CN117229387A - 一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，包括，选择和设计目的基因；构建目的基因的表达载体；将载体导入宿主细胞并转染和表达；培养优化并蛋白质纯化。本发明基因优化可以提高蛋白质的表达水平和稳定性，优化目标蛋白质的功能，通过合适的载体和转染方法可以促进基因的高效表达和稳定转染到细胞，细胞培养优化可以提高细胞的健康状态和蛋白质表达水平，通过纯化和活性验证，确保获得高纯度和功能性的三型胶原蛋白并确保表达的蛋白质对宿主细胞没有显著的不良影响。

Description

一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法。

背景技术

目前，胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，是结缔组织的主要组成成分，三型胶原蛋白是一种间质胶原，由3条α1三链组成，它是皮肤、血管等组织的主要纤维蛋白成分之一，三型胶原蛋白通常与一型胶原蛋白共生，作为一种伴生胶原蛋白，三型胶原蛋白在哺乳动物体内多以富有弹性的薄纤维层的形式与一型胶原形成纤维组织，三型胶原蛋白在人体创伤愈合、组织修复中发挥重要作用，在皮肤修复敷料中有良好的应用效果，三型胶原蛋白呈现出独特的三螺旋结构，三螺旋结构是三型胶原蛋白具有良好生物功能的关键因素，因此，从动物组织中提取三型胶原蛋白的关键，是在保证其纯度的前提下，在提取过程中保持三型胶原蛋白的结构完整性，防止其发生变性。因此，获取高活低毒素三型胶原蛋白的挑战之一是实现足够的表达水平，某些蛋白质在哺乳动物细胞中表达水平较低，需要进行优化以提高表达，有些蛋白质在培养和纯化过程中可能容易变性或降解，导致蛋白质的丧失，而且需要大量的时间、资源和实验操作，耗费人力物力。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有的生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明所要解决的问题在于如何提供一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例提供了一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其包括，选择和设计目的基因；构建目的基因的表达载体；将载体导入宿主细胞并转染和表达；培养优化并蛋白质纯化。

作为本发明所述生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述选择和设计目的基因具体包括，从基因数据库中获取牛的Ⅲ型胶原蛋白的基因序列GenBank，在选择基因之后，对基因序列进行优化，确保高效的表达和蛋白质稳定性。

作为本发明所述生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述对基因序列进行优化具体包括，获取与目标有关的植物胶原蛋白的基因序列和蛋将基因的密码子序列优化为目标宿主细胞的常用密码子，提高翻译效率，减少折叠问题；选择适当的启动子，确保在宿主细胞中实现高水平的基因表达；在基因序列中添加稳定性元素5'UTR，提高信使RNA的稳定性；根据蛋白质结构预测，避免在基因序列中包含可能导致不稳定的区域；使用生物信息学工具来分析基因序列，预测潜在的结构问题并进行优化；在基因序列中加入可以增强蛋白质正确折叠的序列，提高蛋白质的稳定性和生物活性；使用生物信息学工具预测目标Ⅲ型胶原蛋白的结构，找出可能的不稳定或折叠问题。

作为本发明所述生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述构建目的基因的表达载体具体包括，从GenBank数据库中选择一个含有多克隆位点和启动子、选择性标记的载体序列，下载一个FASTA格式的DNA序列，将已优化的Ⅲ型胶原蛋白基因序列插入载体序列中的多克隆位点，通过DNA连接酶将两个序列连接起来，并注意DNA片段的连接方向和正确性，使用DNA序列比对工具验证插入的基因序列是否正确，确保插入序列与设计的基因序列完全匹配，进行PCR扩增，将含有目标基因的载体片段扩增出来。

作为本发明所述生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述将载体导入宿主细胞并转染和表达具体包括，将哺乳动物细胞作为宿主细胞并培养，使用电穿孔法导入到哺乳动物细胞中，载体成功导入细胞，优化培养条件，最大限度地促进基因的表达和蛋白质合成。

作为本发明所述生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的一种优选方案，其中：所述培养优化并蛋白质纯化具体包括，设置培养温度为37℃，CO2浓度为5％，选择含有适当营养物质和生长因子的培养基培养，定期进行细胞传代，以避免细胞过于密集和老化，传代时，将适当数量的细胞分配到新的培养器皿中，以维持适当的密度，定期更换培养基，确保细胞的健康和生长，根据细胞状态，适时添加细胞营养物质；培养到适当的细胞密度后，使用细胞裂解液将细胞膜破裂，将蛋白质释放到裂解液中，使用低速离心去除细胞碎片和核酸，获得上清液，使用亲和层析方法，将目标蛋白质从上清液中分离出来。

本发明有益效果为：本发明提供一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，基因优化可以提高蛋白质的表达水平和稳定性，优化目标蛋白质的功能，通过合适的载体和转染方法可以促进基因的高效表达和稳定转染到细胞，细胞培养优化可以提高细胞的健康状态和蛋白质表达水平，通过纯化和活性验证，确保获得高纯度和功能性的三型胶原蛋白并确保表达的蛋白质对宿主细胞没有显著的不良影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

参照图1，为本发明第一个实施例，该实施例提供了一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，包括：

S1：选择和设计目的基因。

优选的，从基因数据库中获取牛的Ⅲ型胶原蛋白的基因序列GenBank，在选择基因之后，对基因序列进行优化，确保高效的表达和蛋白质稳定性。

进一步的，牛的Ⅲ型胶原蛋白基因序列在GenBank获得较容易，从而避免从头开始克隆和合成，牛的Ⅲ型胶原蛋白基因序列具有相对稳定的性质，稳定性更高的基因序列更不容易发生突变或脱落，这对于基因的操作、转染和表达都有好处，牛的Ⅲ型胶原蛋白基因序列更适合一些哺乳动物细胞株，它与哺乳动物细胞的生物学特性更为相似，从而提高表达效率。

更进一步的，获取与目标有关的植物胶原蛋白的基因序列和蛋将基因的密码子序列优化为目标宿主细胞的常用密码子，提高翻译效率，减少折叠问题；选择适当的启动子，确保在宿主细胞中实现高水平的基因表达；在基因序列中添加稳定性元素5'UTR，提高信使RNA的稳定性；根据蛋白质结构预测，避免在基因序列中包含可能导致不稳定的区域；使用生物信息学工具来分析基因序列，预测潜在的结构问题并进行优化；在基因序列中加入可以增强蛋白质正确折叠的序列，提高蛋白质的稳定性和生物活性；使用生物信息学工具预测目标Ⅲ型胶原蛋白的结构，找出可能的不稳定或折叠问题。

S2：构建目的基因的表达载体。

优选的，从GenBank数据库中选择一个含有多克隆位点和启动子、选择性标记的载体序列，下载一个FASTA格式的DNA序列，将已优化的Ⅲ型胶原蛋白基因序列插入载体序列中的多克隆位点，通过DNA连接酶将两个序列连接起来，并注意DNA片段的连接方向和正确性，使用DNA序列比对工具验证插入的基因序列是否正确，确保插入序列与设计的基因序列完全匹配，进行PCR扩增，将含有目标基因的载体片段扩增出来。

进一步的，将限制性酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在琼脂糖凝胶中，DNA片段会根据大小进行迁移，与预期大小相符的DNA片段表示连接正确，而与预期大小不符的可能表示连接方向错误或连接不正确，使用引物从连接后的载体中扩增出连接的DNA片段，进行DNA片段扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的大小和预期性，将连接后的载体与未连接的载体以及目标基因序列进行比较。

S3：将载体导入宿主细胞并转染和表达。

优选的，将哺乳动物细胞作为宿主细胞并培养，使用电穿孔法导入到哺乳动物细胞中，载体成功导入细胞，优化培养条件，最大限度地促进基因的表达和蛋白质合成。

进一步的，使用细胞株HEK293，保证培养器皿应为无环境，确保细胞健康生长，准备包含已优化Ⅲ型胶原蛋白基因的载体，该载体通常包括启动子、选择性标记以及多克隆位点，确保DNA质量和浓度适合电穿孔；对细胞进行电穿孔，引入载体DNA，从而使DNA能够进入细胞质，设置电穿孔电压电压为300-500V/cm，然后逐步增加，脉冲宽度为10μs到100ms，然后逐步增加，脉冲数1到10，然后逐渐增加；恢复细胞，在导入DNA后，细胞会在培养基中恢复一段时间，以便自然修复受损的细胞膜，在培养一定时间后，收获细胞，准备细胞裂解液，使用SDS-PAGE提取蛋白质，检测目标蛋白质的表达水平。

S4：培养优化并蛋白质纯化。

优选的，设置培养温度为37℃，CO2浓度为5％，选择含有适当营养物质和生长因子的培养基培养，定期进行细胞传代，以避免细胞过于密集和老化，传代时，将适当数量的细胞分配到新的培养器皿中，以维持适当的密度，定期更换培养基，确保细胞的健康和生长，根据细胞状态，适时添加细胞营养物质；培养到适当的细胞密度后，使用细胞裂解液将细胞膜破裂，将蛋白质释放到裂解液中，使用低速离心去除细胞碎片和核酸，获得上清液，使用亲和层析方法，将目标蛋白质从上清液中分离出来。

进一步的，定期检查细胞在培养器皿中的生长状态，细胞应该呈现单层均匀的生长状态，不能过于密集或过稀，当细胞密度达到80-90％的融合度时，进行传代以避免过于密集的细胞和老化，使用适当的胰蛋白酶或其他细胞分离方法将细胞从培养器皿中解离；将适量的细胞分配到新的培养器皿中，以确保每个器皿中的细胞密度适中，细胞密度过低可能影响细胞健康，而过高则可能导致细胞过度堆积；定期更换培养基，1-3天一次，以保持细胞在适宜的营养和生长因子供应下生长。

实施例2

参照表1，为本发明第二个实施例，该实施例提供了一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，为了验证本发明的有益效果，通过对比进行科学论证。

表1

通过表1对比发现本发明基因优化可以提高蛋白质的表达水平和稳定性，优化目标蛋白质的功能，通过合适的载体和转染方法可以促进基因的高效表达和稳定转染到细胞，细胞培养优化可以提高细胞的健康状态和蛋白质表达水平，通过纯化和活性验证，确保获得高纯度和功能性的三型胶原蛋白并确保表达的蛋白质对宿主细胞没有显著的不良影响。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：包括，

选择和设计目的基因；

构建目的基因的表达载体；

将载体导入宿主细胞并转染和表达；

培养优化并蛋白质纯化。

2.如权利要求1所述的生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述选择和设计目的基因具体包括，

从基因数据库中获取牛的Ⅲ型胶原蛋白的基因序列GenBank，在选择基因之后，对基因序列进行优化，确保高效的表达和蛋白质稳定性。

3.如权利要求2所述的生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述对基因序列进行优化具体包括，

获取与目标有关的植物胶原蛋白的基因序列和蛋将基因的密码子序列优化为目标宿主细胞的常用密码子，提高翻译效率，减少折叠问题；选择适当的启动子，确保在宿主细胞中实现高水平的基因表达；在基因序列中添加稳定性元素5'UTR，提高信使RNA的稳定性；根据蛋白质结构预测，避免在基因序列中包含可能导致不稳定的区域；使用生物信息学工具来分析基因序列，预测潜在的结构问题并进行优化；在基因序列中加入可以增强蛋白质正确折叠的序列，提高蛋白质的稳定性和生物活性；使用生物信息学工具预测目标Ⅲ型胶原蛋白的结构，找出可能的不稳定或折叠问题。

4.如权利要求1所述的生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述构建目的基因的表达载体具体包括，

从GenBank数据库中选择一个含有多克隆位点和启动子、选择性标记的载体序列，下载一个FASTA格式的DNA序列，将已优化的Ⅲ型胶原蛋白基因序列插入载体序列中的多克隆位点，通过DNA连接酶将两个序列连接起来，并注意DNA片段的连接方向和正确性，使用DNA序列比对工具验证插入的基因序列是否正确，确保插入序列与设计的基因序列完全匹配，进行PCR扩增，将含有目标基因的载体片段扩增出来。

5.如权利要求1所述的生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述将载体导入宿主细胞并转染和表达具体包括，

将哺乳动物细胞作为宿主细胞并培养，使用电穿孔法导入到哺乳动物细胞中，载体成功导入细胞，优化培养条件，最大限度地促进基因的表达和蛋白质合成。

6.如权利要求1所述的生物合成高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述培养优化并蛋白质纯化具体包括，

设置培养温度为37℃，CO2浓度为5％，选择含有适当营养物质和生长因子的培养基培养，定期进行细胞传代，以避免细胞过于密集和老化，传代时，将适当数量的细胞分配到新的培养器皿中，以维持适当的密度，定期更换培养基，确保细胞的健康和生长，根据细胞状态，适时添加细胞营养物质；培养到适当的细胞密度后，使用细胞裂解液将细胞膜破裂，将蛋白质释放到裂解液中，使用低速离心去除细胞碎片和核酸，获得上清液，使用亲和层析方法，将目标蛋白质从上清液中分离出来。