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CN117604031B - 一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统及其构建方法 - Google Patents

一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统及其构建方法 Download PDF

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CN117604031B CN202310428659.6A CN202310428659A CN117604031B CN 117604031 B CN117604031 B CN 117604031B CN 202310428659 A CN202310428659 A CN 202310428659A CN 117604031 B CN117604031 B CN 117604031B
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Abstract

本公开提供了一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统及其构建方法，包括如下步骤:对猫冠状病毒S蛋白mRNA序列进行修饰和优化；将设计好的S蛋白基因片段连接体外转录载体，构建pGEM‑S重组质粒，转入大肠杆菌大量培养，并提取质粒进行线性化处理及胶回收，以获得体外转录的DNA模板；通过体外转录反应获得FCoV S mRNA，并进行加帽及纯化。用同样的技术路线构建了pGEM‑EGFP载体，体外转录成EGFP mRNA；以EGFP mRNA作为报告基因进行细胞转染实验，并在体外转染多种细胞系以验证IVT‑mRNA系统。本发明人首次构建了猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统，可以在细胞水平上高效表达目的蛋白，并可以在不同细胞系中应用，为后期制备猫冠状病毒mRNA疫苗提供了基础。

Description

一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统及其构建方法
技术领域
本公开涉及基因工程的技术领域，尤其涉及一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统及其构建方法。
背景技术
猫传染性腹膜炎是由猫冠状病毒( Feline coronavirus，FCoV)引起的慢性致死性疾病，以腹膜炎、大量腹水积聚或各脏器出现肉芽肿病变为主要特征，不同年龄的猫均可感染，但老龄猫和2岁以内的猫发病率较高，纯种猫发病率高于一般品种的家猫，传染率非常高。FCoV为不分节段、单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovi-rale)，冠状病毒科(Coronaviridae)，α冠状病毒(Alphacoronavirus)。FCoV有11个开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)，以及7种非结构蛋白：辅助蛋白3a、3b、3c、7a、7b，和复制酶1a和1b。冠状病毒S蛋白全长为12-24 nm，呈穹顶状，排列方式类似于王冠样，是病毒表面最大的结构蛋白。S蛋白是机体识别病原的主要靶蛋白，它能够介导病毒与宿主细胞的识别以及侵入过程的膜融合。研究表明，S蛋白在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中都发挥重要生物学作用，是基因工程疫苗和诊断技术等方面研究中是最重要的一个靶蛋白。
本发明人通过从5’和3’非编码区元件入手，为了评价不同来源、不同排布的非编码区元件对mRNA翻译效率的影响，利用绿色荧光蛋白（EGFP）对三种体外转录系统的蛋白表达效果进行对比分析，进而筛选出三者中最佳的体外转录系统。本发明人发现，使用球蛋白序列作为mRNA的非编码区序列能够大大提高蛋白的翻译效率，并且通过非编码区元件不同排布的组合，翻译效率也会有所不同。
发明内容
本公开提供了一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统，同时构建了该体外转录系统的构建方法，可作为一种新型构建方法在后续开发制备猫冠状病毒mRNA疫苗的基础。
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统，包括核酸分子，该核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统的构建方法，包括以下步骤：
（a）以猫冠状病毒S蛋白片段作为目的基因，从5’和3’非编码区元件入手，根据不同来源、不同排布的非编码区元件，构建三种体外转录核酸分子，分别为IVT-Sn1-mRNA、IVT-Sn2-mRNA及IVT-Sn3-mRNA，IVT-Sn1-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:1所示；IVT-Sn2-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:2所示，IVT-Sn3-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:3所示；它们的区别在于非编码区序列的不同；
（b）将所述体外转录核酸分子通过两端酶切位点连接到体外转录载体，构建pGEM-S，分别得到pGEM-Sn1，pGEM-Sn2及pGEM-Sn3；转入大肠杆菌大量培养，并对重组质粒进行线性化单酶切处理及胶回收，获得体外转录的DNA模板；
（c）用T7酶体外转录获得构建好的FCoV S mRNA，并进行加帽反应及纯化；鉴于EGFP易于观察检测的特点，用同样的技术路线构建了pGEM-EGFP载体，分别得到pGEM-EGFPn1，pGEM-EGFPn2及pGEM-EGFPn3，并体外转录成EGFP mRNA；
（d）以EGFP mRNA作为报告基因进行细胞转染实验，并在体外转染多种细胞系以验证IVT-mRNA系统；
（e）制备脂质体纳米颗粒LNPs用于保护mRNA不被降解：用制备的阳离子脂质纳米材料LNPs与 FCoV S mRNA进行自组装，制备 FCoV S mRNA-LNPs；
（f）以制备的FCoV S mRNA-LNPs转染细胞进行体外细胞转染实验，测定细胞S蛋白的表达。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（a）中，所述体外转录载体为pGEM-3Zf(+)。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（b）中，所述大肠杆菌为TOP10；线性化单酶切的位点为XhoⅠ。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（c）中，所述体外转录反应：体外转录反应体系为：反应体系20μL，其中Linearized template DNA with T7 RNAP promoter 1μg、10X T7-FlashScribe Transcription Buffer 2μL、100 mM ATP 1.8μL、100 mM CTP 1.8μL、100 mM UTP 1.8μL、100 mM GTP 1.8μL、100 mM DTT 2μL、ScriptGuard RNaseInhibitor 0.5μL、T7-FlashScribe Enzyme Solution 2μL，补充灭菌ddH2 O至终体积20μL；体外转录反应条件为：37℃反应2h；加入RNase-Free DNase I 1μL，37℃反应15min。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（c）中，所述加帽反应：加帽反应体系为：反应体系100μL，其中In vitro transcribed RNA 50-60 µg，补充灭菌ddH2 O至67μL、10X ScriptCap Capping Buffer 10μL、10 mM GTP 10μL、20 mM SAM 2.5μL、ScriptGuardRNase Inhibitor 2.5μL、ScriptCap 2'-O-Methyltransferase 4μL、ScriptCap CappingEnzyme 4μL；加帽反应条件为：In vitro transcribed RNA 65℃10min后置于冰上保存；混合10X ScriptCap Capping Buffer、10 mM GTP、20 mM SAM、ScriptGuard RNaseInhibitor、ScriptCap 2'-O-Methyltransferase，最后加入ScriptCap Capping Enzyme；混合两种溶液37℃反应30min。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（d）中，所述转染包含以下步骤：
（d1）将细胞接种于12孔板，用培养基进行培养，直至细胞融合度近80%；
（d2）将残留的培养基清洗干净；每孔加入不含血清与抗生素的培养基；
（d3）按一定的体积与质量比分别配置Lipofectamine3000 Reagent和EGFP mRNA溶液，之后等比例进行混合，室温静置15min后，逐滴加入孔中，将孔板中液体轻轻摇晃均匀后，放入温箱中继续培养；
（d4）培养时间超过12h，需要在第6h每孔补加含胎牛血清不含抗生素的培养基。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（d1）中，所述转染细胞为CRFK猫肾细胞；培养基为DMEM培养基；培养基中胎牛血清比例为10%。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（d3）中，所述体积与质量比为1.5μL/0.75μg。
采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
本发明通过对mRNA各翻译元件优化，从5′和3′非编码区元件入手，根据不同排布的非编码区序列构建三种体外转录系统，利用绿色荧光蛋白（EGFP）与FCoV S蛋白基因对三种体外转录系统的蛋白表达效果进行对比分析，进而筛选出三者中最佳的体外转录系统。本发明人发现，使用α球蛋白的一段序列作为mRNA的非编码区序列能够大大提高蛋白的翻译效率，并且通过非编码区元件不同排布的组合，翻译效率也会有所不同。
附图说明
附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
图1是本公开重组质粒双酶切鉴定结果；其中：
1-1为pGEM-Sn1重组质粒酶切结果：M：GL10000Marker；1:目的片段；
1-2为pGEM-Sn2重组质粒酶切结果：M：GL10000Marker；1:目的片段；
1-3为pGEM-Sn3重组质粒酶切结果：M：GL10000Marker；1:目的片段。
图2是本公开重组质粒线性化单酶切鉴定结果；其中：
2-1为pGEM-Sn1重组质粒线性化酶切结果：M：GL5000Marker；1：未线性化质粒；2：线性化质粒；
2-2为pGEM-Sn2重组质粒线性化酶切结果：M：GL5000Marker；1：未线性化质粒；2：线性化质粒；
2-3为pGEM-Sn3重组质粒线性化酶切结果：M：GL5000Marker；1：未线性化质粒；2：线性化质粒。
图3是本公开体外转录获得的mRNA核酸质量分析结果；其中：
图3-1为IVT-Sn1-mRNA核酸质量分析结果；M：GL5000Marker；1：IVT-Sn1-mRNA；
图3-2为IVT-Sn2-mRNA核酸质量分析结果；M：GL5000Marker；1：IVT-Sn2-mRNA；
图3-3为IVT-Sn3-mRNA核酸质量分析结果；M：GL5000Marker；1：IVT-Sn3-mRNA。
图4是本公开EGFP报告基因细胞免疫荧光结果；其中：
A：IVT-EGFP-n1；B：IVT-EGFP-n2；C：IVT-EGFP-n3；D：control 。
图5是本公开FCoV S蛋白片段基因细胞免疫荧光结果；其中：
A：IVT-S-n1；B：IVT-S-n1核染；C：IVT-S-n2；D：IVT-S-n2核染
E：IVT-S-n3；F：IVT-S-n3核染；G：control；H：control核染。
图6是本公开mRNA与LNPs自组装后粒径测定结果图。
图7是本公开mRNA与LNPs自组装电位测定结果图。
图8是本公开mRNA与LNPs自组装体外细胞转染效果评价结果图；
其中：
A：Sn1-mRNA-LNP；B：Sn1-mRNA；C：Sn1-mRNA转染试剂盒。
图9是本公开IVT-mRNA-n1转染4种细胞系荧光观察结果；其中：
a：CRFK；b：FCWF-4；c：293；d：PK-15。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
本公开提供了一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录核酸分子，该核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
本公开提供了一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录核酸分子的构建方法，包括以下步骤：
（a）以猫冠状病毒S蛋白片段作为目的基因，根据理化性、亲水性、可及性以及二级结构等预测结果，目的基因选自FCoV标准毒株EU186072 S蛋白1127-1400片段；从5’和3’非编码区元件入手，根据不同来源、不同排布的非编码区元件，构建三种体外转录核酸分子，分别为IVT-Sn1-mRNA、IVT-Sn2-mRNA及IVT-Sn3-mRNA，IVT-Sn1-mRNA碱基序列如SEQ IDNO:1所示；IVT-Sn2-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:2所示，IVT-Sn3-mRNA碱基序列如SEQ IDNO:3所示；它们的区别在于非编码区序列的不同；非编码区序列选自人α球蛋白和β球蛋白序列；
（b）将所述体外转录核酸分子通过两端酶切位点Kpnl和Hindlll连接到体外转录载体，构建pGEM-S，分别得到pGEM-Sn1，pGEM-Sn2及pGEM-Sn3；转入大肠杆菌DH5α大量培养，并对重组质粒进行线性化单酶切处理及胶回收，获得体外转录的DNA模板；
（c）用T7酶体外转录获得构建好的FCoV S mRNA，并进行加帽反应及纯化；鉴于EGFP易于观察检测的特点，用同样的技术路线构建了pGEM-EGFP载体，分别得到pGEM-EGFPn1，pGEM-EGFPn2及pGEM-EGFPn3，并体外转录成EGFP mRNA；
（d）以EGFP mRNA作为报告基因进行细胞转染实验，并在体外转染多种细胞系以验证IVT-mRNA系统；通过与EGFP报告基因双重比对蛋白翻译效率，筛选得到最佳体外转录系统；
（e）制备脂质体纳米颗粒LNPs用于保护mRNA不被降解：用制备的阳离子脂质纳米材料LNPs与 FCoV S mRNA进行自组装，制备 FCoV S mRNA-LNPs；
（f）以制备的FCoV S mRNA-LNPs转染细胞进行体外细胞转染实验，测定细胞S蛋白的表达。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（a）中，所述体外转录载体为pGEM-3Zf(+)。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（b）中，所述大肠杆菌为TOP10；线性化单酶切的位点为XhoⅠ。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（c）中，所述体外转录反应：体外转录反应体系为：反应体系20μL，其中Linearized template DNA with T7 RNAP promoter 1μg、10X T7-FlashScribe Transcription Buffer 2μL、100 mM ATP 1.8μL、100 mM CTP 1.8μL、100 mM UTP 1.8μL、100 mM GTP 1.8μL、100 mM DTT 2μL、ScriptGuard RNaseInhibitor 0.5μL、T7-FlashScribe Enzyme Solution 2μL，补充灭菌ddH2 O至终体积20μL；体外转录反应条件为：37℃反应2h；加入RNase-Free DNase I 1μL，37℃反应15min。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（c）中，所述加帽反应：加帽反应体系为：反应体系100μL，其中In vitro transcribed RNA 50-60 µg，补充灭菌ddH2 O至67μL、10X ScriptCap Capping Buffer 10μL、10 mM GTP 10μL、20 mM SAM 2.5μL、ScriptGuardRNase Inhibitor 2.5μL、ScriptCap 2'-O-Methyltransferase 4μL、ScriptCap CappingEnzyme 4μL；加帽反应条件为：In vitro transcribed RNA 65℃10min后置于冰上保存；混合10X ScriptCap Capping Buffer、10 mM GTP、20 mM SAM、ScriptGuard RNaseInhibitor、ScriptCap 2'-O-Methyltransferase，最后加入ScriptCap Capping Enzyme；混合两种溶液37℃反应30min。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（d）中，所述转染包含以下步骤：
（d1）将细胞接种于12孔板，用培养基进行培养，直至细胞融合度近80%；
（d2）将残留的培养基清洗干净；每孔加入不含血清与抗生素的培养基；
（d3）按一定的体积与质量比分别配置Lipofectamine3000 Reagent和EGFP mRNA溶液，之后等比例进行混合，室温静置15min后，逐滴加入孔中，将孔板中液体轻轻摇晃均匀后，放入温箱中继续培养；
（d4）培养时间超过12h，需要在第6h每孔补加含胎牛血清不含抗生素的培养基。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（d1）中，所述转染细胞为CRFK猫肾细胞；培养基为DMEM培养基；培养基中胎牛血清比例为10%。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤（d3）中，所述体积与质量比为1.5μL/0.75μg。
实施例1 重组质粒双酶切鉴定
使用Kpnl和HindIII限制性内切酶对重组质粒pGEM-Sn1，pGEM-Sn2及pGEM-Sn3进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示。
实施例2 重组质粒线性化模板鉴定
用Xbal限制性酶来单酶切pGEM-Sn1，pGEM-Sn2及pGEM-Sn3。在1.5mL离心管中按优化好的体系配好，在37℃水浴锅中酶切15min，迅速转入65℃水浴锅中停止酶切20min。在1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定后切下目的片段，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行回收。在1%琼脂糖凝胶电泳跑电泳鉴定，用微光分光光度计测量浓度，结果如图2所示。
实施例3 核酸质量分析
回收得到的线性化模板，体外转录成IVT-Sn1-mRNA、IVT-Sn1-mRNA及IVT-mRNA-n3，在1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳中鉴定分析，mRNA鉴定结果如图3所示。
实施例4 体外转染IVT-EGFP荧光观察
按体积与质量比为1.5μL/0.75μg分别配置Lipofectamine3000Reagent和EGFPmRNA溶液，之后按体积1:1的比例进行混合，室温静置15min后，逐滴加入293细胞板中，将孔板中液体轻轻摇晃均匀后，放入温箱中继续培养；若培养时间超过12h，需要在第6h每孔补加500uL的含10%胎牛血清的DMEM培养基（不加抗生素）。EGFP mRNA转染细胞结果如图4所示，IVT-EGFP-n1的荧光强度要高于IVT-EGFP-n2和IVT-EGFP-n3。
实施例5 体外转染IVT-S荧光观察
按体积与质量比为1.5μL/0.75μg分别配置Lipofectamine3000Reagent和S-mRNA溶液，按上述方法转染CRFK细胞，荧光显微镜下结果如图5所示，IVT-S-n1的荧光强度要高于IVT-S-n2和IVT-S-n3，表明IVT-mRNA-n1的翻译效率要优于IVT-mRNA-n2和IVT-mRNA-n3。
实施例6 疫苗粒径大小测定
纳米疫苗颗粒的大小具有重要的意义，因为粒径的大小与目的细胞摄取纳米疫苗的方式有关。对Sn1 mRNA-LNPs进行粒径大小测定，结果如图6所示。
实施例7 疫苗电位及包封率测定
电位对转染细胞的成功率十分重要，因为电位影响附着在转染细胞上的脂质体复合物数量，如图7所示，本发明对Sn1mRNA-LNPs进行了电位测量。通过测量（总核酸量-游离核酸量）/总核酸量*100%计算得到包封率。
实施例8 mRNA与LNPs自组装体外细胞转染效果评价
取一瓶生长状态良好的CRFK细胞，将细胞稀释将细胞稀释至1*106个／mL，向24孔板中各加入1mL，吹打混匀，将孔板放置37℃细胞培养基孵育培养1h。阳离子脂质体与核酸自组装后，与裸mRNA分别转染1μg至同一批次的CRFK细胞中，转染完成后放置37℃培养箱中孵育18h后，荧光显微镜下观察S蛋白片段表达情况。结果如图8所示，Sn1-mRNA-LNP的绿色荧光强度要大于裸Sn1-mRNA。该结果说明，裸mRNA在转染及孵育的过程中可能被降解，而经过LNP包裹的Sn1-mRNA可被有效保护并可以被递送到细胞内完成翻译，从而提高蛋白翻译水平。
实施例9 体外转染多种细胞系验证IVT-mRNA系统
为了进一步验证IVT-mRNA-n1在其他细胞系上的表达效果，将IVT-mRNA-n1转录的mRNA分别转染猫肾细胞（CRFK）、猫胚胎细胞（FCWF-4）、人胚胎肾细胞（293）和猪肾细胞（PK-15）。转染12小时后，进行IFA检测。结果如图9显示，4个细胞系当中均出能观察到不同强度的绿色荧光，表明IVT-mRNA-n1在上述4个细胞系当中均能够表达FCoV S蛋白。其中在CRFK细胞系荧光强度最高，在PK-15细胞系荧光强度较弱。
本发明人首次构建了猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统，可以在细胞水平上高效表达目的蛋白，并可以在不同细胞系中应用，为后期制备猫冠状病毒mRNA疫苗提供了基础。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

Claims (9)

1.一种猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统，其特征在于，包括核酸分子，该核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述猫冠状病毒S蛋白mRNA的体外转录系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）以猫冠状病毒S蛋白片段作为目的基因，从5’和3’非编码区元件入手，根据不同来源、不同排布的非编码区元件，构建三种体外转录核酸分子，分别为IVT-Sn1-mRNA、IVT-Sn2-mRNA及IVT-Sn3-mRNA，IVT-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:1所示；IVT-Sn2-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:2所示，IVT-Sn3-mRNA碱基序列如SEQ ID NO:3所示；它们的区别在于非编码区序列的不同；
（b）将所述体外转录核酸分子通过两端酶切位点连接到体外转录载体，构建pGEM-S，分别得到pGEM-Sn1，pGEM-Sn2及pGEM-Sn3；转入大肠杆菌大量培养，并对重组质粒进行线性化单酶切处理及胶回收，获得体外转录的DNA模板；
（c）用T7酶体外转录获得构建好的FCoV S mRNA，并进行加帽反应及纯化；鉴于EGFP易于观察检测的特点，用同样的技术路线构建了pGEM-EGFP载体，分别得到pGEM-EGFPn1，pGEM-EGFPn2及pGEM-EGFPn3，并体外转录成EGFP mRNA；
（d）以EGFP mRNA作为报告基因进行细胞转染实验，并在体外转染多种细胞系以验证IVT-mRNA系统；
（e）制备脂质体纳米颗粒LNPs：用制备的阳离子脂质纳米材料LNPs与 FCoV S mRNA进行自组装，制备 FCoV S mRNA-LNPs；
（f）以制备的FCoV S mRNA-LNPs转染细胞进行体外细胞转染实验，测定细胞S蛋白的表达。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（a）中，所述体外转录载体为pGEM-3Zf(+)。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（b）中，所述大肠杆菌为TOP10；线性化单酶切的位点为XhoⅠ。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（c）中，所述体外转录反应：体外转录反应体系为：反应体系20μL，其中Linearized template DNA with T7 RNAPpromoter 1μg、10X T7-FlashScribe Transcription Buffer 2μL、100 mM ATP 1.8μL、100mM CTP 1.8μL、100 mM UTP 1.8μL、100 mM GTP 1.8μL、100 mM DTT 2μL、ScriptGuardRNase Inhibitor 0.5μL、T7-FlashScribe Enzyme Solution 2μL，补充灭菌ddH2 O至终体积20μL；体外转录反应条件为：37℃反应2h；加入RNase-Free DNase I 1μL，37℃反应15min。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（c）中，所述加帽反应：加帽反应体系为：反应体系100μL，其中In vitro transcribed RNA 50-60 µg，补充灭菌ddH2 O至67μL、10X ScriptCap Capping Buffer 10μL、10 mM GTP 10μL、20 mM SAM 2.5μL、ScriptGuard RNase Inhibitor 2.5μL、ScriptCap 2'-O-Methyltransferase 4μL、ScriptCap Capping Enzyme 4μL；加帽反应条件为：In vitro transcribed RNA 65℃10min后置于冰上保存；混合10X ScriptCap Capping Buffer、10 mM GTP、20 mM SAM、ScriptGuard RNase Inhibitor、ScriptCap 2'-O-Methyltransferase，最后加入ScriptCap Capping Enzyme；混合两种溶液37℃反应30min。
7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（d）中，所述转染包含以下步骤：
（d1）将细胞接种于12孔板，用培养基进行培养，直至细胞融合度近80%；
（d2）将残留的培养基清洗干净；每孔加入不含血清与抗生素的培养基；
（d3）按一定的体积与质量比分别配置Lipofectamine3000 Reagent和EGFP mRNA溶液，之后等比例进行混合，室温静置15min后，逐滴加入孔中，将孔板中液体轻轻摇晃均匀后，放入温箱中继续培养；
（d4）培养时间超过12h，需要在第6h每孔补加含胎牛血清不含抗生素的培养基。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（d1）中，所述转染细胞为CRFK猫肾细胞；培养基为DMEM培养基；培养基中胎牛血清比例为10%。
9.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（d3）中，所述体积与质量比为1.5μL/0.75μg。
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