CN118421723B - 一种酶催化合成r-型玻色因的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶工程和生物医药技术领域，具体涉及一种酶催化合成R‑型玻色因的方法及其应用。具体的，所述酶催化合成R‑型玻色因的方法包括：以羰基还原酶作为催化酶，加入底物和氧化型辅酶对所述底物进行酶催化反应，获得R‑型玻色因。其中，所述羰基还原酶来源慢生根瘤菌，经研究发现，其能够高效催化合成单一R构型的玻色因产物，且具有反应条件温和，反应时间短，产率高等优点，非常适于工业规模化生产，因此具有良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于酶工程和生物医药技术领域，具体涉及一种酶催化合成R-型玻色因的方法及其应用。
背景技术
目前合成玻色因的方法主要是通过化学法合成，但通过化学法合成的玻色因很难得到专一的R构型，另外化学法合成过程往往需要使用硼氢化钠、锂铝氢、催化氢化等危险试剂和复杂的工艺，造成成本的大幅提升，并且至今没有化学法合成单一R-型玻色因的专利报道。因此，利用酶蛋白催化的高效性和专一性合成R-型玻色因极具优势，其催化条件温和、工艺简单，符合绿色化工的理念。
公开号为CN 116904543 B的中国发明专利公开了一种利用脱氢酶制备R-型玻色因的方法。此外，公开号CN 113717997 A 和 CN 115896199 A等专利均提到了化学酶法合成S-型玻色因的方法，但发明人研究发现，上述方法仍然存在反应时间过长，转化率仍然有待提高等缺陷。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶催化合成R-型玻色因的方法及其应用。具体的，本发明通过对来源于慢生根瘤菌中的羰基还原酶BsKRED进行研究，经实验证明其能够高效催化合成单一R构型的玻色因产物，且具有反应时间短、副产物少、纯度高等优点，从而适于大规模工业化生产。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种酶催化合成R-型玻色因的方法，所述方法包括：以羰基还原酶作为催化酶，加入底物β-丙酮木糖苷和氧化型辅酶对所述底物进行酶催化反应，获得R-型玻色因。
所述反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶，更进一步的，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶可通过同一工程菌进行发酵培养获得；具体方法如下：将所述羰基还原酶编码基因与所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入同一质粒载体中，所述质粒载体导入宿主菌中。
本发明的第二个方面，提供上述方法在工业化生产R-型玻色因中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次筛选获得一种羰基还原酶，其能够高效催化合成单一R构型的玻色因产物，且具有反应条件温和，反应时间短，产率高等优点，非常适于工业规模化生产，因此具有良好的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例中重组载体图谱。
图2为本发明实施例中酶催化制备R-型玻色因色谱图。
具体实施方式
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种酶催化合成R-型玻色因的方法，所述方法包括：以羰基还原酶作为催化酶，加入底物β-丙酮木糖苷和氧化型辅酶对所述底物进行酶催化反应，获得R-型玻色因。
其中，所述底物β-丙酮木糖苷的浓度为180g/L~210g/L，进一步优选为195g/L；
所述氧化型辅酶具体可以为氧化型辅酶II，即NADP+，在该反应体系中，所述氧化型辅酶II浓度控制为1~2g/L，进一步优选为1.5g/L；
所述羰基还原酶具体为羰基还原酶BsKRED，其NCBI登录号为ABQ37878.1；具体的，所述羰基还原酶可通过含有该羰基还原酶编码基因的工程菌进行发酵培养获得。
其中，所述羰基还原酶编码基因如SEQ ID NO.2所示。
更具体的，所述反应条件为：在25~35℃条件下反应4~6h，进一步优选为在30℃反应5h。
进一步的，反应体系中还含有Mg2+，其中，所述Mg2+浓度控制为10~40mM，优选为20mM。
进一步的，所述反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶为BmGDH-M6，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。所述葡萄糖脱氢酶也可通过含有该葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌进行发酵培养获得。
更进一步的，所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶可通过同一工程菌进行发酵培养获得；具体方法如下：将所述羰基还原酶编码基因与所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入同一质粒载体中，所述质粒载体导入宿主菌中。
所述质粒载体可以为pETduent-1，所述宿主菌可以为大肠杆菌BL21(DE3)；
更进一步的，将所述羰基还原酶编码基因插入质粒载体pETduent-1的多克隆位点MCS1中NcoI与NotI之间，将所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入质粒载体pETduent-1的多克隆位点MCS2中NdeI与XhoI之间。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在工业化生产R-型玻色因中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1. 重组载体构建
该羰基还原酶来源于慢生根瘤菌，其NCBI登录号为ABQ37878.1，该酶蛋白序列被命名为BsKRED，其核苷酸序列由上海生工生物工程进行密码子优化（优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），并被构建进入载体pETduent-1的多克隆位点MCS1中NcoI与NotI之间，与此同时葡萄糖脱氢酶基因BmGDH-M6（其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示）同样被上海生工生物工程合成并插入进载体pETduent-1的多克隆位点MCS2中NdeI与XhoI之间，最终重组载体的图谱如图1所示。
2. 粗酶液制备
将重组载体通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，大肠杆菌BL21(DE3)感受态购买自上海唯地生物，其货号为EC1002，按照官网提供的说明书要求进行化学法转化，最后涂布含有氨苄抗性的固体LB平板，37℃，恒温培养箱过夜培养。挑单克隆进入50mL小摇瓶带有20mL LB培养基的摇瓶中，摇床37℃，220r培养12h。按1%接种量转接小摇瓶培养物至500mL摇瓶带有100mL TB培养基摇瓶中，37℃条件下220r培养4h，培养过程中监测OD600，OD600至0.6~0.8时，加入IPTG进行诱导，使其终浓度为1mM，在摇床25℃，220r条件下诱导培养12h。离心收集菌体称重，得到大肠杆菌细胞湿重，按照1g细胞湿重加入10mL磷酸缓冲液进行细胞重悬，然后超声破碎。超声破碎参数功率300W，超声10s，间隔10s，总超声时间15min，超声破碎过程所有操作均在冰上进行，最后4℃，12000r离心去菌渣得到粗酶液。
3. 建立反应体系
在此反应体系中3g湿菌体被破碎全部投入进100mL反应体系中参加反应，底物β-丙酮木糖苷浓度为195g/L，NADP+浓度1.5g/L，MgCl2浓度20mM，反应时间为5个小时，转化率97.6%，如图2所示。
实施例中出现的氨基酸及核苷酸序列信息：
羰基还原酶BsKRED氨基酸序列：
MLPVVACAAMLELRLPPVIAPIQDSAHCRAVIQRAVDELGGIDILVNNAAHQATFSEIGDISDDEWEMTFRTNIHAMFYLTKAAVPHMKPGSAIVNTASVNSDMPNPSLLAYATTKGAIQNFTGGLAQMLADKGIRANAVAPGPIWTPLIPSTMPEEKVTSFGQQVPMKRAGQPAELATAYVMLADPLSSYTSGTTVAVTGGKPFI（SEQ ID NO.1）
羰基还原酶BsKRED编码基因序列：
ATGCTGCCTGTCGTTGCTTGCGCCGCAATGCTGGAACTGCGCCTGCCGCCAGTGATTGCCCCAATCCAGGACTCTGCGCACTGCCGTGCAGTTATCCAGCGTGCAGTGGATGAACTGGGCGGTATCGACATTCTGGTGAACAACGCAGCCCACCAGGCAACCTTCTCTGAAATCGGCGATATCTCCGACGATGAATGGGAAATGACCTTCCGTACCAACATCCACGCTATGTTCTACCTGACTAAAGCCGCTGTGCCGCACATGAAACCGGGCAGCGCCATCGTTAACACTGCGAGCGTTAACTCTGATATGCCAAACCCGTCCCTGCTGGCTTATGCAACTACGAAAGGTGCCATCCAGAACTTCACCGGTGGCCTGGCACAGATGCTGGCTGACAAAGGCATCCGTGCTAACGCAGTAGCTCCGGGTCCGATCTGGACTCCGCTGATCCCTAGCACCATGCCTGAGGAAAAAGTAACCAGCTTCGGTCAGCAGGTCCCGATGAAACGCGCTGGTCAGCCTGCTGAACTGGCTACGGCGTACGTCATGCTGGCTGACCCGCTGAGCTCTTACACTTCTGGTACTACCGTCGCAGTGACGGGTGGTAAACCGTTCATC（SEQ ID NO.2）
葡萄糖脱氢酶BmGDH-M6氨基酸序列：
MAHHHHHHMYKDLEGKVVVITGSSTGLGKSMAIRFATEKAKVVVNYRSKEDEANSVLEEIKKVGGEAIAVKGDVTVESDIINLVQSAIKEFGKLDVMINNAGLENPVPSHEMSLSDWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIRGTVINMSSVHEKIPWPLFVHYAASKGGMRLMTKTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPEQRADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASSEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG（SEQ ID NO.3）
葡萄糖脱氢酶BmGDH-M6编码基因序列：
ATGGCGCATCACCACCACCACCACATGTATAAAGATCTGGAAGGTAAAGTTGTTGTTATCACCGGCTCTTCTACCGGCCTGGGTAAATCTATGGCGATCCGTTTCGCGACCGAAAAAGCGAAAGTTGTTGTGAACTACCGTAGCAAAGAAGATGAAGCGAACAGCGTTCTGGAAGAAATCAAAAAAGTTGGTGGTGAAGCGATCGCGGTTAAAGGCGATGTTACCGTTGAATCTGATATCATCAACCTGGTTCAGAGCGCGATCAAAGAATTCGGTAAACTGGATGTTATGATCAACAACGCAGGCCTGGAAAACCCGGTTCCGTCCCACGAAATGTCTCTGTCTGATTGGAACAAAGTTATCGATACCAACCTGACCGGTGCATTCCTGGGTTCTCGTGAAGCTATCAAATATTTCGTTGAAAACGATATCCGTGGTACCGTTATCAACATGAGCAGCGTTCATGAAAAAATTCCGTGGCCGCTGTTCGTTCACTATGCGGCGTCTAAAGGCGGCATGCGTCTGATGACCAAAACCCTGGCGCTGGAATATGCGCCGAAAGGTATCCGTGTTAACAACATCGGTCCGGGCGCGATTAACACCCCGATCAACGCTGAAAAATTCGCTGATCCGGAACAGCGTGCTGATGTTGAAAGCATGATCCCGATGGGCTACATTGGCGAACCGGAAGAAATCGCGGCGGTTGCAGCGTGGCTGGCGAGCTCTGAAGCTTCTTACGTTACCGGTATCACCCTGTTCGCTGATGGTGGTATGACCCTGTACCCGTCTTTCCAGGCGGGCCGTGGTTAA（SEQ ID NO.4）
本发明未尽事宜为公知技术。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种酶催化合成R-型玻色因的方法，其特征在于，所述方法包括：以羰基还原酶作为催化酶，加入底物β-丙酮木糖苷和氧化型辅酶对所述底物进行酶催化反应，获得R-型玻色因；
所述羰基还原酶为羰基还原酶BsKRED，其NCBI登录号为ABQ37878.1；
所述氧化型辅酶为氧化型辅酶II；
反应体系中还含有Mg2+。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物β-丙酮木糖苷的浓度为180g/L~210g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化型辅酶II浓度控制为1~2g/L。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶通过含有羰基还原酶编码基因的工程菌进行发酵培养获得；其中，所述羰基还原酶编码基因如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化反应的条件为：在25~35℃条件下反应4~6h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Mg2+浓度控制为10~40mM。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有葡萄糖脱氢酶，所述葡萄糖脱氢酶为BmGDH-M6，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述葡萄糖脱氢酶通过含有该葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌进行发酵培养获得。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶通过同一工程菌进行发酵培养获得；
方法如下：将所述羰基还原酶编码基因与所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入同一质粒载体中，所述质粒载体导入宿主菌中；
其中，所述质粒载体为pETduent-1，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)；
将所述羰基还原酶编码基因插入质粒载体pETduent-1的多克隆位点MCS1中NcoI与NotI之间，将所述葡萄糖脱氢酶编码基因插入质粒载体pETduent-1的多克隆位点MCS2中NdeI与XhoI之间。
9.权利要求1-8任一项所述方法在工业化生产R-型玻色因中的应用。
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