CN117466980A - 基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其包括多肽链骨架，所述多肽链骨架包括用于修饰可结合金属离子基团的侧链基团，用于修饰抗体桥接结构的侧链基团，及可能存在的多肽链骨架间、多肽链骨架和可结合金属离子基团间、多肽链骨架和抗体桥接结构间避免空间位阻影响标记效果的连接结构。本发明还公开了其在基于质谱流式检测技术检测金属抗体标记中的应用。本发明公开的基于多肽链骨架的应用于金属抗体标记的负载金属缀合物应用于质谱流式检测中标记金属抗体的性能与商用缀合物相当。且相较于商用的可接枝结合金属离子基团的高分子聚合物骨架的合成工艺，本发明公开的非聚合缀合物具有更简单的合成工艺。

Description

基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物及其 应用

技术领域

本发明涉及质谱流式检测技术领域，具体涉及基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物其应用。

背景技术

可实现精确检测样本细胞靶蛋白表达量的技术在科学研究、临床转化的诊断测试应用以及药物筛查等领域发挥重要且极具应用前景的作用。研究蛋白在细胞中的表达量变化，可探索机体组织发育及疾病病理发生的信号通路变化，精确描述特定组织器官的功能性细胞构成，筛选出疾病特征性监测指标，服务于临床诊断测试以及检验药物靶标效用。目前，广泛应用到的样本细胞中靶蛋白的定性、定量检测技术包括：Bradford法/Lowry法/BCA法染料测定法、Western印记、紫外光谱法、有机质谱、高效液相色谱法、流式细胞术、细胞因子流式微球技术、酶联免疫吸附实验以及放射免疫实验等技术。然而，这些技术并不能满足日益增长的高通量、高灵敏度、高精确度的检测需求，服务于临床精准医疗的目标。而通过不同质量数的同位素元素作为信号标签，对靶蛋白进行定量分析为单细胞蛋白质定量提供了显著的优势。基于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的免疫检测建立的质谱流式检测技术，通过选择生物样本中非天然存在的非放射性金属同位素作为检测的标签，可以实现在高达百万级细胞数样本中以单细胞水平同时对多达四十多种靶蛋白进行高灵敏度、高精确度的定量分析。本发明公开的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，可实现将生物样本中非天然存在的非放射性金属同位素标记到靶蛋白的抗体上，从而满足科学研究和精准医疗服务日益严苛的检测需求。

发明内容

本发明的目的是提供基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物及其应用，能够实现将生物样本中非天然存在的非放射性金属同位素标记到靶蛋白的抗体上。

本发明采用以下技术方案：

基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其包括多肽链骨架，所述多肽链骨架包括用于修饰可结合金属离子基团的侧链基团，用于修饰抗体桥接结构的侧链基团，及可能存在的多肽链骨架间、多肽链骨架和可结合金属离子基团间、多肽链骨架和抗体桥接结构间避免空间位阻影响标记效果的连接结构。

进一步地，所述多肽链骨架包括侧链含用于修饰可结合金属离子基团的基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物，侧链含用于修饰抗体桥接结构的基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物，及可能存在的避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物。

进一步地，所述多肽链骨架包括侧链含用于修饰可结合金属离子基团的基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物至少1个，侧链含用于修饰抗体桥接结构的基团的氨基酸或氨基酸衍生物1个，及可能存在的避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物。

进一步地，所述多肽链骨架包括侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物至少1个，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物1个，及可能存在的避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物；

侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团以提供多肽链骨架与金属离子的结合位点，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物侧链上的巯基修饰抗体桥接结构以提供多肽链骨架与待标记抗体的结合位点，避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物延伸多肽链骨架链长以避免空间位阻影响标记效果。

更进一步地，所述侧链含伯胺基团的氨基酸为天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的一种或多种，所述侧链含巯基的氨基酸为半胱氨酸，所述避免空间位阻影响的氨基酸为丙氨酸或甘氨酸或其它侧链不含巯基也不含伯胺基团的氨基酸。

更进一步地，各类氨基酸及氨基酸衍生物以直链状合成为多肽链骨架，除侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物设计在多肽链骨架氨基末端或羧基末端外，其它氨基酸、氨基酸衍生物无需特殊排列顺序。

更进一步地，侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团，可结合金属离子基团包括乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。

更进一步地，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物侧链上的巯基修饰抗体桥接结构，抗体桥接结构包括双马来酰亚胺。

更进一步地，侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团，可结合金属离子基团可结合的金属离子是指具有以下原子序数之一的元素：3、4、11-13、19-32、37-42、44-51、55-60、62-83。

上述基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物在基于质谱流式检测技术检测金属抗体标记中的应用。

进一步地，基于质谱流式检测技术检测包括单细胞水平的靶蛋白的相对表达量的定量检测或生物样本总蛋白提取物靶蛋白的平均表达水平的定量检测。

本发明的有益效果如下：

在单细胞水平上高通量、高检测参数、高灵敏度与高精确度地检测样本细胞中靶蛋白的表达水平，实现精确检测样本细胞靶蛋白表达量的技术，在科学研究、临床转化的诊断测试应用以及药物筛查等领域具有重要意义且极具应用前景。质谱流式检测技术是满足该应用需求的高新检测技术，但针对待检测的细胞表达的靶蛋白表达水平的检测依赖于以特定金属质量数的金属离子作为检测标签，标记到可特异性识别待检测靶蛋白的抗体上，通过检测特定金属质量数金属离子的信号强度，定量该靶蛋白在该单细胞中的表达水平。因此，可实现将金属离子标记到抗体的缀合物是实现质谱流式检测应用的核心技术。

目前商用的应用于质谱流式检测的标记金属抗体的缀合物是基于可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization，RAFT)反应进行可控的自由基聚合反应，形成可接枝结合金属离子基团的高分子聚合物骨架，并在该骨架侧链接枝结合金属离子基团以及在一端修饰结合抗体基团，应用于质谱流式检测中实现金属抗体标记的产品。目前，仅国外(美国)唯一一家质谱流式技术服务供应商提供商用的应用于质谱流式检测技术的基于RAFT的金属抗体标记试剂盒。本发明公开的基于多肽链骨架的应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，开创性使用多肽链骨架作为负载金属、结合抗体的骨架，利用多肽链上侧链含伯胺基团的氨基酸/氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团，以及侧链上含巯基的氨基酸/氨基酸衍生物侧链上的巯基修饰抗体桥接结构，应用于质谱流式检测中实现金属抗体的标记。本发明公开的基于多肽链骨架的应用于金属抗体标记的负载金属缀合物应用于质谱流式检测中标记金属抗体的性能与商用缀合物(商用高分子聚合物)相当。且相较于商用的可接枝结合金属离子基团的高分子聚合物骨架的合成工艺，本发明公开的非聚合缀合物具有更简单的合成工艺，更有利于产品工业化放大生产。

附图说明

图1为实施例1多肽链骨架、基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物(多肽链骨架的缀合物)、商用高分子聚合物的核磁检测结果。

图2为基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物(多肽链骨架的缀合物)标记的CD3金属抗体与商用高分子聚合物标记的CD3金属抗体检测外周血样本中T细胞群体的染色特异性。

图3为基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物(多肽链骨架的缀合物)标记的CD3金属抗体与商用高分子聚合物标记的CD3金属抗体检测外周血样本中T细胞群体的检测信号强度对比。

图4为基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物(多肽链骨架的缀合物)标记的CD16金属抗体与商用高分子聚合物标记的CD16金属抗体检测外周血样本中自然杀伤细胞、单核细胞群体的检测信号强度对比。

具体实施方式

下面用具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

以下所提供的具体实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进以及放大合成体系，亦落入本发明要求的保护范围之内。

实施例1

基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物的制备

步骤一、多肽链骨架的获取

设计合理的多肽链骨架序列，设计原理为，多肽链骨架包括侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物至少1个，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物1个，及可能存在的侧链不含巯基也不含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物，所述侧链含伯胺基团的氨基酸为天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的一种或多种，所述侧链含巯基的氨基酸为半胱氨酸，所述侧链不含巯基也不含伯胺基团的氨基酸为丙氨酸或甘氨酸或其它侧链不含巯基也不含伯胺基团的氨基酸。侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团以提供多肽链骨架与金属离子的结合位点，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物侧链上的巯基修饰抗体桥接结构以提供多肽链骨架与待标记抗体的结合位点，侧链不含巯基也不含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物延伸多肽链骨架链长避免空间位阻影响标记效果。各类氨基酸及氨基酸衍生物以直链状合成为多肽链骨架，除侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物设计在多肽链骨架氨基末端或羧基末端外，其它氨基酸、氨基酸衍生物无需特殊排列顺序。

本实施例使用的多肽链骨架由1个半胱氨酸、10个天冬酰胺、10个谷氨酰胺、10个赖氨酸、10个精氨酸以直链状组成。除半胱氨酸设计在多肽链骨架氨基末端或羧基末端外，其它氨基酸可随机排列。以下实验涉及的多肽链骨架具体为CKNQRKNRQKRNQKRQNKQRNKQNRQKNRQKRNQNKRQNRK。C＝半胱氨酸Cys，K＝赖氨酸lys，N＝天冬酰胺Asn，Q＝谷氨酰胺Gln，R＝精氨酸Arg。由国肽生物按照要求合成后提供。

步骤二、多肽链骨架侧链上的伯胺基团修饰二乙烯三胺五乙酸(DTPA)

1)称取1g DTPA和10mL的水，加入到100mL单口瓶中，使用1M的氢氧化钠将溶液的pH值调整到9.0。

2)称取500mg的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，加入到10mL的水中，使用移液器逐滴滴加到本步骤1)的DTPA溶液中，室温反应1h。

3)称取500mg步骤一的多肽链骨架，溶解到10mL的水中，立即加入到本步骤2)的DTPA溶液中，室温反应过夜。

4)使用10kDa超滤管超滤产物4次后，对所得产物进行冷冻干燥，并对反应产物进行称重。

5)所得产物取10mg进行核磁检测，计算DTPA在多肽链骨架上的修饰效率。修饰效率越高，所标记的金属抗体的检测信号值越强。

步骤三、多肽链骨架侧链上的巯基修饰双马来酰亚胺(bismaleimide，BMI)

1)称取10mg的BMI，溶解到500μL的二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中(本实施例为DMSO)，配制20mg/mL的BMI溶液。

2)称取本实施例步骤二制备的DTPA修饰的多肽链骨架50mg，加入到1mL 20mM的二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中(本实施例为DTT)，37℃反应4h。

3)加入4mL pH值为3.5的醋酸盐缓冲液终止反应，使用10kDa超滤管超滤浓缩后，继续使用醋酸盐缓冲液漂洗反应产物6次。

4)向步骤3)的10kDa超滤管中加入100μL pH值为7.2的磷酸盐缓冲液后，加入50μL20mg/mL的BMI溶液，室温反应过夜。

5)向步骤4)的10kDa超滤管中加入纯水漂洗9次后，冷冻干燥浓缩液回收基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物的最终产物。

6)为了确定BMI修饰在多肽链骨架上的效率，取10mg终产物进行核磁检测。修饰效率越高，多肽链骨架标记到抗体(纯抗)上效率越高。

7)终产物可以保存在-80℃、-20℃以及4℃冰箱中储存，优选-20℃条件长期储存。

实施例2

基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物进行金属抗体标记的制备

步骤一、试剂耗材准备

1)在4℃冰箱中取出X8 MμLtimetal Labeling Kit的4种Buffer(L、R、C、W-Buffer)，放置室温20min以上直至恢复到室温。

2)在-20℃冰箱中取出X8 MμLtimetal Labeling Kit的polymer(即商用高分子聚合物)和实施例1制备的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，在掌上离心机中室温离心20min以上直至恢复到室温。

3)在4℃冰箱中取出待标记金属抗体所对应的单一质量数金属离子溶液(用于CD3金属抗体标记的169Tm(原子质量数为169的铥金属离子)、170Er(原子质量数为170的铒金属离子)，用于CD16金属抗体标记的175Lu(原子质量数为175的镥金属离子))以及待标记纯抗(CD3、CD16)，放置于冰上。

步骤二、金属-基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物连接及纯化

1)用97.5μL L-Buffer溶解200ug polymer，用97.5μL L-Buffer溶解200ug基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，分别吹打直至polymer和基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物完全溶解，在polymer中加入2.5μL 100mM 170Er的金属溶液。在基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物中加入2.5μL100mM 169Tm的金属溶液。均放入PCR仪中37℃孵育30min。

Polymer标记175Lu-CD16金属抗体、多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物标记175Lu-CD16金属抗体，本步骤1)中170Er、169Tm均替换成175Lu。

2)在两个3kDa超滤管中分别加入200μL L-Buffer(3kDa管体系为300μL)，再将孵育完成的金属-polymer和金属-基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物溶液，分别转移至其中并轻吹5次混匀，12000g/常温离心25min，弃去下清液。

3)在本步骤2)的两个3kDa超滤管中分别加入300μL C-Buffer，12000g/常温离心30min，均弃去下清液。

步骤三、纯抗还原

1)在两个50kDa超滤管中分别加入适量R-Buffer，再加入100ug CD3抗体纯抗蛋白(如果是针对CD16，该步骤1)则加入CD16抗体纯抗蛋白)溶解，使混合溶液体积为400μL，12000g/常温离心10min，暂不弃下清液。

2)再在本步骤1)的两个50kDa超滤管中分别加入180μL R-Buffer，轻吹混匀，按步骤六测量管中纯抗溶液OD280并记录，注意该步骤加入R-Buffer前应观察50kDa超滤管中余液液面是否高于白色滤膜，若不超过，则可认为余液体积为20μL，若超过则12000g/常温继续离心直至余液液面低于白色滤膜；再12000g/常温离心5min，弃去下清液。

3)将水浴锅调至37℃并用温度计校准。

4)配制4mM的TCEP溶液，在本步骤2)的两个50kDa超滤管中分别加入100μL 4mMTCEP溶液，轻吹5次混匀，立即放入37℃水浴中孵育，严格控时30min。

5)孵育完成后，立即加入300μL C-Buffer停止还原反应，12000g/常温离心5min，弃去下清液。

6)在本步骤5)的两个50kDa超滤管中分别加入400μL C-Buffer，12000g/常温离心5min，弃去下清液。

步骤四、纯抗连接金属-基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物

将3kDa超滤管中的金属-polymer溶液和3kDa超滤管中的金属-基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物溶液分别转移至对应的50kDa超滤管中，与还原后抗体溶液轻吹5次混匀，放入37℃水浴中孵育90min。

步骤五、金属抗体纯化回收

1)孵育完成后，在步骤四的两个50kDa超滤管中分别加入300μL W-Buffer，12000g/常温离心5min，弃去下清液。

2)在本步骤1)的两个50kDa超滤管中分别加入400μL W-Buffer，12000g/常温离心5min，弃去下清液。并重复步骤2)2次。

3)对应于本步骤2)的两个50kDa超滤管，分别取1个新的收集管，做好标记，在50kDa超滤管中沿两侧滤膜上端加入50μL W-Buffer，然后倒扣在对应新的收集管内，1000g/常温倒转离心2min。

4)对应于本步骤3)的两个收集管，分别取1个1.5mL EP管，做好标记，将收集管内金属抗体溶液转移至对应1.5mL EP管中，再在50kDa超滤管中沿两侧滤膜上端加入50μL W-Buffer，吸取50kDa超滤管底溶液沿两侧滤膜再次冲洗，然后倒扣在对应收集管内，1000g/常温倒转离心2min。

5)将收集管内金属抗体溶液再次转移至对应1.5mL EP管中，测量此时1.5mL EP管中金属抗体体积，按步骤六测量OD280，计算回收率并记录。

6)根据回收金属抗体质量与体积用Antibody stabilizer稀释到指定浓度(通常为0.2或者0.4mg/mL，本实施例为0.4mg/mL)，放入4℃冰箱指定位置保存，以供后续实验使用。

步骤六、测量抗体(纯抗)或金属抗体的OD280

1)打开nano100分光光度计以及软件Spectrophotometer V2.0，选择ProteinA280。

2)使用待测溶液的缓冲液对加样区进行润洗，擦干加样区，加入2μL待测溶液的缓冲液，选择280nm波长，进行blank，擦干加样区；若blank得到的光谱曲线不平整或OD280值超过0.005，则重复blank操作。

3)若待测溶液事先未吹打混匀，则涡旋振荡2s。加入2μL待测溶液，进行测量，记录OD值，擦干加样区。

4)用ddH₂O清洗加样区，擦干，重复3次。

5)按公式C＝OD280/k(mg/ml)计算抗体或金属抗体浓度，k取1.4；根据抗体或金属抗体溶液体积计算抗体或金属抗体质量，并记录。

实施例3

基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物标记的金属抗体的检测应用，并与商用高分子聚合物(X8 MμLtimetal Labeling Kit的polymer)标记的金属抗体做对比

本实施例以标记CD3、CD16金属抗体为例做阐述(本发明并不限于此)。

步骤一、准备待检测样本细胞

1)制备人外周血单个核细胞(PBMCs)的单细胞悬液，细胞计数，确定细胞浓度和活率是否满足实验需求(细胞数在1-3x10⁶，活率90％以上)。

2)一份样本细胞取1.5*10⁶个PBMCs细胞，枪头轻柔捶打重悬样本细胞，室温离心400g/5min，弃上清。

3)加入预冷的含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，4℃离心400g/5min，弃上清；其中，含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液具体由0.5-2mg牛血清白蛋白、100mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成。

步骤二、确定细胞死活

4)每份样本细胞中加入100μL 0.25M提前配制好的染死活试剂，充分混匀，冰上染色5min。

5)加入1mL预冷的含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，4℃离心400g/5min，弃上清，该步骤重复2次。

步骤三、封闭

6)向每份样本细胞加入50μL的封闭液重悬细胞沉淀，并转移到干净的1.5mL的EP管中，做好标记，冰上孵育20min。封闭液具体由0.5-2mL人免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL小鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL大鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL仓鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mg牛血清白蛋白、100mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成。

步骤四、胞外抗体染色

7)向预冷的含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中同时加入0.2ug的商用高分子聚合物标记的170Er-CD3金属抗体和0.2ug的基于多肽链骨架应用于金属标记的负载金属缀合物标记的169Tm-CD3金属抗体，定容到50μL，即胞外染色抗体混合液。将50μL的胞外抗体染色液加入到一份封闭的样本细胞中，充分混合均匀，冰上染色30min。

对于CD16金属抗体标记，本步骤7)是0.2ug的商用高分子聚合物标记的175Lu-CD16金属抗体加入到预冷的含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，定容到50μL，再加入到一份封闭的样本细胞中，充分混合均匀，冰上染色30min；0.2ug的基于多肽链骨架应用于金属标记的负载金属缀合物标记的175Lu-CD16金属抗体加入到预冷的含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，定容到50μL，再加入到另一份封闭的样本细胞中，充分混合均匀，冰上染色30min。

8)加入1mL预冷的含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，4℃离心400g/5min，弃上清，该步骤重复2次。

步骤五、细胞固定

9)使用Fix and perm(Standard BioTools)和DNA嵌入剂191/193Ir(StandardBioTools)，按照体积比2000:1及其他等效比例，配制固定液，将200μL的固定液加入到步骤四的一份样本细胞中，置于4℃固定过夜。

步骤六、漂洗、上机检测

10)将步骤五的样本细胞从4℃条件中取出，4℃离心800g/5min，弃上清。

11)向每支EP管中加入1mL水重悬细胞后，用移液枪吸取细胞悬液过流式管滤头滤膜转移到相应流式管中。再次加入1mL水清洗EP管壁数次后，将清洗液用移液枪吸取后过滤同一个流式管滤头滤膜后到同一个流式管中。

12)4℃离心800g/5min，弃上清。

13)向每支流式管中加入1mL水重悬细胞后，分别取10μL进行细胞计数。

14)根据细胞计数结果，用水再次清洗细胞样品数次后，加入适量的平衡磁珠，在Helios质谱细胞仪(Standard Biotools)上机进行检测，并对数据进行处理分析。

我们通过核磁检测对比商用高分子聚合物(X8 MμLtimetal LabelingKit的polymer)和本发明公开的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物(多肽链骨架的缀合物)，观察到本发明公开的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物同商用高分子聚合物具有明显的结构特征差异，并证明本发明公开的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物是由多肽链骨架通过本发明公开的化工合成途径获得的(图1)，所得本发明公开的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物依然保持有多肽链骨架的结构特征(见图1红色箭头)，且并不存在于商用高分子聚合物的结构中。

CD3是T细胞表面高水平表达的细胞表面蛋白，能够特异性地鉴定出T淋巴细胞；CD16是表达在自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞上表达的细胞表面蛋白，表达水平低于CD3(选用CD3和CD16为例，是基于研发成本和测试样本易获取性、易测试性考虑，选择CD3作为高表达高丰度检测蛋白测试代表，CD16作为低丰度、低表达检测蛋白测试代表，评估本发明的性能指标)。我们将基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物与商用高分子聚合物，采用相同的金属抗体标记技术流程(实施例2)与检测流程(实施例3)分别进行CD3、CD16金属抗体的标记与性能对比。我们观察到，检测高表达蛋白CD3中，基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物所标记的金属抗体，在外周血样本上的染色信号特异性与信号强度均与商用高分子聚合物所标记的金属抗体的性能相当(图2、图3)。而在表达量相对较低的CD16蛋白的细胞表面蛋白的检测中，也能观察到不弱于商用试剂的检测效果，并通过标记相同质量数的金属同位素，避免因金属检测信号的灵敏度的偏差，对检测数据结论的影响(图4)。

Claims (11)

1.基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，其包括多肽链骨架，所述多肽链骨架包括用于修饰可结合金属离子基团的侧链基团，用于修饰抗体桥接结构的侧链基团，及可能存在的多肽链骨架间、多肽链骨架和可结合金属离子基团间、多肽链骨架和抗体桥接结构间避免空间位阻影响标记效果的连接结构。

2.根据权利要求1所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，所述多肽链骨架包括侧链含用于修饰可结合金属离子基团的基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物，侧链含用于修饰抗体桥接结构的基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物，及可能存在的避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物。

3.根据权利要求2所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，所述多肽链骨架包括侧链含用于修饰可结合金属离子基团的基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物至少1个，侧链含用于修饰抗体桥接结构的基团的氨基酸或氨基酸衍生物1个，及可能存在的避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物。

4.根据权利要求3所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，所述多肽链骨架包括侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物至少1个，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物1个，及可能存在的避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物；

侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团以提供多肽链骨架与金属离子的结合位点，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物侧链上的巯基修饰抗体桥接结构以提供多肽链骨架与待标记抗体的结合位点，避免空间位阻影响标记效果的氨基酸或/和氨基酸衍生物延伸多肽链骨架链长以避免空间位阻影响标记效果。

5.根据权利要求4所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，所述侧链含伯胺基团的氨基酸为天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的一种或多种，所述侧链含巯基的氨基酸为半胱氨酸，所述避免空间位阻影响的氨基酸为丙氨酸或甘氨酸或其它侧链不含巯基也不含伯胺基团的氨基酸。

6.根据权利要求4所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，各类氨基酸及氨基酸衍生物以直链状合成为多肽链骨架，除侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物设计在多肽链骨架氨基末端或羧基末端外，其它氨基酸、氨基酸衍生物无需特殊排列顺序。

7.根据权利要求4所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团，可结合金属离子基团包括乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。

8.根据权利要求4所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，侧链含巯基的氨基酸或氨基酸衍生物侧链上的巯基修饰抗体桥接结构，抗体桥接结构包括双马来酰亚胺。

9.根据权利要求4所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物，其特征在于，侧链含伯胺基团的氨基酸或/和氨基酸衍生物侧链上的伯胺基团修饰可结合金属离子基团，可结合金属离子基团可结合的金属离子是指具有以下原子序数之一的元素：3、4、11-13、19-32、37-42、44-51、55-60、62-83。

10.权利要求1-9任一权利要求所述的基于多肽链骨架应用于金属抗体标记的负载金属缀合物在基于质谱流式检测技术检测金属抗体标记中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，基于质谱流式检测技术检测包括单细胞水平的靶蛋白的相对表达量的定量检测或生物样本总蛋白提取物靶蛋白的平均表达水平的定量检测。