CN118252898A - 一种天麻提取物及其制备工艺、培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及培养基领域，用以解决现有培养基培养马尔尼菲篮状菌时，生长较慢的问题，提供了一种天麻提取物及其制备工艺、培养基，天麻提取物的制备工艺包括：S1、将天麻磨浆后的浆液通过恒温浸提工序得到初提液，确认初提液中包含天麻的蜜环菌；S2、初提液通过过滤工序得到滤液；S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物。本发明提供的天麻提取工艺尽可能保留天麻的营养成分以及其附的蜜环菌，采用了全新提取工序。通过天麻提取工艺获取蜜环菌，使得蜜环菌同天麻营养成分一起加入马尔尼菲篮状菌的培养基，蜜环菌合成的物质可以有效促进马尔尼菲篮状菌的生长，加快马尔尼菲篮状菌的实验室培养。
Description
技术领域
本发明涉及培养基领域，具体而言，涉及一种天麻提取物及其制备工艺、培养基。
背景技术
马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei，TM)原名马尔尼菲青霉菌，是罕见的温度依赖性双相真菌，感染常发生于免疫抑制、免疫功能低下或缺陷者。马尔尼菲蓝状菌病是由TM感染引起的真菌病。TM已成为侵袭性真菌病最常见的霉菌型致病菌。马尔尼菲篮状菌为胞内寄生菌，主要侵犯单核巨噬细胞系统，当免疫力低下时侵入机体，在肺、肝、肠淋巴组织、淋巴结及脾脏中繁殖，引起致死性系统性感染。临床表现为咳嗽、发热、胸痛，伴淋巴结、肝和脾肿大，约1/3患者有腹泻等消化道症状。
目前马尔尼菲篮状菌的培养一般采用胰酪蛋白胨液体培养基，马尔尼菲篮状菌的生长较慢，培养时间较长。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种天麻提取物及其制备工艺，将提取物用于马尔尼菲篮状菌培养时，可解决采用现有培养基培养马尔尼菲篮状菌时，生长较慢的问题。
本发明的第二个目的还在于提供一种促进马尔尼菲篮状菌生长的培养基，其中蜜环菌可促进马尔尼菲篮状菌的生长，减少培养时间。
本发明的实施例通过以下技术方案实现：
一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，包括：
S1、将天麻磨浆后的浆液通过恒温浸提工序得到初提液，确认初提液中包含天麻的蜜环菌；蜜环菌在夜晚有蓝绿色。
S2、初提液通过过滤工序得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为31.3-40℃，萃取压力为15-25MPa，萃取时间为3-5h, CO2流量为15-20L/h。
申请人在蜜环菌共生实验中发现蜜环菌可促进马尔尼菲篮状菌的生长。虽然蜜环菌与某些植物的共生关系也可以促进植物的生长，比如蜜环菌与天麻的共生，蜜环菌的菌丝体会入侵天麻的消化层，帮助它消化细胞里的内含物用来提供营养。但是对于马尔尼菲篮状菌，尤其在其成长初期，蜜环菌的菌丝是难以入侵的，由此，申请人猜想蜜环菌对马尔尼菲篮状菌生长的促进可能来源于蜜环菌生理活动过程中产生的物质，而此类物质具有类激素作用。由此申请人提出在工业培养马尔尼菲篮状菌时，可加入蜜环菌以促进马尔尼菲篮状菌的生长。尤其，在工业检测某物质比如：血液、骨髓、痰液或眼分泌物等是否含有马尔尼菲篮状菌时，可通过加入蜜环菌减少培养时间。
本发明通过特定的天麻提取工艺获得蜜环菌而不是直接在培养基中加入菌种培养分离后得到的蜜环菌，首先是因为天麻与蜜环菌的共生关系，使得蜜环菌更适应天麻提供的养分组成环境，有利于蜜环菌的生长，天麻提取物也可以作为马尔尼菲篮状菌生长的营养成分，即天麻组分不仅可保持了蜜环菌的活性，还作为培养基的主要营养成分；其次如果在现有的培养基中直接加入马尔尼菲篮状菌和蜜环菌，蜜环菌生长环境的变化，在其保护机制的作用下，其生理活性的恢复需要一定的时间，而本发明的核心目的在于减少马尔尼菲篮状菌的培养时间，所以期望在培养马尔尼菲篮状菌初期，蜜环菌便保持足够的活性；最后，申请人基于天麻提取物有助于蜜环菌提高生理活性的前提，进行了马尔尼菲篮状菌的培养并记录相应的培养时间，却发现天麻提取物在尽可能保持组分类型和组分配比的情况下，蜜环菌对马尔尼菲篮状菌的生长促进作用不如直接在培养基中加入菌种培养分离后得到的蜜环菌，由此申请人猜想可能是天麻提取物中有抑制马尔尼菲篮状菌生长的成分，需要通过提取工艺的改进去除对应组分。
基于上述，本发明在提取工艺的构思和改进过程中，需要以下述两点为基础，一是尽可能减少工艺过程对蜜环菌的影响，比如温度过高导致的蜜环菌死亡等；二是提取过程在尽可能保留组分种类并保持组分配比的前提下分离出抑制马尔尼菲篮状菌生长的成分。
常规的天麻提取一般采用醇提法、水提法、超声波提取法或微波辅助提取法等，本发明采用了全新的提取工艺，在确保天麻有效成分提出的同时蜜环菌可以保留活性。蜜环菌最好选用休眠状态菌索。菌索是由菌丝体平行组成的长条形绳索状结构，外形与植物的根有些相似，所以也称根状菌索。菌索可抵抗不良环境，也有助于菌体在基质上蔓延，提取工艺的构思过程如下：
在申请人猜想天麻提取物中有抑制马尔尼菲篮状菌生长的成分后，通过使用无蜜环菌的天麻提取物作为马尔尼菲篮状菌培养基的组分进行了验证性试验，最终马尔尼菲篮状菌的生长确实受到了抑制，从而确认了猜想。申请人便希望能找出相应的抑制成分，于是将天麻磨浆并过滤后的滤液在不同参数的超临界CO2萃取工序下进行物质分离，并以萃余液作为马尔尼菲篮状菌培养基的组分，通过马尔尼菲篮状菌的生长情况，判定萃余液是否抑制其生长，以期得到的不会抑制马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物，最终确定当超临界CO2萃取工序的萃取温度为31.3-45℃，萃取压力为15-25MPa，萃取时间为3-7h时，萃余液无明显抑制作用。考虑到蜜环菌在温度超过40℃后可能死亡，所以本发明最终的萃取温度选择为31.3-40℃。此外，通过对萃取液成分的分析，申请人猜想是天麻提取物中的腺苷抑制了马尔尼菲篮状菌的生长。
本发明中恒温浸提工序是借助于热力作用使细胞膨胀，发生质壁分离，水渗入细胞壁和细胞质中，溶解液泡中的物质，使其穿过细胞壁，扩散到外部。
优选的，所述超临界CO2萃取工序中添加极性夹带剂，所述超临界CO2萃取工序的萃取时间为3-5h，所述极性夹带剂包括DMSO、乙醇和二丙二醇甲醚中的一种或多种。
在萃余液中抑制成分的测定试验中，发现当超临界CO2萃取工序的萃取温度为31.3-40℃，萃取压力为15-25MPa时，当萃取时间为6-7h，萃余液对马尔尼菲篮状菌的生长无抑制作用，当萃取时间在6h以下时，萃余液对马尔尼菲篮状菌的生长有一定的抑制作用，但蜜环菌对马尔尼菲篮状菌生长的促进作用可抵消萃余液的抑制作用，最终的天麻提取物依然呈现对马尔尼菲篮状菌生长的促进，如果期望提高制备效率，可选用较小的时间参数。
申请人为了通过提取工艺的改进，进一步减少萃余液达到无抑制作用时所用的时间，虽然可以通过提高萃取温度来提高抑制成分在二氧化碳液体中的溶解度，但是温度过高会使得蜜环菌死亡，所以申请人通过加入夹带剂的方式减少后续萃取时间。夹带剂可从两方面影响溶质在超临界流体中的溶解度和选择性，即溶剂流体的密度和溶质与夹带剂分子间的相互作用，通常夹带剂在使用中用量较少对溶剂流体的密度影响不大，甚至还会降低超临界流体的密度，而影响溶解度和选择性的决定因素就是夹带剂与溶质分子间的范德华力或夹带剂与溶质有特定的分子间作用，如氢键、弱络合及其他各种作用力。另外在溶剂的临界点附近溶质溶解度对温度、压力的变化最为敏感，加入夹带剂后，能使混合溶剂的临界点相应改变，更接近萃取温度。增强溶质溶解度对温度压力的敏感程度，使被分离组分通过温度、压力从循环气体中分离出来，以避免气体再次压缩的高能耗。
由于萃取液中物质分析时，极性基团含量较高，申请人猜想的抑制物：腺苷的极性也较大，所以申请人采用极性夹带剂，提高腺苷在二氧化碳液体中的溶解度，减少萃取时间。最佳的，夹带剂采用DMSO。
优选的，在天麻磨浆前，先将天麻置于季铵碱溶液中浸泡5-7天，浸泡时的环境温度为-20℃~-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为5%-20%；浸泡完成后，再进行天麻磨浆操作。
蜜环菌在磨浆、恒温浸提和超临界CO2萃取时均可能受到影响，所以本发明将天麻先置于不利环境中，使得菌索外层由菌丝分化形成较为紧密的外表皮组织，对内部组织进行保护，蜜环菌成为休眠体。申请人在对于不利环境条件的选择过程中，由于高温环境下天麻中的挥发性成分的挥发以及易氧化成分的氧化会导致组分的变化，所以排除了高温环境，选择低温环境。
季铵碱是一种有机碱，易溶于水并发生100%电离，其可以加速蜜环菌的休眠，同时天麻在季铵碱溶液浸泡时，通过浸泡时间、浸泡温度以及溶液浓度的配合，使得天麻细胞中的有效成分不会溶出的同时，细胞壁出现一定程度的降解，从而在后续恒温浸提时，加速有效成分的溶出。此外，季铵碱有一定的防腐作用，可更好的确保天麻组分的不变，所以本发明中采用季铵碱具有三个功能，一是促进蜜环菌的休眠，二是减少天麻保存过程中组分的变化，三是提高恒温浸提工序的效率。
优选的，所述S3中得到的萃余液在3000-4500r/min下离心15-20min，去除沉淀物后得到上清液，以上清液作为天麻提取物。
由于在天麻提取工艺之前进行了蜜环菌的休眠处理，如果不去除菌丝表面的保护组织，在使用天麻提取物培养马尔尼菲篮状菌时，蜜环菌恢复活性的时间会影响马尔尼菲篮状菌的快速生长。由此，本发明在提取工艺后通过离心工序帮助蜜环菌恢复活性。
优选的，所述S3中得到的萃余液先在4000-4500r/min下离心8-15min，再于3000-3500r/min下离心2-5min，去除沉淀物后得到上清液。
本发明在离心初期采用较高的离心速度是为了菌丝表面保护组织的破坏，而保护组织沉淀时，如果依然采用同样的离心速度会导致菌丝的破坏以及沉淀，为了仅去除保护组织部分以及保护菌丝，本发明后续离心过程采用了更低的转速。
优选的，所述恒温浸提工序的步骤包括浆液在25-35℃的恒温水浴下进行浸提18-24h。
为了有效成分的快速溶出，常规浸提时，一般会在浸提过程中同时进行振荡操作，但由于本发明采用的天麻经过季铵碱溶液浸泡处理，所以振荡操作可省去。
一种制备工艺制得的天麻提取物。
一种促进马尔尼菲篮状菌生长的培养基，包括：水、权利要求8所述的天麻提取物、大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液；
以体积百分数计，所述天麻提取物占水的2%-4%，所述大豆酪蛋白肉汤占水的0.5%-1%，所述酵母浸出液占水的0.2%-0.5%。
大豆酪蛋白肉汤：营养丰富，为微生物生长提供氮源。
酵母浸出液：富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分。
单纯地依靠天麻提取物提供马尔尼菲篮状菌以及蜜环菌生长所需的营养成分，组成不够全面，天麻提取物以多糖、醇、醛等为主，蛋白含量相对较低，所以本发明选用了大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液进行补足。
优选的，所述天麻提取物采用-80℃~-60℃冷冻保存；将马尔尼菲篮状菌加入培养基之前，需要将所述天麻提取物、大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液加入培养基并进行活化工序，所述活化工序包括以下操作：所述培养基放置于真空环境，所述真空环境的温度从0℃-5℃升温至20℃-30℃，升温速度为1℃/min-2℃/min，温度升温结束后恢复常压，培养基保温5min-10min。
在需要制备培养基用于马尔尼菲篮状菌培养时，可通过制备工艺制得天麻提取物作为培养基原料，但是制备过程的耗时会增加马尔尼菲篮状菌的培养时间，所以可提前将天麻提取物制备出来，然后采用冷冻保存，随时取用。但是取用时，天麻提取物中蜜环菌需要活化，由此申请人构思了活化工序，在尽可能降低对蜜环菌损害的情况下，加快活化速度。
本发明没有将天麻提取物单独进行活化，而是加入大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液后再进行活化，通过合理的营养组分配比可加快蜜环菌的活化。天麻提取物在解冻时，如果为了解冻速率而选用较高的温度，蜜环菌的组织可能受损，同时天麻提取物中的成分可能挥发、水解或氧化，而温度过低，花用时间又过高，所以本发明采用真空环境解冻，在确保解冻速度的同时还可降低解冻温度，解冻时未采用固定温度而是采用升温的方式配合合理的升温速度可进一步减少蜜环菌组织的破坏。升温结束后的保温，可增加蜜环菌的活化程度。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供的天麻提取工艺为了尽可能保留天麻的营养成分以及其附的蜜环菌，采用了全新的提取工序。通过天麻提取工艺获取蜜环菌，而不是直接使用培养分离得到的蜜环菌，可以使得蜜环菌同天麻营养成分一起加入马尔尼菲篮状菌用的培养基，蜜环菌合成的物质可以有效促进马尔尼菲篮状菌的生长，而天麻的营养物可以使得蜜环菌前后的生长环境变化较小，蜜环菌可以快速恢复生理活性，及时对马尔尼菲篮状菌的生长进行促进，加快马尔尼菲篮状菌的生长；采用超临界CO2萃取工序可以将天麻提取物中抑制马尔尼菲篮状菌生长的物质去除；
本发明提供的天麻提取物可有效促进马尔尼菲篮状菌生长；
本发明提供的培养基，采用活化工序后，可在避免天麻提取物中蜜环菌组织损伤和有效成分变化的前提下快速活化蜜环菌，减少马尔尼菲篮状菌培养时间。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、方法方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的方法方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为7h，CO2流量为20L/h。
实施例2、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为5h，CO2流量为20L/h。
实施例3、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
实施例4、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的DMSO， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
实施例5、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的乙醇， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
实施例6、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的二丙二醇甲醚， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
实施例7、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，将天麻置于季铵碱溶液中浸泡6天，浸泡时的环境温度为-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为10%；浸泡完成后，天麻经过磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的DMSO， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
实施例8、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，将天麻置于季铵碱溶液中浸泡6天，浸泡时的环境温度为-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为10%；浸泡完成后，天麻经过磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，萃余液在4000r/min下离心15min，去除沉淀物后得到上清液，以上清液作为天麻提取物。
所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的DMSO， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
实施例9、一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，将天麻置于季铵碱溶液中浸泡6天，浸泡时的环境温度为-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为10%；浸泡完成后，天麻经过磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，萃余液先在4000r/min下离心10min，再于3000-r/min下离心3min，去除沉淀物后得到上清液，以上清液作为天麻提取物。
所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的DMSO， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
试验例1-9、按实施例1-9制备工艺制得的天麻提取物4%、大豆酪蛋白肉汤1%以及酵母浸出液0.5%混合后，配置成培养基。配置培养基时，现制天麻提取物。试验例n采用实施例n制备工艺制得的天麻提取物，n取1-9。
试验例10、将按实施例9制备工艺制得的天麻提取物4%、大豆酪蛋白肉汤1%以及酵母浸出液0.5%混合后，配置成培养基。配置培养基之前即制得天麻提取物，天麻提取物采用-80℃冷冻保存，配置培养基时将天麻提取物取出并活化，活化工序包括以下操作：将天麻提取物放置于真空环境，所述真空环境的温度从0℃升温至25℃，升温速度为2℃/min，温度升温结束后恢复常压，培养基保温5min。
试验例11、将按实施例9制备工艺制得的天麻提取物4%、大豆酪蛋白肉汤1%以及酵母浸出液0.5%混合后，配置成培养基。配置培养基之前即制得天麻提取物，天麻提取物采用-80℃冷冻保存，配置培养基时将天麻提取物取出，并与大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液一起加入培养基并活化，活化工序包括将培养基放置于真空环境，所述真空环境的温度从0℃升温至25℃，升温速度为2℃/min，温度升温结束后恢复常压，培养基保温5min。
对比例1、一种天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，将天麻置于季铵碱溶液中浸泡6天，浸泡时的环境温度为-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为10%；浸泡完成后，天麻经过磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；以滤液作为天麻提取物。
将新鲜制得的天麻提取物4%、大豆酪蛋白肉汤1%以及酵母浸出液0.5%混合后，配置成培养基。
对比例2、一种天麻提取物的制备工艺:
S1、将新鲜天麻经过清洗、去皮和切块后，将天麻置于季铵碱溶液中浸泡6天，浸泡时的环境温度为-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为10%；浸泡完成后，天麻经过磨浆得到浆液，浆液在25℃的恒温水浴下进行浸提20h，得到初提液，所述天麻包含蜜环菌；
S2、初提液用纱布过滤得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，萃余液先在4000r/min下离心10min，再于3000-r/min下离心3min，去除沉淀物后得到上清液，去除上清液中的蜜环菌后作为天麻提取物。
所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
所述超临界CO2萃取工序中添加1.5ml/g（每g天麻添加1.5ml），体积分数为90%的DMSO， 所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为35℃，萃取压力为20MPa，萃取时间为3h，CO2流量为20L/h。
将新鲜制得的天麻提取物4%、大豆酪蛋白肉汤1%以及酵母浸出液0.5%混合后，配置成培养基。
对比例3、蜜环菌分离培养
清水洗净蜜环菌子实体分离材料的泥土，无菌水冲洗2-3次，用0.1%升汞溶液分别浸泡0.5～1分钟，无菌水冲洗2-3次，去掉残留消毒液，然后用无菌刀切取所需要的部分组织置于无菌培养皿中，将切下来的组织在金霉素溶液中浸润片刻，取出用无菌滤纸吸取表面水液，置于平面PDA培养基上，在25℃恒温条件下培养7天以后开始长出菌索。
将按对比例3制备工艺制得的天麻提取物4%、大豆酪蛋白肉汤1%、酵母浸出液0.5%以及分离得到的蜜环菌混合后，配置成培养基。
试验、在试验例1-11和对比例1-3制得的培养基按2%（v/v）的接种量接种马尔尼菲篮状菌，置于培养箱在25℃条件下，好氧培养72h，记录培养过程中的活菌数。其中，酵母浸出液的制备方法如下：
取500g鲜酵母，加1500ml蒸馏水，搅拌均匀，充分溶解后煮沸15min,冷却后在4000r/min的转速下离心5min，提取上清液，然后煮沸15min，冷却后顺次用K型澄清滤极和0.22毫微米微孔滤板过滤除菌，最后得到酵母浸出液。
马尔尼菲篮状菌购于北纳创联生物科技有限公司，大豆酪蛋白肉汤购于上海瑞楚生物科技有限公司，鲜酵母购于安琪酵母（滨州）有限公司。
活菌数测量方法：
1、将培养基液体充分摇匀后以无菌吸管吸取原液 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1:10的稀释液。
生理盐水的配置：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
2、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品均液。
3、另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。
4、选择3个连续的适宜稀释度（10-6、10-7、10-8），每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液于计数培养基平板上，使用灭菌 L 形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。在恒温培养箱培养 48 h ，培养温度25℃，通过放大镜观察计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。
5、选择菌落数在适宜计数范围内的平板，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每mL中菌落总数结果，实验结果见表1。
表1
从试验例1-11与对比例1-3的数据结果对比可知，采用本发明提供的天麻提取物可有效促进马尔尼菲篮状菌的生长。
从对比例1和试验例9的数据结果对比可知，超临界CO2萃取工序可大幅提高天麻提取物对马尔尼菲篮状菌生长的促进作用，证明天麻组分中含有抑制马尔尼菲篮状菌生长的成分，同时超临界CO2萃取工序可有效去除抑制成分。
从对比例2和试验例9的数据结果对比可知，蜜环菌对马尔尼菲篮状菌的生长具有促进作用。
从对比例3和试验例9的数据结果对比可知，生活环境基本不变时，蜜环菌对马尔尼菲篮状菌生长的促进作用更佳。
从试验例1-3的数据结果对比可知，当超临界CO2萃取时间减少时，活菌数减少，可证明超临界CO2萃取工序去除了抑制马尔尼菲篮状菌生长的物质并且萃取时间越长，抑制物质的去除量越高。
从试验例3和试验例4的数据结果对比可知，超临界CO2萃取工序采用夹带剂后，抑制物质的去除效率大幅提升，3小时的去除率基本达到了无夹带剂时7小时的去除率。
从试验例4-6的数据结果对比可知，夹带剂最佳选用DMSO。
从试验例4和试验例7-9的数据结果对比可知，天麻于季铵碱溶液中的浸泡操作使得蜜环菌休眠，减少了其在后续提取工艺的损伤或死亡，但是其活化时间也相应增加，由此马尔尼菲篮状菌的生长促进效果不明显，而采用离心工序后，蜜环菌活化时间减少，并且先高速离心后低速离心的方式进一步减少了对蜜环菌的损伤。
从试验例9-11的数据结果对比可知，天麻提取物通过提前制备并冷冻保存后，再次取用配制培养基时，培养基的活化过程会一定程度影响蜜环菌对马尔尼菲篮状菌生长的促进作用，但在合理的活化工序下，可降低活化过程对蜜环菌的影响，此外将天麻提取物、大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液混合后一起活化可大幅提高活化效果。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的方法人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将天麻磨浆后的浆液通过恒温浸提工序得到初提液，确认初提液中包含天麻的蜜环菌；
S2、初提液通过过滤工序得到滤液；
S3、滤液通过超临界CO2萃取工序得到萃余液，以萃余液作为天麻提取物，所述天麻提取物用于促进马尔尼菲篮状菌生长；
其中，所述超临界CO2萃取工序的萃取温度为31.3-40℃，萃取压力为15-25MPa，萃取时间为3-7h，CO2流量为15-20L/h。
2.根据权利要求1所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，其特征在于，所述超临界CO2萃取工序中添加极性夹带剂，所述超临界CO2萃取工序的萃取时间为3-5h，所述极性夹带剂包括DMSO、乙醇和二丙二醇甲醚中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，其特征在于，在天麻磨浆前，先将天麻置于季铵碱溶液中浸泡5-7天，浸泡时的环境温度为-20℃~-10℃，所述季铵碱溶液的质量浓度为5%-20%；浸泡完成后，再进行天麻磨浆操作。
4.根据权利要求1-3任一项所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，其特征在于，所述S3中得到的萃余液在3000-4500r/min下离心10-20min，去除沉淀物后得到上清液，以上清液作为天麻提取物。
5.根据权利要求4所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，其特征在于，所述S3中得到的萃余液先在4000-4500r/min下离心8-15min，再于3000-3500r/min下离心2-5min，去除沉淀物后得到上清液。
6.根据权利要求4所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺，其特征在于，所述恒温浸提工序的步骤包括浆液在25-35℃的恒温水浴下进行浸提18-24h。
7.一种由权利要求1-6任一项所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物的制备工艺制得的天麻提取物。
8.一种促进马尔尼菲篮状菌生长的培养基，其特征在于，包括：水、权利要求7所述促进马尔尼菲篮状菌生长的天麻提取物、大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液；
以体积百分数计，所述天麻提取物占水的2%-4%，所述大豆酪蛋白肉汤占水的0.5%-1%，所述酵母浸出液占水的0.2%-0.5%。
9.根据权利要求8所述促进马尔尼菲篮状菌生长的培养基，其特征在于，所述天麻提取物采用-80℃~-60℃冷冻保存；将马尔尼菲篮状菌加入培养基之前，将所述天麻提取物、大豆酪蛋白肉汤和酵母浸出液加入培养基并进行活化工序，所述活化工序包括以下操作：将所述培养基放置于真空环境，所述真空环境的温度从0℃-5℃升温至20℃-30℃，升温速度为1℃/min-2℃/min，温度升温结束后恢复常压，培养基保温5min-10min。
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