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CN118076387A - 靶向表达cdh17的肿瘤的多特异性抗体及其制备和使用方法 - Google Patents

靶向表达cdh17的肿瘤的多特异性抗体及其制备和使用方法 Download PDF

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CN118076387A
CN118076387A CN202280067595.5A CN202280067595A CN118076387A CN 118076387 A CN118076387 A CN 118076387A CN 202280067595 A CN202280067595 A CN 202280067595A CN 118076387 A CN118076387 A CN 118076387A
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seq
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antigen
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陆满晴
黄广辉
周楚翘
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Albert Pharmaceutical Technology Co ltd
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Albert Pharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

一种双特异性抗体，包含具有重链和轻链的IgG结构域以及连接至重链C末端的两个scFv结构域，其中IgG结构域包含对选自Trop2和CDH17的第一抗原具有结合特异性的Fab区，其中scFv结构域对选自CD3和PD1的第二抗原具有结合特异性。

Description

靶向表达CDH17的肿瘤的多特异性抗体及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.119(e)，本申请要求于2021年10月8日提交的美国临时申请序列号63/253,612的申请日的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及癌症免疫疗法的技术领域，更具体地涉及具有多种抗原结合特异性的修饰抗体的组合物。
背景技术
胃肠癌是沿着GI道(也称为消化道)发展的癌症。胃肠(GI)癌包括消化道器官中的所有癌症，如胃、大肠和小肠、胰腺、结肠、肝、直肠、肛门和胆道系统。GI癌是全球发病率和死亡率的首要原因，其中仅结直肠癌(CRC)就占所有癌症诊断的大约10％，并且是仅次于肺癌的全球癌症死亡第二大原因。最近在中国进行的一项调查显示，中国的癌症谱正在发生变化，除了肝癌、胃癌、食管癌和宫颈癌的高发病率和沉重负担之外，肺癌、乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的发病率和负担也在迅速增加。肝癌和胃癌仍然很普遍，并且是最致命的恶性肿瘤之一，据信这是由乙型肝炎病毒和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染以及肝脏毒素和其他环境污染物及食物污染物所引起。对于大多数形式的GI癌，都没有有效的治疗方法。因此，针对这些侵袭性癌症的药物开发需要新的生物标志物和治疗靶点。一种经过验证的可以消除或抑制这些癌症生长的分子靶向剂将具有重要的临床价值和重大的市场影响。如果疾病在早期得到诊断，就可以通过手术有效切除这些肿瘤。遗憾的是，大多数GI癌通常是无症状的，当出现在诊所时已是晚期。如果缺乏有效的治疗，这些患者会在诊断后不久死亡或在挽救疗法后复发。
基于抗体的靶向免疫疗法是治疗各种形式癌症(如白血病和淋巴瘤)的一种前景光明的疗法。但是抗体疗法用于治疗实体瘤(如GI癌)的成功似乎受到限制。这可能是由于实体瘤和肿瘤微环境的异质性，通常表现为肿瘤逃逸、非肿瘤(off-tumor)在靶(on-target)毒性或免疫抑制肿瘤微环境。为了克服潜在的弱点并增强抗体疗法在癌症治疗中的功效，可以探索靶点特异性的组合。抗体生物制剂可以是靶向多种肿瘤相关抗原(TAA)或免疫效应细胞标志物的双特异性或三特异性抗体，以实现更有效和特异性的反应。根据作用机制，多特异性抗体为这些问题提供了解决方案。在肿瘤逃逸的情况下，抗体生物制剂可以靶向多种TAA，从而在肿瘤细胞上失去单个抗原的情况下，抗体结合仍然发生并且抗肿瘤活性维持有效。在非肿瘤在靶毒性的情况下，不与具有高亲和力的单一TAA结合，而是与具有中等亲和力的多种TAA的结合，增加了相对于正常细胞对肿瘤细胞的选择性亲和力。最后，靶向多个免疫检查点抑制剂，如PD1、Tigit和CTLA4，可能有助于拮抗免疫抑制肿瘤微环境。
钙粘蛋白-17(CDH17)是一种突出的癌症生物标志物，其表征为在肝癌和胃癌中过度表达，而在正常组织中不表达。CDH17在转移性癌症中高度表达。抗CDH17单克隆抗体显示对肝和胃肿瘤细胞的生长抑制作用，并且CDH17表达和功能的阻断可以显著减少肝细胞癌(HCC)的肺转移。这些观察表明，人源化抗CDH17抗体可被开发为治疗肿瘤组织和/或血清样品中具有CDH17生物标志物指征的癌症患者的靶向治疗剂。
虽然抗体药物缀合物有望作为抗体疗法，但多特异性抗体疗法利用对癌症的免疫反应并激活T细胞介导的对癌细胞的细胞毒性。
发明内容
以下概述仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了上述说明性的方面、实施方案和特征之外，通过参考附图和以下详细描述，进一步的方面、实施方案和特征将变得显而易见。
本申请提供了多特异性抗体、抗体样蛋白及其衍生物、片段(如其结合结构域)、含有这些抗体或抗体样蛋白或结合结构域的药物组合物、制备这些抗体或抗体样蛋白或结合结构域的方法以及将抗体或抗体样蛋白用于治疗或诊断应用的方法。
一方面，本申请提供了多特异性抗体及其衍生物或片段。在一个实施方案中，抗体可包括肿瘤抗原和效应细胞抗原的结合部分以产生T细胞接合物。
在一个实施方案中，本申请提供了一种多特异性抗体，其包含重链和轻链。重链包含选自F(ab)2和scFv的第一结合部分、CH1结构域、铰链和CH2结构域以及作为scFv的第二结合部分；轻链包含VL和CL结构域。
在一个实施方案中，本申请提供了一种双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包括具有重链和轻链的IgG结构域，以及连接至重链C末端的两个scFv结构域。IgG结构域包含对第一抗原具有结合特异性的Fab区。scFv结构域对第二种抗原具有结合特异性。
在一个实施方案中，第一抗原选自Trop2和CDH17。在一个实施方案中，第一抗原是Trop2。在一个实施方案中，第一抗原是CDH17。
在一个实施方案中，第二抗原选自CD3和PD1。在一个实施方案中，第二抗原是CD3。在一个实施方案中，第二种抗原是PD1。
在一个实施方案中，Fab结构域包含与选自SEQ ID NO：13、14、15、16、66和67的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，scFv结构域包含与选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，双特异性抗体具有SEQ ID NO：54、55、56的3个重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO：57、58、59的3个轻链CDR。在一个实施方案中，双特异性抗体具有SEQID NO：68、69、70的3个CDR和SEQ ID NO：71、72、73的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，双特异性抗体具有SEQ ID NO：48、49、50的3个重链CDR和SEQID NO：51、52、53的3个轻链CDR。在一个实施方案中，双特异性抗体具有SEQ ID NO：60、61、62的3个重链CDR和SEQ ID NO：63、64、65的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，第一抗原是Trop2，第二抗原是CD3。在一个实施方案中，抗体包含与选自SEQ ID NO：23、24、33、34、35的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一抗原是CDH17，第二抗原是PD1。在一个实施方案中，抗体包含与选自SEQ ID NO：25、26的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了三特异性抗体样蛋白(TriAx-C)、其衍生物或其片段。在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白是异二聚体。
在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白具有N末端和C末端，并且包含第一单体和第二单体。第一单体从N末端到C末端包含对第一抗原具有结合特异性的第一scFv结构域、可变重链、第一CH3结构域和第二CH3结构域。第二单体从N末端到C末端包含可变轻链、CH2结构域、第三CH3结构域以及对第二抗原具有结合特异性的第二scFv结构域。可变重链和可变轻链形成对第三种抗原具有结合特异性的Fab结构域。
在一个实施方案中，第一单体和第二单体通过一个或多个二硫键连接。在一个实施方案中，第三CH3结构域和第二CH3结构域被配置为形成杵臼(knobs-into-holes)结构。
在一个实施方案中，第一抗原是PDL1。在一个实施方案中，第二抗原是CDH17。在一个实施方案中，第三抗原是CD3。在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白对PDL1、CDH17和CD3具有结合亲和力。
在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白包含SEQ ID NO：36、37、38的3个重链CDR和SEQ ID NO：39、40、41的3个轻链CDR。在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白包含SEQID NO：68、69、70的3个重链CDR和SEQ ID NO：71、72、73的3个轻链CDR。在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白包含SEQ ID NO：48、49、50的3个重链CDR和SEQ ID NO：51、52、53的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，三特异性抗体样蛋白包含与选自SEQ ID NO：27、28的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了对Tigit(抗Tigit mAb)具有结合亲和力的抗体及其衍生物或片段。在一个实施方案中，对Tigit具有结合亲和力的抗体包含SEQ ID NO：42、43、44的3个重链CDR和SEQ ID NO：45、46、47的3个轻链CDR。在一个实施方案中，单克隆抗体包含与SEQ ID NO：5、6、7或8具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体或分离的单克隆抗体。
另一方面，本申请提供了抗体或抗体样蛋白的结合结构域。
在一个实施方案中，本申请提供了Fab结构域。在一个实施方案中，Fab结构域具有SEQ ID NO：54、55、56的3个重链CDR和SEQ ID NO：57、58、59的3个轻链CDR。在一个实施方案中，Fab结构域具有SEQ ID NO：68、69、70的3个重链CDR和SEQ ID NO：71、72、73的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本申请提供了scFv结构域。在一个实施方案中，scFv结构域具有SEQ ID NO：48、49、50的3个重链CDR和SEQ ID NO：51、52、53的3个轻链CDR。在一个实施方案中，scFv结构域具有SEQ ID NO：60、61、62的3个重链CDR和SEQ ID NO：63、64、65的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本申请提供了对PDL1具有亲和力的结合结构域。在一个实施方案中，结合结构域包含SEQ ID NO：36、37、38的3个重链CDR和SEQ ID NO：39、40、41的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本申请提供了对CDH17具有亲和力的结合结构域。在一个实施方案中，结合结构域包含SEQ ID NO：68、69、70的3个重链CDR和SEQ ID NO：71、72、73的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本申请提供了对CD3具有亲和力的结合结构域。在一个实施方案中，结合结构域包含SEQ ID NO：48、49、50的3个重链CDR和SEQ ID NO：51、52、53的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，本申请提供了对Tigit具有亲和力的结合结构域。在一个实施方案中，结合结构域包含SEQ ID NO：42、43、44的3个重链CDR和SEQ ID NO：45、46、47的3个轻链CDR。
另一方面，本申请提供了一种分离的核酸序列，其编码抗体、抗体样蛋白、其结合结构域、衍生物或其片段。
另一方面，本申请提供了一种表达载体，其包含本文公开的分离的核酸序列。
另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含本文公开的分离的核酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞包含本文公开的表达载体。在一个实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。
另一方面，本申请提供了用于产生抗体、抗体样蛋白、其结合结构域、衍生物或其片段的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：培养本文公开的宿主细胞，从而产生抗体、抗体样蛋白、其结合结构域、衍生物或其片段。
另一方面，本申请提供了免疫偶联物。在一个实施方案中，免疫偶联物包括细胞毒性剂。在一个实施方案中，免疫偶联物包括显像剂。细胞毒性剂或显像剂可通过化学键(包括如共价键、酰胺键、肽键、醚键或酯键)与抗体、抗体样蛋白、其结合结构域、衍生物或其片段缀合。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载体和抗体、抗体样蛋白、其结合结构域、衍生物、片段或其公开的免疫偶联物。在一个实施方案中，药物组合物可进一步包含放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗剂或其组合。
另一方面，本申请提供了用于治疗或预防受试者的癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，所述方法包含向受试者施用本文公开的药物组合物。在一个实施方案中，治疗癌症受试者的方法包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体的步骤。
在一个实施方案中，治疗方法包含向受试者共同施用有效量的治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂包含抗体、化疗剂、酶或其组合。
在一个实施方案中，受试者是人。
另一方面，本申请提供了一种溶液，其包含有效浓度的抗体、抗体样蛋白、其结合结构域、衍生物、片段或其公开的免疫偶联物。在一个实施方案中，溶液包含有效浓度的本文公开的双特异性抗体。在一个实施方案中，溶液是受试者体内或来自受试者的血浆或体液。
附图说明
现在可以参考附图描述根据本公开的实施方案，其中相同的附图标记表示相同的元件。
图1描绘了两种双特异性抗体ARB203和ARB204的构型；以及三特异性抗体TriAx-C；
图2显示了抗PDL1(克隆2A6)与表达PDL1的293F细胞结合(左)并阻断PD1-PDL1结合(右)；
图3显示了抗Tigit抗体(克隆4F11)与表达Tigit的293F细胞结合(左)并阻断CD155与Tigit结合(右)；
图4描述了抗Trop2(h8B5)和抗CD3(克隆3G8)的双特异性抗体。(A)h3G8 scFv的不同排列影响其与人和猴CD3的结合。V2和V3保持与二者结合。(B)V2对人和猴CD3的亲和力相当。(C)比较变体之间的T细胞介导的对癌细胞的细胞毒性。V1的杀伤效果大大降低，而V2在EC50方面最接近克隆UCHT1。(D)在T细胞介导的细胞毒性过程中，诱导了不同细胞因子的产生。与克隆UCHT1相比，V2在诱导IL2和分泌方面具有相似的EC50；
图5显示了ARB203，一种抗Trop2(h8B5)和抗CD3(UCHT1)的双特异性抗体。(A)ARB203与Trop2阳性细胞系(SW480)结合，但不与Trop2阴性细胞系(A549)结合。(B)克隆8B5对人Trop2的亲和力极高(KD＝1E-12M)，超出了Octet系统的测量极限。(C)ARB 203非常有效，可以在T细胞和癌细胞上的受体占有率低于1％的情况下诱导100％杀伤癌细胞；以及
图6显示了ARB204，一种CDH17-PD1双特异性抗体，与表达PD1的HEK293F结合(左)，并显示对AsPC1的强细胞毒性作用(右)。
具体实施方式
在下面的详细描述中，参考了附图，附图构成本文的一部分。在附图中，除非上下文另有规定，相似的符号通常标识相似的部件。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意指限制性。在不脱离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行其他改变。将容易理解的是，如本文总体上所描述以及附图中所示出的，本发明的各个方面可以以多种不同的配置进行排列、替换、组合、分离和设计，本文对所有这些都明确预期。
为了使免疫疗法能够更有效地治疗癌症，尤其是实体瘤，可以使用结合了多种靶特异性和/或作用机制的联合疗法。为有效治疗癌症并更频繁地实现完全和持久的反应，需要一种如本文所述的联合治疗的治疗剂。具体而言，需要一种支架，该支架具有某些特性，以产生具有相对于批准双特异性抗体而言有利的作用机制、制造、药代动力学和低抗原特性的组合疗法。相对于本文所述的三特异性抗体，基于完整抗体的双特异性抗体可能具有更大的质量。传统的双特异性抗体重定向T细胞以根除癌细胞的功效有限，因为次优的效应细胞参与。使用单链可变片段(scFv)抗体，特别是双特异性T细胞接合物(BiTE)，已经获得了更有效的T细胞活化。虽然基于抗体片段的质量较小的抗体可能具有更强的肿瘤穿透力，但它们通常的药代动力学特性相对较差，如FDA批准的抗CD19/CD3双特异性BiTE抗体贝林妥欧单抗(blinatumomab)(安进(Amgen))用于化疗耐药CD19+B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者。多种BiTE正在几种实体瘤和血液恶性肿瘤中进行临床测试，至少贝林妥欧单抗的临床经验已经证明，尽管在癌细胞上表达靶抗原，但许多患者因尚不清楚的原因而无法接受BiTE治疗。所有这些BiTE都依赖于CD3信号和抗TAA，而不提供任何免疫检查点的共刺激或抑制。
CDH17在转移性GI癌中高度表达，阻断CDH17表达和功能也可以显著减少肝细胞癌(HCC)的肺转移。已开发和表征抗CDH17单克隆抗体和抗CDH17/CD3双特异性抗体(例如，ARB202)，其显示出对肝和胃肿瘤细胞的生长抑制作用(参见申请人的申请WO/2019/222428和美国专利号11,207,419，其全部内容通过引用并入本文)。与CDH17一样，TROP2是一种重要的癌症生物标志物，其表征为在各种形式的实体瘤中过表达，包括胃、结肠、胰腺、肝脏和肝脏。为了使靶向CDH17的抗体疗法对GI癌患者的益处最大化，可能需要另外的结合特异性。
一方面，本申请公开了具有两种结合特异性的双特异性抗体。双特异性抗体的实例包括ARB203(抗Trop2/CD3)和ARB204(抗CDH17/PD1)(图1)。
一方面，本申请另外公开了三特异性抗体或抗体样蛋白(TriAx-C形式)。在一个实施方案中，用于抑制免疫检查点的三特异性抗体样蛋白对PDL1或TIGIT具有结合特异性，可将其配置为增加抗CDH17/CD3特异性(图1)。TIGIT是存在于一些T细胞和自然杀伤细胞(NK)上的免疫受体，可以以高亲和力与树突细胞(DC)、巨噬细胞等上的CD155结合。TIGIT组合治疗的几项临床试验表明，组合的TIGIT和PD-L1共阻断有望用于实体癌患者。
所公开的TriAx-C形式表征为具有在任何恒定结构域中没有突变的杵臼结构。这种构型不同于许多双特异性抗体，那些双特异性抗体在Ig结构的恒定结构域内既有杵臼结构又有突变，这可能有助于抗药物抗体反应。
如本文所用，术语“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”被定义为表示“一个或多个”，并且包括复数形式，除非上下文不合适。
术语“抗体”以最广泛的意义使用，具体涵盖单个单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物以及抗体片段，如Fab、F(ab')2和Fv，只要它们表现出所期望的生物活性。在一些实施方案中，抗体可以是单克隆、嵌合、单链、多特异性、多效、人和人源化抗体。结合已知抗原的活性抗体片段的实例包括Fab、F(ab')2、scFv和Fv片段，以及Fab免疫球蛋白表达文库的产物和上述任何抗体和片段的表位结合片段。在一些实施方案中，抗体可包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的结合位点的分子。免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或类别(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一个实施方案中，抗体可以是完全抗体和来源于完全抗体的任何抗原结合片段。典型的抗体是指通常包含两条重链(H)和两条轻链(L)的异四聚体蛋白。每条重链由重链可变结构域(缩写为VH)和重链恒定结构域组成。每个轻链部分由轻链部分可变结构域(缩写为VL)和轻链部分恒定结构域组成。VH和VL区可以进一步细分为高变互补决定区(CDR)和被称为框架区(FR)的更保守区域。每个可变结构域(VH或VL)通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端排列如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在重链和轻链的可变区内，存在与抗原相互作用的结合区。
如本文所用，术语“多特异性”抗体表示具有至少两个结合位点的抗体，每个结合位点对抗原表位具有结合亲和力。如本文所用，术语“双特异性、三特异性、四特异性或五特异性”抗体表示具有两个、三个、四个、五个或六个抗原结合位点的抗体。
术语“人源化抗体”抗体是指一种基因工程抗体，其CDR来源于非人供体免疫球蛋白，分子的其余免疫球蛋白来源部分来源于一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保留结合亲和力。获得“人源化抗体”的方法为本领域技术人员所熟知(参见Queen等人,Proc.Natl Acad Sci USA,1989；Hodgson等人,Bio/Technology,1991)。在一个实施方案中，可以通过基因工程方法获得“人源化抗体”，该方法能够在大型动物(例如，兔)中产生亲和力成熟的类人多克隆抗体(参见美国专利号7,129,084)。
术语“抗体”或“抗体样蛋白”在本申请中可以互换使用。
术语“抗原”是指能够在生物体(特别是动物，更特别是包括人在内的哺乳动物)中诱导免疫反应的实体或其片段。该术语包括免疫原及其负责抗原性或抗原决定簇的区域。
术语“表位”也称为“抗原决定簇”，是抗原被免疫系统识别的部分，特别是被抗体、B细胞或T细胞识别的部分，是抗体结合的抗原的特定片段。
术语“免疫原性的”是指引发或增强针对免疫原性物质的抗体、T细胞或其他反应性免疫细胞的产生并有助于人或动物免疫反应的物质。当个体针对所施用的本申请的免疫原性组合物产生足够的抗体、T细胞和其他反应性免疫细胞以缓解或减轻待治疗的疾病时，发生免疫反应。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”是指肿瘤细胞中产生的抗原分子。肿瘤抗原可能引发宿主的免疫反应。在一个实施方案中，肿瘤细胞表达肿瘤抗原，包括但不限于肿瘤特异性抗原(TSA)、新抗原和肿瘤相关抗原(TAA)。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异性于”特定抗原或表位是指与非特异性相互作用显著不同的结合。可以通过确定分子的结合与对照分子的结合进行比较来测量特异性结合，对照分子通常是没有结合活性的类似结构的分子。可以通过与类似靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。与特定抗原或表位的特异性结合可由抗体表现出来，该抗体对抗原或表位的KD为至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更高，其中KD指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一些实施方案中，与抗原特异性结合的多特异性抗体的KD是相对于抗原或表位的对照分子的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍或更多倍。此外，与特定抗原或表位的特异性结合可由抗体表现出来，该抗体对抗原或表位的KA或Ka相对于对照至少高20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍或更多倍，其中KA或Ka指特定抗体-抗原相互作用的结合率。
通过参考下面对具体实施方案的详细描述和本文包括的实例，可以更容易地理解本公开。尽管已经参考本发明的某些实施方案的具体细节描述了本发明，但是这些细节不应被视为对本发明范围的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改意图落入所附权利要求的范围内。
实施例
参考以下实施例进一步描述本公开。除非另有说明，否则这些示例仅用于说明目的，并不旨在进行限制。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修改以产生基本相同或相似结果的各种非关键参数。
实施例1.多特异性抗体或抗体样蛋白的构型
如图1所示，双特异性抗体，如ARB203和ARB204，可以通过使用IgG4 Fc作为其主链结构来构建。铰链区被切换至其IgG1对应物以防止臂切换。利用该平台，ARB203被构建为双特异性抗Trop2/CD3抗体。ARB203通过Fab区和CD3(与其重链C末端共价连接)scFv结构域与Trop2形成双价。通过这种构型，ARB203可以用作T细胞接合物将活化的T细胞带到表达Trop2的肿瘤细胞并引发针对癌细胞的免疫反应。
ARB204是一种双特异性抗CDH17/PD1抗体，其主链结构为IgG4 Fc，如图1所示。铰链区被切换至其IgG1对应物以防止臂切换。ARB204与两个结合靶标形成二价，其中其Fab区结合CDH17，共价连接的scFv结构域结合PD1。通过这种构型，ARB204用于阻断表达CDH17的肿瘤细胞周围的免疫检查点，并引发对GI癌的免疫反应。
同样如图1所示，三特异性抗CDH17/CD3/PDL1抗体样蛋白是不对称TriAx-C形式的示例性抗体样蛋白。这些抗体样蛋白可以表征为具有杵臼亚结构，以确保异二聚体抗体的正确配对。在该TriAx-C实例中，抗CD3的可变轻链(VL)与Fc杵部(Fc-knob)和抗CDH17 scFv融合以形成链1，而抗PDL1 scFv与抗CD3的可变重链(VH)和Fc臼部(Fc-hole)融合以形成链2。两条链的正确配对形成含有三种结合特异性的异二聚体Ig结构。
实施例2.抗CDH17、Trop2、PD1、PDL1、Tigit和CD3的抗体和结合片段
将含有一个抗体编码序列的每个质粒转染至HEK293或CHO细胞中用于哺乳动物细胞表达。可以用蛋白A亲和层析从培养上清液中纯化抗体、抗体样蛋白或片段。特异性抗PDL1(2A6)、Tigit(4F11)、CD3(3G8)、Trop2(8B5)和PD1(1C8)的单克隆抗体通过杂交瘤技术产生并人源化。表1列出了编码每只小鼠和人源化单克隆抗体的重链和轻链的新序列。
为了评估每种单克隆抗体的功能，使用人源化抗PDL1抗体(克隆2A6，SEQ ID NO：3、4)作为实例。如图2所示，表达PDL1的HEK293细胞用生物素化的PD1染色，并使用链霉亲和素APC观察。直方图分析结果显示克隆2A6与表达PDL1的HEK293细胞结合并阻断PD1-PDL1相互作用，这验证了预期的与PDL1的结合特异性和阻断PD1-PDL1相互作用。
在另一个实例中，选择人源化抗Tigit抗体或克隆4F11来表征其阻断CD155与Tigit结合的能力。如图3所示，虽然CD155可以与工程化表达Tigit的HEK293细胞结合，但克隆4F11也能够与表达Tigit的HEK293细胞结合。这些结果表明克隆4F11包含能够阻断CD155-Tigit相互作用的抗Tigit结合结构域。
实施例3.双特异性抗体
将含有双特异性抗体编码序列的质粒转染或共转染到HEK293或CHO细胞中用于哺乳动物细胞表达。可以用蛋白A亲和层析从培养物上清液中纯化抗体或片段。
ARB203是一种双特异性抗体，能够结合肿瘤相关抗原Trop2和T细胞表面标志物CD3，因此它可以发挥作用，对表达Trop2的癌细胞引起T细胞依赖性细胞毒性。在序列表中，给出了一组新抗体的VH/VL序列。利用来自相应单克隆抗体的每个结构域或结合片段的氨基酸序列，列出了ARB203的全长序列(SEQ ID NO：23、24)。
ARB203的Trop2结合结构域来自抗Trop2抗体的Fab区(克隆8B5)，CD3结合scFv结构域来自抗CD3抗体(克隆UCHT1)。为了优化CD3结合，引入了新的抗CD3克隆3G8来取代UCHT1。测试了三个版本的3G8scFv结构域(V1至V3)，它们在用于共价连接ARB203重链的Gly-Ser(GS)接头的方向和长度上存在差异。V1在VH-VL中具有3×GS接头；V2在VL-VH中具有3×GS接头；V3在VH-VL中具有6×GS接头。Octet结合分析显示，V2和V3都能与人和猴的CD3结合(图4A)。此外，还评估了V2的相应的亲和力(图4B)。当ARB203作为T细胞接合物整合至双特异性抗体中时，ARB203发挥了强大的杀伤和细胞因子诱导作用(图4C和D)。在三种变体中，V2具有最有利的细胞毒性和细胞因子曲线，与已知的抗CD3克隆UCHT1相当。
为了评估其与Trop2的结合特异性，ARB203表征为其与表达Trop2的HEK293细胞结合的能力以及与Octet平台上Trop2的高亲和力(图5B和C)。此外，ARB203对癌细胞系具有强大的细胞毒性，100％杀伤癌细胞需要<1％的受体占有率(图5D)。
与产生ARB203的方法一样，从抗PD1抗体(克隆1C8)scFv开始产生并表达ARB204，并将来源于克隆10C12的抗CDH17 Fab结构域整合至IgG-scFv形式中。通过这种方式，ARB204与ARB203的作用机制不同。ARB204靶向表达CDH17的GI癌细胞，同时通过阻断PD1-PDL1介导的串扰来抑制免疫检查点。事实上，ARB204与表达PD1的HKE293F结合，并显示出对AsPC1胰腺细胞系的有效细胞毒性(图6)。
实施例4.三特异性抗体或抗体样蛋白质
TriAx-C平台中三特异性抗体的构型是独特的，其中scFv、分裂VH/VL和杵臼Fc结构域的组合可以整合至异二聚体抗体结构的链1和链2中，如图1所示。利用该TriAx-C平台，可以配置针对TAA(例如，CDH17、Trop2)、T细胞接合物(CD3)和免疫检查点靶标(例如，PD1、PDL1、Tigit)的特异性的任何组合，以针对不同适应症产生所需的三特异性抗体。
表1.序列表
序列表
>序列ID号1：抗PDL1(克隆2A6)，小鼠VH序列
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>序列ID号2：抗PDL1(克隆2A6)，人源化VH序列
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>序列ID号3：抗PDL1(克隆2A6)，小鼠VL序列
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>序列ID号4：抗PDL1(克隆2A6)，人源化VL序列
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>序列ID号5：抗Tigit(克隆4F11)，小鼠VH序列
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>序列ID号6：抗Tigit(克隆4F11)，人源化VH序列
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>序列ID号7：抗Tigit(克隆4F11)，小鼠VL序列
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>序列ID号8：抗Tigit(克隆4F11)，人源化VL序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASASSNVIYLAWYQQKPGKAPKLLLYDTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
>序列ID号9：抗CD3(克隆3G8)，小鼠VH序列
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>序列ID号10：抗CD3(克隆3G8)，人源化VH序列
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>序列ID号11：抗CD3(克隆3G8)，小鼠VL序列
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>序列ID号12：抗CD3(克隆3G8)，人源化VL序列
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>序列ID号13：抗Trop2(克隆8B5)，小鼠VH序列
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>序列ID号14：抗Trop2(克隆8B5)，人源化VH序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPAKGLVWVSTINSDGYNIYYSDSMKGRFTISRDNAKYTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARCSYYSYDYFDYWGQGTLVTVSS
>序列ID号15：抗Trop2(克隆8B5)，小鼠VL序列
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>序列ID号16：抗Trop2(克隆8B5)，人源化VL序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIDNYLAWYQQKQGKVPKLLIYAATNLADGMPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQHYYSNQLTFGQGTKLEIK
>序列ID号17：抗PD1(克隆1C8)，小鼠VH序列
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>序列ID号18：抗PD1(克隆1C8)，人源化VH序列
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>序列ID号19：抗PD1(克隆1C8)，小鼠VL序列
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>序列ID号20：抗PD1(克隆1C8)，人源化VL序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNSGVSFMNWYQQKPGQAPRLLIYIASNQVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQIKEVPWTFGGGTKVEIK
>序列ID号21：ARB202，重链
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>序列ID号22：ARB202，轻链
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGGAIKRLIYTTSTLDSGVPKRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>序列ID号23：ARB203，重链
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>序列ID号24：ARB203，轻链
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>序列ID号25：ARB204，重链
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKPAGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRSTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGLNTYFPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRNSNSYYFALDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNSGVSFMNWYQQKPGQAPRLLIYIASNQVSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQIKEVPWTFGGGTKVEIK
>序列ID号26：ARB204，轻链
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>序列ID号27：ARBT01，链1
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FLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLSPGKPAGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGKAIKRLIYTTSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIK
>序列ID号28：ARBT01，链2
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>序列ID号29：UCHT1，人源化scFv
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>序列ID号30：h3G8v1，人源化scFv
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>序列ID号31：h3G8v2，人源化scFv
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>序列ID号32：h3G8v3，人源化scFv
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>序列ID号33：h8B5-h3G8v1，重链
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>序列ID号34：h8B5-h3G8v2，重链
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>序列ID号35：h8B5-h3G8v3，重链
MEFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPAKGLVWVSTINSDGYNIYYSDSMKGRFTISRDNAKYTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARCSYYSYDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKPAGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIYPENVNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDSYGSYFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIK
>序列ID号36：抗PDL1(克隆2A6)CDR-H1序列
GYTFTEYT
>序列ID号37：抗PDL1(克隆2A6)CDR-H2序列
FFPGSGSI
>序列ID号38：抗PDL1(克隆2A6)CDR-H3序列
ARHERGFAY
>序列ID号39：抗PDL1(克隆2A6)CDR-L1序列
ASSSVSY
>序列ID号40：抗PDL1(克隆2A6)CDR-L2序列
STS
>序列ID号41：抗PDL1(克隆2A6)CDR-L3序列
HQWSSYPWT
>序列ID号42：抗Tigit(克隆4F11)CDR-H1序列
GYTFTEYT
>序列ID号43：抗Tigit(克隆4F11)CDR-H2序列
INPNNGGT
>序列ID号44：抗Tigit(克隆4F11)CDR-H3序列
ARLVLRYWYFDV
>序列ID号45：抗Tigit(克隆4F11)CDR-L1序列
ASSNVIY
>序列ID号46：抗Tigit(克隆4F11)CDR-L2序列
DTS
>序列ID号47：抗Tigit(克隆4F11)CDR-L3序列
QQWSSNPLT
>序列ID号48：抗CD3(克隆3G8)CDR-H1序列
GYTFTSYY
>序列ID号49：抗CD3(克隆3G8)CDR-H2序列
IYPENVNT
>序列ID号50：抗CD3(克隆3G8)CDR-H3序列ARDSYGSYFFDY
>序列ID号51：抗CD3(克隆3G8)CDR-L1序列QSLLNSRTRKNY
>序列ID号52：抗CD3(克隆3G8)CDR-L2序列
WAS
>序列ID号53：抗CD3(克隆3G8)CDR-L3序列TQSFILRT
>序列ID号54：抗Trop2(克隆8B5)CDR-H1序列
GFTFSTYT
>序列ID号55：抗Trop2(克隆8B5)CDR-H2序列
INSDGYNI
>序列ID号56：抗Trop2(克隆8B5)CDR-H3序列ARCSYYSYDYFDY
>序列ID号57：抗Trop2(克隆8B5)CDR-L1序列ENIDNY
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AAT
>序列ID号59：抗Trop2(克隆8B5)CDR-L3序列
QHYYSNQLT
>序列ID号60：抗PD1(克隆1C8)CDR-H1序列
GFTFSRST
>序列ID号61：抗PD1(克隆1C8)CDR-H2序列
ISGGGLNTYFPDSVKGRFTI
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TRNSNSYYFALDY
>序列ID号63：抗PD1(克隆1C8)CDR-L1序列
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>序列ID号64：抗PD1(克隆1C8)CDR-L2序列
IAS
>序列ID号65：抗PD1(克隆1C8)CDR-L3序列
QQIKEVPWT
>序列ID号66：抗CDH17(克隆10C12)，人源化VH序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNL GAYWGQGTLVTVSA
>序列ID号67：抗CDH17(克隆10C12)，人源化VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGGAIKRLIYTTSTLDSGVPKRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIK
>序列ID号68：抗CDH17(克隆10C12)，CDR-H1序列
GFTFSSYA
>序列ID号69：抗CDH17(克隆10C12)，CDR-H2序列
IDSNGGST
>序列ID号70：抗CDH17(克隆10C12)，CDR-H3序列
SSYTNLGAY
>序列ID号71：抗CDH17(克隆10C12)，CDR-L1序列
QDISGY
>序列ID号72：抗CDH17(克隆10C12)，CDR-L2序列
TTS
>序列ID号73：抗CDH17(克隆10C12)，CDR-L3序列
LQYASSPFT

Claims (18)

1.一种双特异性抗体，包含具有重链和轻链的IgG结构域以及连接至重链C末端的两个scFv结构域，其中所述IgG结构域包含对选自Trop2和CDH17的第一抗原具有结合特异性的Fab区，其中所述scFv结构域对选自CD3和PD1的第二抗原具有结合特异性。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述Fab结构域包含与选自SEQ ID NO：13、14、15、16、66和67的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scFv结构域包含与选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，包含，
SEQ ID NO：54、55、56的3个重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO：57、58、59的3个轻链CDR，或
SEQ ID NO：68、69、70的3个重链CDR和SEQ ID NO：71、72、73的3个轻链CDR。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，包含，
SEQ ID NO：48、49、50的3个重链CDR和SEQ ID NO：51、52、53的3个轻链CDR，或
SEQ ID NO：60、61、62的3个重链CDR和SEQ ID NO：63、64、65的3个轻链CDR。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原是Trop2，并且所述第二抗原是CD3。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，包含与选自SEQ ID NO：23、24、33、34、35的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原是CDH17，并且所述第二抗原是PD1。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，包含与选自SEQ ID NO：25、26的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体或分离的单克隆抗体。
11.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1所述的双特异性抗体。
12.一种表达载体，其包含根据权利要求11所述的分离的核酸序列。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的分离的核酸序列。
14.一种用于产生根据权利要求1所述的双特异性抗体的方法，包含培养根据权利要求13所述的宿主细胞，从而产生所述抗体。
15.一种用于治疗或预防受试者的癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用包含根据权利要求1所述的双特异性抗体的药物组合物。
16.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1所述的双特异性抗体。
17.根据权利要求28所述的方法，还包含共同施用有效量的治疗剂。
18.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗剂包含抗体、化疗剂、酶或其组合。
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