[go: up one dir, main page]

CN118434768A - 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体 - Google Patents

激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN118434768A
CN118434768A CN202280083563.4A CN202280083563A CN118434768A CN 118434768 A CN118434768 A CN 118434768A CN 202280083563 A CN202280083563 A CN 202280083563A CN 118434768 A CN118434768 A CN 118434768A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
ltbr
cdr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280083563.4A
Other languages
English (en)
Inventor
R·比安奇
F·博尔曼
M·V·布莱顿
S·邓尔
H·杜尔
G·乔治斯
L·J·汉尼希
M·海德里希
R·霍斯
L·F·昆兹
S·莱克莱尔
D·莱西巴赫
F·门德
O·穆迪格尔
M·尼科洛夫
P·乌玛尼亚
C·瓦格纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Priority to CN202410950466.1A priority Critical patent/CN119143873A/zh
Priority claimed from PCT/EP2022/086540 external-priority patent/WO2023117834A1/en
Publication of CN118434768A publication Critical patent/CN118434768A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及与淋巴毒素β受体(LTBR)结合的新颖抗体，并且涉及包含这些新颖LTBR抗体以及结合肿瘤相关抗原、特别是成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，涉及生产这些分子的方法并且涉及使用这些分子的方法。

Description

激动性LTBR抗体以及包含它们的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及与淋巴毒素β受体(LTBR)结合的新颖抗体，并且涉及包含这些新颖LTBR抗体以及结合肿瘤相关抗原、特别是成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，涉及生产这些分子的方法并且涉及使用这些分子的方法。
背景技术
近年来，在癌症免疫疗法诸如阻断免疫检查点PD-1/PD-L1和CTLA-4的药剂得到开发和批准后，癌症治疗的格局发生了深刻的变化。这些癌症免疫疗法可在癌症适应症诸如黑色素瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌中实现持久缓解，并因此正在成为单独或与其他疗法组合的新型标准护理。然而，仅有一部分患者(<30％)从这些疗法中获得持久的益处，并且大多数患者由于原发性或获得性抗性机制而复发。此外，若干常见的癌症适应症(例如，结直肠癌和胰腺癌)大多是用这些免疫调节剂难治的。因此，在开发疗法以解决抗性机制并且增加对癌症免疫疗法(包括检查点抑制剂)的应答方面存在迫切的医疗需求。
临床数据显示，对检查点抑制剂无应答或应答不佳的患者表现出非T细胞炎症免疫表型，其特征在于不存在细胞毒性T细胞或者其局限于肿瘤基质。因此，旨在增加免疫浸润的新颖疗法对于改善对检查点抑制剂的缓解率、扩大其临床获益将具有巨大的用途。
TNFR超家族由19种配体和29种受体构成，这些配体和受体共有一定的结构相似性，但参与许多不同的生理功能。一般来说，该超家族的成员可诱导细胞死亡(例如，DR5-TRAIL、Fas-FasL)，或者它们可促进存活和炎症(例如，TNF-TNFR)。淋巴毒素β受体(LTBR)是属于第二类的TNFR超家族的成员，并且由多种细胞(包括肿瘤微环境的基质细胞、髓样细胞和上皮来源的肿瘤细胞)表达。TNFR超家族内的配体-受体相互作用可以是单价的，也可以是多价的。例如，OX40及其配体(OX40L)形成单型配体-受体对，而LTBR、LTα、LTβ和LIGHT显示出形成互连途径的复杂网络的多价相互作用。淋巴毒素α1β1(LTα1β1)或LIGHT配体结合对LTBR的活化经由经典和非经典NFκB途径诱导受体寡聚化和信号转导，导致炎症和发育基因如黏附分子(ICAM和VCAM)、化学引诱物(CXCL9、10、11)和淋巴组织趋化因子(CCL21、CCL19、CXCL13)的上调(Lu和Browning.,Front Immunol.2014,5:47,doi:10.3389/fimmu.2014.00047)。该途径对于次级淋巴器官的发育和维持至关重要，如ltbr被敲除的小鼠的表型所示，这些小鼠无法发育淋巴结和派尔集合淋巴结(Fütterer等人,Immunity1998,9(1),59-70,doi:10.1016/s1074-7613(00)80588-9)。此外，它对于高内皮小静脉(HEV)的发育和维持也很关键(Browning等人,Immunity 2005,23(5),539-550,doi:10.1016/j.immuni.2005.10.002)。在许多实体瘤中通过组织学检测到类似于次级淋巴器官的多细胞聚集体，其由T细胞和活化的树突状细胞(DC)、B细胞和HEV构成。临床证据显示，此类异位淋巴器官(也称为三级淋巴结构(TLS))的存在或HEV的存在与若干肿瘤适应症的更好的预后相关(Dieu-Nosjean等人,Immunol.Rev.2016,271(1),260-275,doi:10.1111/imr.12405)。TLS和HEV被认为响应于淋巴结发育诸如LTBR途径活化中涉及的相同分子信号而形成。因此，LTBR的活化具有促进肿瘤微环境中TLS的形成并且诱导抗肿瘤免疫应答的潜力。
事实上，临床前证据支持以下假设：LTBR活化可增加免疫浸润、增强对检查点抑制剂的应答并且诱导TLS形成。通过激动性抗体或靶向配体活化LTBR，在若干小鼠肿瘤模型中增加了T细胞浸润(Lukashev等人,Cancer Res.2006,66(19),9617-9624,doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-0217)。因此，检查点抑制剂与LTBR激动剂组合时的组合疗法更有效(Allen等人,Sci Transl Med.2017,9(385),eaak9679,doi:10.1126/scitranslmed.aak9679；Johansson-Percival等人,Cell Rep.2017,13(12),2687-2698,doi:10.1016/j.celrep.2015.12.004；以及Tang等人,Cancer Cell 2016,29(3),285-296,doi:10.1016/j.ccell.2016.02.004)。此外，还报道了响应于此类激动剂的TLS形成和HEV发育的证据。
除了LTBR在TLS和HEV发育中的关键作用以外，还已经发现LTBR的活化诱导某些癌细胞系的细胞死亡(Browning等人,j Exp Med1996,183(3),867-878,doi:10.1084/jem.183.3.867)。一项I期研究评定了LTBR激动性人源化抗体(hCBE11)在患有晚期实体瘤的患者中的安全性和耐受性(ClinicalTrials.gov,NCT00105170)。该研究在完成患者入组之前暂停并且随后终止。这表明存在与人体内广泛的LTBR激动作用相关联的严重安全问题的可能性。
鉴于LTBR激动剂在改善癌症免疫疗法方面具有巨大的治疗潜力，需要提供具有优异的药理学特征的激动性LTBR抗体、或者具有有利的安全性特征并且能够仅在肿瘤微环境中而不是在其他表达LTBR的组织中活化LTBR的双特异性抗体。
发明内容
本发明涉及与人淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的新型抗体，特别是激动性人LTBR抗体。这些抗体能够以小于2倍的亲和力差异与人LTBR和与食蟹猴LTBR结合。一些新型激动性人LTBR抗体甚至能够与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR结合。本发明还涉及包含这些新型激动性抗体的多特异性抗体。
因此，本文提供了一种与人LTBR和与食蟹猴LTBR特异性结合的激动性淋巴毒素β受体(LTBR)抗体，其中所述抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如本文之前所述的激动性LTBR抗体，其中该激动性抗体具有以下特性中的至少一者：
(a)以小于2倍的亲和力差异与人LTBR和与食蟹猴LTBR结合；或者
(b)以通过ELISA测量的小于4nM的EC50与人LTBR细胞外结构域结合，并且以通过ELISA测量的小于5nM的EC50与食蟹猴LTBR细胞外结构域结合；或者
(c)需要针对其激动活性进行交联以活化人LTBR；或者
(d)需要针对其激动活性进行交联以诱导人脐静脉内皮细胞或癌症相关成纤维细胞中的ICAM上调；或者
(e)抑制人LTBR与其人配体淋巴毒素α1β2和LIGHT之间的相互作用。
在一个方面，提供了一种激动性LTBR抗体，该激动性LTBR抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:89的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
在一个方面，如本文之前所述的激动性LTBR抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一个特定的方面，提供了一种如本文之前所述的激动性LTBR抗体，其中该激动性LTBR抗体进一步与鼠LTBR特异性结合。在一个方面，激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于1nM的EC50与鼠LTBR细胞外结构域结合。
在一个方面，进一步特异性结合鼠LTBR的激动性LTBR抗体包含
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，进一步特异性结合鼠LTBR的激动性LTBR抗体包含
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个特定方面，如本文所述的激动性LTBR抗体与人LTBR上的SEQ ID NO:351的表位区域结合。在一个方面，此类激动性LTBR抗体包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一个方面，包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
本发明还涉及激动性LTBR抗体，其为包含如本文之前所述的激动性LTBR抗体的多特异性抗体。在一个特定方面，提供了作为双特异性抗体的激动性LTBR抗体。在本文之前描述的任何方面，激动性LTBR抗体优选地包含人源、特别是人IgG亚类、更特别是人IgG1亚类的Fc结构域。在一个方面，激动性LTBR抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，该Fc结构域包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个方面，激动性LTBR抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，该Fc结构域具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，激动性LTBR抗体为与LTBR和肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合的双特异性抗体。
在一个方面，提供了一种激动性LTBR抗体，该激动性LTBR抗体为双特异性抗体，该双特异性抗体能够与淋巴毒素β受体(LTBR)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合，并因此将与FAP特异性结合的抗原结合结构域与能够与LTBR、特别是人LTBR激动性结合的至少一个抗原结合结构域组合，其中通过LTBR的活化是通过与肿瘤基质细胞上表达的FAP结合进行交联来提供的。与常规的非靶向激动性LTBR抗体相比，靶向FAP等肿瘤相关抗原(TAA)能够将LTBR激动作用仅限于肿瘤微环境(肿瘤内皮和癌症相关成纤维细胞)，从而减少潜在的副作用。
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是一种丝氨酸蛋白酶，在癌症相关基质细胞的细胞表面上以及次级淋巴器官的成纤维细胞网状细胞上高度表达，但在正常组织中的表达却非常有限。FAP在各种癌症适应症中非常普遍，使其可用作应在肿瘤基质内积累的药物的靶向部分。
因此，在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗体对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
双特异性抗体具有由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该Fc结构域包含降低抗体对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。从而消除了Fc受体介导的交联，并且通过与抗原结合结构域的结合进行交联来实现肿瘤特异性活化，该抗原结合结构域通过与其肿瘤相关靶标结合而与FAP特异性结合。提供了一种双特异性抗体，其仅在与FAP结合后活化LTBR。因此，提供了一种活化肿瘤基质中的LTBR的双特异性抗体。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一Fab片段，
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，其中该双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第三抗原结合结构域，即，包含以下的双特异性激动性LTBR抗体：(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域；以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第三抗原结合结构域跟与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域相同，这意味着与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是相同的。在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域为与LTBR特异性结合的Fab片段。在一个方面，与LTBR特异性结合的Fab片段为crossfab片段。在另一方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab片段。
在一个方面，如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列；或者(ii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQID NO:24的氨基酸序列。在一个特定方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列。在一个特定方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列。特别地，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且该第一抗原结合结构域为Fab片段。
在另一方面，如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
在一个方面，提供了如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体，其中与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)各自包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:89的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
在一个方面，如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)，该第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在另一方面，提供了如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体，其中与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ IDNO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体包含与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)，该第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在另一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在又一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
因此，在一个特定方面，如本文所述的双特异性激动性LTBR抗体包含：(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及(b)与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)，该第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在另一方面，如本文所述的双特异性抗原结合分子包含：(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及(b)与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)，该第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在又一方面，如本文所述的双特异性抗原结合分子包含：(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及(b)与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)，该第二抗原结合结构域(和任选地第三抗原结合结构域)包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在本文之前描述的所有这些方面，双特异性激动性LTBR抗体包含Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个方面，由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域为IgG Fc结构域。在一个特定方面，由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一个特定方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，提供了一种如本文之前所定义的双特异性激动性LTBR抗体，其中根据杵臼结构(knobs into holes)方法，Fc区的第一亚基包含杵并且Fc区的第二亚基包含臼。特别地，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中(i)所述Fc区的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且所述Fc区的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)，或(ii)所述Fc区的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D(根据Kabat EU索引编号)，并且所述Fc区的第二亚基包含氨基酸取代E356K和D399K(根据Kabat EU索引编号)。更特别地，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，其中Fc区的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且Fc区的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在另一方面，提供了一种如本文之前所定义的双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一Fab片段，
(b)与LTBR特异性结合的第二Fab片段，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗体对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。在一个方面，与LTBR特异性结合的第二Fab片段为crossFab片段。因此，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体提供了对LTBR的单价结合以及对FAP的单价结合。
在另一方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一Fab片段，
(b)与LTBR特异性结合的第二Fab片段和第三Fab片段，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗体对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，其中与FAP结合的第一Fab片段在其N末端处融合至Fc结构域亚基中的一者的C末端，并且与LTBR特异性结合的第二Fab片段和第三Fab片段各自在其C末端处融合至Fc结构域亚基中的一者的N末端。
因此，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体提供了对LTBR的二价结合以及对FAP的单价结合。
根据本发明的另一方面，提供了分离的一个或多个分离的多核苷酸，其编码如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体。本发明进一步提供了一种载体，特别是表达载体，该载体包含本发明的分离的多核酸；并且提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的分离的核酸或表达载体。在一些方面，宿主细胞为真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在另一方面，提供了一种生产如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的方法，该方法包括在适合于表达激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的条件下培养如上所述的宿主细胞，并且分离该激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体。本发明还涵盖如通过本发明的方法所生产的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体。
本发明进一步提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体以及药用载体。在一个方面，药物组合物包含另外的治疗剂。
本发明还涵盖如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体，或包含该双特异性激动性LTBR抗体的药物组合物，其用作药物。
在一个方面，提供了如本文之前所述的双特异性激动性LTBR抗体或本发明的药物组合物，其用于(a)诱导内皮细胞或癌症相关成纤维细胞上的ICAM上调，或(b)增强T细胞黏附。
在一个具体方面，提供了如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。在另一个具体方面，本发明提供了如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体，其用于治疗癌症，其中激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体与化疗剂、放射和/或供在癌症免疫疗法中使用的其他药剂组合施用。在一个方面，如本文所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体用于治疗癌症，其中该激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体用于与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂组合施用。在另一方面，提供了如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或本发明的药物组合物，其用于上调或延长细胞毒性T细胞活性。
在另一方面，本发明提供了一种抑制个体的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向该个体施用有效量的如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或本发明的药物组合物，以抑制肿瘤细胞的生长。在另一方面，本发明提供了一种治疗或延缓个体的癌症的方法，该方法包括向该个体施用有效量的如本文之前所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或本发明的药物组合物。
另外，提供了如上文所述的双特异性抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体的疾病的药物中的用途，特别是在制造用于治疗癌症的药物中的用途，以及一种治疗个体的疾病的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的包含本发明的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的组合物，该组合物呈药用形式。在一个具体方面，疾病为癌症。在上述方面中的任何方面，个体为哺乳动物，特别是人。
附图说明
图1A至1G显示了用作噬菌体展示和免疫接种以生成抗LTBR抗体的抗原的重组可溶性蛋白质(受体、配体和工具蛋白质)的示意图。图1A显示了所谓生物素化Fc消耗剂(Fc消耗剂kh NC avi生物素化，P1AA0981)的示意图，其包含杵-臼结构(kh)Fc结构域，该结构域用作预清除剂以避免克隆与Fc结构域结合。图1B显示了人淋巴毒素α1β2单链avi his(P1AE1235)的示意图。图1C显示了鼠淋巴毒素α1β2单链avi his(P1AE1236)的示意图。图1D显示了作为Fc融合avi生物素化(P1AE2835)的单体huLTBR胞外域ECD(S28-M227)的示意图。图1E显示了单体muLTBR胞外域ECD(S28-L223)Fc融合avi生物素化(P1AE4410)的示意图。图1F显示了单体食蟹猴LTBR胞外域ECD(S28-M227)Fc融合avi生物素化(P1AE4411)的示意图。图1G显示了单体N末端人LTBR(ECD全长)hu IgG1 Fc-融合kih HRYF avi(P1AE1217)的示意图。
图2A至2F显示了用于抗LTBR抗体和双特异性FAP-LTBR抗体的筛选和克隆表征的另外的抗原的示意图。图2A显示了二聚人LTBR-Fc融合生物素化(P1AE2401)的示意图。图2B显示了人LTBR ECD(S28-M227)N末端和C末端延伸-Fc融合wt kih HRYF-Avi-His生物素化(P1AE7979)的示意图。图2C显示了单体N末端食蟹猴LTbR(ECD全长)hu IgG1Fc融合kihHRYF avi生物素化(P1AE2656)的示意图。图2D显示了二聚鼠LTBR-Fc二硫键连接的生物素化同源二聚体(P1AE2655)的示意图。图2E显示了人FAP-Avi-His生物素化(P1AA5347)的示意图。图2F显示了鼠FAP-Avi-His生物素化(P1AD9907)的示意图。
图3显示了在夹心ELISA中将Fab克隆FAPltbr.P218.076(IgG转化后的P1AE5929)鉴定为交叉反应性抗体，其中确定了与人LTBR(P1AE2835)和鼠LTBR(P1AE4410)的特异性结合。该抗体源自噬菌体展示。使用人Fc片段(P1AA0981)确认与LTBR的特异性结合，并且排除Fc结合，因为噬菌体展示中所用的抗原已经是Fc标记的融合蛋白。Y轴表示OD450-900。
图4显示了抗LTBR IgG抗体对LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用的抑制。选定的抗LTBRIgG已经从100nM(15μg/ml)开始以3倍稀释度进行滴定。
图5显示了抗LTBR IgG抗体对LTBR-LIGHT相互作用的抑制。选定的抗LTBR IgG已经从100nM(15μg/ml)开始以3倍稀释度进行滴定。
图6显示了在不存在或存在交联抗体(接头)的情况下各种抗LTBR IgG的结果，如在实例1.7中所述的HeLa NFκB luc报告基因测定中所确定的。将抗LTBR IgG的浓度相对于孵育并且添加荧光素酶检测溶液后测得的发出的光的单位(RLU)作图。
图7显示了抗LTBR IgG的细胞表面LTBR结合的评定结果(在重组人LTBR CHO细胞上的FACS)，以荧光强度中位数相对于浓度作图。抗LTBR IgG已经用于从20μg/ml开始的3倍稀释步骤的滴定中。
图8显示了基于8种选定抗LTBR IgG的相应的结合值百分比的表位鉴定热图。
图9A至9E显示了抗LTBR抗体和双特异性FAP-LTBR抗体的示意图。图9A显示了单特异性抗LTBR人IgG1 PG LALA抗体的示意图。图9B显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的1+1抗LTBR/抗FAP双特异性抗体的示意图，其在抗LTBR Fab臂中具有交叉的V结构域并且在抗FAP Fab臂的CH1/Ck结构域中带有电荷。图9C显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的1+1抗LTBR/抗FAP双特异性抗体的示意图，其在抗FAP Fab臂中具有交叉的CH1/Ck结构域。图9D显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的2+1抗LTBR/抗FAP双特异性抗体的示意图，其在抗FAP Fab臂中具有交叉的CH1/Ck结构域并且具有融合至Fc结构域的C末端的第二抗LTBRFab片段。图9E显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的2+1抗LTBR/抗FAP双特异性抗体的示意图，其在两个抗LTBR Fab臂中均具有交叉的V结构域并且在融合至Fc结构域的C末端的抗FAP Fab片段的CH1/Ck结构域中带有电荷。
图10显示了抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用的抑制。选定的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体已经从100nM(15μg/ml)开始以3倍稀释度进行滴定。
图11显示了抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对LTBR-LIGHT相互作用的抑制。选定的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体已经从100nM(15μg/ml)开始以3倍稀释度进行滴定。
图12A和12B显示了鼠替代物双特异性FAP-LTBR抗体的示意图。图12A显示了作为鼠IgG1 DA PG crossMab的1+1抗LTBR/抗FAP双特异性抗体的示意图，其在抗FAP Fab臂中具有交叉的V结构域并且在抗mu LTBR Fab臂的CH1/Ck结构域中带有电荷。图12B显示了作为鼠IgG1DA PG crossMab的2+1抗LTBR/抗FAP双特异性抗体的示意图，其在两个抗LTBRFab臂的CH1/Ck结构域以及融合至Fc结构域的C末端的抗FAP Fab片段的交叉CH1/Ck结构域中带有电荷。图12C显示了作为鼠IgG1 DA PG crossmab的2+1抗LTBR/非靶向(DP47)双特异性抗体的示意图，其在两个抗LTBR Fab的CH1/Ck结构域以及融合至Fc结构域的C末端的非靶向(DP47)Fab片段的交叉CH1/Ck结构域中带有电荷。
图13A至13D显示了抗LTBR激动性抗体以交联依赖性方式上调内皮细胞上的ICAM。所示为在存在(图13A和图13C)或不存在(图13B和图13D)Fc交联抗体(抗Fc交联剂)的情况下用抗人LTBR激动性抗体处理的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的ICAM的荧光强度中位数。数据根据抗LTBR抗体CBE11(P1AE1873)的活性进行了归一化。
图14A至14D显示了抗LTBR激动性抗体以交联依赖性方式上调癌症相关成纤维细胞(CAF)上的ICAM。所示为在存在(图14A和图14C)或不存在(图14B和图14D)抗Fc交联剂的情况下用抗人LTBR激动性抗体处理的永生化CAF上的ICAM的荧光强度中位数。数据根据抗LTBR抗体CBE11(P1AE1873)的活性进行了归一化。
图15A至15F显示了FAP-LTBR双特异性抗原结合分子与经工程化以过表达人、食蟹猴或鼠LTBR的CHO-K1细胞上的人(图15A和图15D)、食蟹猴(图15B和图15E)和鼠LTBR(图15C和图15F)的结合。所示为检测过表达人LTBR(图15A和图15D)、食蟹猴LTBR(图15B和图15E)或鼠LTBR(图15C和图15F)的细胞上结合的FAP-LTBR双特异性分子的抗人Fc二抗的荧光强度中位数。数据根据基线进行了归一化。
图16A至16D显示了FAP-LTBR双特异性抗原结合分子以FAP依赖性方式上调癌症相关成纤维细胞上的ICAM。所示为内源性表达LTBR和FAP(图16A和图16C，hTERT CAF)或仅表达LTBR(图16B和图16D，hTERT CAFs_delFAP)的永生化CAF上的ICAM荧光强度中位数。数据根据未经处理的对照的ICAM表达进行了归一化。
图17A至17D示出FAP-LTBR双特异性分子以FAP依赖性方式上调内皮细胞上的ICAM。所示为与过表达FAP的NIH-3T3细胞(图17A和图17C)或缺乏FAP表达的NIH-3T3细胞(图17B和图17D)共培养的CD31+HUVEC上的ICAM的荧光强度中位数。数据根据未经处理的对照的ICAM表达进行了归一化，并且EC50值显示在图例中。
图18A至18F证明FAP-LTBR双特异性抗原结合分子以FAP依赖性方式诱导内皮细胞分泌化学引诱物。通过Bio-plex测量与用FAP-LTBR双特异性分子处理48小时的过表达FAP的NIH-3T3细胞(图18A、图18C和图18E)或缺乏FAP表达的NIH-3T3细胞(图18B、图18D和图18F)共培养的HUVEC的上清液中不同趋化因子(CXCL9、CXCL10和CXCL11)的浓度。
图19显示了用FAP-LTBR双特异性抗原结合分子刺激的内皮上的T细胞黏附的增加。所示为贴壁于HUVEC培养物的带标记的T细胞的面积，该HUVEC培养物在存在(黑色条)或不存在(白色条)FAP的情况下用FAP-LTBR双特异性抗体(2nM)进行刺激。将TNFα(0.5ng/mL)用作阳性对照。
图20A和20B证明FAP-LTBR双特异性抗体替代物分子在体外以FAP依赖性方式上调小鼠成纤维细胞上的黏附分子。所示为用FAP-LTBR抗体替代物分子或抗小鼠LTBR激动性抗体(5G11)处理的NIH-3T3细胞(图20A)或过表达FAP的NIH-3T3细胞(图20B)上的VCAM的荧光强度中位数。数据根据未经处理的对照的VCAM基线表达进行了归一化。
图21A和21B显示FAP-LTBR双特异性抗体替代物分子在体外以FAP依赖性方式上调内皮细胞上的黏附分子。显示了与NIH-3T3(图21A)或过表达FAP的NIH-3T3细胞(图21B)共培养的CD31+HUVEC上的ICAM的荧光强度中位数。
图22显示了评估单独的FAP-LTBR双特异性抗体或与抗PD-L1抗体组合的FAP-LTBR双特异性抗体在皮下MC38-hu CEA肿瘤模型中的安全性、有效性和药效学特征的体内小鼠研究的研究设计。时间线描述了治疗和处死时间点，并且表格描述了本研究的治疗组、给药和时间安排的详细信息。
在图23A中，显示FAP-LTBR替代物分子以单一疗法在MC38-huCEA皮下肿瘤模型中抑制肿瘤生长，并且改善对aPD-L1治疗的应答。经媒介物、P1AF4664、P1AF4674、aPD-L1、P1AF4664+aPD-L1和P1AF4674+aPD-L1治疗的小鼠的肿瘤生长曲线绘制于图23A中。治疗开始12天时的肿瘤体积比较显示，媒介物与P1AF4764、媒介物与P1AF4664+aPD-L1、媒介物与P1AF4674+aPD-L1以及aPD-L1与P1AF4674+aPD-L1相比，存在具有统计学意义的更大的体积。统计分析使用单向Anova、Holm-Sidak多重比较检验(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)来进行。(图23B)。经媒介物、P1AF4664、P1AF4674、aPD-L1、P1AF4664+aPD-L1和P1AF4674+aPD-L1治疗的小鼠的个体肿瘤生长曲线显示于图23C至23H中。
图24A和24B证明FAP-LTBR替代物分子能够在MC38-huCEA皮下肿瘤模型中诱导内皮活化。在治疗开始后第9天和第16天对肿瘤单细胞悬液进行流式细胞术分析。以CD45-、huCEA-、CD31+和平足蛋白-对内皮细胞进行门控，并且对ICAM的荧光强度中位数(图24A和图24B)进行定量。数据显示，在整个治疗过程中，用P1AF4664和P1AF4674治疗，增加了肿瘤内皮细胞上的ICAM。统计分析使用单向Anova、Holm-Sidak多重比较检验(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)来进行。
图25显示了评估单独的FAP-LTBR双特异性抗体或与抗PD-L1抗体组合的FAP-LTBR双特异性抗体在皮下KPC4662-huCEA肿瘤模型中的安全性、有效性和药效学特征的体内小鼠研究的研究设计。时间线描述了治疗和处死时间点，并且表格描述了本KPC4662-huCEA研究方案的治疗组、给药和时间安排的详细信息。
图26A至26C证明FAP-LTBR替代物分子在KPC4662-huCEA皮下肿瘤模型中诱导高内皮小静脉。与媒介物组相比，在治疗组中记录到Meca79阳性血管(占所有血管的分数)显著增加。统计分析使用单向Anova、Holm-Sidak多重比较检验(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)来进行(图26A)。图26B和图26C分别显示了来自处理开始后第6天的P1AF4664处理样品中CD31(所有血管)和Meca79(HEV)的代表性免疫荧光染色。
图27显示了哦也能够与评估单独的LTBR双特异性抗原结合分子或与抗PD-L1抗体组合的LTBR双特异性抗原结合分子在原位EMT6肿瘤模型中的安全性、有效性和药效学特征的体内小鼠研究的研究设计。时间线描述了治疗和处死时间点，并且表格描述了本EMT6研究方案的治疗组、给药和时间安排的详细信息。如果没有另外说明，则在上述所有时间点(d0、d2、d5、d7等)注射媒介物和鼠替代物LTBR双特异性抗原结合分子P1AG5459和P1AG5461(非靶向对照)。如果没有另外说明，仅在空箭头指示的时间点注射PDL1。
在图28A和28B中，显示鼠替代物FAP-LTBR双特异性抗体(P1AG5459)以单一疗法在EMT6原位肿瘤模型中抑制肿瘤生长，并且改善对aPD-L1治疗的应答。经媒介物、P1AG5459、P1AG5461、aPD-L1和P1AG5459+aPD-L1治疗的小鼠的肿瘤生长曲线(中位数)绘制于图28A中。治疗开始后22天时肿瘤体积的比较绘制于图28B中，并且显示媒介物相对于P1AG5459、媒介物相对于P1AG5459+aPD-L1、P1AG5459相对于P1AG5461以及P1AG5461相对于P1AG5459+aPD-L1存在具有统计学意义的更大的体积。统计分析使用单向Anova、Holm-Sidak多重比较检验(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)来进行。
图29A至29C证明，鼠替代物LTBR双特异性抗体P1AG5459能够在EMT6原位肿瘤模型中以FAP依赖性方式诱导内皮活化和HEV分化。在治疗开始后第13天对肿瘤单细胞悬液进行流式细胞术分析。以CD45-、CD31+和平足蛋白-对内皮细胞进行门控，并且对ICAM(图29A)和VCAM(图29B)的荧光强度中位数或Meca79+内皮细胞的百分比(图29C)进行定量。数据显示单独用P1AG5459或与aPD-L1组合治疗，但不与非靶向对照P1AG5461组合治疗，可增加肿瘤内皮细胞上的ICAM和VCAM并且提高Meca79+内皮细胞的频率(图29C)。对内皮活化和HEV分化的影响在应答者小鼠(□)中比无应答者小鼠(●)更明显。
图30A显示单独使用P1AG5459或与aPD-L1组合的治疗增加了在治疗开始后第13天通过免疫荧光成像定量的Meca79+内皮细胞的量，但P1AG5461并不增加内皮细胞的量。示例图像显示了主要血管系统(如CD31染色所示)和Meca79+内皮细胞的定位。
图30B、30C和30D显示了如治疗开始后第13天通过免疫荧光成像测量的CD8 T细胞(图30B)、CD4 T细胞(图30C)和B220+B细胞(图30D)向EMT6正位肿瘤的浸润的定量。P1AG5459单独使用或与aPD-L1组合使用时增加肿瘤中T和B细胞的数量，aPD-L1单独使用时也可以在一定程度上增加T和B细胞的数量，但P1AG5461不会增加T和B细胞的数量。在P1AG5459单一疗法的情况下，与无应答者小鼠(●)相比，在应答者小鼠(□)中可以观察到明显的相关性。
图31A至31C证明鼠替代物FAP-LTBR双特异性抗体(P1AG5459)在EMT6原位肿瘤模型中诱导趋化因子的上调。测量在治疗开始后第13天收集的肿瘤裂解物中的趋化因子CXCL13(图31A)、CCL5(图31B)和CCL10(图31C)的浓度。用P1AG5459治疗的肿瘤趋于具有更高含量的CXCL13、CCL5和CXCL10。应答者肿瘤(□)趋于表现出更高浓度的趋化因子。
在图32A至32C中，显示在EMT6原位肿瘤模型中由鼠替代物FAP-LTBR双特异性抗体(P1AG5459)介导的肿瘤生长抑制是由CD8、CD4 T和B细胞介导的。肿瘤生长曲线(中位数)绘制于图32A中。第15天时肿瘤体积的比较绘制于图32B中，并且显示在不存在CD8 T细胞的情况下，当比较媒介物和P1AG5459治疗的小鼠时，肿瘤体积没有差异。第20天时肿瘤体积的比较绘制于图32C中，并且显示在不存在CD4 T细胞或表达CD20+的B细胞的情况下，当比较媒介物和P1AG5459治疗的小鼠时，肿瘤体积没有差异。
图33显示了用媒介物或鼠替代物FAP-LTBR双特异性抗体(P1AG5459)治疗的原位结直肠癌肿瘤的代表性免疫荧光图像。通过对增殖细胞进行Ki67染色来鉴定肿瘤，并且肿瘤边界用虚线标记。CD31标记血管，pNAD/Meca79标记高内皮小静脉，并且CD8标记CD8 T细胞。代表性图像显示P1AG5459在肿瘤中诱导HEV分化和CD8浸润，但在周围正常结肠组织中则不具有诱导作用。
图34显示了在用P1AG5459治疗后携带原位CRC的小鼠中的三级淋巴结构(TLS)的发育。整个切片的Ki67染色引导肿瘤边缘的鉴定，用虚线标记。整个切片的B220(B细胞)染色突出显示了B细胞聚集体，该聚集体在随后的图像中被放大。放大图像更详细地表征了TLS的细胞组成，其中含有pNAD/Meca79+高内皮微静脉、CD11c+髓样细胞、B220+Ki67+增殖细胞(指示生发中心)、CD8和CD4 T细胞，其中一些细胞共表达活化标志物PD1和干性标志物TCF1。
图35A和35B比较了含有不同LTBR抗原结合结构域的FAP-LTBR双特异性抗原结合分子以FAP依赖性方式上调内皮细胞上的ICAM的能力。显示了与过表达FAP的NIH-3T3(图35A)或缺乏FAP表达的NIH-3T3细胞(图35B)共培养的CD31+HUVEC上的ICAM的荧光强度中位数。数据根据未经处理的对照的ICAM表达进行了归一化。
图36A至36C比较了含有不同LTBR抗原结合结构域的FAP-LTBR双特异性抗原结合分子在经工程化以过表达人、食蟹猴或鼠LTBR的CHO-K1细胞上结合人(图36A)、食蟹猴(图36B)和鼠LTBR(图36C)的能力。所示为检测过表达人LTBR(图36A)、食蟹猴LTBR(图36B)或鼠LTBR(图36C)的细胞上结合的FAP-LTBR双特异性分子的抗人Fc二抗的荧光强度中位数。数据根据基线进行了归一化。
图37A至37E显示了抗LTBR IgG抗体和双特异性FAP-LTBR抗体的示意图。图37A显示了单特异性抗LTBR人IgG1 PG LALA抗体(BHA10,P1AH0119)的示意图。图37B显示了作为人IgG1 PG LALA的双特异性2+1抗LTBR/抗FAP(4B9)抗体的示意图，其具有对LTBR(CBE11)具有特异性的2个N末端Fab臂以及克隆4B9(P1AE1079)的C末端抗FAP VL和VH结构域。图37C显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的1+1抗LTBR(BHA10)/抗FAP(4B9)双特异性抗体(P1AH5884)的示意图，其在抗LTBR Fab臂中具有交叉的VL/VH结构域并且在抗FAP Fab臂的CH1/Ck结构域中带有电荷。图37D显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的2+1抗LTBR(BHA10)/抗FAP(4B9)双特异性抗体(P1AH5885)的示意图，其在两个抗LTBR Fab臂中均具有交叉的V结构域并且在融合至Fc结构域的C末端的抗FAP Fab片段的CH1/Ck结构域中带有电荷(Fc杵链)。图37E显示了作为人IgG1 PG LALA crossMab的2+1抗LTBR(P1AE9459)/抗FAP(212)双特异性抗体(P1AH5886)的示意图，其在两个抗LTBR Fab臂中均具有交叉的V结构域并且在融合至Fc结构域的C末端的抗FAP Fab片段的CH1/Ck结构域中带有电荷(Fc杵链)。
图38A至38D显示了结合的人LTBR与非复合LTBR相比的氘化差异图。氘化差异图显示了人LTBR(P1AH2680)的一级序列，以及对于五种不同标记时间15秒、1分钟、10分钟、60分钟和300分钟的人LTBR加抗体/配体与无抗体/配体LTBR之间的氘化差异。序列上方的条显示了肽。方框指示针对相应的抗体/配体的建议的表位。下方将拟定的表位映射(黑色区域)到alphafold模型AF-P36941-F1-model_v2 S28至M227上。所示为人LTBR上针对P1AE9459(图38A)、P1AE1873(图38B)；P1AH0119(图38C)和P1AE1235(图38D，配体)的拟定表位。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。
如本文所用，术语“抗原结合分子”或“抗体”可互换使用并且在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例为抗体、双特异性抗体或多特异性抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域”或“能够与靶细胞抗原特异性结合的部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在一个特定方面，抗原结合结构域能够将与其连接的实体(例如，LTBR激动性抗体)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。另外，能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。特别地，能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域为能够与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的抗原结合结构域。关于抗体或其片段，术语“能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域”是指分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。可通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供能够特异性抗原结合的抗原结合结构域。特别地，能够特异性抗原结合的抗原结合结构域包含抗体的抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。在另一方面，“能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域”也可以是Fab片段或交叉Fab片段。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够与至少两种独特的抗原决定簇特异性结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。如本文所述的双特异性抗原结合分子还可形成多特异性抗体的一部分。
本申请中所用的术语“价态”表示在对一种独特抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子中存在特定数量的对一种独特抗原决定簇具有特异性的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在对特定抗原决定簇具有特异性的两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在本发明的特定方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子对特定抗原决定簇可以是单价的，意味着它们对所述抗原决定簇仅具有一个结合位点，或者对特定抗原决定簇可以是二价或四价的，意味着它们对所述抗原决定簇分别具有两个结合位点或四个结合位点。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用地是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，之后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，该五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如：EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，该轻链片段包含VL结构域和轻链恒定结构域(CL)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。根据本发明，术语“Fab片段”还包括如下文所定义的“交叉Fab片段”或“交换型Fab片段”。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中该抗体结构域和该接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中该接头是至少30个氨基酸，优选是32个至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中该抗体结构域和该接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中该接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，与十个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra，Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子(诸如蛋白A的Z结构域(亲和体))、A结构域(Avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody(例如US7166697B1)。Evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见Journal ofImmunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，可转运小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。Anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见Biochim Biophys Acta1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架，其可以被工程化改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP 1641818A1。Avimer是来源于A结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组A结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞支架的附接的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而设计成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白可以经工程化以结合抗原的支架。Adnectin由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化，以使Adnectin能够特异性识别目标治疗靶标。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，该恒定的支架蛋白含有在活性位点处插入的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3个至4个半胱氨酸桥、长度为25个至50个氨基酸的天然存在的微蛋白，该微蛋白的实例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
作为参考分子的“与相同表位结合的抗体”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中该抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。作为参考分子的“并非与相同表位结合的抗体”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子未使参考分子与其抗原的结合阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子未使抗原结合分子与其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”是指抗体的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性地结合并互补的区域。在抗原较大的情况下，抗体可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个特定实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。
如本文所用，“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，特别地肿瘤中的靶细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。因此，靶细胞抗原是肿瘤相关抗原。特别地，“肿瘤相关抗原”或TAA为成纤维细胞活化蛋白(FAP)。
术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”也称为脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指任何脊椎动物来源的任何天然FAP，该脊椎动物来源哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工FAP，以及通过细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合到人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(149版，SEQ ID NO:2)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的细胞外结构域(ECD)从氨基酸位置26处延伸至位置760处。Avi-His标记的人FAP的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:264中。小鼠FAP的氨基酸序列示出于UniProt登录号P97321(126版，SEQ ID NO:282)或NCBIRefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP的胞外结构域(ECD)从氨基酸位置26延伸至氨基酸位置761。SEQ ID NO:265示出Avi-His标记的小鼠FAP的氨基酸。优选地，本发明的抗FAP结合分子与FAP的细胞外结构域结合。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并且确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在以下氨基酸残基处的CDR：24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)，以及93至101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名系统来确定。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其他形式为这样的抗体，其中相对于原始抗体，恒定区已经过额外的修饰或改变以产生根据本发明的特性，尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。
术语“CH1结构域”表示大致从EU 118位延伸至EU 215位(根据Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个方面，CH1结构域具有ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO:283)的氨基酸序列。通常，接下来具有EPKSC(SEQ ID NO:284)的氨基酸序列的区段将CH1结构域连接至铰链区，然而，在具有游离C末端的CH1结构域的情况下(诸如在crossfab片段中)，该区段还可以包含EPKSCD(SEQ ID NO:285)或EPKSCS(SEQ IDNO:286)的氨基酸序列。
术语“铰链区”表示抗体重链多肽的在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域的部分，例如根据Kabat的EU编号系统从约位置216至约位置230，或根据Kabat的EU编号系统从约位置226至约位置230。其他IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。铰链区通常是由两种氨基酸序列相同的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含多达25个氨基酸残基，并且是柔性的，允许相关联靶结合位点独立地移动。铰链区可细分为三个结构域：上铰链区、中铰链区和下铰链区(参见例如，Roux等人,J.Immunol.161(1998)4083)。在一个方面，铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO:287)，其中X为S或P。在一个方面，铰链区具有氨基酸序列HTCPXCP(SEQ ID NO:288)，其中X为S或P。在一个方面，铰链区具有氨基酸序列CPXCP(SEQ ID NO:289)，其中X为S或P。
本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgGCH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约第231位的氨基酸残基延伸至约第340位的氨基酸残基。(根据Kabat的EU编号系统)。在一个方面，CH2结构域具有APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:290)的氨基酸序列。CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域的配对不紧密。相反，两个N连接的支链碳水化合物链介于完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。在一个实施例中，碳水化合物链连接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以为天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中C-末端至CH2结构域的一段残基(即，来自根据EU编号系统(根据IgG的Kabat)的约341位处的氨基酸残基到约447位处的氨基酸残基)。在一个方面，CH3结构域具有GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG(SEQ ID NO:291)的氨基酸序列。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在其一个链中具有引入的“凸起”(“杵”)并在其另一个链中具有相应的引入的“空腔”(“臼”)的CH3结构域；参见美国专利号5,821,333，其以引用方式明确并入本文)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
术语“野生型Fc结构域”表示与自然界中发现的Fc结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc结构域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。野生型Fc区表示在SEQ IDNO:155(IgG1，白种人同种异型)、SEQ ID NO:156(IgG1，非裔美国人同种异型)、SEQ ID NO:157(IgG2)、SEQ ID NO:158(IgG3)和SEQ ID NO:159(IgG4)中。术语“变体(人)Fc结构域”表示与“野生型”(人)Fc结构域氨基酸序列的氨基酸序列区别在于至少一个“氨基酸突变”的氨基酸序列。在一个方面，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，诸如在天然Fc区中从约一个到约十个氨基酸突变，并且在一个方面，从约一个到约五个氨基酸突变。在一个方面，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％的同源性。
“杵臼(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。举例而言，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie，J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，该Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞以及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如：Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.,等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.,等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341和Gessner,J.E.,等人,Ann.Hematol。76(1998)231-248中。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个残基处的修饰降低与FcγRI的结合。在233-236位的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合IgG，并得到广泛表达。该受体可分为两种亚型，即FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)中，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞中。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并且包括两种类型。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上，并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIIA的结合力降低。
Shields,R.L.等人(J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)描述了人IgG1上与Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”是由Fc受体结合介导的功能，并且是指在效应子细胞存在下本文所报道的抗体对靶细胞的裂解。通过测量抗体与表达Fcγ受体的细胞(诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA或NK细胞(在本质上表达FcγRIIIA)的细胞)的结合来研究抗体诱导介导ADCC的初始步骤的能力。特别地，测量与NK细胞上与FcγR的结合。
“活化Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“LTBR”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然淋巴毒素β受体(LTBR)，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”的未加工LTBR，以及通过细胞中加工产生的任何形式的LTBR。该术语还涵盖LTBR的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人LTBR的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:1(UniProt登录号P36941)中，并且示例性小鼠LTBR的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:297(UniProt登录号B2RRV3)中。受体在大多数淋巴器官的实质和基质中的细胞表面表达，但不存在于T淋巴细胞和B淋巴细胞上。LTBR也可称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员3(TNFRSF3)”。LTα/β异三聚体(LTα1β2)通过LTBR进行的信号传导在淋巴发育期间很重要。已知LTBR还结合配体LIGHT(TNFSF14)。LTα1β2对LTBR具有特异性，而LIGHT也与HVEM(TNFRSF14)(一种在免疫细胞上表达并且参与免疫细胞的调节的受体)结合并且使其活化。
如本文所用的术语“LTBR激动剂”包括使LTBR与其配体的相互作用激动的任何部分。如此上下文中所用，LTBR优选地是指人LTBR，因此LTBR激动剂优选地为人LTBR(SEQ IDNO:1)的激动剂。通常，该部分将为激动性LTBR抗体或抗体片段。
术语“抗LTBR抗体”、“抗LTBR”、“LTBR抗体”和“与LTBR特异性结合的抗体”是指能够以足够的亲和力与LTBR特异性结合的抗体，是的该抗体可用作在靶向LTBR中的诊断剂和/或治疗剂。在一个方面，例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)所测得的，抗LTBR抗体与不相关的非LTBR蛋白的结合程度小于该抗体与LTBR结合程度的约10％。在某些实施例中，与LTBR结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-6M或更小，例如10-68M至10-13M，例如10-8M至10-10M)的解离常数(KD)。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸(通常约2至20个氨基酸)的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽为例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为在1与10之间、通常在2与4之间的数字，特别是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:298)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:299)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:300)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:301)，但也包括以下序列：GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:302)、(G4S)3(SEQ ID NO:303)、(G4S)4(SEQ ID NO:304)、GSGSGSGS(SEQ IDNO:305)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:306)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:307)、GGSGSG(SEQ ID NO:308)、GGSG(SEQ ID NO:309)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:310)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:311)和GGNGSG(SEQ ID NO:312)。特定目标肽接头为(G4S)(SEQ ID NO:298)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:299)、(G4S)3(SEQ ID NO:303)和(G4S)4(SEQ ID NO:304)。
如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。
“融合”或“连接”意指组分(例如，抗体和Fab片段的重链)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在出于比对的目的而不考虑将任何保守性取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。替代性地，可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且在WO 2001/007611中有所描述。除非另外指明，否则出于本文的目的，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序，利用BLOSUM50比较矩阵生成氨基酸序列同一性百分比的值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“ImprovedTools for Biological Sequence Analysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人(1997)Genomics 46:24-36 创作并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。替代性地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出比对标头中给出氨基酸同一性百分比。
在某些实施例中，考虑了本文提供的双特异性抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善含TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。含TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。用于取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守性取代在表B中表头“优选的取代”下提供，并在下文中参考氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标分子中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选。
表A
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴定可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代性地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N末端甲硫氨酰残基的本发明的双特异性抗原结合分子。分子的其他插入变体包括与增加双特异性抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N末端或C末端的融合。
在某些方面中，改变本文提供的双特异性抗原结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当含TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键合连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体，其具有缺乏附接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)或US2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。在另一方面，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体提供有两分型寡糖的变体，例如其中附接于Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US2005/0123546(Umana等人)。还提供了在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些方面，可期望产生本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定方面，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些方面，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
术语“核酸”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的实例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。举例而言，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人,Nature Medicine 2017,在线发表于2017年6月12日,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码双特异性抗原结合分子或抗体的分离的核酸”是指编码双特异性抗原结合分子或抗体的重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并且指导该基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良反应。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”或“药物配制物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。
“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。
如本文所用，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。在一个方面，化学治疗剂为抗代谢物。在一个方面，抗代谢物选自由以下项组成的组：氨基蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷和吉西他滨。在一个特定方面，抗代谢物为卡培他滨或吉西他滨。在另一方面，抗代谢物为氟尿嘧啶。在一个方面，化学治疗剂是影响微管形成的药剂。在一个方面，影响微管形成的药剂选自由以下项组成的组：紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、泰素帝、依托泊苷和替尼泊苷。在另一方面，化学治疗剂为烷化剂诸如环磷酰胺。在一个方面，化学治疗剂为细胞毒性抗生素，诸如拓扑异构酶II抑制剂。在一个方面，拓扑异构酶II抑制剂为多柔比星。
示例性激动性LTBR抗体
本文提供了与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的新颖抗体和抗体片段。提供了与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的抗原特异性结合的新颖抗体和抗体片段。因此，这些抗体与人LTBR特异性结合。它们是激动性人LTBR抗体。
这些抗体能够以小于2倍的亲和力差异与人LTBR和与食蟹猴LTBR结合。一些新型激动性人LTBR抗体甚至能够与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR结合。
本文公开了激动性LTBR抗体，其以通过ELISA测量的小于4nM的EC50(参见实例1.5)与人LTBR细胞外结构域(SEQ ID NO:359的氨基酸序列的ECD)结合。在一个方面，激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于1nM的EC50与人LTBR ECD结合。在一个特定方面，激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于0.15nM的EC50与人LTBR ECD结合。
如本文所公开的激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于5nM的EC50(参见实例1.5)与食蟹猴LTBR细胞外结构域(SEQ ID NO:361的氨基酸序列的ECD)结合。在一个方面，激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于0.5nM的EC50与食蟹猴LTBR ECD结合。在一个特定方面，激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于0.1nM的EC50与食蟹猴LTBR ECD结合。
如本文所述的激动性LTBR抗体需要针对其激动活性进行交联以活化人LTBR，这意味着它们只能通过交联依赖性机制刺激LTBR。“交联依赖性机制”可以为例如Fc交联依赖性机制，其中抗体必须结合LTBR和Fc受体两者以便刺激LTBR。这样，抗体必须能够结合LTBR和Fc受体两者。如果抗体不具有交联依赖性，则它可以在不存在与Fc受体结合的情况下刺激LTBR。这可能导致人体内广泛的LTBR活化以及与之相关联的严重安全问题。
如本文所述的激动性LTBR抗体还需要针对激动活性进行交联以诱导人脐静脉内皮细胞或癌症相关成纤维细胞中的ICAM上调，如本文实例5.2中所示。
如本文所述的激动性LTBR抗体还能够抑制人LTBR与其人配体淋巴毒素α1β2和LIGHT之间的相互作用。这已经显示于如实例1.6中所述的通过ELISA进行的配体竞争实验中。
已经显示，如本文所述的激动性LTBR抗体与人LIGHT(包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的LTBR的天然配体)竞争与人LTBR的结合。
在一个方面，本文提供了一种激动性LTBR抗体(或与LTBR特异性结合的抗原结合结构域)，其中所述抗体或抗原结合结构域包含
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种激动性LTBR抗体(或与LTBR特异性结合的抗原结合结构域)，其中所述抗体包含
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列；
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种激动性LTBR抗体(或与LTBR特异性结合的抗原结合结构域)，其中所述抗体或抗原结合结构域包含
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个特定方面，如本文所述的激动性LTBR抗体为与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR特异性结合的激动性LTBR抗体。本文公开了激动性LTBR抗体，其以通过ELISA测量的小于1nM的EC50(参见实例1.5)与鼠LTBR细胞外结构域(SEQ ID NO:360的氨基酸序列的ECD)结合。在一个方面，激动性LTBR抗体以通过ELISA测量的小于0.15nM的EC50与鼠LTBR结合ECD。
在一个方面，提供了一种与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR特异性结合的激动性LTBR抗体(或抗原结合结构域)，该激动性LTBR抗体包含
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，与人LTBR、食蟹猴LTBR和鼠LTBR特异性结合的激动性LTBR抗体(或抗原结合结构域)包含
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个特定方面，如本文所述的激动性LTBR抗体与人LTBR上的SEQ ID NO:351的表位区域结合。在一个方面，如本文所述的激动性LTBR抗体与表位结合，该表位与人LTBR上人淋巴毒素α1β2所结合的表位重叠。在一个方面，如本文所述的激动性LTBR抗体与参考抗体BHA10和CBE11相比与人LTBR上的不同表位区域结合。这已通过氢/氘交换(HDX)质谱法得到证明，如实例6.4中所述。
在一个方面，此类激动性LTBR抗体包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一个方面，包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列(抗体P1AE9459)。
在一个方面，提供源自转基因兔中的免疫接种的激动性LTBR抗体(或与LTBR特异性结合的抗原结合结构域)。在一个方面，该抗体(或抗原结合结构域)包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
在一个方面，来源于转基因兔免疫接种的激动性LTBR抗体(或抗原结合结构域)为与人、食蟹猴和小鼠LTBR特异性结合的交叉反应性抗体或抗原结合结构域。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQID NO:50的氨基酸序列。
在另一方面，提供了源自大鼠免疫接种的人LTBR抗体或抗原结合结构域。特别地，该抗体或抗原结合结构域为与人、食蟹猴和小鼠LTBR特异性结合的交叉反应性抗体或抗原结合结构域。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在又一方面，提供了从噬菌体展示文库生成的人LTBR抗体或抗原结合结构域。特别地，该抗体或抗原结合结构域为与人、食蟹猴和小鼠LTBR特异性结合的交叉反应性抗体或抗原结合结构域。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ IDNO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ IDNO:93的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQID NO:94的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQID NO:96的氨基酸序列。在一个方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在另一方面，抗体或抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ IDNO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个方面，与LTBR特异性结合的抗体为全长抗体，特别地属于人IgG1亚类。在一个特定方面，它包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定方面，抗体包含
(i)包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列的两条轻链；或者
(ii)包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的两条轻链；或者
(iii)包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的两条轻链；或者
(iv)包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:234的氨基酸序列的两条轻链；或者
(v)包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列的两条轻链；或者
(vi)包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列的两条轻链；或者
(vii)包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列的两条轻链；或者
(viii)包含SEQ ID NO:241的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:242的氨基酸序列的两条轻链；或者
(ix)包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列的两条重链，以及包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列的两条轻链。
双特异性激动性LTBR抗体
本文还提供了能够与淋巴毒素β受体(LTBR)和肿瘤相关抗原诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的新型双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子将与FAP特异性结合的抗原结合结构域与能够激动性与LTBR结合的至少一个抗原结合结构域组合，其中通过LTBR的活化是通过与肿瘤基质细胞上表达的FAP结合的交联来提供的。本文公开的双特异性激动性LTBR抗体具有诸如以下的特别有利的特性：可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、靶向效率、减少的内化、可接受的药代动力学(PK)特性、降低的毒性、可以给予患者的扩展剂量范围以及从而可能增强的功效。
示例性双特异性激动性LTBR抗体
在一个方面，提供了激动性LTBR抗体，其为包含如本文之前所述的激动性LTBR抗体的多特异性抗体。在一个方面，提供了作为双特异性抗体的激动性LTBR抗体。双特异性激动性LTBR抗体优选地包含人源、特别是人IgG亚类、更特别是人IgG1亚类的Fc结构域。在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，该Fc结构域包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，该Fc结构域具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面，激动性LTBR抗体为与LTBR和肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合的双特异性抗体。特别地，双特异性激动性LTBR抗体为靶向针对FAP的LTBR激动剂。在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc区，该Fc区包含降低效应子功能的突变。使用包含减少或消除效应子功能的突变的Fc区将通过经由Fc受体进行交联来防止非特异性激动作用，并且防止表达LTBR的细胞的ADCC。如本文所述的双特异性激动性LTBR抗体与常规抗体相比具有优势，因为它们选择性诱导靶细胞处的免疫应答，所述靶细胞通常在肿瘤基质中(即邻近肿瘤)。
因此，双特异性激动性LTBR抗体的特征在于与LTBR的靶向FAP的激动性结合。在存在表达FAP的细胞的情况下，双特异性抗原结合分子能够活化癌症相关成纤维细胞(CAF)(实例5.2.1)、活化内皮细胞(实例5.2.2)并且调节人内皮细胞以上调黏附分子和化学引诱物(其对于免疫浸润级联至关重要)。本文描述的双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞黏附(实例5.2.3)。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
双特异性激动性LTBR抗体具有由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，该Fc结构域包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。从而消除了Fc受体介导的交联，并且通过与抗原结合结构域的结合进行交联来实现肿瘤特异性活化，该抗原结合结构域通过与其肿瘤相关靶标结合而与FAP特异性结合。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一Fab片段，
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个方面，如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体包含与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一个特定方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在另一方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在另一方面，它包含：重链可变区(VHFAP)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在又一方面，它包含：重链可变区(VHFAP)，其包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
在一个方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一个特定方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一个方面，它包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在另一方面，它包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。特别地，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。特别地，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab片段。
在一个方面，如本文所公开的双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VHLTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在又一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域可以包含：重链可变区(VHLTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列(CBE11)。
在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域可以包含：重链可变区(VHLTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:343的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:345的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:347的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:348的氨基酸序列。在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:349的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:350的氨基酸序列(BHA10)。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:89的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：(i)重链可变区(VHLTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者(iii)重链可变区(VHLTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQID NO:34的氨基酸序列。在另一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在又一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域也能够与鼠LTBR特异性结合并且包含
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域也能够与鼠LTBR特异性结合并且包含
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域也能够与鼠LTBR特异性结合并且包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，其中该双特异性抗体包含与LTBR特异性结合的第三抗原结合结构域，这意味着双特异性抗原结合分子包含
(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第三抗原结合结构域跟与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域相同，这意味着与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是相同的。在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域为与LTBR特异性结合的Fab片段。在一个方面，与LTBR特异性结合的Fab片段为crossfab片段。在另一方面，与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab片段。
在一个方面，本文公开的双特异性激动性LTBR抗体包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域两者均包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
在一个特定方面，第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域是相同的。
在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ IDNO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在又一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VHLTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在另一方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的双特异性激动性LTBR抗体，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:89的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:42的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；和轻链可变区(VL LTBR)，其包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的双特异性激动性LTBR抗体，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一个方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在另一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在又一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在一个方面，提供了一种包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的双特异性激动性LTBR抗体，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列(CBE11)。
在一个方面，提供了一种包含与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的双特异性激动性LTBR抗体，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:343的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:345的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:346的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:347的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:348的氨基酸序列。在一个特定方面，与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:349的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:350的氨基酸序列(BHA10)。
在另一方面，提供了一种包含与人LTBR特异性结合并且还能够特异性结合鼠LTBR的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的双特异性激动性LTBR抗体，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列；或者
重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体包含与人LTBR特异性结合并且还特异性结合鼠LTBR的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
在一个特定方面，双特异性激动性LTBR抗体包含与人LTBR特异性结合并且还特异性结合鼠LTBR的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
与FAP和LTBR结合的双特异性激动性LTBR抗体
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在另一方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个特定方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(i)能够与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，以及(ii)能够与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含：重链可变区(VHLTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列。
在另一个特定方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(i)能够与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，以及(ii)能够与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域包含：重链可变区(VHLTBR)，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列，以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列。
双特异性单价激动性LTBR抗体(1+1形式)
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域；以及由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，其中双特异性抗原结合分子包含
(i)与FAP特异性结合的全长抗体的第一轻链和第一重链，以及
(ii)与LTBR特异性结合的全长抗体的第二(经修饰的)轻链和第二(经修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换。
与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab片段，并且与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域为crossFab片段。
在另一方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域；以及由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，其中双特异性抗原结合分子包含
(i)与FAP特异性结合的全长抗体的第一(经修饰的)轻链和第一(经修饰的)重链，本文中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换；以及
(ii)与LTBR特异性结合的全长抗体的第二轻链和第二重链。
与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域为crossFab片段，并且与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域为Fab片段。
在一个特定方面，提供了
(a)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的第二轻链；或者
(b)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的第二轻链；或者
(c)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链；或者
(d)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二轻链；或者
(e)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第二轻链；或者
(f)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的第二轻链；或者
(g)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的第二轻链；或者
(h)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的第二轻链；或者
(i)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的第二轻链；或者
(j)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:145的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:144的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:146的氨基酸序列的第二轻链；或者
(k)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:147的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:148的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的第二轻链；或者
(l)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:151的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的第二轻链；或者
(m)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:158的氨基酸序列的第二轻链；或者
(n)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:161的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:160的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:162的氨基酸序列的第二轻链；或者
(o)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:165的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的第二轻链；或者
(q)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:215的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:217的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:216的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:218的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含含有SEQ ID NO:329的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:330的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:331的氨基酸序列的第一轻链以及含有SEQ ID NO:332的氨基酸序列的第二轻链。
对于与LTBR的结合为二价且对于与FAP的结合为单价的双特异性激动性LTBR抗体(2+1形式)
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域；以及由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，该Fc结构域，其中双特异性抗原结合分子包含
(i)与LTBR特异性结合的全长抗体的两条轻链和两条重链，以及
(ii)与FAP特异性结合的Fab片段或crossFab片段经由肽接头连接至两条重链的C末端中的一者。
在另一方面，提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域；以及由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，其中双特异性抗原结合分子包含
(i)与FAP特异性结合的全长抗体的第一轻链和第一重链，以及
(ii)与LTBR特异性结合的全长抗体的第二(经修饰的)轻链和第二(经修饰的)重链，其中与LTBR特异性结合的Fab片段或CrossFab片段经由肽接头连接至第二重链的C末端。
因此，提供了一种双特异性抗原结合分子，其中该双特异性抗原结合分子对于与LTBR的结合为二价且对于与FAP的结合为单价。
在一个特定方面，提供了：
(a)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的一条轻链；或者
(b)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的一条轻链；或者
(c)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:175的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:177的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:176的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的一条轻链；或者
(d)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:179的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:181的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:180的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的一条轻链；或者
(e)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:185的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:184的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的一条轻链；或者
(f)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:187的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:189的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:188的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的一条轻链；或者
(g)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:191的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:193的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:192的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:194的氨基酸序列的一条轻链；或者
(h)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:195的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:197的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的一条轻链；或者
(i)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:201的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的一条轻链；或者
(j)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:203的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的一条轻链；或者
(k)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:207的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:208的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:210的氨基酸序列的一条轻链；或者
(l)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:211的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:212的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:214的氨基酸序列的一条轻链。
此外，提供了
(m)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:326的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:328的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:327的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:329的氨基酸序列的一条轻链；或者
(n)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:335的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:336的氨基酸序列的一条轻链；或者
(o)双特异性激动性LTBR抗体，其包含含有SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:339的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:340的氨基酸序列的一条轻链。
在一个特定方面，提供了一种包含双特异性抗原结合分子的双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性抗原结合分子包含含有SEQ ID NO:195的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:197的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的两条轻链、含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的一条轻链。
鼠替代物激动性LTBR抗体
本文还提供了鼠替代物分子。在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个特定方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含含有SEQ ID NO:219的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:221的氨基酸序列的第二重链、含有SEQ ID NO:220的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ ID NO:222的氨基酸序列的第二轻链(1+1形式)。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含
重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域各自包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含含有SEQ ID NO:223的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:224的氨基酸序列的两条轻链、含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的一条轻链。
在一个特定方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含含有SEQ ID NO:318的氨基酸序列的第一重链和含有SEQ ID NO:320的氨基酸序列的第二重链、各自含有SEQ ID NO:319的氨基酸序列的两条轻链以及含有SEQ ID NO:321的氨基酸序列的一条轻链。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
本文描述的双特异性激动性LTBR抗体进一步包含Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。因此，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如，取代)。
Fc结构域对本发明的双特异性抗体赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比率。然而，与此同时它可能导致将双特异性激动性LTBR抗体不希望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。因此，在特定方面，与天然IgG Fc结构域，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域相比，双特异性激动性LTBR抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。更具体地，Fc结构域为IgG1 Fc结构域。
在一个此类方面，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出对Fc受体的结合亲和力的小于50％、优选地少小20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％；和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出效应子功能的小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％。在一个方面，Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)不在实质上与Fc受体结合和/或诱导效应子功能。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一个方面，效应子功能是CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌中的一个或多个。在一个特定方面，效应子功能是ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域相比较，Fc结构域表现出基本上类似的对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的双特异性激动性LTBR抗体)对FcRn的结合亲和力的大于约70％、具体地大于约80％、更具体地大于约90％时，实现了与FcRn基本上类似的结合。
在一个特定方面，Fc结构域经过工程化改造，以与非工程化改造的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个特定方面，双特异性激动性LTBR抗体的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在另一方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个方面，与包含非工程化的Fc结构域的本发明的双特异性抗体相比，包含工程化的Fc结构域的双特异性激动性LTBR抗体表现出小于20％、特别地小于10％、更特别地小于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个特定方面，Fc受体为Fcγ受体。在其他方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一些方面，Fc受体是活化的Fc受体。在一个具体的方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，尤其对C1q的特异性结合亲和力也降低了。在一个方面，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性激动性LTBR抗体)表现出非工程化形式的Fc结构域(或包含所述非工程化形式的Fc结构域的双特异性激动性LTBR抗体)对FcRn的大于约70％的结合亲和力时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的双特异性激动性LTBR抗体可表现出此类亲和力的大于约80％以及甚至大于约90％。在某些方面，双特异性激动性LTBR抗体的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸处的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在一个方面，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位处包含氨基酸取代。在一些方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(“LALA”)。在一个此类方面，Fc结构域为IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施例中，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代并且包含选自由E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S组成的组的另外的氨基酸取代。在更特定的方面，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如PCT专利申请号WO 2012/130831 A1中所述。所述文档还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和用于确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。此类抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1(根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991的EU索引编号)。
在一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域为包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G的IgG4 Fc结构域。这种氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人,DrugMetabolism and Disposition 38,84-91(2010))。
具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593；以及Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)的抗体描述于US 2005/0014934中。那些抗体包含这样的Fc区，该Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他示例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。另选地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评价Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性激动性LTBR抗体的效应子功能可通过本领域已知的方法进行测量。本文描述了用于测量ADCC的合适测定。评定感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，JExpMed 166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定目的分子的ADCC活性。
以下部分描述了包含降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本文描述的双特异性激动性LTBR抗体的优选方面。在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二(和任选地第三)抗原结合结构域；以及(c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中该Fc结构域包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力、特别是对Fcγ受体的结合亲和力的一个或多个氨基酸取代。在另一方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二(和任选地第三)抗原结合结构域；以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中该Fc结构域包含降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在特定方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本文描述的双特异性激动性LTBR抗体包含融合至Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个的不同抗原结合位点，因此该Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性激动性LTBR抗体的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，在特定方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域；以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰为所谓的“杵臼结构”修饰，该修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰以及Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(a)能够与LTBR特异性结合的至少一个抗原结合结构域；(b)能够与靶细胞抗原特异性结合的至少一个抗原结合结构域，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中根据杵臼结构方法，Fc结构域的第一亚基包含杵并且Fc结构域的第二亚基包含臼。在一个特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个方面，在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代。
在又进一步的方面，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在一个特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个替代的方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如在PCT公开WO 2009/089004中所描述的。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基替换两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
如本文报道的双特异性激动性LTBR抗体的重链的C末端可为以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个特定方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C-末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在如本文所报道的所有方面的一个方面，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性激动性LTBR抗体包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
Fab结构域中的修饰
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含(a)能够与FAP特异性结合的第一Fab片段，(b)能够与LTBR特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中在Fab片段中的一者中，可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL被交换。根据Crossmab技术制备双特异性抗体。
在WO2009/080252和Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)。它们明显减少了由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在一个方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含(a)能够与FAP特异性结合的第一Fab片段，(b)能够与LTBR特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域，其中在Fab片段中的一者中，可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分。更特别地，在能够与LTBR特异性结合的第二Fab片段中，可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分。
在另一方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含(a)能够与FAP特异性结合的第一Fab片段，其中恒定结构域CL和CH1被彼此替换，使得CH1结构域是轻链的一部分并且CL结构域是重链的一部分，以及(b)能够与LTBR特异性结合的第二Fab片段。此类分子提供了对LTBR和FAP两者的单价结合。
在另一方面，提供了一种双特异性激动性LTBR抗体，该双特异性激动性LTBR抗体包含(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一Fab片段，(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二Fab片段和第三Fab片段，以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，其中在与LTBR特异性结合的第二Fab片段和第三Fab片段中，可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分。
在另一方面，并且为进一步改善正确的配对，双特异性激动性LTBR抗体可含有不同的带电荷的氨基酸取代(所谓的“带电荷的残基”)，其包含：(a)能够与LTBR特异性结合的第一Fab片段，(b)能够与FAP特异性结合的第二Fab片段，以及(c)由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。在一个特定方面，本发明涉及双特异性抗原结合分子，其中在CL结构域之一中位置123(EU编号)处的氨基酸已被精氨酸(R)取代和/或其中位置124(EU编号)处的氨基酸已被赖氨酸(K)取代；并且其中在CH1结构域之一中位置147(EU编号)和/或位置213(EU编号)处的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
多核苷酸
进一步提供了编码如本文所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其片段的分离的多核苷酸。
编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。
在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体中包含的多肽。
在一个方面，提供了一种编码双特异性激动性LTBR抗体的分离的多核苷酸，该双特异性激动性LTBR抗体包含：(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域；(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域；以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。如本文所述的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
如本文所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可以例如通过重组生产来获得。对于重组生产，提供了一种或多种编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的多核苷酸。将一种或多种编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的多核苷酸分离并且插入一种或多种载体中，以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个方面，提供了一种载体，优选地为表达载体，该载体包含本文描述的多核苷酸中的一者或多者。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建含有激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献中描述的技术：Maniatis等人,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，如本文所述的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键结性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的DNA模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。
本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
如本文所述的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区缔合，这些额外编码区指导由本文描述的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段，可以将编码信号序列的DNA置于编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与该多肽的N末端融合的信号肽，该信号肽被从翻译的多肽上切割下来以生产该多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。替代性地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
DNA编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白可包含在编码激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在另一方面，提供了一种包含本文描述的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，提供了一种包含本文描述的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码如本文所公开的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中生产，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致生产具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,NatBiotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了一种生产激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的方法，其中该方法包括在适于激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的表达的条件下培养包含编码如本文所提供的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其多肽片段。
如本文所述制备的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、体积排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可使用激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于抗体的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和体积排阻色谱来分离抗原结合分子。激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体或其片段的纯度可通过各种众所周知的分析方法中任一者来确定，所述众所周知的分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。例如，如实例中所述表达的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原SDS-PAGE所示。
测定
本文提供的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可以通过本领域已知的各种测定法来表征其结合特性和/或生物活性。特别地，它们的特征在于实例中更详细描述的测定。
1.结合测定
可以例如通过使用表达人成纤维细胞活化蛋白(FAP)的鼠成纤维细胞系和流式细胞术(FACS)分析来评估本文提供的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体与相应靶标表达细胞的结合。本文提供的双特异性抗原结合分子与LTBR的结合可通过使用如实例5.1中所述的经工程化以过表达人、犬或鼠的LTBR的CHO-K1细胞来确定。
2.活性测定
对如本文所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的生物活性进行测试。生物活性可包括双特异性抗原结合分子的功效和特异性。功效和特异性通过测量其在体外上调人内皮细胞和癌症相关成纤维细胞(CAF)中的ICAM的能力的测定法来证明(实例4)。LTBR的活化可通过基质细胞上调炎症和发育基因(诸如黏附分子(ICAM和VCAM)和化学引诱物(CXCL9、CXCL10和CXCL11))来进一步测量(实例5.2)。
药物组合物、制剂和施用途径
在另一方面，提供了包含本文提供的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体中的任一者的药物组合物，所述药物组合物例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体中的任一者以及至少一种药用赋形剂。在另一个实施例中，药物组合物包含本文提供的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体中的任一者以及(例如)如下文所述的至少一种另外的治疗剂。
如本文所公开的药物组合物包含溶于或分散于药用载体中的治疗有效量的一种或多种激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体。短语“药用或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(诸如例如人)时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。具体地，组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药用赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。对于注射，激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可以在水溶液中配制，优选地在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)构建。通过根据需要将激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，该真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白的安全水平保持最低。合适的药用赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质呈例如膜或微胶囊的成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂(诸如例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，抗原结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，融合蛋白可以用合适的聚合或疏水材料(例如配制成可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。
包含本文公开的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，该载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。
激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药用盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药用盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
本文的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文提供的任何激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体、特别是双特异性激动性LTBR抗体可用于治疗方法中。为了用于治疗方法中，双特异性激动性LTBR抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，提供了用作药物的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体。
在另外的方面，提供了如本文所述的双特异性激动性LTBR抗体，其用于通过活化癌症相关成纤维细胞(CAF)或内皮细胞来诱导免疫刺激。此外，提供了如本文所述的双特异性抗原结合分子用于(i)治疗癌症，(ii)延缓癌症的进展，以及(iii)延长罹患癌症的患者的存活期，特别是在存在表达FAP的细胞的情况下。在一个特定方面，提供了用于治疗疾病、特别是用于治疗癌症的双特异性激动性LTBR抗体。
在某些方面，提供了用于治疗方法中的如本文所述的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体。在一个方面，提供了如本文所述的双特异性激动性LTBR抗体，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些方面，提供了一种用于治疗患有疾病的个体的方法中的双特异性激动性LTBR抗体，该方法包括向该个体施用治疗有效量的双特异性激动性LTBR抗体。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一个方面，提供了一种方法，该方法用于i)诱导通过CD40+抗原呈递细胞(APC)的免疫刺激，(ii)刺激肿瘤特异性T细胞应答，(iii)引起肿瘤细胞凋亡，(iv)治疗癌症，(v)延迟癌症进展，(vi)延长癌症患者的存活期，或者(vii)治疗感染，其中该方法包括向有此需要的个体施用治疗有效量的本文公开的双特异性激动性LTBR抗体。
在另一方面，提供了本文描述的双特异性激动性LTBR抗体用于制造或制备药物的用途，该药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在一个方面，药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些方面，待治疗的疾病为增殖性疾患，特别是癌症。癌症的实例包括但不限于膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌以及肾癌。癌症的其他实例包括恶性肿瘤、淋巴瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子或抗体治疗的其他细胞增殖疾患包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢神经系统和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部以及泌尿种系统。还包括癌前病症或病变和癌转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员容易认识到，在许多情况下，双特异性激动性LTBR抗体可能不提供治愈，但是可以提供益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。
为了预防或治疗疾病，本文描述的双特异性激动性LTBR抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、具体分子、疾病的严重程度和进程、本发明的双特异性抗原结合分子是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对双特异性抗原结合分子的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑到各种施用时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
双特异性激动性LTBR抗体适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的双特异性抗原结合分子可为例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。本发明的双特异性抗原结合分子的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他实例中，剂量还可包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的示例中，可以基于上述数字施用约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重、约5μg/kg体重至约1mg/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。在一个特定方面，双特异性激动性LTBR抗体将每三周施用。在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体将每两周施用。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他给药方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
双特异性激动性LTBR抗体将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防疾病病况，将本发明的双特异性激动性LTBR抗体或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。对于全身施用，最初可以根据体外测定(诸如细胞培养测定)来估计治疗有效剂量。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。还可以使用本领域熟知的技术来根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的本发明的双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.1至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。在局部施用或选择性摄入的情况下，双特异性激动性LTBR抗体的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域的技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所描述的治疗有效剂量的双特异性激动性LTBR抗体通常将在不会引起显著毒性的情况下提供治疗益处。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的双特异性激动性LTBR抗体是优选的。在一个方面，双特异性激动性LTBR抗体表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括毒性很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用双特异性激动性LTBR抗体治疗的患者的主治医师应知道由于毒性、器官功能障碍等而如何以及何时终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其他药剂和治疗
双特异性激动性LTBR抗体可以与治疗中的一种或多种其他药剂组合施用。例如，激动性LTBR抗体或双特异性激动性LTBR抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些方面，另外的治疗剂是另一种抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。在某些方面，附加治疗剂为免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂或细胞抑制剂、细胞凋亡活化剂或增加细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂。
因此，提供了双特异性激动性LTBR抗体或包含它们的药物组合物，其用于治疗癌症，其中该双特异性抗原结合分子与化疗剂、放射和/或供在癌症免疫疗法中使用的其他药剂组合施用。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用双特异性激动性LTBR抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。双特异性激动性LTBR抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或单独的组合物中)，以及单独施用，在分开施用的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。
在另一方面，提供了用于治疗癌症的如本文之前所述的双特异性激动性LTBR抗体，其中该双特异性抗原结合分子与另一免疫调节剂组合施用。
术语“免疫调节剂”是指影响免疫系统的任何物质，包括单克隆抗体。本文公开的分子可被视为免疫调节剂。免疫调节剂可用作治疗癌症的抗肿瘤剂。在一个方面，免疫调节剂包括但不限于抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗)、抗PD1抗体(例如，纳武单抗或帕博利珠单抗)、PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗)、OX-40抗体、4-1BB抗体和GITR抗体。在进一步的方面，提供用于治疗癌症的如上文所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂联合施用。在一个方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂为抗PD-L1抗体或抗PD1抗体。更特别地，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂为抗PD-L1抗体，特别是选自由阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗组成的组中的抗PD-L1抗体。在一个具体方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂为阿特珠单抗(MPDL3280A,RG7446)。在另一方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂为抗PD-L1抗体，该抗体包含SEQ ID NO:313的重链可变结构域VH(PDL-1)和SEQ ID NO:314的轻链可变结构域VL(PDL-1)。在另一方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂为抗PD-L1抗体，其包含SEQ IDNO:315的重链可变结构域VH(PD-L1)和SEQ ID NO:316的轻链可变结构域VL(PD-L1)。在另一方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂为抗PD1抗体，特别是选自派姆单抗或纳武单抗的抗PD1抗体。此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用双特异性激动性LTBR抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。如本文之前所述的双特异性激动性LTBR抗体通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或单独的组合物中)，以及单独施用，在分开施用的情况下，双特异性激动性LTBR抗体的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。
制品
在另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的疾患的材料。该制品包括容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。该容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断该病症的组合物组合，并且该容器可具有无菌入口(例如该容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本文公开的双特异性激动性LTBR抗体。
标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)第一容器，该第一容器中含有组合物，其中该组合物包含双特异性激动性LTBR抗体；以及(b)第二容器，该第二容器中含有组合物，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施例中的制品可进一步包括包装插页，该包装插页指示这些组合物可以用于治疗特定病况。
替代性地或另外地，该制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表B(序列)：
以下编号的段落(段)为本发明的各方面：
1.一种双特异性抗原结合分子，其包含(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，(b)与淋巴毒素β受体(LTBR)特异性结合的第二抗原结合结构域，以及(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
2.根据段落1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子在与FAP结合后活化LTBR。
3.根据段落1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子包含与LTBR特异性结合的第三抗原结合结构域。
4.根据段落3所述的双特异性抗原结合分子，其中与LTBR特异性结合的第三抗原结合结构域跟与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域相同。
5.根据段落1至4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域为Fab片段。
6.根据段落1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VHFAP)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
7.根据段落1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
8.根据段落1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
9.根据段落1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列。
10.根据段落1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
11.根据段落1至10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
12.根据段落1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含
(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列；以及
(b)与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，该第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
13.根据段落1至12中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域为IgG Fc结构域，特别地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中Fc结构域包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
14.根据段落1至13中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中Fc结构域属于人IgG1亚类，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
15.根据段落1至14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)与FAP特异性结合的第一Fab片段，
(b)与LTBR特异性结合的第二Fab片段，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。
16.根据段落15所述的双特异性抗原结合分子，其中与LTBR特异性结合的第二Fab片段为crossFab片段。
17.根据段落1至14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)与FAP特异性结合的第一Fab片段，
(b)与LTBR特异性结合的第二Fab片段和第三Fab片段，以及
(c)由第一亚基和第二亚基构成并且包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，
其中与FAP结合的所述第一Fab片段在其N末端处融合至Fc结构域亚基中的一者的C末端，并且与LTBR特异性结合的第二Fab片段和第三Fab片段各自在其C末端处融合至Fc结构域亚基中的一者的N末端。
18.一种与LTBR特异性结合的抗体，其中所述抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:48的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:56的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，该重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，该轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ IDNO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:88的氨基酸序列。
19.根据段落18所述的抗体，其中该抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
20.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落18或19所述的抗体。
21.一种表达载体，其包含根据段落20所述的一种或多种分离的多核苷酸。
22.一种原核或真核宿主细胞，其包含根据段落20所述的一种或多种分离的多核苷酸或根据段落21所述的表达载体。
23.一种生产双特异性抗原结合分子的方法，该方法包括以下步骤：a)在适合于双特异性抗原结合分子的表达的条件下培养根据段落22所述的原核或真核宿主细胞，以及b)任选地回收该双特异性抗原结合分子。
24.一种药物组合物，其包含根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落18或19所述的抗体以及药用赋形剂。
25.根据段落24所述的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
26.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，其用作药物。
27.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，其用于(a)诱导内皮细胞或癌症相关成纤维细胞上的ICAM上调，或(b)增强T细胞黏附。
28.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
29.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，其用于治疗癌症，其中该双特异性抗原结合分子或药物组合物用于与化疗剂、放射和/或供在癌症免疫疗法中使用的其他药剂组合施用。
30.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物，其用于治疗癌症，其中该双特异性抗原结合分子用于与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂联合施用。
31.根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
32.一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向该个体施用有效量的根据段落1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据段落24所述的药物组合物。
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第五版,NIH公开号91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
蛋白质纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(MabSelectTM SuReTM,Cytiva)并且用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，随后立即中和样品。通过体积排阻色谱(SEC)(16/600S200,Cytiva)在PBS中或在20mM组氨酸、150mM NaCl(pH 6.0)中将聚集的蛋白质与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(如果需要)，冷冻并且储存于-20℃或-80℃。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、CE-SDS、分析型体积排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen)。特别地，使用10％或4％至12％ Bis-TRIS预制凝胶(pH6.4)和MES(还原凝胶，具有抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
CE-SDS
通过CE-SDS使用微流控技术(Caliper Life Science,USA)分析双特异性和对照抗体的纯度、抗体完整性和分子量。使用HT Protein Express试剂盒根据制造商的说明制备5μl蛋白溶液用于CE-SDS分析，并且在GXII TouchTM蛋白质表征系统上使用HT Protein Express芯片进行分析。使用GX软件3.0.618.0版分析数据。
分析型体积排阻色谱
通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的体积排阻色谱(SEC)。简言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh(例如，G3000 SWXL)柱，或施加至Dionex HPLC系统上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度以及峰面积的积分来定量洗脱的蛋白质。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
实例1
抗LTBR抗体的生成
1.1用于噬菌体展示和免疫接种以生成抗LTBR抗体的蛋白质
为了通过噬菌体展示和免疫接种生成抗LTBR抗体，将不同物种的淋巴毒素β受体和淋巴毒素α1β2以及工具蛋白作为可溶性重组蛋白生成。这些是生物素化和Fc标记的淋巴毒素β受体(用作噬菌体展示中的抗原以及用于免疫接种的免疫原)、生物素化Fc片段(Fc消耗剂)(用作预清除剂以避免噬菌体展示中的Fc结合物)以及生物素化和his标记的单链淋巴毒素α1β2配体(用于噬菌体展示与进一步表征期间的竞争)。表1提供了关于这些蛋白质及其相应的标识符的概述，它们的结构示意性地显示在图1A至1G中。
表1：用于噬菌体展示和免疫接种的重组可溶性受体、配体和工具蛋白
表1中列出的所有重组可溶性蛋白质由evitria使用其专有的媒介物系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，evitria使用其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。对于体内生物素化，将avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE,SEQ ID NO:259)融合至这些构建体的C末端(对于P1AA0981，还融合至杵重链的N末端)，其允许在与BirA生物素连接酶共表达时进行特异性生物素化。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
将Fc标记的蛋白质通过蛋白A亲和色谱(蛋白A MabSelectTM SuReTM，Cytiva)和制备型体积排阻色谱(SEC)(16/600S200,Cytiva)纯化，而将his标记的蛋白质通过cOmplete His标签亲和色谱及随后的制备型体积排阻色谱(SEC)(26/60S200)纯化，其全部根据标准程序和制造商的说明进行。纯化的蛋白质的纯度通过分析型体积排阻色谱法(例如G3000 SWXL)和CE-SDS(例如Caliper GXII)进行确定。
1.2用于筛选和表征抗LTBR IgG抗体和抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的另外的蛋白质
为筛选和表征通过噬菌体展示和免疫接种生成的抗体，已经表达和纯化或商业化购买了另外的重组可溶性淋巴毒素β受体、配体(人LIGHT)和肿瘤基质靶标(人和鼠FAP)。此外，已经购买了商业化淋巴毒素β受体并且在体外进行了生物素化。表2和图2A至2F提供了关于这些蛋白质及其相应的标识符的概述。
表2：另外的重组可溶性受体、配体和肿瘤基质靶标
1.3通过噬菌体展示生成抗LTBR Fab(片段抗原结合)
1.3.1抗LTBR Fab的选择和筛选
通过噬菌体展示从基于完全人框架的合成Fab文库中选择抗LTBR Fab，其中VL(3种不同长度)和VH结构域(6种不同长度)的CDR3中具有序列多样性。
根据以下方案在溶液中进行选择轮次(生物淘选)：1.在包被有500nM无关生物素化人Fc片段的中性抗生物素蛋白包被的96孔板上预清除每个文库池约1012个噬菌粒颗粒；2.将上清液中结合非人Fc片段的噬菌粒颗粒与淋巴毒素配体和生物素化LTBR受体(见表3)以总体积0.8ml孵育0.5小时；3.通过加入80μl链霉抗生物素蛋白包被的磁性颗粒捕获生物素化LTBR受体并且特异性结合噬菌体，持续20min；4.使用磁性颗粒分离器，将相应的磁性颗粒用0.8ml PBS/Tween 20洗涤5次至10次，并且使用0.8ml PBS洗涤5次至10次；5.通过加入0.8ml的10mM甘氨酸(pH 2)，将噬菌体颗粒洗脱5min，随后加入0.8ml 100mM三乙胺(TEA)洗脱5min，接着通过加入1/2体积的1M Tris/HCl(pH 7.4)中和；6.将对数期大肠杆菌TG1细胞用洗脱的噬菌体颗粒重新感染，用辅助噬菌体VCSM13感染，在30℃摇床上孵育过夜，接着用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，用于下一轮选择。
使用降低的抗原浓度进行4轮选择。在选择轮次之间交替使用人和小鼠淋巴毒素配体和受体，以获得不与天然配体竞争的人和小鼠LTBR交叉反应抗体。由于人与食蟹猴LTBR的胞外域之间的高度序列同源性，假定也产生人和食蟹猴LTBR交叉反应抗体。表3总结了在LTBR噬菌体展示选择活动中用于预清除、配体竞争和选择的蛋白质，以获得非配体竞争的人和鼠LTBR特异性抗体。
表3：用于选择非配体竞争性人和鼠LTBR特异性抗体的噬菌体展示选择活动
1.3.2夹心ELISA用于鉴定通过噬菌体展示获得的人和小鼠LTBR交叉反应Fab
将各个克隆以96孔形式作为1ml培养物进行细菌表达，并且通过ELISA筛选上清液。特异性结合物定义为具有高于单体huLTBR ECD(S28-M227)Fc-fusion avi生物素化(P1AE2835)以及muLTBR ECD(S28-L223)Fc-fusion avi生物素化(P1AE4410)背景信号5倍的信号并且Fc消耗剂kh NC avi B(P1AA0981)无显著信号。
更准确地说，将中性抗生物素蛋白96孔条板在37℃用100nM生物素化蛋白质包被30min，随后在室温用2％ MPBS(奶粉磷酸盐缓冲盐水)(200μl/孔)封闭板1h。将板用PBS洗涤3次，然后加入含有Fab的细菌上清液，并且将板在室温孵育1h。再用PBS洗涤3步后，加入抗FLAG-HRP二抗(1:4000)(Sigma)，并且将板在摇床上在室温孵育1h。将板用PBS洗涤3次并通过添加100μl/孔BM Blue POD(Roche)显色。通过加入50μl/孔1M H2SO4终止酶促反应。在450nm处读取OD(在900nm处读取参考)，用于最终读取OD450-900。将ELISA特异性结合物转换为IgG形式，以便通过SPR进行进一步表征，如下所述。
选定的Fab克隆FAPltbr.P218.076满足与人和鼠LTBR特异性结合的标准(图3)。随后将其转换为人IgG1形式以进行进一步表征(IgG转换后的P1AE5929)。尽管采用了选择策略，但它确实与天然配体淋巴毒素α1β2和LIGHT竞争(分别参见表5以及图4和5)。由于其具有2nM的高亲和力，该抗体可能在选择期间替代配体。
1.4通过用蛋白质免疫接种的兔和大鼠生成抗体
对于免疫接种，使用获自Charles River Laboratories International,Inc.的CD大鼠以及Roche专有的转基因兔(其包含人免疫球蛋白基因座，如WO 2000/46251、WO2002/12437、WO 2005/007696、WO 2006/047367、US2007/0033661和WO 2008/027986中所报道)。根据附录A“动物的住宿和照料指南”将动物圈养在AAALAC认可的动物设施中。所有动物免疫接种方案和实验均已获得上巴伐利亚行政区政府批准(许可号55.2-1-54-2531-66-16和55.2-1-54-2532-90-14)，并且根据《德国动物福利法》和欧洲议会和理事会指令2010/63进行。
使用重组单体N末端人LTBR(ECD全长)hu IgG1 Fc融合kih HRYF avi(P1AE1217)免疫接种3只转基因兔。每只兔最初用400μg蛋白质进行皮内免疫接种，然后在第7天、第14天、第42天、第70天和第98天交替进行肌内和皮下注射200μg蛋白质。将TLR激动剂的混合物用作每次免疫接种的佐剂。在第三次、第四次、第五次和第六次免疫接种后(免疫接种后5天至7天)采集血样，并且用作抗原特异性B细胞的来源。在免疫接种期间通过血清样品的ELISA分析来监测抗原特异性滴度。
将CD大鼠(n＝4)用相同的免疫原免疫(即重组单体N末端人LTBR(ECD全长)huIgG1 Fc融合kih HRYF avi(P1AE1217))进行免疫接种。对于初始免疫接种，将40μg免疫原用不完全弗氏佐剂(IFA)和TLR激动剂乳化，并且将混合物的一半皮下注射(分布在多个注射部位)，而将另一半腹膜内注射。六周后，以相同方式进行加强免疫接种，不同之处在于使用PBS代替IFA。第二次免疫接种后四天，抽取血液并且用作抗原特异性B细胞的来源。
1.4.1分离外周血单核细胞(PBMC)
将含有全血的EDTA用1x PBS(Pan Biotech，德国艾登巴赫)稀释两倍，之后使用哺乳动物淋巴细胞(Cedarlane Laboratories，加拿大安大略省伯灵顿市)根据制造商的说明书进行密度离心。用1×PBS洗涤PBMC两次。
1.4.2兔B细胞克隆程序
细胞的耗尽：将覆盖有单层CHO细胞或未覆盖的无菌6孔板(细胞培养级)用于通过与塑料的非特异性粘附来耗尽非特异性结合的淋巴细胞以及巨噬细胞/单核细胞。每个孔最多装有4mL培养基和至多6x106个PBMC，并且使其在培养箱中在37℃结合1h。上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘筛步骤。
人和食蟹猴LTBR上B细胞的富集：将覆盖有单层人或食蟹猴LTBR阳性CHO细胞或包被有重组人LTBR-Fc融合蛋白的6孔组织培养板用每4mL培养基至多6x106个PBL接种，并且在培养箱中在37℃结合1h。通过用1x PBS小心地洗涤孔1次至2次来移除非贴壁细胞。在培养箱中在37℃持续10min通过胰蛋白酶使剩余的粘性细胞脱离。利用EL-4B5培养基停止胰蛋白酶化。将细胞保持在冰上，直到进行免疫荧光染色。
免疫荧光染色和流式细胞术：将抗IgG FITC(Abcam，英国剑桥)用于单细胞分选。对于表面染色，将来自耗尽和富集步骤的细胞与在PBS中的抗IgG FITC抗体一起孵育，并且在黑暗中在4℃孵育45min。在染色之后，将PBMC用冰冷的PBS洗涤两次。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中并且立即进行FACS分析。在FACS分析之前加入浓度为5μg/mL的碘化丙啶(BDPharmingen，美国加利福尼亚州圣迭戈)以辨别死细胞和活细胞。将配备有计算机的BectonDickinson FACSAria以及FACSDiva软件(BD Biosciences，美国)用于单细胞分选。
B细胞培养：B细胞的培养采用与Lightwood等人描述的方法(JImmunol Methods,2006,316:133-143)类似的方法进行。简言之，将单个分选的兔B细胞在96孔板中与200μL/孔EL-4B5培养基一起在培养箱中在5％CO2的气氛下在37℃孵育7天，该培养基中含有Pansorbin细胞(1:100000)(Calbiochem(Merck)，德国达姆施塔特)、根据WO/2018/122147与PMA(Sigma，德国达姆施塔特)合并的细胞因子混合物(Miltenyi，德国贝吉施格拉德巴赫)以及γ射线照射的鼠EL-4-B5胸腺瘤细胞(5×104/孔)。移除B细胞培养的上清液以用于筛选，并且立即收集剩余细胞并将其在-80℃下冷冻于100μL RLT缓冲液(Qiagen，德国希尔登)中。
EL-4B5培养基由补充有以10％ FCS、10mM HEPES(PAN Biotech，德国艾登巴赫)、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液(PAA，奥地利帕兴)、2mM丙酮酸钠和0.05mMβ-巯基乙醇(Gibco，苏格兰佩斯利)的RPMI 1640(Pan Biotech，德国艾登巴赫)组成。
兔V结构域的PCR扩增：使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)根据制造商的方案由B细胞裂解物(重悬于RLT缓冲液中-Qiagen-目录号79216)制备总RNA。将RNA用60μL无RNA酶水洗脱。将6μL RNA用于使用Superscript IIIFirst-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)和oligo dT引物根据制造商的说明通过逆转录酶反应生成cDNA。所有步骤在Hamilton ML Star System上进行。利用4μL cDNA，用AccuPrime Supermix(Invitrogen12344-040)以50μL的最终体积扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，其中针对转基因兔B细胞的重链使用引物rbHC.up(SEQ IDNO:317)、HUJH5.HFc-DO3(SEQ ID NO:267)和HUJH6.HFc-DO3(SEQ ID NO:268)，并且针对轻链使用BcPCR_FHLC_leader.fw(TG)(SEQ ID NO:269)和HuCK.Do.2AA(所有正向引物(分别为VH和VL的)对信号肽具有特异性，而反向引物(分别为VH和VL的)对框架或恒定区具有特异性。用于VH和VL的PCR条件如下：热启动，94℃，持续5min；在94℃持续20秒、在70℃持续20秒、在68℃持续45秒的35个循环；以及在68℃最终延伸7min。将50μL PCR溶液中的8μL加载到48E-Gel 2(Invitrogen G8008-02)上。将阳性PCR反应液使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案净化，并且用75μL洗脱缓冲液洗脱。所有净化步骤在Hamilton ML Starlet System上进行。
1.4.3大鼠B细胞克隆程序
细胞的耗尽：第一步，使用无菌6孔板(细胞培养级)通过与塑料的非特异性粘附来耗尽非特异性结合的淋巴细胞以及巨噬细胞/单核细胞。每个孔最多装有4mL培养基和至多6x106个PBMC，并且使其在培养箱中在37℃结合1h。将上清液中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于第二耗尽步骤。为此，使用覆盖有抗大鼠CD4(BD Biosciences，美国圣何塞)和抗大鼠IgM(Biorad，美国赫拉克勒斯)的6孔板来耗尽如上所述的贴壁细胞。
免疫荧光染色和流式细胞术：对于表面染色，将来自耗尽步骤的细胞与抗大鼠IgG1、抗大鼠IgG2a、抗大鼠IgG2b(均为FITC)、抗κ轻链(PE)和抗大鼠CD8a(Alexa Fluor647)抗体(全部获自BD Bioscience，美国圣何塞)在PBS中在4℃避光孵育45min。随后，将PBMC用冰冷的PBS洗涤两次。最后，将PBMC重悬于冰冷的PBS中并且立即进行FACS分析。在FACS分析之前加入浓度为5μg/mL的碘化丙啶(BD Pharmingen，美国加利福尼亚州圣迭戈)以辨别死细胞和活细胞。对CD8a+细胞进行阴性门控后，对IgG和κ轻链双阳性细胞进行单细胞分选。将配备有计算机的Becton Dickinson FACSAria以及FACSDiva软件(BDBiosciences，美国)用于分选。
B细胞培养：B细胞的培养采用与Lightwood等人描述的方法(JImmunol Methods,2006,316:133-143)类似的方法进行。简言之，将单个分选的大鼠B细胞在96孔板中与200μL/孔EL-4B5培养基一起在培养箱中在5％ CO2的气氛下在37℃孵育12天，该培养基中含有Pansorbin细胞(1:100000)(Calbiochem(Merck)，德国达姆施塔特)、根据WO 2018/122147与PMA合并以适应浓度的细胞因子混合物以及γ射线照射的小鼠EL-4-B5胸腺瘤细胞(5×104/孔)。移除B细胞培养的上清液以用于筛选，并且立即收集剩余细胞并将其在-80℃下冷冻于100μL RLT缓冲液(Qiagen，德国希尔登)中。
大鼠V结构域的PCR扩增：使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)根据制造商的方案由B细胞裂解物(重悬于RLT缓冲液中-Qiagen-目录号79216)制备总RNA。将RNA用60μL无RNA酶水洗脱。将6μL RNA用于使用Superscript IIIFirst-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)和oligo dT引物根据制造商的说明通过逆转录酶反应生成cDNA。所有步骤在Hamilton ML Star System上进行。利用4μL cDNA，用AccuPrime Supermix(Invitrogen12344-040)以50μL的最终体积扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，其中使用由WTRat.VH.FW11至WTRat.VH.FW17(SEQ IDNo:271至277)组成的正向引物与作为反向引物的682.rev do(SEQ ID NO:278)的混合物扩增VH结构域，并且使用WTRat.VK.FW1(SEQ ID NO:279)和WTRat.VK.FW2(SEQ ID NO:280)与作为反向引物的WTRat.CKappa.Do2(SEQ ID NO:281)的混合物扩增VL结构域。用于扩增VH结构域的PCR条件如下：热启动，94℃，持续4min；在94℃持续20秒、在57℃持续20秒、在68℃持续45秒的35个循环；以及在68℃最终延伸5min。用于扩增VL结构域的PCR条件如下：热启动，94℃，持续4min；在94℃持续20秒、在56℃持续20秒、在68℃持续45秒的35个循环；以及在68℃最终延伸5min。将阳性PCR反应液使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案净化，并且用75μL洗脱缓冲液洗脱。
1.4.4单克隆LTBR抗体的表达
用于表达单克隆抗体的重组载体的生成：为了重组表达家兔单克隆二价抗体，通过突出端克隆法(RS Haun等人，Biotechniques(1992)13,515-518；MZ Li等人，NatureMethods(2007)4,251-256)将编码VH或VL的PCR产物作为cDNA克隆到表达载体中。表达载体含有表达盒，该表达盒由包括内含子A的5'CMV启动子和3'BGH聚腺苷酸化序列组成。除了表达盒之外，质粒还含有源于pUC18的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，以用于在大肠杆菌(E.coli)中进行质粒扩增。使用基本质粒的三种变体：一种含有兔IgG恒定区的质粒，设计用于接受来自DNA免疫兔的VH区；一种含有带PG LALA突变的人IgG恒定区的质粒，设计用于接受来自蛋白质免疫兔的VH区；以及一种含有人κLC恒定区的质粒，用于接受VL区。
使用重叠引物通过PCR扩增编码κ或γ恒定区和VL/VH插入序列的线性化表达质粒。将纯化的PCR产物与T4 DNA聚合酶一起孵育，这生成单链突出端。通过添加dCTP停止反应。在下一步骤中，将质粒和插入序列合并并且与诱导位点特异性重组的recA一起温育。将重组质粒转化到大肠杆菌中。第二天，挑取生长菌落并且通过质粒制备和DNA测序测试正确重组的质粒。与编码兔抗体序列的质粒相比，大鼠抗体序列的基因是在TWIST Bioscience合成的。
对于抗体表达，将分离的HC和LC质粒瞬时共转染到HEK293细胞中，并在1周后收获上清液。
IgG的瞬时表达：在Expi293培养基(Invitrogen Corp.)中培养的瞬时转染的Expi293F细胞(人胚胎肾细胞系293衍生)中产生抗体。对于转染，使用基于脂质的ExpiFectamine 293转染试剂(Invitrogen Corp)。从IgG轻链和重链的单个表达质粒中表达抗体。按照制造商的说明进行转染。转染后六天收获含有重组蛋白的细胞培养物上清液。将上清液储存于降低的温度(例如-80℃)直至纯化。关于在例如HEK293细胞中的人免疫球蛋白的重组表达的一般信息给出于：Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203.选择用于进一步表征的由兔免疫接种得到的IgG为P1AE9452、P1AE9450、P1AE9459、P1AF0080、P1AF0079和P1AE9457，以及来自噬菌体展示的P1AE5929。选择用于进一步表征的由大鼠免疫接种得到的IgG为P1AF0064。
1.5如通过ELISA测量的IgG抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合
将Nunc链霉抗生物素蛋白包被的板(MicroCoat#11974998001)用融合至人IgG1Fc片段的25μl/孔生物素化人、鼠或食蟹猴LTBR细胞外结构域(分别为P1AE2401、P1AE2655和P1AE2656)以125ng/ml的浓度包被，并且在4℃孵育过夜。将3x90μl/孔用PBST缓冲液(10xPBS，Roche#11666789001+0.1％ Tween 20)洗涤后，以1:3稀释液(起始浓度为15μg/ml)加入25μl抗LTBR抗体，并且在室温孵育1h。洗涤(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔抗huκPOD(Millipore,AP502P,1:2000)，并且在RT孵育1h。洗涤(6x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)。测量在370/492nm处进行。
通过直接ELISA测试抗LTBR IgG与人、食蟹猴和鼠LTBR细胞外结构域的二价结合。所有IgG均显示出与人LTBR的强结合，EC50范围为3pM至3nM。对于大多数IgG，与食蟹猴LTBR的结合是相当的。例外情况是P1AE9452(与食蟹猴LTBR的结合强约2倍)、P1AF0079(与食蟹猴LTBR的结合强约1.7倍)，并且对于P1AE1873(即CBE11)，未观察到与食蟹猴LTBR的结合。检测到P1AE9459、P1AF0080、P1AF0064和P1AE5929与小鼠LTBR的结合，所有这些都与人LTBR的结合相当。
表4总结了抗LTBR IgG与人、食蟹猴和小鼠LTBR的ELISA结合。与P1AE1873(CBE11)相比，所有IgG均与食蟹猴LTBR发生交叉反应，并且一部分还与鼠LTBR发生交叉反应。
表4：抗LTBR IgG与人、食蟹猴和小鼠LTBR的结合。
1-4指示作为表12中双特异性抗体的一部分的LTBR抗体。
1.6ELISA测量抗LTBR IgG与人淋巴毒素α1β2和人LIGHT的配体竞争
将Nunc链霉抗生物素蛋白包被的板(MicroCoat#11974998001)用融合至人IgG1Fc片段的25μl/孔生物素化人LTBR细胞外结构域(P1AE2401)以125ng/ml的浓度(对于LIGHT相互作用为500ng/ml)包被，并且在4℃孵育过夜。将3x90μl/孔用PBST缓冲液(10x PBS，Roche#11666789001+0.1％ Tween 20)洗涤后，以1:3稀释液(起始浓度为15μg/ml)加入25μl抗LTBR抗体，并且在室温孵育1h。将3x90μl/孔用PBST缓冲液(10x PBS,Roche#11666789001+0.1％ Tween 20)洗涤后，将25μl配体(人淋巴毒素α1β2(P1AE1235)或His6标记的人LIGHT(R&Dsystems,664-Li))以250ng/ml和1000ng/ml的浓度(对于LIGHT)加入，并且在RT孵育1h。洗涤(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔抗His6-POD(Bethyl#A190-114P,1:10000)并且在RT孵育1h。洗涤(6x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)。测量在370/492nm处进行。
在多步ELISA测定中测试人LTBR与人配体淋巴毒素α1β2和LIGHT之间蛋白质-蛋白质相互作用的抑制。以下抗LTBR IgG显示出对LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用的强烈抑制作用，IC50值在约20pM与约0.9nM之间：P1AE9452、P1AE9459、P1AF0064、P1AF0079、P1AE5929和P1AE1873。P1AE9450和P1AE9457显示出可检出但较弱的对相互作用的抑制(未计算IC50，见图4)。P1AF0080显示测定信号随浓度增加而增加，表明LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用稳定。表5列出了相对IC50值(nM)以及顶部和底部OD。
表5：抗LTBR IgG对LTBR-淋巴毒素α1β2和LTBR-LIGHT相互作用的抑制
1-4指示作为表13中双特异性抗体的一部分的LTBR抗体。
在类似的多步ELISA测定中测试LTBR-LIGHT相互作用。所有测试的抗LTbR IgG均显示出可检出的对相互作用的抑制，与相同化合物对LTBR-淋巴毒素α1β2的抑制相比，通常具有更高的IC50值(见图5)。P1AF0080显示出可检出的对LTBR-LIGHT相互作用的抑制，相比之下，该化合物似乎对LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用具有稳定作用。
1.7HeLa NFκB luc报告基因测定
为鉴定激动性抗LTBR抗体，使用HeLa NFκB报告细胞来检测NFκB活化，其在许多受体(包括TNFR和LTBR，两者均由HeLa细胞内源性表达)的下游。使HeLa NFκB荧光素酶报告细胞在DMEM Gibco 42430+1％Glutamax+10％FBS+1％P/S+100ug/mL潮霉素B中生长。将它们与抗LTBR IgG抗体以从15μg/ml开始的滴定系列一起孵育6h，并且根据制造商的说明使用荧光素酶检测试剂盒(ONE-glow,Promega,E6110)。使用Spectra Max酶标仪(MolecularDevices)检测发光作为NFκB活性的量度。使用CBE11 IgG抗体(P1AE1873)作为阳性对照。在不存在或存在以88μg/ml的固定浓度使用的抗人Fc交联抗体(Fab山羊抗人Fc(Jacksonimmunoresearch 109-006-008))的情况下来测试抗体。
具体而言，第1天，将25'000个细胞接种到经过组织培养处理的平底96孔板中的完全HeLa培养基中。第2天，除去培养基，并且将抗LTBR IgG抗体(+/-交联抗体)加入100ul完全培养基中并且孵育6h。将板从培养箱中取出并且在室温平衡，就像对ONE-glow试剂所做的那样。加入100μl/孔ONE-glow试剂并且将测试溶液转移至白色板，然后使用Spectra Max酶标仪(Molecular Devices)读取发光。结果已绘制于图6中，并且数据总结于表6中。
表6：具有和不具有交联的抗LTBR IgG的HeLa NFκB luc报告基因测定数据
1.8细胞结合(关于重组人LTBR CHO细胞的FACS)
与细胞表面人LTBR的结合是通过在4℃对重组人LTBR CHO细胞进行FACS分析来确定的。使用accutase处理将细胞从细胞培养烧瓶中分离出来，并且以500g离心5min，然后重悬于细胞培养基中。然后将细胞转移至U形底PP板中，并且与抗LTBR IgG抗体在1％ BSA/PBS中在4℃孵育1h。经过额外的洗涤后，使用偶联至Alexa Fluor 488的抗人IgG多克隆抗体(F(ab')2-山羊抗人IgG Fc二抗，Alexa Fluor 488，目录号10120，Life Technologies)检测细胞结合的抗LTBR抗体。在BD FACSCantoTMII细胞分析仪中使用适当的滤光片设置测量细胞结合的荧光。结果以荧光值中位数绘制于图7中，并且数据总结于表7中。将抗LTBRIgG用于从20μg/ml开始的3倍稀释步骤的滴定中。
表7：评定细胞表面LTBR与抗LTBR IgG的结合(绘制荧光强度中位数)
1.9抗LTBR IgG抗体的表位鉴定
抗LTBR IgG抗体的表位仓通过在Octet系统(Molecular Devices LLC，美国)上使用生物膜干涉(BLI)进行竞争性结合分析来表征。简言之，将单体人LTBR ECD(S28-M227)Fc融合avi生物素化(P1AE2835)在HBSP缓冲液中以1μg/ml的浓度捕获在链霉抗生物素蛋白传感器上。第一步，测量抗体与捕获的抗原的直接结合，并且确定每种抗体的缔合信号(“缔合直接结合”)。仅选择具有低解离速率的稳定结合物作为一抗。第二步，分析抗LTBR IgG抗体与同一组抗LTBR IgG“一抗”的竞争性结合。简言之，将HBSP缓冲液中浓度为1μg/ml的生物素化人LTBR ECD捕获在链霉抗生物素蛋白传感器上，随后进行短暂的浸洗。一抗在HBSP缓冲液中以10μg/ml的浓度与抗原结合，以便饱和并且阻断其结合表位(“缔合抗体1”)。在后续步骤中，分析第二抗体(10μg/ml，在HBSP缓冲液中)与抗原/一抗复合物的结合(“缔合抗体2”)。通过将第二抗体的结合信号(来自“缔合抗体2”步骤的120秒处的报告点)除以来自直接结合的结合信号(来自“缔合直接结合”步骤的120秒处的报告点)，获得第二抗体的结合的相对结合值。使用相对结合值以及利用各种聚类算法(例如UPGMA、WPGMA或Ward方法)的内部聚类工具，将评估的抗体分为各种表位仓。所得表位鉴定热图描绘于图8中，相应的结合值百分比显示于表8中。经过表位鉴定的8种选定的抗LTBR IgG的数据导致分配到四个不同的表位仓1、3、4和5(见表9)。P1AE9452与CBE11(P1AE1873)落入相同的表位仓1中。
表8：二抗的结合百分比，如抗LTBR IgG抗体的表位鉴定矩阵中所描绘的
表9：抗LTBR IgG抗体的表位仓
抗LTBR IgG 表位仓
P1AE1873 1
P1AE5929 4
P1AE9452 1
P1AE9457 5
P1AE9459 5
P1AF0064 4
P1AF0079 3
P1AF0080 5
1.10抗LTBR IgG抗体的SPR表征
与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合动力学：使用Biacore T200或Biacore8K仪器(Cytiva)通过表面等离子共振研究抗LTbR IgG与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合。所有实验均在25℃进行，使用HBS-P(Cytiva#BR-1006-71)作为运行和稀释缓冲液。使用标准胺偶联化学将抗人IgG PG LALA特异性抗体固定在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare#29104988)上。将抗LTBR IgG捕获在表面上，使得捕获水平在10RU至100RU之间。将人、食蟹猴或鼠LTBR(分别为P1AE7979、P1AE4411或P1AE4410)以3.7nM至最高300nM的浓度(1:3稀释系列)以30μl/min的流速注射到表面(缔合阶段)，持续120s。通过用运行缓冲液洗涤来监测解离阶段600s。通过以5μl/min的流速持续60s注射10mM NaOH进行表面再生。通过减去从参考表面获得的应答来校正本体折射率差异。减去空白注入(双重参照)。使用BIAevaluation软件将记录的传感图拟合至1:1Langmuir结合模型。缔合和解离速率常数以及相应的亲和力(平衡解离常数KD)已总结在下表10中。
表10：如通过SPR所确定的抗LTBR IgG抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合动力学
1.11降低抗LTBR抗体P1AE5929的疏水性
由于抗LTBR IgG P1AE5929表现出一定程度的疏水性，因此尝试生成其更亲水的变体。因此，生成P1AE5929中V结构域的3D模型，并且分析表面的疏水性斑块。在VH结构域的CDR2尖端清楚地鉴定出一个此类斑块，该斑块以粗体所示的异亮氨酸为中心：IPIFG(SEQID NO:266)。由于该环中的一些疏水性残基可能对于抗原结合关重要，因此保守性替换被视为至关重要，并且引入苯丙氨酸(F)到组氨酸(H)的突变，以便保留芳香族部分，但与苯丙氨酸相比，包含组氨酸时具有更强的极性。该突变通过在两个异亮氨酸附近引入暴露的组氨酸来分离疏水性斑块，并且得到疏水性修复的抗LTBR抗体P1AF7213。如通过疏水相互作用色谱(HIC)所评定的，P1AE5929的表观疏水性可从0.733降至0.321(与疏水性标准品相比的相对保留时间)，并且在用于P1AF7213的55min HIC梯度中，实际保留时间从41.1min降低至29.7min，同时保留对人、食蟹猴和鼠LTBR 的相当的亲和力。
实例 2
抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的生成
2.1抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的生成和生产
在生成和表征单特异性抗LTBR IgG后(图9A)，若干优选的激动性抗LTBR IgG已转化为1+1(LTBR单价)和2+1(LTBR二价)肿瘤基质靶向(即，靶向FAP的)双特异性抗体。抗FAP克隆4B9的生成和制备公开于WO 2012/020006 A2中，该专利以引用方式并入本文。
所制备的不同双特异性抗体结构的示意图显示于图9B至9E以及图37B至37E中。表11汇总了抗LTBR IgG以及1+1和2+1抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的标识符，这些抗体是基于相应IgG的V结构域序列及其所得双特异性衍生物生成的。
表11：抗LTBR抗体及其所得双特异性衍生物的标识符
双特异性抗FAP/抗LTBR抗体用CrossMab技术构建为Fc杵-臼结构IgG。这意味着为生成不对称的双特异性抗体，Fc结构域亚基含有“杵”或“臼”突变以避免重链的错配。为了避免双特异性抗体中轻链的错配，在一个结合部分中引入VH/VL或CH1/Cκ结构域的交换(CrossFab技术)。对于P1AF9727、P1AF9728、P1AF9729和P1AG0694，具有FAP特异性的Fab臂的CH1和Cκ结构域经过交叉。对于P1AG1326、P1AF0532、P1AF0534、P1AF5257、P1AF 5260、P1AF0535、P1AF0537、P1AF5261、P1AH5884、P1AH5885和P1AH5886，具有LTBR特异性的Fab臂的VH和VL结构域经过交叉，并且具有FAP特异性的Fab臂的CH1和Cκ结构域配备有互补电荷，其中CH1中具有两个带负电荷的谷氨酸并且Cκ中具有带正电荷的精氨酸和赖氨酸。已将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变(PG-LALA)引入人IgG1重链的恒定区以消除与Fcγ受体的结合。
双特异性抗FAP/抗LTBR抗体在Roche在Expi293(HEK)细胞(P1AG1326、P1AF9728、P1AF0534、P1AF0535、P1AF0537、P1AF9727和P1AE107)中表达，或者在evitria在CHO K1细胞(P1AF9729和P1AF5261)中表达。所有双特异性抗FAP/抗LTBR抗体均在Roche使用组合的蛋白A亲和色谱(蛋白A(MabSelectTM SuReTM,Cytiva))和阳离子交换色谱(POROSTM XS)方法以及随后的制备型体积排阻色谱(16/600S200,Cytiva)进行纯化。纯化的双特异性抗体的纯度通过分析型体积排阻色谱法(例如TSK G3000 SWXL)和CE-SDS(例如Caliper LabChip GXII)来确定。通过LC-MS检测还原和非还原抗体的理论质量数来确认双特异性抗体的身份。已确定内毒素水平并且均低于0.33EU/mg。双特异性抗FAP/抗LTBR抗体P1AH5884、P1AH5885和P1AH5886在药明生物在CHO中生产，并且通过MabSelectSuRe LX蛋白A亲和色谱、HiTrap SP HP阳离子交换色谱和Superdex200体积排阻色谱进行纯化。
2.2如通过ELISA测量的抗FAP/抗LTBR抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合
将Nunc链霉抗生物素蛋白包被的板(MicroCoat#11974998001)用融合至人IgG1Fc片段的25μl/孔生物素化人、鼠或食蟹猴LTBR细胞外结构域(分别为P1AE2401、P1AE2655和P1AE2656)以125ng/ml的浓度包被，并且在4℃孵育过夜。将3x90μl/孔用PBST缓冲液(10xPBS，Roche#11666789001+0.1％ Tween 20)洗涤后，以1:3稀释液(起始浓度为15μg/ml)加入25μl抗FAP/抗LTBR双特异性抗体，并且在室温孵育1h。洗涤(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔抗huκPOD(Millipore,AP502P,1:2000)，并且在RT孵育1h。洗涤(6x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)。测量在370/492nm处进行。
通过直接ELISA测试抗FAP/抗LTBR双特异性抗体(与FAP和LTBR单价结合，P1AF9729除外，其对于FAP为单价的并且对于LTBR为二价的)与人、食蟹猴和鼠LTBR细胞外结构域的结合(表12)。所有抗FAP/抗LTBR双特异性抗体均显示出对人LTBR的强大的单价结合，EC50值在100pM至1.5nM的范围内。对于LTBR为二价第P1AF9729以约50pM的EC50结合。这些双特异性抗体对人、食蟹猴和鼠LTBR的结合与含有相同LTBR结合物(由表12中的1-4指示)的单特异性IgG(见表4)的结合相当。与其IgG前身一样，所有双特异性抗体均与食蟹猴LTBR发生交叉反应，并且一部分还与鼠LTBR发生交叉反应。与表12中的单价LTBR对应物相比，二价LTBR IgG(见表4)未显示出总体上向更低EC50值的变化。因此，对于二价IgG，在该测定中无明显的经由亲合力的结合。相比之下，P1AF9729包含与P1AF0534相同的抗LTBR激动剂，但具有额外的LTBR结合Fab片段，因此向更低EC50的变化可能是由于亲和力所致。
表12：双特异性抗FAP/抗LTBR抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的ELISA结合
1-4是指表4中的LTBR IgG。
2.3ELISA测量双特异性抗FAP/抗LTBR抗体与人淋巴毒素α1β2和人LIGHT的配体竞争
将Nunc链霉抗生物素蛋白包被的板(MicroCoat#11974998001)用融合至人IgG1Fc片段的25μl/孔生物素化人LTBR细胞外结构域(P1AE2401)以125ng/ml的浓度(对于LIGHT相互作用为500ng/ml)包被，并且在4℃孵育过夜。将3x90μl/孔用PBST缓冲液(10x PBS，Roche#11666789001+0.1％ Tween 20)洗涤后，以1:3稀释液(起始浓度为15μg/ml)加入25μl抗FAP/抗LTBR抗体，并且在室温孵育1h。将3x90μl/孔用PBST缓冲液(10x PBS,Roche#11666789001+0.1％ Tween 20)洗涤后，将25μl配体(人淋巴毒素α1β2(P1AE1235)或His6标记的人LIGHT(R&D systems,664-Li))以250ng/ml(对于淋巴毒素α1β2)和1000ng/ml(对于LIGHT)的浓度加入，并且在RT孵育1h。洗涤(3x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔抗His6-POD(Bethyl#A190-114P,1:10000)并且在RT孵育1h。洗涤(6x90μl/孔，用PBST缓冲液)后，加入25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)。测量在370/492nm处进行，并且总结于表13中。列出了相对IC50值(nM)以及顶部和底部OD。
表13：抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对LTBR-淋巴毒素α1β2和LTBR-LIGHT相互作用的抑制
1-4是指表5中的LTBR IgG。
在多步ELISA测定中测试人LTBR与人配体淋巴毒素α1β2和LIGHT之间蛋白质-蛋白质相互作用的抑制。以下抗FAP/抗LTBR双特异性抗体显示出对LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用的强烈抑制作用，IC50值在约140pM与约0.8nM之间：P1AF9728、P1AF0537、P1AF9727和P1AF9729。P1AF0534和P1AF0535显示出对相互作用的弱抑制或无抑制(图10)。P1AF5261(其包含P1AF0080的抗LTBR抗体)同样显示测定信号随浓度增加而增加，正如已经针对二价IgG形式的该抗LTBR抗体所检测到的那样。
在此生化测定中，LTBR-LIGHT相互作用也可以被抗FAP/抗LTBR双特异性抗体抑制，但抑制程度低于LTBR-淋巴毒素α1β2相互作用。虽然P1AF9727和P1AF9728显示出显著的抑制作用，但针对P1AF0535在较高抗体浓度下仅检测到弱抑制作用，而针对P1AF9729和P1AF0537则未检测到抑制作用。与二价IgG P1AF0080的行为相比，P1AF5261在较高抗体浓度下显示出微弱增加的信号。P1AF0534还在较高浓度下显示出信号的增强(图11)。
2.4抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的SPR表征
与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合动力学：使用Biacore T200或Biacore8K仪器(Cytiva)通过表面等离子共振研究抗FAP/抗LTBR双特异性抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合。所有实验均在25℃进行，使用HBS-P(Cytiva#BR-1006-71)作为运行和稀释缓冲液。使用标准胺偶联化学将抗人IgG PG LALA特异性抗体固定在S系列CM5传感器芯片(GEHealthcare#29104988)上。将双特异性抗体捕获在表面上，使得捕获水平在10RU至100RU之间。将人、食蟹猴和鼠LTBR(分别为P1AE7979、P1AE4411或P1AE4410)以3.7nM至最高300nM的浓度(1:3稀释系列)以30μl/min的流速注射到表面(缔合阶段)，持续120s。通过用运行缓冲液洗涤来监测解离阶段600s。通过以5μl/min的流速持续60秒注射10mM NaOH进行表面再生。通过减去从参考表面获得的应答来校正本体折射率差异。减去空白注入(双重参照)。使用BIAevaluation软件将导出的曲线拟合成1:1Langmuir结合模型。缔合和解离速率常数以及相应的亲和力(平衡解离常数KD)总结在表14中。
表14：如通过SPR所确定的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合动力学
对于选定的1+1和2+1双特异性抗体(分别为P1AF0534、P1AF0537、P1AF5261和P1AF0546、P1AG5683)，通过SPR进一步表征了对人LTBR的单价结合(亲和力)和二价结合(亲合力)。为测量亲和力，将双特异性抗体通过已使用标准胺偶联化学固定在S系列CM3传感器芯片(GE Healthcare)上的抗人IgG PG LALA特异性抗体捕获，并且使用人LTBR(P1AE7979)作为分析物。相比之下，为测量对于LTBR为二价的2+1双特异性构建体的亲和力，将生物素化人LTBR(P1AE7979)捕获在SA链霉抗生物素蛋白芯片上捕获，并且将双特异性抗体用作分析物。结果已总结于表15A和表15B中。显示了抗体:受体复合物的缔合速率和解离速率、(对于LTBR为二价的双特异性抗体的)亲和力或表观亲和力以及半衰期。
正如预期的那样，对于对LTBR为二价的双特异性抗体(分别为P1AF0546和P1AG5683)，可观察到亲合力效应：对于P1AF0546，解离速率常数kd和亲和力分别为2.25E-04(1/s)和0.2nM(表15A)，降低至超出仪器规格的值(表15B)，而对于P1AG5683，解离速率常数和亲和力分别为1.23E-03kd(1/s)和1.1nM(表15A)，降低至kd为4.33E-05(1/s)并且表观亲和力(亲合力)为0.01nM(表15B)。
表15A：在“亲和力”测定设置下通过SPR确定的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对人LTBR的结合动力学
表15B：在“亲合力”测定设置下通过SPR确定的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对人LTBR的结合动力学
*超出规范
2.5对人FAP的结合动力学
使用Biacore T200(Cytiva)通过表面等离子体共振考察抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的抗FAP结合结构域的结合。使用标准胺偶联化学将抗His IgG(Cytiva,#28995056)特异性抗体固定在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare#29104988)上。将抗体捕获在表面上，使得捕获水平在20RU至30RU之间。将人FAP(P1AA5347)以0.37nM至最高30nM的浓度(1:3稀释系列)以30μl/min的流速注射到表面(缔合阶段)，持续180s。通过用运行缓冲液洗涤来监测解离阶段600s。通过以5μl/min的流速持续60秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行表面再生。通过减去从参考表面获得的应答来校正本体折射率差异。减去空白注入(双重参照)。使用BIAevaluation软件将导出的曲线拟合成1:1Langmuir结合模型。缔合和解离速率常数以及相应的亲和力(平衡解离常数KD)已总结在表16中。显示了抗体:FAP复合物的缔合和解离速率、亲和力和半衰期。
表16：如通过SPR所确定的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对人FAP的结合动力学
实例3
双特异性鼠替代抗体的生成
3.1抗FAP/抗LTBR双特异性鼠替代抗体的生成
利用人、食蟹猴和鼠三重交叉反应性抗LTBR激动剂P1AF0080生成双特异性1+1和双特异性2+1(LTBR二价)鼠替代抗体，用于小鼠体内研究。这些抗FAP/抗LTBR双特异性鼠替代抗体P1AF4664和P1AF4674分别描绘于图12A和12B中。虽然它们的V结构域保留为人源的，但所有恒定抗体结构域均为鼠源的。将鼠IgG1 Fc通过CH3(KK+和DD-链)中的互补电荷异二聚化，并且通过在CH2中引入DA PG突变来实现Fc效应子功能的沉默。
P1AF4664和P1AF4674由evitria使用其专有的媒介物系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术和使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，evitria使用其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
简言之，将它们通过蛋白A亲和色谱(蛋白A MabSelectSure)和制备型体积排阻色谱(SEC)(HiLoad 50/600S200)根据标准程序和制造商的说明进行纯化。蛋白质的纯度通过分析型体积排阻色谱法(例如TSK G3000SWXL)和CE-SDS(例如Caliper LabChip GXII)来确定。确定内毒素水平，并且分别为≤0.11EU/mg和0.07EU/mg。
利用人、食蟹猴和鼠类三重交叉反应性抗LTBR激动剂P1AE9459生成双特异性2+1(LTBR二价)FAP靶向或非靶向(DP47)鼠替代抗体，用于小鼠体内研究。这些抗FAP/抗LTBR或非靶向/抗LTBR双特异性鼠替代抗体P1AG5459和P1AG5461分别如图12B和12C中所描绘。虽然它们的V结构域保留为人源的，但所有恒定抗体结构域均为鼠源的。将鼠IgG1 Fc通过CH3(KK+和DD-链)中的互补电荷异二聚化，并且通过在CH2中引入D265A P329G突变来实现Fc效应子功能的沉默。
P1AG5459和P1AG5461由药明生物生产并且纯化。简言之，它们在CHO中生产，并且通过MabSelectSuRe LX蛋白A亲和色谱和Superdex200体积排阻色谱(P1AG5459)或MabSelectSuRe LX蛋白A亲和色谱、HiTrap Butyl HP疏水相互作用色谱和Superdex200体积排阻色谱(P1AG5461)进行纯化。
3.2抗FAP/抗LTBR双特异性鼠替代抗体的SPR表征
对鼠LTbR和鼠FAP的结合亲和力和亲合力：
由于P1AF4664对于LTBR为单价的，而P1AF4674对于LTBR为二价的，因此在BiacoreT200仪器(Cytiva)上确定结合亲和力和亲合力。所有实验均在25℃进行，使用HBS-P(Cytiva#BR-1006-71)作为运行和稀释缓冲液。为确定这些双特异性鼠替代抗体的亲和力，使用标准胺偶联化学将山羊抗小鼠Fcγ特异性抗体(JacksonImmunoResearch#115-005-071)固定在S系列CM3传感器芯片上。将双特异性鼠替代抗体捕获在表面上，并且在单循环动力学运行中以30μl/min的流速用3.7nM至最高300nM的浓度(1:3稀释系列)注射鼠LTbR(P1AE4410)，缔合时间为120s。使用相同的传感器芯片，通过使用如上所述的缔合时间和流速将单一浓度为100nM的鼠FAP(P1AD9907)注射到表面上，来确定对鼠FAP的亲和力。通过用运行缓冲液洗涤来监测最终解离阶段600s。随后，通过以5μl/min的流速各持续60秒注射10mM甘氨酸pH 2.0以及随后的10mM NaOH进行表面再生。通过减去从参考表面获得的应答来校正本体折射率差异。减去空白注入(双重参照)。使用BIAevaluation软件将导出的曲线拟合成1:1Langmuir结合模型。
为确定2+1双特异性鼠替代抗体P1AF4674的亲合力，将大约100RU的生物素化鼠LTbR(P1AE4410)固定在S系列传感器芯片SA上。将双特异性鼠替代抗体作为分析物注射，并且在单循环动力学运行中以30μl/min的流速用11.1nM至100nM的浓度(1:3稀释系列)进行测试，缔合时间为120s。通过用运行缓冲液洗涤来监测最终解离阶段1800s。随后，通过以5μl/min的流速各持续60秒注射10mM甘氨酸pH 2.0进行表面再生。通过减去从参考表面获得的应答来校正本体折射率差异。减去空白注入(双重参照)。使用BIAevaluation软件将导出的曲线拟合成1:1Langmuir结合模型。在该测定设置下，P1AF4674显示出明显的亲合力(表观KD 0.2nM)，与1+1双特异性鼠替代抗体P1AF4664(表观KD 5nM)形成对比。对于与鼠LTBR或鼠FAP结合的单价(1+1)和二价(2+1)抗FAP/抗LTBR双特异性鼠替代抗体，复合物的平衡解离常数(KD)以及半衰期(t1/2)报告于表17中。
表17：对于抗FAP/抗LTBR双特异性鼠替代抗体，复合物的平衡解离常数(KD)和半衰期(t1/2)
实例 4
LTBR 抗体的功能表征
LTBR的活化导致基质细胞上调炎症和发育基因诸如黏附分子ICAM。我们通过测量新颖LTBR激动剂在体外上调人内皮细胞和癌症相关成纤维细胞(CAF)中ICAM的能力来表征其生物活性。
4.1人抗LTBR抗体对内皮细胞的影响
在存在或不存在抗Fc交联剂的情况下用抗LTBR抗体处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且通过FACS分析测量黏附分子ICAM的水平。
简言之，将HUVEC(15000个细胞/孔，目录号C2517AS，Lonza)接种到明胶包被的96孔板中的完全EGM-2培养基(目录号CC3162，Lonza)中，并且使其过夜形成单层。将HUVEC单层细胞用抗LTBR抗体处理过夜，在具有或不具有抗人Fc F(ab)2交联剂(目录号109-006-008，Jackson ImmunoReasearch，抗体与交联剂摩尔比为1:2)的情况下在测定培养基(补充有2％ FBS、抗坏血酸、肝素、GA-1000和肝素的EBM-2培养基，目录号CC3156和CC4176，Lonza)中预孵育30分钟。将处理后的HUVEC用accutase(Gibco)分离，并且用活/死染料(Zombie Aqua Fixable Viability试剂盒，目录号423102，Biolegend)和抗人ICAM-BV421标记的抗体(BD目录号564077，以1:100稀释)染色。在流式细胞仪(BD Fortessa)上采集样品。在FlowJo中分析ICAM表达的荧光强度中位数，并且使用以下公式将数据归一化至CBE11：归一化MFI＝(MFI-MFImin)/(MFImax-MFImin)，其中MFImax作为在包含交联剂的CBE11(PAE1873)的最高浓度下测得的MFI值的中位数来计算，并且MFImin作为在不包含交联剂的CBE11(P1AE1873)的最低浓度下测得的MFI值的中位数来计算。
新颖的抗人LTBR抗体以剂量依赖性和交联依赖性方式诱导HUVEC上的ICAM上调(图13A至13D)。
4.2人抗LTBR抗体对癌症相关成纤维细胞的影响
我们进一步表征了新颖的抗LTBR抗体在体外诱导第二种基质细胞类型(即癌症相关成纤维细胞)中黏附分子上调的能力。为此，在存在或不存在抗Fc交联剂的情况下用抗体处理CAF培养物，并且通过FACS分析测量黏附分子ICAM的水平。
简言之，将来自前列腺的永生化癌症相关成纤维细胞(12000个细胞/孔，hTERTPF179T CAF，ATCC CRL-3290)接种到96孔板的完全培养基(补充有10％ FBS、0.075％碳酸氢钠、1μg/mL嘌呤霉素的EMEM)中。将CAF用抗LTBR抗体处理过夜，在具有或不具有抗人Fc F(ab)2交联剂(目录号109-006-008，Jackson ImmunoReasearch，抗体与交联剂摩尔比为1:2)的情况下在完全培养基中预孵育30分钟。将处理后的CAF用accutase(Gibco)分离，并且使用NIR活/死染料(LIVE/DEAD Fixable近红外死细胞染色试剂盒，Thermo FischerScientific目录号L34975)和抗人ICAM-BV421标记的抗体(BD目录号564077，以1:100稀释)染色。在流式细胞仪(BD Fortessa)上采集样品。在FlowJo中分析ICAM表达的荧光强度中位数，并且使用以下公式将数据归一化至CBE11：归一化MFI＝(MFI-MFImin)/(MFImax-MFImin)，其中MFImax作为在包含交联剂的CBE11(PAE1873)的最高浓度下测得的MFI值的中位数来计算，并且MFImin作为在不包含交联剂的CBE11(P1AE1873)的最低浓度下测得的MFI值的中位数来计算。
抗人LTBR抗体以剂量依赖性和交联依赖性方式诱导CAF上的ICAM上调(图14A至14D)。
总而言之，这些实例表明新颖的抗人LTBR激动性抗体能够上调多种基质细胞中的黏附分子ICAM，并且它们的活性严格依赖于交联。接下来，我们生成包含优选的新颖LTBR激动剂和FAP抗原结合结构域的双特异性分子以获得抗FAP/抗LTBR双特异性抗体。
实例5
抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的功能表征
5.1抗FAP/抗LTBR双特异性抗体结合细胞上的人、食蟹猴和鼠LTBR
为测试抗FAP/抗LTBR双特异性抗体结合细胞上的人、食蟹猴(cyno)和鼠LTBR的能力，将抗FAP/抗LTBR双特异性抗体与经工程化以表达人、食蟹猴或小鼠LTBR的细胞一起孵育，并且通过流式细胞术测量它们的结合。
简言之，用accutase(Gibco)将经工程化以过表达人、食蟹猴或鼠LTBR的CHO-K1细胞分离，并且将100'000个细胞/孔接种到96孔板中，并且与抗FAP/抗LTBR双特异性抗体在培养基(DMEM/F12,10％ FBS)中在4℃孵育1h。洗涤后，将细胞结合的分子使用PE标记的抗人Fc抗体(AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ，Jackson Immunoresearch，目录号109-116-098)进行检测。在iQue流式细胞仪(Sartorius)中测量细胞结合的荧光。在FlowJo中分析PE的荧光强度中位数，并且将数据根据未经处理的对照进行归一化(MFI/基线MFI)。
所有双特异性分子均结合人和食蟹猴LTBR，但P1AG1326除外，其结合人LTBR但不结合食蟹猴LTBR(图15A和图15B以及图15D和15E)。这些数据与实例2.4中描述的SPR数据一致。
与食蟹猴的交叉反应性是新颖的双特异性分子的重要优势，因为它将允许考察相关物种中的毒性特征。由于LTBR是一种广泛表达的靶标，因此降低体内潜在毒理学效应的风险非常重要。
P1AF0537、P1AF5261、P1AF0546、P1AG5683以及较小程度的P1AF9728和P1AF9727另外结合细胞上的鼠LTBR(图15C和15F)，其允许在鼠同基因模型中测试功效和药效学。
5.2抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的FAP依赖性体外活性表征
抗FAP/抗LTBR双特异性抗体旨在通过FAP靶向将LTBR活化限制在肿瘤基质。LTBR的活化导致通过基质细胞上调炎症和发育基因(诸如黏附分子(ICAM和VCAM)和化学引诱物(CXCL9、CXCL10和CXCL11))。我们通过测量抗FAP/抗LTBR双特异性抗体在体外以FAP依赖性方式上调人内皮细胞和癌症相关成纤维细胞中黏附分子和化学引诱物的能力，表征该抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的生物活性。
5.2.1抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对癌症相关成纤维细胞的影响
为测试抗FAP/抗LTBR双特异性抗体在体外以FAP依赖性方式活化癌症相关成纤维细胞的能力，将表达内源性FAP的CAF以及不表达FAP的CAF的培养物用双特异性分子处理，并且通过FACS分析测量黏附分子ICAM。
简言之，将来自前列腺的永生化癌症相关成纤维细胞(hTERT PF179TCAF,ATCCCRL-3290)的FAP表达通过CRISPR技术敲除。将亲本hTERT CAF和敲除FAP的CAF(hTERTCAFs_delFAP)以每孔12000个细胞的密度接种到96孔板中的完全培养基(EMEM、10％ FBS、0.075％碳酸氢钠、1μg/mL嘌呤霉素)中。将细胞用完全培养基中的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体处理过夜。将处理后的细胞用accutase(Gibco)分离，并且使用NIR活/死染料(LIVE/DEAD Fixable近红外死细胞染色试剂盒，Thermo Fischer Scientific目录号L34975)和抗人ICAM-BV421标记的抗体(BD目录号564077，以1:100稀释)染色。在流式细胞仪(BDFortessa)上采集样品。在FlowJo中分析ICAM表达的荧光强度中位数，并且将数据根据未经处理的对照的基线进行归一化，并且表示为相对于基线的倍数变化。
FAP-LTBR双特异性分子以剂量依赖性和FAP依赖性方式诱导hTERT CAF上的ICAM上调(图16A至16D)。
5.2.2抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对内皮细胞的影响
为测试抗FAP/抗LTBR双特异性抗体在体外以FAP依赖性方式活化人内皮细胞的能力，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和过表达人FAP的NIH-3T3细胞的共培养物用双特异性分子进行处理。通过FACS分析来测量HUVEC上黏附分子ICAM的水平，并且通过Bio-plex分析来测量上清液中分泌的化学引诱物CXCL9、CXCL10和CXCL11的量。
简言之，将HUVEC(13000个细胞/孔，目录号C2517AS，Lonza)用NIH-3T3或过表达FAP的NIH-3T3(2000个细胞/孔)接种到明胶包被的96孔板中的完全EGM-2培养基(目录号CC3162，Lonza)中，并且使其过夜形成单层。将共培养物在测定培养基(补充有2％ FBS、抗坏血酸、肝素、GA-1000和肝素的EBM-2培养基，目录号CC3156和CC4176，Lonza)中用抗FAP/抗LTBR双特异性抗体进行处理。24小时后，将共培养物用accutase(Gibco)分离，并且使用PBS中的NIR活/死染料(LIVE/DEAD Fixable近红外死细胞染色试剂盒，Thermo FischerScientific目录号L34975)以及抗人ICAM-BV421(BD目录号564077，以1:100稀释)和抗人CD31-APC/Cy7标记的抗体(Biolegend目录号303120，以1:300稀释)染色。在流式细胞仪(BDFortessa)上采集样品。在FlowJo中分析CD31+群体中ICAM表达的荧光强度中位数，并且将数据根据未经处理的对照的基线进行归一化，并且表示为相对于基线的倍数变化。48小时后收集条件培养基，并且使用定制的Bio-plex多重趋化因子测定试剂盒(Biorad)按照制造商的说明测量CXCL9、CXCL10和CXCL11的浓度。
抗FAP/抗LTBR双特异性抗体以剂量依赖性和FAP依赖性方式诱导人内皮细胞上的ICAM上调(图17A至17D)。二价双特异性分子P1AF0546和P1AG5683具有最低的EC50值，表明这种2+1形式具有更高的功效。抗FAP/抗LTBR双特异性抗体还显示上清液中CXCL9、CXCL10和CXCL11的剂量依赖性和FAP依赖性诱导(图18A至18F)。总而言之，这些数据表明抗FAP/抗LTBR双特异性抗体能够调节内皮细胞以增加黏附分子和化学引诱物，这对增加肿瘤中的免疫浸润很重要。重要的是，该效应取决于FAP的存在，证明LTBR激动作用可经由FAP靶向而限制在肿瘤微环境。
5.2.3抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对T细胞黏附的影响
之前的实例表明，抗FAP/抗LTBR双特异性抗体能够调节人内皮细胞以上调黏附分子和化学引诱物，这对免疫浸润级联至关重要。为测试这些效应是否导致T细胞浸润增加，我们测量了免疫浸润级联的第一步，即免疫细胞与抗FAP/抗LTBR双特异性抗体刺激的内皮细胞的黏附。
简言之，将HUVEC用NIH-3T3或过表达FAP的NIH-3T3接种，并且用FAP-LTBR双特异性分子(2nM)(如之前的实例中所述)或用TNFα(0.5ng/mL,Peprotech)刺激。使用Histopaque-1077通过密度梯度离心从健康供体血沉棕黄层中分离PBMC，并且冷冻直至使用。使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-096-535)并且按照制造商说明从冷冻PBMC等分试样中纯化泛T细胞。将纯化的T细胞在T细胞培养基(T细胞优化剂培养基，Gibco目录号A1048501)中静止过夜。收集静止的T细胞，用DPBS++(Gibco，目录号14040182)(补充有0.2％ BSA)洗涤，并且用Calcein AM(Invitrogen，目录号C3100MP)在37℃标记20min。经过大量洗涤后，将标记的T细胞重悬于DPBS++0.2％ BSA中，并且将100’000个细胞/孔加入之前用测定培养基洗涤的处理后的共培养物中。使T细胞在37℃黏附1小时，并且通过用DPBS++0.2％ BSA倒置洗涤来去除非贴壁细胞。使用Incucyte S3活细胞分析系统(Sartorius)采集相位和绿色荧光图像(每孔5张)，并且使用Incucyte图像分析软件将贴壁T细胞作为绿色荧光T细胞所覆盖的面积进行定量。
TNFα刺激独立于FAP诱导T细胞黏附，并且用作阳性对照。用抗FAP/抗LTBR双特异性抗体处理的内皮上的T细胞黏附增加，并且该效应取决于共培养系统中FAP的存在情况(图19)。
总而言之，这些数据表明，LTBR激动能够以FAP靶向方式诱导并且上调人内皮细胞的炎症程序，从而诱导T细胞黏附，这是免疫浸润级联的第一步。因此，抗FAP/抗LTBR双特异性抗体可用作肿瘤微环境调节剂以增加免疫细胞向肿瘤中的募集。
5.3抗FAP/抗LTBR双特异性抗体替代物的体外和体内表征
新颖的FAP-LTBR双特异性分子的一个子集与鼠LTBR具有交叉反应性。我们在鼠IgG骨架上生成鼠替代物分子，如之前实例中所述，并且对它们的体外和体内活性进行了测试。
5.3.1抗FAP/抗LTBR双特异性抗体替代物对小鼠成纤维细胞的体外活性
为测试抗FAP/抗LTBR替代物分子以FAP依赖性方式在体外活化小鼠基质细胞的能力，将FAP-LTBR双特异性分子与NIH-3T3或过表达FAP的NIH-3T3细胞一起孵育，并且通过FACS分析来测量VCAM的上调。
简言之，将NIH-3T3或过表达FAP的NIH-3T3细胞接种到96孔板中的完全培养基中。将抗FAP/抗LTBR替代物分子或抗体5G11(抗小鼠LTBR激动性抗体，Hycult Biotech目录号hm1079)用低血清培养基(DMEM,1％ FBS)稀释，并且将细胞刺激过夜。将处理后的细胞用accutase(Gibco)分离，并且使用NIR活/死染料(LIVE/DEAD Fixable近红外死细胞染色试剂盒，Thermo Fischer Scientific目录号L34975)和抗小鼠VCAM-太平洋蓝标记的抗体(Biolegend，目录号105722)进行染色。在流式细胞仪(BD Fortessa)上采集样品。在FlowJo中分析VCAM表达的荧光强度中位数，并且将数据根据未经处理的对照的基线进行归一化，并且表示为相对于基线的倍数变化。
抗鼠LTBR激动性抗体5G11诱导两种细胞类型上的VCAM上调，而P1AF4664以及较小程度的P1AF4674对NIH-3T3细胞无活性，并且仅在存在FAP表达的情况下诱导VCAM(图20A和20B)。
5.3.2抗FAP/抗LTBR双特异性抗体替代物对内皮细胞的体外活性
为测试抗FAP/抗LTBR替代物分子在体外以FAP依赖性方式活化内皮细胞的能力，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与过表达人FAP的NIH-3T3细胞的共培养物用双特异性分子处理，并且通过FACS分析来测量HUVEC上黏附分子ICAM的水平。
简言之，将HUVEC(15000个细胞/孔，Lonza目录号C2517AS)与亲本NIH-3T3或过表达FAP的NIH-3T3细胞(2000个细胞/孔)一起接种到明胶包被的96孔板中的完全EGM-2培养基(目录号CC3162，Lonza)中。将共培养物在测定培养基(补充有2％ FBS、抗坏血酸、肝素、GA-1000和肝素的EBM-2培养基，目录号CC3156和CC4176，Lonza)中用FAP-LTBR双特异性分子处理过夜。将处理后的共培养物用accutase(Gibco)分离，并且使用PBS中的NIR活/死染料(LIVE/DEAD Fixable近红外死细胞染色试剂盒，Thermo Fischer Scientific目录号L34975)以及抗人ICAM-BV421(BD目录号564077，以1:100稀释)和抗人CD31-APC/Cy7标记的抗体(Biolegend目录号303120，以1:300稀释)染色。在流式细胞仪(BD Fortessa)上采集样品。在FlowJo中分析CD31+群体中ICAM表达的荧光强度中位数。
抗FAP/抗LTBR替代物分子以剂量依赖性和FAP依赖性方式诱导人内皮细胞上的ICAM上调(图21A和21B)。
总而言之，这些数据表明替代物分子在体外具有活性，并且诱导基质细胞发生FAP依赖性LTBR激动作用，类似于人骨架分子的效应。接下来，我们在同基因小鼠肿瘤模型中测试替代物分子的体内活性。
5.3.3FAP-LTBR替代物分子在结直肠癌和胰腺癌、皮下肿瘤模型中的体内功效和 药效学研究
在携带表达人癌胚抗原(CEA)的皮下结直肠肿瘤(MC38-huCEA)和表达人CEA的胰腺肿瘤(KPC4662-huCEA)的小鼠中评定FAP-LTBR替代物分子对内皮活化的功效和药效学效应。后一种模型的特征在于基质中表达丰富的FAP+并且基线时免疫浸润极少，而MC38-huCEA肿瘤模型的特征在于基质中的中等程度的FAP表达以及基线时更丰富的免疫浸润。
KPC4662细胞获自宾夕法尼亚大学，并且经过内部工程化以表达人CEA。将细胞在DMEM+FBS10％+潮霉素500μg/ml中培养。表达人CEA的MC38细胞获自希望之城贝克曼研究所(Beckman Research Institute of the City of Hope)。将细胞在DMEM+FBS10％+遗传霉素(Geneticin)500μg/ml中培养。注射前，对细胞进行计数，并且将500,000个细胞(MC38-huCEA)或300,000个细胞(KPC4662-huCEA)以100μl的总体积与RPMI和Matrigel以1:1混合，皮下注射到表达人CEA的小鼠的侧腹。使用卡尺每周测量肿瘤生长至少两次，并且按下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(W2/2)x L(W：宽度，L：长度)。
在MC38-huCEA研究中(图22)，将小鼠在细胞注射后21天随机分组，此时肿瘤大小平均达到大约195mm3。所有小鼠均用200μl媒介物、P1AF4664、P1AF4674、aPD-L1(克隆6E11)、aPD-L1+P1AF4664和aPD-L1+P1AF4674的适当溶液(P1AF4664、P1AF4674，每周3次，5mg/kg，以及aPD-L1，每周两次5mg/kg，对于aPD-L1，首次注射以10mg/kg腹膜内进行)静脉内注射。为在每200μl中获得适量的化合物，将储备液用组氨酸缓冲液(20mM组氨酸，140mMNaCl，pH 6.0)稀释。在治疗开始后第9天和第16天，处死五只小鼠或存活数量的小鼠。对这些小鼠的肿瘤进行处理以用于下游分析。
通过用Liberase和DNA酶酶解肿瘤样品，获得用于流式细胞术分析的肿瘤单细胞悬液。然后对单细胞悬液中的鼠CD45、人CEA PerCP-Cy5.5、鼠平足蛋白PE-Cy7、鼠CD31APC/Cy7和ICAM APC等进行染色。在BD Fortessa流式细胞仪上采集样品并且在FlowJo中分析数据。
在KPC4662-huCEA研究中(图25)，在小鼠初始肿瘤生长16天后，当肿瘤大小达到大约140mm3时，将小鼠随机分组并且每周用组氨酸缓冲液(媒介物)或P1AF4664或P1AF4674(10mg/kg)治疗三次。向所有小鼠静脉注射200μl适当的溶液。为了在每200μl中获得适量的化合物，将储备液用组氨酸缓冲液(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0)稀释。在治疗开始后第6天，每组处死五只小鼠。对这些小鼠的肿瘤进行处理以用于下游组织学分析。
为通过免疫荧光(三维图像处理，3DIP)进行组织学分析，将肿瘤固定在以PBS按1:4稀释的BD Cytofix溶液中大约20小时。洗涤并且转移至PBS后，将肿瘤包埋于4％低胶凝温度琼脂糖中。使用配备有普通剃刀刀片的Leica VT1200s Vibratome从这些块上切下肿瘤切片(70μm厚)。随后对切片进行透化(TBS+0.3％ Triton-X)并且使用BSA和小鼠血清(各1％)封闭两小时，然后使用以下抗体在室温染色过夜(约15小时)：PNAd/Meca79(AF647)和CD31(AF594)。图像采集是在Leica SP8倒置共焦显微镜上完成的。图像定量是在Imaris9.6(Bitplane)中进行的。
对于肿瘤生长数据、流式细胞术以及3DIP分析，在GraphPad PRISM 8和单向Anova检验中绘图，在组之间进行多重比较，并且使用Holm-Sidak校正进行多重检验。
在MC38-huCEA(图22)研究中，我们观察到用FAP-LTBR替代物分子P1AF4664和P1AF4674治疗以单一疗法抑制MC38-huCEA肿瘤的生长并且改善aPD-L1的肿瘤生长抑制(图23A至23C)。肿瘤生长动力学显示，经治疗的动物的肿瘤生长抑制在治疗大约一周后开始显现(图23A和23C)。在治疗开始后12天，在媒介物与P1AF4674之间以及媒介物与包含P1AF4664和P1AF4674的两种aPD-L1组合之间的肿瘤体积存在具有统计学意义的差异。此外，P1AF4674与aPD-L1的组合显示出比aPD-L1单一疗法具有统计学意义的更小的肿瘤体积(图23B)。这表明与1+1形式(P1AF4664)相比，2+1形式(P1AF4674)显示出更优异的肿瘤生长抑制作用。
在治疗开始后第9天和第16天对肿瘤单细胞悬液的流式细胞术分析揭示了在用FAP-LTBR替代物分子治疗后肿瘤内皮上的黏附分子ICAM的上调(图24A和24B)。P1AF4674(一种二价LTBR激动剂)相比于单价分子P1AF4664是更优异的。
在KPC4662-huCEA研究(图25)中，治疗开始后6天，我们通过组织学分析观察到，在用FAP-LTBR替代物分子P1AF4664和P1AF4674治疗后，肿瘤组织中高内皮小静脉(HEV)的存在情况显著增加(图26A、26B和26C)。
5.3.4FAP-LTBR替代物分子联合抗PD-L1在原位乳腺癌模型中的体内功效和药效 学研究。
在携带原位乳腺肿瘤(EMT6)的小鼠中评定抗FAP/抗LTBR双特异性抗体P1AG5459作为单一疗法或与检查点抑制剂aPD-L1组合治疗时对内皮活化、细胞因子分泌和免疫浸润的功效和药效学效应。该模型的特征在于丰富的FAP+表达基质以及极少的免疫浸润(主要位于基线时的肿瘤边缘)。
EMT6细胞获自ATCC(CRL-2755)。细胞在DMEM+15％ FCS中培养。注射前，对细胞进行计数，并且将1,000,000个细胞以50μl的总体积以与RPMI和Matrigel 1:1混合的形式注射到BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。使用卡尺每周测量肿瘤生长至少两次，并且按下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(W2/2)x L(W：宽度，L：长度)。在本研究中，应答者和无应答者定义为在分析的时间点的肿瘤体积分别低于或高于治疗开始时的肿瘤体积。
用于流式细胞术分析和组织学分析的肿瘤单细胞悬液按照5.3.3中所述进行，其中向组织学组合中加入针对CD8(BV421)、CD4(BV570)和B220(BV711)的抗体。
使用BCA试剂盒(Thermo Scientific，Pierce BCA蛋白检测试剂盒，#23225，美国)，根据制造商的说明评定肿瘤裂解物中的趋化因子水平，并且在Spectramax i3 ELISA检测仪(Molecular Devices，美国)上读取板。然后使用Bio-Plex ProTM小鼠趋化因子组合33-Plex(#12002231，BioRad，美国)测量蛋白质裂解液中的细胞因子和趋化因子水平。在96孔mag板(Bio-Plex ProTM平底板，#171025001，BioRad，美国)根据制造商的说明制备样品。按照仪器随附的软件4.2版的说明，在Flexmap 仪器(Luminex，美国)上读取测定结果。
在EMT6研究中(图27)，我们观察到用FAP-LTBR替代物分子P1AG5459治疗以单一疗法有效控制EMT6原位肿瘤，并且进一步改善了抗PD-L1治疗的部分肿瘤生长抑制，诱导肿瘤消退(图28A-B)。研究结束时，单一疗法臂中的3只小鼠和组合臂中的5只小鼠无肿瘤。重要的是，当用非靶向(DP47)-LTBR抗体(P1AG5461，图28A-B)治疗小鼠时，未观察到肿瘤生长抑制作用，证明双特异性抗FAP/抗LTBR双特异性抗体在体内具有FAP依赖性效应。疗法开始后第13天对肿瘤单细胞悬液的流式细胞术分析揭示了在用P1AG5459治疗的所有组中肿瘤内皮上黏附分子ICAM(图29A)和VCAM(图29B)的FAP依赖性上调，但用P1AG5461治疗的组中则不存在这种效应。肿瘤内皮上黏附分子的上调可促进免疫细胞从血液跨内皮迁移到组织中。此外，在用P1AG5459治疗的肿瘤中可检测到丰富的Meca79+HEV群体(图29C)。HEV是淋巴器官中初始T细胞和记忆T细胞外渗的专用血管，并且最近已经与肿瘤中增加的免疫浸润关联起来(Asrir等人,Cancer Cell.2022年3月14日；40(3):318-334.e9.doi:10.1016/j.ccell.2022.01.002)。观察到的PD读数是异质的，但与无应答者(实心圆圈，●，图29A-C)相比，对内皮细胞黏附分子水平的影响更大，并且在应答者(空心方块，□)的肿瘤中观察到更高百分比的HEV。免疫荧光组织学分析确认，在单独用P1AG5459或与aPD-L1抗体组合治疗的肿瘤中，Meca79+分化的高内皮小静脉的存在显著增加(图30A)。在用P1AG5461治疗的肿瘤中检测到的HEV少得多，确认了FAP LTBR在体内的FAP依赖性活性。组织学分析进一步揭示，用P1AG5459治疗增加了B细胞(图30D)、CD8 T细胞(图30B)和CD4T细胞(图30C)向肿瘤的浸润。增加的免疫浸润也是异质的，但与无应答者(实心圆圈，●)相比，在应答者肿瘤(空心方块，□)中观察到更高水平的免疫浸润。增加的免疫浸润具有FAP依赖性，因为在使用非靶向分子P1AG5461治疗后未观察到这种情况。肿瘤裂解物的分析揭示了响应于P1AG5459治疗，趋化因子CXCL13(图31A)、CCL5(图31B)和CXCL10(图31C)的量增加。响应于FAP-LTBR治疗的肿瘤部位的趋化因子上调可介导肿瘤部位吸引更多免疫细胞。
5.3.5在原位乳腺癌模型中使用FAP-LTBR替代物分子以及T和B细胞耗尽组进行体 内功效研究。
在耗尽CD4 T细胞、CD8 T细胞或表达CD20+的B细胞并且携带原位乳腺肿瘤(EMT6)的小鼠中评定P1AG5459以单一疗法的抗肿瘤功效依赖性。该模型的特征在于丰富的FAP+表达基质以及极少的免疫浸润(主要位于基线时的肿瘤边缘)。
EMT6细胞获自ATCC(CRL-2755)。细胞在DMEM+15％ FCS中培养。注射前，对细胞进行计数，并且将100,000个细胞以50μl的总体积以与RPMI和Matrigel 1:1混合的形式注射到BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。使用卡尺每周测量肿瘤生长至少两次，并且按下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(W2/2)x L(W：宽度，L：长度)。通过在第4天、第5天、第6天、第9天和第16天腹膜内注射150微克抗CD4(GK1.5)或抗CD8(2.43)来进行CD4/CD8 T细胞耗尽。通过在第8天静脉内注射250微克抗CD20(SA271G2)来进行B细胞耗尽。
对于肿瘤生长数据，在GraphPad PRISM 8和单向Anova检验中绘图，在指定的组之间进行多重比较，并且使用Holm-Sidak校正进行多重检验。
在本研究中，我们确认用FAP-LTBR替代物分子P1AG5459进行治疗以单一疗法有效控制了EMT6原位肿瘤(见图32A至32C)。我们还表明，在不存在CD8 T细胞的情况下，经媒介物和P1AG5459治疗的肿瘤生长速度相似。在第15天，当每组仍剩下超过3只动物时，统计分析显示在CD8耗尽的媒介物组与P1AG5459组之间，肿瘤体积无统计学显著差异，表明CD8 T细胞对于在EMT6肿瘤模型中介导P1AG5459功效是必需的(图32B)。类似地，在第20天的分析的在CD4耗尽的媒介物组与P1AG5459组之间以及在表达CD20+的B细胞耗尽的媒介物组与P1AG5459组之间，肿瘤体积无统计学显著差异(图32C)，表明CD4和B细胞在介导P1AG5459的功效中也发挥作用。
5.3.6在含有Apc/KrasG12D/p53shRNA/Smad4突变的CRC的原位模型中使用FAP- LTBR替代物分子进行体内药效学研究。
在携带原位CRC肿瘤(AKPS类器官模型)的小鼠中评定P1AG5459以单一疗法的药效学作用。该模型的特征在于丰富的FAP+表达基质以及非常少的免疫浸润(如果有的话)(主要位于基线时的肿瘤边缘)。
AKPS结直肠癌类器官(经由CRISPR-Cas9工程化以在Apc、KrasG12D(敲入)、p53(敲除)和Smad4中含有突变的小鼠肠道类器官)获自基因泰克。将类器官在含有B-27TM补充剂(GibcoTM)、N2、Advanced DMEM/F-12(GibcoTM)加谷氨酰胺和HEPES的培养基中培养。注射前，对类器官进行计数，并且将200个类器官以总体积为50μl的上述相同的培养基注射到C57BL/6-N小鼠的结肠粘膜下层(经由结肠镜检查)。每周经由结肠镜检查来监测肿瘤生长。
当根据当地指南需要处死小鼠时或最后在植入后第50天时进行肿瘤收获。为通过免疫荧光(三维图像处理，3DIP)进行组织学分析，将肿瘤固定在以PBS按1:4稀释的BDCytofixTM固定缓冲液中大约20小时。洗涤并且转移至PBS后，将肿瘤包埋于4％低胶凝温度琼脂糖中。使用配备有普通剃刀刀片的Leica VT1200s Vibratome从这些块上切下肿瘤切片(70μm厚)。随后对切片进行透化(TBS+0.3％ Triton-X)并且使用BSA和小鼠血清(各1％)封闭两小时，然后使用以下抗体在室温染色过夜(约15小时)：Ki67(AF532)、B220(AF647)、CD8(BV421)、CD4(BV570)、CD11c(BV480)、PD1(PE)、TCF1(AF488)、PNAd/Meca79(AF647)和CD31(AF594)。图像采集是在Leica SP8倒置共焦显微镜上完成的。图像制备是在Imaris9.9(Bitplane)中进行的。除一项染色外，所有染色均在同一切片上进行(如图34中所指示)。
如在其他小鼠模型中观察到的，我们确认用P1AG5459治疗诱导Meca79+HEV的分化(图33)。重要的是，HEV在肿瘤内发育，但不在邻近的正常结肠组织中发育(图33)。此外，用P1AG5459治疗显著增加了肿瘤中CD8 T细胞的数量(图33)。此外，在第50天处死的接受P1AG5459治疗的小鼠的一个样品中，我们发现肿瘤免疫浸润物本身组织成三级淋巴结构(TLS)，其特征在于存在CD11c骨髓细胞、不同的B和T细胞区、增殖的B细胞中心并且含有活化的T细胞(PD1+)和表达干性标志物TCF1的T细胞(图34)。
本研究表明，P1AG5459治疗不仅能够增加肿瘤内免疫细胞和HEV的含量，而且能够形成三级淋巴结构，已知这些结构与各种癌症中检查点抑制剂治疗的应答改善相关(Schumacher和Thommen,DOI:10.1126/science.abf9419)。
总之，实例5中描述的数据表明，新颖的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体在体内有效并且能够在结直肠癌和免疫排除的乳腺癌模型中控制肿瘤生长。抗FAP/抗LTBR双特异性抗体与检查点抑制剂抗PD-L1协同作用，表明抗FAP/抗LTBR双特异性抗体可用于改善临床上对检查点抑制剂的应答。数据还表明，抗FAP/抗LTBR双特异性抗体通过上调黏附分子并且将血管向HEV表型分化以及诱导化学引诱物的分泌来调节肿瘤微环境(特别是肿瘤脉管系统)。总的来说，这些效应改善了向肿瘤中的免疫浸润，并且免疫细胞含量的增加介导了新颖的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体的抗肿瘤功效，这在乳腺癌原位模型中得到证明。此外，如在原位结直肠癌模型中观察到的，新颖的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体可以驱动三级淋巴结构的形成。
实例6
抗FAP/抗LTBR双特异性抗体与已知LTBR抗体的比较和优异性6.1抗FAP/抗LTBR双特异性抗体对体外内皮细胞的影响
为了在功能上比较含有抗LTBR抗体P1AE9459或已知抗LTBR抗体CBE11(如US 7,429,644 B2中所述)和BHA10(如US 7,429,645 B2中所述)的抗FAP/抗LTBR双特异性抗体，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与过表达人FAP的NIH-3T3细胞的共培养物用双特异性分子处理，并且通过FACS分析来测量HUVEC上的黏附分子ICAM的水平，如5.2.2中所述。
在存在FAP的情况下，所测试的所有双特异性分子以相似的效力上调内皮细胞上的ICAM(图35A)。大多数分子在不存在FAP的情况下无活性(图35B)，然而，含有作为LTBR激动剂抗原结合结构域的CBE11的双特异性抗体(P1AE1079)在高剂量下在不存在FAP的情况下显示出一定的活性，表明含有新颖的LTBR激动性抗体或BHA10的双特异性形式相较于抗体克隆CBE11具有优异性。
6.2抗FAP/抗LTBR双特异性抗体结合细胞上的人、食蟹猴和鼠LTBR
为比较含有抗LTBR抗体P1AE9459和已知抗LTBR抗体CBE11和BHA10的双特异性抗体结合细胞上的人、食蟹猴(cyno)和鼠LTBR的能力，将抗FAP/抗LTBR双特异性抗体与经工程化以表达人、食蟹猴或小鼠LTBR的细胞孵育，并且通过流式细胞术测量它们的结合，如5.1中所述。
所有抗FAP/抗LTBR双特异性抗体类似地与细胞上的人LTBR结合，然而，P1AE1079与人LTBR的结合效率低于含有BHA10的双特异性抗体或抗LTBR抗体P1AE9459。此外，与含有BHA10的LTBR(1+1形式)单价结合的双特异性抗体与人LTBR的结合不如与LTBR二价结合的分子(对于BHA10以及对于新颖的抗LTBR抗体P1AE9459)(图36A)。
含有新颖的抗LTBR抗体P1AE9459或BHA10的双特异性抗体类似地与食蟹猴LTBR结合，然而含有CBE11的双特异性分子不与食蟹猴LTBR结合(图36B)，与实例5.1一致。与食蟹猴的交叉反应性是新颖的双特异性抗体的重要优势，因为它将允许考察相关物种中的毒性特征。由于LTBR是一种广泛表达的靶标，因此降低体内潜在毒理学效应的风险非常重要。
有趣的是，仅含有新颖的抗LTBR抗体P1AE9459的双特异性分子与细胞上的鼠LTBR结合，而含有已知抗体CBE11或BHA10的双特异性分子与鼠LTBR不发生交叉反应(图36C)。这些数据表明，新颖的抗LTBR抗体P1AE9459结合独特的表位，尽管人与小鼠LTBR之间的同一性较低(人和小鼠ECD的比对为69％)，但该表位允许跨三个物种进行交叉反应。与鼠LTBR的结合是新颖的双特异性抗体的重要优势，因为它允许在相关的同基因模型直接研究相同结合物的体内功效和药效学效应，仅需要对骨架进行鼠源化。反映不同的人肿瘤生物学的同基因模型可引导探讨相关的组合策略和患者选择策略，从而为临床开发提供信息。
6.3通过表面等离子共振(SPR)比较与LTBR的结合
将新型LTBR激动性抗体P1AE9459的结合行为与已知LTBR抗体CBE11和BHA10的结合行为进行比较。使用Biacore T200或Biacore 8K仪器(Cytiva)通过表面等离子共振考察抗LTbR IgG抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合。所有实验均在25℃进行，使用HBS-P(Cytiva#BR-1006-71)作为运行和稀释缓冲液。使用标准胺偶联化学将抗人IgG PG LALA特异性抗体固定在S系列CM5或CM3传感器芯片上。将抗LTBR IgG捕获在表面上，使得捕获水平在10RU至100RU之间。将人、食蟹猴或鼠LTBR(分别为P1AE7979、P1AE4411或P1AE4410)以3.7nM至最高300nM的浓度(1:3稀释系列)以30μl/min的流速注射到表面(缔合阶段)，持续120s。通过用运行缓冲液洗涤来监测解离阶段600s。通过以5μl/min的流速持续60s注射10mM NaOH进行表面再生。通过减去从参考表面获得的应答来校正本体折射率差异。减去空白注入(双重参照)。使用BIAevaluation软件将记录的传感图拟合至1:1Langmuir结合模型。缔合和解离速率常数以及相应的亲和力(平衡解离常数KD)已总结在下表18中。新颖的LTBR激动性抗体P1AE9459与人、食蟹猴和鼠类LTBR发生交叉反应，而CBE11仅与人LTBR结合，并且BHA10与人和食蟹猴LTBR发生交叉反应，但不与鼠LTBR结合。P1AE9459和BHA10对人LTBR的亲和力相当(分别为0.3nM和0.5nM)，而CBE11对人LTBR的亲和力比P1AE9459低约3倍。与已知抗体CBE11和BHA10相比，P1AE9459是对人和食蟹猴LTBR亲和力最强的抗体，并且是唯一一种与鼠受体发生交叉反应的抗体。
表18：如通过SPR所确定的抗LTBR IgG抗体与人、食蟹猴和鼠LTBR的结合动力学的比较
6.4通过氢/氘交换(HDX)质谱确定表位
通过氢/氘交换质谱确定LTBR激动性抗体P1AE9459以及CBE11(P1AE1873)和BHA10(P1AH0119)的表位。为了进行比较，还确定了天然配体人淋巴毒素α1β2(P1AE1235)的单链构建体与从丝氨酸28克隆到甲硫氨酸227的人LTBR(P1AH2680)的结合界面。
通过不存在抗体或配体(蛋白质状态1)或存在先导抗体P1AE9459(蛋白质状态2)或存在抗体CBE11(蛋白质状态3)或存在BHA10(蛋白质状态4)或存在天然配体人淋巴毒素α1β2(蛋白质状态5)的单链构建体的情况下在缓冲氘化水(D2O)中孵育不同的持续时间，将人LTBR用氘标记。使用以下缓冲液和仪器：H2O缓冲液(20mM组氨酸、140mM氯化钠，pH 6.0，在H2O中)、D2O缓冲液(20mM组氨酸、140mM氯化钠，pH 6.0，在D2O中)和淬灭缓冲液(4M尿素、0.17M KH2PO4、0.3M三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)，pH 2.8)。对于移液和标记，使用来自Leap Technologies的PAL HTC自动进样器。所有标记样品(0min、15秒、1分钟、10分钟、60分钟和300分钟标记)均一式三份进行。
在不同的标记时间后，通过加入淬灭缓冲液来淬灭交换反应。随后，将所有样品均通过猪笼草蛋白酶-2进行蛋白酶酶解。将所得肽通过反相UPLC分离，并且使用ThermoOrbitrap FusionTM LumosTM TribidTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific)通过MS/MS检测进行鉴定。对于数据评估，为了分别鉴定在蛋白质状态1、2、3、4和5的下具有不同氘化水平的LTBR的肽，使用可从Bioinformatics Solutions,Inc.(BSI)商购获得的软件工具PeaksTMStudio以及从Sierra Analytics商购获得的HDExaminer。
更详细地，对氘标记样品的分析按如下方法进行：将标记和淬灭的样品加载到冷却的(0℃)nanoACQUITY 系统(Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德)上。用天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白酶-2(Affipro,#AP-PC-004)在20℃进行在线酶解。将获得的肽在0℃捕获并且脱盐3min(0.23％甲酸水溶液，200μl/min，WatersTM VanGuardC18，1.7μm，2.1x5 mm)。随后，使用含有0.23％甲酸的乙腈(pH 2.5)在7min内从8％增加至35％的梯度、以40μl/min的流速对所有样品进行反相分离(WatersTM BEH C18柱，1.7μm，1x100 mm)。
通过Thermo Orbitrap FusionTM LumosTM TribidTM质谱仪，使用正离子电喷雾进行质谱分析。对于使用0min标记时间样品的肽鉴定，第一次重复测定使用高能碰撞解离(HCD)，第二次重复测定使用电子转移解离(ETD)，并且第三次重复测定使用电子转移/高能碰撞解离(EThcD)；全部采用数据依赖型采集(DDA)模式。对于所有标记测量，全扫描模式足以满足要求。
就数据评估而言，根据提供商的说明书，使用PeaksTM Studio(BioinformaticsSolutions Inc.(BSI))进行肽鉴定。根据提供商的说明书，使用HDExaminer(SierraAnalytics)确定由不同标记时间得到的肽中的氘掺入，与未氘化的对照(0min标记时间)进行比较。HDExaminer的氘化差异图，将结合蛋白质状态2、3、4和5的氘化水平分别与未结合蛋白质状态1进行比较，用于确定表位。
针对不同LTBR抗体以及针对天然配体人淋巴毒素α1β2(P1AE1235)确定的氘化差异图显示于图38A至38D中。对应的表位区域的总结显示于下表19中。P1AE9459的表位与抗体BHA10的表位重叠但不同。抗体CBE11与完全不同的表位结合。
表19：如通过HDX质谱所确定的表位区的总结
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实例相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。

Claims (38)

1.一种与人激动性淋巴毒素β受体(LTBR)和与食蟹猴LTBR结合的LTBR抗体，其中所述抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和
CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体具有以下特性中的至少一者：
(a)以小于2倍的亲和力差异与人LTBR和与食蟹猴LTBR结合；或者
(b)以通过ELISA测量的小于4nM的EC50与人LTBR细胞外结构域结合，并且以通过ELISA测量的小于5nM的EC50与食蟹猴LTBR细胞外结构域结合；或者
(c)需要针对其激动活性进行交联以活化人LTBR；或者
(d)需要针对其激动活性进行交联以诱导人脐静脉内皮细胞或癌症相关成纤维细胞中的ICAM上调；或者
(e)抑制人LTBR与其人配体淋巴毒素α1β2和LIGHT之间的相互作用。
3.根据权利要求1或2所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；或者
(vi)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；或者
(vii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者
(viii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLLTBR)，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
(ix)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体还与鼠LTBR结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体以通过ELISA测量的小于1nM的EC50与鼠LTBR细胞外结构域结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQID NO:85的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和
CDR-L3，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体包含
(i)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；或者
(iii)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列；或者
(iv)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或者
(v)重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；
以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中所述抗体与人LTBR上的SEQ ID NO:351的表位区结合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中所述抗体包含：重链可变区(VH LTBR)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，所述轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中所述抗体包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQID NO:34的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体为多特异性抗体，特别是双特异性抗体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体包含人源、特别是人IgG亚类、更特别是人IgG1亚类的Fc结构域。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，所述Fc结构域包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体包含人IgG1亚类的Fc结构域，所述Fc结构域具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体为与LTBR和与肿瘤相关抗原(TAA)、特别是与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的双特异性抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中激动性抗体为双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)与成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性结合的第一抗原结合结构域，
(b)与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，以及
(c)人IgG1亚类的Fc结构域，其包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
17.根据权利要求16所述的激动性LTBR抗体，其中所述双特异性抗体在与FAP结合后活化LTBR。
18.根据权利要求16或17所述的激动性LTBR抗体，其中所述双特异性抗体包含与人LTBR结合的第三抗原结合结构域。
19.根据权利要求18所述的激动性LTBR抗体，其中与人LTBR结合的第三抗原结合结构域跟与LTBR结合的第二抗原结合结构域相同。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中与FAP特异性结合的所述第一抗原结合结构域包含
(i)重链可变区(VHFAP)，所述重链可变区包含：重链互补决定区(CDR-H1)，其包含SEQID NO:3的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQIDNO:5的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，所述轻链可变区包含：轻链互补决定区CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者
(ii)重链可变区(VHFAP)，所述重链可变区包含：CDR-H1，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，所述轻链可变区包含：CDR-L1，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中与FAP特异性结合的所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；或者所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中与FAP特异性结合的所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中所述激动性LTBR抗体为双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)与FAP特异性结合的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含：重链可变区(VHFAP)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及轻链可变区(VLFAP)，其包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列；以及
(b)与LTBR特异性结合的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含：重链可变区(VH LTBR)，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL LTBR)，其包含SEQID NO:34的氨基酸序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中所述激动性LTBR抗体为双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)与FAP结合的第一Fab片段，
(b)与人LTBR结合的第二Fab片段，以及
(c)人IgG1亚类的Fc结构域，其包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
25.根据权利要求24所述的激动性LTBR抗体，其中与人LTBR特异性结合的所述第二Fab片段为crossFab片段。
26.根据权利要求1至23中任一项所述的激动性LTBR抗体，其中所述激动性LTBR抗体为双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
(a)与FAP结合的第一Fab片段，
(b)与人LTBR结合的第二Fab片段和第三Fab片段，以及
(c)人IgG1亚类的Fc结构域，其包含降低抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代，其中与FAP结合的所述第一Fab片段在其N末端处融合至Fc结构域亚基中的一者的C末端，并且与LTBR特异性结合的所述第二Fab片段和第三Fab片段各自在其C末端处融合至所述Fc结构域亚基中的一者的N末端。
27.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体。
28.一种表达载体，其包含根据权利要求27所述的一种或多种分离的多核苷酸。
29.一种原核或真核宿主细胞，其包含根据权利要求27所述的一种或多种分离的多核苷酸或根据权利要求28所述的表达载体。
30.一种生产双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：a)在适合于激动性LTBR抗体的表达的条件下培养根据权利要求29所述的原核或真核宿主细胞，以及b)任选地回收所述激动性LTBR抗体。
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体以及药用赋形剂。
32.根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体，其用作药物。
33.根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体，其用于(a)诱导内皮细胞或癌症相关成纤维细胞上的ICAM上调，或(b)增强T细胞黏附。
34.根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体，其用于治疗癌症。
35.根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体，其用于治疗癌症，其中所述激动性LTBR抗体或药物组合物用于与化疗剂、放射和/或供在癌症免疫疗法中使用的其他药剂组合施用。
36.根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体，其用于治疗癌症，其中所述激动性LTBR抗体用于与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂组合施用。
37.根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体或根据权利要求30所述的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
38.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求1至26中任一项所述的激动性LTBR抗体或根据权利要求31所述的药物组合物。
CN202280083563.4A 2021-12-20 2022-12-19 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体 Pending CN118434768A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410950466.1A CN119143873A (zh) 2021-12-20 2022-12-19 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21215804.2 2021-12-20
EP22208828.8 2022-11-22
EP22208828 2022-11-22
PCT/EP2022/086540 WO2023117834A1 (en) 2021-12-20 2022-12-19 Agonistic ltbr antibodies and bispecific antibodies comprising them

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410950466.1A Division CN119143873A (zh) 2021-12-20 2022-12-19 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118434768A true CN118434768A (zh) 2024-08-02

Family

ID=84360974

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280083563.4A Pending CN118434768A (zh) 2021-12-20 2022-12-19 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118434768A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7386911B2 (ja) 共刺激ｔｎｆ受容体に対する二重特異性抗体
JP7459186B2 (ja) 標的化４－１ｂｂ（ｃｄ１３７）アゴニストとの併用療法
US11613587B2 (en) Combination therapy of T cell activating bispecific antigen binding molecules and PD-1 axis binding antagonists
JP7587656B2 (ja) Ｐｄ－ｌ１及びｃｄ１３７に結合する抗体分子
US20220073646A1 (en) Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
JP7675739B2 (ja) Ｏｘ４０およびｆａｐを標的化する二重特異性抗原結合分子
JP6996979B2 (ja) 三量体ｔｎｆファミリーリガンドを含む抗原結合分子
CN118440201A (zh) 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子
JP2021528988A (ja) 新規の二重特異性アゴニスト４−１ｂｂ抗原結合分子
US20250034269A1 (en) Agonistic ltbr antibodies and bispecific antibodies comprising them
EP3231813A1 (en) Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
CN111741979A (zh) 包含4-1BBL的Her2靶向性抗原结合分子
US11453722B2 (en) Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory TNF receptor
JP2023530760A (ja) Ｈｅｒ２を標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子
JP2024522340A (ja) ＥｐＣＡＭを標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子
CN118434768A (zh) 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体
RU2826084C2 (ru) МОЛЕКУЛЫ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ PD-L1 и CD137
TW202502811A (zh) 與ｂｃｍａ特異性結合之免疫刺激性抗原結合分子
TW202506740A (zh) 使用ＦＡＰ靶向淋巴毒素β受體促效劑之組合療法
TW202504918A (zh) 靶向ｂｃｍａ及ｃｄ２８的雙特異性抗體

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40114510

Country of ref document: HK