[go: up one dir, main page]

CN117025627A - 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用 - Google Patents

烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117025627A
CN117025627A CN202310785468.5A CN202310785468A CN117025627A CN 117025627 A CN117025627 A CN 117025627A CN 202310785468 A CN202310785468 A CN 202310785468A CN 117025627 A CN117025627 A CN 117025627A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
ntclc13
gene
channel protein
chloride channel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310785468.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117025627B (zh
Inventor
张慧
徐国云
刘萍萍
翟妞
郑庆霞
金立锋
周会娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Original Assignee
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC filed Critical Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority to CN202310785468.5A priority Critical patent/CN117025627B/zh
Publication of CN117025627A publication Critical patent/CN117025627A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117025627B publication Critical patent/CN117025627B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明克隆获得烟草氯离子通道蛋白NtCLC13的编码基因NtCLC13基因，而且利用亚细胞定位分析发现，烟草氯离子通道蛋白NtCLC13定位在细胞质中。利用CRISPR/Cas9技术，通过农杆菌转化法将构建的基因编辑载体转入烟草植株中，成功构建了NtCLC13基因敲除烟草植株。敲除株叶片氯离子含量显著降低，这使培育低氯烟草新品种成为可能，为改善我国部分烟区烤烟氯含量偏高的情况提供一个新的方向。同时丰富了烟草中氯离子调控的基因网络，对调控烟草中氯离子含量、进一步了解氯离子转运的分子调控有重要意义。

Description

烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
已有的研究普遍认为，烟叶中的氯离子含量以0.3～0.8为宜，在含量达到1％时会影响阴燃持火性，进一步高于1％时会出现黑灰熄火现象；另一方面，烟叶中氯离子含量过高时会造成淀粉积累多，叶片肥厚而脆，吸湿性大，使得存放时颜色易变深，产生不良气味。总之，烟叶中氯离子含量对于烟叶质量具有较为重要的直接影响。目前，河南、云南等部分烟区烟叶中氯离子含量偏高，降低了烟叶的品质和产量，这成为了种植者和研究人员亟需解决的问题。
传统改善方式多是从栽培技术入手，通过优化田间管理措施、完善调制发酵技术来稳定和提升烟叶品质。但总体而言，这些措施并未从根本上改变这些烟叶质量偏低、工业实用性不强的局面。
随着基因组学尤其是基因编辑技术的快速发展，人们对于烟叶中氯离子积累与相关基因之间的关系认识越来越深入。基于已有研究已经知晓的是：对于氯离子通道蛋白(CLC，Chloride Channel)蛋白家族，拟南芥中有7个成员，研究表明AtCLCa在驱使硝酸盐进入液泡的过程中起到关键作用，而AtCLCb就没有这种功能；其他的AtCLC分布在其他细胞区间，AtCLCd和AtCLCf可能在转运高尔基囊泡网络中起到酸化作用；AtCLCe可能参与类囊体膜的阴离子渗透性；AtCLCg与AtCLCc功能一致，参与植物盐胁迫。2007年Anne Marmagne等人在研究拟南芥CLCf时发现(Two members of the Arabidopsis CLC(chloride channel)family,AtCLCe and AtCLCf,are associated with thylakoid and Golgi membranes,respectively，Journal of Experimental Botany，2007，58(12):3385-3393)，AtCLCf定位于高尔基体膜上，并在功能上补充了编码高尔基相关蛋白的单CLC基因中中断的酵母gef1突变体。但总体而言，由于CLC家族蛋白功能的多样化，以及不同物种中CLC家族蛋白功能并不完全一致。仅就烟草品种改良而言，针对烟草中CLC家族蛋白的功能进行深入研究可能为烟草品种改良，甚至可为其他植物改良奠定理论基础和应用基础。因此，挖掘烟草中CLC家族蛋白成员及其相关功能，对调控烟草中氯离子含量、进一步了解氯离子转运的分子调控有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因，该基因能够编码烟草氯离子通道蛋白NtCLC13，进而对烟草中氯离子转运进行调控。
本发明的第二个目的是提供一种烟草氯离子通道蛋白NtCLC13，本发明通过实验证明NtCLC13蛋白参与烟草中氯离子的吸收转运，能通过调控该蛋白的表达对烟草中氯离子的含量进行调控。
本发明的第三个目的是提供烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在调控烟草氯离子转运中的应用，通过实验证明调控NtCLC13基因的表达能影响烟草中氯离子的含量，丰富了烟草中氯离子调控的基因网络。
本发明的第四个目的是提供烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将烟草植株中NtCLC13基因敲除，发现敲除株系的叶片中氯离子含量显著下降，获得低氯烟草品种。
为了实现上述目的，本发明烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因所采用的技术方案是：
一种烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因，其特征在于：其核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过设计特异性引物，克隆获得了烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因，在烟草中通过抑制其表达，减少氯离子向地上部的转运，说明NtCLC13基因参与调控烟草中氯离子转运的过程。
为了实现上述目的，本发明烟草氯离子通道蛋白NtCLC13所采用的技术方案是：
一种烟草氯离子通道蛋白NtCLC13，其氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
上述技术方案的有益效果在于：NtCLC13蛋白被NtCLC13基因编码表达，经验证发现，烟草氯离子通道蛋白NtCLC13与烟草中氯离子吸收转运密切相关，抑制其表达，氯离子的从根部向地上部转运的能力降低，烟草叶片中的氯离子含量显著降低。
为了实现上述目的，本发明烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在调控烟草氯离子转运中的应用所采用的技术方案是：
烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在调控烟草氯离子转运中的应用。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过CRISPR/Cas9技术获得的NtCLC13基因敲除的烟草植株，NtCLC13基因敲除株在正常培养基中与对照组相比相差不大，加入盐胁迫后，NtCLC13基因敲除株生长与对照组相比明显受到抑制，根长变短，说明NtCLC13基因参与了烟草盐胁迫响应。
作为进一步地改进，抑制NtCLC13基因的表达，烟草叶片中氯离子的含量显著降低。
上述技术方案的有益效果在于：通过进一步检测发现，NtCLC13基因敲除株的叶片中氯离子含量显著下降，说明抑制NtCLC13基因表达，氯离子的从根部向地上部转运的能力降低。
为了实现上述目的，本发明烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用所采用的技术方案是：
烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，通过抑制NtCLC13基因的表达，降低烟草叶片中的氯离子，获得低氯烟草品种。
上述技术方案的有益效果在于：本发明通过CRISPR/Cas9技术，在烟草中敲除NtCLC13基因，抑制其表达，获得NtCLC13基因敲除的烟草植株，检测发现所得的NtCLC13基因敲除株叶片中氯离子含量显著降低，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量的改善提供技术支撑。
作为进一步地改进，所述抑制NtCLC13基因的表达是构建基因编辑载体，对烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因进行敲除。
上述技术方案的有益效果在于：CRISPR/Cas9技术相较于传统基因干扰等，具有敲除效率高、操作简便的优势。
作为进一步地改进，基因编辑载体通过如下方法获得：将靶位点双链DNA连接至基因编辑空载体上，测序鉴定。
作为进一步地改进，靶位点双链DNA对应的sgRNA序列为：TCTCGGCGATAGTGCTCCAC。
上述技术方案的有益效果在于：使用上述sgRNA能实现烟草中NtCLC13基因的有效敲除，成功构建出NtCLC13基因敲除的烟草植株，为研究NtCLC13基因的功能奠定基础。
作为进一步地改进，所述低氯烟草品种通过以下方法获得：将基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，通过筛选、鉴定获得叶片氯离子含量明显下降的烟草品种。
附图说明
图1为本发明实施例3中烟草NtCLC13蛋白的亚细胞定位图；
图2为本发明实施例3中NtCLC13基因敲除的靶位点选择示意图；
图3为本发明实施例3中NtCLC13基因T0代基因编辑植株敲除靶位点的测序结果图；
图4为本发明实施例3中NtCLC13基因编辑植株在盐胁迫下的表型；
图5为本发明实施例3中NtCLC13基因编辑植株叶片氯离子含量图(**代表p<0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
生物材料：
烟草品种：K326和中烟100，所使用的种子均由国家烟草基因研究中心提供。
载体：pCS1300获赠于武汉天问生物科技有限公司；CRISPR/Cas9载体由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。
菌株：Trans5α化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；GV3101农杆菌感受态细胞，购自上海唯地生物技术有限公司；引物的合成和DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司提供完成。
实验试剂：RNA提取试剂盒(RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒)、基因组提取试剂盒(多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒)购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量试剂盒、反转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)购自瑞士Roche公司；DNA扩增酶，购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BsaI、质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自宝生物技术有限公司。
实验设备：PCR仪Tprofessional Thermocycler，Biometra公司；定量PCR仪LightCycler96，Roche公司。
实施例1烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因
本实施例中的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因的核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
实施例2烟草氯离子通道蛋白NtCLC13
本实施例中的烟草氯离子通道蛋白NtCLC13的氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
实施例3烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用
本实施例通过PCR成功克隆出NtCLC13基因，亚细胞定位发现烟草NtCLC13蛋白定位于细胞质中，为进一步挖掘其功能，构建NtCLC13基因的基因编辑载体，利用农杆菌转化法将基因编辑载体转化入烟草植株，成功构建了NtCLC13基因敲除的烟草植株。盐胁迫实验发现NtCLC13基因参与了烟草盐胁迫响应，对基因敲除株T1代进行培养，检测发现NtCLC13基因敲除株的叶片中氯离子含量显著下降。具体实施操作如下：
1、氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因克隆及亚细胞定位
1)NtCLC13基因的克隆
NtCLC13基因的克隆及获得过程如下所示：
(1)提取RNA，反转录cDNA
将K326种子消毒之后接种在MS培养基上进行萌发，发芽两周后，幼苗移栽到盆里，在培养温度为23～26℃的植物培养间进行培养，待烟苗长至六叶一心时转移至1/2MS液体培养基中继续培养，两周后选取根部进行取样，液氮速冻后备用，采用植物RNA提取试剂盒提取烟草根部总RNA。RNA提取时，参考试剂盒说明书操作即可，然后反转录为cDNA备用。
(2)设计引物，进行PCR扩增
PCR扩增引物序列如下：
NtCLC13-F：5’-ATGACGGGAGGCGAGTAC-3’(SEQ ID NO.3所示)；
NtCLC13-R：5’-CTACATTGAAAAGATGC-3’(SEQ ID NO.4所示)。
以步骤(1)中反转录的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。
PCR扩增体系为：5×GCL buffer 10μL，cDNA 2μL，上下游引物各1μL，dNTP 6μL，GXL DNA Polymerase 1μL，加灭菌水至50μL。
PCR扩增条件为：98℃、10sec；55℃、15sec，68℃、2min，30个循环。PCR产物进行琼脂糖电泳检测分析并用参照DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收PCR扩增后产物。
纯化产物再连接至pFF19载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，6μL；pFF19载体，1μL；混匀后，25℃连接25min。
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体转化过程如下所示：
从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上使其溶解，加连接产物于100μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min；42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2min；加入900μL平衡至室温的LB(不含抗生素)液体培养基，37℃摇荡培养1h；4000rpm离心3min，去部分上清，留100μL将沉淀混匀，均匀地涂布到LB固体平板(含50μg/μL卡那霉素)上，倒置培养皿，37℃培养过夜。
翌日，挑单克隆，送出测序。
测序结果及分析结果表明，NtCLC13基因基因编码区长度为2238bp个核苷酸；对该基因分析后可知，其所编码的NtCLC13蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2)烟草NtCLC13蛋白的亚细胞定位
设计引物pCS1300S-NtCLC13F和pCS1300S-NtCLC13R，将NtCLC13克隆到含有GFP标签的pCS1300S载体上，引物序列为：
pCS1300S-NtCLC13F：5’-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGACGGGAGGCGAGTAC-3’(SEQ IDNO.5所示)；
pCS1300S-NtCLC13R：5’-CCCTTGCTCACCATGGATCCCATTGAAAAGATGC-3’(SEQ IDNO.6所示)。
注：划线部分为接头序列。
PCR扩增体系和反应程序同第1)部分NtCLC13基因的克隆中PCR扩增体系和反应程序。获得的PCR产物用In-Fusion酶连接至pCS1300载体上，连接体系如下：DNA扩增产物，2μL；pCS1300S载体2μL；In-Fusion酶1μL。混匀后，50℃连接15min。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落测序。
测序正确的质粒经质粒大提试剂盒提取高质量质粒，转化本氏烟原生质体，以线粒体marker做对照(红色)，结果如图1所示，NtCLC13定位于细胞质中。
2、基因编辑载体的构建
为进一步了解NtCLC13基因在烟草氯离子吸收转运中的功能，构建了用于敲除NtCLC13基因的CRISPR/Cas9表达载体，实验过程如下：
首先，根据CRISPR/Cas9系统的识别特点设计靶位点，在NtCLC13基因的第1个外显子区域设计20bp的sgRNA靶点序列，如图2所示，sgRNA序列为：TCTCGGCGATAGTGCTCCAC(SEQID NO.7所示)，设计敲除引物序列NtCLC13-T1_F和NtCLC13-T1_R如下：
NtCLC13-T1_F：GTGGAGCACTATCGCCGAGAtgcaccagccgggaat(SEQ ID NO.8所示)；
NtCLC13-T1_R：ttctagctctaaaacGTGGAGCACTATCGCCGAGA(SEQ ID NO.9所示)。
设计反应体系，以获得靶位点的DNA双链(退火)，20μL反应体系设计如下：Annealing Buffer for DNA OLigos(5×)，4μL；上下游引物(NtCLC13-T1_F、NtCLC13-T1_R)，各4μL(50μmoL/μL)；Nuclease-free water补充至20μL。
反应程序为：95℃5min，每8s下降0.1℃，降至25℃；反应产物4℃保存备用，或者直接进行后续反应。
将上述退火产物与BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体进行连接，并筛选获得用于敲除NtCLC13基因的CRISPR/Cas9表达载体，20μL连接体系设计如下：退火产物，6μL；酶切产物(BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体)，3μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，2μL；T4 DNA Ligase，1μL；灭菌水补充至20μL，37℃连接3h。
连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过挑取阳性克隆、扩大培养，提取质粒后，经PCR确认载体构建成功后，低温保存，用于农杆菌转化。
3、转基因植株的获得
将上述步骤所构建CRISPR/Cas9表达载体转化农杆菌，并进而转化烟草植株，构建NtCLC13基因敲除的转基因植株，实验过程如下：
(1)农杆菌的转化
从-80℃冰箱中取出农杆菌GV3101感受态细胞，在冰上冻融，待即将解冻时加入5μL已经构建好的基因编辑载体，轻弹混匀；冰浴30min，液氮中冻5min，然后在37℃水浴5min后立即放冰上；加入900μL的无抗生素的LB液体培养基，200rpm、振荡培养4h；然后将菌液4500rpm离心3min，弃一半体积的上清，重新悬浮后均匀涂于含有Rif(100μg/mL)、和Kan(50μg/mL)的LB固体培养基上，28℃倒置培养约2～3d，直至单菌落形成；挑取单菌落，扩培后对菌液进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌株，即为转化正确的工程菌。
(2)转化烟草植株
取生长一个月左右的烟草(中烟100)无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5cm大小的叶盘，将处理后叶盘在MS固体培养基上预培养3d；将上述所制备转化后农杆菌工程菌，培养至OD600＝0.6左右，4000rpm离心5min收集菌体，再用20mL的MS液体培养基悬浮菌体；然后将上述预培养后叶盘置于菌液中，侵染10min；用无菌的滤纸吸干浸染后叶盘周围多余的菌液，在MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.5mg/L)的固体培养基上暗培养3d；用含有Cef(400mg/L)的无菌水清洗叶盘，并用无菌滤纸吸去多余的液体，将叶盘转到含有6-BA(2mg/L)、NAA(0.5mg/L)、Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体筛选培养基上，28℃光照培养；待不定芽长到0.5cm时，转移到含Cef(200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体培养基上生根。
(3)基因编辑的鉴定
待生长一个月左右，取少量叶片，参照植物基因组提取试剂盒说明书提取DNA，通过PCR扩增、克隆、测序的方法，检测阳性转基因株系和突变形式。具体鉴定方法为：
在NtCLC13基因组上，设计一对检测引物，该引物位于敲除靶位点的两侧，具体为：
NtCLC13-J-F：5’-GGAGTGAGTACGGTGTGCCAGAAGGCGATTTAGAAAGC-3’(SEQ ID NO.10所示)；
NtCLC13-J-R：5’-GAGTTGGATGCTGGATGGGCTGAAACTAACCCCGC-3’(SEQ ID NO.11所示)。
以T0代转基因株系DNA模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系为：10×buffer 2μL，cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP 3μL，EazyTaq酶1μL，加灭菌水至20μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；再72℃终延伸10min。PCR产物送Hi-tom测序。
分析测序结果如图3所示，在T0代植株中，检测到NtCLC13基因有在敲除的靶位点发生单碱基的缺失突变，而野生型植株的NtCLC13基因未检测到任何突变，这说明在T0代植株中已经成功实现了对NtCLC13基因进行了敲除，编辑植株命名为ntclc13-。
4、NtCLC13基因编辑植株表型观察
(1)种子消毒
将中烟100(对照正常烟草植株)和ntclc13-编辑材料的种子经75％酒精消毒1-2min后用10％NaClO消毒10min，用灭菌水反复冲洗3-5次。
(2)盐胁迫表型观察
将已消毒的种子在加有200mM NaCl的1/2MS固体培养基上播种，不加盐的1/2MS固体培养基做对照，2-3周后观察平板上植株的表型。
结果如图4所示，正常培养基中ntclc13-植株生长与对照相比差别不大，加入盐胁迫后，ntclc13-植株生长与对照相比明显受到抑制，根长变短，说明NtCLC13基因参与了烟草盐胁迫响应。
5、NtCLC13基因编辑植株叶片氯离子含量检测
(1)水培试验
NtCLC13基因编辑植株T1代和对照中烟100植株种植于国家烟草基因研究中心植物培养间，培养条件为：温度(23±1)℃，相对湿度60％±2％，16h光照培养，8h黑暗培养。待烟苗长至六片真叶期，移至Hoagland’s营养液中继续培养，1周后更换一次营养液，再培养3d后取叶片进行后续氯离子含量的测定。叶片经液氮速冻后放-80℃冰箱保存。每个株系设置3个独立重复，每个重复至少选取3株长势一致的烟苗。
(2)氯离子含量测定
将保存的叶片样品冷冻干燥后，使用混合型振荡研磨仪对其研磨至粉末状，称取约0.0500g(精确至0.1mg)粉末，置于10mL 5％(体积分数)醋酸中，30℃震荡萃取30min，然后用定性滤纸过滤，滤液经稀释后用美国安莱立思Alalis MP6500型台式pH计测定氯离子含量。
结果如图5所示，NtCLC13基因编辑后，叶片中的氯离子含量显著下降(**代表p<0.01)。
综上所述，本发明通过对烟草NtCLC13基因的研究，发现NtCLC13蛋白定位在细胞质上；通过基因编辑技术获得NtCLC13基因敲除株，盐胁迫后，ntclc13-编辑植株生长受到抑制，根长与对照相比显著变短；编辑植株叶片中的氯离子含量显著下降，获得了烟叶氯离子含量降低的烟草植株。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因，其特征在于：其核苷酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
2.一种烟草氯离子通道蛋白NtCLC13，其特征在于：其氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
3.一种如权利要求1所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在调控烟草氯离子转运中的应用。
4.根据权利要求3所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在调控烟草氯离子转运中的应用，其特征在于：抑制NtCLC13基因的表达，烟草叶片中氯离子的含量显著降低。
5.一种如权利要求1所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，其特征在于：通过抑制NtCLC13基因的表达，降低烟草叶片中的氯离子，获得低氯烟草品种。
6.根据权利要求5所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，其特征在于：所述抑制NtCLC13基因的表达是构建基因编辑载体，对烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因进行敲除。
7.根据权利要求6所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，其特征在于：基因编辑载体通过如下方法获得：将靶位点双链DNA连接至基因编辑空载体上，测序鉴定。
8.根据权利要求7所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，其特征在于：靶位点双链DNA对应的sgRNA序列为：TCTCGGCGATAGTGCTCCAC。
9.根据权利要求5～8任一项所述的烟草氯离子通道蛋白编码基因NtCLC13基因在获得低氯烟草品种中的应用，其特征在于：所述低氯烟草品种通过以下方法获得：将基因编辑载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，通过筛选、鉴定获得叶片氯离子含量明显下降的烟草品种。
CN202310785468.5A 2023-06-29 2023-06-29 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用 Active CN117025627B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310785468.5A CN117025627B (zh) 2023-06-29 2023-06-29 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310785468.5A CN117025627B (zh) 2023-06-29 2023-06-29 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117025627A true CN117025627A (zh) 2023-11-10
CN117025627B CN117025627B (zh) 2024-11-01

Family

ID=88601162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310785468.5A Active CN117025627B (zh) 2023-06-29 2023-06-29 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117025627B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854411A (en) * 1997-01-09 1998-12-29 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human chloride channel
US20060075522A1 (en) * 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
WO2007035650A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
CN101054586A (zh) * 2007-03-29 2007-10-17 上海大学 水稻氯离子通道基因OsCLC、其编码蛋白及其克隆方法
WO2014096283A2 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Philip Morris Products S.A Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN108841834A (zh) * 2018-06-27 2018-11-20 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用
CN112760329A (zh) * 2021-03-11 2021-05-07 河南中烟工业有限责任公司 烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F及其应用
WO2023036691A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
WO2023117701A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854411A (en) * 1997-01-09 1998-12-29 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human chloride channel
US20060075522A1 (en) * 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
WO2007035650A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
CN101054586A (zh) * 2007-03-29 2007-10-17 上海大学 水稻氯离子通道基因OsCLC、其编码蛋白及其克隆方法
WO2014096283A2 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Philip Morris Products S.A Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN108841834A (zh) * 2018-06-27 2018-11-20 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用
CN112760329A (zh) * 2021-03-11 2021-05-07 河南中烟工业有限责任公司 烟草氯离子通道蛋白基因NtCLC-F及其应用
WO2023036691A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
WO2023117701A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI ZHANG等: "Identification and analysis of the chloride channel gene family members in tobacco (Nicotiana tabacum)", GENE, vol. 676, 26 June 2018 (2018-06-26), pages 56 - 64 *
NCBI: "PREDICTED: Nicotiana tabacum chloride channel protein CLC-f-like (LOC1 07798879), transcript variant X2, mRNA", GENBANK DATABASE, 3 May 2016 (2016-05-03), pages 01 *
康敏华;陈暖;杜喜玲;刘特;刘志学;: "水稻氯离子通道蛋白基因的克隆及表达分析", 西北植物学报, no. 04, 15 April 2011 (2011-04-15), pages 647 - 650 *
张慧;金立锋;徐国云;翟妞;刘萍萍;陈千思;郑庆霞;陈霞;周会娜;: "烟草慢阴离子通道蛋白基因NtSLAH1的克隆及表达分析", 烟草科技, no. 03, 30 March 2018 (2018-03-30), pages 1 - 6 *
王亚宁;张翔;范艺宽;李亮;毛家伟;司贤宗;: "烟草氯素营养研究进展与展望", 中国农学通报, no. 27, 25 September 2017 (2017-09-25), pages 66 - 70 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117025627B (zh) 2024-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019297209B2 (en) Method of obtaining multi-leaf alfalfa material by means of MsPALM1 artificial site-directed mutant
US20250027100A1 (en) USE OF MfERF026 GENE REGULATION IN GROWTH, DEVELOPMENT, AND STRESS TOLERANCE OF MEDICAGO SATIVA
CN116218876A (zh) 一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用
CN116143890B (zh) SlGSK8基因在调控番茄果实果肩颜色中的应用
CN117362406A (zh) 一种同时提升水稻苗期和穗期高温耐受性的蛋白htt7、编码基因及用途
CN116590335A (zh) Gsk3家族同源基因在调控番茄果实形状中的应用
CN114457094B (zh) 一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用
CN102690341A (zh) 一种与植物分蘖相关蛋白及其编码基因
CN114292855B (zh) 一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用
CN116083429A (zh) 一种促进杨树茎伸长和高生长的miRNA及其应用
CN108424910B (zh) 一种用于目的基因干扰的rna片段及其应用
CN117025626A (zh) 烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体和应用
CN117866066A (zh) 毛竹根发育相关PheWOX13-1蛋白及编码基因与应用
CN117534744A (zh) 神农香菊转录因子ChiMYB44及其应用
CN117143889A (zh) 一种e3泛素连接酶基因的新用途
CN117646008A (zh) 一种提升水稻苗期高温耐受性的基因OsHTG8及其编码蛋白和应用
CN117305302A (zh) 油菜中低硼响应基因BnaC4.BOR2的启动子及应用
CN117106798A (zh) PeLAP1基因在促进‘南林895杨’分枝中的应用
CN117025627B (zh) 烟草氯离子通道蛋白NtCLC13及其编码基因和应用
CN113755520B (zh) 半矮化香蕉基因编辑载体及其构建方法和应用
CN113416735A (zh) 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用
CN118703557B (zh) 月季生长素氧化酶基因RhDAO1的新用途
CN112724216B (zh) 改变玉米开花期的基因及方法
CN112724215B (zh) 改变玉米开花期的基因及方法
CN115700281B (zh) 水稻OsRGE3基因及其编码蛋白与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant