CN118258998B - 一种抗原特异性b细胞检测探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗原特异性B细胞检测探针及其制备方法和应用，所述探针包括用于靶向抗原特异性B细胞的抗原多肽，以及分别与抗原多肽共价连接的荧光染料和八臂聚乙二醇马来酰亚胺。本发明通过构建抗原特异性B细胞检测探针，直接靶向致病性B细胞，可以通过流式细胞术检测患者的生物样品中致病性抗原特异性B细胞的比例来作为类风湿关节炎（RA）的诊断指标，具有显著的临床诊断价值。此外，将抗原特异性B细胞与对应抗原多肽的自身抗体联合检测，可进一步提升RA诊断效率。
Description
技术领域
本发明涉及疾病诊断技术领域，具体涉及一种抗原特异性B细胞检测探针及其制备方法和应用。
背景技术
抗原特异性B细胞是一种特定类型的B淋巴细胞，其表面表达能够识别和结合特定抗原的B细胞受体（BCR）。BCR识别特定抗原后，抗原特异性B细胞被激活并参与免疫反应，包括产生抗体、形成记忆B细胞以及参与抗原呈递等，在免疫系统中起着关键作用，保护机体免受病原体侵害。然而，在自身免疫病中，抗原特异性B细胞异常激活，通过产生自身抗体和参与免疫调节失衡等途径，促进疾病的发生和发展。在类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）中，抗原特异性B细胞被RA相关自身抗原异常激活，产生大量自身抗体，包括类风湿因子（rheumatoid factor，RF）和抗环瓜氨酸肽（anti-CCP）抗体等，并释放炎症介质，促进疾病的发生进展（Bugatti S, Codullo V, Caporali R, Montecucco C. B cellsin rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 2007;7(2):137-142）。在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）中，抗原特异性B细胞通过分泌多种自身抗体，如抗核抗体和抗双链DNA抗体等，并进一步形成免疫复合物和激活免疫细胞，直接参与了疾病的发生和发展过程（Tsokos GC, Lo MS, Costa Reis P, Sullivan KE. New insights intothe immunopathogenesis of systemic lupus erythematosus. Nat Rev Rheumatol.2016;12(12):716-730）。系统性研究抗原特异性B细胞对于正常免疫反应及自身免疫反应的认识和调控至关重要，而对于这群细胞的精准检测和识别是关键。
然而精准靶向和识别抗原特异性B细胞仍存在许多难点和挑战。目前，研究中最常用的方法是四聚体法（tetramer）。这种方法是借助生物素-链霉亲和素系统，将抗原肽四聚化，可与B细胞表面的多个BCR结合，从而大大提高了多肽与BCR的亲和力和稳定性，实现靶向识别抗原特异性B细胞（Kerkman PF, Fabre E, van der Voort EI, et al.Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cellsin peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis.2016;75(6):1170-1176）。另外，有文献报道通过高分子材料（PIC）作为载体偶联多肽和荧光，同样可以靶向识别抗原特异性B细胞。然而，上述方法存在制备难度大（目前该技术仅掌握在少数几个实验室中），成本高的局限性，加大了研究这群致病性B细胞的难度。另外，由于抗原特异性B细胞比例极低，同时受到探针灵敏度的限制，检测得到的抗原特异性B细胞仅占总B细胞的0.01%-0.06%甚至更低（Kristyanto H, Holborough-Kerkvliet MD,Lelieveldt L, et al. Multifunctional, Multivalent PIC Polymer Scaffolds forTargeting Antigen-Specific, Autoreactive B Cells. ACS Biomater Sci Eng. 2022;8(4):1486-1493）。因此，亟需开发一种灵敏度高、制备简单且成本低的检测探针。
抗原特异性B细胞检测探针的制备有望为这一种学术难题提供解决方案。自身抗体是目前RA诊断的主要指标，包括RF和anti-CCP抗体。然而这些自身抗体敏感性和特异性有限，仍有超三分之一的患者缺乏诊断标志物而被漏诊误诊。能否通过检测上游的抗原特异性B细胞来提高RA的诊断效力值得研究。抗原特异性B细胞检测探针的制备有望为这一种学术难题提供解决方案。
II型胶原（CII）是最常见的RA相关自身抗原之一，可刺激T细胞增殖和B细胞产生的CII抗体。CII二次免疫可引起小鼠关节炎的发生，出现与RA类似的病理表现，即胶原诱导性关节炎（CIA）。此外，CII抗体也可以用于RA的诊断，但敏感性较低（仅40-50%）（BurkhardtH, Sehnert B, Bockermann R, Engström A, Kalden JR, Holmdahl R. Humoral immuneresponse to citrullinated collagen type II determinants in early rheumatoidarthritis. Eur J Immunol. 2005;35(5):1643-1652）。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的：针对目前靶向识别抗原特异性B细胞的方法存在制备难，灵敏度低的困境，发明一种新型抗原特异性B细胞检测探针；针对目前临床上常用的RA诊断方法敏感性较差的难题，提供新的诊断指标，为RA诊断助力。
基于此，本发明还提供了抗原特异性B细胞检测探针的制备方法和应用。
本发明技术方案详述如下：
第一方面，本发明提供了一种抗原特异性B细胞检测探针，包括用于靶向抗原特异性B细胞的抗原多肽，以及分别与抗原多肽共价连接的荧光染料和八臂聚乙二醇马来酰亚胺（MAL-PEG-8arm）。
MAL-PEG-8arm属于PEG材料的一种，具有良好的水溶性、稳定性，低免疫原性和高临床实用性等优点，在医学中用途广泛。本发明利用PEG水溶性好、稳定性高的特性，将其作为载体，形成探针骨架。利用荧光染料对抗原多肽进行标记，再将标记有荧光染料的抗原多肽与MAL-PEG-8arm连接。
上述抗原特异性B细胞探针，基于抗原多肽的特异性结合功能可以直接靶向这群具有致病性的抗原特异性B细胞，通过流式细胞术检测抗原特异性B细胞来作为RA的诊断指标，通过计算这些具有致病性的抗原特异性B细胞的比值进行诊断，可有效避免以往使用血清标志物诊断导致的敏感性差问题，提高RA诊断准确性。
可选或优选的，所述抗原多肽为II型胶原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1（氨基酸序列：C-GA-(cit)-GLTG-(cit)-PGDA-GPOGPO，其中第4、9位为瓜氨酸）所示。
可选或优选的，所述荧光染料为AF647或Cy5.5，均可购买市售产品。相较于其他连接NHS（用于连接多肽）酯标记的荧光染料，AF647、Cy5.5光稳定性更强。
AF647（Alexa Fluor 647）具有极性大、水溶性极好、荧光稳定性能高的特点，特别适应于标记蛋白质，所标记的蛋白不易聚集变性，蛋白表面可以容忍标记多个AF647染料分子从而达到信号倍增效果。
Cy5.5（Cyanine5.5）具有良好的光稳定性和化学稳定性，可以通过其NHS酯、马来酰亚胺或其他活性酯与蛋白质形成共价键。
第二方面，本发明提供了以上任一所述探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将抗原多肽、荧光染料-NHS和三乙胺三种原料在无水DMSO中混匀，氮气保护下震荡反应，反应结束后装入透析袋在蒸馏水中透析以除去未反应原料，获得中间产物；
（2）将中间产物与八臂聚乙二醇马来酰亚胺（MAL-PEG-8arm）加入到PBS中混合，氮气保护下反应，反应结束后装入透析袋在蒸馏水中透析以除去未反应的中间产物与八臂聚乙二醇马来酰亚胺，获得所述探针。
其中，荧光染料-NHS是指连接有NHS的荧光染料。DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸缓冲盐溶液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，可直接购买市售商品也可以自行配制。优选pH值为6.8，偏中性，更利于反应进行。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide），是一种常用的伯胺活化试剂，常用于合成肽、蛋白质化学修饰以及制备药物等方面。NHS与氨基反应的方程式如下：NHS+H2N-R→NHS酯-R+H2O 其中，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，H2N-R表示一种含有氨基的化合物，NHS酯-R表示活化的NHS酯，H2O表示水。NHS与氨基反应主要发生在碱性条件下，其机理为荧光染料-NHS中的NHS与抗原多肽的氨基（-NH2）之间进行酯化反应连接。
抗原多肽中游离的氨基（-NH2）会和荧光染料携带的NHS酯发生酯化反应，使荧光染料共价连接到抗原多肽上。
本发明采用连接有NHS的荧光染料对抗原多肽进行标记，相较于其他标记方式，不会引入其他官能团（容易增加结构及反应的复杂性）。抗原多肽与荧光染料结合用氨基和羧基的缩合反应来进行，-NHS是羧基-COOH活化后的形式，因此基于此反应的合成过程简单，反应条件更为温和，适合大规模生产应用。
实施上述制备方法时，可直接购买自带NHS的商品化荧光染料，例如AF647-NHS、Cy5.5-NHS。
三乙胺为碱性催化剂，三乙胺中氮原子的孤对电子可以与质子结合，形成质子化的三乙胺，其具有更强的碱性，可以促进酯化反应。
步骤（2）中，将中间产物，即进行荧光标记的抗原多肽（抗原多肽的半胱氨酸侧链的胺基（-NH2）与荧光染料的NHS连接），通过其半胱氨酸侧链的巯基（-SH）与PEG中的马来酰亚胺（Mal）连接，完成探针构建。
第三方面，本发明提供了以上任一所述探针在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用。将本发明上述探针制备成流式检测试剂，进行流式细胞术检测，统计抗原特异性B细胞的比例，即可进行RA的诊断。
可选或优选的，所述诊断产品包括探针流式检测试剂。实验结果表明，使用探针进行流式细胞术检测，敏感性能达到70%，特异性为90%。
可选或优选的，所述诊断产品还包括含有捕获抗原的ELISA试剂，所述捕获抗原的氨基酸序列与所述探针的抗原多肽氨基酸序列相同。抗原特异性B细胞的流式检测与对应抗原多肽的自身抗体ELISA检测相联合，可进一步提升RA诊断效率。
第四方面，本发明提供了一种类风湿关节炎诊断产品，其含有以上任一所述的探针。
可选或优选的，上述诊断产品还含有供ELISA方法检测用的捕获抗原，所述捕获抗原的氨基酸序列与所述探针的抗原多肽氨基酸序列相同。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过构建抗原特异性B细胞检测探针，直接靶向识别抗原特异性B细胞；通过流式检测得到的抗原特异性B细胞的比例可以作为RA的诊断指标；抗原特异性B细胞的探针流式检测与相同氨基酸序列作为捕获多肽的自身抗体ELISA检测进行联合，能进一步提高RA诊断效率。
附图说明
图1为双荧光探针靶向抗原特异性B细胞模式图，探针由抗原多肽连接荧光染料再与载体骨架八臂聚乙二醇马来酰亚胺连接构成。抗原多肽为CII多肽，起到靶向抗原特异性B细胞的作用，与抗原特异性B细胞表面受体（BCR）结合，同时探针携带荧光染料（AF647或Cy5.5），便于识别抗原特异性B细胞的检测。
图2 为CII多肽探针检测抗原特异性B细胞的流式示意图，其中横轴代表MAL-PEG-8arm：CII-AF647（CII多肽探针携带AF647荧光），纵轴代表MAL-PEG-8arm：CII-Cy5.5（CII多肽探针携带Cy5.5荧光），图中圈门为抗原特异性B细胞，数字为抗原特异性B细胞在总B细胞中的比例。
图3为CII多肽探针的特异性验证。利用CII多肽探针分选得到抗原特异性B细胞和非抗原特异性B细胞，然后进行体外培养。进而收集细胞培养上清进行抗CII抗体的检测，其中横轴代表两种B细胞类型，纵轴代表细胞分泌的抗CII抗体AU值（Arbitrary units）【AU值=（待测血清OD值/阳性血清OD值）*100，OD值为酶标仪450nm检测值-570nm检测值】，图中* p<0.05。
图4为利用CII多肽探针进行抗原特异性B细胞的检测，并评价其对类风湿关节炎的诊断价值，图中* p<0.05， ** p<0.01, *** p<0.001（采用Kruskal-Wallis检验方法）。
图5为抗CII多肽抗体对类风湿关节炎的诊断价值，图中* p<0.05， ** p<0.01,*** p<0.001（采用Kruskal-Wallis检验方法）。
图6为CII抗原特异性B细胞与抗CII多肽抗体联合检测对类风湿关节炎的诊断价值。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合实施例及附图，对本申请进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例中所用仪器、试剂，如无特殊说明均来源于商业渠道。
实施例1抗原特异性B细胞检测探针的制备
抗原特异性B细胞检测探针包括MAL-PEG-8arm：CII-AF647和MAL-PEG-8arm：CII-Cy5.5。以MAL-PEG-8arm：CII-AF647为例详细说明制备过程。
原料化合物：抗原多肽为II型胶原多肽（简称CII多肽），氨基酸序列：C-GA-(cit)-GLTG-(cit)-PGDA-GPOGPO（SEQ ID NO:1）；荧光染料：AF647-NHS；催化剂：三乙胺。
制备过程：
（1）将CII多肽（0.01 mmol）和AF647-NHS（0.02 mmol）和三乙胺（2 µL）在无水DMSO中混匀，室温条件下，氮气保护下反应，震荡反应。反应结束后将全部溶液装入透析袋（MWCO1000 Da），在蒸馏水中透析2天，以除去未反应的原料化合物。将透析后的溶液冻干，得到中间产物。
（2）将步骤（1）所得中间产物（0.01 mmol）和MAL-PEG-8arm（0.002 mmol）混合在PBS（pH = 6.8）中，室温条件下，氮气保护下反应过夜。反应结束后将全部溶液装入透析袋（MWCO 2000 Da），然后在蒸馏水中透析2天，以除去未反应的中间产物和MAL-PEG-8arm。将透析后的溶液冻干，得到抗原特异性B细胞检测探针MAL-PEG-8arm：CII-AF647固体产物。
采用氮气保护可以防止外部氧化环境干扰，步骤（1）和（2）中的冻干操作利于产品保存更久。
产物用紫外分光光度计检测。
抗原特异性B细胞检测探针为MAL-PEG-8arm：CII-Cy5.5时，将荧光染料换成Cy5.5-NHS（0.02 mmol），其余步骤同上。
抗原多肽为CII多肽的抗原特异性B细胞检测探针制备和识别模式请参考图1，探针的抗原多肽分别连接MAL-PEG-8arm和荧光染料（AF647或Cy5.5），与患者生物样品中抗原特异性B细胞表面的BCR特异性结合以后，抗原特异性B细胞被荧光标记，进而能够被观察统计。
实施例2抗原特异性B细胞检测探针性能评价
2.1 探针有效性
采用淋巴细胞分离液获得人的外周血单个核细胞，流式染色CD3+percp-Cy5.5、CD19+APC、FVD-BV510、抗原特异性B细胞检测探针MAL-PEG-8arm：CII-AF647、MAL-PEG-8arm：CII-Cy5.5，进行流式细胞术检测。在外周单个核细胞上设置了门(FSC/SSC)，FVD-和CD3-/CD19+B细胞，可以标记出CII-AF647+/ CII-Cy5.5+的抗原特异性B细胞。计算出总B细胞中AF647+/Cy5.5+的CII多肽抗原特异性B细胞的百分比。
如图2所示，总B细胞中圈出AF647和Cy5.5两种荧光双阳性，为CII多肽靶向抗原特异性B细胞；AF647和Cy5.5两种荧光双阴性，为非抗原特异性B细胞。图中显示与健康对照相比，RA患者中抗原特异性B细胞明显占比更高，具有很高的识别能力。
2.2 探针特异性
采用流式分选技术分选得到CII多肽识别的抗原特异性B细胞（AF647+/Cy5.5+）和非抗原特异性B细胞（AF647-/Cy5.5-）（图2），分别进行细胞培养，7天后收集培养上清进行CII抗体的ELISA检测。
如图3，结果显示：分选得到的抗原特异性B细胞分泌的抗CII抗体明显高于非抗原特异性B细胞，而非抗原特异性B细胞基本不分泌抗CII抗体。因此，验证了MAL-PEG-8arm：CII-AF647、MAL-PEG-8arm：CII-Cy5.5探针具有特异性，可以有效标记出抗原特异性B细胞，同时也表明这群抗原特异性B细胞是分泌致病性抗体的主要致病细胞亚群。
实施例3 抗原特异性B细胞检测探针检测抗原特异性B细胞，对类风湿关节炎（RA）的诊断价值分析
3.1 抗原特异性B细胞检测探针流式检测对RA的诊断价值分析
选择RA患者20人，疾病对照系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、骨关节炎（OA）和健康对照各10人，获得其外周血，分离得到的单个核细胞做流式检测，验证抗原特异性B细胞检测探针的有效性。
流式细胞术检测技术：
1) 取新鲜EDTA抗凝全血3.5 mL（1 深紫管），与PBS液 1:1 混匀；取15 mL离心管加入7mL人外周血淋巴细胞分离液，缓慢地将稀释的全血加入分离液上层，避免震荡；室温1800rpm离心20min；吸掉上层稀释的血浆，将中间细胞层用1mL移液器缓慢吸至新的15mL离心管，加入 PBS（约10 mL）混匀，1800rpm离心5min；弃上清，得到PBMC。
2) 将提取单个核细胞的离心管中加入12mL PBS混匀，放入离心机，1800rpm5min，弃上清，重复清洗一遍；
3）加入1 mL PBS混匀后转移至新的EP管中，离心1800rpm 5min，弃上清；
4）加入200μL PBS混匀后，避光下分别加入Percp-Cy5.5标记的CD3抗体；APC标记的CD19；MAL-PEG-8arm：CII -AF647、MAL-PEG-8arm：CII -Cy5.5探针标记的抗原特异性B细胞，室温孵育30min；
5) 每管加入1 mL PBS混匀清洗，离心1800rpm 5min，弃上清；再重复洗一次；
6）每管加入300μL的PBS混匀，等待上机；
7）上机前用200目的滤网进行过滤样品至检测管中，避免分子量过大阻塞机器；
8）使用流式细胞分析仪上机收集500,000个细胞，结束后用贝克曼软件进行分析。
如图4所示，A图为用抗原特异性B细胞检测探针对不同人群分离得到的单个核细胞进行染色后流式分析统计的抗原特异性B细胞在总B细胞中的比值结果，显示RA患者中抗原特异性B细胞的比值明显高于正常人和相关疾病对照组，具有统计学意义。B图为抗原特异性B细胞检测探针对RA患者的协变量调整的受者工作特性曲线（ROC）曲线，反映了探针诊断的敏感性和特异性的相互关系，AUC为0.908。图中ROC曲线的横坐标为false positiverate（FPR）即医学上的假阳性；纵坐标为true positive rate（TPR）即医学上的真阳性。AUC：ROC曲线下面积，该值能够量化反映基于ROC曲线衡量出的模型性能。
3.2 抗CII多肽抗体ELISA检测对RA的诊断价值分析
选择上述的RA患者20人，疾病对照系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、骨关节炎（OA）和健康对照各10人，获得其外周血后分离得到的血清做抗CII抗体ELISA检测，分析ELISA检测对RA诊断的敏感性和特异性，并且与抗原特异性B细胞检测探针进行比较。
ELISA检测技术：
1)将包被有CII多肽（氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）的检测板从冰箱中取出放置室温，拆开外包装；
2)孵育血清：1% BSA-PBST稀释样本血清（1:100），每孔100μL，37℃孵育1h；
3) 洗板：用洗液（0.05%PBST）洗板3次，每孔300μL洗液停留2min，用力甩去洗液并拍干；
4) 二抗孵育：加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG（1%BSA-PBST 1:10000稀释，100μL/孔），37℃孵育30min；
5) 洗板：用洗液（0.05%PBST）洗板3次，每孔300μL洗液停留2min，用力甩去洗液并拍干；
6) 显色：吸取 100μL TMB 显色液加到每个微孔中，避光温育15min；
7) 终止：每个微孔中加入100μL终止液（2 mol/L稀硫酸），使用酶标仪读取450 nm和570nm处的光密度值并计算结果。产生的颜色在至少30min内保持稳定，在此时间内读取光密度值；
8) 结果计算：每板均设置阳性对照标准血清，阳性对照标准血清为通过挑选OD值大于1的10例RA血清，等体积混匀所得。最终结果用AU值表示。【AU值=（待测血清OD值/阳性血清OD值）*100，OD值为酶标仪450nm检测值-570nm检测值】
如图5所示，A图为用抗CII多肽抗体ELISA对不同人群外周血血清进行抗CII多肽抗体含量检测的统计结果，结果显示RA患者中的抗CII多肽抗体明显高于正常人和相关疾病对照组，并且具有统计学意义。B图为抗CII多肽抗体ELISA检测对RA患者的ROC曲线，反映了ELISA诊断的敏感性和特异性的相互关系，AUC为0.889。
综上，流式细胞术和ELISA检测结果显示：与正常人和其他疾病对照相比，CII多肽靶向的抗原特异性B细胞和抗CII多肽抗体在RA患者中都明显增加。因此，这两种检测技术对于RA的诊断有具有显著意义。
进一步分析两种检测方法对RA诊断的敏感性和特异性，结果如下表1：
表1. 抗原特异性B细胞和抗CII多肽抗体及其联合对RA的诊断价值分析
结果显示，CII多肽作为抗原多肽的抗原特异性B细胞检测探针在流式检测中诊断RA的敏感性为70%，特异性为90%；抗CII多肽抗体ELISA检测中诊断RA的敏感性为60%，特异性为92.5%。因此，在保证特异性的情况下，抗原特异性B细胞检测探针的敏感性更优于抗CII多肽抗体ELISA检测。同时，探针检测的AUC也高于ELISA检测，说明探针对于RA的诊断具有重要意义。
3.3 CII抗原特异性B细胞检测探针和抗CII多肽抗体联合检测，进一步提高RA诊断效率
当抗原特异性B细胞检测探针（抗原多肽为CII多肽）流式检测与抗CII多肽抗体ELISA检测结果进行联合分析诊断，参见上表1，其敏感性达到90%，特异性达到90%。探针与ELISA联合检测的ROC结果显示：抗原特异性B细胞检测探针（抗原多肽为CII多肽）流式联合抗CII多肽抗体ELISA后AUC达0.938，均高于抗原特异性B细胞检测探针和抗CII多肽抗体ELISA的AUC（0.908和0.889）（参见图6），表明二者联合诊断准确性更高。
图6分别反映了抗原特异性B细胞检测探针流式检测、ELISA试剂盒检测及两者联合检测的敏感性和特异性的相互关系。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种抗原特异性B细胞检测探针，其特征在于，包括用于识别抗原特异性B细胞的抗原多肽，以及分别与抗原多肽共价连接的荧光染料和八臂聚乙二醇马来酰亚胺；所述共价连接为抗原多肽中游离的氨基和荧光染料携带的NHS酯发生酯化反应，使荧光染料共价连接到抗原多肽上，再通过抗原多肽半胱氨酸侧链的巯基与PEG中的马来酰亚胺连接；
所述抗原多肽为II型胶原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光染料为AF647或Cy5.5。
3.权利要求1或2所述探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将抗原多肽、荧光染料-NHS和三乙胺三种原料在无水DMSO中混匀，氮气保护下震荡反应，反应结束后，将反应液装入透析袋中并在蒸馏水中透析以除去未反应原料，得抗原多肽连接荧光染料的中间产物；
（2）将中间产物与八臂聚乙二醇马来酰亚胺加入到PBS中混合，氮气保护下反应，反应结束后装入透析袋在蒸馏水中透析以除去未反应的中间产物与八臂聚乙二醇马来酰亚胺，获得所述探针。
4.权利要求1或2所述探针在制备类风湿关节炎诊断产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诊断产品包括探针流式检测试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诊断产品还包括含有捕获抗原的ELISA试剂，所述捕获抗原的氨基酸序列与所述探针的抗原多肽氨基酸序列相同。
7.一种类风湿关节炎诊断产品，其特征在于，含有权利要求1或2所述的探针。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，还含有供ELISA方法检测用的捕获抗原，所述捕获抗原的氨基酸序列与所述探针的抗原多肽氨基酸序列相同。
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