CN118451094A

CN118451094A - 抗病毒肽及其使用方法

Info

Publication number: CN118451094A
Application number: CN202280086299.XA
Authority: CN
Inventors: 赵旵军; 袁国勇
Original assignee: Virus And Vaccine Research Center Co ltd; Versitech Ltd
Current assignee: Virus And Vaccine Research Center Co ltd; Versitech Ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2024-08-06
Also published as: US20250171511A1; EP4457237A1; WO2023125432A1

Abstract

描述了用于治疗或预防冠状病毒感染的一种或多种症状的抗病毒肽及其制剂。已证实衍生自人β防御素2的肽具有针对不同冠状病毒变体的抗病毒特性，包括交联病毒颗粒、阻断细胞间融合和/或抑制病毒释放。还提供了使用一种或多种抗病毒肽的药物组合物和方法。优选地，抗病毒肽经由鼻内途径施用，以预防或缓解冠状病毒感染的一种或多种症状，例如减少合胞体形成和肺损伤。

Description

抗病毒肽及其使用方法

技术领域

本发明总体上涉及具有抗病毒特性的肽，更具体地说，涉及用于预防或治疗冠状病毒变体引起的感染的组合物和方法。

背景技术

在过去二十年中，冠状病毒已引发三次爆发(2003-SARS-CoV、2012-MERS-CoV和2019-SARS-CoV-2)。在撰写本发明时，SARS-CoV-2大流行已持续近两年(J.F.Chan,et al.,Lancet,395(2020)514-523)。然而，很少有广泛使用的药物可以有效保护人类免受SARS-CoV-2感染。重症COVID-19肺炎患者会出现肺泡弥漫性损伤，伴随其肺组织中合胞体的形成，这是由于病毒刺突-ACE2介导的细胞融合所引起的(R.Bussani,et al.,EBioMedicine,61(2020)103104；Z.Xu,et al.,Lancet Respir Med,8(2020)420-422)。病毒刺突-ACE2介导的融合引起的合胞体可能与重症COVID-19患者的过度炎症反应有关，抗合胞体药物或许会产生更好的临床结果(H.Ma,et al.,Cell Discov,7(2021)73；J.Buchrieser,et al.,Embo j,39(2020)e106267；和L.Lin,et al.,Cell Death Differ,28(2021)2019-2021)。

有效的抗病毒药物和中和抗体可以阻止病毒进入易感宿主细胞，从而中止病毒复制周期的第一步。许多研究试图通过鉴定病毒进入抑制剂作为关键的抗病毒策略(R.Heida,et al.,Drug Discov Today,26(2021)122-137)。已知SARS-CoV-2通过与硫酸肝素(HS)和受体ACE2结合进入细胞内部，其通过TMPRSS2介导的细胞膜融合途径或内吞途径的细胞进入(T.M.Clausen,et al.,Cell,183(2020)1043-1057.e1015；和M.Hoffmann,etal.,Cell,181(2020)271-280e278)。尽管许多研究表明一些抗病毒药物可以阻止SARS-CoV-2进入或病毒RNA合成(D.Asarnow,et al.,Cell,184(2021)3192-3204.e3116；V.GilMartínez,et al.,Pharmaceuticals(Basel),2021Jul 28；14(8):736；Y.W.Zhou,et al.,Signal Transduct Target Ther,6(2021)317)，但关于SARS-CoV-2是如何从受感染的细胞释放并进入到其他未感染的细胞的报道较少。此外，尚未有抗病毒药物被明确证实可以抑制SARS-CoV-2的释放。

需要开发有效的预防性和/或治疗性疗法，以用于患有一种或多种呼吸道病原体(例如SARS-CoV-2)或有暴露于一种或多种呼吸道病原体(例如SARS-CoV-2)的风险的人群。因此，本发明的目的是提供用于治疗和/或预防SARS-CoV-2感染的预防性和/或治疗性疗法。

本发明的另一个目的是提供用于治疗和/或预防与SARS-CoV-2感染相关的一种或多种病理过程的组合物和方法。

发明概述

研究发现，衍生自人β防御素2肽的抗病毒肽在体内和体外广泛抑制了SARS-CoV-2变体。

描述了包括抗病毒肽的组合物。抗病毒肽通常具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其片段或变体，例如，在一些情况下，抗病毒肽与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、99％的序列相似性。在一些形式中，抗病毒肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中任一项的氨基酸序列或其变体；或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性的其变体。在一些形式中，抗病毒肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些形式中，抗病毒肽具有以四聚体形式交联的SEQ IDNO:4的氨基酸序列。在一些形式中，两种或多种抗病毒肽呈二聚体、三聚体、四聚体或多聚体的形式。

在一些形式中，抗病毒肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有序列SEQ ID NO:1或者为SEQ ID NO:1的片段或变体。在一些形式中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、99％的序列相似性。在一些形式中，所述氨基酸序列具有SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的序列，或者为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的变体。在一些形式中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。在一些形式中，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:4的序列。

在一些形式中，抗病毒肽具有序列SEQ ID NO:1或者为SEQ ID NO:1的片段或变体。在一些形式中，抗病毒蛋白与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、99％的序列相似性。在一些形式中，抗病毒肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的序列，或者为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的变体。在一些形式中，抗病毒肽与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。在一些形式中，抗病毒肽包含SEQ ID NO:4。

还提供了多聚体，所述多聚体具有两个或多个抗病毒肽，其中所述抗病毒肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有序列SEQ ID NO:1或者为SEQ ID NO:1的片段或变体。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、99％的序列相似性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中任一项的序列，或者为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项的变体。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。在一些实施方案中，所述多聚体为二聚体、三聚体或四聚体，和/或为同源多聚体或异源多聚体。在一些实施方案中，多聚体由每个单体抗病毒肽交联形成，优选使用2,2-双(羟甲基)丙酸(MPA)或具有4个反应位点的第二代MPA树枝状分子。在一些实施方案中，所述多聚体是通过将MPA与两个具有SEQ ID NO:4的单体抗病毒肽偶联形式，所述单体抗病毒肽通过C端的赖氨酸交联，以形成具有两个抗病毒肽分支的分子，或者，通过将具有4个反应位点的第二代MPA树枝状分子与具有SEQ ID NO:4的单体抗病毒肽偶联形成，所述单体抗病毒肽通过C端的赖氨酸交联，以形成具有四个抗病毒肽分支的分子。

还提供了包含抗病毒肽和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的抗病毒肽或多聚体。在一些形式中，药物组合物是冻干的，或以液体或粉末的形式。还描述了包括抗病毒肽的试剂盒。通常，试剂盒包括一个或多个单一单位剂量的抗病毒肽，以及关于如何施用剂量以治疗或预防冠状病毒感染、流感病毒感染或鼻病毒感染的说明书。所述流感病毒可以是HIN1病毒，和/或，所述鼻病毒可以是HRV-1B或HRV-B14。

还提供了通过向有此需要的受试者施用有效量的抗病毒肽或多聚体或抗病毒肽组合物治疗、延缓进展或预防进展一种或多种呼吸道病毒感染症状或者阻断病毒传播的方法。该方法特别适用于患有呼吸道病毒感染或有感染呼吸道病毒风险的受试者。在一些形式中，呼吸道病毒是SARS-CoV-2病毒或其变体，例如SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变体)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变体)、SARS-CoV-2P.1(Gamma变体)、SARS-CoV-2B.1.617、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变体)、SARS-CoV-2B.1.621(Mu变体)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变体)、SARS-CoV-2B.1.617.3或SARS-CoV-2B.1.1.529(Omicron变体)。该方法通常将组合物以例如粉末、液体或悬浮液的形式施用至肺部或鼻腔系统。在一些形式中，组合物以气雾剂形式或经由喷雾器或吸入器施用。在其他形式中，该组合物与另一种治疗剂、预防剂或诊断剂联合施用。示例性药剂包括支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗过敏剂及其组合。

在一些形式中，组合物以选自以下组的间隔施用：每周一次、每两周一次、大约每月一次、每两个月一次和每三个月一次，任选地每周一次，持续最长达1、2、3、4、5或6个月。在一些形式中，组合物以0.001mg/kg受试者体重(含)和100mg/kg受试者体重(含)之间的剂量；或以2.0mg(含)和20mg(含)之间的剂量；任选地以5mg的剂量施用于人受试者。优选地，该方法以有效减轻受试者的合胞体形成和肺损伤的量施用，任选地减轻咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促中的一种或多种症状。

提供了本文所述的抗病毒肽、多聚体或组合物用于治疗或延缓进展呼吸道病毒感染的一种或多种症状或者阻断病毒传播，其包括向有此需要的受试者施用有效量的抗病毒肽、多聚体或组合物。在一些实施方案中，所述受试者患有呼吸道病毒感染或有感染呼吸道病毒的风险。在一些实施方案中，呼吸道病毒选自以下组：SARS-CoV-2病毒、流感病毒或鼻病毒。在一些实施方案中，流感病毒是HIN1病毒和/或鼻病毒是HRV-1B或HRV-B14。在一些实施方案中，该病毒是选自以下组的SARS-CoV-2病毒变体：SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变体)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变体)、SARS-CoV-2P.1(Gamma变体)、SARS-CoV-2B.1.617、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变体)、SARS-CoV-2B.1.621(Mu变体)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变体)、SARS-CoV-2B.1.617.3和SARS-CoV-2B.1.1.529(Omicron变体)。在一些实施方案中，组合物被施用于肺部或鼻腔系统。在一些实施方案中，组合物以选自以下组的形式施用：粉末、液体和悬浮液。在一些实施方案中，组合物以气雾剂的形式施用。在一些实施方案中，组合物经由雾化器或吸入器施用。在一些实施方案中，组合物与另一种治疗剂、预防剂或诊断剂联合施用。在一些实施方案中，组合物与一种或多种选自以下组的药剂联合施用：支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗过敏剂及其组合。在一些实施方案中，组合物以选自以下组的间隔施用：每周一次、每两周一次、大约每月一次、每两个月一次和每三个月一次。在一些实施方案中，组合物每周施用一次，持续最长达1、2、3、4、5或6个月的时间。在一些实施方案中，组合物以0.001mg/kg受试者体重(含)至100mg/kg受试者体重(含)之间的剂量施用于人受试者。在一些实施方案中，组合物以2.0mg(含)至20mg(含)之间的剂量施用于人受试者。在一些实施方案中，组合物以5mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，组合物以有效减轻受试者的合胞体形成和肺损伤的量施用。在一些实施方案中，组合物以有效减轻咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促中的一种或多种症状的量施用。

提供了本文所述的抗病毒肽、多聚体或组合物在制备用于治疗或延缓进展呼吸道病毒感染的一种或多种症状或者阻断病毒传播的药物或试剂盒中的用途。在一些实施方案中，受试者患有呼吸道病毒感染或有感染呼吸道病毒的风险。在一些实施方案中，所述症状选自以下组：咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促。在一些实施方案中，呼吸道病毒选自以下组：SARS-CoV-2病毒、流感病毒或鼻病毒。在一些实施方案中，流感病毒是HIN1病毒，和/或，鼻病毒是HRV-1B或HRV-B14。在一些实施方案中，该病毒是选自以下组的SARS-CoV-2病毒变体：SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变体)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变体)、SARS-CoV-2P.1(Gamma变体)、SARS-CoV-2B.1.617、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变体)、SARS-CoV-2B.1.621(Mu变体)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变体)、SARS-CoV-2B.1.617.3和SARS-CoV-2B.1.1.529(Omicron变体)。在一些实施方案中，该组合物用于施用于肺部或鼻腔系统。在一些实施方案中，该组合物的形式选自以下组：粉末、液体和悬浮液。在一些实施方案中，该组合物是气溶胶的形式。在一些实施方案中，该组合物用于经由雾化器或吸入器施用。在一些实施方案中，药物或试剂盒包含另一种治疗剂、预防剂或诊断剂。在一些实施方案中，药物或试剂盒包含一种或多种选自以下组的药剂：支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗过敏剂及其组合。在一些实施方案中，组合物以选自以下组的间隔施用：每周一次、每两周一次、大约每月一次、每两个月一次和每三个月一次。在一些实施方案中，组合物每周施用一次，持续最长达1、2、3、4、5或6个月的时间。在一些实施方案中，组合物以0.001mg/kg受试者体重(含)至100mg/kg受试者体重(含)之间的剂量施用于人受试者。在一些实施方案中，组合物以2.0mg(含)至20mg(含)之间的剂量施用于人受试者。在一些实施方案中，组合物以5mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，组合物以有效减轻受试者的合胞体形成和肺损伤的量施用。在一些实施方案中，组合物以有效减轻咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促中的一种或多种症状的量施用。

附图说明

图1A-1E是显示使用噬斑减少测定对SARS-CoV-2的抗病毒活性的条形图。图1A是显示在低盐条件(30mM磷酸盐缓冲液，PBS/5)下浓度为25、12.5和0μg/ml的H23、H26、H30肽存在时，通过噬斑减少测定(n＝3)测定的噬斑形成单位百分比(PFU％)的条形图；图1B是显示在高盐条件(150mM PBS)下浓度为25、12.5和0μg/ml的H23、H26、H30肽存在时，通过噬斑减少测定(n＝3)测定的噬斑形成单位的百分比(PFU％)的条形图；图1C是显示在PBS中的浓度为0至12.5μg/ml的2-分支H30(2H30)和4-分支H30(4H30)肽存在时，通过噬斑减少测定(n＝4)测定的噬斑形成单位的百分比(PFU％)的条形图；图1D是显示在浓度为0至400μg/ml(n＝3)的4H30肽存在时，VeroE6和Calu-3细胞的细胞活力(％)的条形图；图1E是显示感染后VeroE6和Calu-3细胞(n＝6)中在DMEM或4H30存在下针对SARS-CoV-2(B.1.1.63)的噬斑形成单位百分比(PFU％)的条形图。病毒感染6小时后，将4H30(50μg ml^-1)添加到感染的细胞中，并在感染后24-30小时测量上清液中的病毒滴度，*表示与DMEM相比P<0.05，**表示与DMEM相比P<0.01，P值由双尾学生’t检验计算，数据以独立生物样品的平均值±SD呈现。

图2A-2F是条形图。图2A显示了病毒感染前1h(1h-Pre)4H30(25μgml^-1)预处理的每个样品的病毒RNA拷贝(RNA拷贝，0-16倍)，分别相对于模拟处理的病毒(Mock)和病毒感染前4H30预处理的病毒(Pre-mix)，在感染后1小时(1h)测量。相对RNA拷贝数(倍数)相对于模拟处理的病毒(n＝4)归一化；图2B显示了在病毒感染前1小时(1h)用4H30(25μg ml^-1)预处理的每个样品的病毒RNA拷贝数(病毒RNA拷贝相对于1h，0-90倍)，分别相对于模拟处理的病毒(Mock)和病毒感染前4H30预处理的病毒(Pre-mix)，在感染后6小时(6h)测量(n＝4)；图2C显示了病毒附着，显示对于用DMEM、25μg ml^-1 4H30(4H30)、0.1％Triton X100(Triton)、中和抗体(Anti-S)或模拟中的每个处理，然后加入到VeroE6细胞中在4℃下附着(n＝4)的SARS-CoV-2样品通过RT-qPCR测量的RNA拷贝数(相对RNA，0-5倍)，*表示与DMEM相比P<0.05，**表示与DMEM相比P<0.01。P值通过双尾学生’t检验计算，数据以指示的四个独立生物样品的平均值±SD呈现；图2D显示了与ACE2相比(n＝8)，4H30与刺突的结合情况，分别显示了在ELISA板上，刺突(S)、150ng、37.5ng、0ng的S结合的4H30、或结合至150ng、37.5ng、0ng的包被的4H30的ACE2(100ng)以及单独的ACE2的OD值(0-3.0)，*表示与ACE2相比P<0.05；图2E显示了在ELISA板上，刺突(100ng)与包被的ACE2的结合情况，分别显示了刺突(S)、抗体处理的刺突(Ab)、ACE2处理的4H30(4H30)以及单独的PBS(Mock)中的每个与ACE2的相对结合(0-125％)(n＝4)。用中和抗体(Ab)处理的刺突用作对照，**表示与S+PBS相比P<0.01；图2F显示了4H30(50μg ml^-1)预处理的4H30对抗SARS-CoV-2病毒的活性，分别显示了PBS、4H30和Mock中的每个的PFU/ml(10⁴-10⁷)，(n＝4)，*表示与PBS相比P<0.05。

图3A至3J是条形图。图3A分别显示了10hpi上清液中包含DMED、4H30-6h和Mock的每个样品的病毒RNA拷贝(0-120％)；图3B显示了感染后10小时用DMEM、4H30或Mock(未感染的细胞)处理的每个样品的病毒RNA拷贝(10⁶-10¹⁰)；图3C分别显示了18hpi上清液中包含14h、BSA、4H30、CS、HS、4H30-CS、4H30-HS和4H30-BSA的每个样品的病毒RNA拷贝(0-200％)；图3D分别显示了在300ng GAG、75ng GAG和0ng GAG以及4H30存在下，每个CS和HS样品与4H30结合的OD值(0-0.40)；图3E分别显示了包含DMEM、4H30、BSA、CS、HS、4H30-BSA、4H30-CS、4H30-HS和Mock的每个样品针对A549的病毒RNA拷贝(0-1000％)；图3F分别显示了在4H340处理后4天SARS-CoV-2与Calu-3细胞的附着，使用DMEM、4H30或Mock处理的每个样品的病毒RNA拷贝数/孔(10⁵-10⁸)；*表示与DMEM相比P<0.05。P值通过双尾学生’t检验计算。数据以四个独立生物样品的平均值±SD呈现；图3G分别显示了在Mock、4H30和ChABC+Hase存在下，包含DMEM或4H30的每个样品针对A549的病毒RNA拷贝(0-250％)；图3H是在4H30预处理1小时然后暴露于SARS-CoV-2的Calu-3细胞中SARS-CoV-2复制的图，分别显示了用DMEM、4H30或Mock(未感染的细胞)处理的每个样品的PFU/ml(10¹-10⁵)(n＝4)。所有数据以四个独立生物样品的平均值±SD表示；图3I分别显示了分别包含DMEM、4H30、CS、HS、4H30-CS、4H30-HS和4H30-BSA的每个样品的病毒RNA拷贝数(0-350％)；图3J分别显示了在320ngGAG、80ng GAG和0ng 4H30(12.5μg/ml GAG)以及DMEM存在下，每个CS和HS样品的病毒RNA拷贝(0-140％)。

图4A-4E是条形图。图4A是VeroE6细胞中抑制内体酸化的线性图，分别显示了4H30和Mock中每个随时间(0-40天)的体重变化(50％-130％)；图4B分别显示了包含4H30-24h、4H30-8h、4H30-4h、4H30-Pre、Mock和H23-Pre的每个样品对于B.1.1.63的PFU/肺(10⁵-10⁸)；图4C分别显示了Mock、4H30-0.5和4H30-0.1的每个对于B.1.1.63的PFU/肺(10⁵-10⁸)；图4D分别显示了包含B.1.163(IC₅₀＝0.48)、B.1.1.7(IC₅₀＝0.75)、B.1.351(IC₅₀＝0.89)和B.1.617.2(IC₅₀＝0.79)的每个样品的PFU(0-140％)；图4E分别显示了B.1.617.2暴露后Mock、4H30和Remde中的每个的PFU/肺(10⁴-10⁹)；P＝0.061。

图5是显示4H30对H1N1病毒复制的抑制效果的条形图，数据以具有两次以上的独立实验的至少三个生物样品的平均值±SD呈现。

图6是显示使用噬斑减少测定的4H30抑制次要组HRV-1B和主要组HRV-B14的条形图，病毒RNA拷贝(％)是将4H30处理的病毒RNA相对于未处理的病毒(0μg/ml肽)的RNA归一化，数据以至少三个独立生物样品的平均值±SD呈现。

发明详述

I.定义

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于鼠类、猿类、人类、哺乳类农场动物、哺乳类运动动物和哺乳类宠物动物。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指，例如，与未接受该化合物的匹配受试者相比，在施用该制剂的受试者中能够治疗疾病或病症的一种或多种症状、逆转疾病或病症的一种或多种症状的进展、停止疾病或病症的一种或多种症状的进展、或预防疾病或病症的一种或多种症状的发生的量。化合物的实际有效量可以根据所使用的具体化合物或其组合、配制的特定组合物、施用方式以及个体的年龄、体重、状况和所治疗的症状或状况的严重程度而变化。

术语“药学上可接受的”或“生物相容性的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并具有合理的效益/风险比的组合物、聚合物和其他材料和/或剂型。短语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如用于将任何主题组合物从一个器官或身体部分携带或运输到另一个器官或身体部分的液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或封装材料。每种载剂必须是“可接受的”，即与主题组合物的其他成分兼容并且不会伤害患者。

术语“药学上可接受的盐”是本领域公认的，包括相对无毒的化合物的无机和有机酸加成盐。药学上可接受的盐的例子包括衍生自矿物酸(例如盐酸和硫酸)的盐，以及衍生自有机酸(例如乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸)的盐。适合形成盐的无机碱的例子包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝和锌的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。还可以与合适的有机碱形成盐，包括无毒并且强度足够形成此类盐的有机碱。为了说明的目的，此类有机碱的类别可以包括单、二和三烷基胺，例如甲胺、二甲胺和三乙胺；单、二或三羟基烷基胺，例如单、二和三乙醇胺；氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡萄糖胺；N-甲基葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；等等。

在抑制的上下文中的术语“抑制”或“降低”是指活性和数量的降低或减少。这可以是活性或数量的完全抑制或降低，也可以是部分抑制或降低。抑制或降低可与对照或标准水平进行比较。抑制可用％值来测量，例如从1％至最高100％，诸如5％、10％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。例如，与未接受或未用所述组合物治疗的受试者的相同标志物的活性和/或数量相比，包含治疗剂的组合物可抑制或降低受试者的疾病或病症的一种或多种标志物约10％、20％、30％、40％、50％、75％、85％、90％、95％或99％。在一些形式中，根据mRNA、蛋白质、细胞、组织和器官的水平比较抑制和降低。

在疾病或病症的上下文中，术语“治疗”或“延缓进展”是指改善、减少或以其他方式阻止疾病、病症或病况在可能易患该疾病、病症和/或病况但尚未被诊断为患有该疾病、病症或病况的动物中发生或进展；抑制该疾病、病症或病况，例如，阻碍其进展；以及缓解该疾病、病症或病况，例如，导致该疾病、病症和/或病况消退。治疗疾病或病况包括改善特定疾病或病况的至少一种症状，即使潜在的病理生理学不受影响，例如通过施用止痛剂来治疗受试者的疼痛，即使这种药剂不能治疗疼痛的病因。治疗的理想效果包括降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与冠状病毒感染相关的一种或多种症状，包括但不限于减少和/或抑制合胞体形成和肺损伤、提高疾病患者的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延缓疾病的进展和/或延长个体的生存期，则个体被成功“治疗”。

术语“可生物降解”通常指材料在生理条件下会降解或侵蚀为能够被受试者代谢、消除或排泄的较小单元或化学物质。降解时间取决于成分和形态。

术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指两个以上的天然或非天然氨基酸的任何链，无论是否经过翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)，构成天然存在或非天然存在的多肽或肽的全部或部分。

术语“冠状病毒病2019”、“COVID-19”或“COVID”是指由人类大流行SARS-CoV-2病毒引起的疾病。

术语“联合治疗”是指治疗疾病或其症状，或实现期望生理变化的方法，包括向动物(例如哺乳动物，尤其是人类)施用有效量的两种或两种以上的化学药剂或组分，以治疗疾病或其症状，或产生生理变化，其中化学药剂或组分一起施用，例如作为同一组合物的一部分，或者同时或不同时间分别独立地施用(即，每种药剂或组分的施用彼此之间间隔一段有限的时间)。

术语“给药方案”是指药物施用时涉及的剂型、施用途径、药物剂量、给药间隔和治疗持续时间。

除非本文另有说明，否则本文中列出的数值范围仅仅旨在作为单独提及落入该范围内的每个单独值的简便方法，并且每个单独值都并入说明书中，如同其在本文中被单独列出。

II.组合物

已确定衍生自人β防御素2肽的抗病毒肽可在体内和体外广泛抑制SARS-CoV-2变体。实施例中的机制研究表明，此类抗病毒肽与SARS-CoV-2交联形成病毒簇，无法进入VeroE6和Calu-3细胞。抗病毒肽的交联机制有效阻断了SARS-COV-2的两种进入途径(即内吞途径和TMPRSS2介导的进入途径)。此外，抗病毒肽抑制内体酸化，从而阻断通过内吞作用的刺突-ACE2介导的融合。因此，未交联并进入内体的逃逸的病毒颗粒将在病毒复制周期的这一步骤停止。此外，抗病毒肽对刺突-ACE2介导的融合的抑制可以减少合胞体的形成，从而可能减轻体内病理。最后，抗病毒肽通过将SARS-CoV-2刺突与糖胺聚糖(GAG)交联来抑制SARS-CoV-2的释放，这显著限制了SARS-CoV-2的释放，作为终止病毒复制周期的最后策略。这种具有三重抗病毒机制的人类抗病毒肽可以在细胞表面形成保护屏障，阻止SARS-CoV-2的进入和释放。重要的是，吸入的抗病毒肽可在暴露前和暴露后对抗SARS-CoV-2变体，并减少受攻击的仓鼠肺中的合胞体形成。这一发现强调了开发这种人源肽用于治疗COVID-19的临床意义。因此，在一些形式中，该组合物包含一种或多种衍生自HBD2的抗病毒肽。在优选形式中，该组合物包括衍生自HBD2a的单一抗病毒肽，能够抑制一种或多种呼吸道病毒的病毒进入、融合和释放。

人β防御素2(HBD2)氨基酸序列(UniProtKB-O15263(DFB4A_HUMAN))如下：

MRRVLYLLFSF LFIFLMPLPG VFGGIGDPVT CLKSGAICHP VFCPRRYKQI GTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID NO:1)。

提供了抗病毒肽组合物以施用于受试者。公开了HBD2蛋白变体、包含此类变体的组合物、以及使用该变体和组合物的方法。在一些形式中，该组合物包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％至95％相同的HBD2变体。

多肽的典型变体在氨基酸序列上与另一个参考多肽不同。一般来说，差异是有限的，因此参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列可能因一个或多个修饰(例如取代、添加和/或缺失)而不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的。多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。

可以对本文所公开的多肽的结构进行修饰和改变，而仍获得与多肽具有相似特征的分子(例如，保守的氨基酸取代)。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其他氨基酸，而不会明显损失活性。由于多肽的相互作用能力和性质决定了该多肽的生物功能活性，因此可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，但仍能获得具有相似特性的多肽。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予多肽相互作用的生物功能中的重要性是本领域中普遍理解的。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸，并且仍然产生具有相似生物活性的多肽。根据疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被赋予了亲水性指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

据信氨基酸的相对亲水性决定了所得多肽的二级结构，进而决定了多肽与其他分子(如酶、底物、受体、抗体和抗原)的相互作用。本领域已知，一个氨基酸可以被另一个具有相似亲水性指数的氨基酸取代，并且仍可获得功能等同的多肽。在此类改变中，亲水指数在±2内的氨基酸取代是优选的，在±1内的氨基酸取代是特别优选的，在±0.5内的氨基酸取代是甚至更特别优选的。

也可以根据亲水性进行类似氨基酸的取代，特别是当由此产生的生物功能等同多肽或肽旨在用于免疫学实施方案时。已将以下亲水性值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，一种氨基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸取代，并且仍然可以获得生物学等同的、特别是免疫学等同的多肽。在这样的变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸取代是优选的，在±1以内的是特别优选的，在±0.5以内的是甚至更特别优选的。

氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷和大小。考虑到上述各种特征的示例性取代是本领域技术人员所熟知的，并且包括(原始残基：示例性取代)：(Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln、His)、(Asp:Glu、Cys、Ser)、(Gln:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala)、(His:Asn、Gln)、(Ile:Leu、Val)、(Leu:Ile、Val)、(Lys:Arg)、(Met:Leu、Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp、Phe)和(Val:Ile、Leu)。该多肽可以包括与感兴趣的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的变体。

“同一性”和“相似性”可以容易地通过已知方法计算，例如在ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,Ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,Ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,Eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.,M Stockton Press,New York,1991；以及Carilloand Lipman,SIAM J Applied Math,48:1073(1988)中所描述的那些。

确定同一性的优选方法旨在实现所测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法已编入公开的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可通过使用分析软件(即Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,MadisonWis.)来确定，该软件并入了Needelman和Wunsch(J.Mol.Biol.,48:443-453,1970)算法(例如NBLAST和XBLAST)。使用默认参数来确定本公开内容的多肽的同一性。

举例来说，多肽序列可以与参考序列相同，即100％相同，或者与参考序列相比可以包含最多达一定整数的氨基酸改变，使得％同一性小于100％。此类改变包括至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，其中改变可以发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或发生在这些末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的氨基酸之间或散布在参考序列内的一个或多个连续组中。给定％同一性的氨基酸改变的数量是通过将参考多肽中的氨基酸总数乘以各自百分比同一性(除以100)的数值百分比，然后从参考多肽中的氨基酸总数中减去该乘积来确定的。

A.抗病毒肽

在一些形式中，抗病毒肽衍生自HBD2或HBD2的片段。示例性的抗病毒肽如表1所示。在一些形式中，抗病毒肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的一种或多种变体。在一些形式中，抗病毒肽与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％或99％的同一性。在一些形式中，抗病毒肽为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

在一些形式中，抗病毒肽变体可以包括一个或多个取代突变。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。

表1.H23、H26、H30、2H30和4H30肽

肽	序列
		H23	CHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKC(SEQ ID NO:2)
H26	CHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKK(SEQ ID NO:3)
		H30	GAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID NO:4)
2H30	GAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP-2MPA
		4H30	GAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP-4MPA

1.抗体病毒肽的修饰

在一些形式中，抗病毒肽被修饰以改善其药代动力学和药效学特征。在一些形式中，活性抗病毒肽是单体。在一些形式中，抗病毒肽是二聚化的、三聚化的、四聚化的或多聚化的。二聚化、三聚化、四聚化或多聚化可在两个或多个抗病毒肽(相同或不同)之间通过二聚化、三聚化、四聚化或多聚化结构域发生。或者，抗病毒肽的二聚化、三聚化、四聚化或多聚化可以通过化学交联发生。形成的二聚体、三聚体、四聚体或多聚体可以是同源二聚体/同源多聚体或异源二聚体/异源多聚体。

术语“单体”是指单个抗病毒肽分子。术语“二聚体”、“三聚体”、“四聚体”或“多聚体”分别指形成一个多肽分子的两个、三个、四个或更多个单体。二聚体、三聚体、四聚体或多聚体可以是同源二聚体、同源三聚体、同源四聚体或同源多聚体，其中形成二聚体、三聚体、四聚体或多聚体的每个单体含有相同的氨基酸序列。所述二聚体、三聚体、四聚体或多聚体可以是异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体或异源多聚体，其中形成二聚体、三聚体、四聚体或多聚体的每个单体含有不同的氨基酸序列。

在优选形式中，抗病毒肽是通过使用2,2-双(羟甲基)丙酸(MPA)交联每个单体抗病毒肽形成的二聚体或四聚体。在一种形式中，其为MPA，其与两个具有SEQ ID NO:4的单体抗病毒肽偶联，通过C端的赖氨酸交联以形成具有两个抗病毒肽分支的分子。在一种形式中，其为具有4个反应位点的第二代MPA树枝状分子，该树枝状分子与具有SEQ ID NO：4的单体抗病毒肽偶联，并通过C端的赖氨酸交联以形成具有四个抗病毒肽分支的分子。

结构I：2,2-双(羟甲基)丙酸的化学式

B.额外的治疗剂、预防剂或诊断剂

一种或多种额外的治疗剂、诊断剂和/或预防剂可用于治疗或延缓进展、或预防进展肺部炎症和/或由COVID-19引起的肺炎导致的全身炎症。

除了抗病毒肽之外，该组合物还可以含有一种或多种额外的治疗剂、诊断剂和/或预防剂。在一些形式中，该组合物可以含有一种或多种额外的化合物来缓解炎症或呼吸急促等症状。代表性的治疗剂(包括前体药物)、预防剂或诊断剂可以是肽、蛋白质、碳水化合物、核苷酸或寡核苷酸、小分子、或它们的组合。活性剂可以是小分子活性剂或生物分子，例如酶或蛋白质、多肽或核酸。合适的小分子活性剂包括有机和有机金属化合物。在一些情况下，小分子活性剂的分子量小于约2000g/mol，更优选小于约1500g/mol，最优选小于约1200g/mol。小分子活性剂可以是亲水性、疏水性或两亲性化合物。在一些情况下，一种或多种额外的活性剂可以溶解或悬浮在药学上可接受的载剂中。

对于用于治疗肺部疾病的药物组合物，其制剂可以含有一种或多种治疗剂来治疗、预防或诊断肺部疾病或病症。治疗剂的非限制性例子包括支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗生素、抗氧化剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗过敏剂及其组合。

第二种治疗的剂量通常取决于所要治疗的肺部病症的严重程度。本领域技术人员可以容易地确定具体剂量。参见Ansel,Howard C.et al.Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems(6^th ed.)Williams and Wilkins,Malvern,PA(1995)。

在其他形式中，一种或多种药剂包括支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗生素、抗氧化剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗炎剂、免疫抑制剂和/或抗过敏剂，在使用公开的抗病毒肽制剂治疗之前、同时、之后或交替施用。

添加药物可以其中性形式存在，也可以药学上可接受的盐形式存在。在一些情况下，可能期望制备含有活性剂盐的制剂，因为该盐具有一种或多种有利的物理特性，例如增强的稳定性或期望的溶解度或溶解特性。

在一些形式中，额外的药剂是对应用部位进行成像或以其他方式评估的诊断剂。示例性诊断剂包括顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子和放射性核素、X射线成像剂和造影剂。这些还可以是用上述物质标记的配体或抗体，或者与本领域技术人员已知的方法可检测的标记配体或抗体结合。

在某些形式中，药物组合物含有一种或多种局部麻醉剂。代表性的局部麻醉剂包括丁卡因、利多卡因(lidocaine)、阿美索卡因、丙美卡因、利多卡因(lignocaine)、布比卡因。在一些形式中，还会将一种或多种额外的药剂(例如透明质酸酶)添加到制剂中，以加速和改善局部麻醉剂的分散。

1.气管扩张剂

在一些形式中，抗病毒肽及其制剂与一种或多种支气管扩张剂联合使用。支气管扩张剂是一种有助于打开气道、使呼吸更轻松的药物。

在紧急情况下或需要快速缓解时使用短效支气管扩张剂。一些示例性的短效支气管扩张剂包括抗胆碱能药物例如异丙托溴铵(例如， )、β2-激动剂例如沙丁胺醇(例如， )和左旋沙丁胺醇(例如，)。

长效支气管扩张剂用于长期治疗COPD。它们通常在很长的一段时间内每天服用一次或两次，并且作为用于吸入器或雾化器的制剂出现。一些示例性的长效支气管扩张剂包括抗胆碱能药物，例如阿地溴铵(例如，)、噻托溴铵(例如，)或芜地溴铵(例如，INCRUSE)，β2-激动剂，例如阿福特罗(例如，)、福莫特罗(例如，)、茚达特罗(例如，)、沙美特罗(例如，)和奥达特罗(例如，STRIVERDI)。

2.皮质类固醇

在一些形式中，抗病毒肽或其制剂与一种或多种皮质类固醇联合使用。皮质类固醇有助于减少体内炎症，使空气更容易进入肺部。有几种皮质类固醇。其中一些与支气管扩张剂一起开处方，因为这两种药物可以协同作用，使呼吸更有效。氟替卡松(例如)、布地奈德(例如)和泼尼松龙是医生常处方用于COPD的药物。

3.甲基黄嘌呤

甲基黄嘌呤是杂环化合物，是黄嘌呤的甲基化衍生物，包含偶联的嘧啶二酮和咪唑环(Talik et al.,Separ.Purif.Rev.2012；41:1–61)。几十年来，甲基黄嘌呤被广泛用于治疗性目的，并在不同的医疗领域具有被证实的治疗性益处。例如，天然存在的甲基黄嘌呤如咖啡因、茶碱和可可碱已被用于治疗呼吸系统疾病(Lam and Newhouse,Chest.1990；98:44–52)、心血管疾病、癌症(Hayashi et al.,Anticancer Res.2005；25:2399–2405；Kimuraet al.,J.Orthop.Sci.2009；14:556–565)，并且商业生产的黄嘌呤衍生药物如己酮可可碱已被广泛证实具有免疫调节特性。

在一些形式中，抗病毒肽及其制剂与一种或多种甲基黄嘌呤(如己酮可可碱和咖啡因)联合使用。甲基黄嘌呤(如己酮可可碱和咖啡因)可作为治疗COVID-19患者的辅助疗法的潜在有益作用已被提出(Monji F et al.,Eur JPharmacol.2020Nov 15；887:173561)。在这些情况下，可以使用茶碱(例如

和)与支气管扩张剂一起服用，作为抗炎和/或抗氧化剂发挥作用，并放松呼吸道肌肉。茶碱以药丸或液体的形式存在，可以每天服用，也可以与其他药物组合服用。

4.磷酸二酯酶-4抑制剂

罗氟司特是一种磷酸二酯酶4(PDE-4)抑制剂，其作为全面支持COVID-19发病机制的益处已被报道(Sugin Lal Jabaris S et al.,Pulm Pharmacol Ther.2021Feb；66:101978)。罗氟司特是一种著名的抗炎和免疫调节药物，可以保护呼吸道模型免受化学物质和烟雾引起的肺损伤。大量数据证明PDE-4抑制剂在呼吸道病毒模型中具有保护作用，并且可能有助于对抗COVID-19的发病机制。

在一些形式中，抗病毒肽及其制剂与一种或多种磷酸二酯酶-4抑制剂联合使用。在一些形式中，这些组合物有助于缓解炎症和/或改善肺部的空气流动。已鉴定到多种PDE-4抑制剂，例如西洛司特、吡拉米司特、oglemilast、替托司特、托非司特、ronomilast、revamilast、UK-500,001、AWD 12–281、CDP840、CI-1018、GSK256066、YM976、GS-5759，用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。CHF6001是一种吸入式PDE-4抑制剂，目前正在进行COPD的II期临床试验。此外，两种口服施用的PDE-4抑制剂如罗氟司特和阿普司特已连续获批用于治疗COPD、牛皮癣和银屑病关节炎等炎症性疾病。

5.抗菌剂

在一些形式中，抗病毒肽或其制剂与一种或多种抗菌剂联合使用。抗菌剂是一种能够杀伤细菌、真菌、病毒或寄生虫等微生物或者抑制其生长的物质。抗菌剂包括抗病毒剂、抗菌剂、抗寄生虫剂和抗真菌剂。代表性的抗病毒剂包括更昔洛韦和阿昔洛韦。代表性抗生素剂包括氨基糖苷类药物，例如链霉素、阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素，安沙霉素类药物，例如格尔德霉素和除莠霉素，碳头孢烯类药物，碳青霉烯类药物，头孢菌素类药物，糖肽类药物，例如万古霉素、替考拉宁和特拉万星，林可酰胺类药物，脂肽类药物，例如达托霉素，大环内酯类药物，例如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和红霉素，单环内酯类药物，硝基呋喃类药物，青霉素类药物，多肽类药物，例如杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B，喹诺酮类药物，磺胺类药物和四环素类药物。

其他示例性抗菌剂包括碘、银化合物、莫西沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑啉、替加环素、庆大霉素、头孢他啶、氧氟沙星、加替沙星、两性霉素、伏立康唑、纳他霉素。

6.局部麻醉药

在一些形式中，抗病毒肽及其制剂与一种或多种局部麻醉剂联合使用。局部麻醉剂是一种引起可逆性局部麻醉并具有丧失痛觉效果的物质。局部麻醉剂的非限制性实例包括安布卡因、阿莫拉酮、阿米洛卡因、丁氧普鲁卡因、苯佐卡因、贝托卡因、苯柳胺酯、布比卡因、布他卡因、氨苯丁酯、布坦卡因、丁胺卡因、丁托西卡因、卡替卡因、氯普鲁卡因、可卡乙碱、可卡因、环甲卡因、地布卡因、dimethysoquin、二甲卡因、地哌冬、dycyclonine、脱水芽子碱、芽子碱、氯乙烷、依替卡因、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、formocaine、海克卡因、羟基丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮氨卡因、左旋屈尔、利多卡因、卡波卡因、美普卡因、美布卡因、氯甲烷、麦替卡因、纳帕因、奥他卡因、奥索卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、非那卡因、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、丙吗卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、普鲁派奴卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、psuedococaine、吡咯卡因、罗哌卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏及其任意组合。在该形式的其他方面，抗病毒肽或其制剂包括麻醉剂，其量例如为约10mg、约50mg、约100mg、约200mg或超过200mg。组合物中局部麻醉剂的浓度可以是治疗上有效的，这意味着该浓度足以提供治疗性益处而不会对患者造成伤害。

7.抗炎剂

在一些形式中，抗病毒肽及其制剂与一种或多种抗炎剂联合使用。抗炎药减轻炎症并且包括类固醇药物和非类固醇药物。合适的类固醇活性剂包括糖皮质激素、孕激素、盐皮质激素和皮质类固醇。其他示例性抗炎剂包括曲安奈德、氟轻松、泼尼松龙、地塞米松、loteprendol、氟米龙、布洛芬、阿司匹林和萘普生。示例性的免疫调节药物包括环孢菌素、他克莫司和雷帕霉素。示例性的非甾体抗炎药(NSAID)包括甲芬那酸、阿司匹林、二氟尼柳、水杨酰水杨酸、布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、deacketoprofen、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康、伊索昔康、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、elecoxib、罗非昔布、伐地昔布、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布、非罗昔布、磺苯胺类、尼美舒利、尼氟酸和利克飞龙。

在一些形式中，抗炎剂是抗炎细胞因子。示例性细胞因子是IL-10、TGF-β和IL-35。

C.制剂

还提供了抗病毒肽的制剂。抗病毒肽可以配制用于施用至受试者，例如作为药物制剂。示例性制剂包括溶液、干粉、片剂、胶束、胶体、纳米液滴、纳米结构水凝胶、纳米晶体和纳米悬浮液。通常，制剂包含一定量的抗病毒肽，以适合期望施用途径的形式。该组合物可以以冻干形式储存在一次性小瓶中，以便在使用前立即再水化。再水化和施用的其他方式是本领域技术人员已知的。

药物制剂含有抗病毒肽与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。代表性赋形剂包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张力剂、稳定剂及其组合。合适的药学上可接受的赋形剂优选选自通常认为是安全的(GRAS)的材料，并且可以施用于个体而不会引起不期望的生物学副作用或不必要的相互作用。

一般来说，药学上可接受的盐可以通过将活性剂的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水或有机溶剂中，或两者的混合物中发生反应来制备；一般而言，优选非水介质，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。药学上可接受的盐包括衍生自无机酸、有机酸、碱金属盐、碱土金属盐的活性剂的盐以及药物与合适的有机配体反应形成的盐(例如季铵盐)。合适的盐的列表可以在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,20th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,p.704中找到。

抗病毒肽的示例性制剂包括液体和干粉。在一些形式中，抗病毒肽的量为约1％(含)至约100％(含)，约1％至约80％，约1％至约50％，优选约1％至约40％(按重量计)，更优选约1％至约20％(按重量计)，最优选约1％至约10％(按重量计)。上述范围包括从1％到100％的所有值。

1.干粉制剂

在一些形式中，抗病毒肽被配制成干粉形式的细分固体制剂。干粉各组分可分别储存在单独的容器中，或按照特定比例混合后储存。在一些形式中，合适的水性和有机溶剂包含在额外的容器中。在其他形式中，干粉组分、一种或多种溶剂、以及混合和准备组装纳米结构的操作说明包含在试剂盒中。替代性地，经由真空干燥或冷冻干燥将稳定化的、组装的颗粒、纳米颗粒或其块状凝胶进行干燥，并在使用时添加合适的药用液体载剂以重新水化并悬浮组装的纳米结构或凝胶组合物。

干粉制剂通常通过将一种或多种胶凝剂、稳定剂或活性剂与一种或多种药学上可接受的载剂混合来制备。药物载剂可以包括一种或多种分散剂。药物载剂还可以包括一种或多种pH调节剂或缓冲剂。合适的缓冲剂包括由有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠或抗坏血酸钠。药物载剂还可以包括一种或多种盐，例如氯化钠或氯化钾。干粉制剂可以悬浮在液体制剂中以形成纳米颗粒溶液，并且以本领域已知的递送液体制剂的方法施用于全身或局部。

2.液体制剂

在一些形式中，抗病毒肽被配制成液体。合适的液体载剂包括但不限于蒸馏水、去离子水、纯水或超纯水、盐水和其他生理上可接受的含有盐和/或缓冲液的水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和等渗氯化钠，或任何其他可接受用于施用至动物或人的水溶液。

液体制剂可以包括一种或多种悬浮剂，例如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶或卵磷脂。液体制剂还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

制剂可以使用一种或多种药学上可接受的赋形剂来制备，包括稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、膨胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。液体制剂还可以含有少量的聚合物、表面活性剂或本领域技术人员熟知的其他赋形剂。在本文中，“少量”是指不存在可能对抗病毒肽组合物向器官或组织的递送(例如通过循环)产生不利影响的赋形剂。

在一些形式中，抗病毒肽被配制在合适的载剂中。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、油(例如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等))及其组合。

在一些形式中，抗病毒肽被配制成含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可以含有抗氧化剂，以防止活性剂的降解。防腐剂可用于防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、过氧化苄、苄索氯铵、苯甲醇、十六烷基氯化吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇和硫柳汞。

在一些形式中，抗病毒肽被配制成缓冲至pH，例如pH 2、3、4、5、6、7、8、9或pH 10。在示例性形式中，制剂通常缓冲至pH 3-8以用于肠胃外的施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。

在一些形式中，抗病毒肽被配制成包含一种或多种水溶性聚合物。水溶性聚合物通常用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

一般来说，分散液是通过将各种无菌胶凝剂、稳定剂和/或活性成分加入到含有基本分散介质和以上列出的其他所需成分的无菌媒介物中来制备的。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术可以从先前无菌过滤的溶液中得到活性成分以及任何其他期望成分的粉末。

制剂可以如标准参考文献所述来制备，例如“Pharmaceutical dosage formtablets”,eds.Liberman et.al.(New York,Marcel Dekker,Inc.,1989),“Remington–Thescience and practice of pharmacy”,20th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,以及“Pharmaceutical dosage forms and drug deliverysystems”,6th Edition,Ansel et al.,(Media,PA:Williams and Wilkins,1995)。这些参考文献提供了有关制备片剂和胶囊以及缓释剂型片剂、胶囊和颗粒的赋形剂、材料、设备和工艺的信息。

3.剂量单位

抗病毒肽组合物优选以剂量单位形式配制，以方便施用和剂量均匀。短语“剂量单位形式”是指适合于所要治疗的患者的缀合物的物理上离散的单位。然而，应当理解，组合物的总共单次施用将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。治疗有效剂量可以通过细胞培养测定或动物模型(通常是小鼠、大鼠、兔、狗或猪)进行初步评估。还使用动物模型来实现理想的浓度范围和施用途径。这些信息将有助于确定人类的有效剂量和施用途径。

IV.使用方法

描述了预防或治疗受试者冠状病毒感染的一种或多种症状的方法。该方法施用有效的抗病毒肽或其药物制剂来治疗或预防疾病，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。抗病毒肽可以通过任何适当的药物载剂施用，例如液体(例如水和盐水)或粉末，以施用于呼吸系统。制剂可以通过任何当前用于肺部输送的方法和/或装置来输送。例如，可以使用雾化器和吸入器。

气雾剂剂量、制剂和递送系统可根据特定的治疗应用进行选择，例如Gonda,I.在Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,6:273-313(1990)里的“Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to therespiratory tract”以及Moren在Aerosols in Medicine.Principles,Diagnosis andTherapy,Moren,et al.,Eds.,Esevier,Amsterdam,1985里的“Aerosol dosage forms andformulations”中所述，其公开内容以引用方式并入本文中。

A.待治疗的受试者

需要治疗的受试者是患有感染或者有患感染风险的受试者，例如患有病毒感染或者有感染病毒风险的受试者。该方法特别适合那些有暴露于一种或多种呼吸道病原体(如SARS-CoV-2)风险的人。因此，在一些形式中，受试者尚未出现任何COVID症状，但仍有出现此类症状的风险。

阳性的SARS-CoV-2病毒检测(即逆转录聚合酶链反应[RT-PCR]检测或抗原检测)或血清学(抗体)检测有助于评估当前或以前的感染。在一些形式中，这些方法延缓经由一项或多项SARS-CoV-2病毒检测确诊为阳性的患者的症状进展，无论患者是否有任何症状。

在一些形式中，该方法提供有效量的抗病毒肽以治疗或预防受试者的冠状病毒感染的一种或多种症状，例如减轻或预防受试者的严重获得性呼吸道综合征(SARS)的一种或多种症状或生理标志物。COVID-19的示例性症状包括咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促。因此，在一些形式中，所述方法可预防或减轻咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促中的一种或多种。

在一些形式中，这些方法减少或预防受试者感染致病的病毒性疾病COVID-19。在其他形式中，该方法防止或减少入侵的病毒病原体进入一个或多个靶细胞和/或在一个或多个靶细胞中增殖。

在一些形式中，冠状病毒是SARS-CoV-2的变体，例如SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变体)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变体)、SARS-CoV-2P.1(Gamma变体)、SARS-CoV-2B.1.617、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变体)、SARS-CoV-2B.1.621(Mu变体)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变体)、SARS-CoV-2B.1.617.3和SARS-CoV-2B.1.1.529(Omicron变体)。

B.施用方法

该组合物通常以有效量施用于受试者。本文使用的术语“有效量”是指足以抑制或预防一种或多种感染或疾病症状或以其他方式提供期望药理学和/或生理学效果的剂量。精确剂量会根据多种因素而有所不同，例如个体相关变量(例如年龄、免疫系统健康状况等)、病毒的具体变体以及受影响的治疗。

该药物组合物可通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下注射)、透皮(被动或使用离子电渗疗法或电穿孔)或透粘膜(鼻腔、阴道、直肠或舌下)施用途径或使用生物可蚀性插入物进行施用，并且可以配制成适合每种施用途径的剂型。

在优选的形式中，组合物是局部施用的，例如通过鼻内施用。通常，局部施用会导致组合物的局部浓度增加，其大于全身施用所能达到的浓度。在一些形式中，通过使用导管或注射器将组合物局部递送至适当的细胞。将此类组合物局部递送至细胞的其他方式包括使用输液泵(例如来自Alza Corporation,Palo Alto,Calif.)或将组合物掺入聚合物植入物中(参见例如P.Johnson and J.G.Lloyd-Jones,eds.,Drug Delivery Systems(Chichester,England:Ellis Horwood Ltd.,1987)，其可以影响颗粒向植入物直接区域的持续释放。

在一种形式中，该方法包括经由雾化器向受试者施用有效量的含有抗病毒肽的组合物。

1.施用途径

抗病毒肽特别适合施用于鼻腔或肺部系统或施用于粘膜表面。该组合物可以作为干粉、水性悬浮液(在水、盐水、缓冲盐水等中)、水凝胶或脂质体、胶囊、片剂、锭剂或其他标准药物赋形剂来施用。

在一些形式中，抗病毒肽或其制剂经由雾化器施用。雾化溶液是分散在空气中形成气溶胶的溶液，雾化器会产生非常细小的液滴，适合吸入肺部。雾化器通常使用压缩空气、超声波或振动网来产生液滴雾，并且还可以具有挡板以通过撞击从雾中去除较大的液滴。有多种雾化器可用于此目的，例如超声波雾化器、喷射雾化器和呼吸驱动雾化器。

吸入的药物沉积到肺部和气道受到多种因素的影响，包括雾化器装置的特性、气溶胶的制剂特性、患者的呼吸模式、气道几何形状以及区域气道通气的潜在差异。雾化器系统之间的差异可能会对药物输送到肺部的效率产生数倍的影响。因此，选择雾化器是为了有效地将期望量的制剂递送到肺部的目标区域，同时使得药物相关的副作用最小化。

选择合适的雾化器的一个重要考虑因素是它是否能够产生用于肺部治疗的合适气溶胶液滴尺寸。一般来说，为了更有效地递送制剂到达下呼吸道，优选小液滴尺寸。小液滴(<5μm)中的药量，通常描述为细液滴部分，是气雾化药物中最有效地递送到远端气道的部分。在一些形式中，小于5.0μm的液滴尺寸是合适的，例如约1.5μm–5.0μm，优选约2.5μm–3.5μm或更小的液滴尺寸。

在一些形式中，抗病毒肽或其制剂是经由吸入器施用的。吸入器是一种小型手持设备，可将一口药递送到呼吸道。有三种基本类型：定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和软雾吸入器(SMI)。

C.治疗方案

治疗方案可以包括抗病毒肽及其制剂的一次或多次施用以实现期望的生理变化，包括向动物(例如哺乳动物，特别是人类)施用有效量的组合物以治疗疾病或其症状，或产生生理变化。在优选形式中，期望的生理变化是减少受试者中合胞体形成的量和肺损伤。

1.剂量和有效量

用于治疗与冠状病毒感染相关的疾病和病症的治疗有效量的抗病毒肽通常足以减少或缓解与冠状病毒感染相关的疾病和病症的一种或多种症状。与冠状病毒感染相关的疾病和病症的症状可以是咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促。因此，抗病毒肽的量可以有效例如治疗或预防冠状病毒感染的一种或多种症状。优选地，将抗病毒肽局部递送至肺的粘膜表面。优选地，抗病毒肽不靶向或以其他方式调节其他代谢过程或代谢产物。在一些形式中，将有效量的抗病毒肽施用于有暴露于SAR-Cov-2病毒风险的受试者中的冠状病毒感染，或与冠状病毒感染相关的一种或多种疾病或病症。

抗病毒肽的实际有效量可以根据多种因素而变化，包括所施用的特定抗病毒肽、所配制的特定组合物、施用方式和被治疗的受试者的年龄、体重、状况，以及施用途径和疾病或病症。

在一些形式中，有效量的抗病毒肽几乎不杀伤或不杀伤受试者体内的细胞，并且优选地几乎不抑制或不抑制细胞的代谢。特别优选的是，组合物不会抑制免疫细胞的活性。

在一些形式中，每天一次、两次或三次，或每隔一天、两天、三天、四天、五天或六天向人施用抗病毒肽的剂量。在一些形式中，抗病毒肽的剂量约每周一次或两次、每两周、每三周或每四周施用。在一些形式中，剂量约每月一次或两次、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月或每六个月施用。

在一些形式中，方案包括一个周期或多个周期抗病毒肽治疗轮次，随后是药物假期(例如，不使用抗病毒肽)。治疗轮次可以是例如上述任何一种施用方式。同样，药物假期可以是1、2、3、4、5、6或7天；或者1、2、3、4周；或者1、2、3、4、5或6个月。

在特定形式中，向受试者施用约0.1mg/kg体重(含)至100mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约0.1mg/kg体重(含)至10mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约0.2mg/kg体重(含)至10mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约0.3mg/kg体重(含)至10mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约0.4mg/kg体重(含)至10mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约0.5mg/kg体重(含)至10mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约1.0mg/kg体重(含)至10mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。在一些形式中，向受试者施用约1.0mg/kg体重(含)至5mg/kg体重(含)之间的抗病毒肽剂量。特定的给药方案包括例如一个或多个周期，其中在连续两天、三天、四天、五天、六天或七天、两周、三周、四周、五周、六周或七周或两月、三月、四月、五月、六月或七月中的每一天向受试者施用抗病毒肽，然后是一天、两天、三天、四天、五天、六天或七天、一周、两周、三周、四周、五周、六周或七周或一月、两月、三月、四月、五月、六月或七月的药物假期。

在最优选的形式中，使用抗病毒肽的方法导致合胞体形成和肺损伤的直接或间接减少，提高患有该疾病的人的生活质量，减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量，延缓疾病的进展，和/或延长个体的生存期。

2.对照

可将抗病毒肽组合物的效果与对照进行比较。合适的对照是本领域中已知的，并且包括例如未经治疗的受试者或接受安慰剂治疗的受试者。典型的对照是对受试者在施用靶向药物之前和之后的状况或症状的比较。状况或症状可以是生化、分子、生理或病理读数。例如，可以将组合物对特定症状、药理学或生理指标的影响与未接受治疗的受试者或受试者在治疗之前的状况进行比较。在一些形式中，在治疗之前测量受试者的症状、药理或生理指标，并在开始治疗之后再次测量一次或多次。在一些形式中，对照是基于测量不具有要治疗的疾病或病况的一个或多个受试者(例如，健康受试者)的症状、药理学或生理指标而确定的参考水平或平均值。在一些实施方案中，将治疗的效果与本领域已知的常规治疗进行比较。

D.联合疗法和程序

抗病毒肽组合物可以单独施用或与一种或多种常规疗法联合施用。在一些形式中，常规疗法包括施用一种或多种组合物与一种或多种额外的活性剂的组合。联合疗法可包括将活性剂以相同的混合物或单独的混合物形式一起施用。因此，在一些形式中，药物组合物包含两种、三种或更多种活性剂。此类制剂通常包括有效量的靶向治疗部位的药剂。额外活性剂可以具有相同或不同的作用机制。在一些形式中，这种组合会对肺部病况的治疗产生额外效应。在一些形式中，这些组合对于疾病或病症的治疗产生超过加成效应。

额外的疗法或程序可以与树枝状聚合物组合物的施用同时或顺序进行。在一些形式中，额外疗法是在药物周期之间或作为剂量方案一部分的药物假期期间进行的。例如，在一些形式中，额外治疗或程序是损伤控制手术、液体复苏、输血、支气管镜检查和/或引流。

在一些形式中，抗病毒肽制剂与氧气疗法联合使用。在进一步的形式中，额外疗法或程序是俯卧位、复张手法、NO吸入、体外膜氧合(ECMO)、插管和/或PGI₂吸入。俯卧位可通过多种机制增强潜在可复张肺的肺复张，释放横膈膜，减少心脏和肺的重量和形状对肺组织的影响，减少腹部对肺的压迫，释放下叶，从而改善气体交换，降低严重ARDS患者的死亡率。ECMO提供体外气体交换，对肺复张没有影响。它可以让肺部得到休息，并且对无法复张的肺部很有效。已经证明可以提高高性能ECMO中心某些患者群体的生存率。额外的治疗剂还可以包括一种或多种抗生素、表面活性剂、皮质类固醇和糖皮质激素。

在一些形式中，所述组合物和方法在一种或多种另外的疗法或程序的治疗之前或与之结合、之后或交替使用。

V.试剂盒

还公开了试剂盒。试剂盒可以包括单剂量或多剂量的组合物，所述组合物包括一种或多种抗病毒肽或其药物制剂，以及用于施用所述组合物的说明书。具体而言，说明书指导向有暴露于一种或多种呼吸道病原体(例如严重急性呼吸综合征(SARS)病毒)风险的个体施用有效量的抗病毒肽组合物。组合物可以按照上述方法根据特定的治疗方法进行配制，并且可以以任何方便的方式进行包装。

参考下列非限制性实施例将进一步理解本发明。

实施例

实施例1：鉴定用于抑制SARS-CoV-2变体、H1N1病毒、HRV-1B和主要组HRV-B14病毒的衍生自人β防御素2(HBD2)的人多肽4H30

材料与方法

细胞和病毒培养

来自ATCC的Madin Darby犬肾(MDCK,CCL-34)、293T(CRL-3216)、A549(CCL-185)、VeroE6(CRL-1586)、VeroE6-TMPRSS2(VeroE6-T)、Calu-3(HTB-55)细胞(H.Zhao,et al.,Nat Commun,12(2021)1517)在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU ml^-1青霉素和100μg ml^-1链霉素的杜氏最小必须培养基(DMEM)或DMEM-F12K中培养。本研究中使用的病毒株包括SARS-CoV-2变体(H.Zhao,et al.,Nat Commun,11(2020)4252；和L.L.Chen,et al.,ClinInfect Dis,(2021))。SARS-CoV-2变体在VeroE6或VeroE6-T细胞中培养，并通过噬斑测定测定病毒滴度。

肽的合成

表1中显示的H23、H26、H30、2H30、4H30由ChinaPeptide(上海，中国)合成。所有肽均溶于水。肽在水中的溶解度大于5mg ml^-1。所有肽的纯度均>80％。每个肽的纯度和质量均通过HPLC和质谱法验证。

噬斑减少测定使用噬斑减少测定测量肽的抗病毒活性(H.Zhao,et al.,NatCommun,9(2018)2358)。简而言之，肽溶解在PBS或30mM磷酸盐缓冲液(PBS/5)中，其中含有24.6mM Na₂HPO₄和5.6mM KH₂PO₄，pH值为7.4。肽或牛血清白蛋白(BSA，0.2–25.0μg ml^-1)在室温下与SARS-CoV-2预混合。孵育45-60分钟后，肽病毒混合物相应地转移到Vero-E6细胞中。感染后1小时，除去感染培养基，向细胞中加入1％低熔点琼脂。感染后2-3天用4％福尔马林固定细胞。加入0.1％结晶蓝进行染色，并计算噬斑的数量。

细胞毒性测定

肽的细胞毒性通过使用四唑盐比色MTT测定检测50％细胞毒性浓度(CC₅₀)来确定(H.Zhao,et al.,Sci Rep,6(2016)22008)。简而言之，细胞以4×10⁴个细胞/孔的初始密度接种于96孔细胞培养板中，并在补充有10％FBS的DMEM中孵育过夜。去除细胞培养基，然后将补充有不同浓度的肽和1％ FBS的DMEM加入到相应的孔中。37℃孵育24h后，向每个孔中加入MTT溶液(5mg ml^-1,每孔10μl)，37℃孵育4小时。然后，向每个孔中加入100μl含10％SDS的0.01M HCl。进一步在室温下振荡孵育过夜后，使用VictorTM X3Multilabel Reader(PerkinElmer,USA)在OD570处读取板。不含肽的细胞培养孔作为实验对照，培养基仅作为空白对照。

透射电子显微镜测定

为了确定4H30对病毒颗粒的影响，用100μg ml^-1的4H30或H30预处理SARS-CoV-2 1小时。福尔马林固定病毒过夜。对于用4H30或H30处理的刺突，将100μg ml^-1刺突与50μg ml^-1的4H30或H30混合。将病毒或蛋白质样品施加到连续碳网格上。将网格转移到4％醋酸铀酰中并孵育1分钟。去除溶液后，将网格在室温下风干。对于每个肽/DNA纳米颗粒，进行了三次独立实验，通过FEI Tecnal G2-20 TEM或Philips CM100-TEM拍摄TEM图像。

ELISA测定

对于ELISA测定(H.Zhao,et al.,Nat Commun,9(2018)2358)，将溶解在H₂O中的肽(每孔1.0μg)或溶解在PBS中的GAG(CS或HS)包被到ELISA板上，并于4℃孵育过夜，于4℃封闭过夜。为了确定刺突和ACE2结合，将PBST中的60ng S蛋白或ACE2与肽在37℃下孵育30分钟。通过在37℃下与兔抗刺突(Sino,Cat^#40590-T62,1:8,000)或兔抗ACE2(Takara,Cat^#A4612,1:6000)孵育30分钟，然后在37℃下与山羊抗兔HPR(Life Technologies,Cat^#656120,1:4000)孵育30分钟来确定S蛋白或ACE2蛋白与肽的结合能力。加入100μl TMB单一溶液(Life Technologies,Cat^#002023)于37℃下孵育15分钟来进行显色反应，并用50μl1M H₂SO₄终止反应。在ELISA读板仪(Victor 1420Multilabel Counter；PerkinElmer)上获取450nm处的读数。

病毒RNA提取和RT-qPCR

按照制造商的说明，通过病毒RNA小提试剂盒(QIAGEN,Cat^#52906,USA)提取病毒RNA。实时RT-qPCR按照我们之前描述的方式进行(H.Zhao,et al.,Nat Commun,9(2018)2358)。使用PCR系统9700(Applied Biosystems,USA)用PrimeScript II1^st链cDNA合成试剂盒(Takara,Cat^#6210A)将提取的RNA逆转录为cDNA。然后使用特异性引物(表2)扩增cDNA，采用480SYBR Green I Master(Roach,USA)检测SARS-CoV-2。为了定量，制备了标准质粒的10倍连续稀释液，相当于每个反应10¹至10⁶份拷贝，用于生成校准曲线。实时qPCR实验在系统(Roche,USA)进行。

表2.SARS-CoV-2的正向和反向引物序列

内体酸化测定

内体酸化用pH敏感染料(pHrodo green dextran,Invitrogen,Cat^#P35365)检测，根据制造商的说明进行，如前所述，但略作修改(H.Zhao,et al.,Nat Commun,9(2018)2358)。首先，在4℃下用DMEM、4H30(25.0μg ml^-1)或巴佛洛霉素A1(50.0nM)处理VeroE6细胞15分钟。其次，将100μg ml^-1pH敏感染料和DAPI一起加入至VeroE6细胞，然后在4℃下孵育15分钟。在拍摄图像之前，将细胞在37℃下进一步孵育15分钟，然后用PBS清洗细胞两次。最后，将PBS添加到细胞中并立即用共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 800,Germany)拍摄图像进行观察。

核蛋白(NP)免疫荧光测定

根据之前的实验(H.Zhao,et al.,Nat Commun,9(2018)2358)，将VeroE6细胞接种于细胞培养载玻片上，用DMEM或4H30(50.0μg ml^-1)预处理的0.01MOI的SARS-CoV2感染细胞。感染18小时后，细胞用4％福尔马林固定1小时，然后用0.2％ TritonX-100的PBS透化处理5分钟。用PBS清洗细胞，然后用5％BSA在室温下封闭1小时。将细胞与兔IgG抗NP(1:4000)(M.L.Yeung,et al.,Cell,184(2021)2212-2228.e2212)在室温下孵育1小时。然后用PBS洗涤，用于接下来与山羊抗兔IgG Alexa-488(Life Technologies,Cat^#A32731,1:600)在室温下孵育1小时。最后，细胞用PBS洗涤并用DAPI染色。通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM800,Germany)拍摄图像。

病毒进入荧光测定

为了确定4H30对病毒的影响，根据制造商的介绍，用绿色Dio染料(Invitrogen,Cat^#3898)预先标记SARS-CoV-2。用DMEM、4H30或H30(25μg ml^-1)处理Dio标记的病毒45分钟。用预处理的病毒感染VeroE6或Calu-3细胞1小时。病毒和细胞由4％福尔马林固定。细胞膜通过膜染料Alexa594(红色，Invitrogen，W11262)染色，细胞核通过DAPI(蓝色)染色。用共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 800,Germany)确定病毒是否进入细胞膜。

病毒释放测定

使用SARS-CoV-2(0.01MOI)感染VeroE6细胞。感染6小时或14小时后，去除病毒培养上清液。向感染的细胞中添加含有或不含有4H30(50.0μg ml^-1)的DEME。感染后10小时或18小时，收集上清液，通过RT-qPCR测量病毒滴度或固定进行抗刺突免疫荧光测定。室温下固定45分钟后，用5％BSA封闭细胞1小时。兔抗刺突(Sino,Cat#40590-T62,1:6,000)和山羊抗兔IgGAlexa-488(Life Technologies,Cat^#A32731,1:600)在室温下孵育45分钟。图像由共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 800,Germany)拍摄。

刺突-ACE2介导的细胞融合测定

根据之前的研究(S.Xia,et al.,Signal Transduct Target Ther,5(2020)92)，将SARS-CoV-2的pSpike、pACE2-human或pGFP转染到293T细胞中进行蛋白表达。24小时后，为了触发刺突-ACE2介导的细胞融合，将293T-刺突-GFP细胞与293T-ACE2或Calu-3细胞在补充药物的情况下共培养。将293T-GFP细胞与293T-ACE2或Calu-3细胞共培养作为阴性对照。共培养6-8小时后，在每个孔中随机选择五个视野，用荧光显微镜拍摄细胞融合照片。

蛋白质印迹

刺突、ACE2(7.5μg)或PBS与4H30(10μg)预混合，然后通过30kDa离心过滤器以洗脱未结合的4H30。收集离心过滤器中剩余的蛋白质，并将样本上样至15％PAGE进行蛋白质印迹。用抗HBD2(Thermo Scientific,Cat#PA5-103126,1:5000)和山羊抗兔HRP作为二抗(Thermo Scientific,656120,1:4000稀释)检测4H30。

动物抗病毒测定

将雌性仓鼠(6-8周龄)(J.F.Chan,et al.,Clin Infect Dis,(2020))饲养在生物安全2/3级实验室中(饲养温度在22℃-25℃之间，黑暗/光照循环)，并可自由获取标准颗粒饲料和水。所有实验方案均遵循已批准的生物安全2/3级动物设施的标准操作程序。动物伦理规范已获香港大学活体动物教学和研究使用委员会批准(B.J.Zheng,et al.,Proc NatlAcad Sci USA,105(2008)8091-8096)。为了评估药物的体内毒性，在病毒攻击之前或之后，将4H30(0.5mg kg^-1)经鼻接种到仓鼠和小鼠的肺中。第二天再给予小鼠两剂。在第4天收获肺组织进行H&E染色。为了评估暴露前的抗病毒活性，在接种SARS-CoV-2前24小时、8小时、4小时、0.05小时(前)将4H30、H23或PBS经鼻腔接种到仓鼠肺中。感染后第2天收集肺组织以确定病毒滴度和组织病理学。为了评估暴露后的抗病毒活性，将SARS-CoV-2(B.1.1.63或B.1.617.2)经鼻腔接种到仓鼠肺中。感染后8小时，给动物注射PBS。第二天再给予小鼠/仓鼠两剂。感染后第2天通过噬斑测定测量小鼠/仓鼠肺中的病毒载量。

结果

人β防御素2(HBD2)已被证实具有抗菌活性(M.K.Holly,et al.,Annu Rev Virol,4(2017)369-391)。然而，与低盐条件下的活性相比，防御素肽在生理盐条件下普遍显示出降低的抗菌活性(H.Zhao,et al.,Nat Commun,12(2021)1517；R.Bals,et al.,J ClinInvest,102(1998)874-880)。尽管防御素肽在体外具有广谱抗菌活性，但在生理盐条件下降低的抗菌活性对其作为体内抗菌药物的开发构成了障碍。为了找到在生理盐条件下具有有效抗病毒活性的人源抗病毒肽，首先鉴定出一种衍生自HBD2的30个氨基酸肽(H30)，它在PBS中抑制SARS-CoV-2，但在低盐条件下更有效(图1A和1B)。表1所示的H23、H26、H30、2H30和4H30均为合成的。通过噬斑减少测定确定了这些肽在低盐条件(30mM磷酸盐缓冲液，PBS/5)和高盐条件(150mM PBS)下对SARS-CoV-2的抗病毒活性(图1A和1B)。PBS中H30的弱抗菌活性与生理盐条件下HBD2和其他防御素的抗菌活性降低一致(R.Bals,et al.,J ClinInvest,102(1998)874-880；E.Guaní-Guerra,et al.,Clin Immunol,135(2010)1-11；C.Xu,et al.,Viruses,13(2021))。

接下来，合成了两分支的H30(2H30)和四分支的H30(4H30)。抗病毒测定表明，4H30显著抑制了SARS-CoV-2感染(IC₅₀＝0.59μg ml^-1)，其效力比PBS中的H30(IC₅₀>25μg ml^-1)和2H30(图1C)更强。细胞毒性测定表明，4H30在VeroE6和Calu-3细胞中的TC₅₀高于400μg ml^-1(图1D)。为了证实4H30的抗病毒活性，抗NP染色结果证实，与未经处理的病毒相比，病毒复制在极少数细胞中受到显著抑制和限制(数据未显示)。此外，研究表明，感染后6小时(hpi)将4H30添加到细胞中时，4H30可显著抑制VeroE6和Calu-3细胞中的SARS-CoV-2复制(图1E)。这些结果表明，在生理盐条件下，在病毒攻击之前或之后用4H30处理时，分支的4H30可有效抑制SARS-CoV-2复制。

4H30阻断SARS-CoV-2进入

接下来，研究了4H30的抗病毒机制。当用4H30预处理细胞或用4H30预处理病毒时，感染后1小时(hpi)病毒附着和/或至VeroE6细胞的进入显著增加(图2A)。在6hpi时，用4H30预处理病毒时，细胞裂解物中的病毒复制受到显著抑制，如与1hpi时的病毒载量相比病毒载量没有显著增加所证明的(图2B)，这与用4H30预处理病毒时的噬斑减少测定结果一致(图1C)。然而，与1hpi时的病毒载量相比，PBS处理的病毒显示在6hpi时的病毒载量增加了50倍。与1hpi时的病毒载量相比，在病毒攻击前用4H30预处理细胞时，6hpi时的病毒载量增加了13倍，这表明与PBS处理的病毒相比，1hpi时病毒附着和/或进入的增加并没有增加病毒复制(图2B)。

其次，4H30还显示可在4度下增加SARS-CoV-2对细胞的附着(图2C)，这与1hpi时病毒载量的增加一致(图2A)。此外，与ACE2相比，4H30与刺突结合更有效(图2D)，而4H30对刺突与ACE2之间的结合没有显著影响(图2E)。这些结果表明4H30不能直接将刺突与ACE2交联以提高病毒附着，因为4H30能够与刺突结合，但不能有效与ACE2结合。此外，当用50μg ml^- ¹4H30预处理1×10⁶PFU ml^-1SARS-CoV-2，然后将4H30处理的病毒稀释10,000倍进行噬斑测定时，4H30(以0.005μg ml^-1<IC₅₀＝0.59μg ml^-1)显著抑制SARS-CoV-2感染(图2F)，这表明4H30在病毒进入之前通过与病毒的不可逆结合显著抑制病毒感染。总之，这些结果表明4H30增加了病毒在细胞上的附着，但在病毒进入后仍有效抑制了病毒复制。

接下来，荧光显微镜显示4H30可以交联SARS-CoV-2，在Calu-3和VeroE6细胞膜上形成大的病毒簇，而没有病毒进入；这表明交联的病毒颗粒不会通过SARS-CoV-2的两种进入途径感染细胞：在Calu-3细胞中使用TMPRSS2⁺通过表面膜融合介导，或在VeroE6细胞中通过内吞作用介导。为了进一步确认4H30可以使病毒颗粒聚集，在透射电子显微镜(TEM)下进一步证实了4H30交联SARS-CoV-2形成更大的病毒簇。TEM下完整的病毒颗粒表明4H30没有破坏病毒颗粒。由于4H30能够结合刺突(图2D)，如TEM下所示，可以推测4H30也可以交联刺突蛋白。当Calu-3细胞或VeroE6细胞在病毒攻击前用4H30处理(4H30-Pre)时，4H30不会聚集病毒颗粒，也不会阻止病毒进入，这表明4H30不会影响细胞膜上的ACE2等宿主因子来抑制病毒附着/进入。总之，这些结果表明4H30通过与刺突结合交联SARS-CoV-2形成大病毒颗粒，从而阻止病毒通过两种途径进入。

4H30抑制SARS-CoV-2释放

值得注意的是，4H30被证明显著抑制病毒释放，如以下所指示：在6hpi时向感染的细胞中加入4H30，10hpi时细胞培养上清液中SARS-CoV-2的病毒载量降低(图3A)，而4H30的抑制作用并不作用于细胞内复制过程(图3B)。为了证明4H30的抑制作用发生在病毒释放步骤，采用了免疫荧光成像法。在14hpi时向感染的细胞中加入4H30，此时病毒颗粒粘附在细胞膜上，在18hpi时固定感染的细胞。18hpi时上清液中的病毒载量显著下降，进一步证实，与对照相比，4H30显著抑制了SARS-CoV-2的释放(图3C)。

先前的研究表明，HBD2可以与糖胺聚糖(GAG)结合(E.S.Seo,et al.,Biochemistry,49(2010)10486-10495)。本文已证明，与BSA相比，4H30可以有效与GAG结合，包括硫酸软骨素(CS)和硫酸肝素(HS)(图3D)。此外，已证明当4H30用CS或HS预处理时，4H30对病毒释放的抗病毒活性显著降低，但BSA没有显著影响4H30对SARS-CoV-2释放的抑制活性(图3C)。这些结果表明，4H30将SARS-CoV-2的刺突与GAG交联，从而抑制病毒释放。为了进一步证实4H30能够使病毒与细胞GAG交联，证明了与未处理的细胞相比，SARS-CoV-2与经4H30处理的细胞的附着在A549(ACE2^-)和Calu-3(ACE2⁺)细胞中显著增加(图3E和3F)。当用GAG预处理4H30(图3E)或用可以去除细胞表面GAG的软骨素酶ABC(ChABC)和肝素酶(Hase)预处理细胞时(图3G)，附着显著降低。这些结果进一步证实，即使在A549细胞中没有ACE2的情况下，4H30也能使病毒与GAG交联，从而增加病毒对细胞的附着(M.L.Yeung,et al.,Cell,184(2021)2212-2228.e2212)。但病毒附着量的增加并没有增加SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制(图3H)。这与用4H30预处理细胞后，VeroE6细胞中的病毒复制结果一致(图2B)。

进一步证明，与未处理的4H30或BSA处理的4H30相比，经1250ng/ml CS或HS处理的4H30的抗病毒活性(图3I)显著降低。然而，当CS或HS处于生理浓度(50-100ng/ml)时(E.Papakonstantinou,et al.,Br J Pharmacol,157(2009)1111-1127)，GAG处理的4H30仍然可以显著抑制病毒复制(图3J)，这与4H30在病毒攻击后加入细胞中的抗病毒活性一致。结合其对病毒进入的抑制作用，这些结果表明4H30可以通过GAG交联病毒颗粒和交联病毒刺突，通过阻断病毒进入和病毒释放两个步骤的双重功能达到期望的抗病毒效果。

4H30对抗SARS-CoV-2变体

为了测试4H30在体内的潜在毒性，经鼻腔接种4H30到仓鼠/小鼠体内后，监测了病理和体重变化。吸入4H30在接种后4天(dpi)没有引起病理和体重变化(图4A)。为了确定4H30是否会在较长时间内引起肺损伤，监测了40dpi时的肺组织病理学和体重变化。与模拟组相比，没有显著的组织病理学和体重变化。

接下来，测试了4H30对SARS-CoV-2(B.1.1.63)的体内预防活性。结果表明，在病毒攻击前的时间向仓鼠肺中给予一剂4H30(0.5mg kg^-1)(4H30-Pre)可显著抑制SARS-CoV-2复制。在病毒攻击前4小时向仓鼠给予一剂4H30可显著抑制病毒复制(图4B)。与未经治疗的对照相比，在病毒攻击前8小时向仓鼠给予4H30可使病毒复制减少2.3倍，但在病毒攻击前24小时给予4H30则未表现出抗病毒活性。此外，在模拟治疗的仓鼠肺中观察到支气管树中的合胞体和上皮细胞紊乱，但在用4H30-0.05治疗的仓鼠中没有发现这些组织病理学变化，这可能是由于4H30阻断了刺突-ACE2介导的融合所致。4H30对融合的这种抑制可能归因于对内体酸化的抑制，类似于巴佛洛霉素A1抑制内体酸化和细胞融合的活性。此外，研究还表明4H30不抑制刺突-Calu-3细胞介导的融合，其中刺突-ACE2介导的融合依赖于TMPRSS2途径而不是内吞作用途径。总之，这些结果表明，除了4H30对病毒进入和释放的抑制作用外，4H30对刺突-ACE2介导的融合的抑制也有助于减少病理变化。

为了研究4H30在体内的攻击后抗病毒活性，采用SARS-CoV-2(B.1.163)攻击仓鼠，然后在8hpi时通过鼻内吸入4H30(0.5mg kg^-1)、4H30(0.1mg kg^-1)和PBS来治疗仓鼠。第二天再给予仓鼠两剂。由于SARS-CoV-2在仓鼠肺中迅速复制并在2dpi达到峰值滴度(J.F.Chan,et al.,Clin Infect Dis,(2020)；S.J.F.Kaptein,et al.,Proc Natl AcadSci U S A,117(2020)26955-26965)，因此第一剂在8hpi时开始，并在2dpi时测量肺中的病毒载量(图4C)。与模拟治疗的仓鼠相比，4H30(0.5mg kg^-1和0.1mg kg^-1)可以显著抑制SARS-CoV-2复制。

为了研究4H30对抗SARS-CoV-2变体的功效，结果表明4H30显著抑制了四种SARS-CoV-2变体在细胞中的复制(图4D)。进一步证实4H30(0.15μmol kg^-1＝0.5mg kg^-1)显著抑制了仓鼠体内SARS-CoV-2(B.1.617.2，Delta)的复制(图4E)，与同剂量瑞德西韦(0.75μmolkg^-1＝0.5mg kg^-1)的效果相当。与模拟治疗的仓鼠相比，4H30减少了仓鼠肺中的合胞体形成和支气管上皮病理。然而，在接受瑞德西韦治疗的仓鼠肺支气管中仍然观察到合胞体，这符合瑞德西韦的抗病毒机制，即干扰RNA合成而不影响刺突诱导的细胞融合。合胞体的减少可以减轻SARS-CoV-2感染在体内的损害，因为死于重症COVID-19的患者在尸检时肺部有合胞体的改变(L.Braga,et al.,Nature,594,pages 88–93(2021))。这些结果表明，吸入4H30(仓鼠的剂量为0.5mg kg^-1，低于根据FDA建议的人体等效剂量指导的人的剂量5mg/50kg)可广泛抑制仓鼠体内SARS-CoV-2变体的病毒复制，并减少肺中合胞体的形成。

4H30阻断SARS-CoV-2传播

将SARS-CoV-2Delta变体接种到用PBS或4H30处理的仓鼠。然后将未接触过病毒的仓鼠放入同一个笼子中，用塑料板隔开，以进行空气传播。暴露6小时后，将未接触过病毒的仓鼠放入新笼子中进行病毒培养。暴露后第3天收集肺和鼻甲组织，用于通过RT-qPCR和噬斑测定测量病毒载量。PBS处理的仓鼠在6只仓鼠中显示100％的传播率(6/6)，这表明Delta变体在仓鼠中通过空气传播具有很高的传播潜力。4H30处理的仓鼠在4只仓鼠中显示25％的传播率(1/4)，这表明4H30可以阻断SARS-CoV-2在仓鼠中的传播。

4H30抑制H1N1病毒复制

用hBD2肽H30、2-分支H30(2H30)或4-分支H30(4H30)处理H1N1病毒以进行噬斑减少测定。用PBS中的hBD2肽H30、2-分支H30(2H30)或4-分支H30(4H30)处理H1N1病毒30分钟，然后将病毒接种到VeroE6中进行噬斑减少测定。用PBS(0)处理的H1N1为无抑制对照。在37℃下孵育1小时以进行病毒感染，之后，去除未感染的病毒并将1％低熔点琼脂添加到感染细胞中以形成噬斑。在37℃下孵育3天后。固定细胞以计数噬斑数量。数据表示为至少三个生物样品的平均值±SD，其中进行了两次以上的独立实验。如图5所示，以PBS(0μg/ml肽)处理的H1N1为无抑制对照，H1N1病毒复制受到4H30的显著抑制。

4H30抑制次要组HRV-1B和主要组HRV-B14

病毒经4H30处理后感染RD或H1-Hela细胞。病毒、HRV-1B和HRV-B14经PBS中的4H30处理30分钟，然后将处理过的病毒加入RD或H1-Hela细胞进行感染。感染1小时后，去除未感染的病毒，并将具有所示浓度4H30的新鲜培养基加入细胞进行病毒培养。通过RT-qPCR测量30hpi时的上清病毒。病毒RNA拷贝数(％)是4H30处理病毒的病毒RNA相对于未处理病毒(0)的病毒RNA归一化。数据以至少三个独立生物样品的平均值±SD表示。检测病毒RNA拷贝数的引物：HRV-F1：5’-AGCCYGCGTGGCKGCC-3’；HRV-F2：5’-AGCCYGCGTGGTGCCC-3’；HRV-R：5’-GAAACACGGACACCCAAAGTAGT-3’；HRV-探针：5’HEX-TCCGGCCCCTGAATGYGGCTAA-lABkFQ3’(Y＝C或T，K＝G或T)。在30hpi测量上清病毒。4H30有效抑制了次要组HRV-1B和主要组HRV-B14(图6)。

讨论

在本研究中，鉴定出一种人源防御素肽4H30，它可交联SARS-CoV-2以阻断VeroE6和Calu-3细胞的细胞膜外的病毒进入。它还通过防止内体酸化来抑制通过内吞途径的病毒进入，并通过将病毒刺突与细胞表面GAG交联来抑制SARS-CoV-2释放。因此，4H30在细胞表面提供了一层保护以阻断病毒进入和释放，从而抑制病毒感染和传播。此外，4H30抑制了刺突-ACE2介导的细胞融合，从而减少了指示严重的SARS-CoV-2肺炎的合胞体的形成。重要的是，4H30在体外和仓鼠中有效抑制了SARS-CoV-2变体，这表明其具有广泛的抗病毒活性，凸显了这种人源肽的临床相关性。

随着SARS-CoV-2大流行的传播，具有逃避疫苗诱导的中和抗体的潜在能力的变体成为当下重要的关注点。迫切需要找到具有广泛抗冠状病毒活性的新型抗病毒药物。在这项研究中，鉴定出一种人源防御素肽4H30，其含有与原始的人β防御素2相同的氨基酸序列片段。因此，4H30预计可安全用于临床试验。最近的研究报告称，人β防御素2可以与刺突蛋白结合，抑制刺突与ACE2的结合(L.Zhang,et al.,bioRxiv,(2021))。然而，生理盐条件下防御素的低抗病毒活性以及难以产生足够的重组hBD2可能是将其制备用于临床治疗的重要障碍。此外，先前的研究表明，hBD2可以与GAG结合(E.S.Seo,et al.,Biochemistry,49(2010)10486-10495)，但hBD2的抗病毒活性较差，并且体内数据很少(C.Xu,et al.,Viruses,13(2021))。根据先前与小鼠β防御素4(HBD2的直系同源物)相关的研究(30个氨基酸的P9和P9R)(H.Zhao,et al.,Nat Commun,12(2021)1517；H.Zhao,et al.,Sci Rep,6(2016)22008；H.Zhao,et al.,Nat Commun,11(2020)4252)，从HBD2设计出30个氨基酸肽H30，并通过构建分支的4H30增强其抗病毒活性。因此，4H30能够与SARS-CoV-2的刺突结合并交联病毒颗粒，从而在VeroE6和Calu-3细胞中阻断病毒进入。此外，碱性4H30抑制内体酸化以阻断刺突-ACE2介导的融合，类似于巴佛洛霉素A1和氯喹抑制内体酸化以阻断刺突-ACE2介导的融合(H.Zhao,et al.,Nat Commun,12(2021)1517)。对刺突-ACE2介导的细胞融合的抑制可归因于合胞体的减少，这与SARS-CoV-2肺炎的严重程度相关(Z.Xu,et al.,Lancet Respir Med,8(2020)420-422)。由于受感染细胞表面的刺突表达可触发与ACE2表达细胞的细胞融合，因此4H30阻断细胞间融合可以在减少合胞体形成和肺损伤方面发挥重要作用。此外，研究表明4H30交联刺突与细胞表面GAG(CS和HS)可阻断病毒释放，从而限制SARS-CoV-2向未感染细胞的扩散。因此，这一发现为抑制SARS-CoV-2释放提供了证据和策略。总之，已鉴定出一种4-分支H30(4H30)，它可结合刺突和GAG，从而有效地将病毒颗粒聚集在细胞膜上，阻断新合成的病毒的病毒进入和释放。

更重要地是，4H30在体外和仓鼠体内以低剂量(0.5mg kg^-1)表现出对SARS-CoV-2变体的强效抗病毒活性，如果通过气雾剂途径施用，这可能转化为对患者有希望的抗病毒活性。吸入疫苗也提供了证据，表明气雾吸入抗病毒药物可能是治疗COVID-19的替代方法(D.An,et al.,Sci Adv,7(2021)；S.Wu,et al.,Lancet Infect Dis,(2021))。这种具有三重抗病毒机制(交联病毒颗粒、阻断细胞间融合和抑制病毒释放)的4H30的发现为其他具有多重抗病毒机制的抗病毒药物的发现提供了另一种抗病毒策略。

Claims

1.抗病毒肽，其具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项的序列，或为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项的变体。

2.根据权利要求1所述的抗病毒肽，其中所述抗病毒肽与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。

3.根据权利要求2所述的抗病毒肽，其中所述抗病毒肽具有SEQ ID NO:4的序列或由SEQ ID NO:4的序列组成。

4.具有两个或更多个抗病毒肽的多聚体，其中所述抗病毒肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有序列SEQ ID NO:1或为SEQ ID NO:1的片段或变体。

5.根据权利要求4所述的多聚体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有约80％、85％、90％、95％、99％的序列相似性。

6.根据权利要求4或5所述的多聚体，其中所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3中任一项的序列，或者为SEQID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项的变体。

7.根据权利要求6所述的多聚体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的多聚体，其中所述多聚体为二聚体、三聚体或四聚体，和/或为同源多聚体或异源多聚体。

9.根据权利要求4-8中任一项所述的多聚体，其中所述多聚体是由每个单体抗病毒肽交联而成，优选使用2,2-双(羟甲基)丙酸(MPA)或具有4个反应位点的第二代MPA树枝状分子。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的多聚体，其中所述多聚体是通过将MPA与两个具有SEQ ID NO：4的单体抗病毒肽偶联，通过C端的赖氨酸交联以形成具有两个所述抗病毒肽分支的分子，或通过将具有4个反应位点的第二代MPA树枝状分子与具有SEQ ID NO：4的单体抗病毒肽偶联，通过C端的赖氨酸交联以形成具有四个所述抗病毒肽分支的分子。

11.包含抗病毒肽的组合物，其中所述抗病毒肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的片段或变体，其中所述氨基酸序列与SEQID NO:1具有约80％、85％、90％、95％、99％的序列相似性，任选地所述组合物包含另一种治疗剂、预防剂或诊断剂。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4中任一项的序列，或者为SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的变体。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。

14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述药剂选自由以下组成的组：支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗过敏剂及其组合。

15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述抗病毒肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的序列，或者为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中任一项的变体。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的任一项具有约80％、85％、90％、95％的序列相似性。

17.根据权利要求11所述的组合物，其中所述抗病毒肽包含SEQ ID NO:4。

18.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物，其中两个或更多个所述抗病毒肽为二聚体、三聚体、四聚体或多聚体的形式。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述抗病毒肽包含四聚体形式的SEQ ID NO:4。

20.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗病毒肽、权利要求中4-10任一项所述的多聚体、或权利要求11-19中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载剂。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述组合物是冻干的，或者所述组合物的形式选自由以下组成的组：气雾剂粉末、液体和悬浮液。

22.试剂盒，其包括

(a)一个或多个单一单位剂量的组合物，所述组合物包括权利要求1-3中任一项所述的抗病毒肽、权利要求4-10中任一项所述的多聚体、或权利要求11-19中任一项所述的组合物，以及

(b)关于如何施用所述剂量来治疗或预防冠状病毒感染、流感病毒感染或鼻病毒感染的说明书。

23.治疗或延缓呼吸道病毒感染的一种或多种症状的进展或阻断病毒传播的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-3中任一项所述的抗病毒肽、权利要求4-10中任一项所述的多聚体、或权利要求11-19中任一项所述的组合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者患有呼吸道病毒感染或者有感染呼吸道病毒的风险。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述呼吸道病毒选自由以下组成的组：SARS-CoV-2病毒、流感病毒或鼻病毒。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述流感病毒是HIN1病毒，和/或所述鼻病毒是HRV-1B或HRV-B14。

27.根据权利要求23-24中任一项所述的方法，其中所述病毒是选自以下的SARS-CoV-2病毒变体：SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变体)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变体)、SARS-CoV-2P.1(Gamma变体)、SARS-CoV-2B.1.617、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变体)、SARS-CoV-2B.1.621(Mu变体)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变体)、SARS-CoV-2B.1.617.3和SARS-CoV-2B.1.1.529(Omicron变体)。

28.根据权利要求23-27中任一项的方法，其中将所述组合物施用至肺部或鼻腔系统。

29.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述组合物以选自以下的形式施用：粉末、液体和悬浮液。

30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述组合物以气雾剂的形式施用。

31.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述组合物经由雾化器或吸入器施用。

32.根据权利要求23-31中任一项所述的方法，其中所述组合物与另一种治疗剂、预防剂或诊断剂组合施用。

33.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述组合物与一种或多种选自以下的药剂组合施用：支气管扩张剂、皮质类固醇、甲基黄嘌呤、磷酸二酯酶-4抑制剂、抗血管生成剂、抗菌剂、抗氧化剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗过敏剂及其组合。

34.根据权利要求23-33中任一项所述的方法，其中所述组合物以选自以下的间隔施用：每周一次、每两周一次、大约每月一次、每两个月一次和每三个月一次。

35.根据权利要求23-33中任一项所述的方法，其中所述组合物每周施用一次，持续长达1、2、3、4、5或6个月的时间。

36.根据权利要求23-35中任一项所述的方法，其中所述组合物以0.001mg/kg受试者体重(含)至100mg/kg受试者体重(含)的剂量施用于人受试者。

37.根据权利要求23-36中任一项所述的方法，其中所述组合物以2.0mg(含)至20mg(含)的剂量施用于人受试者。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述组合物以5mg的剂量施用于所述受试者。

39.根据权利要求23-38中任一项所述的方法，其中所述组合物以有效减少所述受试者的合胞体形成和肺损伤的量施用。

40.根据权利要求23-38中任一项所述的方法，其中所述组合物以有效减轻咳嗽、疲劳、发烧、身体疼痛、头痛、喉咙痛、味觉和/或嗅觉丧失或改变、呕吐、腹泻、细胞因子风暴、皮肤变化、眼部并发症、意识错乱、慢性神经损伤、胸痛和呼吸急促中的一种或多种症状的量施用。