠的加入不影响汉黄芩素口鼻吸入溶液的含量。

实施例3

一种汉黄芩素口鼻吸入溶液的小动物口鼻吸入暴露实验

为考察汉黄芩素口鼻吸入溶液是否可获得稳定而持续气溶胶，本实施例提供一种汉黄芩素口鼻吸入溶液的小动物口鼻吸入暴露实验。

处方和制备方法如下：

制备方法：将精氨酸溶于水中，搅拌溶清后，加入处方量原料药溶清。必要时，用枸橼酸调节pH至9-10，得亮黄色溶液。

本实施例中采用小动物口鼻吸入暴露系统进行口鼻吸入研究。小动物口鼻吸入暴露系统(见图4)是一种通用的口鼻吸入实验方法。将药物经过气溶胶发生器后产生均匀的气溶胶，到达暴露塔后，实现不同动物的口鼻吸入，同时避免实验动物身体除口鼻外的其它部分暴露到气溶胶中。可用于液体药物口鼻吸入药效学研究、毒理初步研究等。

上述口鼻吸入溶液4、5经过小动物口鼻吸入暴露系统进行气溶胶发生。采用滤纸收集不同时间段的气溶胶，经HPLC测定含量。不同浓度、不同时间段的气溶胶浓度见下表和图5。

结果显示：不同浓度的汉黄芩素吸入溶液均可获得稳定的气溶胶。

实施例4

口鼻吸入用汉黄芩素对对原位接种U87 MG-luciferase的裸鼠脑胶质瘤模型的主要药效学作用研究

1.实验材料

(1)药物

实施例3制备的口鼻吸入用汉黄芩素溶液。

(2)实验动物

BABL/c裸鼠，5周龄，雄性，饲养于SPF环境，温度20～25℃，相对湿度30～70％，12：12h光暗照明；自由饮水及采食。

(3)试剂

1)D-荧光素钾盐：购自上海翌圣生物科技有限公司，-20℃保存。

2)DMEM/F12培养基：购自美国Gibco公司，使用前称取12g DMEM/F12培养基和2.438g NaHCO₃，溶解于1L超纯水中，搅拌均匀后经0.22μm滤器过滤后，4℃保存。

3)异氟烷：购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，室温避光保存。

2.实验方法：

取状态良好的Luciferase标记的U87 MG细胞，用无血清DMEM/F12培养基重悬，计数，分别以2×10⁵的数量接种至裸鼠右侧大脑尾状核内，建立小鼠原位胶质瘤模型。接种7天后，经异氟烷麻醉裸鼠，腹腔注射浓度为30mg/mL荧光素酶底物D-荧光素钾盐，每只0.2mL。10min后，利用生物发光活体成像检测裸鼠颅内成瘤情况，并使用Living Image软件定量计算裸鼠颅内的生物荧光强度。选取12只生物发光强度大于1×10⁸的裸鼠随机分为2组，分别为模型对照组、受试样品组，每组6只。分组情况见下表：

表1实验动物分组

随机分组后，次日进行首次给药，受试样品组利用小动物口鼻吸入暴露系统给药，每天给药1次，连续给药14天。分别在给药第0天及第14天对裸鼠进行活体成像。

实验期间，为监测给药期间的用药稳定性，在给药过程中对气溶胶药物浓度进行持续监测。

实验过程中，每日观察裸鼠的精神状态、进食情况和运动量，并记录裸鼠的生存状态、死亡时间和数量。利用R软件(版本4.2.2)中survival包的ggsurvplot函数绘制裸鼠的Kaplan-Meier生存曲线，通过Log-rank检验分析两组之间的生存差异。

小鼠死亡后，取脑。用4％多聚甲醛固定脑组织后石蜡切片。将样品切片脱蜡、水化后，进行苏木素-伊红染色。

3.实验结果：

给药期间，小动物口鼻吸入暴露系统气溶胶持续监测浓度见图6，结果显示：给药期间，气溶胶浓度稳定。

图7～图8结果表明：给药第0天，模型对照组与汉黄芩素组裸鼠头部生物发光强度没有显著差异。给药第14天，模型对照组裸鼠头部生物发光强度显著升高，并且与汉黄芩素组之间存在显著差异。结果表明口鼻吸入用汉黄芩素可以显著抑制原位胶质瘤在裸鼠颅内的生长。

图9结果表明：汉黄芩素组相较于模型对照组小鼠，脑胶质瘤组织的区域明显减少，说明口鼻吸入用汉黄芩素可以降低裸鼠原位胶质瘤的体积。

图10结果表明模型对照组裸鼠中位生存时间为37.5天，汉黄芩素组裸鼠中位生存时间为51天，口鼻吸入用汉黄芩素可显著延长原位胶质瘤模型裸鼠的生存期。

综上所述，口鼻吸入用汉黄芩素对原位脑胶质瘤治疗效果良好。

Claims (10)

1.一种口鼻吸入用汉黄芩素制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，汉黄芩素包括如式(1)所示的汉黄芩素、及其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂是由汉黄芩素、及其药学上可接受的盐添加了药学上可接受的辅料所制成的包含汉黄芩素的制剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口鼻吸入用汉黄芩素制剂为可雾化后吸入的口鼻吸入制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口鼻吸入制剂为液体制剂。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂的成分包括汉黄芩素、等渗调节剂氯化钠、可实现汉黄芩素较高溶解度的氨基酸类物质以及水。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述可实现汉黄芩素较高溶解度的氨基酸类物质包括精氨酸、赖氨酸。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水为纯化水或注射用水。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口鼻吸入用汉黄芩素制剂的制备方法包括以下步骤：

将精氨酸溶于水中，溶清；加入处方量原料药汉黄芩素，加热，溶清；或可用枸橼酸调节pH值；

各组分含量范围：汉黄芩素含量为0.1-5.0％(w/v)，精氨酸含量为2％～10％(w/v)，枸橼酸含量为0.01％～0.05％(w/v)，pH值为7.0～11.0。

10.根据权利要9所述的应用，其特征在于，所述pH值为9～10。